LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA, MEDICINOS FAKULTETAS
KARDIOLOGIJOS INSITUTAS
ELEKTRINĖS BANGOS SKLIDIMO MIOKARDE ĮVERTINIMAS:
EKSPERIMENTINIS TYRIMAS
Medicinos vientisųjų studijų
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė: dr. R. Mačianskienė
Darbo autorė: Birutė Vaidelytė
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 3 ABSTRACT ... 4 INTERESŲ KONFLIKTAS/PADĖKA ... 5 SANTRUMPOS ... 6 SĄVOKOS ... 7 ĮVADAS ... 8DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1 Optinis elektrinio signalo registravimo metodas ... 10
1.2 Naujų artimo infraraudonam spektrui PJFD potencialios galimybės OM tyrimuose ... 11
1.3 Optinio signalo išgauto su NIR PJFD vertinimas ... 13
1.4 Transmuralinių veikimo potencialų nustatymas ... 13
1.5 Optinio metodo ribotumai ... 14
1.6 Optinio signalo, registruojamo su NIR PJFD, parametrų vertinimas ... 15
2. MEDŽIAGOS IR METODAI ... 17
2.1 Tyrimuose naudoti tirpalai ir medžiagos ... 17
2.2 Vienetinių ląstelių išskyrimas ... 17
2.3 Ląstelių fluorescencijos stebėjimas ir vertinimas ... 18
2.4 JPW dažo toksiškumo nustatymas ląstelėse ... 19
2.5 Širdies išėmimas ir paruošimas perfuzijai Langendorfo sistemoje ... 19
2.6 Skilvelio sienelės preparato paruošimas ... 20
2.7 PJFD fototoksiškumo nustatymas ... 20
2.8 Elektrinių veikimo potencialų registracija mikroelektrodais ... 21
2.9 Visos širdies paruošimas elektrinio signalo registracijai ... 22
2.11 Optinių veikimo potencialų registracija ... 24
2.12 Veikimo potencialo parametrai ir jų vertinimas ... 24
2.13 Statistinė duomenų analizė ... 25
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26
3.1 Širdies izoliuotų ląstelių gyvybingumo tyrimai taikant naujus NIR PJFD ... 26
3.2 PJFD fototoksinio poveikio širdies audiniui įvertinimas ... 27
3.3 Elektrinio signalo sklidimo miokardu eksperimentinis įvertinimas taikant naujus NIR PJFD 31 3.3 Rezultatų apibendrinimas ... 35
4. IŠVADOS ... 38
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39
3
SANTRAUKA
Neinvazinis optinis metodas (OM), naudojant potencialui jautrius fluorescencinius dažus (PJFD), ypač infraraudonos sugerties (NIR), leidžia labai tiksliai įvertinti elektrinės bangos sklidimo miokarde pokyčius. Tačiau, nežiūrint didelių privalumų kitų, klinikoje naudojamų, elektrinio signalo registravimo metodų atžvilgiu, iki šiol naudojamas tik eksperimentiniuose tyrimuose, nes gautų duomenų interpretavimas yra sudėtingas, o fluorescenciniai dažai pasižymi toksiniu ar fototoksiniu poveikiu.
Šiame darbe tyrėme naujai sukurto NIR PJFD di-4-ANBDQBS toksines/fototoksines savybes ir jo poveikį į optinio veikimo potencialo (OVP) priekinį frontą, iš kurio pokyčių galima spręsti apie elektrinės bangos sklidimą miokardu. Tyrimai atlikti naudojant triušio širdies izoliuotus kardiomiocitus, jūrų kiaulytės dešinio skilvelio širdies preparatus bei Langendorfo sistemoje perfuzuojamas triušio širdis.
Gauti rezultatai atskleidė, kad di-4-ANBDQBS naudojant nuo 10 µM iki 50 µM dažo koncentracijas toksiškumu nepasižymėjo ir tik 100 μL koncentracija buvo toksiška bei sukėlė kardiomiocitų žūtį. Nebuvo nustatytas ir fototoksinis šio dažo poveikis jūrų kiaulytės skilvelio preparatuose. Stebėti veikimo potencialo pokyčiai buvo tik dėl šviesos šaltinių sukeltų temperatūros pokyčių, o ne dėl dažo fototoksinio poveikio.
Elektriniai veikimo potencialai (VP) užregistruoti su mikroelektrodais skirtingo gylio kardiomiocitų sluoksniuose transmuraliai kairiojo skilvelio sienelės leido išskaičiuoti vidurkinį transmuralinio-VP (TVP) ir, įvertinto per gylį G-TVP, priekinį frontą. Dirginant skirtingus širdies paviršius buvo eksperimentiškai sumodeliuojama norima bangos sklidimo kryptis. Vienu metu užregistruoti OVP (su di-4-ANBDQBS) ir G-TVP (su mikroelektrodais) leido OVP priekinį frontą išskirstyti į dvi dedamąsias: per gylį įvertintą transmuralinę ir lateralinę komponentes, kurios padėjo išskaičiuoti, kokia OVP priekinio fronto dalis tiesiogiai priklauso nuo transmuralinio sklidimo (iš endokardo-į-epikardą), o kokia nuo lateralinio (šoninio, paraleliai epekardiniam paviršiui) elektrinės bangos sklidimo miokardu.
Gauti duomenys gali būti naudingi įvertinant elektrinio signalo formavimosi ir sklidimo širdyje ypatybes normoje ir patologijų metu.
4
ABSTRACT
The non-invasive technique of optical mapping by using voltage-sensitive fluorescent dyes (VSFD), especially near-infrared (NIR) dyes. enables precise evaluation of electrical excitation propagation in the myocardium. However, in spite of considerable advantages when comparing with other clinical methods, OM is limited due to complicated data interpretation, fluorescent dye toxicity, and phototoxic effect, therefore, OM is used only in experimental studies.
In this study we investigated the toxicity and phototoxicity of the novel NIR VSFD di-4-ANBDQBS, and their influence on the optical action potential (OAP) upstroke. The OAP upstroke provides information about electrical exitation propagation in cardiac tissue. The experiments were performed using the isolated cardiac cells of the rabbit heart, the right ventricle wall of the guinea pig heart, and the Langerdorf-perfused rabbit heart model.
The results revealed that concentrations of 10–50 µM of di-4-ANBDQBS dye did not cause toxicity effects, and only 100 μM was determined as a toxic threshold which causes cardiac cell death. Also, we did not observe the phototoxic effect of the investigated dye in preparations of guinea pig ventricles. Registered temporary AP changes were just surface temperature variation that was caused by the light source. These temporary changes were not related with the phototoxic effect of the dye.
Obtained transmural recordings of electrical APs via multiple cell layers in various depths of the LV wall enabled the calculation of averaged transmural-AP (TAP) and depth weighted DWTAP, which allowed evaluation of the OAP upstroke. The direction of excitation wave was simulated by artificial pacing from various cardiac surfaces. Simultaneous registration of OAP (by using di 4 ANBDQBS) and DWTAP (with microelectrodes) enabled to split the OAP upstroke into two components: the depth-weighted and the lateral-scattering, which corresponds to the components of the propagating electrical wave that are transmural (from endocardium to epicardium) and parallel to the epicardium.
In this study the obtained data may have great value in evaluation of electrical signal formation and the formation of excitation in the heart under normal and pathological conditions.
5
INTERESŲ KONFLIKTAS/PADĖKA
Deklaruojame, kad autorių interesų konflikto nėra.
Šiems moksliniams tyrimams atlikti buvo gauta finansinė parama iš Lietuvos mokslo tarybos projekto „Studentų mokslinės veiklos skatinimas“ pagal 2007-2013 m. sutartį Nr.VP1-3,1-ŠMM-01-V-02-003 (Projektai: Nr. PRM14-29/SMT14R-148; Nr. PRM14/02/20/03/SMT14P-016; Nr. PRM13/02/04/08/SMT13P-052;) ir LSMU Studentų mokslinės draugijos. Projektų vadovė dr. R.Mačianskienė.
Tyrimams su eksperimentiniais gyvūnais atlikti yra gautas Lietuvos Respublikos valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimas (Nr. 0227, 2012-05-03).
6
SANTRUMPOS
∆F/F -Fluorescencijos pokyčio ir foninio fluorecencijos lygio santykis BDM - 2,3-butandiono monoksimas
CCD – naudojamas greitaeigėms kameroms krūvio sąsajos įtaisas, turintis puslaidininkių
(fotodiodinių) daviklių masyvą, kuris optinį signalą keičia į elektrinį (angl. charge coupled device)
KS – kairysis skilvelis
LED – šviesą emituojantis diodas (angl. light-emitting diode) ME – mikroelektrodas
NIR - artimas infraraudonam spektrui (angl. near-infrared) OM – optinis mepingas (angl. optical mapping)
OVP – optinis veikimo potencialas
PJFD – potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai SR – sinusinis ritmas
TVP - transmuralulinis veikimo potencialas VP - veikimo potencialas
VPT50 - veikimo potencialo trukmė, esant 50 proc. repoliarizacijos lygiui s.v. – santykiniai vienetai
7
SĄVOKOS
Optinis mepingas - optinė membraninio potencialo registravimo sistema, kurios pagrindu
registruojami membraninio potencialo pokyčiai, naudojant potencialui jautrius fluorescuojančius dažus (PJFD).
Potencialui jautrūs fluorescenciniai dažai – membraniniais potencialo pokyčiais aktyvuojami dažai,
kurių molekulės nusėda ant ląstelių membranos ir apšviestus tam tikro ilgio elektromagnetine banga geba transformuoti mebraninio potencialo pokyčius į optinius fluorescencinių bangų signalus.
Veikimo potencialo priekinis frontas - depoliarizacijos metu užrašomo veikimo potencialo kreivės
kylanti dalis.
Optinis veikimo potencialas – optiniu metodu registruotas elektrinis veikimo potencialas.
Transmuralinis veikimo potencialas – sumarinis (bendras) veikimo potencialas, kuris
išskaičiuojamas suvidurkinus visus su mikroelektrodais užregistruostus elektrinius veikimo potencialus skirtinguose kardiomiocitų sluoksniuose transmuraliai skilvelio sienelės.
