Propolio tirpalų technologija ir kokybės tyrimas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

Deimantė Andrulytė

Propolio tirpalų technologija ir kokybės tyrimas

Darbo vadovai:

Doc. dr. K. Ramanauskienė

Doc. dr. A. Inkėnienė

KAUNAS

2011

Darbas rengtas 2010 – 2011 metais, Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitete, Medicinos Akademijoje, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedroje.

Darbo vadovai: Doc. dr. K. Ramanauskienė Doc. dr. A. Inkėnienė. Recenzentas: Lekt. dr. D. Burdulis. Padėka.

Uţ suteiktas darbo sąlygas ir materialinę bazę bei pagalbą atlikti mokslinį tiriamąjį darbą „Propolio tirpalų technologija ir kokybės tyrimas“ dėkoju LSMU MA, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedros doc. dr. K. Ramanauskienei, doc. dr. A. Inkėnienei, doktorantui M. Ţiliui ir kolektyvui, Vaistų chemijos katedros lekt., dr. V. Petrikaitei, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros prof. L. Ivanauskui. Uţ darbo recenziją ir vertinimą dėkoju lekt. dr. D. Burduliui.

SANTRUMPOS

LSMU MA - Lietuvos sveikatos mokslų universitas, Medicinos akademija MSK - maţiausioji slopinančioji koncentracija

MTL - maţo tankio lipoproteinai Ph. Eur. - Europos farmakopėja UV - ultravioletinis

TURINYS

SANTRUMPOS ... 3

TURINYS ... 4

1. ĮVADAS ... 6

1. 1. Darbo tikslas ir uţdaviniai ... 7

1.2. Darbo naujumas ir praktinė reikšmė ... 7

2. LITERATŪROS APŢVALGA ... 8

2.1. Propolis, jo cheminė sudėtis ir savybės, gydomasis poveikis ... 8

2.1.1. Propolio fizinės savybės ... 8

2.1.2. Propolio cheminė sudėtis ... 8

2.1.3. Propolio farmakologinės savybės ... 10

2.1.4. Propolio gydomasis poveikis ... 12

2.1.5. Propolio panaudojimas odontologijoje ir burnos higienoje ... 13

2.2. Tirpikliai, jų savybės, panaudojimas ... 13

2.2.1. Reikalavimai tirpikliams... 13

2.2.2. Vanduo... 14

2.2.3. Etanolis ... 15

2.2.4. Propilenglikolis ... 15

3. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 17

3.1. Tyrimo medţiagos ir aparatūra ... 17

3.2. Tyrimo metodai ... 17

3.2.1. Gamybos metodas... 17

3.2.2. Analizės metodai ... 18

3.2.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometrijos metodu ... 18

3.2.2.2. Mikrobiologinio aktyvumo nustatymas (tyrimas atliktas LSMU MA, Mikrobiologijos katedroje) ... 19

3.2.2.3. Propolio ištraukų cheminės sudėties nustatymas ESC metodu (tyrimas atliktas LSMU MA, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje) ... 19

4. TYRIMO EIGA IR REZULTATAI, JŲ APTARIMAS ... 20

4.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 20

4.1.1. Vandens ir nevandeninių tirpiklių įtaka propolio ištraukų kokybei ... 20

4.1.2. Tirpiklių sistemos (vanduo – etanolis – propilenglikolis) įtaka propolio ištraukų kokybei ... 22

4.1.4. Temperatūros įtaka propolio ištraukų kokybei ... 24

4.1.5. Emulsiklio Tween® 20 panaudojimo įtaka propolio ištraukų kokybei ... 25

4.1.6. Ţaliavos surinkimo būdo įtaka propolio ištraukų kokybei ... 26

4.2. Propolio tirpalų mikrobiologinio aktyvumo nustatymas ... 27

4.3. Rezultatų aptarimas ... 28

5. IŠVADOS ... 31

SANTRAUKA ... 32

1. ĮVADAS

Šiandien vis daţniau natūralūs produktai tampa mokslininkų ir visuomenės susidomėjimo objektu. Apiterapija – gydymas bičių produktais šiuo metu visame pasaulyje išgyvena renesansą.

Bitės (Apis mellifera) pasaulyje egzistuoja jau daugiau nei 125 milijonus metų ir ši jų egzistencijos sėkmė priklauso nuo produktų, kuriuos jos geba pagaminti ar surinkti. Nuo senų laikų liaudies medicinoje buvo naudojami įvairūs bičių produktai: medus, ţiedadulkės, vaškas, bičių nuodai, pikis. Dėl savo populiarumo liaudies medicinoje pikis, arba kitaip propolis, tapo daugelio mokslinių tyrimų objektu, kurie jau tęsiasi virš 30 metų. Buvo įrodyta daugybė jo farmakologinių savybių: antibakterinės, antigrybelinės, antivirusinės, antioksidacinės, priešuţdegiminės, priešvėţinės, nuskausminančios ir kitos.

Propolis – natūralus bičių produktas, kurį jos renka nuo augalų pumpurų ir eksudatų. Sumaišiusios jį su vašku ir seilėmis, panaudoja avilio gynybai, įvairių plyšių padengimui, įsibrovėliams balzamuoti. Egiptiečiai naudojo propolį numirusiems balzamuoti, graikai ir romėnai – kaip antiseptinę, ţaizdų gyjimą skatinančią priemonę, inkai ţinojo jo antipiretines savybes. XVII amţiuje propolis buvo oficialiai įrašytas į anglų farmakopėją [9]. Jo naudojimas tęsiasi ir šiais laikais bei skatina didelį susidomėjimą. Propolio preparatai plačiai taikomi odontologijoje burnos gleivinės opoms ir parodontozei gydyti. Kinų odontologai propolio tirpalu gydo periodontitus ir perikoronitus. Jie nurodo, kad propolis pasiţymi ne tik antibakteriniu bei uţdegimą maţinančiu, bet ir skausmą malšinančiu poveikiu. Bulgarų mokslininkai siūlo parodontozės profilaktikai naudoti dantų pastą su propoliu [9]. Propolio preparatais daţnai gydomos pūlingos, ilgai negyjančios ţaizdos, taip pat trofinės blauzdų opos.

Dėl plataus propolio pritaikymo, aktualu pagaminti propolio tirpalus su įvairiais tirpikliais ir įvertinti jų įtaką ištraukų kokybei. Be to, svarbu ištirti technologinius faktorius, įtakojančius propolio ištraukų kokybę, nes iki šiol propolio skystieji ekstraktai gaminami klasikinės maceracijos metodu.

1. 1. Darbo tikslas ir uţdaviniai

1. Ištirti ţaliavos ir ekstrahento santykio bei propolio surinkimo būdo įtaką ištraukų kokybei.

2. Ištirti tirpiklio (vandens, etanolio, propilenglikolio) ir pagalbinių medţiagų įtaką veikliųjų medţiagų išsiskyrimui iš propolio ţaliavos.

3. Įvertinti technologinių parametrų (maišymo laiko, temperatūros) įtaką propolio ištraukų kokybei.

4. Įvertinti pagamintų propolio ištraukų antimikrobinį aktyvumą.

1.2. Darbo naujumas ir praktinė reikšmė

Propolio preparatai plačiai taikomi odontologijoje burnos gleivinės opoms ir parodontozei gydyti, ginekologijoje, kosmetologijoje, dermatologijoje. Ne etanolinių propolio tirpalų gamyba atveria dar platesnį jų pritaikymą medicinoje, vartojime. Literatūroje nurodoma daug mokslinių tyrimų duomenų apie propolio etanolinių tirpalų cheminę sudėtį, antimikrobinį aktyvumą. Tačiau yra labai maţai ar praktiškai nėra atliktų bandymų su lietuviško propolio ištraukomis propilenglikolyje, vandeniniais jo tirpalais bei atitinkamų tirpiklių mišiniais. Nėra ištirta tokių ištraukų cheminė sudėtis bei biologinis aktyvumas.

2. LITERATŪROS APŢVALGA

2.1. Propolis, jo cheminė sudėtis ir savybės, gydomasis poveikis

Propolis yra sakingas, malonaus, stipraus kvapo ir kartoko, aštraus, deginančio skonio biologiškai aktyvus produktas. Jis būna nuo geltonos iki tamsiai rudos ar net ţalios spalvos, priklausomai nuo augalų, iš kurių jis surinktas. Kuo pikis senesnis, tuo jo spalva tamsesnė. Surinktas būna gabalėlių ar kruopelių pavidalo. Šios propolio savybės gali skirtis priklausomai nuo jo sudėties, metų laiko, kuriuo jis buvo renkamas, augmenijos [8, 9, 17].

Kambario temperatūroje bičių pikis yra kietas, šaldant pasidaro trapus, pašildytas iki 30 – 400C, tampa plastiškas, lipnus, 80 – 1040C temperatūroje lydosi [9, 16].

Propolis yra lipofilinė medţiaga. Vandenyje praktiškai netirpus, gerai tirpsta etanolyje, eteryje, terpentine ir kituose aliejiniuose tirpikliuose. Geriau tirpsta pašildytuose tirpikliuose [8, 9, 16].

2.1.2. Propolio cheminė sudėtis

Cheminiu poţiūriu propolis yra labai sudėtinga gamtinės kilmės medţiaga. Jo sudėtis daugiausiai priklauso nuo augalijos, vyraujančios tame regione, kuriame jis surinktas. Tyrėjai nurodo daugiau nei 67 augalų rūšis, iš kurių bitės renka ţaliavą propoliui. Pagrindiniai augalai yra berţai, tuopos, gluosniai, kaštonai, alksniai, pušys [8, 9, 16, 17]. Skirtingose geografinėse zonose, tokiose kaip Europa, Pietų ir Šiaurės Amerika, Afrikos, Azijos šalys, surinkto propolio sudėtis skiriasi, vyrauja vis kitos medţiagos ir skiriasi jų kiekiai [5, 10]. Šiuolaikiniais analizės metodais jau identifikuota apie 200 junginių, tačiau literatūroje daugėja straipsnių apie naujų propolio cheminių junginių nustatymą. Ši cheminės sudėties įvairovė apsunkina standartizaciją ir kokybės kontrolės tyrimus [5, 8, 9, 17].

