RECEPTORIAUS) GENO POLIMORFIZMO SĄSAJOS SU HIPOFIZĖS ADENOMA

(1)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINAJOS AKADEMIJA

GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTAS

DAINA LIDEIKYTĖ

AGER (SPECIFINIO GLIKOZILINIMO GALUTINIŲ PRODUKTŲ

RECEPTORIAUS) GENO POLIMORFIZMO SĄSAJOS SU HIPOFIZĖS ADENOMA

Magistro baigiamasis darbas

Medicinos studijų programa, valstybinis kodas 601A30002

Darbo vadovė dr. doc. Alina Smalinskienė

Kaunas, 2017

(2)

TURINYS

SANTRAUKA ... 4

SUMMARY ... 5

PADĖKA ... 6

INTERESŲ KONFLIKTAS ... 6

BIOETIKOS LEIDIMAS ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

I. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1 Posmegeninės liaukos anatomija ... 11

1.2 Hipofizės adenoma ... 11

1.2.1 Hipofizės adenomos epidemiologija ... 12

1.2.2 Hipofizės adenomos etiologija ... 12

1.2.3 Hipofizės adenomos klinika ... 13

1.2.4 Hipofizės adenomos diagnostika ... 13

1.2.5 Hipofizės adenomos gydymas ... 14

1.3 AGER genas ir jo mutacijos ... 14

1.4 AGER geno mutacijų ryšys su hipofizės adenomos inazyvumu ir aktyvumu ... 16

II. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 17

2.1 Tyrimo planavimas ... 17

2.1.1 Tyrimo objektas ... 17

2.1.2 Tiriamųjų atranka ... 17

2.2 Deoksiribonukleino rūgšties išskyrimas ... 17

2.3 DNR išskyrimas naudojant rinkinius ... 17

2.3.1 Pasiruošimas DNR išskyrimui ... 18

2.4 DNR išskyrimo etapai ... 18

2.4.1 Ląstelių lizė ... 18

2.4.2 DNR nusodinimas ant silikagelio kolonėlės membranos ... 18

2.4.3 DNR išvalymas ... 18

2.4.4 DNR išplovimas iš kolonėlės ... 18

2.5 DNR koncentracijos matavimas ... 19

2.6 Polimerazės grandinės reakcija ... 19

2.6.1 Mėginių paruošimas genotipavimui ... 19

(3)

2.7 Statistinė duomenų analizė ... 20

III. REZULTATAI ... 21

IV. REZULTATŲ APTARIMAS ... 30

V. IŠVADOS ... 32

VI. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 33

(4)

SANTRAUKA

Baigiamojo magistro darbo autorė: Daina Lideikytė

Baigiamojo magistro darbo pavadinimas: AGER (specifinio glikozilinimo galutinių produktų receptoriaus) geno polimorfizmo sąsajos su hipofizės adenoma.

Darbo vadovė: dr. doc. Alina Smalinskienė

Hipofizė – nedidelė endokrininė liauka esanti smegenų pamate, turkiškojo balno duobėje. Ji, išskirdama hormonus, veikia įvairius organizmo organus bei audinius ir reguliuoja kitų endokrininių liaukų veiklą. Hipofizės adenoma – gerybinis navikas augantis iš adenohipofizės ląstelių, tačiau jos etiologija ir rizikos veiksniai nėra visiškai išaiškinti, todėl pastaraisiais metais yra atliekama daug tyrimų, nagrinėjant genetinius veiksnius ir jų įtaką adenomos išsivystymui.

Darbo tikslas: įvertinti AGER geno polimorfizmą, pacientams, sergantiems hipofizės adenoma.

Tyrimo metodika ir metodai: ištirti 139 asmenys, kuriems buvo nustatyta hipofizės adenoma ir 200 sveikų tiriamųjų. Tyrimui buvo naudoti komerciniai rinkiniai DNR išskyrimui iš periferinio kraujo leukocitų. Tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu atliktas genotipavimas. Tyrimo rezultatai apskaičiuoti ,,IBM SPSS Statistics programa“.

Rezultatai: Nustatyta, kad AGER geno rs1800625 statistiškai reikšmingai skiriasi alelių dažniai: sergančiųjų grupėje A alelis sudaro 79,1 %, G - 20,9 %, kontrolinėje grupėje atitinkamai 85,5

% ir 14,5 %. Nenustatyta jokių statistiškai reikšmingų AGER geno rs1800625 VNP sąsajų su hipofizės adenomos invazyvumu. Įvertinę AGER geno rs1800625 polimorfizmo sąsajas su hipofizės adenomos aktyvumu, recidyvumu ir augimu nustatėme: atsižvelgiant į HA aktyvumą, GG genotipas 4 kartus, AG+GG genotipai kartu 2,2 karto, o G alelis 2 kartus padidina riziką susirgti neaktyvia HA, atsižvelgiant į HA recidyvumą, GG genotipas didina galimybę susirgti nerecidyvia HA 3,8 karto, o AG+GG genotipai kartu didina galimybę susirgti recidyvia 2,5 karto, atsižvelgiant į HA augimą, G alelis 2 kartus, AG+GG genotipai kartu 2 kartus, o GG genotipas 4,4 karto didina riziką susirgti hipofizės mikroadenoma.

Išvados: įvertinus AGER geno rs1800625 VNP, buvo nustatytas statistiškai reikšmingas alelių pasireiškimo dažnis. Atsižvelgiant į HA aktyvumą, nustatyta, kad rizikos alelio G pasireiškimo dažnis yra statistiškai reikšmingai didesnis sergančiųjų neaktyvia HA grupėje. Šis, G alelis, statistiškai reikšmingai dažniau pasireiškia ir tarp pacientų sergančių mikroadenoma. Taip pat riziką susirgti mikroadenoma didina G alelis ir GG genotipas. GG genotipas didina galimybę susirgti nerecidyvine HA, o AG+GG genotipai kartu didina galimybę susirgti recidyvine HA.

Darbas atliktas: LSMU Veterinarijos akademijos Gyvulininkystės technologijos fakultete Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute.

(5)

SUMMARY

The author of Master‘s thesis: Daina Lideikytė

The title of Master‘s thesis: The link between the AGER (Advanced glycosylation end product-specific receptor) gene polymorphism and pituitary adenoma.

The Head of thesis: dr. doc. Alina Smalinskienė

Pituitary gland – a small endocrynic gland, located in the Sella turcica. Hormones secreted from this gland regulate the function of other endocrynic glands and affect various organs and tissues. Pituitary adenoma is a benign tumor growing from the cells of adenohypophysis, however the aetiology and possible risk factors are not yet fully undestood. For this reason, in recent years, various scientific studies test different genetic factors and their realation to the growth of pituary adenomas.

The aim of work: to evaluate the polymorphysm, of the RAGE gene in patients with a hypophysis adenoma.

Methods and materials: 139 patients with pituary adenoma and 200 healthy people were tested. To gather the DNA samples, commmercial kits that isolate the DNA from white blood cells of the perriferal blood were used. The genotyping was done by using a real time polymerase chain reaction method. Results of this study were calculated using the IBM SPSS Statiscs program.

Results: A statistically significant frequency differences of allele manifestation in RAGE (rs1800625) were found. The A allele was found in 79,1 % and the G allele in 20,9 % of the patients with a pituary adenoma, while the A allele was found in 85,5 % and the G allele in 14,5 % of people in the control group. It was estimated, that the G allele increases the risk of having a micro adenoma 2 times, while AG+GG genotypes combined 2 times, and GG genotype 4 times. The GG genotype increases the risk of having a non-benign pituary adenoma 3,8 times. The AG+GG genotypes combined increase the risk of having a benign pituary adenoma 2,5 times. While the GG genotype increases the risk of having an inactive pituary adenoma 4 times, the AG+GG genotypes combined 2,2 times, and the G allele 2 times.

Conclusion: statistically significant frequency of allele manifestation in the RAGE gene rs1800625 single nucleotide polymorphism were found. Frequency of the G allele is statistically significantly higher in patients with pituary micro-adenomas, while the frequency of the AG+GG genotypes combined and the GG genotype is statistically significantly higher in patients with benign pituary adenomas.

Research performed at: Institute of Biology Systems and Genetics, Faculty of Animal Husbandry Technology, Veterinary Academy, Lithuanian University of Health Sciences.

(6)

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovei dr. doc. Alinai Smalinskienei už pagalbą, ir pastabas rašant baigiamąjį magistro darbą. Dėkoju dr. doc. Rasai Liutkevičienei. Už pagalbą laboratorijoje ir patarimus dėkoju Alvitai Vilkevičiūtei. Už konsultacijas, rašant baigiamąjį magistro darbą, dėkoju prof. Rasai Banienei.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui interesų konflikto nebuvo.

BIOETIKOS LEIDIMAS

Tyrimas atliktas LSMU Veterinarijos akademijos Gyvulininkystės technologijos fakultete Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute. LSMU Bioetikos centro leidimas: Nr. P2 – 9, 2003 m.

(7)

SANTRUMPOS

DNR – deoksiribonukleorūgštis RNR – ribonukleorūgštis

AGER (angl. advanced glycosylation end product specific receptor) – specifinis glikozilinimo galutinių produktų receptorius

VNP – vieno nukleotido polimorfizmas EDTA – etilendiamino tetraacto rūgštis

TL – PGR – tikro laiko polimerazės grandinės reakcija AKTH – adrenokortikotropinis hormonas

SCAs ( angl. silent corticotroph adenomas) – besimptomė kortikotropiną gaminanti adenoma TNFα ( angl. tumor necrosis factor) – naviko nekrozės veiksnys

TTH – tirotropinis hormonas

FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas LTH – luteotropinis hormonas

STH – somatotropinis hormonas

MSH – melanocitus stimuliuojantis hormonas

MEN1 – dauginės endokrininės neoplazijos sindromas 1 tipas MEN4 – dauginės endokrininės neoplazijos sindromas 4 tipas CNC (angl. Carney complex) – Carney kompleksas

GNAS1 – baltymas, kurį koduoja GNAS genas

AIP ( angl. aryl - hydrocarbon receptor-interacting protein) – baltymas sąveikaujantis su aromatinių angliavandenilių receptoriais

PTTG – genas transformuojantis hipofizės auglį

MMP1 – matrikso metaloproteinazė 1 miRNR – mikroRNR

(8)

p53 tumoro supresijos baltymas, kurį koduoja TP53 genas

GADD45B (angl. growth arrest and DNA damage inducible beta) baltymas mažinantis augimą ir sukeliantis DNR pažeidimus, jį koduoja GADD45B genas

MMP – 9 matrikso metaloproteinazė - 9

NCAM (angl. neural cell adhesion molecule) neuronų adhezijos molekulė

(9)

ĮVADAS

Hipofizė – vidaus sekrecijos liauka išsidėsčiusi smegenų pamate, turkiškojo balno duobėje.

