LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Rūta Vosyliūtė
IŠEMINIO MIOKARDO ELEKTRINIO
SIGNALO ALTERNAVIMO MECHANIZMŲ
TYRIMAS
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
biologija (01B)
Disertacija rengta 2010–2015 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Membranų biofizikos laboratorijoje.
Mokslinis vadovas
habil. dr. Jonas Jurevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto biologijos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkė
prof. habil. dr. Vaiva Lesauskaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
Nariai:
dr. Liudas Gargasas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biome-dicinos mokslai, biologija – 01B)
prof. dr. Aidas Alaburda (Vilniaus universitetas, biomedicinos mokslai, biofizika – 02B)
prof. dr. Rimantas Daugelavičius (Vytauto Didžiojo universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
dr. Virginijus Valiūnas (Stony Brook University (JAV), biomedicinos mokslai, biofizika – 02B)
Disertacija bus ginama viešame biologijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2015 m. birželio 30 d. 13 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto posėdžių salėje.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Rūta Vosyliūtė
INVESTIGATION OF THE MECHANISMS
OF ISCHEMIA-INDUCED ELECTRICAL
SIGNAL ALTERNANS
Doctoral Dissertation Biomedical Sciences, Biology (01B) Kaunas, 2015
Dissertation has been prepared at Laboratory of Membrane Biophysics, Institute of Cardiology, Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2010–2015.
Scientific Supervisor
Dr. Habil. Jonas Jurevičius (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biology – 02B)
Dissertation is defended at the Biology Research Council of the Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences:
Chairperson
Prof. Dr. Habil. Vaiva Lesauskaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biology – 01B)
Members:
Dr. Liudas Gargasas (Lithuanian University of Health Sciences, Biome-dical Sciences, Biology – 01B)
Prof. Dr. Aidas Alaburda (Vilnius University, Biomedical Sciences, Bio-physics – 02B)
Prof. Dr. Rimantas Daugelavičius (Vytautas Magnus University, Biome-dical sciences, Biology – 01B)
Dr. Virginijus Valiūnas (Stony Brook University (USA), Biomedical Sciences, Biophysics – 02B)
Dissertation will be defended at the open session of the Biology Research Council on June 30th
, 2015, at 1 p.m. in the Institute of Cardiogy of Lithuanian University of Health Sciences.
TURINYS
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
Darbo tikslas ir uždaviniai ... 9
Darbo uždaviniai ... 9
Darbo aktualumas ir naujumas ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai ... 10
1.1.1. Lėtieji potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai ... 11
1.1.2. Greitieji potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai ... 11
1.2. Optinis elektrinio veikimo potencialo registravimo metodas ... 15
1.2.1. Šviesos šaltinių palyginimas ... 16
1.2.2. Fotodetektorių palyginimas ... 17
1.2.3. Kiti elektrinio signalo registravimo optiniu metodu įrenginiai ... 18
1.3. Optinio elektrinio signalo registravimo metodo ribotumai ... 18
1.4. Elektrinis veikimo potencialas ir impulso sklidimas širdyje ... 19
1.5. Širdies aritmijų susidarymo mechanizmai ... 20
1.6. Elektrinio signalo alternavimas ... 22
1.6.1. Veikimo potencialo trukmės ir sklidimo greičio restitucija ... 24
2. METODIKA ... 28
2.1. Širdies izoliavimo procedūros ... 28
2.2. Tirpalai, cheminės medžiagos ir potencialui jautrių fluorescencinių dažų paruošimas ... 30
2.3. Optinių signalų registravimas ... 30
2.4. Elektrinių signalų registravimas ... 32
2.5. Regioninės išemijos sukėlimas ... 34
2.6. Statistinė duomenų analizė ... 35
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 37
3.1. Optinio signalo registravimo metodo pritaikymas darbui su smulkių gyvūnų širdimis ir optimalių sąlygų parinkimas signalo registravimui ... 37
3.1.1. Šviesos šaltinio intensyvumo poveikis širdies audiniui ... 37
3.1.2. Potencialui jautrių fluorescencinių dažų fotoblukimo ir (foto)toksinio poveikio širdies audiniui įvertinimas ... 38
3.2. Optinio signalo teikiamos informacijos įvertinimas ... 44
3.3. Veikimo potencialo alternavimo vystymosi mechanizmų tyrimai ... 45
3.4. Veikimo potencialo trukmės ir veikimo potencialo amplitudės alternavimo vystymasis laiko ir erdvės atžvilgiu ... 48
3.4.1. Sklidimo blokai ... 50 IŠVADOS ... 54 BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 55 PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 63 MOKSLINIAI STRAIPSNIAI ... 66 SUMMARY... 104 CURRICULUM VITAE ... 118 PADĖKA ... 119 6
SANTRUMPOS
BDM 2,3-butandiono monoksimasGPJFD Greitieji potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai LED Šviesą emituojantis diodas
LPJFD Lėtieji potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai NIR Angl. near-infrared, artimas infraraudonam spektrui OVP Optinis veikimo potencialas
OVPA Optinio veikimo potencialo amplitudė OVPT Optinio veikimo potencialo trukmė PJFD Potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai SP Stimuliavimo periodas
TBA T-bangos alternavimas VP Veikimo potencialas
VPA Veikimo potencialo amplitudė VPT Veikimo potencialo trukmė
VP90 Veikimo potencialo trukmė 90 proc. repoliarizacijos lygyje ∆F/F Fluorescencijos pokytis nuo foninio lygio
ĮVADAS
Širdies ir kraujagyslių ligos yra vienos iš pagrindinių mirties priežasčių ne tik Lietuvoje, bet ir visame pasaulyje. Širdies ritmas gali sutrikti dėl įvairių veiksnių, tačiau dažniausiai staigią mirtį nulemia pakitęs elektrinio jaudinimo formavimasis ar sklidimas. Širdies jaudinimo sutrikimų mecha-nizmų supratimas ir tikslus patologijos pažeistos vietos nustatymas – sėkmingas aritmijų gydymo pagrindas. Todėl veiksmingų metodų, leidžian-čių stebėti veikimo potencialo sklidimą širdyje, vystymas yra svarbus kardiologijoje.
T-bangos alternavimas yra reikšmingas širdies ritmo sutrikimų ir staigios mirties žymuo, o alternavimo susidarymo mechanizmų tyrimams jau daugiau kaip tris dešimtmečius yra skiriamas didelis dėmesys (Schwartz ir Malliani, 1975). T-bangos alternavimas gali susidaryti dėl: 1) kas antro (angl. beat-to-beat) veikimo potencialo alternavimo visose miokardo ląstelėse arba 2) 2:1 blokų susiformavimo skirtingose širdies audinio vietose ir sumacijos pasekoje atsiradusio alternavimo.
Neinvaziniai metodai tampa vis populiaresni atliekant širdies elektrofiziologinius tyrimus. Vienas iš dažniausiai naudojamų tyrimuose – optinis elektrinio signalo registravimo metodas (angl. optical mapping), pagrįstas širdies audinio dažymu potencialui jautriais fluorescenciniais dažais. Tokių dažų bangos ilgis gali būti artimas infraraudonam spektrui (angl. near-infrared, NIR) ir jų fluorescencijos signalas gali būti matuoja-mas iš gilių miokardo sluoksnių (Kee ir kt., 2008; Matiukas ir kt., 2006, 2007).
Optiniu būdu užregistruotas signalas teikia informaciją, susumuotą per visą audinio gylį, tačiau signalo pokyčiai skirtinguose audinio sluoksniuose vyksta nevienodai. Naudojant standartinius stiklinius mikroelektrodus, galima registruoti elektrinius signalus iš atskirų ląstelelių, esančių skirtinguose audinio gyliuose. Dviejų metodų kombinacija ir signalų regist-ravimas vienu metu teikia itin tikslius duomenis apie širdies sužadinimą bei sklidimo pokyčius įvairiuose tiriamojo audinio gyliuose.
Tokia dviejų metodų kombinacija gali būti sėkmingai naudojama širdies ritmo sutrikimų ir T-bangos alternavimo mechanizmų tyrimams.
Darbo tikslas ir uždaviniai
Darbo tikslas – ištirti regioninės išemijos sukeltų elektrinių signalų alternavimo mechanizmus, naudojant kompleksinį optinį ir elektrinį širdies jaudinimo registravimo metodą ir įvertinti optinio signalo, registruoto naudojant potencialui jautrius fluorescencinius dažus, teikiamą informaciją apie miokardo jaudinimo sklidimą.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti potencialui jautrių fluorescencinių dažų (foto)toksinį poveikį miokardui ir ištirti, fluorescencinius dažus sužadinančios, didelio intensyvumo šviesos įtaką širdies elektriniam aktyvumui.
2. Įvertinti širdyje sklindančio elektrinio jaudinimo įtaką optinio veikimo potencialo formavimuisi, naudojant kompleksinį optinį ir elektrinį signalo registravimo metodą.
3. Įvertinti elektrinių signalų alternavimo susidarymą laike ir erdvėje išemijos metu, naudojant optinį miokardo jaudinimo metodą.
4. Ištirti optinių veikimo potencialų alternavimo susidarymo mechanizmus regioninės išemijos metu, naudojant kompleksinį optinį ir elektrinį signalo registravimo būdą.
Darbo aktualumas ir naujumas:
Skirtingų potencialui jautrių fluorescencinių dažų (PJFD) jautrumas šviesos šaltinio apšvietimo intensyvumui skiriasi ir turi būti nustatinėjamas kiekvienam PJFD individualiai. Šio darbo metu buvo tirtas sužadinančios šviesos poveikis elektriniams signalams, bei naujai susintetintų potencialui jautrių fluorescencinių dažų (di-4-ANBDQBS) poveikis miokardui. PJFD dažų pritaikymas klinikoje itin reikšmingas, tad atlikti eksperimentai suteikė naujų žinių apie jų panaudojimą širdies elektrofiziologiniuose tyrimuose. Eksperimentuose buvo panaudotas kompleksinis metodas, kai tuo pačiu metu registruojamas optinis signalas ir transmuraliniai viduląsteliniai veikimo potencialai. Toks metodas leido orginaliu būdu įvertinti gylį, iš kurio buvo matuojama fluorescencija, o taip pat padalinti optinio veikimo potencialo priekinį frontą į dvi komponentes atitinkančias elektrinio signalo sklidimo širdyje transmuralinę ir lygiagrečią epikardui komponentes. Eksperimentai su triušių širdimis, sukeliant regioninę išemiją, leido ištirti veikimo potencialo alternavimo susidarymo mechanizmus laiko ir erdvės atžvilgiu, bei įrodyti, kad alternavimas yra 2:1 laidumo blokų audinyje pasekmė.
