LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALITINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
GRETA PILVENYTĖ
ANTIDEPRESANTŲ MIŠINIO TYRIMAS CHROMATOGRAFINIAIS
METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Doc. Daiva Kazlauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
ANTIDEPRESANTŲ MIŠINIO TYRIMAS CHROMATOGRAFINIAIS
METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. Daiva Kazlauskienė Data
Recenzentas Darbą atliko
A.Stankūnienė Magistrantė
Data Greta Pilvenytė
Data
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
SANTRAUKA ... 6
SUMMARY ... 7
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
1.1. Fluoksetino, paroksetino, escitalopramo, buspirono suvartojimas ... 11
1.1.1. Tiriamųjų medţiagų suvartojimas Lietuvoje ... 11
1.1.2. Tiriamųjų medţiagų suvartojimo Lietuvoje ir kitose šalyse palyginimas ... 12
1.2. Apsinuodijimo antidepresantais statistika ... 13
1.3. Tiriamosios medţiagos ... 14
1.3.1. Fluoksetino hidrochloridas ... 14
1.3.2. Paroksetino hidrochloridas ... 14
1.3.3. Buspirono hidrochloridas ... 15
1.3.4. Escitalopramo oksalatas ... 15
1.4. Klinikinės indikacijos ir kontraindikacijos ... 16
1.5. Farmakodinaminės savybės ... 16
1.6. Nepageidaujamas poveikis ir toksiškumas ... 17
1.7.Vaistinių medţiagų biologinė analizė ... 18
1.8. Mėginio paruošimas tyrimui ... 18
1.9. Kietafazė ekstrakcija ... 19
1.9.1. Sorbentai ... 19
1.9.2. Tirpikliai ... 20
1.10. Plonasluoksnė chromatografija ... 20
1.11. Efektyvioji skysčių chromatografija... 22
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 24
2.1.Tyrimo objektas ir reagentai ... 24
2.1.1. Tyrimo objektas ... 24
2.1.2. Reagentai ... 24
2.1.3. Naudota įranga ... 25
2.2. Tirpalų ruošimas ... 25
2.2.1. Etaloninių tirpalų ruošimas... 25
2.3. Tyrimo metodai ... 26
2.3.1. Kietafazės ekstrakcijos metodas ... 26
2.3.2. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas ... 26
2.3.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas ... 27
2.3.4. Metodikos validacija ... 27
2.3.5. Duomenų analizė ... 27
3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas ... 28
3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija ... 28
3.2.1.Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos specifiškumas ... 29
3.2.2. Rezultatų glaudumas ... 30
3.2.3. Tiesiškumas ... 32
3.2.4. Aptikimo ir nustatymo ribos ... 34
3.2.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas išekstrahuotų iš kraujo plazmos antidepresantų analizei ... 35
3.3.Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos pritaikymas antidepresantų analizei ... 35
3.4. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos validacija ... 35
3.4.1.Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos specifiškumas ... 36
3.4.2. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos rezultatų glaudumas ... 36
3.4.3. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos pritaikymas išekstrahuotų iš kraujo plazmos antidepresantų analizei ... 37
3.5. Kietafazės ekstrakcijos pritaikymas antidepresantų mišinio išskyrimui iš kraujo plazmos ... 38
3.5.1. Kietafazės ekstrakcijos rezultatų įvertinimas ... 39
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42
6. PRIEDAI ... 47
SANTRUMPOS
5-HT1A – 5-hidroksitriptamino 1A receptorius
5-HT2C – 5-hidroksitriptamino 2C receptorius
DAD – diodų matricos detektorius DC – dujų chromatografija
EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
GASR – gama amino sviesto rūgšties receptoriai
ICH – tarptautinė harmonizavimo konferencija (angl. International Conference on
Harmonisation)
KFE – kietafazė ekstrakcija
mACh – muskarininiai cholino receptoriai MAOI – monoaminooksidazės inhibitoriai MS – masių spektrometrija
PC – plonasluoksnė chromatografija Rf – sulaikymo rodiklis
R2 – koreliacijos koeficientas SSE – skysčių-skysčių ekstrakcija
SSRI – selektyvūs serotonino reabsorbcijos inhibitoriai SSN – santykinis standartinis nuokrypis
TFA – trifluoracto rūgštis
tR – sulaikymo laikas (angl. Retention time)
UV – ultraviolerinė spinduliuotė
SANTRAUKA
ANTIDEPRESANTŲ MIŠINIO TYRIMAS CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS
G. Pilvenytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė doc. D. Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas.
Tyrimo objektas – kraujo plazmos mėginiai su antidepresantų (fluoksetino hidrochlorido, paroksetino hidrochlorido, buspirono hidrochlorido ir escitalopramo oksalato) vaistų mišiniu. Darbo tikslas – pritaikyti efektyviosios plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygas escitalopramo, fluoksetino, paroksetino ir buspirono išskirstymui iš mišinių, jų identifikavimui ir kiekybiniam vertinimui kraujo plazmoje. Uždaviniai: pritaikyti tinkamiausias kietafazės ekstrakcijos sąlygas antidepresantų mišinio išskyrimui iš kraujo plazmos. Pritaikyti efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodo sąlygas antidepresantų komponentų atskyrimui ir identifikavimui, metodiką validuoti. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygas antidepresantų mišinio komponentų atskyrimui ir identifikavimui, metodiką validuoti. Išskirti antidepresantų mišinį iš kraujo plazmos kietafazės ekstrakcijos metodu ir nustatyti komponentų tapatybę ir kiekį pritaikytais analizės metodais.
Naudoti metodai: kietafazė ekstrakcija, efektyvioji skysčių chromatografija ir efektyvioji plonasluoksnė chromatografija.
Tyrimo rezultatai ir išvados. Eksperimento metu parinkta ir validuota efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos tirpiklių sistema (acetonitrilas: metanolis: amonio hidroksidas 85: 10: 10), leidţianti išskirstyti ir identifikuoti antidepresantų mišinio komponentus, išskirtus iš kraujo plazmos. Metodika validuota pagal specifiškumo ir pakartojamumo kriterijus. Rf pakartojamumas
neviršijo nustatytos 5 proc. leistinos paklaidos ribos. Pritaikyta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika tiriamųjų analičių kokybiniam ir kiekybiniam tyrimui. Kokybės įvertinimo validacija atlikta, įrodant metodo specifiškumą, rezultatų glaudumą (SSN nesiekė nustatytos 5 proc. ribos), tiesiškumą (tiriamųjų medţiagų koreliacijos koeficiento reikšmės yra didesnės nei 0,99 ir artimos 1, kurios atitinka reikalavimus), aptikimo ribas (fluoksetino – 0,048 µg/ml, paroksetino – 0,1 µg/ml, escitalopramo – 0,1 µg/ml, buspirono – 0,088 µg/ml), nustatymo ribas (fluoksetino – 0,105 µg/ml, paroksetino – 0,29 µg/ml, escitalopramo – 0,27 µg/ml, buspirono – 0,201 µg/ml). Iš kraujo plazmos antidepresantų daugiausiai buvo išskirta, naudojant gryną metanolį kaip eliuentą.
SUMMARY
THE ANALYSIS OF ANTIDEPRESSANTS MIXTURE USING CHROMATOGRAPHIC METHODS
G. Pilvenyte Master‘s thesis/ scientific supervisor Assoc. Prof. D. Kazlauskiene; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Analytical and Toxicological Chemistry Department. Kaunas.
The object of the study – human plasma samples with the mixture of four antidepressant drugs (fluoxetine hydrochloride, paroxetine hydrochloride, escitalopram oxalate and buspirone hydrochloride). The aim of the study was to select the best conditions for chromatographic analysis methods – High-Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC) and High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) for fluoxetine, paroxetine, escitalopram and buspirone separation from their mixture, identification and quantification in human plasma. The tasks were to select the most suitable solid phase extraction conditions for extraction of the analytes from blood plasma. To select the best conditions for the separation and identification of antidepressants by Thin-Layer Chromatography and validate. To select the most suitable conditions for the separation and identification of the antidepressant mixture components by HPLC and validate. To select the most suitable conditions for quantification of extracted antidepressants from human blood plasma. Used methods: Solid-Phase extraction, High-Performance Liquid Chromatography, Thin Layer Chromatography.
Results and conclusions of the study. The mobile phase (acetonitrile : methanol : ammonium hydroxide 85: 10: 10) of HPTLC was selected and validated during the experiment. This mobile phase allows to separate and identify all four components of antidepressants mixture, extracted from blood plasma. The specifity and repeatability were determined. The error of repeatability of Rf did not
exceed the permissible limit of 5 %. The HPLC method was applied for quantitative and qualitative analysis of all four analytes. Validation of HPLC qualitative method was carried out by determination of specifity, precision (relative standard deviation did not exceed the permissible limit of 5 %), linearity (correlation coefficient values of the analytes are greater than 0,99 and close to 1, which meet the requirements), limits of detection (fluoxetine – 0,048 µg/ml, paroxetine – 0,1 µg/ml, escitalopram – 0,1 µg/ml, buspirone – 0,088 µg/ml), and limits of quantification (fluoxetine – 0,105 µg/ml, paroxetine – 0,29 µg/ml, escitalopram – 0,27 µg/ml, buspirone – 0,201 µg/ml). For extraction from blood plasma by SPE, the best recovery of analytes was carried out when the chosen eluent was pure methanol.
PADĖKA
Dėkoju darbo vadovei, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros doc. Daivai Kazlauskienei uţ nuoširdţius patarimus ir reikšmingas pastabas, atliekant baigiamąjį Magistro darbą. Dėkoju Kauno klinikų Kraujo centrui uţ bendradarbiavimą, suteikiant anoniminius kraujo plazmos mėginius tiriamajam darbui. Ačiū Mindaugui Marksai ir Ivan Bezruk uţ palaikymą ir pagalbą laboratorijoje.