Hipofizė laikoma viena svarbiausių vidaus sekrecijos liaukų, nes ji išskirdama hormonus reguliuoja kitų liaukų hormoninę veiklą. Ši liauka sudaryta iš dviejų skilčių: adenohipofizės ir neurohipofizės. Hipofizę supa daug svarbių nervinių, endokrininių, kraujagyslinių ir kaulinių struktūrų, todėl čia gali kilti daug patologinių procesų.

Hipofizės adenoma (HA) – parenchimos ląstelių gerybinis navikas, kuris sudaro 10–15 % visų intrakranijinių navikų. Kliniškai reikšmingos HA pasireiškia 1 iš 1064 gyventojų [1]. Didžioji dalis hipofizės adenomų yra sudarytos iš nepilnai diferencijuotų ląstelių su menkai išsivysčiusia citoplazma ir mažomis sekrecinėmis granulėmis. HA klasifikuojamos į funkcionuojančias (išskiriančias hormonus) ir nefunkcionuojančias (hormonų neišskiriančias). Taip pat HA yra klasifikuojamos atsižvelgiant į ląstelių diferenciaciją ir adenomos dydį. HA klinika priklauso nuo adenomos tipo. Funkcionuojančios HA sukelia įvairius hormoninius disbalansus, priklausomai nuo to, kokį hormoną adenoma sekretuoja.

Nefunkcionuojančios adenomos yra linkusios greičiau augti. Nustatyta, kad navikui didėjant spaudžiama chiazma, todėl net 76 % sergančiųjų HA pirma pajunta atsiradusius regos sutrikimus [1]. Esant mažai HA ir nesant simptomams liga dažniausiai nustatoma atsitiktinai.

Aktyvios ir invazyviai augančios adenomos gali plisti į aplinkinius audinius taip sukeldamos ir letalias išeitis, nes daugelis organų ir audinių yra tiesiogiai ar netiesiogiai veikiami šios liaukos išskiriamų hormonų. Dėl to plačiai tyrinėjami biologiniai markeriai ir jų svarba HA patogenezėje. Jie leistų tiksliau prognozuoti HA klinikinę eigą ir parinkti tinkamą gydymą, tačiau dar nėra įrodyta, kad nors vienas biologinis markeris tinkamas invazyvių ir aktyvių HA diagnostikai.

HA etiopatogenezė ir rizikos veiksniai nėra iki galo išaiškinti. Pastaraisiais metais daugiausia dėmesio skiriama genetiniams HA atsiradimo veiksniams. Vienas iš genų, siejamas su adenomos išsivystymu, yra AGER (specifinis glikozilinimo galutinių produktų receptorius) geno rs1800625 vieno nukleotido polimorfizmas (VNP). AGER genas yra 6p21.3 chromosomoje, jo bendras ilgis 3.27 kb. Jis priklauso imunoglobulinų šeimos ląstelių paviršiaus receptorių grupei. Tai multiligandinis receptorius, kuris be AGE, sąveikauja su kitais ligandais, svarbiais ląstelės homeostazės užtikrinimui, vystymuisi bei atsakui į uždegimą Esant audinių pažaidai, kuri atsiranda dėl uždegiminės reakcijos vystosi oksidacinis stresas, kuris gali sukelti AGER geno mutacijas. AGER geno mutacijas pasiūlyta laikyti blogo audinių reorganizavimosi žymeniu ir naudoti vėžio nustatymui. Šiame moksliniame darbe bus tiriamas AGER geno rs1800625 polimorfizmas ir jo sąsajos su HA pasireiškimu.

(10)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas

Nustatyti AGER geno rs1800625 polimorfizmą ir įvertinti sąsajas su hipofizės adenoma.

Darbo uždaviniai

1. Nustatyti AGER geno (rs1800625) vieno nukleotido polimorfizmo dažnumą hipofizės adenoma sergantiems pacientams ir kontrolinės grupės asmenims.

2. Nustatyti AGER geno polimorfizmo sąsajas su hipofizės adenomos invazyvumu.

3. Nustatyti AGER geno polimorfizmo sąsajas su hipofizės adenomos aktyvumu.

(11)

I. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Posmegeninės liaukos anatomija

Hipofizė – nedidelė endokrininė liauka, išsidėsčiusi smegenų pamate, turkiškojo balno duobėje.

Ją iš šonų supa veniniai ančiai. Hipofizę sudaro dvi skiltys: priekinė (adenohipofizė) ir užpakalinė (neurohipofizė) (1 pav.).

Adenohipofizėje yra kamieninių ląstelių, kurios atlieka atraminę funkciją ir liaukinių ląstelių, kurios sekretuoja hormonus, tokius kaip: tirotropiną (TTH), kortikotropiną, folitropiną (FSH), liutropiną (LTH), prolaktiną (PRL), somatotropiną (STH) ir melanotropiną (MSH) [2].

Neurohipofizė pati hormonų negamina. Ji kaupia ir sekretuoja pogumburyje gaminamus hormonus oksitociną ir vazopresiną. Hipofizė išskirdama hormonus veikia įvairius organizmo organus bei audinius ir reguliuoja kitų endokrininių liaukų veiklą.

1 pav. Hipofizės adenomos sandara.

1.2 Hipofizės adenoma

Hipofizės adenoma (HA) – gerybinis navikas atsirandantis iš adenohipofizės ląstelių. Didžioji dalis hipofizės adenomų yra sudarytos iš nepilnai diferencijuotų ląstelių su menkai išsivysčiusia citoplazma ir mažomis sekrecinėmis granulėmis. Dėl morfologinių žymenų trūkumo šie navikai yra klasifikuojami kaip nediferencijuotų ląstelių adenoma. Remiantis imunohistocheminių ir elektroninės mikroskopijos tyrimų duomenimis HA yra skirstomos į funkcionuojančias, kurios sekretuoja hormonus ir nefunkcionuojančias, kurios nesekretuoja hormonų. 50,5 % HA yra funkcionuojančios, iš jų daugiausia, net 50 % yra prolaktinomos. Kortikotropiną gaminančios adenomos sudaro 6 % visų HA [3]. Dalis HA gamina kortikotropiną, tačiau jo nesekretuoja, tokios adenomos yra vadinamos tyliosiomis adenomomis (biologiškai neaktyvios) ir skirtingų tyrimų duomenimis sudaro net 20 – 43 % visų kortikotropiną gaminančių HA [4, 5]. Nefunkcionuojančios adenomos sudaro 24,4 – 54,1 % visų hipofizės adenomų [3]. Šios adenomos yra linkusios augti, greitai tampa makroadenomomis (>1 cm) ar gigantinėmis adenomomis (>4 cm). Navikui didėjant spaudžiama chiazma, dėl to sutrinka rega:

susiaurėja akiplotis, gali išsivystyti regos nervo atrofija [1, 6]. Didėjanti adenoma gali sukelti ir

(12)

stiprius galvos skausmus, lydimus pykinimo ir vėmimo [7]. Funkcionuojančios HA nėra linkusios didėti, tačiau jos, išskirdamos hormonus, sukelia įvairius organizmo funkcijų sutrikimus.

1.2.1 Hipofizės adenomos epidemiologija

Tiksliai nustatyti HA epidemiologiją yra sudėtinga, nes tai priklauso nuo hipofizės adenomos diagnozės ir klinikinių simptomų pasireiškimo. Dalis HA yra besimptomės, ypač nedidelės – iki 1 cm dydžio. Tokios HA dažnai yra nediagnozuojamos arba diagnozuojamos atsitiktinai [8]. Pagrindiniai metodai HA diagnostikai tai radiologiniai tyrimai: kompiuterinė tomografija (KT) ir magnetinė rezonanso tomografija (MRT) bei autopsijos metu atliekama histologinė analizė [8]. Atliktas tyrimas, kuriame buvo lygintas hipofizės adenomos paplitimas tarp autopsijos metu atliktų histologinių tyrimų ir radiologinių tyrimų. Atliekant histologinius tyrimus autopsijos metu HA buvo rasta 14,4 %, o radiologinių tyrimų metu 22,5 % tirtų pacientų. Skirtingų šaltinių duomenimis HA sudaro 10 – 16,7 % visų intrakranijinių navikų [8]. Nustatyta, kad vyrai šia liga serga du kartus rečiau nei moterys. Vyrams dažniau nei moterims diagnozuojamos makroadenomos. McDowell su kolegomis nustatė, kad sergamumo skirtumas yra aptinkamas ir tarp skirtingų rasių žmonių [9]. Šis tyrimas parodė, kad Amerikos juodaodžiai serga dažniau nei kitos etninės grupės žmonės, o juodaodės moterys serga tris kartus dažniau nei baltaodės [9]. Kitas tyrimas, atliktas Italijoje, parodė, kad šioje šalyje sergamumas tarp vyrų yra 1,3/100000, o tarp moterų 2,1/100000 (tirti nuo 20 iki 44 metų amžiaus) [10].

Šiuolaikinė medicininė įranga leidžia anksčiau ir tiksliau nustatyti augančią HA. Tai svarbu tikslesnės epidemiologijos nustatymui ir tolimesniems tyrimams.