Nustatyta, kad propolio ţaliavoje yra 30% vaško, 50% dervų, 10% eterinių aliejų, 5% ţiedadulkių ir 5% mineralinių medţiagų (Zn, Cu, Mn, Ni, K, Ca, Se) bei vitaminų (A, C, E, B1, B2, B3, B6) [8, 9, 10, 14].

Europoje daţniausiai medţiagas propoliui bitės renka nuo tuopų, berţų, kaštonų, gluosnių ir pušų. Vertingiausia tokio propolio sudedamoji dalis yra dervos, kuriose vyrauja polifenoliniai junginiai (fenolinės rūgštys ir jų esteriai, flavonoidai), taip pat alifatinės ir aromatinės rūgštys bei jų esteriai, terpenoidai. Kitą dalį sudaro vaškas, eteriniai aliejai ir ţiedadulkės [8, 9, 16].

„Tuopų“ tipo propolis neabejotinai yra labiausiai ištyrinėtas iš visų esamų. Tačiau dabar labai susidomėta ir Braziliškojo tipo propoliu, kuris pasiţymi intensyvia raudona spalva bei skirtinga chemine sudėtimi, kurią įtakoja Brazilijos klimato ir biologinė įvairovė. Buvo manoma, kad skirtinguose regionuose surinkto propolio biologinis aktyvumas skiriasi dėl cheminės sudėties variacijų. Tačiau tyrimais įrodyta, jog farmakologinis veikimas yra toks pat, nepaisant visų skirtumų [8, 14, 16].

1 lentelė. Propolio tipų ir cheminės sudėties įvairovė [2, 8, 9]

Propolio tipas Geografinis regionas Augmenija Pagrindiniai bioaktyvūs junginiai

„Tuopų“ tipo

Europa, Šiaurės Amerika, ne tropinio klimato Azijos

šalys Populus spp., daugiausia Populus nigra L. Flavonai, flavononai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai

„Berţų“ tipo Rusija Betula verrucosa

Ehrh.

Flavonai, flavononai (kt. nei tuopų propolyje) „Rozmarino“

tipo (ţaliasis)

Brazilija Baccharis spp. p–kumaro rūgštis,

diterpeninės rūgštys

Raudonasis Kuba, Venesuela Clusia spp. Poliprenilbenzofenonai

„Ramiojo vandenyno“ tipo Ramiojo vandenyno regionas (Okinava, Taivanas Neţinoma c–prenilflavanonai

„Kanarų“ tipo Kanarų salos Neţinoma Furofurano lignanai

Europos propolio sudėtyje vyrauja polifenoliniai junginiai (flavonoidai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai), terpenoidai, alifatinės rūgštys ir jų eteriai, aromatinės rūgštys ir jų esteriai.

Didţiausia junginių, randamų propolyje, grupė yra flavonoidai. Jie labai plačiai paplitę gamtoje ir sutinkami beveik visuose augaluose. Propolyje daţniausiai randami šie flavonoidai: flavonoliai (kvercetinas, kemferolis, galanginas, ramocitrinas), flavonai (chrizinas, apigeninas ir kt.), flavononai (pinocembrinas, pinostrobinas ir kt.), fenoksirūgštys (kumaro, ferulo, kavos, vanilino ir kt.) [5, 9, 10, 14]. Kai kurių junginių struktūra pavaizduota 1 pav.

Kumaro rūgštis

Pav. 1. Fenolinių junginių cheminė struktūra

Terpenoidų klasės junginių sutinkama eterinių aliejų sudėtyje. Daţniausiai randami monoterpenai ir seskviterpenai, pavyzdţiui azulenas (būdingi Chamomila officinalis (Koch.)), citralis (būdingas Melissa officinalis (L.)), kariofilenas, amferzenas, amorfenas ir kiti (būdingi daugeliui augalų – Mentha piperita (L.), Origanum vulgaris (L.), Juniperus communis (L.) ir t.t.). Pagal terpeninių junginių gausumą propolio sudėtyje, galima spręsti apie augalų, iš kurių bitės surinko medţiagas propolio gamybai, įvairovę [2, 9].

Laisvų alifatinių ir aromatinių rūgščių sutinkama retai. Daţniausiai jos būna esterių pavidalu. Taip pat yra vitaminų, mineralinių medţiagų, aminorūgščių. Sudėties įvairovė paaiškina platų propolio farmakologinį veikimą ir pritaikymą įvairių ligų gydymui.

Lietuviškas propolis priskiriamas Europos „tuopų“ tipui. Tačiau ši informacija gali būti vertinama prieštaringai, nes su lietuvišku propoliu atliktas tyrimas parodė, kad šis propolis neturi junginių, būdingų Populus nigra (L.) – pinocembrino, pinobanksino ir prenilkofeato. Taip pat nenustatyta ir fenolinių junginių gliceridų, būdingų Populus tremula (L.) [14, 15].

Nustatyta, kad mūsų šalyje surinktame propolyje fenolinių junginių kiekis yra apie 22 – 32 proc., išskirtos 68 cheminės medţiagos. Tai terpenoidai, aromatinių rūgščių esteriai ir alifatinių rūgščių esteriai, dominuoja ferulo ir kumaro rūgštys. Fenolinių junginių įvairovė lietuviškoje propolio ţaliavoje priklauso nuo vyraujančios augalijos [3, 5, 7, 9, 14].

2.1.3. Propolio farmakologinės savybės

Propolio veikimo spektras yra labai platus. Jam būdingos šios farmakologinės savybės: antibakterinės, antivirusinės, priešgrybelinės, antioksidacinės, taip pat skausmą malšinančios, priešuţdegiminės ir skatinančios audinių regeneraciją [9, 16].

Moksliniais tyrimais įrodyta, kad propolis gerina ir stimuliuoja ląstelių energijos apykaitą, padeda apsaugoti ląsteles, audinius ir organus nuo hipoksijos, padidina imuninių ląstelių aktyvumą, stiprina organizmo imunitetą. Taip pat sumaţina kraujagyslių pralaidumą, atkuria patologinio proceso paţeistų organų veiklą. Propolis stimuliuoja kraujodarą, maţina padidėjusį

kraujo krešėjimą, vieną iš trombų formavimosi prieţasčių, malšina kraujagyslių spazmus, skatina cholesterolio ir trigliceridų pasišalinimą iš organizmo. Polifenoliai didina plazmos antioksidacinį potencialą, slopina MTL oksidaciją [8, 9, 16].

Dėl stipraus antimikrobinio poveikio propolis daţnai pavadinamas natūraliu antibiotiku. Jis inhibuojančiai veikia daugelį mikroorganizmų (> 100 rūšių), grybelių ir virusų. Šis poveikis priklauso nuo propolio cheminės sudėties. Galanginas, pinocembrinas ir pinostrobinas nustatyti kaip patys efektyviausi flavanoidai, veikiantys įvairias bakterijas. Bakteriostatinis ir baktericidinis poveikiai aiškinami baltymų sintezės slopinimu mikroorganizme, tiesioginiu poveikiu citoplazmai ir ląstelių membranoms. Stipriau veikia gramteigiamas bakterijas (Staphylococcus aureus, Streptococus faecalis), silpniau – gramneigiamas bakterijas (pavyzdţiui, Escherichia coli). Gydant bičių pikiu neišsivysto mikrobų rezistentiškumas, nesunaikinama naudinga organizmo mikroflora [4, 8, 9, 10, 15, 16]. Šios savybės leidţia taikyti propolį kompleksiškai gydant su kitomis priemonėmis bei antibiotikais. Švieţias, grynas ir stipriau kvepiantis propolis pasiţymi didesnėmis antibakterinėmis savybėmis [8].

Taip pat nustatyta, kad propolio preparatai turi antivirusinių savybių. Tai grindţiama propolio sugebėjimu suaktyvinti virusų inhibitorius, kurie veikia analogiškai interferonui. Propolyje esantys flavonoidai slopina viruso baltymus bei sukuria aplink jį izoliacinį apvalkalą, galutinai jį inaktyvuodami. Flavonoidai chrizinas ir kemferolis gerai inhibuoja A ir B tipo gripo, herpes virusus, rotavirusus [8, 9].

Antibakteriniu poveikiu ypač pasiţymi pinocembrinas, galanginas, kofeino bei ferulinė rūgštys, diterpenai, antivirusiniu – kvercetinas, luteolinas, pinocembrinas [8, 9, 16].

Antioksidacinį propolio aktyvumą lemia flavonoidai, ypač galanginas, kemferolis, taip pat laisvosios fenolinės rūgštys, kurios suriša laisvuosius radikalus, slopina jų sukeliamas reakcijas, lipidų peroksidaciją, trombocitų agregaciją ir fermentinių sistemų aktyvumą. Surišdamas laisvuosius radikalus, propolis maţina viduląstelinių riebalų oksidaciją, todėl lėtėja ląstelių senėjimas. Antioksidaciniam aktyvumui yra svarbus pirokatecholio ţiedas ir flavonolinė struktūra [8, 9].