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai
Optinis elektrinio signalo registravimo metodas (angl. optical mapping) pagrįstas tuo, kad jo metu yra naudojami potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai (toliau PJFD), kurie yra labai lipofiliški ir susikaupia ląstelių membranose. Sklindant elektriniam signalui širdyje, keičiasi membraninis širdies ląstelių potencialas, kuris keičia fluorescencinių dažų švytėjimo intensyvumą. Pokyčiai yra užrašomi ir juos analizuojant galima nustatyti elektrinio signalo sklidimo savybes.
PJFD yra molekulės, kurios rišasi su ląstelių membranomis ir gali keisti savo spektrines savybes priklausomai nuo įtampos pokyčių, tačiau signalas priklauso ne tik nuo dažo, bet ir nuo eksperimentinės sistemos bei protokolo, kuris naudojamas įvertinti signalo pokyčius membranoje (Pratap ir kt., 1990). Yra daugybė fluorescencinių dažų, kurie gali būti naudojami įtampos pokyčiams ląstelės membranoje matuoti. Potencialui jautrius fluorescencinius dažus būtų galima išskirti į keturias dažų klases: rodaminus, merocianinus, cianinus ir oksonolius. Tačiau jie dažniausiai klasifikuojami pagal atsaką į membraninio potencialo pokyčius – į lėtuosius ir greituosius dažus (Waggoner, 1979; Loew, 2010; Grinvald ir Hildesheim, 2004). Tokie dažai turi atitikti tam tikrus reikalavimus (Tritthart, 2005):
1. Turi rištis arba sąveikauti su plazmine membrana ir veikti kaip membranos potencialo sensorius arba judėti per membraną, veikiami membraninio potencialo.
2. Turi duoti didelius fluorescencijos ir/arba absorbcijos pokyčius, dar geriau jei tie pokyčiai bus tiesinės priklausomybės su membranos potencialo pokyčiais.
3. Optinis atsakas turi būti susijęs su potencialo pokyčiais, o ne su jonų koncentracijomis, transmembraninėmis srovėmis ar membranos laidumu.
4. Širdies dažymas su potencialui jautriais fluorescenciniais dažais neturi sukelti farmakologinio ar (foto)toksinio poveikio audiniui.
5. Dažas turi buti optiškai stabilus, t. y. turėti kuo mažesnį fotoblukimą (angl. fotobleaching).
Dažų fluorescencija priklauso nuo dažų agregacijos, molekulinės struktūros ir jos dalių, kuriomis dažai jungiasi prie ląstelės (Sims ir kt., 1974).
1.1.1. Lėtieji potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai
Daugelis lėtųjų potencialui jautrių fluorescencinių dažų (toliau LPJFD) naudojami nuo potencialo priklausančių (krūvių) persiskirstymo mecha-nizmų tyrimams (Hoffman ir Laris, 1974; Chen, 1988; Freedman ir Novak, 1989). Tokie dažai dar vadinami „Nernst‘o“ dažais arba persiskirstymo (angl. redistribution). Ląstelių ir organelių membranos yra pralaidžios tokiems dažams. Iš fluorescencinių dažų LPJFD priklauso cianino ir roda-mino klasės dažai. Kuo geresnis membranos pralaidumas, tuo greičiau dažai prasiskverbia į ląstelės vidų. Lėtieji dažai gali paveikti joninius kanalus ir įvairias ląstelių funkcijas. Lėtųjų dažų šviesos intensyvumas pakinta 1–2 proc., kai membraninis potencialas pakinta vienu milivoltu. Kadangi lėtųjų dažų laiko konstanta yra 1–20 s, jie daugiausiai naudojami mažų ląstelių ir organelių membraninio potencialo įvertinimo eksperimentuose (Waggoner, 1979; Freedman ir Novak 1989; Chen, 1988).
1.1.2. Greitieji potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai
Greitieji potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai (toliau GPJFD) yra molekulės, besirišančios su membrana ir veikiančios kaip keitikliai, transformuojantys membraninį potencialą į optinius signalus.
Eksperimentai su GPJFD parodė, kad laikas, per kurį gaunamas atsakas iš ląstelės, trunka mažiau negu milisekundė. Yra žinoma virš 2000 susintezuotų GPJFD. Išskiriamos 4 GPJFD klasės: 1) Merocianinai-oksazolonai (angl. merocyanine-oxazolone) 2) Merocianinai-rodaninai (angl. merocyanine-rhodanine) 3) Oksonoliai (angl. oxonol) 4) Stiriliniai (angl. styryl) (Ross ir kt., 1977; Cohen ir kt., 1974, Loew ir Simpson 1981). Paminėtų klasių dažų junginiai teikia nuo įtampos priklausomus atsakus iš audinių bei stipriai rišasi su membranomis. Anksčiau atlikti tyrimai parodė, kad optiniu būdu registruoti signalai nepriklauso nuo membraninio laidumo ar srovės (Cohen ir kt., 1974; Ross ir kt., 1977; Gupta ir kt., 1981).
Cohen (Cohen ir kt., 1968) ir Tasaki (Tasaki ir kt., 1968) nepriklausomai vienas nuo kito, naudodami GPJFD, pirmą kartą užregistravo optinius signalus moliuskų aksonuose. Cohen eksperimentuose buvo panaudota virš 800 naujų GPJFD. Barry ir Carnay (1969) pirmieji analizavo šviesos išsklai-dymo pokyčius skeleto raumenyse. Pirmasis sėkmingas bandymas panau-doti GPJFD (Merocyanine 540) varlės kvarkuolės (angl. bullfrog) širdyje buvo atliktas 1976 metais (Salama ir Morad, 1976). Tačiau buvo įrodyta ir tai, kad šis dažas yra toksiškas (Ross ir kt., 1977). Nuo 1976 metų daug naujų greitųjų PJFD buvo ištirta skirtinguose širdies audiniuose.
Loew laboratorijoje buvo susintetinta šimtai PJFD, tarp jų pasaulio laboratorijose plačiai įvairiuose tyrimuose naudojami: di-5-SP, di-4-ANEPPS,
di-8-ANEPPS ir di-4-ANEPPDHO (Loew ir kt., 1978, 1979, 1994; Fisher ir kt., 2008). Visai nesenai buvo susintetinti GPJFD, turintys hemocianino chromoforus, kurių absorbcija ir emisija yra beveik infraraudonos spalvos spektro (raudono spektro pačioje pabaigoje) (Kee ir kt., 2008, Matiukas ir kt., 2006, 2007). Šie dažai dar yra vadinami „mėlynais dažais“, dėl to, kad sugerdami ilgos bangos raudoną šviesą, tampa mėlynos spalvos. Be minėtos Loew laboratorijos, yra keletas kitų laboratorijų, aktyviai sintetinančių GPJFD. Rina Hildesheim jau 25 metus dirba Amiram Grinvald (1986) laboratorijoje ir yra susintetinusi virš šimto GPJFD. RH1691, RH1692 – naujausi sukurti oksonoliai, sugeriantys 630 nm bangos ilgio šviesą, sėkmingai yra panaudoti eksperimentuose in vivo (Derdikman ir kt., 2003).
ANEP (Amino Naphthyl Ethenyl Pyridinium) grupės dažai, priklausantys stirilinių dažų klasei, yra dažniausiai naudojami GPJFD (Deligeorgiev, 2010).
Anksčiau paminėti GPJFD di-4-ANEPPS ir di-8-ANEPPS yra vieni iš svarbiausių stirilinių ANEP grupės dažų, keičiančių transmembraninį potencialą į optinį signalą. Di-4-ANEPPS (sužadinimas 532 nm, emisija 640±50 nm) naudojamas visos širdies eksperimentuose (Loew ir kt., 1992; Rosenbaum ir kt., 1991), eksperimentuose su širdies preparatais (Davidenko ir kt., 1992; Muller ir kt., 1989) ir izoliuotais kardiomiocitais (Ahammer ir kt., 1993; Windisch ir kt., 1991; Rohr ir Salzberg, 1994). Daugelis laboratorijų naudoja šiuos dažus, kadangi jų fluorescencijos pokytis nuo foninio lygio (toliau ∆F/F) yra gana didelis (8–15 proc.), o (foto)toksišku-mas ir fotoblukimas mažas (Loew ir kt., 1992). Tiriant dažų veikimą audiniuose, atsirado kliūčių, nes tokie GPJFD yra sužadinami mėlynai-žaliame šviesos spektre. Šio bangos ilgio šviesą stipriai sugeria audiniuose esančios chromoforų ir hemoglobino molekulės. Tai stabdo šių dažų pritaikymą klinikinėje diagnostikoje. Signalo registracija įmanoma tik fiziologiniu tirpalu perfuzuojamuose objektuose ir tik iš nedidelio audinio gylio (Loew, 2010). Be ANEP grupės dažų yra ir kitų, tokių kaip RH 160, RH 237, RH 421, bet jų ∆F/F nedidelis – nuo 2 iki 6 proc. (Muller ir kt., 1986).
Pastaraisiais dešimtmečiais buvo susintetinti nauji, stirilinių junginių klasei priklausantys GPJFD, sužadinami beveik infraraudonos šviesos spektre – NIR (angl. near-infrared). Tokie dažai, kurie yra sužadinami ilgos bangos šviesoje, kurios nesugeria hemoglobinas, gali būti naudojami krauju perfuzuotų organų tyrimams bei tyrimams iš gilesnių audinio sluoksnių (Salama ir kt., 2005; Kee ir kt. 2008; Matiukas ir kt., 2006, 2007). Lyginant NIR dažus, pavyzdžiui, su di-4-ANEPPS, NIR GPJFD ∆F/F yra didesnis – 20 proc. (Walton ir kt., 2009). Eksperimentuose su širdies audiniais
labiausiai populiarus NIR GPJFD di-4-ANBDQBS (literatūroje dar vadina-mas JPW6033), kurio tiek absorbcijos, tiek emisijos bangos yra daug ilgesnės, negu di-4-ANEPPS ir di-8-ANEPPS, o tai reiškia, kad sužadinta šviesa įsiskverbia į miokardo audinį daug geriau ir daug giliau.