ĮVADAS
Pasaulyje vienas daţniausių saviţudybės metodų yra vaistų perdozavimas. JAV Maisto ir vaistų administracija įspėja, kad visi antidepresantai yra susiję su padidėjusia saviţudiškų minčių ir veiksmų rizika pacientams iki 25m. amţiaus, o 2009 metais atlikta antidepresantų klinikinių tyrimų duomenų metaanalizė, kurios rezultatai patvirtina, jog su saviţudybe susijusio elgesio rizika yra didesnė jauniems pacientams (iki 25m. amţiaus), vartojantiems antidepresantus [7]. Antidepresantai yra panaudojami kaip saviţudybės priemonė, kuri apima apie 20 proc. visų apsinuodijimo saviţudybių Jungtinėje Karalystėje ir 20-30 proc. nemirtinų perdozavimo atvejų [3].
Deja, nemaţa dalis apsinuodijimų medikamentais yra uţregistruojami vaikų amţiaus grupėse. 2010 m. Lietuvoje ištirti 1946 apsinuodijimo atvejai. Vaikų apsinuodijimai sudaro daugiau kaip pusę visų apsinuodijimų. Iš jų daugiausia paplitę atsitiktiniai vaikų, iki 7 metų amţiaus, apsinuodijimai nesaugiai namie laikomais medikamentais (273 atv.). Šioje amţiaus grupėje vien tik psichotropiniais vaistais uţregistruoti 89 apsinuodijimo atvejai. Tarp vyresnių vaikų, 8-14 ir 15-17 metų amţiaus grupėse, paplitę tyčiniai apsinuodijimai medikamentais ir alkoholiu [13].
Moksliniuose literatūros šaltiniuose daţnai randamos analizės metodikos, tinkamos pavienių medţiagų įvertinimui biologiniuose mėginiuose, tačiau apie bendrą antidepresantų (fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono) analizę mišinyje nerasta daug duomenų. Lietuvos ir Pasaulio apsinuodijimų vaistais statistika rodo, jog yra būtinas naujų metodikų kūrimas, kurios leistų skubiai ir efektyviai atpaţinti toksinį poveikį sukėlusias medţiagas kraujo plazmoje bei įvertinti jas kiekybiškai. Šis darbas yra aktualus tuo, kad antidepresantai yra skiriami depresija sergantiems pacientams, kurie daţnai yra linkę piktnaudţiauti vaistais, todėl atsiranda didesnė apsinuodijimų rizika. Kadangi reikia greitai nustatyti apsinuodijimą sukėlusias medţiagas, tai daugialypės analizės metodai yra labai pageidautini, siekiant sumaţinti bendrą analizės laiką.
Darbo tikslas – pritaikyti efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygas escitalopramo, fluoksetino, paroksetino ir buspirono išskirstymui iš mišinių, jų identifikavimui ir kiekybiniam vertinimui kraujo plazmoje.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Tikslas: Pritaikyti efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygas escitalopramo, fluoksetino, paroksetino ir buspirono išskirstymui iš mišinių, jų identifikavimui ir kiekybiniam vertinimui kraujo plazmoje.
Uţdaviniai:
1. Pritaikyti tinkamiausias kietafazės ekstrakcijos sąlygas antidepresantų mišinio išskyrimui iš kraujo plazmos.
2. Pritaikyti efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodo sąlygas antidepresantų komponentų atskyrimui ir identifikavimui, metodiką validuoti.
3. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygas antidepresantų mišinio komponentų atskyrimui, identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui, metodiką validuoti.
4. Išskirti antidepresantų mišinį iš kraujo plazmos kietafazės ekstrakcijos metodu ir nustatyti komponentų tapatybę ir kiekį pritaikytais analizės metodais.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Fluoksetino, paroksetino, escitalopramo, buspirono suvartojimas
1.1.1. Tiriamųjų medţiagų suvartojimas Lietuvoje
Vaistų suvartojimo šalyje statistikai sudaryti yra naudojama Pasaulio sveikatos organizacijos siūloma Anatominės terapinės cheminės (ATC) klasifikacijos ir nustatytų paros dozių (DDD) sistema (ATC/DDD). 2017 metų analizės duomenimis, pagal ATC grupes, Lietuvoje nervų sistemą veikiantys vaistai uţima antrą vietą pagal suvartojimą ir sudaro 14 proc. visų suvartojamų vaistų [5]. Antidepresantai bei anksiolitikai patenka į daugiausiai vartojamų vaistinių preparatų sąrašą.
1 lentelė. Fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono vaistų suvartojimas Lietuvoje, 2013 m. - 2017 m. [8]
ATC kodas
Pavadinimas
DDD /1000 Lietuvos gyventojų/ per dieną
2013 m. 2014 m. 2015 m. 2016 m. 2017 m. N05B Anksiolitikai 41,426 41,653 41,007 40,781 37,811 N05BE01 Buspironas (DDD 30 mg) 0,055 0,049 0,047 0,048 0,055 N06A Antidepresantai 24,684 25,680 27,863 29,279 32,054 N06AB SSRI 15,916 16,611 18,618 19,679 21,758 N06AB03 Fluoksetinas (DDD 20 mg) 0,572 0,622 0,661 0,659 0,696 N06AB05 Paroksetinas (DDD 20 mg) 2,891 3,018 3,097 3,218 3,533 N06AB10 Escitalopramas (DDD 10 mg) 6,561 6,878 7,246 7,916 9,670
Pagal ATC klasifikavimą, antidepresantų (N06A) suvartojimas per penkerius metus išaugo net 9 proc. – nuo 24,684 (2013 m.) iki 32,054 (2017 m.) DDD/1000gyv./per dieną. Nors nuo 2013 iki 2017 metų Lietuvoje anksiolitikų (N05B) suvartojimas sumaţėjo 7 proc., bet jų suvartojimas visgi išlieka gana didelis: 41,426 (2013 m.) iki 37,811 (2017 m.) DDD/1000gyv./per dieną. Fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono suvartojimas Lietuvoje pagal Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos (VVKT) statistiką yra pateikiamas 1 lentelėje. Iš šių tiriamų vaistų, 2017 m. daugiausiai
suvartota escitalopramo, maţiausiai – fluoksetino. Per penkerius metus, nuo 2013 m. iki 2017 m. tiriamųjų selektyvių serotonino reabsorbcijos inhibitorių (SSRI) – fluoksetino, paroksetino ir escitalopramo – suvartojimo kiekis padidėjo. Anksiolitiko buspirono suvartojimas nuo 2013 m. maţėjo neţymiai, o 2017 m. vėl padidėjo. Taigi, remiantis šia VVKT statistika apie suvartotus vaistus, galima daryti išvadą, kad antidepresantai bei anksiolitikai visgi išlieka paklausūs, gydant Lietuvos gyventojus.
1.1.2. Tiriamųjų medţiagų suvartojimo Lietuvoje ir kitose šalyse palyginimas
Lyginant tiriamųjų medţiagų paplitimą Lietuvoje ir kitose valstybėse, išnagrinėta Lietuvos, Latvijos bei Estijos vaistų suvartojimo statistika 2013 - 2015 m.
2 lentelė. Fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono vaistų suvartojimas Lietuvoje, Latvijoje, Estijoje 2013 m. - 2015 m. [16]
ATC ATC grupė, šalis DDD/1000 gyventojų/per dieną Pokytis
2013 2014 2015 NO5BE01 BUSPIRONAS Lietuva 0,06 0,05 0,05 -4 % Latvija 0,27 0,28 0,31 12 % Estija - <0,01 - NO6AB03 FLUOKSETINAS Lietuva 0,57 0,62 0,66 6 % Latvija 0,31 0,28 0,30 8 % Estija 2,74 2,97 2,89 -3 % NO6AB05 PAROKSETINAS Lietuva 2,89 3,02 3,10 3 % Latvija 2,19 2,35 2,45 4 % Estija 2,01 2,12 2,24 6 % NO6AB10 ESCITALOPRAMAS Lietuva 6,56 6,88 7,25 5 % Latvija 2,58 2,98 3,43 15 % Estija 5,20 5,61 5,78 3 %
Trijų Baltijos šalių vaistų suvartojimo statistika rodo, kad Lietuvoje 2015 metais daugiau nei Latvijoje ir Estijoje buvo suvartota nervų sistemą veikiančių vaistų. Daugiausia buspirono suvartojama Latvijoje (2 lentelė), o per trejus metus (2013 - 2015 m.) jo suvartojimas išaugo net 12 proc. Pagal šią statistiką, fluoksetino vartojimas didţiausias yra Estijoje, 2015 m. siekė 2,89 DDD/1000 gyventojų/per dieną. Lietuvoje jo suvartojimas 2013-2015 m. išaugo 6 proc., o Latvijoje 8 proc. Nors paroksetino suvartojimas visose trijose Baltijos šalyse padidėjo, Lietuvoje jo suvartojama daugiausiai (3,10DDD/1000 gyventojų/per dieną, 2015 m.). Escitalopramo vartojimas ţenkliai padidėjo Latvijoje – 15 proc., tačiau Lietuvoje jo suvartojimas vis tiek didţiausias – net 7,25 DDD/1000 gyventojų/dieną [16].
Išanalizavus Baltijos šalių vaistų suvartojimo statistiką, galima teigti, kad populiariausias vaistas iš tiriamųjų yra escitalopramas ir jo suvartojimas 2013-2015 m. Lietuvoje kur kas didesnis nei kitose dviejose šalyse. Lietuvoje taip pat per 2013-2015 metus daugiausia iš visų šių šalių suvartojama paroksetino.