Propolyje esantys sterinai, steridai, terpeno ir triterpeninės rūgštys skatina audinių regeneracijos procesus, spartina epitelio ląstelių dalijimąsi bei kraujo apytaką paţeidimo vietoje. Todėl stebimas efektyvus gydomasis rezultatas gydant odos ţaizdas, terminius paţeidimus.

Monoterpenoidai (lakūs junginiai) sudaro 80-100 proc. eterinių aliejų, kurie suteikia propoliui anestezuojančių savybių [9, 13]. Stipriau kvepiantis propolis dėl didesnio eterinių aliejų kiekio pasiţymi stipresniu anestezuojamuoju poveikiu [13].

Aromatinės rūgštys ir karboksirūgštys su benzeno ţiedu alifatinėje grandinėje (cinamono ir kumaro rūgščių dariniai) pasiţymi stipriu antigrybeliniu poveikiu, efektyviai naikina bakterijas Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa [15].

Literatūroje nurodyti duomenys įrodo, kad negalima išskirti nei vienos individualios medţiagos, suteikiančios tam tikrą propolio poveikį, stipresnį nei viso komplekso poveikis. Visi propolyje esantys komponentai papildydami vienas kitą sustiprina jo farmakologinį aktyvumą [8, 9].

2.1.4. Propolio gydomasis poveikis

Jau senovėje ţmonės naudojo propolį norėdami sumaţinti dantų karieso plitimą, taip pat gydydami odos ţaizdas ir išopėjimus. Manoma, kad propolis naudingas ir gydant ginekologines bei otorinolaringologines ligas [8].

Pastarųjų kelių dešimčių metų išsamūs tyrinėjimai parodė, kad propolis teigiamai veikia ţmogaus organizmą. Geras terapinis efektas gaunamas gydant tokias ligas, kurias sukelia įvairūs mikroorganizmai. Propolis, veikdamas sinergistiškai kartu su antibiotikais, gali padėti sumaţinti pastarųjų dozę, reikalingą terapiniam efektui pasiekti. Tai ypač svarbu norint kontroliuoti didėjantį mikroorganizmų rezistentiškumą antibiotikams bei oportunistinių patogenų plitimą [8, 13, 16].

Propolis yra natūralus bičių produktas, o tai labai aktualu šiuolaikinei visuomenei, kurios susidomėjimas natūralios terapijos būdais, sveikais ir ekologiškais produktais bei gaminiais, vis auga. Labai svarbu ir tai, kad daugybė klinikinių tyrimų patvirtino, jog propolis neturi šalutinių reiškinių skirtingai nuo cheminių, sintetinių preparatų. Tiriant propolio ūmų ir lėtinį toksiškumą nustatyta, kad jis gerai toleruojamas ir yra netoksiškas, nors gali sukelti alergines reakcijas ţmonėms, kurie netoleruoja bičių produktų [9].

Įvertinus propolio farmakologines savybes ir sukauptą klinikinę bei liaudies medicinos patirtį, propolis ir iš jo sukurti vaistai bei maisto papildai sėkmingai vartojami šių dienų medicinos praktikoje, gydant įvairias ligas ar vartojant profilaktiškai, veterinarijoje bei kosmetikos pramonėje. Propolio preparatai maţina ligų sukėlėjų aktyvumą ir juos naikina, slopina uţdegimus, stiprina imuninę sistemą, skatina audinių regeneraciją, ţaizdų, opų gijimą, veikia lipoperoksidacijos reakcijas [8, 9].

Šiuo metu su bičių pikiu gaminami etanoliniai ir vandeniniai tirpalai, sirupai, aliejinės ištraukos, tabletės, ţvakutės, purškalai, ledinukai, kremai ir kitos priemonės. Gydytojai rekomenduoja vartoti propolio preparatus nusilpusiems ţmonėms, norint apsisaugoti nuo peršalimo

ligų, gripo, sergant ūminėmis ir lėtinėmis kvėpavimo sistemos ligomis, virškinimo trakto, odos ligomis, jų profilaktikai [4, 9, 33].

2.1.5. Propolio panaudojimas odontologijoje ir burnos higienoje

Pastaraisiais metais propolis tampa vis reikšmingesnis odontologijoje ir burnos higienoje. Dėl nuskausminančio, antibakterinio, taip pat dantenas stimuliuojančio veikimo jo preparatais sėkmingai gydomi burnos gleivinės, dantenų, lieţuvio ir kitų burnos organų uţdegimai [9]. Buvo atlikta ir toliau atlikinėjami daug tyrimų, susijusių su propolio panaudojimu burnos ligoms gydyti bei jų profilaktikai. Išskirtos kelios gydomosios savybės:

- ţaizdų gydymas – burnos skalavimo skystis, kurio sudėtyje yra propolio, gali papildyti pochirurginių ţaizdų gydymą ir taip pat pasiţymi nestipraus skausmo bei uţdegimo malšinimu. Tyrimai taip pat parodė, kad toks skalavimo skystis turi maţai ar visai neturi erzinančių gyjančią ţaizdą savybių. Paspartėja ţaizdos epitelizacija, audinio atsistatymas [9, 23].

- dantenų jautrumo maţinimas – atlikti tyrimai parodė, kad propolis turi teigiamą efektą kontroliuojant dantenų padidėjusį jautrumą ir jį maţinantį poveikį.

- periodontito gydymas – tyrimai parodė, kad propolis, vartojamas sistemiškai, reikšmingai sumaţino periodontito sukelto ţandikaulio kaulinio audinio alveolių irimą.

- stomatito gydymas – įrodytas efektyvus propolio poveikis gydant stomatitą ţmonėms, kurie nešioja dantų protezus ir kuriems ši liga yra lėtinė.

- nuskausminimas – propolis naudojamas ir nuskausminti danties pulpą. Po gydymo juo nepastebėta jokių skausmingų reakcijų, o atidarius pulpos kamerą nesijautė nemalonaus kvapo, nebuvo nei pūlių, nei kraujo [9, 23].

Dėl kaulo regeneraciją skatinančių ir anestezuojančių propolio savybių, jis rekomenduojamas įtraukti į danties kanalų uţpildų sudėtį, o dėl antimikrobinio poveikio – karieso profilaktikai ir gydymui [9, 22, 23].

2.2. Tirpikliai, jų savybės, panaudojimas

2.2.1. Reikalavimai tirpikliams

Tirpikliai – tai cheminiai junginiai arba jų mišiniai, tirpinantys įvairias medţiagas ir sudarantys vientisas sistemas – tirpalus. Jiems keliami atitinkami reikalavimai:

 turi būti gryni, netoksiški, maţai klampūs;  turi būti malonaus skonio, kvapo, spalvos;  turi būti ekonomiškai naudingi;

 turi būti chemiškai indiferentiški ir biologiškai nekenksmingi [29, 30, 32].

Plačiausiai naudojamas tirpiklis yra vanduo, nes jis labiausiai atitinka aukščiau išvardytus reikalavimus. Tačiau daţnai su juo naudojamas ir pagalbinis tirpiklis tam, kad pagerintų vandens funkciją ar suteiktų cheminį ar fizikinį stabilumą galutiniam produktui. Daţniausiai pasirenkami alkoholis, glicerinas ar propilenglikolis [18].

Tokie tirpikliai kaip acetonas, izopropilo alkoholis yra per daug toksiški naudoti juos peroralinių preparatų gamybai, tačiau yra labai naudingi organinėje chemijoje ar įvairiose vaistų sintetinimo ir gamybos stadijose [18].

2.2.2. Vanduo

Vanduo labiausiai paplitęs Ţemėje junginys. Jis plačiausiai naudojamas ir įvairiose vaistų formose. Neturi skonio, kvapo, kitų erzinančių savybių bei yra farmakologiškai neaktyvus. Vandens grynumas ir geras išsilaikymas leidţia jį laikyti ir naudoti minimaliomis pastangomis. Tačiau geriamasis vanduo turi būti išgrynintas prieš naudojant jį farmacinėje gamyboje [29, 30].

Vandens molekulė pasiţymi labai dideliu poliškumu, kadangi yra sudaryta iš stipriai elektroneigiamo deguonies atomo ir dviejų silpnai elektroteigiamų vandenilio atomų. Tai suteikia vandeniui reikšmingas fizines savybes, tokias kaip maţesnis tankis kietoje būsenoje, lyginant su skysta. Dėl didelio vandens molekulių poliškumo vanduo yra labai geras kitų polinių junginių tirpiklis [32, 34].

Pav. 2. Vandens struktūrinė formulė [36]

Distiliuotas vanduo farmakologiškai indiferentiškas, gerai tirpina daugelį vaistinių medţiagų, bet jame greitai vyksta kai kurių medţiagų hidrolizė, dauginasi mikroorganizmai. Vaistų gamybai vartojamo vandens kokybę reglamentuoja farmakopėjiniai straipsniai [32].

Distiliuotas vanduo turi būti bespalvis, skaidrus, be kvapo ir skonio, pH gali svyruoti nuo 5,0 iki 6,8. Vandenyje neturi būti redukuojančių medţiagų, nitratų, nitritų, chloridų, sulfatų, kalio, sunkiųjų metalų, CO2, neturi būti amoniako [29, 32].

Distiliuotas vanduo gaunamas distiliuojant vandenį tam skirtais prietaisais, specialiai įrengtose patalpose.

2.2.3. Etanolis

Vienhidroksiliai ir daugiahidroksiliai alkoholiai kaip tirpikliai naudojami daugelyje pasaulio šalių. Maţiau klampūs nei aliejai, gerai tirpina daugelį vaistinių medţiagų. Jie maišosi su vandeniu, tad tokiame tirpiklyje gali ištirpti tiek vandenyje tirpios, tiek ir alkoholyje tirpios medţiagos. Iš vienhidroksilių alkoholių daţniausiai naudojamas etanolis, iš daugiahidroksilių – propilenglikolis, polietilenglikolis, glicerolis [30, 32].