8
ĮVADAS
Pasaulyje, jau daug metų didelis dėmesys skiriamas širdies elektrinio jaudinimo sutrikimų tyrimams. Optiniu būdu registruojamas elektrinis signalas, naudojant potencialui jautrius fluorescuojančius dažus (PJFD), turi daug privalumų lyginant su mikroelektrodais registruojamu signalu. Tačiau tradiciškai PJFD sužadinami mėlynai-žaliame šviesos spektre (532-nm), todėl jų taikymas klinikinėje diagnostikoje yra ribotas. Jais galima tirti tik paviršinius širdies elektrinio jaudinimo sutrikimus (iki ~2 mm) ir tik perfuzuojant fiziologiniu tirpalu, nes kraujyje esančios hemoglobino molekulės stipriai sugeria šio bangos ilgio šviesą ir dažų intensyvumas sumažėja.
Tik pastarąjį dešimtmetį, Dr. Loew laboratorijoje sukonstravus infraraudonos sugerties (angl.
near-infrared; NIR) PJFD [1,2], atsirado galimybe tirti elektrinio jaudinimo sutrikimus skirtinguose
miokardo lastelių sluoksniuose, nes su NIR fluorescenciniais dažais sužadinta šviesa įsiskverbia į audinį gerokai giliau (>1 cm.) ir geriau lyginant su mėlynai-žalio spektro PJFD. Be to, NIR dažai yra sužadinami ilgos bangos šviesoje (660-nm), kurios nesugeria hemoglobinas. Tai leido tirti širdies patologijų mechanizmus kraujo apsuptyje.
Naudojant eksperimentinių gyvūnų modelį ar taikant kompiuterinį modeliavimą yra nustatyta, kad su NIR PJFD registruojamas elektrinis signalas ir ypač jo priekinis frontas yra stipriai prailgėjęs, lyginant su mikroelektrodu registruotais veikimo potencialais (VP) iš vienos ląstelės nuo endokardinio ar epikardinio KS paviršiaus. Taip yra todėl, kad optiniu būdu išgaunamas signalas apima registruojamo elektrinio signalo informaciją ne tik iš vieno kardiomiocito, bet iš daugelio širdies lastelių esančių tiek epikardo paviršiuje, tiek giliau miokarde [3,4]. Todėl OVP priekinis frontas nors ir turi „užkoduotą“ visą informaciją apie elektrinį bangos skilidimą miokardu, tačiau jo interpretacija yra sudėtinga.
Šio darbo pagrindas buvo nustatyti NIR PJFD di-4-ANBDQBS sukeltus OVP priekinio fronto pokyčius įvairių eksperimentinių situacijų metu išaiškinimui. Norint palyginti skirtingais metodais išgautų elektrinių veikimo potencialų priekinius frontus, reikėjo vienu metu užregistruoti optinius ir transmuralinius-VP (t.y., ne iš vieno kardiomiocito, o visuose jų sluoksniuose transmuraliai KS sienelės). Naudoti skirtingų širdies paviršių dirginimai leido eksperimentiškai sumodeliuoti norimą bangos sklidimo kryptį ir tai padėjo OVP priekinį frontą išskirstyti į dvi dedamąsias (transmuralinę ir lateralinę) [5]. Šių dedamųjų nustatymas padėjo atskleiti, kaip keičiantis elektrinės bangos sklidimui kinta OVP priekinio fronto forma.
9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti naujai sukurto potencialui jautraus fluorescencinio dažo di-4-ANBDQBS
toksines/fototoksines savybes ir nustatyti optinio veikimo potencialo priekinį frontą formuojančias komponentes bei jų įtaką elektrinės bangos sklidimui miokardu.
Darbo uždaviniai:
1. Išmatuoti di-4-ANBDQBS fluorescencinio dažo švytėjimo intensyvumo priklausomybę nuo laiko ir nustatyti šio dažo toksinę koncentraciją izoliuotose triušio širdies ląstelėse.
2. Ištirti di-4-ANBDQBS dažo ilgalaikį poveikį širdies dešinio skilvelio optinių ir elektrinių veikimo potencialų (VP) parametrams ir įvertinti fototoksiškumą, bei gautus rezultatus palyginti su šio dažo trumpalaikiu poveikiu.
3. Naudojant kombinuotą metodą vienu metu užregistruoti optinius (su di-4-ANBDQBS) ir elektrinius (su mikroelektrodais) veikimo potencialus izoliuotos triušio širdies modelyje ir įvertinti optinio VP priekinį frontą formuojančias komponentes bei jų įtaką elektrinės bangos sklidimui miokardu.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Optinis elektrinio signalo registravimo metodas
Pasaulyje, kasmet daugėja žmonių sergančių širdies-kraujagyslių ligomis [6,7], todėl norint gerinti gyvenimo kokybę, svarbu ne tik tobulinti širdies ligų, ypač susijusių su širdies elektrinio jaudinimo sutrikimais, diagnostiką bet ir gebėti juos valdyti. Pastaraisias metais sukūriama vis daugiau inovatyvių diagnostikos priemonių, kurios palengvina kardiovaskulinės sistemos morfologinių, funkcinių ar metabolinių pokyčių tyrimus. Tačiau vis dar trūksta neinvazinio metodo, kuris leistų klinikinėje praktikoje trimatėje erdvėje tiksliai vizualizuoti elektrinio signalo sklidimą miokardu. Tokio metodo atsiradimas būtų labai naudingas ankstyvųjų aritmogeninių židinių diagnostikai, aritmijų gydymui bei moksliniam aritmogeninės židinių patogenezės mechanizmų išaiškinimui [8]. Nustatyta, kad pavienių kardiomiocitų alternavimo židinių atsiradimas elektrokardiogramoje yra susijęs su elektrinio sklidimo pokyčiais miokarde [9].
Nors jau daug metu yra skiriamas didelis demesys įvairių širdies sutrikimų tyrimams, tačiau tik neinvazinio optinio metodo (OM) atsiradimas, naudojant potencialui jautrius fluorescencinius dažus (PJFD), leidžiantis labai tiksliai įvertinti elektrinio signalo pokyčius erdvės ir laiko atžvilgiu, iškėlė elektrofiziologinių tyrimų galimybes į visai naują ir daug aukštesnį lygmenį [10,11,12]. Šis optinis elektrinio signalo registravimo metodas pagrįstas tuo, kad yra naudojami labai lipofiliški PJFD, kurie susikaupia ląstelių membranose. Sklindant elektriniam signalui širdyje, keičiasi širdies ląstelių membraninis potencialas, kuris pakeičia fluorescencinių dažų švytėjimo intensyvumą. Tai reiškia, kad PJFD molekulės, susirišusios su širdies ląstelių membranomis, priklausomai nuo įtampos pokyčių gali keisti savo spektrines savybes.
Numatant dideles šios metodikos perspektyvas ir reikšmę klinikinėje praktikoje, bei širdies aritimijų patogenezės mechanizmų išaiškinimui, OM pastaruosius du dešimtmečius buvo sparčiai tobulinamas. Buvo atlikti įvairūs tyrimai, kurie analizavo OM pritaikymo galimybes [13]: miokardo ląstelių kultūroms[14], ploniems audiniams [15] ex vivo izoliuotoms širdims [16,17] bei in vivo – neatjungtoms gyvoms širdims. Eksperimentuose buvo naudojama skirtinga OM metodika [18]. Išbandyti įvairūs šviesos šaltiniai [19,20,21], tokie kaip nelazeriniai šviesos šaltiniai (volframo halogeninės lempos ir lankinės lempos, kurios gali būti ksenoninės, gyvsidabrinės ir mišrios), lazeriai ir šviesą emituojantys diodai (angl. LED). Iš šių šviesos šaltinių argoniniai lazeriai dėl didelės spinduliuotės galios ir didelio spinduliuojamos šviesos intensyvumo plačiai taikomi eksperimentuose. Išbandytos ir įvairios optinio signalo detektorinės sistemos: silikoninių fotodiodų matricos (angl.
photodiode arrays) [22,23], lazerinis skenavimas [24], CCD (angl. charge coupled device) greitaeigės
11 Ne mažiau svarbūs OM sistemos įrenginiai, kurie būtini optinio signalo išgavimui, yra įvairūs sužadinimo ir emisijos filtrai, dichroiniai veidrodžiai, lęšiai, stiprintuvai ir kita įranga [26]. Todėl, ieškant optimaliausio PJFD bei OM registravimo metodikos per naują tekdavo įvertinti tiek fluorescencinio dažo savybes, tiek optinės sistemos ypatybes. Taip pat buvo susidurta ir su problemomis, tokiomis kaip miokardo nehomogeniškumas, nevienoda dažo sugertis bei signalo išsklaidymas. Nustatyta, kad priklausomai nuo dažo, jo skleidžiamas signalas silpsta gilesniuose miokardo sluoksniuose. Todėl OVP pokyčiai iš gilesnių miokardo sluoksnių likdavo neužregistruoti ir tai neleido vizualizuoti miokardo sienelės elektrinio aktyvumo trimatėje erdvėje. Taip yra todėl, kad anksčiau OM tyrimuose dažniausiai buvo naudojami klasikiniai mėlynai-žalio šviesos spektro spindulius sugeriantys dažai (dažniausiai stiriliniai ANEPPS – angl. Amino Naphthyl Ethenyl
Pyridinium grupės dažai) [27].
Tačiau, svarbu paminėti, kad tokių fluorescencinių dažų, kurių sužadinimas yra mėlynai-žaliame šviesos spektre (532-nm), taikymas klinikinėje diagnostikoje būtų labai ribotas. Su šio sužadinimo spektro dažais galima tirti tik paviršinius širdies elektrinio jaudinimo sutrikimus (iki ~2 mm) ir, svarbiausia, tik perfuzuojant fiziologiniu tirpalu. Taip yra todėl, kad kraujyje esančios hemoglobino molekulės stipriai sugeria šio bangos ilgio šviesą ir dažų intensyvumas ženkliai sumažėja.