1.1.2.1. Greitųjų potencialui jautrių fluorescencinių dažų veikimo mechanizmai
GPJFD gali reaguoti į potencialo pokyčius dėl skirtingų mechanizmų. Wagonner vienas iš pirmųjų mokslininkų, aprašiusių GPJFD veikimo mechanizmus (Waggoner, 1979): rotacijos-dimero (angl. rotation-dimer), persigrupavimo (angl. „on-off“), elektrochromizmo (angl. electrochromism) ir visiškos rotacijos (angl. pure-rotation). Kituose literatūros šaltiniuose dar minimi tokie dažų veikimo mechanizmai kaip FRET (angl. Fluorescence
resonance energy transfer) (Loew, 2010) ir perskirstymo (angl. redistri-bution) (Tritthart, 2005).
Persigrupavimo (angl. „on–off“) mechanizmas pavaizduotas 1.1.2.1.1 paveiksle. Pasikeitus membraniniam potencialui, dėl dažų persigrupavimo tarp membranos ir išorinio tirpalo, pasikeičia dažo fluorescencija. Teigiamai įkrauti dažai turi geresnę susirišimo konstantą su poliarizuota, nei su depoliarizuota membrana. Neigiamai įkrauti dažai, atvirkščiai, geresnė susirišimo konstanta su depoliarizuota membrana, negu su poliarizuota. Nors tokių dažų jautrumas ir yra didelis, tačiau atsako laikas yra dažnai per lėtas veikimo potencialams registruoti (Tritthart, 2005). Cianino ir oksonolio chromoforus turintys dažai, dažniausiai veikia persigrupavimo mechanizmo principu (Waggoner ir kt., 1979).
1.1.2.1.1 pav. Persigrupavimo (angl. „on-off“) mechanizmas (adaptuota
pagal Loew, 2010)
Persiorientavimo mechanizmas (angl. reorientation) pavaizduotas 1.1.2.1.2 paveiksle. Besikeičiantis elektrinis laukas, nulemia su membrana surišto dažo vertikalios padėties pakeitimą į horizontalią padėtį. Dažo molekulinė aplinka tampa pasikeitusi ir tai sukelia spektrinių dažo savybių
kitimą. Persiorientavimo mechanizmas gali būti labai greitas, tačiau jautrumas yra nedidelis. Šio mechanizmo principu veikia merocianinai (Dragsten ir Webb, 1978).
1.1.2.1.2 pav. Persiorientavimo mechanizmas (adaptuota pagal Loew, 2010)
Fluorescencijos rezonanso energijos pernešimo (angl. Fluorescence
resonance energy transfer, FRET) mechanizmas pavaizduotas 1.1.2.1.3
paveiksle. Donoras fluoroforas, prisikabinęs išoriniame ląstelės membranos paviršiuje, perneša savo energiją šalia esantiems chromoforams akcepto-riams, kurie emituoja ilgesnio bangos ilgio šviesą. Jeigu akceptorius yra neigiamai įkrautas, depoliarizavus membraną jis nutolsta nuo donoro molekulės ir pats donoras emituoja šviesą, kuri yra trumpesnio bangos ilgio nei akceptoriaus (Gonzalez ir Tsien, 1997).
1.1.2.1.3 pav. Fluorescencijos rezonanso energijos pernešimo mechanizmas
(adaptuota pagal Loew, 2010)
Daugelis GPJFD veikia elektrochromizmo principu (1.1.2.1.4 pav.), kai nevyksta joks molekulių judėjimas. Tokiu būdu užtikrinamas greitas atsakas į potencialo pokyčius. Loew laboratorijoje buvo pradėti kurti tokie dažai, kurių chromoforai sąveikauja tiesiogiai su membranos elektriniu lauku. Dažo chromoforas sužadinimo metu pakeičia krūvį ta pačia kryptimi, kaip keičiasi membraninis krūvis VP metu, ir dėl membraninio krūvio įtakos persislenka dažo fotonų emisijos spektras (Loew, 2010).
1.1.2.1.4 pav. Elektrochromizmas (adaptuota pagal Loew, 2010)
E – elektrinis laukas.
1.2. Optinis elektrinio veikimo potencialo registravimo metodas
Optinis elektrinio širdies signalo registravimo metodas (angl. optical
mapping) turi daug privalumų, lyginant su kitomis elektrinio signalo
registravimo metodikomis ir todėl yra plačiai naudojamas daugelyje laboratorijų visame pasaulyje.
Dažas, įvedamas į visą širdį, į širdies audinį ar kardiomiocitus yra sužadinamas skirtingo bangos ilgio šviesa. Fluorescencija, sklindanti nuo epikardinio paviršiaus yra registruojama. Pagrindinis tokio metodo tikslas – pasiekti kiek įmanoma didesnį signalo-triukšmo santykį, tuo pat metu sumažinant neigiamus optinių matavimų efektus, tokius kaip fotoblukimas ir (foto)toksiškumas.
Standartinis optinis elektrinio signalo registravimo metodas pateiktas 1.2.1 paveiksle. Jį sudaro: sužadinimo šviesos šaltiniai, fotodetektoriai, įvairūs filtrai, dichroiniai veidrodžiai, kompiuteriai, programinė įranga.
1.2.1 pav. Optinis elektrinio signalo registravimo metodas (adaptuota pagal
Arora ir kt. 2003)
PJFD – potencialui jautrus fluorescencinis dažas. 1.2.1. Šviesos šaltinių palyginimas
Šviesos šaltiniai – vieni iš svarbiausių elementų, įtakojančių signalo kokybę optinėje sistemoje. Šiuo metu patys populiariausi ir labiausiai naudojami šviesos šaltiniai: volframo halogeninės lempos, lankinės lempos, lazeriai ir šviesą emituojantys diodai (angl. LED). Šviesos šaltiniai eksperimentui turi būti parenkami, atsižvelgiant į apšviečiamo preparato tipą, vaizdinimo plotą, norimą signalo-triukšmo lygį. Dažnai atsižvelgiama ir į kainą.
Nelazeriniai šviesos šaltiniai – volframo halogeninės lempos ir lankinės lempos. Volframo halogeninių lempų galia nuo 100 iki 250 vatų. Jos yra trumpesnio šviesos bangos ilgio negu kiti šviesos šaltiniai. 250 vatų lemputė, kurios matmenys 7×3,5 mm, tinkama apšviesti vidutinio dydžio objektus, tokius kaip, pavyzdžiui, triušio širdis. Volframo halogeninės lempos yra ilgo veikimo laiko, žemo triukšmo lygio ir mažos kainos. Dėl tokių gerų charakteristikų, volframo halogeninėms lempoms eksperimen-tuose turėtų būti teikiama pirmenybė (Fast, 2005).
Lankinės lempos gali būti keleto rūšių: ksenono (Xe), gyvsidabrio (Hg) ir mišrios (Hg/Xe) lempos. Skirtumas nuo volframo halogeninių lempų tas, kad lankinės lempos turi geras dydžio savybes, leidžiančias apšviesti mažus ar vidutinio dydžio objektus. Gyvsidabrio lankinės lempos yra mažesnės už volframo halagonines lempas, tačiau jos yra trumpesnio veikimo laiko ir
daug brangesnės (Parker, 2003). Hg lempų spinduliuotė daug intensyvesnė negu ksenono lempų, tačiau ksenono lempų privalumas – platus emituojamos šviesos diapazonas (nuo 250 nm iki 750 nm). Šių lempų trūkumas tas, kad spektre esanti UV spinduliuotė gali pažeisti akis, todėl reikia vengti žiūrėti į šio tipo lempų skleidžiamą šviesą. Mišrių Hg/Xe lempų privalumas – jose esančio Hg gaunamas didesnis intensyvumas UV srityje, nei veikiant Xe lempoms.
Be lempų, plačiai naudojami ir lazeriai, kurių šviesa yra monochro-matinė, t. y. vienos spalvos (vieno bangos ilgio). Argono jonų lazeriai daugelį metų yra naudojami eksperimentuose dėl didelės spinduliuotės galios ir gebėjimo intensyviai šviesti (Parker, 2003). Lyginant su volframo halogeninėmis ir lankinėmis lempomis, lazerių triukšmo lygis daug žemesnis. Tačiau lazeriai yra brangūs, veikimo laikas yra neilgas, o energijos suvartojimas labai didelis. Naudojant lazerius, turi būti naudojami ir apsauginiai akiniai, o patalpa, kurioje eksperimentuojama, turi būti pažymėta atitinkamais ženklais, įspėjančiais apie tai, jog naudojamas lazeris.
Šviesą emituojantis diodas (angl. LED) – patogus šviesos šaltinis, be to jų energijos sąnaudos daug mažesnės negu lazerių. Lyginant su anksčiau aprašytais šviesos šaltiniais, šviesą emituojantys diodai yra pigesni. Emituojamos šviesos spektas siauresnis negu lempų, bet platesnis negu lazerių, o jų valdymo blokas daug paprastesnis negu kitų šviesos šaltinių.
1.2.2. Fotodetektorių palyginimas
Be šviesos šaltinių, labai svarbi optinio elektrinio signalo registravimo metodo dalis – fotodetektoriai, kurie yra būtini, norint užregistruoti atsaką iš objekto. Fotodetektorių tipai: fotodiodų matricos (angl. photodiode arrays), fotodaugintuvai (angl. photomultiplier), krūvio kaupimo įrenginiai, greitaeigės kameros (angl. charge coupled device, CCD camera), metalo-oksido puslaidininkės kameros (angl. complementary metal-oxide-semicon-ductor). Visi detektoriai keičia šviesos energiją į elektros srovę. Fotodiodų matricos pasižymi dideliu triukšmo lygiu, lyginant su kitais fotodetektoriais. Fotodaugintuvai yra daug jautresni negu fotodiodų matricos, o jų atsakas yra daug greitesnis, tačiau vienu metu yra registruojamas tik vieno bangos ilgio intensyvumas ir jie veikia daug lėčiau, negu naudojant daugiakanalius registravimo elementus (Himel ir kt., 2011).