Pav. 3. Etanolio struktūrinė formulė [37]

Etanolis (Spiritus aethylicus, Spiritus vini) – skaidrus, bespalvis, judrus, lakus skystis, pasiţymintis būdingu kvapu ir deginančiu skoniu. Verda esant 780C temperatūrai. Dega mėlyna liepsna. Molekulėje esanti –OH grupė padeda tirpinti polines molekules, o hidrofobinė CH3CH2- grupė – nepolines molekules. Medţiagų tirpumas jame priklauso nuo etanolio koncentracijos. Neribotai maišosi su vandeniu, gerai su gliceroliu, eteriu, acetonu, pasiţymi bakteriostatiniu ir baktericidiniu veikimu, todėl naudojamas ir kaip konservantas [29, 30, 32].

Etanolio vartojimą riboja farmakologinis neindiferentiškumas, polinkis oksiduotis, dehidratuojantis veikimas, toksiškumas ţmogaus organizmui.

1,2 – propandiolis, kitaip vadinamas propilenglikoliu, vis plačiau naudojamas kaip tirpiklis ar konservantas įvairioms skystoms, taip pat ir parenteralinėms vaisto formoms ruošti [29]. Propilenglikolis – skaidrus, bespalvis, klampus, praktiškai bekvapis, šiek tiek saldaus, deginančio skonio skystis, sugeriantis drėgmę iš oro [29, 32].

Propilenglikolio kaip tirpiklio naudojimas yra ribojamas. Daţniausiai naudojami vandeniniai tirpalai, taip pat mišiniuose su kitais tirpikliais – etanoliu, polietilenglikoliu.

Propilenglikolis yra higroskopiškas ir turi būti laikomas gerai uţdarytoje talpyklėje, saugant nuo saulės, vėsioje, sausoje vietoje.

3. EKSPERIMENTINĖ DALIS

3.1. Tyrimo medţiagos ir aparatūra

1. Propolio ţaliava, surinkta įvairiuose Lietuvos regionuose, kur vyrauja pušynai, eglynai, liepynai, grikių laukai (Kauno raj., Varėnos raj., Kėdainių raj.). Gauta iš ūkininkų – bitininkų.

2. Propolio ţaliava, kurios tiekėjas UAB Bičių korys, Lietuva. 3. Etanolis 96,3 proc. V/V (Stumbras, Lietuva).

4. 1,2 – propandiolis (Carl Roth GmbH, Vokietija). 5. Išgrynintas vanduo (Phonix GmbH, Vokietija).

6. Natrio karbonatas, grynas > 99,5 proc. (Merck, Vokietija). 7. Fiolin-Ciocalteu fenolinis reagentas (Sigma, Šveicarija).

8. Emulsiklis Tween® 20 pure Ph. Eur. (Applichem GmbH, Vokietija).

9. UNICAM Helios α UV spektrofotometras (Unicam, Cambridge, Didţioji Britanija). 10. Analitinės svarstyklės GX-200-EC (A&D Instruments, Japonija).

11. Magnetinė maišyklė 15L, Yellowline MSC basicC. 12. Automatinės pipetės (Transferpette, Vokietija).

13. Miulerio-Hintono agaras, (Mueller-Hinton Agar, Becton, Dickinson and Company). 14. Metanolis, Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Vokietija).

3.2. Tyrimo metodai

3.2.1. Gamybos metodas

Gamyba atliekama maceracijos metodu. Išdţiovinta ir susmulkinta ţaliava dedama į sandariai uţdaromą indą ir uţpilamas apskaičiuotas kiekis ekstrahento. Sandariai uţdarius ir kas dieną daug kartų sumaišant laikoma esant kambario temperatūrai penkias – septynias paras. Paskui ištrauka nupilama, ţaliava nuspaudţiama [31].

Paruošiami 2,5 proc., 5 proc. ir 10 proc. tiriamieji propolio tirpalai [12]. Kaip tirpikliai naudojami išgrynintas vanduo, 70 proc. V/V etanolis, 96,3 proc. V/V etanolis, 1,2 – propandiolis bei iš jų sudarytos sistemos. Propolio susmulkinta ţaliava uţpilama atitinkamu tirpikliu ir paliekama septynias dienas maceruotis [11]. Nufiltruojama naudojant popieriaus filtrą į tamsaus

Vandeninių propolio ištraukų gamyba: paruošiami 2,5 proc., 5 proc. ir 10 proc. tirpalai, atsveriant atitinkamą kiekį, t.y. 0,625 g, 1,25 g, 2,5 g, propolio ţaliavos ir uţpilant ją išgrynintu vandeniu iki bendro 25 ml tūrio. Paliekama savaitei maceruotis. Nufiltruojama. Laikoma tamsaus stiklo talpyklėse, vėsioje vietoje.

Etanolinių propolio ištraukų gamyba: paruošiami 2,5 proc., 5 proc. ir 10 proc. tirpalai kaip tirpiklį naudojant 70 proc. V/V etanolį. Propolio ţaliava uţpilama tirpikliu iki 25 ml bendro tūrio ir paliekama savaitei maceruotis. Nufiltruojama į tamsaus stiklo talpykles ir laikoma vėsioje vietoje.

Propolio ištraukų su propilenglikoliu gamyba: ruošiami 2,5 proc., 5 proc. ir 10 proc. tirpalai. Atitinkami propolio ţaliavos kiekiai uţpilami propilenglikoliu iki 25 g bendros masės. Paliekami maceruotis savaitę laiko. Nufiltruojami į tamsaus stiklo talpykles. Laikomi vėsioje vietoje.

Propolio ištraukų, naudojant trijų tirpiklių sistemą, gamyba: ruošiami 2,5 proc., 5 proc. ir 10 proc. tirpalai. Atsveriami atitinkami kiekiai propolio ţaliavos ir uţpilami tirpiklių sistema, pagaminta naudojant vienodą kiekį, t.y. 6,25 ml – 96,3 proc. V/V etanolio, 2,5 g propilenglikolio ir išgryninto vandens iki 25 ml bendro tūrio. Paliekama savaitei maceruotis. Nufiltruojama. Laikome tamsaus stiklo talpyklėse, vėsioje vietoje.

3.2.2. Analizės metodai

3.2.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometrijos metodu

Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas pagrįstas spalvine oksidacijos – redukcijos reakcija su Folin – CioCalteu reagentu šarminėje aplinkoje. Atliekamas esant 765 nm bangos ilgiui UNICAM Helios α UV spektrofotometru (Unicam, Cambridge, Didţioji Britanija). Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas ferulinės rūgšties ekvivalentu (FRE) mg/g.

Spalvinė reakcija. Į 100 ml matavimo kolbą įpilama 15 ml išgryninto vandens, 4 ml Folin – CioCalteu reagento, pilamas tam tikras kiekis, priklausomai nuo koncentracijos, tiriamojo tirpalo, tada 6 ml 20 proc. natrio karbonato tirpalo. Praskiedţiama išgrynintu vandeniu iki 100 ml ţymos. Pagamintas tirpalas paliekamas stovėti 2 valandas kambario temperatūroje tam, kad įvyktų reakcija. Absorbcija matuojama palyginamuoju tirpalu naudojant išgrynintą vandenį [20].

3.2.2.2. Mikrobiologinio aktyvumo nustatymas (tyrimas atliktas LSMU MA, Mikrobiologijos katedroje)

Mikrobiologinio aktyvumo nustatymas atliekamas pagal Ph Eur. 01/2002, 2.6.12. Mikrobiologinis tyrimas atliktas aseptinėmis sąlygomis. Mikrobiologinio tyrimo metu nustatyta tirto preparato MSK (maţiausioji slopinančioji koncentracija) – didţiausias preparato skiedimas (maţiausia preparato koncentracija), kuris dar slopina konkrečios etaloninės mikroorganizmų kultūros augimą. Paruošus preparato pagrindinius tirpalus, buvo atliekami skiedimai 10 ml Miulerio-Hintono agaru (Mueller-Hinton Agar, Becton, Dickinson and Company) ir gaunami darbiniai skiedimai Miulerio-Hintono agare, kuriuose nustatytas tiriamų preparatų slopinamasis poveikis (MSK) etaloninių mikroorganizmų augimui. Po to į kiekvieno skiedimo Petri lėkštelę su Miulerio - Hintono agaru buvo sėjamos etaloninės bakterijų kultūros: Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterrococcus faecalis, Proteus mirabilis, Bacillus cerius, Bacillus subtilis, Candida albicans. Pasėliai buvo inkubuoti 24 val. termostate 37ºC temperatūroje ir po to vertintas mikroorganizmų augimas sėjimo vietoje (susidaro mikroorganizmų apnašas).

3.2.2.3. Propolio ištraukų cheminės sudėties nustatymas ESC metodu (tyrimas atliktas LSMU MA, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje)

Medţiagos: metanolis - efektyviosios skystinės chromatografijos tyrimui gautas iš Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Vokietija). Išgrynintas vanduo pavyzdţių paruošimui buvo filtruotas per 0,22 µm kasetę Millipore HPLC grade (Bedford, JAV). Fenolinių rūgščių standartai gauti iš ChromaDex (Santa Ana, JAV).