1.2. Apsinuodijimo antidepresantais statistika
Nacionalinio visuomenės sveikatos centro prie Sveikatos apsaugos ministerijos Vilniaus departamentas kasmet tiria ţmonių apsinuodijimo aplinkybes pagal gydymo įstaigų pateiktus pranešimus. Atsitiktinis apsinuodijimas daţniausiai įvyksta dėl neatsargaus elgesio su pavojingomis medţiagomis. Daugiausiai apsinuodijusių – vaistais, jie sudaro 54 proc. visų atsitiktinių apsinuodijimų [1]. Lietuvos Apsinuodijimų informacijos biuras skelbia, kad 2017 m. dėl apsinuodijimo atvejų skambučių sulaukė ir konsultacijas suteikė 2227 kartus, iš jų apie 1000 skambučių dėl apsinuodijimo medikamentais [14]. Remiantis 2016 m. Amerikos apsinuodijimo centro statistiniais duomenimis, SSRI patenka į daugiausiai mirtinų apsinuodijimų sukeliančių medţiagų kategoriją [23]. Pagal 2011 metų apsilankymų skaičių skubios pagalbos skyriuje, antidepresantai yra kur kas daţnesnis pasirinkimas nusiţudymui (19,6 proc.) negu nelegalūs narkotikai. SSRI pasirinkimas šioje statistikoje sudaro 9,8 proc. Dėl SSRI pavojų gyvybei sukėlusių nepageidaujamų reakcijų uţfiksuoti 102471 apsilankymai skubios pagalbos skyriuje, kurie sudaro 4,5 proc. visų apsilankymų 2011 m. [42].
Apsinuodijimų statistika parodo, jog apsinuodijimai vaistais įvyksta kasmet, o nuo jų nukenčia ne tik suaugusieji, bet ir vaikai. Antidepresantai vis dar pasirenkami kaip viena iš daţnesnių nusiţudymo priemonių.
1.3. Tiriamosios medţiagos
1.3.1. Fluoksetino hidrochloridas
C17H18F3NO,HCl
CAS - 59333-67-4 Mr=345.8 [32]
1 pav. Fluoksetino hidrochlorido struktūrinė formulė [32] IUPAC pavadinimas: N-metil-3-fenil-3-[4-(trifluormetil)fenoksi]propan-1-aminas.
Fizikinės savybės: Balta arba beveik balta kristalinė kieta medţiaga. Tirpsta metanolyje, etanolyje, acetonitrile, chloroforme ir acetone. Tirpsta etilacetate, dichlormetane ir vandenyje (maksimaliai 14g/l). Netirpsta toluene, cikloheksane ir heksane [32].
Patentuoti pavadinimai: Adofen; Docutrix; Erocap; Fluctin; Fluctine; Fluoxeren; Fontex; Foxetin; Lorien; Lovan; Mutan; Prozac; Prozyn; Reneuron; Sanzur; Zactin [32].
Lietuvoje registruoti: Fluoxetine Lannacher, Fluoxetine Vitabalans, Flux, Magrilan [9].
1.3.2. Paroksetino hidrochloridas
C19H20FNO3,HCl,½H2O
CAS - 110429-35-1 Mr = 369.85 [32]
2 pav. Paroksetino hidrochlorido struktūrinė formulė [32]
IUPAC pavadinimas: (3S,4R)-3-[(1,3-benzodioksol-5-iloksi)metil]-4-(4-fluorofenil)-piperidino hidrochloridas.
Fizikinės savybės: kietos būsenos kristaliniai milteliai, tirpūs vandenyje 1,131 mg/ml, esant 25 o
C. Disociacijos konstanta pKa1 = 9.6 [32].
Patentuoti pavadinimai: Aropax; Casbol; Deroxat; Frosinor; Motivan; Paxil; PaxPar; Sereupin; Seroxat; Tagonis [32].
1.3.3. Buspirono hidrochloridas
C21H31N5O2,HCl
CAS—33386-08-2 Mr = 422.0 [32]
3 pav. Buspirono hidrochlorido struktūrinė formulė [32]
IUPAC pavadinimas: 8-[4-[4-(2-Pirimidinil)-1-piperazinil]butyl]-8-azaspiro[4.5]-dekan-7,9-dionas. Fizikinės savybės: balta kristalinė pudra. Labai tirpus vandenyje, maţiau etanolyje ir acetonitrile, labai maţai tirpus etilacetate. Lengvai tirpsta metanolyje ir metileno chloride, tačiau beveik netirpus heksanuose [32].
Patentuoti pavadinimai: Ansial; Ansiced; Axoren; Buspar; Buspimen; Buspinol; Buspisal; Censpar; Lucelan; Narol; Travin [32].
Lietuvoje registruoti: Spitomin [11].
1.3.4. Escitalopramo oksalatas
C20H21FN2O,C2H2O4= 324.4
CAS—219861-08-2 Mr = 414.4 [32]
4 pav. Escitalopramo struktūrinė formulė [32]
IUPAC pavadinimas: (1S)-1-(3-dimetilaminopropil)-1-(4-fluorfenil)-3H-2-benzofuran-5-karbonitrilo oksalo r.
Fizikinės savybės: escitalopramo oksalatas yra balti arba šiek tiek gelsvi milteliai, laisvai tirpstantys metanolyje, dimetilsulfokside, tirpūs izotoniniame druskos tirpale, maţiau tirpsta vandenyje ir etanolyje, šiek tiek tirpsta etilo acetate. Netirpsta heptane.
Patentuoti pavadinimai: Aramix; Cipralex; Citalax; Ectiban; Entact; Esertia; Ipran; Lexapro; Lextor; Meridian; Neozentius; Recita; S-Citadep; Seroplex; Sipralexa [32].
Lietuvoje registruoti: Cipralex, Elicea, Escitalopram Actavis, Escitalopram Orion, Escitalopram Teva, Escitil, Estan [12].
1.4. Klinikinės indikacijos ir kontraindikacijos
Suaugusiems fluoksetinas, paroksetinas ir escitalopramas, priklausantys SSRI, yra skiriami depresijai, nerimui ir kitiems nuotaikos sutrikimams gydyti. Iš jų, tik fluoksetinas gali būti skiriamas depresijos gydymui vaikams nuo 8 metų [2, 4]. Buspirono pagrindinė indikacija yra generalizuotas nerimo sutrikimas, taip pat jis vartojamas ir didţiajai depresijai gydyti kartu su kitais antidepresantais [25, 4]. Nepaisant oficialių indikacijų, Lietuvoje bei visame pasaulyje antidepresantai skiriami ir ne vien pagal patvirtintas indikacijas. Kanadoje atliktame tyrime, kuriame dalyvavo daugiau nei šimtas tūkstančių suaugusių ţmonių, nustatyta, kad net 45 proc. paskirtų antidepresantų indikacijos buvo kitos nei depresija (t.y. antidepresantai buvo skirti nerimui – 18,5 proc., nemigai – 10,2 proc., skausmui – 6,1 proc., panikos sutrikimui – 4,1 proc.). Nepatvirtintos oficialiai indikacijos tyrime apėmė skausmo malšinimą, migrenos, nemigos, dėmesio deficito, hiperaktyvumo, virškinamojo trakto sutrikimus, menopauzės karščio šuolius [30]. Kitas tyrimas atliktas Danijoje, kurio metu buvo analizuojami receptai, išrašyti 0-17 metų pacientams. Gauti rezultatai parodė, kad neoficialiomis indikacijomis išrašyti antidepresantai siekia net 32,3 proc. [18].
Atliktų tyrimų rezultatai reiškia, kad šie vaistai yra vartojami ne vien pagal jiems patvirtintas medicinines indikacijas, todėl galimas daţnesnis apsinuodijimas šiais vaistais, todėl reikia kurti metodiką, kuri leistų greitai ir efektyviai išskirti visus keturis vaistus iš kraujo plazmos, juos identifikuoti bei ištirti juos kiekybiškai.
SSRI vartojimas su monoamino oksidazės inhibitoriais (MAOI) yra kontraindikuotinas dėl galimai mirtino serotoninerginio sindromo. SSRI galima pradėti vartoti tik praėjus 14 dienų po MAO inhibitorių vartojimo pabaigos. Bent penkios savaitės turi praeiti po fluoksetino vartojimo pabaigos, kai norima skirti MAOI. Buspirono negalima vartoti, esant sunkiam kepenų ar inkstų sutrikimui, ūminiam apsinuodijimui alkoholiu, migdomaisiais vaistiniais preparatais, analgetikais, sergant epilepsija. Taip pat vaistų vartoti negalima, esant padidėjusiam jautrumui veikliajai arba bet kuriai pagalbinei medţiagai.
1.5. Farmakodinaminės savybės
SSRI veikimo mechanizmas: selektyviai blokuoja serotonino transporterius, maţas efektas norepinefrino transporteriams [27]. Fluoksetinas ir paroksetinas maţai veikia į noradrenalino ir dopamino reabsorbciją, silpnai blokuoja muskarininius cholino receptorius (mACh) ir histamino (H1)
receptorius. Fluoksetinas naudojamas kaip raceminis mišinys, kuris inhibuoja serotonino reabsorbciją
ir 5-hidroksitriptamino 2C receptorių (5-HT2C) receptorių blokavimo [19]. Paroksetinas yra stipriai
selektyvus serotonino patekimo į neuroną inhibitorius. Escitalopramas, selektyviausias SSRI, tačiau neblokuoja H receptorių. Nepasireiškia anticholinerginis ir antihistamininis efektas, atsakingas uţ nepageidaujamus, tricikliams antidepresantams būdingus poveikius. Dopaminerginis ir į gama amino sviesto rūgšties (GASR) receptorius veikimas yra minimalus [22]. Buspironas yra nebenzodiazepinų grupės anksiolitikas ir cheminės struktūros pobūdţiu nesusijęs su psichotropiniais vaistais. Tikslus jo veikimo mechanizmas neţinomas. Buspironas neveikia benzodiazepinų – GASR receptorių, todėl neturi traukulius slopinančių savybių. Buspironas yra selektyvus dalinis serotonino 5-HT1A
presinapsinių ir postsinapsinių 5-HT1A receptorių agonistas.