CCD kamera pasižymi labai mažu triukšmo lygiu, dėl to dažniausiai naudojama optiniam elektrinių signalų registravimui (Himel ir kt., 2011). Naujausia CCD kamerų versija yra EM (angl. electron multiplied) – greita-eigė CCD kamera (EMCCD), kuri pasižymi dar mažesniu triukšmo lygiu
negu CCD, tačiau yra jautresnė. Metalo-oksido puslaidininkės kameros, lyginant su kitais fotodetektoriais, pasižymi didesniu triukšmo lygiu, bet yra greitaeigės (Himel ir kt., 2011).
1.2.3. Kiti elektrinio signalo registravimo optiniu metodu įrenginiai
Optinei elektrinio signalo registravimo metodikai reikalingi ir kiti įrenginiai: sužadinimo filtrai, emisijos filtrai, dichroiniai veidrodžiai, lęšiai, stiprintuvai ir kt. (Ding ir Everett, 2010).
Filtras, padengtas specialiomis medžiagomis, sugeria tik tam tikro dažnio spalvos šviesą, kitą praleisdamas be pakitimų. Selektyvinės absorbcijos principas naudojamas šviesos filtrų gamybai. Sužadinimo filtrai yra parenkami atsižvelgiant į šviesos šaltinį ir PJFD. Emisijos filtrai parenkami, atsižvelgiant tik į PJFD. Jie gali būti trumpalaidžiai, ilgalaidžiai ir juostiniai. Dichroiniai veidrodžiai yra gaminami atsižvelgiant į potencialui jautrių fluorescencinių dažų spektrines savybes, ir dažniausiai jie naudojami nukreipti sužadinimo šviesą į tiriamąjį objektą, bei praleisti emisijos šviesą į detektorių. Dichroiniai veidrodžiai turi būti tinkamai sumontuoti ir orientuoti tiriamojo objekto atžvilgiu (Ding ir Everett, 2010).
1.3. Optinio elektrinio signalo registravimo metodo ribotumai
Pasak literatūros šaltinių, optinis elektrinio signalo registravimo metodas turi ir keletą ribotumų (angl. limitations). Optiniai signalai yra labai jautrūs širdies judesiams, todėl judesio artefaktas yra vienas iš pagrindinių ribotumų, registruojant optinį signalą (Efimov ir kt., 2004). Judesio artefakto pašalinimui naudojama tiriamo objekto imobilizacija ir farmakolo-ginės medžiagos. Optinio elektrinio signalo tyrimuose dažniausiai naudoja-mos farmakologinės medžiagos yra skyrikliai, atskiriantys elektrinį jaudini-mą nuo susitraukimo: 2,3-butandiono monoksimas (BDM), blebistatinas, citochalasinas-D (Matiukas 2007; Myles ir kt., 2010; Harada ir kt., 2011; Cram ir kt., 2011; Lou ir kt., 2012). Blebistatinas gali panaikinti susitrau-kimą triušio širdies raumenyje, nesukeldamas jokio šalutinio poveikio (Fedorov ir kt., 2007), tačiau yra labai brangus. Nors BDM kaina yra daug priimtinesnė, naudojant jį, sumažėja kalcio srovė (Gwathmey ir kt., 1991), kuri įtakoja veikimo potencialo trukmę (Wu ir kt., 1998). Eksperimentuose, kuriuose buvo naudojamas BDM, didinant stimuliavimo dažnį, daug dažniau atsirasdavo skilvelių fibriliacija (Lee ir kt., 2001). Taigi reikia paminėti, kad tokie skyrikliai turi būti naudojami atsargiai, nes gali sukelti sklivelių fibriliavimą (Lee ir kt., 2001; Baker ir kt., 2004).
Optinis elektrinio signalo registravimo metodas gali iškraipyti signalą, kuris nulemtas fotonų išsisklaidymo audinyje (Bishop ir kt., 2007). Iškraipytas signalas neleidžia gerai interpretuoti gautų duomenų. Bishop naudodamas kompiuterinius modelius pademonstravo, kad fotonų išsisklai-dymas (angl. photon-scattering) priklauso nuo audinio geometrijos ir ekspe-rimento modelio (Bishop ir kt., 2006).
Norint teisingai įvertinti elektrinį signalą, užregistruotą optiniu būdu, privalu sumažinti triukšmus, o tai dažniausiai daroma didinant apšvietimo intensyvumą. Tačiau didėjant audinį apšviečiančios šviesos intensyvumui, atsiranda fotoblukimas ir (foto)toksiškumas (Rohr ir Salzberg, 1994; Schaffer ir kt., 1994; Hardy ir kt., 2009). Lazerio apšvietimo sukeltas PJFD (foto)toksiškumas – įprastas reiškinys eksperimentuose su izoliuotais miocitais (Hardy ir kt., 2006, 2009; Warren ir kt., 2010), tačiau paprastai mažiau ryškus eksperimentuose su ląstelių kultūromis (Rohr ir Salzberg, 1994) ar audinio preparatais (Efimov ir kt., 2004; Matiukas ir kt., 2007). Eksperimentuose su izoliuotais miocitais, naudojant di-4-ANBDQBS dažus, buvo parodyta, kad dėl šviesos šaltinio poveikio veikimo potencialo trukmė pasikeičia (Warren ir kt., 2010). Skirtingų PJFD jautrumas šviesos šaltinio apšvietimo intensyvumui skiriasi ir turi būti nustatinėjamas kiekvienam PJFD individualiai. Eksperimentuose naudojamų PJFD koncentracija taip pat turi būti įvertinta, kadangi nuo jos priklauso audinio fotodinaminiai pokyčiai (Grinvald 1982).
Per pastarąjį dešimtmetį, optinis elektrinio signalo registravimo metodas ištobulėjo ir yra naudojamas ritmo sutrikimų (aritmijų) mechanizmų priežastims analizuoti.
1.4. Elektrinis veikimo potencialas ir impulso sklidimas širdyje
Optinis elektrinio signalo registravimo metodas leidžia įvertinti elektrinį sklidimą širdyje ir išanalizuoti aritmijų atsiradimo priežastis.
Elektrinis impulsas, pradedantis normalų širdies susitraukimą, kyla sinusiniame mazge (pagrindiniame širdies ritmo vedlyje), peismeikerinėse (P) ląstelėse. Iš sinusinio mazgo impulsas toliau plinta prieširdžiais iki atrioventrikulinio mazgo. Per atrioventrikulinį mazgą impulsas lėtai sklisdamas pasiekia Hiso-Purkinje sistemą ir toliau išplinta skilveliuose. Širdies laidžioji sistema ir jaudinimo plitimas joje pavaizduotas 1.4.1 pav.
1.4.1 pav. Širdies laidžioji sistema ir jaudinimo plitimas joje
(adaptuota pagal Kėvelaitis, 2006)
SA mazgas – sinoatrialinis mazgas; AV mazgas – atrioventrikulinis mazgas; EKG – elektrokardiograma. 0 fazė – regeneracinė depoliarizacija; 1 fazė – pradinė repoliarizacija; 2 fazė – plato; 3 fazė – galutinė repoliarizacija, 4 fazė – ramybės potencialas (RP).
Pradinė staigi depolizacija ir membranos potencialo šuolis į viršų yra susiję su įtampos valdomų Na+ jonų kanalų atsidarymu (0 fazė) ir staigiu Na+
jonų plūstelėjimu į ląstelės vidų. Greitą depoliarizaciją keičia repoliarizacija. Na+ jonų kanalų užsidarymas yra sąlygojamas pradinės greitosios repoliarizacijos (1 fazė). Vėlesnė, ilgai besitęsianti plato fazė (2 fazė) priklauso nuo lėto, taip pat ilgai besitęsiančio įtampos – valdomų Ca2+ jonų kanalų atsidarymo, Ca2+ jonų srovės įtekėjimo į ląstelės vidų ir sumažėjusios K+ jonų srovės iš ląstelės vidaus į išorę. Galutinė repolia-rizacija (3 fazė) yra susijusi su Ca2+ jonų kanalo užsidarymu. Ramybės potencialo (4 fazė) metu, jonai grįžta į savo vietas, tuo metu labiausiai skvarbūs K+
jonai (Snyders, 1999; Roden ir kt. 2002).
1.5. Širdies aritmijų susidarymo mechanizmai
Aritmijų susidarymo mechanizmus galima suskirstyti į dvi pagrindines grupes:
Elektrinio jaudinimo sutrikimus:
Ektopinis anormalus automatizmas;
Trigerinis aktyvumas (ankstyvieji ir vėlyvieji postpotencialai).
Elektrinio jaudinimo sklidimo sutrikimus: Grįžtamasis sužadinimas (angl. re-entry);
Blokai.
Automatizmas – širdies gebėjimas spontaniškai generuoti veikimo poten-cialus (Antzelevitch, 2001). Širdies ląstelės, kurios lokalizuojasi sinusinia-me mazge, atrioventrikuliniasinusinia-me mazge ar Purkinje skaidulose, turi gebėjimą veikti automatizmo principu (Matteo ir Nargeot, 2008). Pakitus impulso atsiradimo vietai, susidaro ektopinis židinys. Dėl pakitusio automatizmo ektopiniame židinyje, atsiranda ritmo sutrikimai – aritmijos. Trigerinis aktyvumas (TA) – tai toks reiškinys, kai kontraktilinio miokardo ląstelėse nenormalų impulsą sukelia prieš tai buvęs VP. Postpotencialai gali pasiekti slenkstinį potencialą ir sukelti ekstrasistoles. Jie skirstomi į ankstyvuosius ir vėlyvuosius. Ankstyvieji postpotencialai (angl. early afterdepolarization,
EAD) atsiranda 2 arba 3 veikimo potencialo fazės metu, prailgindami
veikimo potencialo trukmę. Ca2+ jonų srovės plato fazės metu yra atsakin-gos už EAD susidarymą (Zipes, 2003). Vėlyvieji postpotencialai (angl.
delayed afterdepolarization, DAD) – atsiranda VP repoliarizacijos pabaigoje
(4 fazės metu), kyla dėl Ca2+jonų perkrovos ląstelėse (1.5.1 pav.).
1.5.1 pav. Trigerinis aktyvumas (adaptuota pagal Gaztanga ir kt., 2012)
A: 2 fazė, ankstyvieji postpotencialai. B: 3 fazė, ankstyvieji postpotencialai. C: vėlyvieji postpotencialai
1.5.2 paveiksle pateiktas klasikinis impulso sklidimo sutrikimų pavyzdys. Grįžtamojo sužadinimo susidarymui pagrindinę įtaką turi vienakrypčio bloko (D) atsiradimas impulso sklidimo kelyje.