Tirta naudojant Waters 2690 chromatografijos sistemos modelį (Waters, Milford, JAV) su UV/PDA detekcija, įrengta su Waters 2487 UV/Vis ir Waters 996 PDA detektoriais. Išskyrimui naudota Hichrom kolona Hypersil H5ODS-150A 150×4.6 mm (Hichrom Ltd., Berkshire, Didţioji Britanija) ir H5ODS-10C apsaugos prieškolonelė. Eliuentas A (metanolis) ir eliuentas B (0,5% (t/t) acto rūgštis vandenyje). Gradientas: 0 min 10% A eliuente B, 28 min 60% A eliuente B ir 30 min 10% A eliuente B. Kitimas linijiškas. Srovės greitis 1 ml/min, kolonos temperatūra – aplinkos, injekcijos tūris 10µl. UV analizė atlikta, 290 nm bangos ilgyje. Veikliosios medţiagos buvo indentifikuotos, remiantis tirtųjų medţiagų sulaikymo trukme ir lyginant su standartų sulaikymo trukme (26).

4. TYRIMO REZULTATAI, JŲ APTARIMAS

4.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Bendras fenolinių junginių kiekis kiekvienoje tiriamoje propolio ištraukoje nustatytas spektrofotometriniu metodu pagal ferulinės rūgšties ekvivalentą (FRE). Tyrimai kartojami 2 kartus, rezultatai pateikiami išvedus vidurkį.

4.1.1. Vandens ir nevandeninių tirpiklių įtaka propolio ištraukų kokybei

BFK nustatymas propolio vandeninėse ištraukose

14,4 17,04 19,64 0 5 10 15 20 25 2,5% 5,0% 10,0% Propolio koncentracija B FK ( FR E ) mg/ g

Pav. 5. Bendras fenolinių junginių kiekis (BFK) vandeninėje propolio ištraukoje, išreikštas FRE mg/g.

Iš grafiko matoma tendencija, jog didėjant propolio koncentracijai, didėja bendras fenolinių junginių kiekis ištraukoje. Nustatytas statistiškai labai reikšmingas skirtumas tarp 2,5 proc. ir 5 proc. propolio ištraukų p=0,0319 (p<0,05) ir tarp 5 proc. ir 10 proc. ištraukų p=0,03. Išsiskyręs fenolinių junginių kiekis nėra reikšmingai didelis. Iš paimto didesnio propolio ţaliavos kiekio išsiskyrė atitinkamai daugiau fenolinių junginių nei iš maţesnio.

BFK nustatymas etanolinėse propolio ištraukose 167,52 175,6 195 150 160 170 180 190 200 2,50% 5% 10% Propolio koncentracija BF K ( F RE ) mg /g

Pav. 6. Bendras fenolinių junginių kiekis (BFK) etanolinėje propolio ištraukoje, išreikštas FRE mg/g.

Iš grafiko matyti, kad yra tiesioginė priklausomybė tarp propolio ištraukų koncentracijos ir fenolinių junginių kiekio ištraukose. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp tirtųjų ištraukų (p<0.05). Kaip tirpiklį naudojant 70 proc. etanolį daugiausia fenolinių junginių išsiskyrė 10 proc. propolio ištraukoje, o maţiausiai – 2,5 proc. propolio ištraukoje. Lyginant su vandeninėmis propolio ištraukomis, etanolinėse ištraukose fenolinių junginių išsiskyrė daugiau.

BFK nustatymas propolio ištraukose su propilenglikoliu

97,92 118,6 171,43 0 50 100 150 200 2,50% 5% 10% Propolio koncentracija B FK ( FR E ) m g/ g

Pav. 7. Bendras fenolinių junginių kiekis (BFK) propolio ištraukoje propilenglikolyje, išreikštas FRE mg/g.

Iš grafiko matome, jog fenolinių junginių kiekis tendencingai didėja, didėjant ištraukos koncentracijai. Nustatyti statistiškai labai reikšmingi skirtumai tarp tirtųjų tirpalų. Daugiausia fenolinių junginių yra 10 proc. propolio ištraukoje. Lyginant su vandeninėmis ištraukomis, išsiskyręs jų kiekis reikšmingai didesnis, bet lyginant su etanolinėmis ištraukomis, fenolinių junginių išsiskyrė maţiau.

4.1.2. Tirpiklių sistemos (vanduo – etanolis – propilenglikolis) įtaka propolio ištraukų kokybei Remiantis literatūros duomenimis [7, 18, 19, 25], propolio ištraukos gamybai naudojama trijų tirpiklių sistema, kurią sudaro 6,25 ml 96,3 proc. V/V etanolio, 2,5 g 1,2 – propandiolio ir išgryninto vandens iki 25 ml bendro tūrio. Paruošti 2,5 proc., 5 proc. ir 10 proc. tirpalai.

BFK nustatymas propolio ištraukose trijų tirpiklių sistemoje 85,4 82,52 73,72 65 70 75 80 85 90 2.5% 5% 10% Propolio koncentracija BF K ( F RE ) mg /g

Pav. 8. Bendras fenolinių junginių kiekis (BFK) propolio ištraukose trijų tirpiklių sistemoje, išreikštas FRE mg/g.

Iš grafiko matome tendenciją maţėti – kuo maţesnė ištraukos koncentracija, tuo didesnis joje esančių fenolinių junginių kiekis. Daugiausia fenolinių junginių išskirta 2,5 proc. propolio ištraukoje, o maţiausia – 10 proc. ištraukoje. Skirtumas tarp 2,5 proc. ir 5 proc. propolio ištraukų p=0,06 ir tarp 5 proc. ir 10 proc. - p=0,05 yra statistiškai nereikšmingi, o tarp 2,5 proc. ir 10 proc. - p=0,0059 (p<0,05) – skirtumas statistiškai labai reikšmingas.

Tyrimų rezultatai parodė, kad ekstrahavimo metu susidaro didelis ribinis sluoksnis ir difuzijos procesas nevyksta, vadinasi reikia įterpti technologinius faktorius, kad būtų pagerintas difuzijos procesas [25].

4.1.3. Maišymo įtaka propolio ištraukų kokybei

Norint pagerinti veikliųjų medţiagų išsiskyrimą vykdomas ištraukos su trijų tirpiklių sistema maišymas magnetine maišykle. Maišoma tris valandas, mėginiai paimami tyrimui po vienos valandos maišymo, po dviejų valandų maišymo ir po trijų valandų maišymo. Tyrimas atliekamas naudojant propolio ištraukas tirpiklių sistemoje.

BFK nustatymas propolio ištraukose po 1h maišymo 15,36 14,8 17,12 13 14 15 16 17 18 2,5% 5,0% 10,0% Propolio koncentracija B FK ( FR E ) mg/ g

Pav. 9. Bendras fenolinių junginių kiekis (BFK) propolio ištraukose tirpiklių sistemoje po vienos valandos maišymo, išreikštas FRE mg/g.

Iš grafiko matome, kad po vienos valandos maišymo fenolinių junginių daugiausia išsiskyrė 2,5 proc. propolio ištraukoje, o maţiausia 10 proc. propolio ištraukoje. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp 2,5 proc. ir 5 proc. propolio ištraukų - p<0,0001, o tarp 5 proc. ir 10 proc. skirtumas yra statistiškai nereikšmingas p=0,53. Lyginant veikliųjų medţiagų kiekį 2,5 proc. ir 10 proc. propolio ištraukose, nustatytas skirtumas statistiškai labai reikšmingas - p<0,0001.

BFK nustatymas propolio ištraukose po 2h maišymo

25,13 27,36 35,3 0 10 20 30 40 2,5% 5,0% 10,0% Propolio koncentracija BF K ( F RE ) mg /g

Pav. 10. Bendras fenolinių junginių kiekis (BFK) propolio ištraukose tirpiklių sistemoje po dviejų valandų maišymo, išreikštas FRE mg/g.

BFK nustatymas propolio ištraukose po 3h maišymo 25,29 28 36,1 0 10 20 30 40 2,5% 5,0% 10,0% Propolio koncentracija BF K ( F RE ) mg /g

Pav. 11. Bendras fenolinių junginių kiekis (BFK) propolio ištraukose tirpiklių sistemoje po trijų valandų maišymo, išreikštas FRE mg/g.

Iš grafiko matyti tendencija didėti. Maţiausiai fenolinių junginių išsiskyrė 2,5 proc. propolio ištraukoje, o daugiausia – 10 proc. propolio ištraukoje. Tačiau lyginant su duomenimis po dviejų valandų maišymo, nustatytas fenolinių junginių kiekis nėra reikšmingai didesnis.

Galima teigti, kad optimalus maišymo laikas yra dvi valandos. Maišant ilgiau, išsiskyręs fenolinių junginių kiekis kinta maţai, todėl maišyti tampa nebeekonomiška.

4.1.4. Temperatūros įtaka propolio ištraukų kokybei

Temperatūros įtaka tirta naudojant magnetinę maišyklę ir maišant dvi valandas skirtingose temperatūrose. Tirta 400, 500 ir 600C temperatūros įtaka. Temperatūros intervalas parinktas remiantis propolio aliejaus technologija [27]. Tyrimui naudoti 5 proc. propolio tirpalai su propilenglikoliu.

BFK nustatymas propolio ištraukose temperatūros poveikyje 85,6 125,2 153,8 0 50 100 150 200 40 50 60 Temperatūra (0_C) BF K ( F RE ) mg /g

Pav. 12. Bendras fenolinių junginių kiekis (BFK) propolio ištraukose, veikiant jas temperatūra, išreikštas FRE mg/g.

Iš grafiko matyti, kad maţiausiai fenolinių junginių išsiskyrė maišant dvi valandas 400C temperatūroje, o daugiausiai išsiskyrė maišant dvi valandas 600C temperatūroje. Rezultatai parodo, kad temperatūros didėjimas turi įtakos fenolinių junginių išsiskiriančiam kiekiui. Nustatyti reikšmingi veikliųjų medţiagų skirtumai, lyginant ištraukas ekstrahuotas skirtingoje temperatūroje. Efektyviausias išsiskyrimas vyksta palaikant 600C temperatūrą.