1.2 Naujų artimo infraraudonam spektrui PJFD potencialios galimybės OM tyrimuose
Tik pastarąjį dešimtmetį įvyko ypač didelis proveržis, kai dr. L. Loew laboratorijoje buvo sukonstruoti infraraudonos sugerties (angl. near-infrared; NIR) PJFD [1,2]. Neseniai susintetintų NIR PJFD, turinčių hemocianino chromoforus, sužadinimas ir emisija yra beveik infraraudonos spalvos spektro (raudono spektro apačioje). Naudojant NIR fluorescencinius dažus atsirado galimybė tirti ne tik paviršinius elektrinio jaudinimo sutrikimus, bet ir gerokai gilesniuose miokardo ląstelių sluoksniuose. Taip yra todėl, kad audinių chromoforai ir hemoglobinas sugeria mažiau infraraudonam spektrui artimų šviesos bangų. Todėl NIR PJFD, tokie kaip di-4-ANBDQBS ir di-8-ANBDQBS, dėl savo unikalių savybių įgalina žymiai gilesnių (>1 cm.) miokardo sluoksnių vaizdinimą [1,2,28. 29]. 1pav. pateikti palyginamieji klasikinio mėlynai-žalio spektro di-4-ANEPPS PJFD ir naujo NIR PJFD di-4-ANBDQBS panašumai ir skirtumai.
12 1 .pav. Mėlynai-žalio ir artimo-infraraudonam spektrui (NIR) potencialui jautrių fluorescencinių
dažų (PJFD) cheminė struktūra, panašumai ir skirtumai.
NIR PJFD leido tiksliau nustatyti ir prognozuoti, naudojant eksperimentinių gyvūnų modelį ar taikant kompiuterinį modeliavimą [4,30], išemijos bei kitų širdies patologijų galimas pažeidimo vietas ir tai labai svarbu širdies-kraujagyslių ligų diagnostikoje. Tačiau, nežiūrint daugiametės eksperimentinės patirties ir gerų kompiuterinio modeliavimo rezultatų, OM iki šiol netaikomas klinikinėje praktikoje. Viena iš priežasčių – dauguma anksčiau tirtų PJFD dažų, kuriais buvo sėkmingai registruotas OVP, vėliau pasirodė esantys toksiški [31], todėl jų panaudojimas klinikoje yra neįmanomas. Taigi, daug tyrimų buvo orientuota į tinkamiausio PJFD klinikiniam panaudojimui paieškas. Mokslininkai gavo naują uždavinį – atrasti ne tik būdą, kuris kuo tiksliau registruotų miokardu sklindantį elektrinį signalą, bet ir būtų įmanomas pritaikyti praktikoje (t.y. būtų netoksiškas, nežalojantis audinių, ekonomiškas ir pakankamai informatyvus). Reikia paminėti, kad naujai sukontruotų di-4-ANBDQBS ir di-8-ANBDQBS dažų toksiškumas širdies ląstelėse dar nebuvo ištirtas.
13
1.3 Optinio signalo išgauto su NIR PJFD vertinimas
Neabejotinai, OM turi didelių privalumų kitų, klinikoje naudojamų, elektrinio signalo registravimo metodų atžvilgiu, tačiau išgaunamo OVP signalo interpretacija yra sudėtinga. Taip yra todėl, kad su NIR PJFD užregistruotas OVP, ypač jo priekinis frontas, yra ženkliai prailgėjęs, lyginant su elektriniais VP, kurie registruojami su mikroelektrodais (2 pav.), nes optiniu būdu išgaunamas signalas apima registruojamo elektrinio signalo informaciją ne tik iš vieno kardiomiocito, bet iš daugelio širdies ląstelių esančių tiek epikardo paviršiuje, tiek giliau miokarde [3,4].
2 pav. Veikimo potencialo priekinio fronto forma užregistruota su PJFD ir mikroelektrodu naudojant jūrų kiaulytės širdies modelį. A – vienas ant kito užkloti VP užregistruoti su mėlynai-žalio
spektro ir NIR PJFD, bei su mikroelektrodu iš epikardinės pusės. B – schematinis VP registravimo vaizdas (M – stiklinis mikroelektrodas, S – stimuliuojantis elektrodas, * - mikroelektrodo vieta). C-E –
veikimo petencialų priekinio fronto formos kitimas priklausomai nuo atstumo tarp dirginančio elektrodo ir mikroelektrodo.
Iki šiol, naudojant visos širdies modelį, kaip parodyta 2 pav. [32,33], OVP priekinio fronto, išgauto su NIR PJFD, vertinimui buvo naudojami mikroelektrodiniai užrašai gauti tik iš epikardinio paviršiaus ląstelių. Akivaizdu, kad OVP priekinis frontas yra gerokai ilgesnis už mikroelektrodais registruoto VP. Taigi, esant tokioms eksperimentinėms sąlygoms, šie elektriniai signalai tarpusavyje negali būti deramai palyginti. Todėl OVP priekinio fronto morfologijos interpretacijai dažniausiai buvo naudojamas kompiuterinis modeliavimas [3,4, 30, 34]. Norint tiksliau įvertinti, turėtų būti užregistruotas elektrinis signalas ne vienoje ląstelėje, o visuose kardiomiocitų sluoksniuose transmuraliai skilvelio sienelės. Tik turint transmuralinį elektrinio VP priekinio fronto profilį, būtų galima tiksliau įvertinti su NIR PJFD išgauto optinio veikimo potencialo priekinio fronto formos pokyčius įvairių eksperimentinių situacijų metu (pvz., kaip parodyta 2 pav., D-E, kintanti OVP priekinio fronto konfiguracija, kai signalas buvo registruojamas skirtingu atstumu nuo dirginančio elektrodo).
1.4 Transmuralinių veikimo potencialų nustatymas
Iki šiol, transmuralinių-VP registravimui buvo naudojami įvairių modelių optrodai [35,36,37,38]. Tik sukūrus optrodus atsirado galimybė ant visos širdies užregistruoti ~7-9 elektrinius
14 veikimo potencialus transmuraliai KS sienelės. Toks metodas leido neprapjovus skilvelio sienelės, t.y. nesuardžius Hiso-Purkinje laidžiosios sistemos, tirti ląstelių membranos potencialo ar viduląstelinio kalcio pokyčius endokardiniame paviršiuje bei vertinti elektrinės bangos sklidimą miokardu ar alternantų susidarymą. Tačiau, kaip parodyta 3 pav., tokie prietaisai buvo pakankamai invazyvūs ir stipriai pažeizdavo širdies audinį. Todėl, visi matavimai galėjo būti atliekami tik po stabilizavimosi periodo, t.y. praėjus daugiau nei 30 min. po optrodo įvedimo į širdį.
3 pav. Transmuralinių-VP registravimas su optrodu naudojant šuns širdies modelį. A – Schematinis
optrodo sumontavimas: skerspjūvio ir iš šono vaizdas. B – schematinis optrodo įvedimo transmuraliai KS sienelės vaizdas (Epi – epikardinis paviršius, Endo – endokardinis skilvelio paviršius) . C-D-E –
Optrodu registruojamo signalo vaizdas: atitinkamai eksperimento metu, schematinis ir VP (stačiakampyje - VP priekinis frontas).
Tačiau, tokio prietaiso naudoti klinikinėje diagnostikoje taip pat nebūtų galima dėl didelių invazinių širdies pažeidimų, kurie akivaizdžiai matomi (žiūr., 3 pav., E) ir ant užregistruotų elektrinių signalų. Be to, taikant šį metodą taip pat nėra galimybės užregistruoti elektrinio signalo pavieniuose kardiomiocituose, nes, kaip ir OM atveju, yra registruojamas sumarinis veikimo potencialas iš aplinkinių kardiomiocitų. Todėl su optrodu transmuraliai užregistruoto veikimo potencialo priekinis frontas taip pat yra prailgėjęs.
1.5 Optinio metodo ribotumai
Vienas iš pagrindinių optinio signalo registravimo ribotumų yra širdies judesio artefaktas [11], kuris neleidžia išskirti registruojamo optinio signalo iš triukšmų. Todėl OM eksperimentų metu yra naudojamos įvairios širdies imobilizacijos priemonės ir farmakologinės medžiagos, kurios gali atskirti širdies elektrinį jaudinimą nuo susitraukimo. Dažniausiai eksperimentuose buvo vartoti 2,3-butandiono monoksimas (angl. 2,3-butandione monoxime, BDM), blebistatinas ar citoholasinas D [39,40,41]. Nors blebistatinas efektyviai panaikina miokardo kontrakciją, nesukeldamas didelių šalutinių poveikių
15 [42], tačiau tyrimuose jis rečiau naudojamas dėl brangumo. Kaip alternatyva, dažnai naudojamas BDM. Tačiau nustatyta, kad BDM dėl blokuojančio poveikio į kalcio srovę, turi įtakos ir veikimo potencialo trukmei [43]. Todėl užregistruoti optiniai signalai gali būti siauresni. Be to, yra duomenų, kad BDM gali skatinti skilvelių virpėjimo atsiradimą [44]. Blebistatinas taip pat gali sukelti aritmogeninius pokyčius, tačiau labai retai ir tik esant itin dideliai preparato koncentracijai [45].
Kitas, ne mažiau svarbus OM metodikos ribotumas, kuris gali iškraipyti optinį signalą, yra fotonų išsiklaidymas (angl. photon-scattering) audinyje [34], kuris priklauso nuo taikyto eksperimentinio modelio bei audinio geometrijos [30]. Iškraipytas signalas neleidžia gerai interpretuoti gautų duomenų. Nustatyta, kad norint pagerinti signalo kokybę, reikėtų didinti šviesos intensyvumą ir tada mažėtų registruojamų OVP triukšmai. Tačiau, kartu su šviesos intensyvumo didėjimu atsiranda ir foto-blukimas bei sukeliami foto-toksiškumo reiškiniai [46]. PJFD foto-toksiškumas gali atsirasti esant dideliai apšvitai, kas gana dažnai pasitaiko tiriant izoliuotus kardiomiocitus. Atlikus eksperimentus su di-4-ANBDQBS PJFD ant izoliuotų ląstelių nustatyta, kad esant ilgalaikei šviesos šaltinio apšvitai, VP trukmė gali pailgėti, t.y. pakinta VP forma [47]. Fototoksinis poveikis priklauso tiek nuo tiriamo preparato (izoliuotose ląstelėse stebimi didesni fototoksniai poveikiai nei visos širdies preparatuose), tiek apšvietimo šaltinio ir audinio morfologinių savybių. Be to, skirtingi PJFD turi skirtingą fototoksinį poveikį, kuris kinta keičiantis dažų koncentracijoms [48]. Todėl fototoksiškumas turi būti ištirtas kiekvienam PJFD individualiai.