1.5.2 pav. Grįžtamasis sužadinimas (adaptuota pagal Berne ir Levy, 2008)
P – Purkinje skaidula, α ir β Purkinje skaidulos šakelės, M – miokardo skaidula. A: normalus sklidimas, impulsas plinta į miokardą tiek α, tiek β šakele. B: blokas abejose šakelėse. C: impulsas plinta α šakele, nes β šakelėje susidaręs dvikryptis blokas. D: grįžtamasis sužadinimas, impulsas plinta α šakele, o β šakelėje vienakryptis blokas, pasibaigus refrakteriniam periodui impulsas plinta β šakele, taip sudarydamas grįžtamąjį sužadinimą (angl. re-entry).
Sklidimo blokai, gali susidaryti skirtingose širdies dalyse. Jų susidarymą gali įtakoti tokie veiksniai kaip didelis širdies dažnis, farmakologinės medžiagos (pvz., kanalų blokatoriai) ar metaboliniai procesai.
1.6. Elektrinio signalo alternavimas
Aritmijų atsiradimą lemia procesai, vykstantys tiek ląsteliniame, tiek audinio lygmenyje. Širdies sužadinimo sutrikimų mechanizmų supratimas ir tikslus patologijos pažeistos vietos nustatymas yra sėkmingo aritmijų gydymo pagrindas. Skilvelių fibriliacija – dešimtmečius tyrinėjama patalo-gija, dėl kurios visame pasaulyje miršta daugiausiai žmonių (Verrier ir kt., 2009, 2010, 2011). Jau daugiau kaip tris dešimtmečius dėmesys skiriamas T-bangos alternavimo (toliau TBA) mechanizmų tyrimams, nes manoma, kad TBA – pagrindinis širdies ritmo sutrikimų ir staigios mirties (angl.
sudden cardiac death) žymuo (Schwartz ir Malliani., 1975; Narayan, 2008),
susijęs su daugeliu širdies ligų, pvz. tokių kaip širdies nepakankamumas (Luomanmaki ir kt., 1975), ilgo QT komplekso sindromas (Zareba ir kt., 1994), išemija (Nakashima ir kt., 1978), Brugada sindromas (Chinushi ir kt., 2001) ir kt.
Alternavimai gali atsirasti įvairiuose EKG komponentuose, tokiuose kaip QRS komplekse, ST segmente ar T-bangoje. QRS alternavimai paprastai yra susiję su didžiulėmis mechaninėmis anomalijomis, pasireiškiančiomis pvz., perikardiniu kraujo išsiliejimu arba gali būti susijęs su sklidimo sutrikimais, kaip, pavyzdžiui, alternuojanti Hiso pluošto kojyčių blokada. ST segmento alternavimai susiję su ūmine miokardo išemija. Taip pat gali būti ir širdies ritmo alternavimai (RR), tokie kaip, pavyzdžiui, prieširdžių arba skilvelių bigeminija ir kai kurių formų skilvelinė tachikardija. Šiuo metu nėra atrastas klinikinis ar mechaninins ryšys tarp RR, QRS ar ST alternavimų ir tachiaritmijų. Priešingai, TBA yra dažniausiai pastebima EKG alternavimo forma, kuri susijusi su patofiziologiniais mechanizmais ir klinikinėmis staigios mirties (angl. sudden cardiac death) prognozėmis.
Eksperimentai atliekami pastarąjį dešimtmetį parodė, kad alternavimo atsiradimas EKG nulemtas sklidimo pokyčių audinyje ir VP pokyčių atskirose miokardo ląstelėse (Hoffman ir kt., 1974).
TBA elektrokardiogramos forma, kuri suprantama kaip: 1) kas antro (angl. beat-to-beat) veikimo potencialo alternavimas visose miokardo ląstelėse arba 2) 2:1 blokų atsiradimas skirtingose širdies audinio vietose ir sumacijos pasekoje atsirandančio alternavimo (Pastore ir kt., 1999; Walker ir Rosenbaum, 2003; Pruvot ir kt., 2003). Tačiau ląstelinis mechanizmas nėra galutinai išaiškintas. Literatūroje rašoma, kad alternavimas gali atsirasti dėl membraninio potencialo dinaminio nestabilumo, dėl Ca2+
cikliškumo arba dėl jų abiejų tarpusavio ryšio (Pastore ir kt., 1999; Mironov ir kt., 2008). Alternavimas, atsirandantis prie didelių dažnių (3-5 Hz) yra paremtas veikimo potencialo trukmės (VPT) ir diastolinio intervalo (DI) tarpusavio ryšio. VPT restitucija, apibūdinama kaip VPT priklausomybė nuo diastoli-nio intervalo, priklausančio nuo daugelio joninių srovių bendro atsistatymo. Audinyje, sklidimo greitis (toliau SG) taip pat sulėtėja prie trumpo diastoli-nio intervalo, dar apibūdinamo kaip SG restitucija, kuri lemia erdvėje nedarnių veikimo potencialo trumės alternavimų susiformavimą.
1.6.1. Veikimo potencialo trukmės ir sklidimo greičio restitucija
Veikimo potencialo trukmė (toliau VPT) yra apibūdinama kaip laikas nuo priekinio fronto maksimalaus greičio iki 90 proc. repoliaricazijos (VP90). VPT restitucija gali būti išmatuojama tolygiai didinant stimu-liavimo dažnį arba staigiai keičiant intervalą, tarp dviejų iš eilės einančių veikimo potencialų, kurie pakeičia diastolinį intervalą (1.6.1 pav.) (Bass, 1975).
1.6.1 pav. Elektrinio signalo restitucija (adaptuota pagal Qu ir kt., 2010)
A: VPT restitucijos nustatymas. B: VPT restitucijos kreivė (VPT lyginant su prieš tai buvusiu DI). C: sklidimo greičio kreivės (sklidimo greitis su prieš tai buvusiu DI) esant normaliam Na+ kanalų atsistatymui (juoda kreivė) ir esant sulėtėjusiam Na+ kanalų
atsistatymui (punktyrinė linija) DI – diastolinis intervalas. VPT – veikimo potencialo trukmė. SG – sklidimo greitis.
Dėl nepasibaigusio joninių kanalų atsistatymo, trumpesnis diastolinis intervalas lemia trumpesnę VPT. Greitas Na+ kanalų atsistatymas po inaktyvacijos, įtakoja VPT restituciją daugiausiai prie trumpo DI (0-40 ms). Na+
kanalai daugiausiai yra inaktyvinti VP plato fazės metu ir jų įtaka VPT yra nedidelė, tačiau nepilnas Na+ kanalų atsistatymas sumažina VP amplitudę (toliau VPA), kuri įtakoja kitų kanalų, įtakojančių VPT, aktyvaciją. Veikimo potencialo priekinį frontą lemia Na+
kanalai, tad sklidimo greičio restitucija yra beveik visiškai valdoma Na+
kanalų atsistatymo (Qu ir kt., 2010). L-tipo Ca2+kanalai atsistato daug lėčiau negu Na+
kanalai, toks efektas akivaizdus prie trumpų ir vidutinių DI (0-100 ms). Veikimo potencialo trukmė jautresnė L-tipo Ca2+
kanalams negu kitiems kanalams, tad L-tipo Ca2+ kanalų atsistatymas nulemia VPT restitucijos nuolydį. Tokių kanalų užblokavimas sumažina VPT restitucijos kreivės nuolydį. Kalio kanalai (IKr ir IKs) atsistato dar lėčiau, o jų užblokavimas VPT restitucijos kreivę padaro statesnę.
VPT alternavimo mechanizmas pirmą kartą buvo paaiškintas Nolasco ir Dahlem 1968 metais (1.6.2 paveikslas).
1.6.2 pav. Veikimo potencialo trukmės alternavimas (adaptuota pagal Gaeta
ir Christini, 2012)
Nuolatinio stimuliavimo periodo metu veikimo potencialo trukmė (VPTn) sutrumpina
vėlesnį diastolinį intervalą (DIn). Veikimo potencialo trukmės restitucija lemia tai, kad
sutrumpėjęs diastolinis intervalas įtakoja kito veikimo potencialo trukmę (VPTn+1). To
pasekoje kitas diastolinis intervalas tampa ilgas (DIn+1). Toks diastolinis intervalas lemia
kitą vėl ilgą veikimo potencialą (VPTn+2) ir tai kartojasi iš naujo.
Ca2+ cikliškumas taip pat įtakoja veikimo potencialą, bet Ca2+ signalas gali ir pats alternuoti. Ryšys tarp VPT alternavimo ir Ca2+ signalo alternavimo audinyje buvo tiriamas tiek eksperimentinėmis sąlygomis, tiek kuriant įvairius modelius (Naryan, 2008; Bayer ir kt., 2010). Tiek eksperimentinių tyrimų metu, tiek modeliuojant buvo identifikuotas mechanizmas, kuriuo VPT ir Ca2+
signalas alternuoja nepriklausomai vienas nuo kito dėl jonų kanalų nestabilumo ir viduląstelinio kalcio jonų
kos. Veikimo potencialo trukmė ir Ca2+
signalas yra dvikryptiškai susiję, t. y. vieno alternavimas lemia kito alternavimą. Tai gali būti paaiškinama dviem hipotezėmis: 1) membranos potencialo dinamikos nestabilumas lemia VPT alternavimus, sukeliančius viduląstelinio Ca2+ signalo alternavimus (Guevara ir kt., 1984; Watanabe ir kt., 2001). 2) Ca2+ cikliškumo dinamikos nestabilumas sukelia Ca2+ signalo alternavimus, sukeliančius VPT alterna-vimus (Chudin ir kt., 1999; Pruvot ir Rosenbaum, 2003; Wan ir kt., 2005).
Širdies audinyje, veikimo potencialo trukmės alternanavimas gali būti darnus erdvės atžvilgiu (angl. spatially concordant) ir nedarnus erdvės atžvilgiu (angl. spatially discordant) (1.6.3 paveikslas) (Cao ir kt., 1999; Pastore ir kt., 1999; Hayashi ir kt., 2007). Esant darniems alternavimams, VPT visame registravimo plote, tiek pirmame, tiek antrame VP alternuoja kaip „ilgas-trumpas“, o nedarnių alternavimų atžvilgiu, pirmame VP alternuoja „trumpas-ilgas“, o antrame VP „ilgas-trumpas“.