1.6. Nepageidaujamas poveikis ir toksiškumas
Vartojant SSRI, gali padidėti serotonino aktyvumas. Jis ţarnyne gali sukelti nepageidaujamus poveikius kaip pykinimą, viduriavimą ir kitus virškinamojo trakto sutrikimus. Serotonino aktyvumas nugaros smegenyse siejasi su seksualine disfunkcija. Dar vienas daţnas nepageidaujamas poveikis, susijęs su serotonino aktyvumo poveikiu yra galvos skausmas, hipersomnija arba nemiga. SSRI vaistų, kurių trumpas pusinės eliminacijos laikas, greitas vartojimo nutraukimas gali pasireikšti galvos svaigimu, jutimo sutrikimais, kitais simptomais, kurie prasideda po vienos arba dviejų dienų nuo vaisto vartojimo nutraukimo dienos ir išlieka savaitę arba netgi ilgiau [19]. SSRI vartojimas retai, tačiau vis tiek gali sukelti stipriai pasireiškiantį serotoninerginį sindromą, traukulius, centrinės nervų sistemos slopinimą arba įvairius širdies sutrikimus.
Apsinuodijus SSRI, pirmiausia reikėtų pastebėti konkrečius serotonino sindromo poţymius, tokius kaip delyrą, hipertermiją, lėtus, nepertraukiamus, horizontalius akių judesius, hipertoniją, sustiprėjusius refleksus, tremorą. Šis sindromas - pavojingiausias SSRI nepageidaujamas poveikis, galintis atsirasti neatidţiai didinant SSRI dozes, pavartojus per didelę dozę arba vartojant kelis serotoninerginius vaistus vienu metu [31].
3 lentelė. Vaistų koncentracijos kraujo plazmoje (µg/ml) [39] Preparatas Vaisto koncentracija kraujo plazmoje (mg/ml)
Terapinė Toksinė Mirtina Pusperiodis, h
Fluoksetinas 0,12-0,5 1 6 2-6
Buspironas 0,001-0,004 0,008 neţinoma 2-3 Paroksetinas < 0,01-0,05 0,35-0,4 3,7 16-24 Escitalopramas 0,015-0,08 0,16 neţinoma 26,3±10,8
Citalopramas ir escitalopramas struktūriškai skiriasi nuo kitų SSRI ir gali pasireikšti didesniu toksiškumu, perdozavimo atveju. SSRI, lyginant su tricikliais antidepresantais ir monoamino oksidazės inhibitoriais, yra daug saugesni. Mirčių vien tik nuo SSRI perdozavimo atvejai yra reti [19].
Kaip matoma 3 lentelėje, tiriamųjų vaistų terapinės, toksinės bei mirtinos koncentracijos kraujyje skiriasi. Buspirono ir escitalopramo mirtinos kraujo koncentracijos neţinomos.
1.7.Vaistinių medţiagų biologinė analizė
Bioanalizė – tai analitinės chemijos dalis, apimanti vaistų bei jų metabolitų matavimus biologinėse terpėse. Ji gali būti pritaikyta vaistų farmakokinetikos, farmakodinamikos, toksikologijos, vaistų bioekvivalentiškumo, narkotikų vartojimo ir teismo ekspertizės tyrimų įvertinimui. Tiriamasis mėginys paimamas iš pasirinktos biologinės terpės. Terapiniam vaistų monitoringui paprastai naudojami kraujo serumo ir kraujo plazmos mėginiai [43]. Iš šių terpių vaistų išskyrimui naudojamos skysčių-skysčių ekstrakcija (SSE), kietafazė ekstrakcija (KFE), kietafazė mikroekstrakcija, skystos fazės mikroekstrakcija arba vien tik baltymų nusodinimas kaip mėginių paruošimo metodai [38, 28]. Analičių matavimui daţniausiai naudojami chromatografiniai metodai, tokie kaip efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), dujų chromatografija (DC) su įvairiais detektoriais (UV; fluorescencija; masių spektrometrija (MS), diodų matricos detektorius (DAD) ir kt.) [43, 32, 38, 28]. Nustatant medţiagas biologinėse terpėse, sunku yra parinkti tinkamą metodą, tačiau chromatografija turi privalumą prieš daţnai naudojamą imunoanalizę, nes vienu mėginio praleidimu pro chromatografą galima nustatyti kelias vaistines medţiagas (ypač aktualu, kai ţmogus vartoja daugiau nei vieną vaistą) bei jų aktyvius metabolitus.
Bioanalizei pirmiausia paimamas mėginys iš biologinės sistemos. Iš mėginio išskiriama analitė pasirinktu ekstrakcijos būdu, kuomet mėginys yra išvalomas nuo priemaišų ir sukoncentruojamas. Po to atliekama chromatografinė analizė bei analičių detekcija [33].
Chromatografiniai metodai, skirti tiriamosioms analitėms atpaţinti, analizuoti jas tiek kiekybiškai, tiek kokybiškai, apima ESC su detekcija ultravioletine (UV) spinduliuote, nustatymą fluorescencija, dujų chromatografiją-masių spektrometriją (DC-MS), skysčių chromatografiją-masių spektrometriją (SC-MS), plonasluoksnę chromatografiją (PC) ir spektrofluorometriją [15].
1.8. Mėginio paruošimas tyrimui
Prieš analizę iš kraujo plazmos mėginio yra pašalinami baltymai, kadangi dauguma antidepresantų yra gerai besijungiantys su baltymais, o tai gali sumaţinti analičių išgavą, jas
ekstrahuojant iš kraujo plazmos. Tai vyksta todėl, kad aktyvios analičių vietos, kurios turėtų jungtis su KFE sorbentu, yra susijungusios su baltymais, todėl su sorbentu sąveikauti nebegali. Susiduriama ir su ta problema, kad baltymai yra makromolekulės, trukdančios analitėms patekti į paties sorbento poras [44]. Mokslininkų grupė įvertino kelis baltymų nusodinimo būdus kraujo plazmoje: organiniais tirpikliais, rūgštimis, druskomis ir metalų jonais. Įvertinimas atliktas kelių rūšių kraujo plazmose, naudojant skirtingus tūrius. Acetonitrilas, trichloracto r. ir cinko sulfatas parodė optimalius rezultatus baltymų nusodinime, atitinkamai 96 proc., 92 proc. ir 91 proc. efektyvumu, kai nusodiklio ir kraujo plazmos santykis yra 2:1 [36]. Daţnai nusodinami baltymai trichloracto r. arba pasirinktu su vandeniu besimaišančiu tirpikliu, tokiu kaip metanolis arba acetonitrilas [28, 32].
Kadangi baltymai gali sumaţinti kietafazės ekstrakcijos išgavą, uţimdami analičių vietą sorbente, prieš kietafazę ekstrakciją juos būtina nusodinti pasirinktu būdu. Daroma išvada, kad išvalant biologinį mėginį nuo baltymų yra padidinamas analizės jautrumas ir specifiškumas, reikalingi mėginio komponentai yra sukoncentruojami, o trukdantys – pašalinami [44].
1.9. Kietafazė ekstrakcija
Kietafazė ekstrakcija – tai mėginio paruošimo būdas, kai naudojami kietos fazės sorbentai, kurie cheminiu būdu analites iš tiriamojo mėginio atskiria jas prisijungdami. KFE naudojamos specialios kolonėlės, kuriose įdėti sorbentai, o per juos leidţiamas tiriamasis mėginys. Anksčiau daţnai naudota SSE, tačiau dabar KFE naudojama didesniu mastu ir pagerino antidepresantų išskyrimo iš biologinių terpių išgavos rezultatus [38]. Literatūroje autoriai teigia, kad KFE, palyginus su SSE, turi keletą privalumų: didelis selektyvumas, švarūs ekstraktai, reikalingi maţi tirpiklių kiekiai, trumpesnis ekstrakcijos laikas, maţesnė kaina, ekstrahuojant nesusidaro emulsija [32, 44, 28].
Taigi, KFE pagalba pasiekiamas didesnis mėginio sukoncentravimas, analites galima saugoti sulaikytas KFE kolonėlės sorbente – patogu transportuoti, atlikti ekstrakcijos galutinį etapą patogiu laiku. Metodas suteikia galimybę atskirti tiriamąsias medţiagas, mėginį galima skirstyti į keletą junginių grupių.
1.9.1. Sorbentai
Sorbentų yra įvairių – bendri junginių grupėms, specifiniai klasėms arba atskiriems junginiams, bet svarbu, kad būtų atsiţvelgta į mėginių prigimtį, tiriamųjų medţiagų savybes ir analizės metodą po ekstrakcijos, norint efektyvių ir atsikartojančių rezultatų. Daţniausiai kietafazei ekstrakcijai naudojami sorbentai būna silikagelio ir polimeriniai sorbentai [24].
Vaistų ekstrakcijai iš biologinių mėginių gali būti naudojami lipofiliniai – hidrofiliniai sorbentai (Oasis HLB, Waters) [24]. Jie dar vadinami atvirkštinių fazių sorbentais, turinčiais polimerinių grupių, tinkami neutralių, rūgštinių bei šarminių tiriamųjų medţiagų ekstrakcijai, jų platus pH spektras. Antidepresantų ekstrakcijai iš biologinių mėginių naudojami nepoliniai (BondElut C18,
Empore HDC8, RP-select B Lichrolut), polimeriniai sorbentai (Focus, Strata X, Oasis HLB) [44].