1.2.2 Hipofizės adenomos etiologija

HA etiologija nėra visiškai išaiškinta. Hipofizės adenoma, kitaip nei kiti navikai, turi labai mažai su jos atsiradimu ir vystymusi susietų veiksnių. Manoma, kad genetiniai veiksniai yra vienas iš svarbiausių faktorių nulemiančių hipofizės adenomos atsiradimą. Per kelerius pastaruosius metus mokslininkai padarė didelę pažangą tirdami ryšį tarp DNR pokyčių ir adenomos atsiradimo. Atlikti tyrimai parodė, jog dauginės endokrininės neoplazijos sindromo I tipas (MEN1) yra paveldima būklė ir turi didelę reikšmę HA atsiradimui. Dauguma pacientų su somatotropiną gaminančiomis adenomomis turi mutavusį GNAS1 geną. Šis genas nėra paveldimas, tačiau susiformuoja iki gimimo. Carney kompleksas (CNC) yra retas sindromas, daugeliu atvejų jį sukelia paveldima PRKAR1A (nuo ciklinio AMP priklausomos baltymų kinazės reguliacinio subvieneto alfa) geno mutacija. Ši būklė laikoma gana didele rizika hipofizės adenomai išsivystyti. Prie rizikos veiksnių priskiriamas ir dauginės endokrininės neoplazijos sindromo IV tipas (MEN4) [11]. Jis susijęs su CDKN1B (nuo ciklino priklausomos kinazės inhibitorius 1B) geno mutacija. Su adenomos atsiradimu susijusi ir AIP (baltymas, sąveikaujantis su aromatinių angliavandenilių receptoriais) geno mutacija. Ši AIP geno mutacija aptinkama pas sergančiuosius izoliuota šeimine hipofizės adenoma [11–13].

(13)

1.2.3 Hipofizės adenomos klinika

Hipofizės adenomos kliniką lemia naviko tipas. Hormonus sekretuojančios adenomos pasireiškia ednokrininiais sutrikimais: hiperfunkcija ar hipofunkcija. Simptomai gali būti įvairūs, priklausomai nuo to, kokį hormoną adenoma sekretuoja. Parodyta, kad prasidėjus adenomos ląstelių iniciacijai, hormonų sekrecija sutrinka per kelis mėnesius [14]. Adenoma, sekretuojanti kortikotropiną, sąlygoja Kušingo ligos arba Nelsono sindromo išsivystymą [5]. Augimo hormono perteklius lemia akromegalijos atsiradimą. Prolaktinomos atveju klinika vyrams ir moterims skiriasi. Moterims gali atsirasti galaktorėja, menstruacijų sutrikimai: oligomenorėja ar amenorėja, vyrams – erekcijos sutrikimai, gali padidėti krūtys. Esant hormonų trūkumui pasireiškia hipogonadizmas, hipopituitarizmas [15]. Šie sutrikimai atsiranda, kai adenoma spaudžia hipofizę ir ji nebeišskiria liuteotropinio hormono (LH) ir folikulus stimuliuojančio hormono (FSH). Sumažėjus tirotropinio hormono (TTH) sekrecijai gali atsirasti hipotireozė, adrenokortikotropinio hormono (AKTH) trūkumas, kuris gali sukelti antinksčių nepakankamumą.

Hormonų nesekretuojančios adenomos sukelia neurologinius simptomus. Dėl didėjančios masės ir kitų organų bei audinių spaudimo pirmiausia atsiranda regos sutrikimai ir galvos skausmai.

Dažniausi regos sutrikimai tai susiaurėjęs akiplotis, regėjimo lauko iškritimai, sumažėjęs regos aštrumas.

Šie simptomai atsiranda, kai didėdama adenoma spaudžia chiazmą. Retesni regos sutrikimai - regos nervų diskų pažeidimai, aklumas [1]. HA išplitus į akytąjį antį gali atsirasti diplopia ar ptozė, galimas III (oculomotor), IV (trochlearis), VI (abducens) galvinių nervų paralyžius [5, 7]. Šalia regos sutrikimų atsiranda ir galvos skausmas, jis būna nenuolatinis, tačiau ligai progresuojant, skausmai atsinaujina, juos lydi pykinimas, vėmimas [1]. Kiti pasireiškiantys simptomai - silpnumas, kūno svorio praradimas.

1.2.4 Hipofizės adenomos diagnostika

HA nustatymui svarbu tiek instrumentiniai tiek laboratoriniai tyrimai. Įtariant funkcionuojančią adenomą reikalinga atlikti šlapimo bei kraujo tyrimą vertinant hormonų kiekį organizme. Atsiradus regos pažeidimams reikėtų įtarti greitai augančią HA ir atlikti oftalmologinį ištyrimą. MRT yra laikomas tiksliausiu būdu HA diagnozei nustatyti. Šis tyrimas yra išsamesnis už KT. MRT galima diagnozuoti HA, kurios yra mažesnio nei 3 mm dydžio. Tačiau net 10 % sveikų žmonių turi besimptomius hipofizės pakitimus, kuriuos sunku atskirti nuo hipofizės adenomos [16].

KT metu naudojami rentgeno spinduliai. Šio tyrimo metu galima aptikti tik pakankamai didelius darinius, todėl šiuo tyrimu galima diagnozuoti tik jau pažengusią HA. Atliekant KT kartu naudojamas kontrastas, kurio pagalba galima tiksliau įvertinti adenomos ribas, dinamikoje vertinti jos aktyvumą ir augimą.

Tais atvejais, kai yra didelė rizika susirgti mikroadenoma, atliekama angiografija.

(14)

1.2.5 Hipofizės adenomos gydymas

Hipofizės adenomos gydymas yra kompleksinis ir susideda iš medikamentinio gydymo, chirurginio gydymo ir radioterapijos. Funkcionuojančių adenomų ligos eiga, dažniausiai, galima kontroliuoti medikamentiniu gydymu. Jo dažniausiai pakanka visiškai sunormalizuoti hormonų disbalansą kraujyje. Nesant atsakui į medikamentinį gydymą ar jo netoleruojant yra rekomenduojamas chirurginis HA gydymas.

Pagrindinis chirurginio gydymo metodas yra transfenoidalinė mikrochirurgija [17]. Atlikti tyrimai rodo, kad tai pakankamai saugus gydymo metodas, nes tik 11,8 % gydytų asmenų atsirado pooperacinių komplikacijų ir iš jų tik 1 % buvo pavojingos gyvybei [18, 19]. Chirurginis gydymas taikomas tada, kai medikamentinis gydymas būna neveiksmingas ar yra diagnozuojama nefunkcionuojanti adenoma [20, 21]. Besimptomes mikroadenomas patartina stebėti neskiriant jokio gydymo.

Radioterapija taikoma tada, kai adenoma yra neoperabili, yra recidyvas arba jei operacijos metu auglys nebuvo visiškai pašalintas. Nors radioterapija yra efektyvi ir užkerta kelią nefunkcionuojančių adenoma atsinaujinimui [22], tačiau gydymas radioterapija gali sukelti daug šalutinių reiškinių – sveikos hipofizės pažeidimus, smegenų audinių pažeidimus, psichikos sutrikimus ar antrinius smegenų auglius.

Po spindulinio HA gydymo, susirgimo antriniais smegenų augliais rizika siekia net 10,5 % (1 iš 10 gydytų ir 1,9 iš 20 gydytų) [23], todėl prieš skiriant radioterapiją būtina įvertinti naudos ir rizikos santykį.

HA etiopatogenezė ir rizikos veiksniai nėra iki galo ištirti. Todėl, aiškinantis HA priežastis bei gydymo būdus, vis daugiau dėmesio skiriama genetiniams HA išsivystymo veiksniams. Vienas iš faktorių, galinčių turėti įtakos adenomos išsivystymui yra AGER geno vieno nukleotido polimorfizmas.

1.3 AGER genas ir jo mutacijos

AGER genas lokalizuotas 6 chromosomoje p21.3. Šis genas yra sudarytas iš 11 egzonų ir 10 intronų, jis yra 3.27 kb ilgio (2 pav.).

2 pav. Žmogaus 6 chromosomos schema

AGER koduoja baltymą – specifinį glikozilinimo galutinių produktų receptorių (2 pav.), sudarytą iš ekstraląstelinėje srityje lokalizuoto domeno, kuris jungia AGE (specifinius angliavandenių,

6 chromosoma

(15)

baltymų glikozilinimo galutinius produktus), transmembraninio domeno ir citozolinio domeno, atsakingo už signalų perdavimą ląstelėje. Jis priklauso imunoglobulinų šeimos ląstelių paviršiaus receptorių grupei. Tai multiligandinis receptorius, kuris be AGE, sąveikauja su kitais ligandais, svarbiais ląstelės homeostazės užtikrinimui, vystymuisi bei atsakui į uždegimą [24, 25]. Parodyta, kad be AGE receptorių AGER geną aktyvina lipopolisacharidas, S100 šeimos baltymai, amiloido – beta peptidas, transtiretinas ir beta 2 integrinai, kurie jungiasi prie receptoriaus ekstraląstelinių v ir c domenų (3 pav.).

3 pav. Specifinio glikozilinimo galutinių produktų receptoriaus (AGER) schema

Yra žinoma, kad ligandui susijungus su AGER, ląstelėje yra aktyvuojama signalinė seka susijusi su branduolio kappa B faktoriaus (NF – kB) aktyvinimu. NF – kB aktyvina genų, susijusių su uždegiminio proceso plitimu, raišką. Nustatyta, kad AGER aktyvinimas susijęs su Alzheimerio ligos ir cukrinio diabeto išsivystymu [25 – 28].

AGER koduojančio geno mutacijos, kurias gali lemti oksidacinis stresas, keičia šio receptoriaus struktūrą ir aktyvumą. Iki šiol nustatytos AGER geno mutacijos – vieno nukleotido polimorfizmo (VNP) mutacijos – G82S (rs2070600), -374T/A (rs1800624) ir -429T/C (rs1800625) [29].