Eksperimentuose ir modeliuojant buvo parodyta, kad perėjimas iš darnaus alternavimo į nedarnų gali įvykti dėl dinaminio fenomeno, kuris yra nulemtas sklidimo greičio ir VPT restitucijos sąveikos (Watanabe ir kt., 2001; Sato ir kt., 2007; Diego ir kt., 2008). Kad sklidimo greičio restitucija įtakoja nedarnių alternavimų atsiradimą, pirmasis įrodė Cao (Cao ir kt., 1999).
1.6.3 pav. Darnaus ir nedarnaus VP alternavimo modelis širdies audinyje
(adaptuota pagal Gaeta ir Christini, 2012)
A: darnus alternavimas, kur visame plote VP alternuoja vienodai. B: VP alternavimas nevienodas, atsiranda nedarnus alternavimas. Tuo pačiu metu a taške VP alternuoja „trumpas-ilgas“, kai b taške „ilgas-trumpas“. Centrinė linija tai vieta, kur alternavimas nematomas.
Normalus elektrinio impulso sklidimas apibūdinamas kaip 1:1, o esant dideliam stimuliavimo dažniui atsiranda 2:1 sklidimo blokai. Analizuojant elektrinius signalus, registruotus optiniu metodu, pastebėta, kad VPA alternavimai yra daug ryškesni negu VPT. Optiniu būdu registruojamas VP, susumuoja elektrinį signalą visame miokarde (Hyatt ir kt., 2003). Todėl nėra aišku, ar VPA alternavimai atsiranda atskirose ląstelėse, ar dėl sumavimosi, kada kai kuriuose miokardo sluoksniuose atsiranda 2:1 sklidimo blokai. Paskelbti duomenys literatūroje yra gan prieštaringi (Chudin ir kt 1999; Shimzu ir Antzelevitch, 1999, Walker ir Rosenbaum, 2003).
Disertaciniame darbe didžiausias dėmesys buvo skiriamas VP alterna-vimo susidarymo mechanizmų tyrimams, naudojant kompleksinį optinį ir elektrinį signalo registravimo metodą.
2. METODIKA
Visi eksperimentai ir procedūros atitinka Europos Bendrijos nustatytus principus ir turi Lietuvos Respublikos valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimus atlikti eksperimentus su gyvūnais (Nr. 0227, 2012-05-03).
2.1. Širdies izoliavimo procedūros
Objektas: jūrų kiaulytės (n=20, 200–300 g.), dešiniojo skilvelio sienelės preparatai.
Prieš atliekant anesteziją, gyvūno skausmo sumažinimui į raumenį buvo suleista natrio pentobarbitalio (300 mg/kg) ir 500 U/kg heparino injekcija. Patikrinus jūrų kiaulytės jautrumą ir neužfiksavus jokių jautrumo požymių, buvo atliekama krūtinės ląstos atvėrimo procedūra. Atvėrus krūtinės ląstą, širdis buvo izoliuojama ir patalpinama oksigenuotame (100 proc. O2) kambario temperatūros fiziologiniame tirpale (Normal Tyrode). Širdis per aortą buvo kanuliuojama ir pakabinama Langendorfo perfuzinėje sistemoje. Po 10 minučių, nusistovėjus širdies ritmui, per aortą buvo suleidžiami potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai. Po šios procedūros širdis buvo nukabinama, išpjaunama dešinio skilvelio sienelė ir pritvirtinama prie guminio rėmelio (2.1.1 pav.) su nuolat palaikoma perfuzija. Perfuzinio tirpalo temperatūra 36,5 °C, tėkmės greitis 10 ml/min. Temperatūra buvo nustatoma, naudojant termostatą (170051A Thermo Fisher Scientific, JAV). Preparatai buvo stimuliuojami 1 Hz dažniu, naudojant laboratorijoje paga-mintą bipolinį elektrodą, 2 ms trukmės impulsais, kurių amplitudė du kartus didesnė negu slenkstinė. Stimulai buvo generuojami naudojant DS8000 stimuliatorių (Word Precision Instruments, JAV), su linijiniu izoliaciniu bloku (A395R, Word Precision Instruments, JAV).
2.1.1 pav. Jūrų kiaulytės dešiniojo skilvelio sienelės preparatas
Objektas: Naujosios Zelandijos baltųjų triušių (New Zealand white rabbits) širdys (n=25, triušių svoris 3,33±0,34 kg).
Streso sumažinimui, atsiradusiam gyvūno transportavimo metu, 10 mg/kg ksilazino injekcija buvo suleista į sprando raumenį prieš atliekant anesteziją. Po 10–15 minučių buvo atlikta anestezija suleidžiant ketamino (10 mg/kg) kartu su heparinu (1000 U/kg) injekciją per triušio ausies veną. Kraujo krešumo sumažinimui buvo suleidžiama Heparino injekcija. Patikrinus triušio jautrumą ir neužfiksavus jokių jautrumo požymių buvo atliekama krūtinės ląstos atvėrimo procedūra. Atvėrus krūtinės ląstą, širdis izoliuojama ir per aortą kanuliuojama bei pakabinama Langendorfo perfuzinėje sistemoje (2.1.2 pav.), kurioje širdis buvo perfuzuojama oksige-nuotu (100 proc. O2) fiziologiniu (Normal Tyrode) tirpalu. Fiziologinio tirpalo pratekėjimo per širdį greitis buvo 38,3±1,6 ml/min. Pašalinus visą kraują iš širdies koronarų, buvo atliekmos papildomos procedūros. Naudojant chirurginius instrumentus, atsargiai įkerpamas kairysis prieširdis. Į kairiojo skilvelio ertmę buvo įdedamas bipolinis sidabrinis elektrodas, reikalingas širdies audinio stimuliavimui nuo endokardo pusės, t. y. iš vidaus, ir AgCl, elektrodas reikalingas registravimams mikroelektrodu. Papildomai perfuzijai fiziologiniu tirpalu, plastikinis vamzdelis buvo įdedamas į skilvelio ertmę tam, kad būtų palaikoma pastovi temperatūra širdies viduje, ypač regioninės išemijos metu. Eksperimentuose, kuriuose buvo tiriamas optinio signalo priekinis frontas, širdis buvo stimuliuojama trimis būdais: nuo endokardo pusės, nuo epikardo pusės ir nuo prieširdžių, o veikimo potencialo alternavimo vystymosi mechanizmų tyrimo eksperimen-tuose širdis buvo stimuliuojama tik nuo endokardo pusės. Širdis nuolat stimuliuojama 300 ms intervalu 2 ms trukmės impulsais, kurių amplitudė du kartus didesnė negu slekstinė.
2.1.2 pav. Langendorfo perfuzinė sistema pritaikyta darbui su triušių
širdimis
2.2. Tirpalai, cheminės medžiagos ir potencialui jautrių fluorescencinių dažų paruošimas
Visuose eksperimentuose buvo naudojamas fiziologinis tirpalas (Normal
Tyrode) (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 0,9 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 10 gliukozė, 10 HEPES, 7,4 pH, 37±0.5 °C temperatūros.
Potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai eksperimentuose su jūrų kiaulyčių širdies preparatais buvo ruošiami iš 25 mM di-4-ANBDQBS (etanolyje) arba 10 mM di-4-ANEPPS (DMSO tirpale). Dažai ištirpinami fiziologiniame tirpale iki galutinių koncentracijų, atitinkamai 50 μM (di-4-ANBDQBS) ir 25 μM (di-4-ANEPPS). Įdedama 0,01 proc. Pluronic F-127. Raumens susitraukimo pašalinimui buvo naudotas blebistatinas (20 μM).
Eksperimentuose su triušių širdimis į perfuzinėje sistemoje esantį fiziologinį tirpalą buvo įdėta 20 μM blebistatino ir 5 mM 2,3–Butandiono monoksimo (BDM) raumens susitraukimo pašalinimui. Sumažinus perfuzijos pratekėjimo greitį 50 proc. nuo normalaus pratekėjimo greičio, per 3 minutes, naudojant plastikinį švirkštą buvo įvedamas 10 ml tirpalas su di-4-ANBDQBS (50 μM) dažais į perfuzinę sistemą. Bendras fluorescen-cijos lygis virš fono buvo apskaičiuojamas procentais. ΔF/F pasiekė 20,38± 0,63 proc. (n=4), kas parodo gero optinio veikimo potencialo signalą. Potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai di-4-ANBDQBS (JPW6033) gauti iš Loew laboratorijos (Konektikuto universitetas, JAV), di-4-ANEPPS iš Invitrogen (JAV), blebistatinas iš Cayman (JAV), kiti reagentai iš Sigma-Aldricht (Vokietija).