1.9.2. Tirpikliai
Kondicionuojant sorbentą, atvirkštinių fazių ir jonų mainų sorbentai sudrėkinami 1 ml metanolio ir po to 1 ml vandens [34]. Pašalinėms medţiagoms išplauti iš sorbento taip pat reikia tinkamo tirpiklio. Atvirkštinių fazių sorbentui tinka 5-50 proc. koncentracijos organiniai tirpikliai. Daţniausiai naudojamas praskiestas metanolio tirpalas, bet tinka ir kiti organiniai tirpikliai. Jonų mainų sorbentas plaunamas maţos joninės jėgos buferiniais tirpalais (pvz., kalio fosfatu) [28].
Eliuento pasirinkimas yra svarbus, nes jis turi ištirpinti kuo daugiau analičių, bet kuo maţiau nereikalingų pašalinių medţiagų. Tirpiklis turi būti parinktas pagal tiriamąsias medţiagas ir turi atitikti jų poliškumą. Todėl reikia atsiţvelgti į analitės tirpumą eliuente ir pasirinktą KFE kolonėlę. Gali būti naudojamas grynas organinis tirpiklis, praskiestas su vandeniu, parūgštintas arba pašarmintas. Dirbant su atvirkštinių fazių sorbentu, naudojami poliniai organiniai tirpikliai: metanolis, propanolis, acetonitrilas, trifluoracto rūgštis, acetonas ar etilo acetatas bei nepoliniai – heksanas ir dichlormetanas [34].
1.10. Plonasluoksnė chromatografija
Plonasluoksnė chromatografija – adsorbcijos principu paremtas metodas. Metodas gali būti naudojamas komponentų identifikavimui, priemaišų nustatymui, kokybiniam ir kiekybiniam tiriamųjų medţiagų įvertinimui [32]. Sorbentas ir eliuentas yra parenkami tokie, kad išskiriamos iš mišinio medţiagos tarp fazių pasiskirstytų skirtingai ir turėtų skirtingą pasiskirstymo koeficientą – Rf
(angl. retardation factor), kuris yra pagrindinis parametras, kuriuo galima apibūdinti mėginių padėtį PC plokštelėje. Tiek rankinė, tiek automatinė PC turi daug privalumų: palengvina darbo procesą, analizuoja kelis mėginius identiškomis sąlygomis vienu metu, mėginio paruošimas ir analizė yra lengvai pakartojami [32]. Šiam metodui reikia maţo tiriamos medţiagos kiekio, todėl daţnai naudojamas kokybiniams bandymams. PC sudaro trys ţingsniai: mėginių uţnešimas ant plokštelės, plokštelės įmerkimas į tirpiklių sistemą ir rezultatų įvertinimas.
Nors PC yra maţiau jautrus metodas, lyginant su ESC, jis turi keletą privalumų, tokių kaip metodo naudojimo paprastumas, greitis, aptikimo pakartojamumas, keičiant parametrus ir ekonomiškumas, nes daugelis mėginių gali būti analizuojami ant vienos plokštelės su labai maţais tirpiklių kiekiais.
PC plokštelės gali būti pagamintos iš stiklo, aliuminio ar plastiko. Jos yra įvairių dydţių (10cm × 10cm, 20cm × 20cm ir kt.), padengtos skirtingais sorbentais (0,1 - 0,25 mm storio sluoksniu). Svarbiausiu ir daţniausiai naudojamu sorbentu yra laikomas silikagelis. Jis yra labai poliškas bei geba sudaryti vandenilines jungtis, o jo adsorbcijos vietos yra silanolio grupės [5, 32]. Medţiagos, geriau sąveikaudamos su mobiliąja faze kils chromatografine plokštele aukščiau nuo starto linijos, o medţiagos, kurios sąveikaus labiau su stacionaria faze – liks arčiau starto linijos. Taip išskirstomos analitės iš analizuojamo mišinio. Visa tai paremta poliškumu.
Tiriamųjų vaistų išskyrimui yra taikomos įvairios tirpiklių sistemos, kurios išskirsto iš mišinio atskirus komponentus. Taikant tirpiklių sistemą, tiriamosios medţiagos yra uţnešamos ant silikagelio plokštelės. Norint išryškinti tiriamųjų medţiagų dėmes, galima taikyti skirtingus metodus, pavyzdţiui, panaudoti cheminius ryškinimo reagentus arba UV šviesą [20].
4 lentelė. PC tirpiklių sistemos ir sorbentai, taikomi tiriamųjų antidepresantų kokybinei analizei
Tirpiklių sistema PC sorbentas FLU
Rf PAR Rf ESCI Rf BUS Rf
Metanolis [32] Silica Gel G 2,5
mm 0,11 0,08 - 0,64 Cikloheksanas : toluenas : dietilaminas (75:15:10) [32] Silica Gel G 2,5 mm 0,13 0,04 - 0,3
Etilacetatas : metanolis : konc. amonio hidroksidas (85:10:5) [32]
Silica Gel G 2,5 mm
0,47 0,4 - 0,71
Etilacetatas [32] Silica Gel G 2,5
mm
- - - 0,05
acetonitrilas : metanolis : vanduo (15:2.5:2.5) [41]
Silica Gel 60 F 254
- - 0,85 -
toluenas : acetonas : etanolis : konc. amonio hidroksidas (5:1:1:0.2) [35]
Silica Gel 60 F 254
- - 0,50 -
acetonas : benzenas : konc. amonio hidroksidas (50:45:5) [21]
Silica Gel 60 F 254
0,28 - - -
acetonitrilas : metanolis : konc. amonio hidroksidas (85:10:5) [6]
Silica Gel 60 F 254
- 0,27 - 0,83
Šaltinių analizė (4 lentelė) parodė, kad tiriamosioms analitėms daţniausiai naudojami silikagelio sorbentai, įvairios sudėties organinių tirpiklių sistemos (daţniausiai su metanoliu ir amonio hidroksidu). Literatūros šaltiniuose buvo rasta PC metodikų, kurios yra pritaikytos tiriamųjų medţiagų individualiam identifikavimui, tačiau nebuvo rasta bendros sistemos, tinkamos visų keturių:
fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono mišinio kokybinei analizei PC, todėl tinkamos judančios fazės sistemos sudėtis parenkama ir pritaikoma, atliekant eksperimentą.
1.11. Efektyvioji skysčių chromatografija
Efektyvioji skysčių chromatografija yra metodas, naudojamas analičių išskirstymui iš mišinio, jų identifikavimui bei kiekybiniam nustatymui. Labai maţais kiekiais bandomasis mėginys yra siunčiamas į judančios fazės srautą, tekantį per kolonėlę.
Daţniausiai naudojama atvirkščios fazės ESC, kuri uţtikrina dinamišką organinių junginių sulaikymą. Kolonėlių yra įvairių – su skirtingo dydţio dalelėmis bei skirtingais sorbentų paviršiais. Populiariausias sorbentas yra silikagelis [32].
5 lentelė. Fluoksetinui, paroksetinui, escitalopramui, buspironui nustatyti naudotų ESC metodikų apžvalga
Preparatas Kolonėlė Judrioji fazė Tėkmės
greitis Detektorius Fluoksetinas [40] C18,5 µm, (250mm x 4,6mm) Acetonitrilas : vanduo (75:25) (pH = 2,75) 1,1 ml/min DAD, 224 nm Fluoksetinas, paroksetinas [37] Intersil ODS-3 (250 x 4 mm, 5μm) acetonitrilas : amonio acetatas, 0,05 M, (41:59) 1,3 ml/min UV, 235 nm Buspironas [17] C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) vanduo : acetonitrilas : metanolis (45 : 35 : 20), pH = 5,5 1,0 ml/min UV, 210 nm Escitalopramas [29] Inertsil ODS-2 (250 x 4,6 mm, 5μm) KH2PO4 buferis: acetonitrilas : metanolis (670:280:50) 1,0 ml/min UV, 238 nm
Stacionarios fazės, naudojamos atvirkštinių fazių chromatografijoje paprastai susideda iš skirtingo ilgio angliavandenilių, sudarytų iš C18, C8 ir C4 ilgio grandinių (galimos ir C1, C2, C6, C22 grandinės). C8 kolonėlė naudojama, kai uţtenka maţesnio sulaikymo sorbente, lyginant su C18. C4 daţnai naudojama atskiriant dideles makromolekules kaip baltymus. C18 kolonėlėms yra teikiama pirmenybė, nes jos pasiţymi puikia medţiagų skirstymo galia ir dideliu paviršiaus plotu [32].
Judančios fazės tirpiklių santykis per chromatografinę analizę laikomas pastovus (izokratinis) [32, 40, 37, 17] arba kintantis (gradientinis), taip pagerinant junginių atskyrimą. Tirpiklių sistema (5 lentelė) daţniausiai sudaroma iš vandens ir su juo tarpusavyje besimaišančiu organinio tirpikliu, tokiu kaip acetonitrilas arba metanolis. Judriosios fazės sudėtis parenkama tokia, kad galėtų išskirstyti kuo daugiau skirtingų organinių medţiagų. Daţniausiai analičių UV ir matomų absorbcinių spektrų įrašymui naudojami diodų matricos detektoriai. ESC su diodų matricos detektoriumi yra sėkmingai taikoma metodika vaistų toksikologinėje analizėje ir teismo ekspertizės tyrimuose. Medţiagos atpaţįstamos, kai jų sulaikymo laikai sutampa su standartinių tirpalų sulaikymo laikais chromatogramoje [32].