1.6 Optinio signalo, registruojamo su NIR PJFD, parametrų vertinimas
Optiniu būdu registruojamo OVP įvertinimui, kaip ir su mikroelektrodais registruojamų VP, dažniausiai matuojami sekantys parametrai: VP trukmė (VPT; matuojamas 50 arba 90 proc. repoliarizacijos lygyje (atitinkamai VPT50 ir VPT90), ramybės potencialas (RP) bei VP amplitudė (VPA; greičiausias VP depoliarizacijos (priekinio fronto) kitimas [49]. Tačiau nustatyta, kad labiausiai pakinta OVP priekinis frontas. OM būdu registruojamas OVP priekinis frontas yra ilgesnis, nei analogiškas parametras užregistruotas su mikroelektrodu vienoje ląstelėje. Toks OVP priekinio fronto ilgėjimas nėra atsitiktinis, nes jį nulemia tiek miokardo, tiek dažo optinės savybės [3, 50]. NIR dažams signalo išsisklaidymas yra didesnis [50], kadangi išspinduliuojama fluorescencija kyla iš gilesnių miokardo sluoksnių (didesnė išsisklaidymo erdvė) [3].
Pastarąjį dešimtmetį viena mokslininkų grupė bandė atskleisti, kaip OVP, užregistruoto su PJFD, priekinio fronto morfologija atspindi elektrinės bangos sklidimą miokardu [3,4]. Deja, šiuo klausimu vyrauja kelios skirtingos nuomonės ir, kol kas, nėra prieita vieningos nuomonės [30,34], ar iš pakitusio OVP priekinio fronto galima spręsti apie sužadinančios bangos sklidimą miokardu, ar negalima. Tačiau, kaip jau buvo minėta aukščiau, norint įvertinti OVP, ir ypač jo priekinio fronto,
16 kuris turi visą informaciją apie elektrinės bangos sklidimą miokardu, pokyčius, pirmiausia, turi būti užregistruotas elektrinis signalas transmuraliai KS sienelės (t.y. transmuralinis-VP). Tik tada šiuos parametrus bus galima tiksliau įvertinti.
Lietuvoje (LSMU Kardiologijos institute) buvo sukurtas ir pritaikytas darbui su eksperimentinių gyvūnų širdimis naujas kompleksinis elektrinio signalo sklidimo registravimo metodas, apjungiantis optinę ir elektrinę veikimo potencialų registravimo metodikas [5,51,52]). Šis kompleksinis metodas leido eksplantuotoje širdyje (perfuzuojamos Langendorfo sistemoje) vienu metu užregistruoti optinius (su NIR PJFD pagalba) ir elektrinius veikimo potencialus (naudojant stiklinius mikroelektrodus) skirtinguose širdies kairiojo skilvelio kardiomiocitų sluoksniuose ir leido tiesiogiai palyginti šių elektrinių potencialų, registruotų skirtingomis metodikomis, formą bei įvertinti elektrinio jaudinimo signalo skirtumus, atsiradusius dėl erdvinės optinio signalo sumacijos.
17
2. MEDŽIAGOS IR METODAI
Vykdyti tyrimai atitinka Europos Bendrijos nustatytus principus ir turi Lietuvos Respublikos valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimą atlikti eksperimentus su gyvūnais. Eksperimentai atlikti 2013-2015 m.m. su jūrų kiaulytės ir triušio širdies preparatais LSMU kardiologijos instituto membranų biofizikos laboratorijoje. Siekiant įvykdyti darbo uždavinius tyrimai buvo vykdomi keliais etapais. Iš pradžių buvo siekiama nustatyti naujo di-4-ANBDQBS dažo toksiškumą izoliuotose širdies ląstelėse bei įvertinti jo fototoksiškumą skilvelio sienelės preparatuose. Tolimesniuose tyrimuose buvo siekiama šio naujo potencialui jautraus dažo pagalba užregistruoti ir įvertinti elektrinio impulso sklidimą visoje širdyje.
2.1 Tyrimuose naudoti tirpalai ir medžiagos
Eksperimentų metu naudoto Normalaus Tyrode (NT) tirpalo sudėtis (mM): 135 NaCl, 5.4 KCl, 0.9 MgCl2, 1.8 CaCl2, 0.33 NaH2PO4, 10 HEPES ir 10 D-gliukozės (pH 7,4 su NaOH). Bekalcinis
Tyrode tirpalas paruoštas neįdedant CaCl2 į NT tirpalą.
Ląstelių izoliavimui naudoti fermentai: kolagenazė (390 U/mL; Worthington CLS-II, JAV) ir proteazė (6 U/mL; tipas – XXIV; Sigma, JAV)
NIR PJFD Di-4-ANBDQBS (JPW-6033) gautas iš Dr. L. Loew (Konektikuto universitetas, JAV), blebistatinas buvo iš Cayman (JAV), di-4-ANEPPS iš Molecular Probes (JAV), Pluronic F-127 iš (JAV) ir visi kiti reagentai iš Sigma-Aldrich (JAV) firmų. Baziniai tirpalai paruošiami tirpinant medžiagas etanolyje arba DMSO. Nustatyta, kad šių tirpiklių naudotos koncentracijos (0,1 proc. tūrio) tiriamuose tirpaluose neturi įtakos tiriamiems parametrams.
2.2 Vienetinių ląstelių išskyrimas
Fermentinis širdies ląstelių išskyrimas buvo atliekamas dviem būdais: Langerdorfo sistemoje perfuzuojant visos širdies preparatą arba naudojant širdies raumens audinio gabalėlius.
Pirmuoju būdu izoliuotos triušio širdies ląstelės buvo gaunamos perfuzuojant širdį per aortą Langendorfo sistemoje. Tokiu būdu pirmiausia buvo ~18 min. perfuzuojama bekalciniu, deguonimi prisotintu NT tirpalu (37oC). Vėliau ~20 min. perfuzija buvo tęsiama bekalciniu NT tirpalu su fermentais (1mg/mL kolagenazės ir 0,5 mg/mL proteazės). Taip suardomi miokardo tarpląsteliniai ryšiai. Fermentų poveikio sustabdymui buvo atliekama 5 min. perfuzija su bekalciniu NT tirpalu, vėliau perfuziją 5 min. tęsiant tirpalu, kurio sudėtyje buvo 0,18 mM Ca2+
. Tada širdį išėmus iš Langendorfo sistemos, iškerpamas kairysis skilvelis ir jį švelniai papurčius ląstelės iškratomos į lėkštelę.
18 Antruoju būdu ląstelės buvo išskiriamos naudojant jau sukarpytus širdies raumens audinius (bioptatus), kurie buvo veikiami panašiais fermentiniais tirpalais. Tokiu būdu, širdies audinio bioptatas pirmiausia buvo perkeliamas į oksigenuotą kambario temperatūros bekalcinį NT tirpalą, į kurį papildomai įdėta 30 mM BDM (sužadinimo-susitraukimo proceso atskyrėjo) ir 100 μM EGTA (Ca2+
surišėjo) ir dar smulkiau sukarpomas (iki ~1mm dydžio). Po 5 min. audinių gabalėliai kelis kartus praplaunami bekalciniu NT tirpalu ir inkubuojami į šį tirpalą įdėjus 1 mg/mL kolagenazės, 0,5 mg/mL proteazės ir 5 mg/mL BSA. Stiklinėlė su širdies raumens suspensija įstatoma į termostatą-kratytuvą (37oC) ir 45 min. purtoma, tirpalą nuolat sotinant 100% deguonimi. Po to, nupylus fermentinį tirpalą, širdies audinio gabalėliai užpilami 10 ml šviežiai paruoštu bekalciniu NT tirpalu su 1 mg/mL kolagenazės bei 5 mg/mL BSA ir vėl 15-20 min. purtomi.Purtymo metu kas 10-15 min. buvo imami suspensijos mėginiai ir su invertuotu mikroskopu buvo tikrinamas ląstelių išsiskyrimo kiekis ir kokybė. Pasiekus maksimalią išsiskyrusių ląstelių išeigą, jos buvo nuplaunamos nuo fermentų su bekalciniu NT tirpalu ir filtruojamos. Ląstelės nusodinamos švelniai centrifuguojant ir laikomos kambario temperatūros NT tirpale su 0,18 mM Ca2+
.
Eksperimentiniai tyrimai buvo atliekami tik su nepažeistomis, lazdelės formos ir išreikštu ruožuotumu širdies ląstelėmis kambario temperatūroje (+20 ± 2 o
C).
2.3 Ląstelių fluorescencijos stebėjimas ir vertinimas
Ląstelių suspensija patalpinama į specialią, stebėjimui su fluorescenciniu mikroskopu pritaikytą, lėkštelę. Tyrimai atlikti naudojant invertuotą mikroskopą Olympus IX71. Į 5 mL Tyrode tirpalo buvo įpilama 50 μL ląstelių suspensijos ir ~10 min. laukiama, kol ląstelės nusės ant dugno. Ląstelėms nusėdus ant jų su mikropipete buvo užlašinama 10 μL di-4-ANBDQBS dažų, t.y. dažniausiai moksliniuose tyrimuose naudojama koncentracija. Buvo stebimas švytėjimo intensyvumo pokytis, t.y. buvo dinamiškai sekamas PJFD pasiskirstymas ląstelių membranoje (4 pav.,B). Švytėjimo intensyvumas matuotas kas 30 min. - fiksuota koncentracija sukelianti didžiausią membranos švytėjimą.
Pro mikroskopą stebint ląsteles buvo vertinamas jų gyvybingumas. Stebėta sveikiems kardiomiocitams būdinga stačiakampė ląstelės forma, ryškus vidinis dryžuotumas ir tolygi membrana visoje ląstelėje (4 pav., A). Prasidedant apoptoziniams ląstelės mechanizmams buvo stebimi kardiomiocito formos pokyčiai (galų apvalėjimas), ląstelės membranos vientisumo pakitimas ir kita (4 pav., C-D).