2.3. Optinių signalų registravimas
Optiniai veikimo potencialai (OVP) jūrų kiaulyčių širdies preparatuose buvo registruojami, naudojant optinį elektrinio signalo registravimo metodą pavaizduotą 2.3.1 paveiksle. Buvo naudojama šaldoma (–100 °C) greitaeigė 14-bitų-kamera (EMCCD, iXonEM+DU-860, Andor Technology, Airija) ir vaizdinimo programinė įranga. Vaizdai buvo 128X128 pikselių rezoliucijos, kadrų dažnis 500 Hz. Kamera buvo lokalizuota 30 cm atstumu nuo preparato paviršiaus. Registracija buvo atliekama nuo epikardo paviršiaus, 7,1X7,1 mm plote. Eksperimentuose su jūrų kiaulyčių širdžių preparatais, di-4-ANBDQBS dažų sužadinimui buvo naudojamas 660 nm bangos ilgio, 600 mW diodinis lazeris (SDL-660-600T, Shanghai Dream Lasers Techno-logy, Kinija). Lazerio spindulio išplėtimui buvo naudojamas 5 laipsnių holografinis difuzorius (R217582-11165, Edmund Optics, JAV). Di-4-ANEPPS dažų sužadinimui buvo naudojamas 532 nm, 1000 mW lazeris
(SDL-532-1000T, Shanghai Dream Lasers Technology, Kinija). Apšvietimo intensyvumas buvo keičiamas, naudojant neutralius filtrus (Edmund Optics, JAV) ir poliarizatorių (R215402-11139, Edmund Optics, JAV). Apšvietimas buvo kalibruojamas, naudojant galios matuoklį (PM100, Thorlabs, JAV) ir nuolat kontoliuojamas laboratorijoje gamintu šviesos davikliu. Eksperimen-tuose su di-4-ANBDQBS buvo naudojamas 715 nm ilgalaidis (angl.
long-pass) filtras (NT46-066, Edmund Optics, JAV) t. y. filtras, praleidžiantis
nuo 715 nm ir ilgesnio bangos ilgio šviesą. Eksperimentuose su di-4-ANEPPS – juostinio pralaidumo (angl. band-pass) filtras (HQ650/40 m, Chroma Technology, JAV). Norint sumažinti santykinį triukšmų lygį, fluorescencijos signalas buvo didinamas keičiant matricos stiprinimą nuo 4 iki 100. Eksperimentuose su jūrų kiaulyčių dešiniuoju skilveliu buvo naudojamas apšvietimo protokolas, susidedantis iš nuoseklaus 60 sekundžių apšvietimo ciklo ir 120 sekundžių tamsos periodo. Apšvietimo intensyvu-mas nuosekliai po kiekvieno apšvietimo – tamsos ciklo didinaintensyvu-mas nuo 0,1 iki 5 mW/mm2
. Šilumos efektų įvertinimui buvo naudojamas laboratorijoje pagamintas termosensorius (0,65 mm skersmens), kuris buvo prispaudžia-mas prie preparato paviršiaus. TTL (angl. Transistor-Transistor Logic) buvo naudojami sinchroniškai registruoti mikroelektrodo įrašus, EMCCD kameros signalą ir termostato temperatūrą.
2.3.1 pav. Optinis elektrinio signalo registravimo metodas, pritaikytas
darbui su izoliuotais jūrų kiaulytės širdies audiniais
Optiniai signalai triušio širdyse buvo registruojami taip pat, kaip eksperimentuose su jūrų kiaulyčių širdies preparatais. Di-4-ANBDQBS dažų sužadinimui buvo naudojamas 660 nm bangos ilgio lazeris su
dytuvu, homogeniško širdies apšvietimo gavimui (SDL-660-600T, Shanghai Dream Lasers Technology). Emisijos filtras – 715–850 nm (NT46-066, Edmund Optics, JAV). Optiniu būdu registruoto signalo registravimo pradžios nustatymui, mažas šviesos šaltinis (LED, 940 nm), kuris gene-ruodavo 0,5 ms trukmės impulsus susinchronizuotus su stimuliavimo daž-niu, buvo patalpinamas kameros filmavimo lauke. Registravimo laukas buvo 20×20 mm. Rezoliucija 128×128 pikseliai, naudojama vaizdų apdoro-jimo programa Andor SOLIS x-3467, kadrų dažnis 500 Hz, sužadinimo intensyvumas apie 0,5 mW/mm2. Lazerio sužadinimas kontroliuojamas sinchronizuotai su kamera atsidarančia ir užsidarančia sklende. Užregist-ruotų vaizdų analizei buvo naudota ImageJ 1,45 S programa.
2.4. Elektrinių signalų registravimas
Elektriniai signalai, tiek jūrų kiaulyčių širdelių preparatuose, tiek ekspe-rimentuose su triušių širdimis, buvo registruojami, naudojant tradicinius stiklinius mikroelektrodus, užpildytus KCl (3 M) tirpalu.
Eksperimentuose su jūrų kiaulyčių širdies preparatais mikroelektrodas buvo įvedamas apie 3–4 mm atstumu nuo stimuliuojančio elektrodo (2.4.1 pav.).
2.4.1 pav. Elektrinio signalo registravimas jūrų kiaulytės dešiniame
skilvelyje
Veikimo potencialai buvo registruojami, naudojant MEZ-71011 stiprin-tuvą (Nihon Kohden, Japonija). Veikimo potencialo parametrai, kurie buvo analizuojami: veikimo potencialo amplitudė (VPA), maksimalus priekinio fronto greitis (Vmax), sklidimo greitis, veikimo potencialo trukmė (VPT). Sklidimo greitis buvo skaičiuojamas, padalinus atstumą tarp stimuliuojančio elektrodo ir signalą registruojančio mikroelektrodo iš sklidimo laiko.
dimo laikas buvo apskaičiuojamas nuo stimulo pradžios laiko iki VP prie-kinio fronto maksimalaus greičio. VPT – laikas nuo prieprie-kinio fronto maksi-malaus greičio iki 90 proc. repoliaricazijos (VP90).
Vertinant OVP priekinio fronto teikiamą informaciją, eksperimentuose su triušių širdimis, vienas mikroelektrodas buvo įvedamas į sub-epikardą, t. y. apie 0,5 mm, o kitas mikroelektrodas buvo įvedinėjamas per visą audinio gylį iki sub-endokardo (apie 5 mm). Veikimo potencialo alternavimo vysty-mosi mechanizmų tyrimo eksperimentuose vienas mikroelektrodas įveda-mas į sub-epikardą, t. y. apie 0,5 mm, o kitas mikroelektrodas buvo įvestas iki sub-endokardo (2.4.2 pav.).
2.4.2 pav. Elektrinio signalo registravimas mikroelektrodais
* žymi mikroelektrodų įvedimo vietą signalų registracijos metu.
Mikroelektrodai buvo pritvirtinti prie hidraulinių mikromanipuliatorių. Įvedamų mikroelektrodų gylio įvertinimui, prie mikroelektrodų laikiklių buvo prijungiami specialūs detektoriai (Millitron; Measuring Probes 1310). Elektriniai veikimo potencialai buvo registruojami, naudojant dviejų kanalų stiprintuvą MEZ-71011 (Nihon-Kohden, Japonija) su didele įėjimo varža ir talpumo kompensavimu. Signalas buvo pakeistas į skaitmeninę formą, naudojant 16-os kanalų PowerLab sistemą (ADInstruments, Oksfordas, Didžioji Britanija). Signalas, gautas iš gylio detektorių, buvo registruojamas LabChart8 Pro programa kartu su elektriniais veikimo potencialais. Mikro-elektrodo galiukui palietus paviršinį audinio sluoksnį (epikardą), programo-je buvo nustatomas gylio nulinis taškas. Judant mikroelektrodui gilyn, detektorius fiksavo atstumą nuo paviršiaus. 2.4.3 paveiksle pateiktas pavyz-dys, kaip atrodo registruojamas elektrinis veikimo potencialas LabChart8 Pro programa, įvedant mikroelektrodą per kelis ląstelių sluoksnius.
2.4.3 pav. LabChart8 Pro programa skirta registruoti elektrinius veikimo
potencialus
2.5. Regioninės išemijos sukėlimas
Veikimo potencialo alternavimo vystymosi mechanizmų tyrimo eksperi-mentuose, triušių širdyse buvo sukeliama regioninė išemija. Norėdami sukelti regioninę išemiją užspaudėme kairio skilvelio vainikinę nusileidžian-čią arteriją (LAD, angl. left anterior descending coronory artery), naudodami laboratorijoje sukurtą kraujagyslės užspaudimo metodą, pateiktą 2.5.1 paveiksle. Kraujagyslės užspaudimui naudojome iš elastinio silikoni-nio vamzdelio pagamintą „balionėlį“ (2.5.1 pav. B), kurį, naudojant chirur-ginius siūlus, pritvirtinome prie kraujagyslės (2.5.1 pav. C). Švirkšto pagal-ba (2 ml) buvo paduodamas slėgis ir „pagal-balionėlis“ buvo pripučiamas. Prieš PJFD įvedimą, buvo įvertinamas dažų pratekėjimas per kraujagysles prieš ir po vainikinės nusileidžiančios arterijos užspaudimo. Tuo tikslu buvo naudojamas dekstranas (angl. Dextran) (MW 40.000), 7 mg/10 ml, sužadini-mas 532 nm, emisija 580 nm. 2.5.1 pav. C matyti, kaip dažant dekstrano fluorescenciniais dažais, išryškėja pagrindinės kraujagyslės, o D matyti, kaip po „balionėlio“ išsipūtimo užsispaudžia kraujagyslė ir žemiau užspau-dimo vietos („X“) dekstrano dažai nepatenka į kraujagyslę. Tai leidžia daryti išvadą, kad kraujagyslė yra pilnai užspausta ir žemiau užspaudimo vietos susidaro išeminė zona. 2.5.1 pav., D – baltais taškais pažymėta išeminė zona, kurioje veikimo potencialai sutrumpėja 50 proc. nuo maksimalaus sutrumpėjimo išeminiame regione po 10 minučių nuo išemijos sukėlimo pradžios. Išeminė zona=VP50iš.+(VP50kon.–VP50iš.)/2, kur VP50iš. – VP50 po 10 minučių nuo išemijos sukėlimo pradžios, dirginant 300 ms. VP50kon. – VP50 prieš sukeliant išemiją, dirginant 300 ms.
2.5.1 pav. Regioninės išemijos sukėlimo metodas (adaptuota pagal
Mačianskienė ir kt., 2015)
A: schematinis širdies vaizdas: ME1 ir ME2 – stikliniai mikroelektrodai, kuriais registruojami elektriniai veikimo potencialai. Pilkas kvadratas rodo plotą, kurį registruoja EMCCD kamera. B: laboratorijoje pagamintas „balionėlis“, pritvirtintas prie plono vamzdelio, kuris jungiasi su švirkštu. C: fluorescuojančios kraujagyslės po dažymo su Dekstranu. D: kraujagyslių vaizdas po arterijos užspaudimo. „X“ žymi arterijos užspau-dimo vietą, o balta taškų linija žymi susiformavusią išeminę zoną.
2.6. Statistinė duomenų analizė
Visuose eksperimentuose gauti duomenys pateikiami kaip vidurkis ±SEM (standartinė vidurkio paklaida). Eksperimentuose su jūrų kiaulyčių širdies preparatais, ANOVA testas buvo naudojamas patikimumo palygini-mui tarp eksperimentinių duomenų, skirtumai statistiškai reikšmingi, kai
p<0,05. Eksperimentinės kreivės analizuotos ir paruoštos, naudojant
SigmaPlot 200 (Systat Software Inc., JAV) ir Origin 8,6 (OriginLab, JAV) programas.