Nustatyta, kad rs1800625 mutacijos keičia AGER geno raišką. Rezultatai rodo, kad mutacijos AGER promotoriaus srityje -374 T/A ir -429 T/C susiję su transkripcijos aktyvumo pokyčiais, o G82S polimorfizmas AGER geno 3 egzone yra susijęs su AGER giminingumo ligandams padidėjimu ir išaugusia prouždegiminių mediatorių sinteze ląstelėje [30]. Tolimesni tyrimai rodo, kad polimorfizmas -429T/C (rs1800625) reikšmingai susijęs su sumažėjusiu atsaku į lipopolisasharidą bei naviko nekrozės faktorių (TNF α).

AGER transmembraninio receptoriaus aktyvumo pokyčiai susiję su signalinių kelių, svarbių ląstelės homeostazės, vystymosi ir uždegiminio proceso aktyvinimu.

(16)

1.4 AGER geno mutacijų ryšys su hipofizės adenomos inazyvumu ir aktyvumu

Navikas tai pakitusių, greitai besidauginančių organizmo ląstelių darinys. Navikai paprastai pradeda augti jau pakitusiame audinyje, toks audinys vadinamas proliferaciniu, o procesas ikinavikiniu.

Aktyvi adenoma tai nekontroliuojamai auganti, gaminanti biologiškai aktyvias medžiagas, padedančias išlikti ir apsisaugoti nuo imuninės sistemos. Naviko augimo aktyvumas yra susijęs su pakitusia imunine sistema. Esant imunosupresijai, nevyksta visavertis imuninis atsakas ir organizmas neapsisaugo nuo navikinkių ląstelių augimo ir dauginimosi progresavimo [31]. Yra žinoma keli HA aktyvumui įtakos turintys imunogenetiniai veiksniai. AIP genas – tumoro supresorius, tačiau susijungdamas su specifiniais receptoriais hipofizėje, aktyvuoja HA vystymosi mechanizmą [32, 33]. GADD45B baltymas tumoro supresorius, esant jo trūkumui HA augimas greitėja. Kitaip nei GADD45B [34], PTTG trūkumas slopina ląstelių proliferaciją, taip mažindamas HA vystymąsi [35]. p53 ir miRNR tumoro supresorių baltymai siejami su hipofizės neoplazija, navikinių ląstelių proliferacija [36 - 38].

Navikas augant ir didėjant peržengia vieno organo ar audinio ribas. Toks augimas vadinamas invazyviu, naikinančiu aplinkinius audinius, kraujagysles. Invazyvus augimas dažniausiai susijęs su sunkiomis ligos komplikacijomis tokiomis kaip kraujavimas ar perforacija [31]. Imunogenetiniai veiksniai, turintys įtakos HA invazyvumui: MMP – 9 (matrikso metaloproteinazė9) skatina naviko invaziją ir metastazavimą. MMP – 9 yra potencialus biologinis markeris invazinėms HA diagnozuoti [39 - 40]. NCAM – neuronų adhezijos molekulė, jų kiekis koreliuoja su HA augimu ir invazyvumu [41].

AGER geno rs1800625 VNP yra siejamas su uždegiminio proceso aktyvumu, ir turi įtakos ne tik HA ląstelių, bet ir burnos karcinomos proliferacijai ir augimui [42]. Taip pat yra žinomi ir kiti AGER geno polimorfizmai G82S (rs2070600), -374T/A (rs1800624) ir -429T/C (rs1800625) [29]. Šios geno mutacijos taip pat susijusios su audinių uždegimine reakcija vystantis vėžiniams susirgimams [43].

(17)

II. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1 Tyrimo planavimas

Magistro baigiamojo darbo tyrimai atlikti LSMU Veterinarijos akademijoje, Gyvulininkystės technologijų fakultete, Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute. Prieš pradedant šį darbą buvo analizuojamas problemos aktualumas, ieškoma informacijos apie anksčiau atliktus mokslinius tyrimus, aiškinančius hipofizės adenomos etiopatogenezę, nagrinėjami tirti AGER geno pakitimai ir jų ryšys su hipofizės adenoma. Vėliau analizuojamos genetinių tyrimų metodikos ir jos įsisavinamos bei užsakomi reagentai ir laboratorinės priemonės, reikalingos AGER geno rs1800625 vieno nukleotido polimorfizmui nustatyti. Pasinaudojus Kauno regiono biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimu (protokolo Nr.

P2-9, 2003 m.) buvo pradėtas magistro baigiamojo darbo tyrimas.

2.1.1 Tyrimo objektas

Tyrime dalyvavo hipofizės adenoma sergantys pacientai, buvo ištirta 139 asmenys: 53 vyrai ir 86 moterys, kurių amžiaus vidurkis 52,5 metai. Kontrolinė grupė sudaryta iš 200 asmenų: 41 vyro ir 159 moterų, jų amžiaus vidurkis 58 metai.

2.1.2 Tiriamųjų atranka

Tyrimo metu sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinės grupės asmenims buvo ištirtas AGER rs1800625 polimorfizmas. Tiriamųjų imtis sudaryta laikantis šių kriterijų: asmenys yra vyresni nei 18 metų, jiems diagnozuota hipofizės adenoma, nesergantys kitomis onkologinėmis ligomis, jų bendra būklė yra gera ir jie raštiškai sutinka dalyvauti tyrime. Kontrolinė grupė sudaryta pagal kriterijus:

vyresni kaip 18 metų asmenys, raštiškai sutinkantys dalyvauti tyrime, oftalmologiškai sveiki ir nesergantys jokiais lėtiniais ar ūminiais infekciniais ir neinfekciniais susirgimais.

2.2 Deoksiribonukleino rūgšties išskyrimas

Tyrimui kraujas iš pacientų ir kontrolinės grupės asmenų buvo paimtas į vakuuminius mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamino tetraacetatas), kuris neleidžia kraujui sukrešėti.

2.3 DNR išskyrimas naudojant rinkinius

Genominė DNR buvo išskiriama iš periferinio kraujo leukocitų, naudojant rinkinius, kurių sudėtyje yra silikagelio kolonėlės, mėgintuvėliai ir reagentai (“Genomic DNA Purification Kit“,AB Thermo Fisher, Lietuva).

(18)

2.3.1 Pasiruošimas DNR išskyrimui

DNR išskyrimui reikalingos priemonės: automatinės pipetės, 1 – 1000 µl antgaliai, centrifuga, mikrocentrifuga, termomikseris, galintis kaitinti iki 56 laipsnių, vienkartinės pirštinės, plastikiniai 50 ml talpos mėgintuvėliai, Ependorf tipo 2 ml talpos mėgintuvėliai, traukos spinta.

1 lentelė. Reagentai naudoti DNR išskyrimui

Reagentai 50 mėginių

Proteinazės K tirpalas 1,2 ml

Skaidymo tirpalas 11 ml

Lizavimo tirpalas 24 ml

Plovimo buferis I 10 ml

Plovimo buferis II 10 ml

Eliucijos buferis (10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1 mM EDTA)

30 ml

2.4 DNR išskyrimo etapai 2.4.1 Ląstelių lizė

200 µl veninio kraujo, 400 µl lizavimo tirpalo ir 20 µl proteinazės K tirpalo supilame į sterilų 2 ml talpos Eppendorf tipo mėgintuvėlį. Mėginys gerai išmaišomas ir inkubuojamas 10 min. 56 ºC temperatūroje. Išorinė ląstelių membrana yra suardoma. Proteinazė K suardo ląstelės baltymus, branduolio membraną ir inaktyvuoja nukleazes, ardančias DNR.

2.4.2 DNR nusodinimas ant silikagelio kolonėlės membranos

Į lizatą pilame 200 µl 96 % etanolio, gerai sumaišome. DNR nusėda ant membranos. Visą gautą turinį perkėlus į surenkamąjį mėgintuvėlį centrifuguojame 1 min. 6000 aps./min. greičiu. DNR lieka prisitvirtinusi ant kolonėlės membranos.

2.4.3 DNR išvalymas

Naudojant plovimo buferius DNR yra išvaloma nuo baltyminių liekanų, druskų ir reagentų. Į kolonėlę pilama 500 µl plovimo buferio I, šis mėginys centrifuguojamas 1 min. 8000 aps./min. greičiu.

Tada įpilama 500 µl buferio II, centrifuguojama 3 min. 12000 aps./min. greičiu.

2.4.4 DNR išplovimas iš kolonėlės

Lizuojamos ląstelės surenkamos ant filtrų ir yra išplaunamos iš kolonėlės panaudojant eliucijos buferį, kurio įpilama 75 µl, tada inkubuojama 2 min. kambario temperatūroje ir centrifuguojama 1 min.

8000 aps./min. greičiu.

(19)

2.5 DNR koncentracijos matavimas

Išskyrus DNR būtina nustatyti jos kiekį ir grynumą. Šio tyrimo metu buvo naudojamas spektrofotometrinis metodas (“Agilent Technologies, Cary 60 UV – Vis” spektrofotometras). Optinių tankių (260 nm/280 nm) santykis rodo DNR tirpalų švarumą. Jis turi būti lygus arba didesnis už 1,8. Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Jei tirpale priemaišų daugiau, reikia pakartotinai valyti DNR.

2.6 Polimerazės grandinės reakcija

Geno polimorfizmo nustatymas buvo atliktas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu (TL–PGR). Amplifikuojamas žmogaus AGER rs1800625 geno fragmentas. PGR yra metodas, kuris leidžia amplifikuoti trumpas DNR sekas in vitro. TL–PGR procedūrą sudaro TL-PGR mėginių paruošimas, amplifikacija ir PGR reakcijos produktų detekcija bei analizė (2 lentelė).

2 lentelė. Reagentai ir jų kiekiai TL – PGR reakcijos mišiniui paruošti

Reagentai Kiekis vienam

pavyzdžiui TagMan® Universal Master Mix II (Applied

Biosystems, JAV) 5,0 µl

Vanduo be nukleazių Ambion® (Thermo Fisher

Scientific, JAV) 3,5 µl

Genui specifiniai pradmenys ir molekuliniai zondai su fluorescuojančiais dažais VIC ir FAM (TaqMan®Gene Expression Assay Mix)

0,5 µl

Tiriamųjų DNR darbiniai tirpalai 1 µl

Pagrindiniai TL–PGR komponentai: genominė DNR, universalus genotipavimo mišinys (TagMan Universal PCR Master Mix) ir pradmenys su molekuliniais zondais (SNP Genotypimg Assay).