Signalo intensyvumas membranoje buvo matuotas nufotografavus ląstelę su ImageJ 1.4S programa ir analizuotas kadro šviesos intensyvumas [53,54] parinkus po 1 pikselio 50 taškų, esančių membranoje. Prieš vertinant kiekvienos ląstelės apšvitą, t.y. kadre užfiksuotą fluorescensinį šviesumą,
19 buvo įvertinta bendra kadro vidutinė foninė apšvita, kuri fiksuojama už ląstelių esančiame fone. Apskaičiuotas koreguotas visos ląstelės fluorescencijos šviesumo lygis, kuris buvo skaičiuotas iš pasirinktų membranos taškų šviesumo lygio atėmus integruotą nuotraukos fono, esančio už ląstelės ribų, šviesumą.
Aprašant ląstelės membranos intensyvumą naudoti ImageJ santykiniai pilkumo dydžiai. Rezultatuose jis pateikiamas apskaičiavus vidurkį ir standartinę paklaidą.
4 pav. JPW dažo poveikio vertinimas triušio širdies ląstelėse. Vertinti ląstelės vaizdai: (a) su faziniu
mikroskopu, (b) su fluorescenciniu mikroskopu; PJFD toksiškumo nustatymas: (c) ląstelės trumpėjimas ir (d) žūtis.
2.4 JPW dažo toksiškumo nustatymas ląstelėse
50 μL triušio širdies ląstelių suspensijos įpilama į 5 mL NT tirpalo ir laukiama (~10 min), kol ląstelės nusės ant vaizdinimo lėkštelės dugno. Tyrimai atlikti naudojant invertuotą fluorescencinį mikroskopą Olympus IX71. Ląstelėms nusėdus ant jų su mikropipete buvo užlašinama skirtingos NIR PJFD koncentracijos, siekiant nustatyti kardiomiocitams toksinę dažo koncentraciją, sukeliančią ląstelių žūtį. Buvo stebimas kardiomiocito sutrumpėjimas ir, galiausiai, žūstanti ląstelė tampa beveik sferinės formos (suapvalėja).
2.5 Širdies išėmimas ir paruošimas perfuzijai Langendorfo sistemoje
Pirmiausia eksperimentiniai gyvūnai buvo seduojamos intraperitonaliai (jūrų kiaulytės) arba į sprandą (Naujosios Zelandijos balti triušiai) suleidžiant natrio pentobarbitalio (300 mg/kg) ir 500 U/kg heparino tirpalus. Triušiams buvo atliekama papildoma anestezija suleidžiant ketamino (10 mg/kg) kartu su heparinu (1000 U/kg) injekciją per ausies veną. Po to, patikrinus gyvūno jautrumą ir neužfiksavus jokių jautrumo požymių, buvo atliekama krūtinės ląstos atvėrimo procedūra. Išimama širdelė buvo įdedama į indą su oksigenuotu, kambario temperatūros NT tirpalu.. Jame širdelė buvo
kaniuliuota per aortą ir prijungta prie Langerdorfo perfuzinės sistemos, kurioje ji buvo perfuzuojama fiziologiniu NT tirpalu oksigenuojant su 100 proc. O2. Pašalinus kraują iš širdies koronarų, buvo
matuojamas fiziologinio tirpalo pratekejimo per širdį greitis ir atliekmos kitos procedūros (žiūr. žemiau). Per aortą kaniuliuotos širdelės buvo perfuzuojamos Langerdorfo sistemoje ~10 minučių ir
20 nusistovėjus širdies ritmui į aortą (per burbulų gaudytuvą) buvo lėtai suleidžiama 10 ml NT tirpalo „bolusas“ (angl. bolus) su 25 mM di-4-ANBDQBS arba 10 mM di-4-ANEPPS PJFD. Gauta tiriamo PJFD koncentracija tirpale atitinkamai buvo 50 µM ir 25 µM. Norint palengvinti dažo nusėdimą audinyje buvo pridėta 0,01 proc. Pluronic F-127. Siekiant sumažinti raumens kontrakciją VP registravimų metu, į NT tirpalą su PJFD buvo įdėta 20 μM blebistatino. Eksperimentuose su triušio širdimi, kad išvengti didesnių judesio artefaktų, papildomai buvo įdėta 5 mM BDM.
2.6 Skilvelio sienelės preparato paruošimas
Fototoksiškumo eksperimentai atlikti su 0,2-0,3 kg svorio jūrų kiaulyčių dešiniojo skilvelio sienelės preparatais (n =7). Širdelių svoris buvo 12,8 ± 0,8 g.
Suleidus dažus, širdelė buvo atjungiama nuo Langerdorfo perfuzinės sistemos, iškerpama dešinio skilvelio sienelė ir patalpinama į termostatuojamą kamerą (5 pav.), palaikant perfuzinio tirpalo temperatūrą 36,5 ± 0,5°C su termostatu (170051A Thermo Fisher Scientific, JAV). NT tirpalo tėkmės greitis buvo 10ml/min. Širdies sienelės preparatas buvo dirginamas bipoliariniu elektrodu 1 Hz dažniu, naudojant 2-ms trukmės elektrinius impulsus. Impulsų stiprumo amplitudė buvo nustatoma du kartus didesnė, nei registruota slenkstinė diastolinė riba. Elektrinė stimuliacija generuota per programinį stimuliatorių DS8000 su linijiniu stimulų izoliaciniu bloku A395R (World Prec. Instr., JAV).
5 pav. Jūrų kiaulytės dešiniojo skilvelio sienelės preparatas
2.7 PJFD fototoksiškumo nustatymas
Di-4-ANBDQBS dažų sužadinimui buvo naudotos vientisų 660 nm ilgio bangų, 600mW galios diodinis lazeris (SDL-660-600T, Shanghai Dream Lasers Technology) praplatinant šviesos srovės skersmenį su 5mm storio 5° holografiniu difuzeriniu filtru (R217582-11165, Edmund Optics, JAV). Darbui su di-4-ANEPPS dažais buvo naudotas 532-nm bangų ilgio, 1000-mW galios 3-mm skersmens šviesos srautą generuojantis lazeris (SDL-532-1000T, Shanghai Dream Lasers Technology). Srovė buvo praplėsta papildomai, naudojant 20° holografinį difuzerinį filtrą (R176395-10033, Edmund
21
Optics, JAV). Apšvitos intensyvumas buvo keičiamas naudojant neatspindinčius neutralaus tankio
filtrus (Edmund Optics, JAV) ir linijinį stiklinį poliarizuojantį filtrą (R215402-11139, Edmund Optics, JAV). Apšvita buvo kalibruota naudojant galios matavimo įrenginį (PM100, Thorlabs, JAV) ir nuolat monitoruojant šviesos daviklį. Eksperimentų metu buvo generuojami 60 s (1 min.) ir 300s (5 min.) apšvitos ciklai, po kurių visada sekdavo 120 sek. (2 min.) tamsos periodai. Kiekviename lazerio šviesos cikle apšvitos intensyvumas buvo palaipsniui didinamas nuo 0,1 iki 5mW/mm2
.
Siekiant įvertinti terminį didelio intensyvumo apšvitos poveikį buvo naudojamas 0,65 mm diametro termosensorius, priklijuotas prie širdelės sienelės preparato vidinės apšviečiamos pusės.
Optiniai veikimo potencialai buvo registruojami su greitaeige 14-bitų šaldoma (-80 °C) EMCCD kamera (iXonEMþ DU-860, Andor Technology, Airija) su papildomais lęšiais (Helios 44, fokalinis ilgis 50 mm, F 2.0, Rusija), naudojant vaizdinio registravimo kompiuterinę programą (Andor
SOLIS x-3567, Jungtinė Karalystė). EMCCD kamera buvo pastatyta 30 cm nuo dešiniojo skilvelio
preparato ir nukreipta į epikardinį jo paviršių, nustatant 7,1x7,1 mm registracijos lauką. Iš šio laiko 500Hz dažniu buvo daromi 128x 128 pikselių raiškos paveiksliukai. Di-4-ANBDQBS išspinduliuotos fluorescensinės bangos buvo registruojamos 715 nm ilgalaidžiu filtru (HQ650∕40m, Chroma
Technology, JAV), o di-4-ANEPPS dažų fluorescensinėms bangoms registruoti buvo naudojamas 650
nm juostinio pralaidumo filtru (HQ650∕40m, Chroma Technology). Matricos stiprinimas (EM) buvo nustatomas nuo 4 iki 100, siekiant palaikyti foninį fluorescencijos lygį pastovų ir artimą saturacijos lygiui ir taip sumažinti santykinį OVP triukšmų lygį. Eksperimento metu nufotografuoti kadrai buvo analizuojami kompiuterine programa ImageJ 1.4S.
2.8 Elektrinių veikimo potencialų registracija mikroelektrodais
Siekiant įvertinti elektrinio signalo sklidimą miokardu bei kardiomiocitų VP pokyčius tamsos fazėje (kai po lazerio 1 ar 5 min. apšvietimo būdavo išjungiami lazeriai), optinio mepingo metodas yra negalimas. Todėl eksperimento metu VP pokyčiams ląstelėje registruoti buvo naudojama stikliniai mikroelektrodai (6 pav.), kurie užripildyti 3 M KCl tirpalu. ME buvo įsmeigti į skilvelio preparatą, 3-4 mm atstumu nuo stimuliuojančio elektrodo. VP signalai registruoti MEZ-7101 stiprintuvu (Nihon
Kohden, Japonija) ir 10 kHz dažniu konvertuoti į skaitmeninį signalą 816 AD konverteriu (Advantech,
CA, JAV). ME registruoti VP buvo analizuojami LabChart programa. Taip pat buvo apskaičiuotas signalo sklidimo miokardu greitis. Jo nustatymui buvo padalinamas atstumas nuo ME iki dirginančio elektrodo iš laiko, kuris praėjo nuo dirginimo impulso ir VP repoliarizacijos pradžios.
22 6 pav. Stiklinis mikroelektrodas.
2.9 Visos širdies paruošimas elektrinio signalo registracijai
Tyrimams atlikti naudoti 3,0 - 4,0 kg Naujosios Zelandijos baltieji triušiai (n =14). Širdies išėmimo procedūros pateiktos aukščiau. KS sienelės storis buvo 5,1 ± 0,2 mm.