4.1.5. Emulsiklio Tween® 20 panaudojimo įtaka propolio ištraukų kokybei

Atliekamas tyrimas, panaudojant emulsiklį Tween® 20 [7]. Tiriami 5 proc. propolio tirpalai propilenglikolyje, naudojant 0,1 proc. (0,025 g), 0,3 proc. (0,075 g), 0,5 proc. (0,125 g) ir 0,7 proc. (0,175 g) emulsiklio pagal bendrą ištraukos kiekį. Tiriami tirpalai maišomi dvi valandas, palaikant 600C temperatūrą.

BFK nustatymas propolio ištraukose, naudojant emulsiklį

76,8 113 76 106,9 0 20 40 60 80 100 120 0,1% 0,3% 0,5% 0,7% Emulsiklio koncentracija B FK ( FR E ) m g/ g

Pav. 13. Bendras fenolinių junginių kiekis (BFK) propolio ištraukose, naudojant emulsiklį, išreikštas FRE mg/g.

Iš grafiko galima spręsti, kad tiesioginės priklausomybės tarp išsiskyrusio fenolinių junginių kiekio ir panaudoto emulsiklio kiekio ištraukoje nėra. Didţiausias kiekis fenolinių junginių išsiskyrė ištraukoje, kurioje buvo 0,3 proc. emulsiklio. Maţiausias kiekis fenolinių junginių išsiskyrė ištraukoje su 0,5 proc. ir 0,1 proc. emulsiklio. Nenustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp veikliųjų medţiagų kiekio šiose ištraukose. Remiantis tyrimų duomenimis galima teigti, kad optimalus polisorbato kiekis – 0,3 procentai.

4.1.6. Ţaliavos surinkimo būdo įtaka propolio ištraukų kokybei

Bitininkystės literatūroje aprašoma daug pikio surinkimo būdų. Jų visų pagrindas toks – išnaudoti bičių instinktą uţtaisyti avilio plyšius pikiu [6]. Pagal paskirtį skiriamos dvi propolio rūšys:

- propolis, skirtas korių akutėms lakuoti ir dezinfekuoti. Tai gryna dervinė medţiaga – balzaminis pikis. Šiuo pikiu išteptos korio akutės įgauna gelsvą spalvą, specifinį kvapą ir atsparumą aukštesnei temperatūrai. Jam būdingos stiprios dezinfekuojančios savybės. Toks balzamas įeina į vaško sudėtį, kuriuo uţakiuojamas medus ir perai. Šio pikio surinkti neįmanoma.

- propolis, skirtas avilio plyšiams ir praėjimams uţpildyti, kad į avilio vidų nepūstų vėjas, neprasibrautų pašaliniai gyviai. Šio pikio paskirtis – į avilį nepraleisti vandens ir oro [1].

Bitės geriausiai pikiuoja nuo vieno iki trijų milimetrų tarpus. Pikiuodamos didesnius tarpus, į pikį įmaišo vaško. Apiterapijos reikmėms naudojamas tais pačiais metais surinktas pikis [1, 6].

Norint surinkti kokybišką pikio ţaliavą, reikia naudoti specialius pikio rinktuvus. Tarp atskirų pikio rinktuvo elementų turi būti nuo vieno iki trijų milimetrų atstumas. Pikiui rinkti nuo rėmelių lystelių ir lubelių lentelių reikia turėti specialią dėţutę. Prie jos krašto pritvirtinamas pikio valytuvas. Pertraukus per jį lystelę, pikis subyra į dėţutę. Nuo avilio sienų, falcų, diafragmų pikis švariai nuvalomas kaltu. Šis inventorius gali būti pagamintas iš kieto medţio, maistinės plastmasės, nerūdijančio plieno. Valant avilius, pirmiausia reikia išvalyti jų dugnus, o tik po to nuo sienų rinkti pikį. Bitės rinktuvų plyšius uţpikiuoja per 7 – 20 dienų. Plyšiai energingai pildomi geguţės – birţelio mėnesį, kai sprogstant pumpurams gausu dervingų medţiagų, ir baigiantis vasarai, kai bitės ruošiasi ţiemai. Iš vienos bičių šeimos galima surinkti nuo 200 iki 500 gramų pikio. Tokioje pikio ţaliavoje yra labai maţai vaško ir kitų mechaninių priemaišų [1, 6].

Iš rinktuvų surinktas pikis būna birus. Laikomas gerai izoliuotas nuo saulės šviesos ir oro [1].

Atliekant tyrimus jau aprašytus šiame darbe, buvo naudojamas ūkininkų – bitininkų surinktas pikis iš Kauno, Varėnos ir Kėdainių rajonų. Pasibaigus šiam pikiui, naudotas pramonėje įsigytas bičių pikis. Tų pačių koncentracijų ištraukų tyrimų rezultatai suprastėjo. Tai parodo, jog bitininkų specialiais rinktuvais maţais kiekiais rinktas pikis yra kokybiškesnis, jame daugiau polifenolinių bei kitų biologiškai aktyvių junginių. Nustatytas reikšmingas skirtumas (p<0,05) tarp propolio ištraukų naudojant skirtingą ţaliavą.

2 lentelė. Ţaliavos įtaka propolio ištraukų kokybei

Bendras fenolinių junginių kiekis (BPK) propolio ištraukose, išreikštas FRE mg/g

Bitininkų surinktas pikis Pramonėje įsigytas pikis (UAB Bičių korys)

2,5 % propolio ištrauka tirpiklių sistemoje

85,4±0,98 25,13±0,91

5 % propolio ištrauka tirpiklių sistemoje 82,52±0,88 27,36±0,96

10 % propolio ištrauka tirpiklių sistemoje 73,72±0,75 35,3±0,77

10 % vandeninė propolio ištrauka _{19,64±0,54 5,6±0,93}

10 % etanolinė propolio ištrauka 115,35±0,88 42,9±0,82

4.2. Propolio tirpalų mikrobiologinio aktyvumo nustatymas

3 lentelė. Junginių antimikrobinio aktyvumo tyrimo rezultatai

Nr. Junginio kodas _Tyr im o N r. Konc., µg/ml _S. a ur eu s E .c ol i B . s ubt il is K. pne um oni ae C. al bi cans P . ae rugi nos a P . m ir abi li s E . f ae ca li s S. e pi de rm idi s Pastabos 1 Propolio tirpalas tirpiklių sistemoje 1 0,65 + + + + + + + + + 0,43 + + + + + + + + + 0,21 + + + + + + + + + 0,08 + + + + + + + + + 2 Propolio vandeninis tirpalas 2 0,25 + + + + + + + + + 0,10 + + + + + + + + + 0,05 + + + + + + + + + 0,02 + + + + + + + + + 3 Propolio propilenglik olinis tirpalas (5%) 3 0,73 - - - - 0,49 - + - - - + - - - 0,24 - + - + + + + - - 0,09 - + - + + + + + + 5 Propolio propilenglik olinis tirpalas 4 0,73 - - - - 0,49 - - - + - - 0,24 - + + + + + + + + 0,09 + + + + + + + + +

6 Etanolis 5 A + + + + - - + + + B + + + + + + + + + C + + + + + + + + + D + + + + + + + + + 7 PG 6 A + - + -+ - - +- +- +- B + + + + + + + + + C + + + + + + + + + D + + + + + + + + +

Tyrimų rezultatai (3 lentelė) parodė, kad vandeninis propolio tirpalas ir propolio tirpalas trijų tirpiklių sistemoje (vanduo – etanolis – propilenglikolis) buvo neveiksmingi prieš tirtų mikroorganizmų štamus. Propolio tirpalai propilenglikolyje geriausiai veikia prieš Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis (3 lentelė). Taip pat šie tirpalai buvo aktyvūs ir prieš kitus tirtus mikroorganizmus (3 lentelė). Iš literatūros duomenų yra ţinoma, kad ir propolio etanoliniai tirpalai veikia prieš tirtąsias bakterijas [11, 26].

Atlikus tyrimus galima teigti, kad propolio vandeninis tirpalas nepasiţymi antimikrobiniu aktyvumu ir šio tirpalo technologija bei sudėties vertinimas reikalauja papildomų mokslinių tyrimų.

4.3. Rezultatų aptarimas

Palyginus fenolinių rūgščių tyrimų rezultatus, galima teigti, kad vandeninio propolio tirpalo sudėtyje veikliųjų medţiagų kiekis yra maţas, pavyzdţiui, chlorogeno rūgšties – apie 21 mkg/ml, kumaro rūgšties – apie 3 mkg/ml, ferulinės rūgšties – apie 5 mkg/ml (Pav. 15). Todėl tai gali turėti įtakos propolio vandeninių tirpalų neveiksmingam mikrobiologiniam atyvumui. Fenolinėms rūgštims būdinga chromatograma, tiriant ESC metodu pateikta 14 paveiksle.

Pav. 14. Fenolinių rūgščių chromatograma

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinta propolio etanolinių tirpalų ir propolio tirpalų propilenglikolyje cheminė sudėtis. Remiantis literatūros duomenimis propolyje dominuojančios yra kumaro, ferulo, chlorogeno rūgštys [28].