Pateikti duomenys (5 lentelė) rodo, kad tiriamųjų medţiagų (fluoksetino, paroksetino, escitalopramo, buspirono) nustatymui ESC metodu eliuentais pasirenkamas vanduo, acetonitrilas, amonio acetatas ir įvairūs buferiai. Kolonėlės daţniausiai pasirenkamos su C18 silikagelio sorbentais, o analičių aptikimas atliekamas fotodiodų matricos detektoriumi.
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
2.1.Tyrimo objektas ir reagentai
2.1.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – kraujo plazma su joje esančiomis vaistinėmis medţiagomis (fluoksetino hidrochloridas, paroksetino hidrochloridas, escitalopramo oksalatas, buspirono hidrochloridas).
Anoniminiai kraujo plazmos mėginiai gauti iš LSMU klinikų Kraujo centro. Tam buvo gautas Bioetikos centro leidimas Nr. BEC-FF-23 (1 priedas). Kraujo plazma visą eksperimento laikotarpį laikoma šaldytuve, 2-8˚C temperatūroje.
2.1.2. Reagentai
2-propanolis 99,7 % (Sigma – Aldrich, Vokietija); Acetonitrilas 99,8%(Sigma – Aldrich, Vokietija);
Amonio hidroksidas 25% (Merck, Vokietija);
Dichlormetanas 99,5 % (Sigma – Aldrich, Vokietija); Etanolis 96.9% (Sigma – Aldrich, Vokietija) ;
Išgrynintas vanduo (Millipore vandens ruošimo sistema (Millipore, Bedford, JAV)) ;
Metanolis 99,9% (Sigma – Aldrich, Vokietija);
Skruzdţių rūgštis 98% (Merck, Vokietija)
Trichlormetanas 99,4 % (Sigma – Aldrich, Vokietija); Trifluoracto rūgštis % (Merck, Vokietija)
Vaistinės medţiagos:
Buspirono hidrochloridas (Sigma – Aldrich, Kinija), Escitalopramo oksalatas (Escitalopram Actavis, 10 mg) Fluoksetino hidrochloridas (Gedeon Richter, Vengrija), Paroksetino hidrochloridas (Sigma – Aldrich, JAV)
2.1.3. Naudota įranga
Eksperimentams naudotas vandens gryninimo sistemos (Millipore, Bedford, JAV) išgrynintas vanduo. Mėginių dţiovinimui naudojamos azoto dujos. „FRISENETTE Q-Max® syringe filtre“ (0,22 μm) membraniniai filtrai. Ultragarso vonelė „WiseClean“; vibracinė maišyklė „MS2 Minishaker, IKA; centrifuga „Centurion Scientific C2 series“; Kietos fazės ekstrakcijai naudojamas KFE aparatas (Supelco Visiprep DL), vakuuminis siurblys KNF laboport, kasetės Oasis HLB (Waters, Milfordas, JAV). Chromatografinės plokštelės, padengtos silikagelio sorbciniu sluoksniu (HPTLC Silica gel 60 F 254); „CAMAG TwinChamber“ kameros; pusiau automatinis mėginių uţnešėjas „CAMAG Linomat 5“; vizualizavimo prietaisas „CAMAG TLC Visualize“; programinė įranga „VideoScan“. Efektyviosios skysčių chromatografijos metu analizei naudotas skysčių chromatografas Shimadzu Nexera X2 LC-30AD (Shimadzu, Japan), SPD-M20A diodų matricos detektorius, naudota ACE C18 kolonėlė (250 mm × 4,6 mm, 5,0 μm; Pensilvanija, USA).
2.2. Tirpalų ruošimas
2.2.1. Etaloninių tirpalų ruošimas
Iš standartinių medţiagų ruošiami 0,1 mg/ml etaloniniai tirpalai. Fluoksetinas, paroksetinas, escitalopramas ir buspironas tirpinami metanolyje. Tirpalai filtruojami pro „FRISENETTE Q-Max® syringe filtre“ (0,22 μm) membraninį filtrą.
2.2.2.Tiriamųjų tirpalų ruošimas
Antidepresantų mišinio etaloniniam tirpalui gaminti sumaišyti: 2 ml fluoksetino, 2 ml paroksetino, 2 ml escitalopramo, 2 ml buspirono standartiniai tirpalai, 2 ml metanolio. Vaistinių medţiagų tirpale gaunama po 0,02 mg/ml.
Kraujo plazmos tiriamajam tirpalui pagaminti sumaišoma: 2 ml fluoksetino, 2 ml paroksetino, 2 ml escitalopramo, 2 ml buspirono etaloniniai tirpalai. Ruošiant plazmos mišinius su vaistinėmis medţiagomis, vaistinių medţiagų etaloniniai tirpalai sumaišomi su plazma. Tirpalai maišomi vibracine maišykle, kad medţiagos gerai išsimaišytų tirpale. Vaistinių medţiagų kraujo plazmos tiriamajame mišinyje gaunama po 0,02 mg/ml.
Kraujo baltymų nusodinimui kraujo plazmos mėginiai veikiami acetonitrilu, santykiu 2:1 (acetonitrilas : kraujo plazma). Maišoma vibracinėje maišyklėje 20 sekundţių, palaikoma 20 min ramybės būsenoje ir centrifuguojama 10 min, 3000 aps./min. greičiu. Kraujo plazma pipete atskiriama nuo kraujo ląstelių, likusių mėgintuvėlio dugne. Analizuojamasis mėginys lieka skaidrus.
Gautieji mėginiai naudojami tolimesnei vaistinių medţiagų kietafazei ekstrakcijai iš kraujo plazmos, efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos kokybinės analizės tyrimui bei efektyviosios skysčių chromatografijos kokybiniam ir kiekybiniam tyrimui.
2.3. Tyrimo metodai
2.3.1. Kietafazės ekstrakcijos metodas
Kietafazei ekstrakcijai pasirinkti "Waters" kompanijos HLB Oasis kasetės, nes jų kasečių sorbentai yra universalūs, galintys ekstrahuoti tiek rūgštinės, neutralios ar bazinės kilmės medţiagas. Vakuuminis slėgis nustatomas, kad tekėjimo greitis siektų 1 lašą per 3 s. Sorbentas suaktyvinamas, per jį leidţiant 1 ml metanolio, po to – 1 ml išgryninto vandens. Po kondicionavimo įleidţiama 1 ml tiriamojo plazmos mišinio su ištirpintomis tiriamosiomis analitėmis. Pašalinės medţiagos iš kolonėlės plaunamos 1 ml vandeniniu 5 % metanolio tirpalu. Tiriamosios medţiagos iš sorbento išplaunamos pasirinktu eliuentu ir renkamos į sausą bei švarų mėgintuvėlį. Išekstrahuotas tirpalas laikomas po sauso azoto srove, kol išdţiūsta iki sauso likučio. Sausas likutis ištirpinamas 1 ml acetonitrilo. Gautas tirpalas tuomet tiriamas ESC bei EPC (efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos) metodais.
2.3.2. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas
Ant silikageliu dengtos chromatografinės plokštelės automatiniu būdu uţpurškiami tiriamieji analičių tirpalai, šalia – tiriamasis mišinys, išekstrahuotas iš kraujo plazmos. Dėmės išsidėsto ant plokštelės brūkšnio pavidalo dėmėmis, tolygiais atstumais vienos nuo kitų. Chromatografinė plokštelė patalpinama kameroje su pasirinkta tirpiklių sistema. Tirpiklių sistemai ant plokštelės pakilus iki paţymėtos 10 cm ribos, plokštelė išimama, išdţiovinama ir analizuojama vizualiai. Ryškinimas atliekamas su UV spinduliuote. Nustatomos išekstrahuotame tirpale esančių analičių sulaikymo rodiklio (Rf) reikšmės, kurios palyginamos su darbiniuose tirpaluose esančių analičių Rf reikšmėmis.
Tirpiklių sistema pasirinkta pagal apţvelgtų literatūros šaltinių duomenis. Naudotas acetonitrilas, metanolis ir amonio hidroksidas.
2.3.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas
Analičių nustatymui naudojama ACE C18 kolonėlė (250 mm × 4,6 mm, 5,0 μm; Pensilvanija, USA). Judančiosios fazės binarinė tirpiklių sistema susideda iš tirpiklio A (0,1% trifluoracto rūgšties (TFA)) ir tirpiklio B (acetonitrilo). Gradientinis kitimas pateiktas 6 lentelėje. Tėkmės greitis pasirinktas 1 ml/min. Kolonėlės temperatūra pastoviai išlaikoma 30°C. Mėginio injekcijos tūris 10 μl.
6 lentelė. Eliuentų kiekybinės sudėties priklausomybė nuo laiko Tirpiklio A
konc. (%)
Tirpiklio B konc. (%)
Laikas (min) Tirpiklio tekėjimo greitis (ml/min) 98 2 0:00 1 98 2 1:00 1 2 98 20:00 1 2 98 23:00 1 98 2 24:00 1 98 2 30:00 1
2.3.4. Metodikos validacija
Bioanalitinių metodų validacija apima tam tikras procedūras, įrodančias, kad konkretus metodas, naudojamas kokybiniam ar kiekybiniam analičių matavimui tam tikroje biologinėje terpėje (kraujyje, plazmoje, serume, šlapime ir kt.), yra patikimas ir atkuriamas numatytam naudojimui. Metodikos validacijos parametrai aprašomi „Rezultatai ir jų aptarimas“ skyriuje.
2.3.5. Duomenų analizė
Statistiniai duomenys apdoroti, naudojant Microsoft Office Excel 2007, winCATS 1.4.9 ir
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas
Pagal anksčiau apţvelgtų mokslinių straipsnių duomenis, pasirinkta tiriamosioms analitėms tinkama ESC metodika. Mobilioji fazė sudaryta iš 0,1 % TFA ir acetonitrilo, pasirinktas gradientinis eliuavimas (6 lentelė). Mobiliosios fazės tėkmės greitis pasirinktas 1 ml/min. Kolonėlės temperatūra pastoviai išlaikoma 30 °C. Mėginio injekcijos tūris 10 μl. Detekcija atlikta prie 230 nm UV šviesos bangos ilgio.