AGER geno polimorfizmas nustatomas ABI 7900HT (Applied Biosystems) TL – PGR aparatu.

2.6.1 Mėginių paruošimas genotipavimui

Į optinės reakcijos plokštelės šulinėlius įpilama po 9 µl reakcijos mišinio, tada – po 1 µl tiriamos DNR ir ant plokštelės užklijavus apsauginę plėvelę, plokštelė 2–3 min. yra laikoma centrifugoje. Tada ji uždengiama optiniu kompresiniu kilimėliu ir dedama į TL–PGR aparatą.

Nustatomos dvi programos: standartinė kreivė (angl. Standart Curve – AQ) ir alelio diskriminacija (angl. Allelic Discrimination – AD). Pasirenkama 40 ciklų.

(20)

2.6.2 TL – PGR sudaro trys cikliškai pasikartojantys etapai

1. DNR denatūracija, vykdoma 94 – 95ºC temperatūroje. Jos metu, nutrūksta vandenilinės jungtys tarp azotinių bazių. DNR grandinės atsiskiria viena nuo kitos.

2. Pradmenų hibridizacija vyksta 40 - 60ºC temperatūroje. Pradmenų hibridizacijos metu pradmenys vandenilinėmis jungtimis jungiasi prie jiems komplementarių dauginamos DNR sričių.

3. Elongacija. Šis procesas vyksta 72ºC temperatūroje. Šią reakciją katalizuoja fermentas Taq polimerazė. Šio etapo metu polimerazė sintetina DNR grandinę, kuri yra komplementari matricinei grandinei.

Grandinė sintetinama iš mononukleotidų, kurie pridedami į terpę. DNR kiekis, kartojant denatūraciją, hibridizaciją ir elongaciją didėja eksponentiškai.

2.7 Statistinė duomenų analizė

Naudojant programą „IBM SPSS Statistics“ buvo išanalizuoti ir apskaičiuoti tyrimo duomenys. Duomenys pateikti lentelėse kaip realieji skaičiai (procentais). AGER geno polimorfizmo požymių statistiniams pasireiškimams vertinti taikytas χ² (chi-kvadrato kriterijus). Skirtumai laikyti statistiškai reikšmingais, jei p reikšmė (reikšmingumo lygmuo) < 0, 05.

(21)

III. REZULTATAI

Buvo sudarytos dvi tiriamųjų grupės: pacientai, sergantys HA ir kontrolinės grupės asmenys.

Tiriamųjų charakteristika pateikta 3 lentelėje.

3 lentelė. Tiriamųjų charakteristika

Charakteristika

Sergantys HA n (%) (n=139)

Kontrolinė grupė n (%) (n=200)

Viso:

n (%) (n=339) Vyrai 53 (38,1) 41 (20,5) 94 (27,7) Moterys 86 (61,9) 159 (79,5) 245 (72.3)

HA – hipofizės adenoma.

Nustatėme AGER geno rs1800625 VNP. Buvo įvertinti šio polimorfizmo genotipų dažniai pacientų, sergančių hipofizės adenoma grupėje ir kontrolinėje grupėje, (4 lentelė). Nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant alelių dažnius tiriamųjų grupėse: A alelis sergančiųjų grupėje sudaro 79,1

%, G alelis 20,9 %, kontrolėje atitinkamai 85,5 % ir 14,5 %, p=0,038.

4 lentelė. AGER rs1800625 geno polimorfizmų dažnis pacientams, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje

Genas Genotipas

Dažnis n (%) Sergantys

HA n (%) (n=139)

p vertė

AGER rs1800625

AA 89 (64,0) 146 (73,0) 0,094

AG 42 (30,2) 50 (25,0) 0,321

GG 8 (5,8) 4 (2,0) 0,078

Alelis

A 220 (79,1) 342 (85,5)

0,038

G 58 (20,9) 58 (14,5)

HA – hipofizės adenoma, PI – pasikliautinas intervalas; p vertė - reikšmingumo lygmuo, skirtumai statistiškai reikšmingais laikomi, kai p < 0,05.

Atlikus AGER rs1800625 genotipų dvinarę logistinę regresinę analizę, statistiškai reikšmingų rezultatų nenustatyta, (5 lentelė).

(22)

5 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė Modelis Genotipas/alelis GS (95 %, PI) p reikšmė Recesyvinis GG 2,99 (0,883; 10,140) 0,078 Dominantinis AG+GG 1,519 (0,953;2,421) 0,78

Adityvinis G 1,299 (0,801; 2,106) 0,289

GS - galimybių santykis, PI – pasikliautinas intervalas; p - reikšmingumo lygmuo p<0,05.

Vertinant AGER rs1800625 polimorfizmo dažnį pagal tiriamųjų lytį, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta. Duomenys pateikti 6 lentelėje.

6 lentelė. AGER rs1800625 geno polimorfizmų dažnis pacientams, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį

Genas Genotipas

Vyrai

p reikšmė

Moterys

p reikšmė Sergantys

HA n (%)

Kontrolinė grupė n (%)

Sergantys HA n (%)

Kontrolinė grupė n (%)

AGER rs1800625

AA 34 (64,2) 31 (75,6) 0,267 55 (64,0) 115 (72,3) 0,192 AG 17 (32,1) 9 (22,0) 0,354 25 (29,1) 41 (25,8) 0,651

GG 2 (3,8) 1 (2,4) 1 6 (7,0) 3 (1,9) 0,069

Viso 53 (100) 41 (100) 86 (100) 159 (100)

Alelis

A 85 (80,1) 71 (86,6)

0,328 135 (78,4) 271 (85,2)

0,078 G 21 (19,8) 11 (13,4) 37 (21,5) 47 (14,8)

HA - hipofizės adenoma; p - reikšmingumo lygmuo, p < 0,05.

Atlikus dvinarę logistinę regresiją, moterų ir vyrų grupėse, statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo nustatyta. Duomenys pateikti 7 ir 8 lentelėse.

(23)

7 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė moterų grupėje Modelis Genotipas GS (95 % PI) p reikšmė

Recesyvinis GG 3,900 (0,950; 16,004) 0,059 Dominantinis AG+GG 1,473 (0,841; 2,581) 0,176 Adityvinis G 1,180 (0,657; 2,118) 0,580

GS - galimybių santykis, PI – pasikliautinas intervalas; p - reikšmingumo lygmuo p<0,05

8 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė vyrų grupėje Modelis Genotipas GS (95 % PI) p reikšmė

Recesyvinis GG 1,569 (0,137; 17,923) 0,717 Dominantinis AG+GG 1,732 (0,699; 4,292) 0,235 Adityvinis G 1,679 (0,657; 4,289) 0,279

Nustatėme, kad tiriamųjų pacientų grupėje mikroadenoma serga 15 vyrų ir 34 moterys, makroadenoma atitinkamai 38 vyrai ir 52 moterys. Charakteristika pateikta 9 lentelėje.

9 lentelė. HA charakteristika pagal adenomas dydį

HA dydis

Vyrai, n (%) (n=53)

Moterys, n (%) (n=86)

Viso n (%) (n=139) Mikroadenoma 15 (28,3) 34 (39,5) 49 (35,2) Makroadenoma 38 (71,7) 52 (60,5) 90 (64,7)

Nagrinėjant AGER rs1800625 genotipų ir alelių dažnius sergantiems HA atsižvelgiant į augimą, nustatyta, jog G alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis mikroadenoma sergančių grupėje (25,5

%) nei kontrolinėje grupėje (14,5 %), p=0,0147. AA genotipas statistiškai reikšmingai dažnesnis kontrolinėje grupėje (73,0 %) nei mikroadenoma sergančių grupėje (57,1 %), p=0,037. Duomenys pateikti 13 lentelėje.

(24)

10 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dažnis tiriamiesiems sergantiems HA atsižvelgiant į hipofizės adenomos augimą

Genas Genotipas

Dažnis (%) Makroadenoma

sergantieji n (%) (n=90)

Mikroadenoma sergantieji

n (%) (n=49)

AGER rs1800625

AA 61 (67,0) 28 (57,1) 146 (73,0)

AG 25 (27,5) 17 (34,7) 50 (25,0)

GG 4 (4,4) 4 (8,2) 4 (2,0)

Alelis

A 147 (81,7) 73 (74,5) 342 (85,5)

G 33 (18,3) 25 (25,5) 58 (14,5)

p vertė – reikšmingumo lygmuo, skirtumai statistiškai reikšmingais laikomi, kai p < 0,05.

Atlikus AGER rs1800625 dvinarę logistinę regresiją atsižvelgiant į HA augimą, nustatyta, jog galimybę susirgti mikroadenoma GG genotipas, lyginant su AA+AG genotipais kartu, didina 4,4 karto (GS=4,356; 95 % PI: 1,049; 18,078; p=0,043). AG+GG genotipai kartu, lyginant su AA genotipu, šią galimybę didina 2 kartus (GS=2,028; 95 % PI: 1,063; 3,870; p=0,032). Taip pat G alelis galimybę susirgti mikroadenoma didina 2 kartus (GS=1,992: 95 % PI: 1,166; 3,404; p=0,012). Duomenys pateikti 11 lentelėje.

11 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė pagal hipofizės adenomos augimą

Genas Augimas Modelis Genotipas GS (95 % PI) p reikšmė

AGER rs1800625

Mikroadenoma Recesyvinis GG 4,356 ( 1,049; 18,078) 0,043 Dominantinis AG+GG 2,028 (1,063; 3,870) 0,032 Adityvinis G 1,992 (1,166; 3,404) 0,012 Makroadenoma Recesyvinis GG 2,279 (0,557; 9,325) 0,252 Dominantinis AG+GG 1,285 (0,748; 2,208) 0,363 Adityvinis G 1,316 (0,827; 2,096) 0,247

GS - galimybių santykis, PI – pasikliautinas intervalas, p - reikšmingumo lygmuo p<0,05.