Pav. 15. Propolio tirpalų cheminė sudėtis

20 .7 14 1. 92 1 3. 22 8 4. 85 4 2. 23 0 19 1. 55 6 59 .7 80 1. 03 7. 59 3 29 2. 74 5 90 .7 55 74 .8 33 6. 88 2 4. 28 6 24 .4 16 8. 96 0 0 200.000 400.000 600.000 800.000 1.000.000 1.200.000 Chlor ogen o r Kavo s r Kum aro r Feru line r Rozm arino r K ie ki s (m kg/ m l)

Vandeninis propolio tirpalas Etanolinis propolio tirpalas Propolio tirpalas propilenglikolyje

Tyrimai rodo (Pav. 15), jog didesnis kiekis veikliųjų medţiagų išekstrahuojamas kaip ekstrahentą naudojant etanolį. Tačiau pateikti duomenys (Pav. 15) taip pat rodo, kad abu tirpikliai yra tinkami propolio ţaliavos ekstrahavimui, nes propolio tirpalai su propilenglikoliu irgi pasiţymėjo antimikrobiniu aktyvumu.

Remiantis literatūra galima teigti, kad odontologijoje ir dermatologinių preparatų gamyboje priimtinesnis yra nelakus propilenglikolinis propolio tirpalas. Todėl šio tirpalo technologija reikalauja detalesnių tyrimų.

Remiantis literatūra įvertinta temperatūros ir maišymo faktoriaus įtaka tirpalų kokybei. Tyrimų rezultatai parodė, jog minėtieji faktoriai gerina veikliųjų medţiagų išsiskyrimą iš propolio ţaliavos, nes rezultatai parodė nustatytą didesnį fenolinių junginių kiekį. Galima teigti, kad propolio tirpalų kokybė priklauso ne tik nuo pasirinkto tirpiklio, bet ir nuo technologinių faktorių – surinkimo būdo, temperatūros, maišymo.

5. IŠVADOS

1. Tyrimų rezultatai parodė, kad propolio ţaliavos koncentracija daro įtaka fenolinių junginių kiekiui propolio ištraukose, kai ekstrahentu naudojamas vanduo, etanolis ar propilenglikolis. Nustatytas didţiausias kiekis fenolinių junginių 10 proc. propolio ištraukose, o maţiausias - 2,5 proc. propolio ištraukose.

2. Tyrimų rezultatai parodė, kad propolio surinkimo būdas įtakoja ištraukų kokybę - nustatytas didesnis kiekis fenolinių jųnginių, kai propolio ţaliavos surinkimui naudojami specialūs rinktuvai ir specialūs rinkimo būdai.

3. Tyrimų rezultatai parodė, kad klasikinės maceracijos metodas yra netinkamas propolio veikliųjų medţiagų išskyrimui iš ţaliavos, kai ekstrahentas tirpiklių mišinys (etanolis – propilenglikolis – vanduo), kadangi didėjant ekstrahuojamos ţaliavos kiekiui, fenolinių junginių kiekis ištraukoje maţėja.

4. Tyrimų rezultatai parodė, kad maišymas įtakoja fenolinių junginių išsiskyrimą iš propolio ţaliavos, kai ekstrahentu naudojamas tirpiklių mišinys. Nustatytas optimalus maišymo laikas – 2 val.

5. Tyrimų rezultatai parodė, kad vanduo kaip ekstrahentas išekstrahuoja iš ţaliavos maţiausią kiekį fenolinių junginių (17,03 ± 2,5 mg/g), etanolis - didţiausią kiekį (152,83 ± 25 mg/g), o propilenglikolis uţima tarpinę vietą tarp šių tirpiklių (129,32 ± 37 mg/g). Kadangi yra nelakus ir nevandeninis, propilenglikolis gali būti plačiai naudojamas kaip tirpiklis propolio tirpalų gamyboje.

6. Remiantis tyrimų rezultatais galima teigti, kad Tween® 20 nepagerina veikliųjų medţiagų išsiskyrimo iš propolio ţaliavos, nes nenustatytas reikšmingas skirtumas tarp fenolinių junginių kiekio ištraukose su / be polisorbato.

7. Nustatyta, kad technologiniai parametrai (maišymas, temperatūra), didina fenolinių junginių išsiskyrimą iš propolio ţaliavos, kai tirpiklis yra propilenglikolis. Didţiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas, kai temperatūra 600C, o maišymo laikas - 2 val.

8. Tirtųjų propolio ištraukų antimikrobinio aktyvumo tyrimai parodė, kad ekstrahentas daro įtaką propolio ištraukų mikrobiologiniam aktyvumui - vandeniniai propolio tirpalai neslopino tirtųjų mikroorganizmų augimo, o etanoliniai ir propilenglikoliniai propolio tirpalai pasiţymėjo antimikrobiniu aktyvumu.

9. Cheminės sudėties ir antimikrobinio aktyvumo tyrimai parodė, kad propilenglikolis yra tinkamas tirpiklis propolio veikliųjų medţiagų išekstrahavimui.

SANTRAUKA

Tyrimo tikslas - pagaminti propolio tirpalus ir įvertinti jų kokybę.

Darbo uţdaviniai: ištirti ţaliavos ir ekstrahento santykio bei propolio surinkimo būdo įtaką ištraukų kokybei; ištirti vandens, etanolio, propilenglikolio ir pagalbinių medţiagų įtaką propolio veikliųjų medţiagų išsiskyrimui iš ţaliavos; įvertinti technologinių parametrų (maišymo laiko, temperatūros) įtaką propolio ištraukų kokybei; įvertinti pagamintų propolio ištraukų antimikrobinį aktyvumą.

Tyrimo metodai. Bendras polifenolinių junginių kiekis propolio tirpaluose nustatytas spektrofotometriniu metodu (spektrofotometras UNICAM Helios α UV, Didţioji Britanija) pagal ferulinės rūgšties ekvivalentą. Mikrobiologinis aktyvumas nustatytas LSMU MA Mikrobiologijos katedroje. Metodika pagal Ph Eur. 01/2002, 2.6.12. Atlikta aseptinėmis sąlygomis. Propolio tirpalų cheminė sudėtis nustatyta ESC (efektyviosios skysčių chromatografijos) metodu - LSMU MA Analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje.

Rezultatai ir išvados. Tyrimų rezultatai parodė, kad ţaliavos koncentracija daro įtaką fenolinių junginių kiekiui ištraukose, kai ekstrahentu naudojamas vanduo, etanolis ir propilenglikolis, nustatytas didţiausias kiekis fenolinių junginių 10 proc. propolio ištraukose, o maţiausias - 2,5 proc. propolio ištraukose. Tyrimų rezultatai parodė, kad propolio surinkimo būdas įtakoja ištraukų kokybę - nustatytas didesnis kiekis fenolinių jųnginių, kai propolio ţaliavos surinkimui naudojami specialūs rinktuvai.Tyrimų rezultatai parodė, kad klasikinės maceracijos metodas yra netinkamas propolio veikliųjų medţiagų išskyrimui iš ţaliavos, kai ekstrahentas tirpiklių sistema (etanolis – propilenglikolis – vanduo), kadangi didėjant ekstrahuojamos ţaliavos kiekiui fenolinių junginių kiekis ištraukoje maţėja. Remiantis tyrimų rezultatais galima teigti, kad Tween® 20 nepagerina veikliųjų medţiagų išsiskyrimo iš propolio ţaliavos, nes nenustatytas reikšmingas skirtumas tarp fenolinių junginių kiekio ištraukose su / be polisorbato. Tyrimų rezultatai parodė, kad maišymas pagerina fenolinių junginių išsiskyrimą iš propolio ţaliavos, kai ekstrahentu naudojamas tirpiklių mišinys. Nustatytas optimalus maišymo laikas – 2 val. Vanduo kaip ekstrahentas išekstrahuoja iš ţaliavos maţiausią kiekį fenolinių junginių (17,03 ± 2,5 mg/g), etanolis didţiausia kiekį (152.83 ± 25 mg/g), o propilenglikolis (129.32 ± 37 mg/g) uţimą tarpinę vietą tarp šių tirpiklių. Nustatyta, kad technologiniai parametrai (maišymas, temperatūra), didina fenolinių junginių išsiskyrimą iš

propolio ţaliavos, kai tirpiklis propilenglikolis. Didţiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas, kai temperatūra 600C, o maišymo laikas - 2 val. Tirtųjų propolio ištraukų mikrobiologinis tyrimas parodė, kad ekstrahentas daro įtaką propolio ištraukų antimikrobiniam aktyvumui - vandeniniai propolio tirpalai neslopino tirtųjų mikroorganizmų augimo, o etanoliniai ir propilenglikolio propolio tirpalai pasiţymėjo antimikrobiniu aktyvumu. Cheminės sudėties ir antimikrobinio

aktyvumo tyrimai parodė, kad propilenglikolis yra tinkamas tirpiklis propolio veikliųjų medţiagų išekstrahavimui.

SUMMARY

The purpose of this study is to manufacture propolis solutions and make quality evaluation.

Aims: to examine how propolis and extrahent ratio and propolis gathering method affects the quality of the solutions; to analyse how water, ethanol, propylenglycol and additive ingredients affect the release of active pharmaceutical ingredients; to evaluate how technological parameters affect the quality of extracts; to analyse the microbiological activity of propolis solutions.

Methods: total amount of polyphenolic compounds in the extracts of propolis was determined using spectrophotometry (spectrophotometer UNICAM Helios α UV, UK) with ferulic acid as equivalent. Microbiological activity was determined at University of Health Science of Lithuania, Medicine Academy, Microbiological Department. Method is based on the article of Ph Eur. 01/2002, 2.6.12. Chemical composition of propolis extracts were studied using HPLC (high pressure liquid chromatography).