Atlikus chromatografinę analizę, nustatyti tiriamųjų medţiagų sulaikymo laikai (5 pav.). Chromatograma parodo, kad junginių smailės yra atsiskyrusios viena nuo kitos. Kadangi tai leidţia tiksliai identifikuoti tiriamąsias medţiagas, ši metodika galės būti naudojama tiriamųjų medţiagų, išskirtų iš kraujo plazmos, tyrimui.
5 pav. Antidepresantų etalonų mišinio chromatograma su analičių sulaikymo laikais. 1– buspironas, 2 – escitalopramas, 3 – paroksetinas, 4 – fluoksetinas
3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija
Tam, kad pasirinkta ESC metodika galėtų būti taikoma analičių (fluoksetino, paroksetino, escitalopramo, buspirono) identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui iš kraujo plazmos – būtina įrodyti šios metodikos tinkamumą. Pagal analitines procedūrų validacijos gaires [26] įvertinami šie parametrai (7 lentelė).
7 lentelė. Identifikavimo ir kiekybės parametrai, kuriais šiame darbe įvertintos tiriamosios medžiagos
Analitinės procedūros tipas
Įvertinti parametrai Identifikavimui Kiekio nustatymui
PC ESC ESC
Metodikos specifiškumas + + +
Rezultatų glaudumas, kuris įvertinamas: a) pakartojamumu, b) tarpiniu preciziškumu + + + Tiesiškumas - - + Ribos: a) aptikimo ribos c) nustatymo ribos - - +
3.2.1.Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos specifiškumas
Metodikos specifiškumas leidţia tiriamąją medţiagą atskirti nuo kitų medţiagų ir nustatyti medţiagos buvimą [26]. Pateiktos kraujo plazmos (be analičių), eliuento, antidepresantų etalonų mišinio bei išekstrahuotų antidepresantų iš kraujo plazmos chromatogramos (6 pav.), kuriomis įvertinamas ESC metodikos specifiškumas.
6 pav. A. „Tuščia“ kraujo plazma; B. Eliuentas; C. Antidepresantų etalonų mišinys; D. Išekstrahuoti antidepresantai iš kraujo plazmos. 1–buspironas, 2 – escitalopramas, 3 –
8 lentelė. Antidepresantų chromatogramų sulaikymo laikų palyginimas
Matome, kad 6 paveiksle ir 8 lentelėje antidepresantų etalonų mišinio (C) ir tiriamųjų medţiagų mišinio ekstrakto iš kraujo plazmos (D) smailių sulaikymo laikai (tR) sutampa. Tiriamųjų medţiagų
tirpiklis (B) – netrukdo analičių nustatymui. „Tuščias“ kraujo plazmos mėginys (A) nesudaro matricos efekto, kuris trukdytų analičių smailių analizei. Tai reiškia, kad šis ESC metodikos specifiškumas atitinka reikalavimus antidepresantų mišinio tyrimui.
3.2.2. Rezultatų glaudumas
Rezultatų glaudumas įvertinamas, apskaičiuojant medţiagų sulaikymo laikų bei smailių plotų santykinį standartinį nuokrypį (SSN, proc.), atliekant pakartotinus matavimus. Tą pačią dieną atliekami penki, vienas po kito einantys pakartotiniai matavimai tam pačiam etalonų mišiniui, esant toms pačioms analizės sąlygoms (pav.7), o apskaičiuotas SSN turi neviršyti 5 proc. Tuomet įvertinamas tarpinis preciziškumas, tomis pačiomis sąlygomis analizuojant analites dvi dienas iš eilės, atliekant po penkis matavimus (pav. 8). Vėl apskaičiuojamas SSN. Po to pagal gautuosius rezultatus apskaičiuojami smailių sulaikymo laikų (min.) santykiniai standartiniai nuokrypiai (9 lentelė).
9 lentelė. Buspirono, escitalopram, paroksetino ir fluoksetino glaudumo įvertinimas.
Pakartojamumas Tarpinis preciziškumas
Analitė Sulaikymo laiko SSN, % Smailės ploto SSN, % Sulaikymo laiko SSN, % Smailės ploto SSN, % Fluoksetinas 0,1 0,4 0,2 0,7 Paroksetinas 0,2 1,3 0,6 1,4 Escitalopramas 0,1 0,7 0,3 1,2 Buspironas 0,2 1,1 0,1 0,4
Analičių vidutiniai sulaikymo laikai (min.) chromatogramoje
Analitė Antidepresantų etalonų mišinio
Antidepresantų mišinio ekstrakto iš kraujo plazmos
Buspironas 12,403 12,535
Escitalopramas 13,662 13,705
Paroksetinas 14,180 14,228
7 pav. Buspirono, escitalopramo, paroksetino ir fluoksetino pakartojamumo vertinimo chromatograma
8 pav. Buspirono, escitalopramo, paroksetino ir fluoksetino preciziškumo vertinimo chromatograma
Metodikos glaudumo rezultatuose matoma (9 lentelė), kad metodikos pakartojamumas atitinka reikalavimus, kadangi SSN procentinė reikšmė nesiekia 5 proc. nustatytos ribos. Tiriamųjų medţiagų sulaikymo laiko SSN skiriasi nedaug, tačiau smailės ploto standartiniai nuokrypiai – didesni.
Tarpinio preciziškumo rezultatai neviršija nustatytos 10 proc. ribos, todėl taipogi atitinka nustatytus reikalavimus. Atsiţvelgiant į analizuojamų medţiagų rezultatus, galima teigti, kad ši metodika yra tinkama analičių išskirstymui iš mišinio bei jų identifikavimui.
3.2.3. Tiesiškumas
Analizuojant medţiagų kiekius, daţnai pasitelkiama kalibracinė kreivė, kuri sudaroma, naudojant po penkis skirtingos, bet ţinomos koncentracijos tiriamųjų medţiagų tirpalus ir nurodant minimalius intervalus [26]. Kalibracinės kreivės diagrama parodo analitinį atsaką, tiesiogiai proporcingą tiriamosios medţiagos koncentracijai. Tiesiškumas įvertinamas kalibracinės kreivės metodu (9-12 pav.).
9 pav. Buspirono kalibracinė kreivė, kurios lygtis Y = 7.01e+004 X - 7.89e+003
11 pav. Paroksetino kalibracinė kreivė, kurios lygtis Y = 6.86e+003 X + 3.34e+002
12 pav. Fluoksetino kalibracinė kreivė, kurios lygtis Y = 4.99e+004 X - 9.67e+003
10 lentelė. Fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono kalibracinių kreivių rezultatai Analitės Sulaikymo
laikas tR (min)
Koreliacijos koeficientas R2
Kalibracinės kreivės lygtis
Fluoksetinas 14,576 0,999935 Y =4.99e+004 X - 9.67e+003 Paroksetinas 13,825 0,999881 Y =6.86e+003 X + 3.34e+002 Escitalopramas 13,314 0,999979 Y= 1.42e+004 X - 1.02e+003 Buspironas 12,158 0,999981 Y = 7.01e+004 X - 7.89e+003
Tiriamųjų medţiagų (fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono) kalibracinių kreivių rezultatai (pav. 9-12) įrodo, kad analizuojamose koncentracijų ribose smailės ploto
priklausomybė nuo medţiagos koncentracijos yra tiesiška. Etaloninių medţiagų koreliacijos koeficiento (R2) reikšmės(10 lentelė) yra didesnės nei 0,98 ir artimos 1 (fluoksetino R2 – 0,999935; paroksetino R2 – 0,999881; escitalopramo R2 – 0,999979; buspirono R2 – 0,999981), todėl galima teigti, kad ESC metodikos tiesiškumas atitinka reikalavimus, todėl ji gali būti naudojama tiriamųjų medţiagų kiekybiniam nustatymui.
3.2.4. Aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba yra maţiausias analitės kiekis, kuris gali būti aptinkamas mėginyje, bet ne visada jis tinka kiekybiniam nustatymui. Kiekio nustatymui mėginyje yra naudojama nustatymo riba – maţiausias medţiagos kiekis, kuris gali būti tiksliai kiekybiškai įvertinamas [26]. Jeigu pasireiškia bazinės linijos triukšmas, ribas galima apskaičiuoti, naudojant signalo bei bazinės linijos triukšmo santykį (angl. Signal-to-Noise ratio).
Fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono aptikimo riba nustatyta, kai smailės aukštis ir bazinės linijos triukšmas yra santykiu 3:1. Nustatymo riba įvertinta, kai smailės aukštis ir bazinės linijos triukšmas yra santykiu 10:1.
11 lentelė. Fluoksetino, paroksetino, escitalopramo, buspirono aptikimo ir nustatymo ribos
Rezultatai parodė (11 lentelė), kad visų tiriamųjų medţiagų aptikimo ir nustatymo ribos skiriasi. Maţiausia aptikimo ir nustatymo riba yra fluoksetino – 0,048 µg/ml ir 0,105µg/ml, atitinkamai. Aukščiausios aptikimo ribos yra paroksetino ir escitalopramo po 0,1 µg/ml, aukščiausia nustatymo riba yra paroksetino – 0,29 µg/ml.
Atsiţvelgiant į gautus rezultatus ir įvertinus pasirinktas validacijos charakteristikas, galima daryti išvadą, kad ESC metodika gali būti naudojama fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono mišinio išskirstymui, identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui. Validuota ESC metodika bus taikoma tolesniam fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono mišinio tyrimui po ekstrakcijos iš kraujo plazmos.