Nagrinėjant HA sergančiųjų grupę, kurią sudaro 139 asmenys, nustatyta, kad aktyvia HA serga 18 vyrų ir 59 moterys, makroadenoma atitinkamai 35 vyrai ir 27 moterys. Charakteristika pateikta 12

(25)

12 lentelė. Hipofizės adenomas aktyvumo charakteristika

HA aktyvumas

Vyrai, n (%) (n=53)

Viso:

n (%) (n=139) Aktyvi HA 18 (34,0) 59 (68,6) 77 (55,4) Neaktyvi HA 35 (66,0) 27 (31,4) 62 (44,6)

Nagrinėjant AGER rs1800625 genotipų ir alelių dažnius sergantiems HA atsižvelgiant į aktyvumą, nustatyta, jog G alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis neaktyvios HA grupėje (26,6

%) nei aktyvios HA grupėje (16,2 %), p=0,038. Taip pat G alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis (26,6 %) neaktyvios HA grupėje nei kontrolinėje grupėje (14,5 %), p=0,0027. Duomenys pateikti 13 lentelėje.

13 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dažnis tiriamiesiems sergantiems HA atsižvelgiant į hipofizės adenomos aktyvumą

Genas Genotipas

Dažnis (%) Aktyvios HA

grupė n (%) (n=77)

Neaktyvios HA grupė n (%) (n=62)

AGER rs1800625

AA 55 (71,4) 34 (54,8) 146 (73,0)

AG 19 (24,7) 23 (37,1) 50 (25,0)

GG 3 (3,9) 5 (8,1) 4 (2,0)

Alelis

A 129 (83,8) 91 (73,4) 342 (85,5)

G 25 (16,2) 33 (26,6) 58 (14,5)

HA – hipofizės adenoma, p vertė – reikšmingumo lygmuo, skirtumai statistiškai reikšmingais laikomi, kai p < 0,05.

Nagrinėjant AGER rs1800625 genotipų dvinarę logistinę regresiją atsižvelgiant į HA aktyvumą, GG genotipas 4 kartus didina tikimybę susirgti neaktyvia HA, p=0,034, dominantinio modelio AG+GG genotipai kartu 2,2 karto didina riziką susirgti neaktyvia HA, p=0,008, G alelis 2 kartus didina riziką susirgti neaktyvia HA, p=0,003. Duomenys pateikti 14 lentelėje.

(26)

14 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė pagal hipofizės adenomos aktyvumą

Genas Aktyvumas Modelis Genotipas GS (95 % PI) p reikšmė

AGER rs1800625

Neaktyvi Recesyvinis GG 4,298 (1,117; 16,538) 0,034 Dominantinis AG+GG 2,227 (1,235; 4,015) 0,008 Adityvinis G 2,119 (1,294; 3,471) 0,003 Aktyvi Recesyvinis GG 1,986 (0,434; 9,089) 0,376 Dominantinis AG+GG 1,081 (0,603; 1,941) 0,793 Adityvinis G 1,139 (0,687; 1,889) 0,613

Nagrinėjant HA sergančiųjų grupę, kurią sudaro 139 asmenys, nustatyta, kad invazyvia HA serga 35 vyrai ir 47 moterys, o neinvazyvia serga 18 vyrų ir 39 moterys. Charakteristika pateikta 15 lentelėje.

15 lentelė. HA invazyvumo charakteristika

HA invazyvumas

Vyrai, n(%) (n=53)

Moterys, n(%) (n=86)

Viso:

n(%) (n=139) Invazyvi HA 35 (66,0) 47 (54,7) 82 (59,0) Neinvazyvi HA 18 (34,0) 39 (45,3) 57 (41,0)

Nagrinėjant AGER rs1800625 genotipų dažnį sergantiems HA atsižvelgiant į invazyvumą statistiškai reikšmingų duomenų nenustatyta. Duomenys pateikti 16 lentelėje.

(27)

16 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dažnis tiriamiesiems sergantiems HA atsižvelgiant į hipofizės adenomos invazyvumą

Genas Genotipas

Dažnis (%) Invazyvi HA

n (%) (n=82)

Neinvazyvi HA n (%) (n=57)

AGER rs1800625

AA 51 (62,2) 38 (66,7) 146 (73,0)

AG 27 (32,9) 15 (26,3) 50 (25,0)

GG 4 (4,9) 4 (7,0) 4 (2,0)

Alelis

A 129 (78,6) 91 (79,8) 342 (85,5)

G 35 (21,3) 23 (20,2) 58 (14,5)

Analizuojant AGER rs1800625 dvinarę logistinę regresiją atsižvelgiant į HA invazyvumą, statistiškai reikšmingų duomenų nenustatyta (17 lentelė).

17 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė pagal hipofizės adenomos invazyvumą

Genas Invazyvumas Modelis Genotipas GS (95 % PI) p reikšmė

AGER rs 1800625

Neinvazyvi Recesyvinis GG 3,698 (0,895; 15,280) 0,071 Dominantinis AG+GG 1,352 (0,718; 2,546) 0,351 Adityvinis G 1,464 (0,866; 2,477) 0,155 Invazyvi Recesyvinis GG 2,513 (0,613; 10,298) 0,200 Dominantinis AG+GG 1,643 (0,953; 2,833) 0,074 Adityvinis G 1,599 (1,000; 2,555) 0,050

Nagrinėjant HA sergančiųjų grupę, nustatyta, kad pasikartojančia HA serga 13 vyrų ir 16 moterų, nepasikartojančia HA serga atitinkamai 40 vyrų ir 70 moterų. Charakteristika pateikta 18 lentelėje.

(28)

18 lentelė. HA pasikartojimo charakteristika (AGER rs1800625)

HA pasikartojimas

Vyrai, n (%) (n=53)

Viso:

n (%) (n=139) Pasikartojanti HA 13 (24,5) 16 (18,6) 29 (20,8) Nepasikartojanti HA 40 (75,5) 70 (81,4) 110 (79,1)

Nagrinėjant AGER rs1800625 genotipų ir alelių dažnius sergantiems HA atsižvelgiant į pasikartojimą, nustatyta, jog rizikos G alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis pasikartojančios HA grupėje (33,3 %) nei kontrolinėje grupėje (14,5 %), p=0,0006. Taip pat AA genotipas buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis kontrolinėje grupėje (73,0 %) nei pasikartojančios HA grupėje (51,7 %), p=0,028.

AG genotipas buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis pasikartojančios HA grupėje (48,3 %) nei kontrolinėje grupėje (25,0 %), p=0,013. Lyginant nepasikartojančios HA dažnį su kontroline grupe, nustatyta, kad GG genotipas statistiškai reikšmingai dažnesnis nepasikartojančios HA grupėje (7,3 %) nei kontrolinėje grupėje (2,0 %), p=0,03. Duomenys pateikti 19 lentelėje.

19 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dažnis tiriamiesiems sergantiems HA atsižvelgiant į hipofizės adenomos pasikartojimą.

Genas Genotipas

Dažnis (%) Pasikartojanti

HA n (%) (n=29)

Nepasikartojanti HA n (%) (n=110)

AGER rs1800625

AA 15 (51,7) 74 (67,3) 146 (73,0)

AG 14 (48,3) 28 (25,5) 50 (25,0)

GG - 8 (7,3) 4 (2,0)

Alelis

A 44 (66,7) 176 (80,0) 342 (85,0)

G 22 (33,3) 44 (20,0) 58 (14,5)

Nagrinėjant AGER rs1800625 genotipų dvinarę logistinę regresiją atsižvelgiant į HA pasikartojimą, GG genotipas, lyginant su AA+AG genotipais kartu, didina galimybę susirgti nepasikartojančia HA 3,8 karto (GS=3,843; 95 % PI: 1,130; 13,068; p= 0,031). AG +GG genotipai kartu,

(29)

lyginant su AA genotipu didina galimybę susirgti pasikartojančia HA 2,5 karto (GS=2,523; 95 % PI:

1,142; 5,574; p=0,022). Duomenys pateikti 20 lentelėje.

20 lentelė. AGER rs1800625 genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė pagal hipofizės adenomos pasikartojimą.

Genas Pasikartojimas Modelis Genotipas GS (95 % PI) p reikšmė

AGER rs1800625

Nepasikartojanti Recesyvinis GG 3,843 (1,130;

13,068) 0,031

Dominantinis AG+GG 1,315 (0,793; 2,182) 0,288 Adityvinis G 1,432 (0,943; 2,173) 0,092

Pasikartojanti Recesyvinis GG 0(-) 0,999

Dominantinis AG+GG 2,523 (1,142; 5,574) 0,022 Adityvinis G 1,972 (0,980; 3,968) 0,057

(30)

IV. REZULTATŲ APTARIMAS

Hipofizės adenomos etiopatogenezė ir su jos vystymusi susiję rizikos veiksniai nėra iki galo žinomi. Pastaraisiais metais vis daugiau dėmesio yra skiriama genetiniams veiksniams, kurie gali turėti įtakos HA vystymuisi. Iš viso yra žinomi 4 AGER geno polimorfizmai, iš kurių dažniausiai yra nagrinėjami šie trys: Gly 82 Ser, -374T/A ir -429T/C. Šiame moksliniame darbe buvo tiriama AGER rs1800625 geno vieno nukleotido polimorfizmo įtaka hipofizės adenomos išsivystymui.