Results: the study shows that the concentration of propolis in the solution greatly affects the amount of polyphenolic compounds in the extracts. The highest number was extracted from the 10% propolis solution the lowest from 2,5%. The extrahent also has an effect on the extract - the highest amount of polyphenolic compounds were extracted using ethanol (152.83 ± 25 mg/g) and propylenglycol (129.32 ± 37 mg/g) where as water was the lowest (17,03 ± 2,5 mg/g). The results also show that the gathering of propolis using special tools has a positive effect on the quality of extracts. Results show that the method of Classical Maceration is not effective using a system of solvents (ethanol – propylenglycol – water) as an extrahent, because the higher the amount of propolis was used the less polyphenolic compounds were extracted. The study also shows that there is no noticeable difference in the amount of active pharmaceutical ingredient in the extract when using Tween® 20 as an additive. Evaluation of technological parameters shows that when using system of solvents (ethanol – propylenglycol – water) as extrahents mixing does have a positive effect on the number of polyphenolic compounds and the optimal mixing time is considered to be 2hrs. The evaluation of technological parameters using propylenglycol as extrahent determined that the optimal temperature for best results is 600C and mixing time is also 2hrs. The study of microbiological activity shows that the extrahent has great affect on the microbiological ability of the extracts. Water was least effective and did not inhibit the growth of examined microorganisms. Ethanol and propilenglycol do suppress the growth of the microorganisms. HPLC and microbiological studies show that propilenglycol is suitable as a solvent for propolis for extraction

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Amţiejus A. Pikio ţaliavos surinkimas apiterapijai. Apiterapija ir bitininkystė, 2009, psl. 5 – 6.

2. Bankova V. Chemical diversity of propolis and the problem of standartization. Journal of Ethnopharmacology 100 (2005) psl. 114-117. Prieiga per internetą: http://www.plantasmedicinales.org/archivos/propoleos___diversidad_quimica_y_estandariz acion.pdf

3. Bankova V., Marcucci M., de Castro S. Propolis: recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie 31 (2000), psl. 3 – 15.

4. Bankova V. Recent trends and important developments in propolis research. Evid Based Complement Alternat Med 2005;2(1) psl. 29-32.

5. Bankova V., Popovaa M., Bogdanovb S. and Sabatinic A.G. Chemical Composition of European Propolis: Expected and Unexpected Results. Z Naturforsch C 2002;57:530-3. Prieiga per internetą: http://www.znaturforsch.com/ac/v57c/s57c0530.pdf

6. Blaţekas J.A. Bitininko ţinynas. Mokslas, Vilnius, 1987, psl. 148 – 150.

7. Ceschel G. C., Maffei P., Sforzini A., Lombardi Borgia S., Yasin A., Ronchi C. In vitro permeation through porcine buccal mucosa of caffeic acid phenetyl ester (CAPE) from topical mucoadhesive gel containing propolis. Fitoterapia, Volume 73, Supplement 1, November 2002, psl. S44 – S52.

8. Fokt H., Pereira A., Ferreira A. M., Cunha A., Aguiar C. How does bee prevent hive infections? The antimicrobial properties of propolis. Prieiga per internetą: http://www.formatex.info/microbiology2/481-493.pdf

9. Gendrolis A. Propolis. Kaip sveikai ir ilgai gyventi. Kaunas, 2010.

10. Grange J. M., Davey R. W. Antibacterial properties of propolis. Journal of the Royal Society of Medicine. Volume 83. 1990, psl. 159 - 160. Prieiga per internetą: http://www.paviasalesgroup.com/propolis-study.pdf

11. Kartal M., Yildiz S., Kaya S., Kurucu S. Antimicrobial activity of propolis samples from two different regions of Antolia. Journal of Ethnopharmacology 86 (2003) psl. 69 – 73. 12. Kubilienė L., Gendrolis A. Propolio vandeninių tirpalų technologijos kūrimas ir analizė.

Sveikatos mokslai Nr. 6, 2006, psl. 504 – 505.

13. Majienė D., Trumbeckaitė S., Buinevičiūtė J., Buivydaitė R., Vaidelys A., Gendrolis A. Bičių produktai mūsų sveikatai: propolio cheminė sudėtis ir gydomosios savybės. Sveikatos mokslai Nr. 2; 2003.

14. Majienė D., Trumbeckaitė S., Grūnovienė D., Ivanauskas L., Gendrolis A. Propolio ekstrakto cheminės sudėties tyrimai. Medicina (Kaunas) 2004; 40(8).

15. Majienė D., Šidlauskaitė A., Pavilonis A., Trumbeckaitė S., Gendrolis A., Savickas A. Propolio, surinkto skirtinguose Lietuvos regionuose, cheminės sudėties ir antimikrobinio aktyvumo tyrimas. Sveikatos mokslai Nr. 6(47); 2006, psl. 509 - 513.

16. Marcucci M. C. Propolis: Chemical composition, biological properties and therapeutic activity. Apidologie. 1995, 26, psl. 83 - 99. Prieiga per internetą: http://www.langleybeeclub.org/files/reports/Propolis%20-%20Marcucci.pdf

17. Martirosyan D. M. Functional foods for chronic diseases. D&A Inc., 2006, psl. 158 – 162. 18. Marquele F. D., Oliveira A. R. M., Bonato P. S., Lara M. G., Fonseca Maria Jose V.

Propolis extract realease evaluation from topical formulations by chemiluminescence and HPLC. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, Volume 41, Issue 2, May 2006, psl. 461 – 468.

19. Marquele – Oliveira F., Fonseca Y. M., O. de Freitas, Fonseca M. J. V. Development of topical functionalized formulations added with propolis extract: stability, cutaneous absorption and in vivo studies. International journal of pharmaceutics, Volume 342, Issues 1 – 2, September 2007, psl. 40 – 48.

20. Miguel M. G., Nunes S., Dandlen S. A., Cavaco A. M., Antunes M. D. Phenols and antioxidant activity of hydro – alcoholic extacts of propolis from Algarve, South of Portugal. Food and chemical toxycology, December 2010, 48(12):3418-23.

21. Mizrahi A., Lensky Y. Bee products – properties, applications and apitherapy. Springer, 1997, psl. 129 - 133. Prieiga per internetą: http://books.google.com/books?id=p-ii-nVqFCIC&printsec=frontcover&hl=lt&source=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q &f=false

22. Ozan F., Sumer Z., Polat A. Z., Er K., Ozan U., Deger O. Effect of mouthrinse containing propolis on oral mikroorganisms and human gingival fibroblasts. European journal of dentistry, October 2007, vol. 1(4), psl. 195 - 201.

23. Parolia A., Thomas S. M., Kundabala M., Mohan M. Propolis and it‘s potential uses in oral health. International journal of medicine and medical sciences, Vol. 2(7), 2010, psl. 210 - 215.

24. Ponomariov V.D. Ekstragirovania lekarstvenogo cirija. 1976m. Moskva, psl.110 - 115. 25. Raymond C Rowe, Paul J, Sheskey and Marian E Quinn. Pharmaceutical Excipients 2009.

26. Ramanauskienė K., Inkėnienė A. M., Savickas A., Masteikova R., Brusokas V. Analysis of the antimicrobial activity of propolis and lysozyme in semisolid emulsion systems. Acta Poloniae pharmaceutica. Drug research. Warszawa: Polski Towarzystwo Farmaceutyczne. 27. Ramanauskienė K., Kasparvičienė G., Inkėnienė A. M., Savickas A., Briedis V. Propolis oil:

quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity. 7th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology [elektroninis išteklius] : Malta, Valletta, 8th to 11th March 2010 / [2 p.], no. 233. Prieiga: http://www.worldmeeting.org/fileadmin/content/Scientific_Programm_Final.pdf.

28. Ramanauskienė K., Savickas A., Inkėnienė A., Vitkevičius K., Kasparavičienė G., Briedis V., Amšiejus A. Analysis of content of poliphenolic acids in Lithuanian propolis using high-performance liquid chromatography technique. Kaunas: Medicina; 2009.

29. Remington: the science and practise of pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins, 2005, psl.

745 - 748. Prieiga per internetą:

http://books.google.com/books?id=NFGSSSbaWjwC&pg=PA746&dq=solvents+in+pharma cy&hl=lt&ei=IfVwTeuKLIjZsgac34WEDg&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=7& sqi=2&ved=0CD0Q6AEwBg#v=onepage&q=solvents%20in%20pharmacy&f=false

30. Savickas A., Švambaris L., Gendrolis A., Bernatonis D., Aleknavičienė B., Briedis V., Buragienė I., Štakėnaitė S. Vaistų technologija (II tomas). Kaunas: Medicinos akademijos leidykla; 1996.

31. Savickas A., Briedis V., Švambaris L., Drakšienė G., Klimas R., Ramanauskienė K., Inkėnienė A. M. Vaistų technologija (IV tomas). Kaunas: Universiteto vadovėlis; 2002. 32. Savickas A., Briedis V., Švambaris L., Drakšienė G., Klimas R., Ramanauskienė K.,

Inkėnienė A. M. Vaistų technologija (V tomas). Kaunas: Universiteto vadovėlis; 2008. 33. Sforcin J. M., Bankova V. Propolis: is there a potential for the development of new drugs?

Journal of ethnopharmacology, Volume 133, Issue 2, October 2010, psl. 253 – 260.

34. Sharp K. A., Vanderkooi J. M. Water in the half shell: structure of water, focusing on angular structure and solvation. Acc Chem Res. 2010 February 16; 43(2).

35. Vansevičiūtė D. Propolis extract can replace chemical agents in medications. 5th German Apitherapy Congress, March 23-25, 2007. Prieiga per internetą: http://apitherapy.blogspot.com/2007/04/propolis-extract-can-replace-chemical.html 36. http://rpmedia.ask.com/ts?u=/wikipedia/commons/thumb/f/fa/Water-2D-flat.png/120px-Water-2D-flat.png 37. http://firstyear.chem.usyd.edu.au/prelab/images/ethanol_structural_formula.png 38. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/3e/Propylene_glycol_chemical_st ructure.png/800px-Propylene_glycol_chemical_structure.png