Tiriamoji medţiaga Fluoksetinas Paroksetinas Escitalopramas Buspironas
Aptikimo riba µg/ml 0,048 0,1 0,1 0,088
3.2.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas išekstrahuotų
iš kraujo plazmos antidepresantų analizei
ESC analičių identifikacija buvo įvertinta, palyginus tiriamųjų antidepresantų etalonų tirpalų mišinio ir ekstrahuotų iš kraujo plazmos analičių mišinio smailių sulaikymo laikus (pav. 13). Standartų mišinio ir mišinio po KFE chromatogramų junginių smailės sutampa, tai reiškia, kad KFE metodika tinkama antidepresantų išskyrimui iš kraujo plazmos, o ESC – jų išskirstymui ir identifikavimui.
13 pav. Chromatogramos: A – antidepresantų etaloninio tirpalų mišinio; B - išekstrahuotų iš plazmos antidepresantų mišinio. 1 – buspironas, 2 – escitalopramas, 3 – paroksetinas, 4 –
fluoksetinas
3.3.Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos pritaikymas
antidepresantų analizei
Tiriamųjų medţiagų išskirstymui iš mišinio bei jų identifikavimui pasirinktas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas. Pagal nagrinėtą literatūrą buvo pasirinkta mobilioji fazė, sudaryta iš acetonitrilo : metanolio : amonio hidroksido santykiu 85 : 10 : 10.Tirpalų uţpurškimo tūris 5µl. Įvertinimas vykdomas vizualiai, ryškinant 254 nm bangų ilgio UV spinduliuote.
3.4. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos validacija
EPC metodikos tinkamumui, išskirstant ir identifikuojant analites, atliekama validacija. Validacijos metu atlikti bandymai, įvertinant šiuos parametrus pagal analitines procedūrų validacijos gaires [26]:
Metodikos specifiškumą,
3.4.1.Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos specifiškumas
Specifiškumas įvertintas palyginant kiekvieno antidepresanto etaloninių tirpalų sulaikymo rodiklius Rf su standartų mišinio komponentų Rf rodikliais. Pav. 14. matoma, kad etaloninių tirpalų
buspirono, paroksetino, escitalopramo ir fluoksetino dėmių nukeliavimo vieta nuo starto linijos atitinkamai sutampa su etalonų mišinio buspirono, paroksetino, escitalopramo ir fluoksetino dėmių vietomis. Galima teigti, kad ši EPC metodika yra tinkama tiriamųjų antidepresantų išskirstymui iš mišinio bei jų identifikavimui.
14 pav. EPC plokštelė su išskirstytais junginiais ir pažymėtomis vidutinėmis Rf reikšmėmis.
A – etalonai, B – etalonų mišinys
3.4.2. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos rezultatų
glaudumas
Pakartojamumas įvertinamas, atliekant penkis matavimus tą pačią dieną, naudojant tuos pačius tiriamuosius mėginius, tirpiklius, tirpalų koncentracijas, chromatografinės kameros uţpildymą (tirpiklių sistema - acetonitrilas: metanolis: amonio hidroksidas 85: 10: 10). Tarpinis preciziškumas įvertintas, matuojant dvi dienas iš eilės.
12 lentelė. Analičių sulaikymo rodiklio Rf pakartojamumo ir tarpinio preciziškumo santykinis
standartinis nuokrypis procentais (SSN, proc.)
Analitė
Pakartojamumas Tarpinis preciziškumas Rf vidurkis Rf SSN, % Rf vidurkis Rf SSN, %
Buspironas 0,92 0,76 0,91 0,92
Paroksetinas 0,59 0,91 0,59 1,48
Escitalopramas 0,72 1,15 0,71 1,27
Fluoksetinas 0,65 1,28 0,65 1,07
Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis skyrėsi visiems tiriamiesiems junginiams. Maţiausias pakartojamumo SSN proc. buvo buspirono (0,76%), o didţiausias – fluoksetino (1,28%). Tarpinio preciziškumo rezultatai truputį skyrėsi: maţiausias SSN proc. buvo buspirono (0,92%), o didţiausias – paroksetino (1,48%) (12 lentelė).
Pagal rezultatus, tiriamųjų analičių pakartojamumo SSN neviršija nustatytos 5 % ribos, todėl galima teigti, kad rezultatų glaudumas atitinka keliamus reikalavimus ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodika yra tinkama analičių išskirstymui iš mišinio bei jų identifikavimui.
3.4.3. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos pritaikymas
išekstrahuotų iš kraujo plazmos antidepresantų analizei
Validavus EPC metodiką, tinkamą tiriamųjų antidepresantų identifikavimui ir išskirstymui iš jų etalonų mišinio, metodika buvo pritaikyta ir antidepresantų mišiniui po kietafazės ekstrakcijos iš kraujo plazmos. Pav.15 pavaizduota, kad buspirono, paroksetino, escitalopramo ir fluoksetino standartinių tirpalų dėmių Rf atitinkamai sutampa su išekstrahuoto iš kraujo plazmos antidepresantų
mišinio junginių Rf rodikliais. Pagal gautus rezultatus, galima teigti, kad ši metodika gali būti taikoma
fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono biolanalizei po jų išskyrimo iš biologinės terpės – kraujo plazmos.
15 pav. EPC plokštelė su išskirstytais junginiais. Pažymėtos etalonų Rf vidutinės reikšmės,
sutampančios su išekstrahuotų antidepresantų Rf reikšmėmis.
1 – etalonai, 2 – išekstrahuotų antidepresantų mišinys
3.5. Kietafazės ekstrakcijos pritaikymas antidepresantų mišinio išskyrimui iš
kraujo plazmos
Kietafazės ekstrakcijos metodika tiriamųjų antidepresantų išskyrimui iš kraujo plazmos buvo pritaikyta, remiantis anksčiau apţvelgtais tyrimais [28, 24, 44] bei „Waters“ kompanijos Oasis HLB kasečių gamintojo rekomendacijomis [34] (pav.16).
16 pav. Atlikti kietafazės ekstrakcijos metodikos žingsniai KFE atlikta su atvirkštinių fazių kasetėmis Oasis HLB 1 cm3
30 mg (Waters, JAV). Prieš KFE kraujo plazmos mėginyje esantys baltymai buvo nusodinti acetonitrilu (acetonitrilas : kraujo plazma, santykiu 2:1). KFE tinkamiausių sąlygų nustatymui pasirinkti skirtingi organiniai tirpikliai: grynas metanolis, etanolis, propanolis, acetonitrilas, dichlormetanas, trichlormetanas. Skirtingų eliuentų gebėjimas išekstrahuoti kuo didesnį kiekį kiekvienos analitės yra įvertinamas, pasitelkiant ESC metodiką ir kalibracines kreives, skaičiuojant KFE procentinę išeigą (13 lentelė).
17 pav. Antidepresantų kietafazės ekstrakcijos išeigos palyginimas, naudojant skirtingus eliuentus
3.5.1. Kietafazės ekstrakcijos rezultatų įvertinimas
Pagal gautus rezultatus (pav. 17), galime matyti, kad efektyviausiai buspironą eliuavo acetonitrilas (88,67 proc.), paroksetiną – metanolis (77,73 proc.), escitalopramą – trichlormetanas (81,93 proc.), fluoksetiną – metanolis (83,33 proc.).
Atsiţvelgiant į rezultatus, matomus 17 paveikslėlyje, galima teigti, kad tolygiausiai ir efektyviai medţiagas iš kietafazės ekstrakcijos kasetės sorbento eliuavo metanolis. Taigi, metanolis kaip eliuentas buvo pasirinktas tolesniems antidepresantų EPC ir ESC analizėms.
13 lentelė. Išekstrahuotų antidepresantų koncentracijos, mg/ml, kai KFE eliuentas – metanolis
Antidepresantas Buspironas Escitalopramas Paroksetinas Fluoksetinas
4. IŠVADOS
1. Fluoksetino, paroksetino, escitalopramo ir buspirono išskyrimui iš kraujo plazmos buvo pritaikytos tinkamiausios kietafazės ekstrakcijos sąlygos: eliuentas – metanolis, kuris eliuavo analites tolygiai gerai (buspironą – 81,67%, escitalopramą – 79,58%, paroksetiną – 77,73%, fluoksetiną – 83,33%).
2. Validuota efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodika (tirpiklių sistema - acetonitrilas: metanolis: amonio hidroksidas 85: 10: 10; Rf pakartojamumo paklaida neviršija
leistinos 5 proc. ribos) yra tinkama antidepresantų mišinio komponentų atskyrimui ir jų identifikavimui. Metodika pritaikyta antidepresantų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, identifikavimui.
3. Pritaikyta ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, tinkama antidepresantų mišinio komponentų atskyrimui, identifikavimui (buspirono vid. tR – 12,403, escitalopramo vid.
tR – 13,662, paroksetino vid. tR – 14,180, fluoksetino vid. tR – 15,119) ir kiekybiniam nustatymui
(kiekybinio nustatymo koncentracijų ribos: fluoksetino – 0,105 µg/ml, paroksetino – 0,29 µg/ml, escitalopramo – 0,27 µg/ml, buspirono – 0,201 µg/ml; R > 0,99).
4. Pritaikius kietafazės ekstrakcijos ir chromatografinių analizės metodų sąlygas, iš kraujo plazmos buvo išskirtas antidepresantų mišinys, identifikuoti jo komponentai (buspirono tR – 12,535,
escitalopramo tR – 13,705, paroksetino tR – 14,228, fluoksetino tR – 15,176) ir nustatytas jų
kiekis (buspirono – 0,0163 mg/ml, escitalopramo – 0,0159 mg/ml, paroksetino – 0,0155 mg/ml, fluoksetino – 0,0166 mg/ml).