Kitų mokslininkų anksčiau atliktuose tyrimuose yra pastebėta sąsaja tarp AGER geno ir vėžinių susirgimų vystymosi. Kinijoje, 2016 metais, buvo atliktas tyrimas, kurio metu nustatyta, kad AGER geno homozigotinis kodominantinis variantas yra vienas iš rizikos veiksnių, turinčių įtakos vėžio vystymuisi, ypač tarp Azijos gyventojų [44]. Tačiau kitame tyrime, kurį 2017 metais atliko Irano mokslininkai, sąsajų tarp AGER geno -429C/T -374T/A ir 63–bp polimorfizmų ir limfoblastinės leukemijos išsivystimo nebuvo rasta [45]. 2008 metais nustatyta, kad AGER genas yra susijęs su audinių uždegimine reakcija ir epidermio hiperplazija vystantis odos vėžiui [43]. AGER geno ir vėžinių susirgimų sąsajos buvo tiriamos ir Korėjos mokslininkų. Autoriai ištyrė 1096 vyrus ir 580 moterų ir nustatė, kad AGER geno G82S genotipas yra susijęs su TNF alfa ir C reaktyvinio baltymo (CRB) kiekio padidėjimu.

Asmenims, turintiems S/S genotipą nustatyti didesni kiekiai TNF alfa ir CRB nei pas tuos, kurių genotipai G/G ar G/S [28]. 2007 metais atliktame tyrime, buvo patvirtina, kad AGER genas yra susijęs su vėžio progresavimu ir metastazių vystymusi [46]. Autoriai nustatė AGER geno produktų isoformas, moterims sergančioms krūties vėžiu, ir pastebėjo teigiamą koreliaciją, tarp tirpios AGER izoformos (sAGER) kiekio padidėjimo ir geresnės vėžio baigties [26]. Taip pat 2017 metais atlikto tyrimo metu nustatyta, kad pakitęs AGER genas slopina krūties vėžio augimą, mažina naviko angiogenezę, uždegiminių ląstelių ir žymiai sumažino metastazavimą į plaučius ir kepenis [47]. Galliera ir kt.pastebėjo, kad pas sveikus žmones AGER geno S varianto yra daugiau, nei pas sergančiuosius. Šiame tyrime taip pat buvo nustatyta, kad ši izoforma pasižymi citoprotekciniu poveikiu bei sumažina metastazių susidarymą kauliniame audinyje. Tyrime buvo lyginami sveiki asmenys ir sergantys pirminiais bei metastazavusiais navikais. Ženkliai mažesnis sAGER kiekis buvo rastas pas tiriamuosius su metastazavusiu ir pirminiu naviku nei pas sveikus žmones [48]. 2017 metais Rahimi ir kt. atlikto tyrimus, kuriuose buvo tiriamos sąsajos tarp AGER geno polimorfizmo ir kiaušidžių vėžio. Pastebėtas ryšys tarp AGER ekspresijos, naviko dydžio, angiogenezės ir vėžio stadijos [49]. Atliktas tyrimas, kurio metu įrodyta, jog mutavęs AGER genas susijęs su didėjančia mioblastų proliferacija, migracija ir invazyvumu ir slopina ląstelių apoptozę. Visi šie veiksniai skatina aktyvios ir invazyvios mioblastomos vystymąsi [50].

(31)

Kaip ir jau minėtuose tyrimuose, taip ir šiame darbe, buvo nagrinėtas AGER geno vieno nukleotido polimorfizmas ir jo įtaka naviko formavimuisi – hipofizės adenomai. Buvo nustatytas AGER rs1800625 geno vieno nukleotido polimorfizmas, įvertinti šio polimorfizmo genotipų dažniai pacientų, sergančių HA ir kontrolinėje grupėse. Tyrimo metu buvo nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant alelių dažnius tiriamųjų grupėse: A alelis sergančiųjų grupėje sudaro 79,1 %, G alelis – 20,9 %, kontrolinėje grupėje atitinkamai 85,5 % ir 14,5 %. Matoma, kad rizikos alelis G dažnesnis sergančiųjų HA grupėje. Nagrinėjant hipofizės adenomos augimą nustatyta, kad G alelis statistiškai reikšmingai dažniau aptinkamas mikroadenoma sergančiųjų grupėje (25,5 %) nei kontrolinėje grupėje (14,5 %), o AA genotipas, kuriame nėra rizikos alelio G, dažniau aptinkamas kontrolinėje grupėje (73,0 %), nei sergančiųjų hipofizės mikroadenoma grupėje (57,1 %). Atlikus AGER rs1800625 dvinarę logistinę regresiją atsižvelgiant į HA augimą, nustatyta, jog galimybę susirgti mikroadenoma GG genotipas, lyginant su AA+AG genotipais kartu, didina 4,4 karto. AG+GG genotipai kartu, lyginant su AA genotipu, šią galimybę didina 2 kartus, o kiekvienas G alelis 2 kartus padidina galimybę susirgti mikroadenoma. Nagrinėjant AGER rs1800625 genotipų ir alelių dažnius sergantiems HA, atsižvelgiant į jos aktyvumą, nustatyta, kad G alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis neaktyvios HA grupėje (26,6 %) nei aktyvios HA grupėje (16,2 %) ir kontrolinėje grupėje (14,5 %). Apskaičiuota, kad GG genotipas 4 kartus, o AG+GG genotipai kartu 2,2 karto didina riziką susirgti neaktyvia HA. Statistiškai, G alelis 1,9 karto didina riziką susirgti neaktyvia HA. Toliau buvo nagrinėjama AGER geno rs1800625 įtaka hipofizės adenomos pasikartojimams. Nustatyta, kad G alelis ir AG genotipas buvo dažnesnis pasikartojančios HA grupėje (33,3 % ir 48,3 %) nei kontrolinėje grupėje (14,5 % ir 25 %). Kitaip nei G alelis ir AG genotipas, AA genotipas buvo dažnesnis kontrolinėje grupėje (51,7 %) nei pasikartojančios HA grupėje (73 %). Lyginant nepasikartojančios HA dažnį su kontroline grupe, nustatyta, kad GG genotipas dažnesnis nepasikartojančios HA grupėje (7,3 %) nei kontrolinėje grupėje (2 %). Remiantis šiais duomenimis buvo paskaičiuota, kad GG genotipas, lyginant su AA+AG genotipais kartu, didina galimybę susirgti nepasikartojančia HA 3,8 karto, o AG+GG genotipai kartu, lyginant su AA genotipu didina galimybę susirgti pasikartojančia HA 2,5 karto.

Lietuvoje AGER geno polimorfizmo sąsajos su HA anksčiau nebuvo tirtos. Šiame tyrime buvo nustatytas ryšys tarp AGER geno ir naviko formavimosi. Pastebėtas ryšys tarp AGER geno rs1800625 vieno nukleotido polimorfizmo ir HA formavimosi, dydžio ir pasikartojimo. Panašius rezultatus gavo ir kitų šalių tyrėjai.

(32)

V. IŠVADOS

1. Nustatytas AGER geno rs1800625 polimorfizmo dažnumas: sergančiųjų grupėje AA genotipas sudarė 64,0 %, AG 30,2 %, GG 5,8 %, atitinkamai kontrolinėje grupėje 73,0 %, 25,0 %, 2,0

%. Statistiškai reikšmingai skiriasi alelių dažnumas: sergančiųjų grupėje A alelis sudaro 79,1 %, G - 20,9 %, kontrolinėje grupėje atitinkamai 85,5 % ir 14,5 %.

2. Statistiškai reikšmingų AGER geno rs1800625 VNP sąsajų su hipofizės adenomos invazyvumu nenustatyta.

3. Įvertinę AGER geno rs1800625 polimorfizmo sąsajas su hipofizės adenomos aktyvumu, recidyvumu ir augimu nustatėme:

a) atsižvelgiant į HA aktyvumą, GG genotipas 4 kartus, AG+GG genotipai kartu 2,2 karto, o G alelis 2 kartus padidina riziką susirgti neaktyvia HA.

b) atsižvelgiant į HA recidyvumą, GG genotipas didina galimybę susirgti nerecidyvia HA 3,8 karto, o AG+GG genotipai kartu didina galimybę susirgti recidyvia 2,5 karto.

c) atsižvelgiant į HA augimą, G alelis 2 kartus, AG+GG genotipai kartu 2 kartus, o GG genotipas 4,4 karto didina riziką susirgti hipofizės mikroadenoma.

(33)

VI. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Knispelis R, Vasiliūtė I, Žalinkevičius R, Glebauskienė B, Žilaitienė B, Verkauskienė R. Regos sutrikimai hipofizės adenoma sergantiems pacientams. Lietuvos endokrinologija 2015;23:1–4.

2. Jesser J, Schlamp K, Bendszus M. Pituitary gland tumors. Der Radiologe 2014;54(10):981–988.

3. Ramančiusaitė M, Knispelis R, Žilaitienė B, Verkauskienė R. Clinical characterictics and surgical treatment outcomes of pituitary adenomas. Lietuvos endokrinologija 2015;23(4):50 – 52.

4. Odelia C. Silent Corticotroph Adenomas. Pituitary 2015;18(2);225–231.

5. Horvath E, Kovacs K, Killinger DW, Smyth HS, Singer W. Silent corticotropic adenomas of the human pituitary gland: a histologic, immunocytologic, and ultrastructural study. Journal list Am J Pathol v 1980;98(3):617–638.

6. Kasputytė R, Slatkevičienė G, Liutkevičienė R, Glebauskienė B, Bernotas G, Tamašauskas A.

Changes of visual functions in patients with pituitary adenoma. Medicina 2013;49(3):132–7.

7. Altay T, Krisht KM, Coildwell WT. Sellar and parasellar metastatic tumors. Int J Surg Oncol 2012;1–9.

8. Zeng L, Juan D, Wei G, An QZ, Hai–yan W, Da–lin W et al. Rs1800625 in the receptor for advanced glycation end products gene predisposes to sepsis and multiple organ dysfunction syndrome in patients with major trauma. Crit Care 2015;19(1):6.

9. McDowell DB, Wallace RB, Carnahan RM, Chrischilles EA, Lynch CF, Schlechte JA.

Demographic differences in incidence for pituitary adenoma. Pituitary 2011;14(1):23 – 30.

10. Shozo YMD. Epidemiology of Pituitary Tumors. In Thapar K., Kovacs K., Scheithauer B. W., Lloyd R. V. Diagnosis and management of pituitary tumors 2001;57–69.