Tyrimai atlikti Langendorfo perfuzinėje sistemoje palaikant pastovų slėgį (80 mmHg), pratekančio NT tirpalo perfuzijos greitis 40 ± 3 mL/min. Norint išvengti išorinio širdies paviršiaus atšalimo, per įkirpą kairiajame prieširdyje į KS buvo įvedamas vamzdelis (7 pav.). Per jį buvo atliekama papildoma perfuzija su oksigenuotu NT tirpalu, kurio perteklius drėkindavo epikardo paviršių.
7 pav. Triušio visos širdies preparato Langendorfo perfuzinėje sistemoje instrumentacija.
A – schematinis vaizdas. B – registruotas fluorescencijos signalas. C – mikroelektrodų įvedimas. D – eksperimento metu registruoti elektriniai signalai: optiniai veikimo potencialai (OVP) ir su mikroelektrodais (M1-endokardinis ir M2-epikardinis) veikimo potencialai (VP) skirtingų dirginimų
23 Eksperimentų metu širdis buvo dirginama iš atrialinės (prieširdinės), epikardinio bei endokardinio paviršių (7 pav.). Dirginimo stiprumas buvo nustatomas du kartus didesnis nei diastolinė slenkstinė riba 2-ms intervalu. Atrialiniam ir epikardiniam dirginimams atlikti, atitinkamai, į dešinįjį prieširdį bei KS epikardinį paviršių buvo įsegama po bipoliarinį sidabrinį elektrodą. Endokardinei stimuliacijai bipolinis elektrodas buvo įvedamas į KS ertmę per padarytą įkirpą kairiajame prieširdyje. Be to, į KS ertmę buvo įvedamas ir AgCl elektrodas, kuris reikalingas registravimams mikroelektrodu.
2.10 Veikimo potencialų registracija ant visos triušio širdies
VP registravimui naudojant visos širdies preparatą buvo pritaikyta LSMU KI membranų biofizikos laboratorijoje sukurta unikali VP registravimo įranga. Tam buvo naudojami labai ploni stikliniai ME (7 pav.), kad nebūtų pažeidžiamas miokardas. ME buvo įvedami iš epikardinio KS paviršiaus. ME varža buvo nuo 35 iki 55 MΩ. VP registravimui stikliniai mikroelektrodai buvo pritvirtinti prie hidraulinių mikromanipuliatorių. Įvedamų mikroelektrodų gylio ivertinimui, prie jų laikiklių buvo prijungiami specialūs detektoriai (Millitron; Measuring Probes 1310). VP buvo registruojami, naudojant dviejų kanalų stiprintuvą MEZ-71011 (Nihon Kohden, Japonija) su didele įėjimo varža ir talpumo kompensavimu. Signalas buvo pakeistas į skaitmeninę formą, naudojant 16-kanalų PowerLab sistemą (ADInstruments, Didžioji Britanija). Signalas gautas iš gylio dtektorių buvo buvo registruojamas LabChart8 Pro programa kartu su elektriniais VP. ME galiukui palietus paviršinį epikardo sluoksnį, programoje nustatomas gylio nulinis taškas ir buvo registruojami pirmieji VP. Vedant mikroelektrodą gilyn, detektorius fiksavo atstumą nuo epikardo paviršiaus.
Eksperimento metu vienas mikroelektrodas buvo įvedamas į subepikardinį kardiomiocitų sluoksnį, t. y. apie 0,5 mm nuo epikardo paviršiaus, o kitas mikroelektrodas buvo įvedinėjamas gylyn per visą KS sienelę iki subendokardo kardiomiocitų sluoksnio (į ~5 mm gylį) (7 pav.). VP registravimui transmuraliai (7 pav.) mikroelektrodas buvo įvedinėjamas tolygiai gylyn, t.y. į kiekvieną KS sienelės kardiomiocitų sluoksnį kol buvo pasiekiamas subendokardas. Tikslus KS sienelės storis mikroelektrodo įvedimo vietoje buvo nustatomas eksperimento gale.
24 8 pav. Veikimo potencialų registravimas transmuraliai KS sienelės.
A-C – transmuraliai registruojamų VP vaizdas pateiktas skirtingais išplėtimais. D– matuoti VP parametrai
2.11 Optinių veikimo potencialų registracija
Optiniai veikimo potencialai (OVP) visoje triušio širdyje registruoti, kaip ir atliekant tyrimus su jūrų kiaulyčių dešinio skilvelio preparatais. Padidinti dažo įsiskverbimą į miokardą, dažo leidimo metu (~3 min.) perfuzijos greitis Langerdorfo sistemoje buvo perpus sumažinamas. Dažymo metu buvo sekamas fluorescencinio lygio kitimas. Bendras fluorescencijos lygis virš foninio lygio buvo apskaičiuojamas procentais (7 pav., B). Paskaičiuotas F/F siekė 20,38 ± 0,63 proc. (n = 4), kas parodo gerą optinio signalo dydį.
Di-4-ANBDQBS dažų sužadinimui buvo naudojamas 660 nm bangos ilgio lazeris su sklaidytuvu, kad išgauti homogenišką širdies apšvietimą (SDL-660-600T, Shanghai Dream Lasers Technology). Emisijos filtras – 715-850 nm (NT46-066, Edmund Optics, JAV). Optiniu budu registruojamo signalo laiko pradžios nustatymui, kameros filmavimo lauke buvo patalpinamas mažas šviesos šaltinis (LED, 940 nm), kuris generuodavo 0,5 ms trukmės impulsus, susinchronizuotus su stimuliavimo dažniu. Registravimo laukas buvo 20×20 mm. Rezoliucija 128×128 pikseliai, naudojama vaizdų apdorojimo programa Andor SOLIS x-3467, kadrų dažnis 500 Hz, sužadinimo intensyvumas ~0,5 mW/mm. Lazerio sužadinimas kontroliuojamas sinchronizuotai su kameros atsidarančia ir užsidarančia sklende. Užregistruotų vaizdų analizei buvo naudota ImageJ 1.4S programa.
2.12 Veikimo potencialo parametrai ir jų vertinimas
Buvo analizuojami šie VP parametrai: VP amplitudė (VPA); VP trukmė (VPT- laikas nuo priekinio fronto maksimalaus greičio iki 50 proc. ir 90 proc. repoliaricazijos (atitinkamai VPT50 ir
25 VPT90); maksimalus VP priekinio fronto greitis (Vmax) bei ramybės potencialas. Sklidimo greitis
buvo skaičiuojamas nuo stimulo pradžios laiko iki VP priekinio fronto maksimalaus greičio. Analizuoti VP parametrai pateikti 8 pav., D.
2.13 Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta su IBM SPSS v19. programiniu paketu, OriginPro7 bei Microsoft Excel programomis. Nepriklausomiems kiekybiniams tarpusavyje palyginti naudotas Kolmogorov Smirnov Z (dviems grupėms palyginti) ir Kruskal Wallis H (tijų grupių palyginimui) testai, priklausomų dydžių palyginimui – Wilcoxon Exact testas. Parametrinių dydžių koreliacijoms nustatyti taikytas Pearson, neparametrinių - Spearman testas. Tarpusavio tiesiniam ryšiui nustatyti – linijinė regresinė analizė. Siekiant nustatyti tiesinę dydžių tarpusavio priklausomybę, taikyta tiesinė regresinė analizė. Visuose statistiniuose skaičiavimuose, p < 0,05 buvo laikyta statistiškai reikšminga.
26
3.
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Širdies izoliuotų ląstelių gyvybingumo tyrimai taikant naujus NIR PJFD
Žinoma, kad dauguma fluorescencinių dažų pasižymi toksinėmis savybėmis ir tai yra viena iš pagrindinių priežasčių neleidžiančių jų panaudoti klinikinėje diagnostikoje. Kadangi naujai sukurto NIR PJFD di-4-ANBDQBS (JPW-6030) įtaka ląstelių gyvybingumui nebuvo tirta, todėl šio tyrimo metu pirmiausia siekėme nustatyti, ar ši medžiaga pasižymi toksinėmis savybėmis. Eksperimentiniai tyrimai buvo atliekami dviem etapais.
Pirmo etapo metu buvo tiriama ar fluorescencinio di-4-ANBDQBS dažo 10 μM koncentracija, kuri dažniausiai naudojama įvairiuose moksliniuose tyrimuose, nėra toksinė. Tyrimams atlikti naudojome izoliuotas miokardo ląsteles, kuriose buvo stebimas minėto fluorescencinio dažo kaupimosi ląstelės membranoje kitimas iškart ir po kelių valandų poveikus. Nustatėme, kad sveikose ląstelėse, kurių membrana nėra pažeista, 10 μM di-4-ANBDQBS koncentracija net po keletos valandų veikimo nebuvo toksiška, kadangi fluorescencija kaupėsi tik ląstelės membranoje, t.y. nepateko į jos vidų. NIR PJFD paveikti kardiomiocitai nepakeitė formos ir neprarado jiems būdingo dryžuotumo. Sveikuose kardiomiocituose fluorescencijos intensyvumas buvo tolygiai pasiskirstęs visoje ląstelės membranoje (9 pav., B). Analizuojant membranų švytėjimą skirtingu laiko momentu po dažų poveikio buvo nustatytas tiesioginis ryšys tarp dažų veikimo trukmės ir švytėjimo intensyvumo Atlikus Spearman koreliacinę analizę buvo nustatytas vidutinio stiprumo ryšys tarp dažo koncentracijos ir membranos švytėjimo intensyvumo (r=0,446; p<0,001) (9 pav., A). Mažiausias membranos švytėjimas buvo užregistruotas pirmąją valandą (t.y., po 30 min. ir po 1 val. atitinkamai buvo santykiniais vienetais (s.v.) 71,86 ± 0,98 ir 80,08 ± 1,35). Vėliau fluorescencija membranoje palaipsniui didėjo ir po 2-3 val. jis atitinkamai buvo 83,25 ± 2,46 s.v. ir 85,90 ± 1,48 s.v. Maksimali fluorescencija užregistruota ląstelės membranoje, esant 10 μM di-4-ANBDQBS koncentracijai, buvo 132,05 ± 11.0 s.v. (n =3). Tačiau reikia paminėti, kad ląstelėse, kurių membrana buvo pažeista, galimai dėl fermentinės ląstelių izoliacijos procedūros (pvz. Ca2+ perkrovos ir kt. mechanizmų), dažo kaupimasis vyko citoplazmoje, t.y. nebuvo membraninio dažo kaupimosi. Šiuo atveju dažai tiesiogiai patekdavo į ląstelę ir todėl buvo nustatytas maksimalus švytėjimas citoplazmos srityje. Tokiais atvejais sunku įvertinti tik membranos švytėjimą, todėl žūstančiose ląstelėse buvo fiksuojamas bendras citoplazmos ir membranos švytėjimas (198,32 ± 12,69 s.v.). Esant membranos pažeidimams ląstelės prasidėdavo žūti praėjus keletai valandų nuo ląstelių išskyrimo ir patalpinimo į eksperimentinę lėkštelę su PJFD.