Eksperimentuose, kuriuose buvo tiriamas elektrinio signalo alternavimo atsiradimo procesas, statistinis reikšmingumas tarp alternavimo reikšmių kiekviename išemijos periode įvertintas, naudojant Mann-Whitney testą, skirtumas reikšmingas, kai p <0,05. Elektrolapiai buvo sudaromi naudojant
Scroll 1,16 programą, sukurtą Mironov (Mičigano universitetas, JAV). Aktyvacijos laikas ir optinių veikimo potencialų trukmė atitinkamai buvo vertinti 50 proc. depoliarizacijos ir repoliarizacijos lygyje. Alternavimo dydžiai (∆OVPT, ∆OVPA) buvo apskaičiuojami, naudojant formulę:
∆OVPT=OVPTn-OVPTn+1 ir ∆OVPA=OVPAn-OVPAn+1, kur n – veikimo potencialo eilės skaičius.
Vertinant alternavimo zoną, buvo suskaičiuoti visi pikseliai, atitinkantys kriterijų (∆OVPA/OVPA)≥0,5(∆OVPA/OVPA)max, (∆OVPA/OVPA)max – absoliutus maksimumas (∆OVPA/OVPA) visame registravimo plote. Gauti duomenys buvo normalizuoti į visą pikselių skaičių išeminiame regione. OVPT alternavimo zona įvertinta lygiai taip pat kaip OVPA alternantų zona. Plačiau elektrolapių sudarymas pateiktas straipsnyje „Evolution of action potential alternans in rabbit heart during acute regional ischemia“ (disertacijoje 93 psl.).
Optinio signalo teikiamos informacijos įvertinimo eksperimentuose naudota statistinė analizė plačiai išdėstyta straipsnyje „Evaluation of excitation propagation in the rabbit heart: optical mapping and transmural microelectrode recordings“ (disertacijoje 79 psl.).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Optinio signalo registravimo metodo pritaikymas darbui su smulkių gyvūnų širdimis ir optimalių sąlygų parinkimas signalo
registravimui
3.1.1. Šviesos šaltinio intensyvumo poveikis širdies audiniui
Skirtingų potencialui jautrių fluorescencinių dažų (PJFD) jautrumas šviesos šaltinio apšvietimo intensyvumui skiriasi ir turi būti nustatinėjamas kiekvienam PJFD individualiai. 3.1.1.1 paveiksle pavaizduoti normalizuoti optiniai veikimo potencialai, registruoti, didinant apšvietimo intensyvumą preparatuose su di-4-ANBDQBS PJFD.
3.1.1.1 pav. Optiniai veikimo potencialai, registruoti jūrų kiaulytės širdyje,
naudojant di-4-ANBDQBS PJFD prie skirtingų lazerio apšvietimo intensyvumų (adaptuota pagal Kanaporis ir kt., 2012)
Iš paveikslo galima matyti, kad prie skirtingų lazerio apšvietimo intensyvumų (0,1 mW/mm2, 0,3 mW/mm2, 0,6 mW/mm2, 1 mW/mm2
, 1,5 mW/mm2, 2 mW/mm2, 3 mW/mm2, 4 mW/mm2 ir 5 mW/mm2) ΔF/F buvo panašus, t. y. apie 10 proc. Eksperimento metu buvo aiškiai matomas signa-lo triukšmų sumažėjimas, proporcingas lazerio apšvietimo intensyvumo didėjimui. Fluorescencijos pokyčio nuo foninio lygio vidurkis prie visų apšvietimų buvo 8,52±1,02 proc., naudojant di-4-ANBDQBS dažus (n=6) ir 5,01±1,06 proc., naudojant di-4-ANEPPS dažus (n=5).
Norėdami įvertinti lazerio apšvietimo intensyvumo poveikį širdies audinio elektrofiziologinėms charakteristikoms, registravome optinį signalą ir elektrinį signalą tuo pačiu metu. Naudojome optinį elektrinio signalo registravimo metodą ir standartinę mikroelektrodinę metodiką. 3.1.1.2 pa-veiksle pavaizduotas normalizuoto optinio veikimo potencialo signalas,
sutapatintas su mikroelektrodu registruotu elektrinio veikimo potencialo signalu, naudojant di-4-ANBDQBS PJFD. Lazerio intensyvumas 1 mW/mm2.
3.1.1.2 pav. Sutapatintas optiniu būdu registruotas VP su mikroelektrodu
registruotu VP (adaptuota pagal Kanaporis ir kt., 2012)
Iš 3.1.1.2. paveikslo matyti, kad veikimo potencialo forma ir trukmė yra labai panaši, registruojant signalą tiek optiniu, tiek elektriniu būdu.
3.1.2 Potencialui jautrių fluorescencinių dažų fotoblukimo ir (foto)toksinio poveikio širdies audiniui įvertinimas
Norėdami įsitikinti, kad naujai sukurti potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai yra tinkami mūsų eksperimentams ir nesukelia jokio fotoblukimo poveikio audiniui, atlikome eksperimentus su jūrų kiaulyčių širdimis ir dvejais anksčiau paminėtais PJFD: ANBDQBS ir di-4-ANEPPS. Eksperimentai buvo atlikti su jūrų kiaulyčių širdies preparatais.
Optiniu būdu buvo matuotas foninės fluorescencijos pokytis per 60 sekundžių. Buvo naudojamas lazeris, kurio apšvietimo intensyvumas buvo keičiamas nuo 0,1 mW/mm2 iki 5,0 mW/mm2. Prie maksimalaus lazerio apšvietimo intensyvumo foninės fluorescencijos intensyvumas nukrito vidutiniškai 2,26±0,5 proc. (n=5), kai buvo naudojami di-4-ANBDQBS dažai ir iki 3,16±1,05 proc. (n=4), kai di-4-ANEPPS. Ryškiausias lazerio apšvietimo intensyvumo keitimo poveikis buvo matomas VPT. Paveikle 3.1.2.1 pavaizduoti audinio apšvietimo būdai (A-C) ir optiniu būdu registruoti VP (OVP) (D) viename iš jūrų kiaulytės širdies preparatų. OVP registravimų vieta pažymėta žvaigždute (A-C). Kai žvaigždute pažymėta vieta būna apšviesta 5 mW/mm2
(A) intensyvumu, OVP būna trumpesni (D, kreivė 1). Kai intensyvumas sumažinamas iki 1 mW/mm2
(B), OVP trukmė
padidėja 22 ms (D, kreivė 2). Kai intensyvumas atstatomas į pradinę būseną (5 mW/mm2
) (C), OVP atsistato beveik į pradinę būseną (D, kreivė 3).
3.1.2.1 pav. Lazerio apšvietimo intensyvumo kitimo efektas, optinių būdu
registruotam veikimo potencialui (adaptuota pagal Kanaporis ir kt., 2012)
A: apšvietimas lazeriu, kurio intensyvumas 5 mW/mm2. B: apšvietimas lazeriu, kurio
intensyvumas 1 mW/mm2. C taip pat, kaip A. Juodas plotas visuose paveiksliukuose –
temperatūrinio daviklio vieta. D: OVP, užregistruoti, keičiant lazerio intensyvumą, iš žvaigždute pažymėtos vietos A-C.
VP pokyčiai, priklausomai nuo lazerio apšvietimo intensyvumo, neatsiranda akimirksniu. Pokyčiai vystosi tolygiai, laiko konstanta τ apie 7 s, kuri nepriklauso nuo lazerio apšvietimo intensyvumo. Paveiksle 3.1.2.2 pavaizduota mikroelektrodu registruotų VP90 kinetika po lazerio įjungimo ir išjungimo, apšviečiant skirtingo intensyvumo šviesa. Prie 2 mW/mm2 apšvietimo intensyvumo laiko konstanta buvo 6,76±0,83 s (n=6), prie 5 mW/mm2
6,98±0,83 s (n=6). Išjungus lazerį, VP90 grįžta į pradinį lygį, t. y. τ 9,73±1,15 s ir 9,18±1,5 s, kai lazerio intensyvumas atitinkamai yra 2 mW/mm2 ir 5 mW/mm2. Nenustatėme jokių pokyčių, net ir kelis kartus kartojant lazerio įjungimo – išjungimo ciklą.
3.1.2.2 pav. OVP trukmės kinetika 60 sekundžių apšvietimo periodo ir
tamsos periodo metu (adaptuota pagal Kanaporis ir kt., 2012)
VP trukmės mažėjimas yra proporcingas lazerio apšvietimo intensyvu-mui. 3.1.2.3 paveiksle pavaizduotas VP trukmės trumpėjimas užregistruotas 60 sekundžių apšvietimo pabaigoje, esant trims skirtingoms sąlygoms: nedažytame audinyje, 660 nm (n=4); audiniuose, dažytuose su di-4-ANBDQBS, 660 nm (n=6) ir audiniuose, dažytuose su di-4-ANEPPS, 532 nm (n=5). Visais atvejais VP trukmės mažėjimas buvo proporcingas lazerio apšvietimo intensyvumui. VP sutrumpėjimas labiausiai išryškėjo audiniuo-se, kurie buvo dažomi su di-4-ANEPPS, 30,6±3,8 proc. Įdomu tai, kad pokytis dažytuose ir nedažytuose audiniuose prie tų pačių apšvietimo inten-syvumų, yra labai panašus, kas leidžia manyti, kad pokyčiai yra nulemti ne dažo, bet apšvietimo intensyvumo.
3.1.2.3 pav. Normalizuotų VP90 ir apšvietimo intensyvumo santykis
nedažytuose audiniuose (balti apskritimai), audiniuose dažytuose su di-4-ANBDQS (juodi apskritimai) ir audiniuose dažytuose di-4-ANEPPS
(trikampiai) (adaptuota pagal Kanaporis ir kt., 2012)
Norėdami nustatyti, ar apšvietimo intensyvumo paveiktas VP90 trumpė-jimas yra nulemtas miokardo pakenkimo dėl (foto)toksiškumo, įvertinome apšvietimo intensyvumo įtaką kitiems veikimo potencialo parametrams (3.1.2.4 pav.): veikimo potencialo amplitudei (VPA), maksimaliam prieki-nio fronto greičiui (Vmax) ir laidumo greičiui. Šie parametrai yra žinomi kaip jautrūs indikatoriai, priklausantys nuo miokardo elektrofiziologinės būklės.