11. Stratakis CA, Tichomirowa MA, Boikos S, Azevedo MF, Lodish M, Martari M, et al. The role of germline AIP, MEN1, PRKAR1A, CDKN1B and CDKN 2C mutations in causing pituitary adenomas in a lange cohort of children, adolescent, and patients with genetic syndromes. Clinical genetics 2010;78,457–463.

12. Chahal HS, Stals K, Unterlander M, Balding DJ, Thomas MG, Kumar AV, Basser MG, et al.

AIP mutation in pituitary adenomas in the 18^th century and today. New England journal of medicine 2011;364(1): 43–50.

13. Vasilev V, Daly A, Naves L, Zacharieva S, Becker A. Clinical and genetic aspects of familial isolated pituitary adenomas. Clinics 2012;67(1):37–41.

14. Hofland JL, Lamberts SWJ. Pituitary gland tumors. Human cell culture 1999;1:149–159.

15. Vance ML. Diagnosis, management, and prognosis of pituitary tumors. In: Thapar K, Kovacs K, Scheithauer BW, Lloyd RV. Diagnosis and management of pituitary tumors. Totowa NJ. Humana press 2001;165–172.

(34)

16. Hall WA, Luciano MG, Doppman JL, Patronas NJ, Oldfield EH. Pituitary magnetic resonance imaging in normal human volunteers: occult adenomas in the general population. ANN Iternal Med 1994;120(10):817–820.

17. Ieva AD, Rotondo F, Syro LV, Cusimano MD, Kovacs K. Aggressive pituitary adenomas–

diagnosis and emerging treatments. Nature reviews endocrinology 2014;10:423–435.

18. Šinkūnas K, Rastenytė D, Deltuva PV, Knispelis R, Tamašauskas A. Prolaktiną sekretuojančių hipofizės adenoma transsfenoidinė chirurgija (pagrindiniai rezultatai ir gero baigties prognoziniai kriterijai). Medicina 2007;43(9):691–697.

19. Hong SD, Nam DH, Seol HJ, Choi NY, Kim HY, Chung SK, Dhong HJ. Endoscopic binostril versus transnasal transseptal microscopic pituitary surgery sinonasal quality of life and olfactory function. Am J Rhinol Allergy 2015;29(3):221–225.

20. Rotenberg B, Saunders S, Duggal N. Olfactory outcomes after endoscopic transphenoidal pituitary surgery.The Laryngoscope 2011;121:1611–1613.

21. Li M, Stokke J, D’Anza B, Recinos P, Woodard T, Sindwani R. Olfactory outcomes after endoscopic transsphenoidal pituitary surgery with nasoseptal or nasoseptal “rescue” flap: a systematis review. Journal of Neurological surgery part B 2016;77-78.

22. Richard W. Tsang MD, James D, Brierley MB, Tony PM, Mary K, Gospodarowicz MD, Simon B, Sutcliffe MD, Simpson WJ. Radiation therapy for pituitary adenoma: treatment outcome and prognostic factors. Internal journal of radiation oncology 1994;30(3):557–565.

23. Minniti G, Traish D, Ashley S, Gonslaves A, Brada M. Risk of second brain tumor after conservative surgery and radiotherapy for pituitary adenoma:update after and additional 10 years. J clin Endocrinology and metabolism 2005;90(2):800–804.

24. Xue J, Ray R, Singer D, Bohme D, Burz DS, Rai V, et al. The receptor for advanced glycation end products (RAGE) specifically recognizes methylglyoxal – derived AGEs. Biochemistry 2014;53(20):3327–3335.

25. Valente T, Gella A, Fernandez–Busquets X, Unzeta M, Durany N. Immunohistochemical analysis of human brain suggests pathological synergism of Alzheimer’s disease and diabetes mellitus.

Neurobiol Dis 2010;37(1): 67–76.

26. Tesarova P, Kalousova M, Jachymova M, Mestek O, Petruželka L, Zima T. Receptor for advanced Glycation end products (RAGE) - soluble from (sRAGE) and gene polymorphismsin patients with breast cancer. Cancer investigation 2007;25:720–725.

27. Guo TJ, Li JC, Qing MB, Jun DJ, Wei WS. Association between RAGE gene polymorphisms and the susceptibility of diabetic nephropathy. Int J Clin exp pathol 2016;9(2):2271–2276.

(35)

28. Yangsoo J, Ji YK, Seok MK, Jung SK, Jey SC, et al. Association of the Gly82Ser polymorphism in the recepor for advanced glycation and products (RAGE) gene with circulating levels of soluble RAGE and inflammatory markers in nondiabetic and nonobese Koreans. Metabol 2007;56:199–205.

29. Fu J, Zuo X, Yin J, Luo X, Li Z, Lin J, et al. Association of Polymorphisms of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts Gene with Schizophrenia in a Han Chinese Population. BioMed Research International 2017;2017:6379639.

30. Hofmann MA, Drury S, Hudson BI, Gleason ME, Qu W, Lu Y, et al. RAGE and arthritis: the G82S polymorphism amplifies the inflammatory response. Genes and Immunity 2002;3(3):123–135.

31. 1. Ruschoff J, Plate K, Bittinger A, Thomas C. Nucleolar organizer regions (NORs): Basic Concepts and Practical Application in Tumor Pathology. Pathology 1989;185(6):878-885.

32. 2. Harvinder S, Chahal HS, Stals K, Unterländer M, Balding DJ, Mark GT, et al. AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today. N Engl J Med 2011;364(1):43–50.

33. 3. Lloyd C, Grossman A. The AIP (aryl hydrocarbon receptor interacting protein) gene and its relation to the pathogenesis of pituitary adenomas. Endocrine 2014;46(3):387–96.

34. 4. Tamura RE, de Vasconcellos JF, Sarkar D, Libermann TA, Fisher PB, Zerbini LF. GADD45 proteins: central players in tumorigenesis. Current Molecular. Medicine 2012;12(5):634–51.

35. 5. Salehi F, Kovacs K, Scheithauer BW, Lloyd RV, Cusimano M. Pituitary tumor-transforming gene in endocrine and other neoplasms: are view and up date. Endocr Relat Can cer 2008;15:721–43.

36. 6. Wierinckx A, Auger C, Devauchelle P, Reynaud A, Chevallier P, Jan M, et al. A diagnostic marker set for invasion, proliferation, and aggressiveness of prolactin pituitary tumors. Endocr Relat Can cer 2007;14:887–900.

37. 7. Sivapragasam M, Rotondo F, Lloyd RV, Scheithauer BW, Cusimano M, Syro LV, Kovacs K.

MicroRNAs in the human pituitary. Endocr Pathol 2011;22:134–43.

38. 8. Stilling G, Sun Z, Zhang S, Jin L, Righi A. MicroRNA ex pression in ACTH-producing pituitary tumors: upregulation of microRNA-122 and -493 in pituitary carcinomas. Endocrine 2010;38:67–75.

39. 9. Qui L, He D, Fan X, Li Z, Liao C, Zhu Y, Wang H. The expression of interleukin (IL)-17 and IL-17 receptor and MMP-9 in human pituitary adenomas. Pituitary 2011;14:266–75.

40. 10. Gong J, Zhao Y, Abdel-Fattah R, Amos S, Xiao A, Lopes MBS, et al. Matrix metallo - proteinase-9, a potential biological marker in invasive pituitary adenomas. Pituitary 2008;11:37–48.

41. 11. Daniel L, Trouillas J, Renaud W, Chevallier P, Gouvernet J, Rougon G, Figarella-Branger D. Polysialylated-neural cell adhesion molecule expression in rat pituitary transplantable tumors (spontaneous mammotropic transplantable tumor in Wistar-Furth rats) is related to growth rate and malignancy. Cancer Res 2000;60:80–5.

(36)

42. 12. Su S, Chien M, Lin C, Chen M, Yang S. RAGE gen polymorphism and environmental factor in the risk of oral cancer. J Dent Res 2015;94(3):403-411.

43. 13. Gebhardt C, Riehl A, Durchdewald M, Nemeth J, Furstenberger G, Decker MK. RAGE signaling sustains inflammation and promotes tumor development. JEM 2008;205(2):275.

44. Sitong L, Xiang T, Maoying H, Xiaowei F, Yonggang Z, Hong F. The receptor for advanced glycation end products gene polymorphisms contribute to cancer susceptibility: evidence from meta - analysis. Int J Clin Exp Med 2016;9(3):5867–5879.

45. Eskandari NE, Hashemi M, Hasani SS, Naderi M, Sadeghi BS, Taheri M. Evaluation of functional RAGE gene polymorphisms in childhood acute lymphoblastic leukemia - A case - control study from Iran. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2017;4;36(3):170–180.

46. Giordano C, Barone I, Vircillo V, Panza S, Malivindi R, Gelsomino L et al. Activated FXR inhibits leptin signaling and counteracts tumor – promoting activities of cancer – associated fibroblasts in breast malignancy. Sci Rep 2016;6:21782.

47. Kwak T, Elger DK, Ergonul A, Miller PC, Braley A, Hwang GH et al. Targeting of RAGE- ligand signaling impairs breast cancer cell invasion and metastasis. Oncogene 2017;36:1559-1572.

48. Galliera E, Marazzi MG, Vianello E, Drago L,Luzzati A, Bendinelli P, Maroni P, Tacchini L, Desiderio MA, Croi RMM. Circulating sRAGE in the diagnosis of osteolytic bone metastasis 2016;30(4):1203–1208.

49. Rahimi F, Karimi J, Goodarzi MT, Saidijam M, Khodadali I, Razavi AN, Nankali M.

Overexpression of receptor for advanced glycation end products (RAGE) in ovarian cancer. Cancer Biomark 2017;18(1):61–68.

50. Riuzzi F, Scorci G, Donato R. The amphoterin (HMGB1)/Receptor for advanced glycation end products (RAGE) pair modulates myoblast proliferation, apoptosis, adhesiveness, migration, and invasiveness, functional inactivation of RAGE in L6 myoblasts results in tumor formation in vivo.

Journal of biological chemistry 2006;281:8242-8253.