27 9 pav. Naujo NIR PJFD di-4-ANBDQBS poveikis kardiomiocitų gyvybingumui.
A - Membranos švytėjimo priklausomybė nuo laiko paveikus 10 µM PJFD. B ir C – atitinkamai kardiomiocitų formos ir gyvybingumo pokyčiai esant NT tirpale 25-75 µM PJFD koncentracijoms.
Antrojo etapo metu buvo tiriama, kokia di-4-ANBDQBS dažo koncentracija sukelia maksimalų ląstelės membranos švytėjimą (9 pav., B). Be to tyrėme, kokios koncentracijos poveikyje prasideda kardiomiocitų žūtis, t.y. kokia šio dažo koncentracija yra toksinė. Nustatėme, kad padidinus dažo koncentraciją iki 25 μM ląstelių gyvybingumas nepakito nei iš karto, nei laiko dinamikoje ir gauti duomenys beveik nesiskyrė nuo tų tyrimų rezultatų, kurie buvo užregistruoti ląstelėse, paveiktose su 10 μM šio dažo koncentracija. Tačiau didinant di-4-ANBDQBS koncentraciją iki 50 μM buvo stebimas ženklus švytėjimo padidėjimas T-vamzdelių (angl. T-tubules) sistemoje, o paveikus kardiomiocitus su 75 μM di-4-ANBDQBS buvo stebimi destruktūrizacijos reiškiniai, t.y. T-vamzdeliai stipriai išryškėjo, ląstelių galai pradėjo apvalėti ir po keliolikos minučių (~15 min.) tokios ląstelės žūdavo. Esant NT tirpale 100 μM dažo koncentracijai ląstelės žūdavo iš karto (t.y., <5 min. nuo dažo paveikimo pradžios). Buvo nustatytas statistiškai reikšmingas apšvitos skirtumas tarp dažo skirtingų koncentracijų grupių (9 pav., C ); Kruskall Wallis H testas, p<0,001.
Šie tyrimų rezultatai atskleidė, kad naujas NIR PJFD iki 50 μM sukelia fluorescencijos kaupimąsi ląstelės membranoje ir pažeidimų joje nesukelia. Todėl galima konstatuoti, kad nepasižymi toksiniu veikimu. Tačiau pakankamai didelės (ne fiziologinės) šio fluorescencinio dažo koncentracijos (100 μM) yra toksiškos, nes sukelia ląstelių žūtį.
Kadangi fluorescenciniai dažai gali turėti ne tik toksinių savybių bet ir pasižymėti fototoksiškumu, todėl toliau tyrėme ar šis NIR PJFD nepasižymi fototoksiniu poveikiu.
3.2 PJFD fototoksinio poveikio širdies audiniui įvertinimas
Siekiant įsitikinti, kad naujai sukurti NIR PJFD nespasižymi fototoksiškumu ir gali būti naudojami eksperimentuose su širdies preparatais, atlikome palyginamuosius tyrimus klasikinio mėlynai-žalio sužadinimo spektro (532-nm) PJFD di-4-ANEPPS su naujais di-4-ANBDQBS dažais,
28 kurių sužadinimas yra artimas infraraudonos šviesos spektrui (660-nm). Buvo tiriamas šių skirtingos šviesos lazerių trumpalaikės (1 min.) ir ilgalaikės (5 min.) apšvitos poveikis ir lyginami paviršinės temperatūros pokyčiai bei VP parametrai prieš įjungiant lazerius, jiems esant įjungtiems ir 2 min. po išjungimo. Tyrimai atlikti su jūrų kiaulyčių (n=7) dešinio skilvelio preparatais (žiūr. Metodika).
Matuojant paviršinę tiriamojo preparato temperatūrą buvo nustatyta, kad 1 min. 532-nm lazerio apšvitos metu širdies sienelėje temperatūra vidutiniškai pakilo 2,91 ± 0,28 °C (nuo 37,06 ± 0,09 C° iki 39,97 ± 0,29 C°) (neiliustruota). Nustatėme, kad 660-nm lazerio apšvitoje ji padidėdavo mažiau, t.y. 2,25 ± 0,45 °C (nuo 37,05 ± 0,09 C° iki 39,00 ± 0,29 C°) (10 pav.). Tačiau, praėjus ~3 min. po apšvitos nutraukimo abiem atvejais temperatūra vėl sugrįždavo į pradinius lygius, t.y. 37,10 ± 0,09 C° ir 37,11 ± 0,09°C, atitinkamai švytinant su 532-nm ir 660-nm lazeriais.
10 pav. Trumpalaikė (1 min.) ir ilgalaikė (5 min.) 660-nm lazerio apšvitos įtaka temperatūros pokyčiams paveikus jūrų kiaulytės dešinį skilvelį NIR PJFD di-4-ANBDQBS.
Svarbu pastebėti, kad net 5 min. apšvitos metu naudojant 532-nm ir 660-nm lazerius temperatūros padidėjimas praktiškai buvo toks pat, kaip ir 1 min. apšvytos metu, t.y. pakilo atitinkamai 2,91 ± 0,27 C° ir 2,33 ± 0,88 C°. Panašūs efektai buvo stebimi ir po lazerių apšvitos nutraukimo, t.y. po 3 min. tiriamo preparato paviršinė temperatūra sugrįždavo į pradinius temperatūros lygius (t.y. 37,23 ± 0,12 C° ir 36,82 ± 0, 42 C°, atitinkamai po 532-nm ir 660-nm lazerio apšvitų). Vidurkinti temperatūriniai duomenys esant skirtingai lazerių ir laikinei apšvitai yra pateikti 11 pav., A.
29 11 pav. 532-nm ir 660-nm lazerių apšvitos trumpalaikė ir ilgalaikė įtaka jūrų kiaulytės dešinio skilvelio paviršinės temperatūros ir PVT50 pokyčiams atitinkamai paveikus su PJFD di-4-ANEPPS
ir NIR PJFD di-4-ANBDQBS. Pateikti vidurkinti duomenys ± vidutinė paklaida, esant neįjungtam
lazeriui (tamsiai pilka), įjungtam (šviesiai pilka) ir 3 min. po išjungimo (pilka) (n=7).
Nustačius, kokią įtaką turi trumpalaikė ir ilgalaikė apšvita paveikus mėlynai-žalio ir NIR šviesos spektro lazeriais paviršinei širdies preparato temperatūrai toliau buvo nagrinėjamas galimas fototoksinis poveikis VP parametrams (11 pav., B). Analizuojant VPT50 pokyčius buvo nustatytas didesnis 532-nm lazerio apšvitos poveikis nei po 660-nm apšvitos. Taikant 1 min. ir 5 min. trukmės 532-nm lazerio apšvitas buvo užregistruoti siauresni VP (t.y., jie atitinkamai sutrumpėjo 22,82 ± 4,40 msek. ir 30,61 ± 6,57 msek. lyginant su kontrole, kai lazeris dar nebuvo įjungtas; žiūr. 1 Lentelė) negu po 660-nm apšvitos, t.y. po 1 min. ir 5 min. VP atitinkamai susiaurėjo tik 10,68 ± 1,94 msek. ir 11,88 ± 4,47 msek. (11 pav., B). Palyginus 5 min. ir 1 min. VPT50 pokyčius, kuriuos sukėlė 532-nm lazerio apšvita, buvo nustatyta, kad šis pokytis yra statistiškai reikšmingas. Tačiau 660-nm lazerio apšvitoje VPT50 pokytis taikant 5 min. ir 1 min. trukmės apšvitą reikšmingai nesiskyrė. Analizuojant galimą fototoksiškumo poveikį į kitus VP parametrus buvo nustatyta, kad VP sklidimo greitis ir max dV/dt, kuris parodo VP priekinio fronto depoliarizacijos maksimalų greitį, tiek esant 1 min., tiek 5 min. apšvitai su 532-nm ir 660-nm lazeriais, buvo linkę tik nežymiai padidėti. Be to, po lazerio išjungimo šie parametrai per 2 min. vėl atsistatydavo, t.y. sugįždavo į tuos lygius, kurie buvo užregistruoti prieš lazerių įjungimą. Visų tiriamų parametrų rezultatai yra pateikti 1 Lentelėje.
30 1 Lentelė: Vidurkinti fototoksiškumo tyrimų duomenys
VP – veikimo potencialas, VPT – veikimo potencialo trukmė, esant 50 proc. repoliarizacijai, max dV/dt – maksimalus VP priekinio fronto greitis. „-“ – pažymi tiriamo parametro sumažėjimą. p* - lyginant
neįjungus su įjungtu lazeriu nustatytas statistiškai reikšmingas skritumas (Wilcoxon Exact testas p<0,05), p^ - lyginant tų pačių bangų lazerių 5 min. su 1 min. apšvita nustatytas statistiškai
reikšmingas skirtumas. (Kolmogorov Smirnov Z testas, p<0,05)
Galiausiai, norint įsitikinti, kaip termostatuojamo NT tirpalo temperatūros svyravimai gali įtakoti VP parametrus, buvo dirbtinai (rankiniu būdu) padidinta perfuzinio tirpalo temperatūra nuo +34
o
C iki +41 oC. Pagal gautus tyrimų rezultatus buvo atlikta linijinė regresinė analizė ir nustatyta tiesinė priklausomybė nuo perfuzinio tirpalo temperatūros tiek dV/dt maksimumo, tiek VPT50 (neįliustruota). Apibendrinant atliktus fotofoksiškumo tyrimų rezultatus, galima daryti išvadą, kad keičiantis lazerio apšvietimo intensyvumui, keičiasi audinio temperatūra. Tačiau temperatūriniai pokyčiai naudojant naujus di-4-ANBDQBS dažus, kurie skverbiasi giliau į audinius, ir kurie yra sužadinimi su 660-nm lazeriu, buvo nedideli. Todėl galima teigti, kad stebėti VP pokyčiai yra dėl šviesos šaltinių sukeltų temperatūros pokyčių, o ne dėl di-4-ANBDQBS dažo fototoksinio poveikio. Prie tų pačių intensyvumų apšviečiant 532-nm bangos ilgio šviesa audinio temperatūra padidėja ženkliai daugiau, negu apšviečiant 660-nm bangos ilgio šviesa. Taigi, didesnis audinio šilimo efektas buvo užregistruotas su d-4-ANEPPS PJFD naudojant 532-nm bangos ilgio šviesą. Tytimų rezultatai parodė, kad di-4-ANEPPS pasižymi didesniu fototoksiškumu, tikriausia dėl to, kad tokio bangos ilgio šviesa yra sugeriama miokardo ląstelių ir negali skverbtis giliai į audinį.
31
3.3 Elektrinio signalo sklidimo miokardu eksperimentinis įvertinimas taikant naujus NIR PJFD
Nustatėme, kad naujas NIR PJFD di-4-ANBDQBS neturi toksinių/fototoksinių savybių todėl
gali būti naudojamas in vitro širdies tyrimuose. Todėl veliau eksperimentus atlikome su izoliuota triušio širdimi (n=14), perfuzuojant ją Langendorfo sistemoje (žiūr. Metodai). Šiais tyrimais siekėme išsiaiškinti, kaip šių fluorescencinių dažų pagalba užregistruotas elektrinis signalas, t.y. optinis veikimo potencialas (OVP), atspindi sužadinančios bangos sklidimą miokardu.
12 pav. yra pateikti charakteringi sužadinančios bangos sklidimo pavyzdžiai, kai dirginami skirtingi miokardo paviršiai. Akivaizdu, kad KS sužadinamas sinchroniškai dirginant prieširdį (12 pav., A). Esant sinusiniam ritmui (SR) signalas į skilvelius atsklinda laidžiąja sistema per Purkinje tinklą ir tada visas KS yra sužadinamas vienu metu iš visų pusių [55]. Endokardinio dirginimo metu (12 pav., B) sužadinimo banga sklinda iš apačios į viršų, t.y. nuo apekso iki bazės. Ši situacija panaši tačiau nėra identiška, kaip kad sklindant sužadinančiam impulsui esant SR. Taip yra todėl, kad endokardinio dirginimo metu į KS ertmę įvestas dirginantis elektrodas sužadina Purkinje skaidulas tik iš vieno (t.y. dirginimo) taško. Tuo tarpu epikardinio dirginimo metu, kaip parodyta 12 pav., C, sklidimas vyksta labiau paraleliai epikardiniam KS paviršiui. Šiuo atveju sklidimo banga yra elipsės formos, kuri atspindi didelę miokardo nehomogeniškumo (fibrilių išsidėstymo krypties, kraujagyslių ir riebalinių intarpų bei kitų faktorių) įtaką [56].
12 pav. Sužadinančios bangos sklidimas miokardu užregistruotas naudojant NIR PJFD di-4-ANBDQBS. A, B, C - atitinkamai prieširdinis, endokardinis ir epikardinis dirginimai.
Žinoma, kad OVP priekinis frontas (kylanti VP dalis) atspindi visą informaciją apie elektrinį bangos sklidimą. Tačiau OVP priekinis frontas užregistruotas su NIR dažais dėl didelės šių dažų sugerties audiniuose yra žymiai ilgesnis, lyginant su mikroelektrodais registruotu VP, todėl pasunkėja OVP „nešamos“ informacijos interpretacija [3,4]. Dėl to buvo atliekami kombinuoti tyrimai, kuriuose vienu metu buvo registruojami OVP naudojant NIR PJFD ir VP su mikroelektrodais (13 pav.)
32 13 pav. Veikimo potencialai užregistruoti su di-4-ANBDQBS ir mikroelektrodais. A, B, C - OVP
(viršuje) ir VP (apačioje) atitinkamai dirginant prieširdį, endokardą ir epikardiną. D, E, F – tie patys OVP ir VP, kaip ir A-C, tik vaizdinimui užkloti vienas ant kito ir pateikti išplėstoje skalėje.
Subendo-VP ir epi-Subendo-VP – Subendo-VP užregistruoti atitinkamai iš subendokardinio ir epikardinio paviršių. Kryžiuku pažymėtos OVP ir VP priekinių frontų susikirtimo vietos.
Šių tyrimų metu su mikroelektrodais užregistruotas VP iš skirtingų KS sienelės paviršių (žiūr. Metodai) leido „įrėminti“ tam tikrą OVP priekinio fronto dalį (13 pav., D-E). Tačiau tik prieširdinio dirginimo metu (13 pav., D), kai KS yra sužadinamas vienu metu, visas OVP priekinis frontas yra tarp subendo-VP ir epi-VP. Esant kitiems dirginimams tik dalis OVP priekinio fronto yra tarp mikroelektrodais registruotų VP (žiūr. atstumą tarp kryžiukais pažymėtų vietų 13 pav., D-F). Tai, savo ruožtu, padėjo vizualizuoti, kokia OVP priekinio fronto dalis tiesiogiai priklauso tik nuo transmuralinio (t.y. iš endokardo į epikardą) sklidimo.
Endokardinio (13 pav., E) ir epikardinio (13 pav., F) dirginimo metu OVP priekinis frontas pilnai netelpa tarp mikroelektrodais užregistruotų VP skirtinguose KS paviršiuose. Dalis jo yra už subendo-VP ir epi-VP ribų, kadangi esant šiems dirginimams elektrinė banga sklinda ne tik iš endo-į-epikardą. Šie tyrimai atskleidė, kad OVP priekinio fronto forma kinta priklausomai nuo dirginimo ir ją suformuoja ne tik transmuralinis sklidimas. Taigi, su stikliniais mikroelektrodais užregistruoti VP endokardo ir epikardo ląstelių sluoksniuose neleido tiesiogiai palyginti jų priekinio fronto su OVP priekiniu frontu.
Yra žinoma, kad NIR PJFD prasiskverbia giliai į miokardo audinius[1, 32], o registruojamas OVP yra ne iš vienos ląstelės bet iš daugelio ląstelių sluoksnių. Todėl OVP užregistruotas su NIR
33 PJFD yra suminis potencialas iš gylio ir erdvės [3] ir jo priekinis frontas yra ženkliai ilgesnis nei VP užregistruotų su mikroelektrodais nuo endokardinio ar epikardinio KS paviršiaus. Norit palyginti šių, skirtingais metodais užregistruotų, elektrinių potencialų priekinius frontus būtina užregistruoti VP su mikroelektrodais tik ne iš vienos ląstelės, o visuose kardiomiocitų sluoksniuose transmuraliai KS sienelės.
14 pav. pateiktas transmuraliai registruotų VP priekinio fronto nustatymas. Kiekvieno eksperimento metu buvo atliekama po 30-50 nuoseklių VP registravimų skirtingo gylio kardiomiocitų sluoksniuose ir po to buvo paskaičiuojamas suvidurkintas transmuraliai registruotų VP (TVP) priekinis frontas, kuris dalinai, tačiau dar nepilnai, atitinka OVP priekinį frontą.
14 pav. Stikliniais mikroelektrodais transmuraliai registruojamų VP priekinio fronto nustatymas.
A – schematinis vaizdas transmuraliai registuotų VP. B ir C – atitinkamai vienas ant kito sukloti transmuraliniai-VP ir jų priekinis frontas. D - Išskaičiuotas bendras visų transmuralinių-VP (TVP)
priekinis frontas.
Taip yra todėl, kad registruojant su NIR PJFD fluorescencija gilesniuose miokardo sluoksniuose gęsta. Iš kitos pusės, yra parodyta, kad OVP priekinio fronto trukmė priklauso nuo taip vadinamo fluorescencinio signalo lateralinio-išsklaidymo (L-Sk) (angl. lateral-scattering) fenomeno [34]. Todėl, gautas TVP dar turi būti perskaičiuotas įvertinant signalo gęsimą (angl. depth-weighted) gilesniuose KS sienelės sluoksniuose. Tuo tikslu yra išskaičiuojama signalo gęsimo konstanta k [5]. Tik su k sukoreguotas TVP, kaip parodyta 15 pav., yra laikomas per gylį įvertintu TVP (G-TVP).
34 15 pav. Stikliniu mikroelektrodu registruojamų transmuralinių-VP įvertinimas per gylį. A ir B – atitinkamai vienas ant kito sukloti ir per gylį įvertinti TVP ir jų priekinis frontas (didesniu išplėtimu) .
D - Suvidurkintas per gylį įvertintų TVP (G-TVP) priekinis frontas.
Taigi, G-TVP priekinis frontas jau gali būti lyginamas su OVP priekiniu frontu. Jei G-TVP ir OVP priekiniai frontai sutampa, kaip yra prieširdinio dirginimo metu (16 pav., A), tai sužadinimo banga sklinda tik iš endo-į-epikardą. Tuo tarpu endokardinio ir epikardinio dirginimo metu užregistruotų G-TVP ir OVP priekiniai frontai nesutampa (žiūr. 16 pav., B-C, pilka zona). Išskaičiuotas skirtumas tarp šių potencialų priekinių frontų ilgio leido įvertinti šoninio sklidimo, t.y. L-Sk, dydį [5]. Akivaizdu, kad epikardinio dirginimo metu yra registruojamas didžiausias L-Sk.
16 pav. G-TVP ir OVP priekinių frontų ypatumai skirtingų dirginimų metu. Pilka zona vaizduoja
L-Sk dydį.
Taigi, išskaičiuoto ir per gylį įvertinto TVP (t.y., G-TVP) priekinio fronto ilgis, kuris sudarytas iš visų transmuraliai užregistruotų VP priekinių frontų, leido suskirtyti OVP priekinį frontą į dvi pagrindines dedamąsias: transmuralinę ir L-sk, kurios, atitinkamai, atspindi elektrinės bangos sklidimą transmuraliai KS sienelės iš endo-į-epikardą ir šoninį sklidimą (arba L-Sk).
