FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
EIMANTAS GAULĖ
APSINUODIJIMĄ SUKELIANČIO MIŠINIO, SUDARYTO IŠ
MIDAZOLAMO, TRAMADOLIO IR PARACETAMOLIO ANALIZĖ
PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS IR UV- SPEKTROSKOPIJOS
METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. Dr. Andrejus Ţevţikovas _________ _______ (Parašas) (Data)
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
APSINUODIJIMĄ SUKELIANČIO MIŠINIO, SUDARYTO IŠ
MIDAZOLAMO, TRAMADOLIO IR PARACETAMOLIO ANALIZĖ
PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS IR UV- SPEKTROSKOPIJOS
METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. Dr. Andrejus Ţevţikovas _________ _______
(Parašas) (Data)
TURINYS
Santrauka ... 3
Summary ... 5
Santrumpos ... 6
Įvadas ... 7
Darbo tikslas ir uţdaviniai ... 8
1. Literatūros apţvalga ... 9
1.1. Midazolamo, tramadolio, paracetamolio vartojimo paplitimas ... 9
1.1.1. Midazolamo, tramadolio, paracetamolio vartojimo paplitimas Lietuvoje ... 9
1.1.2 Midazolamo, tramadolio, paracetamolio vartojimo paplitimas Baltijos šalyse ... 9
1.1.3 Apsinuodijimų midazolamu, tramadoliu, paracetamoliu statistika ... 11
1.2. Midazolamo, tramadolio, paracetamolio klinikinės indikacijos ir toksiškumas ... 13
1.2.1. Midazolamo klinikinės indikacijos ir toksiškumas ... 13
1.2.2. Tramadolio klinikinės indikacijos ir toksiškumas ... 14
1.2.3. Paracetamolio klinikinės indikacijos ir toksiškumas ... 15
1.3. Midazolamo, tramadolio ir paracetamolio kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 16
1.3.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodas (PC) ... 16
1.3.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, naudojamos midazolamo, tramadolio ir paracetamolio identifikavimui ... 16
1.4. Midazolamo, tramadolio ir paracetamolio kokybinis vertinimas UV- spektroskopijos metodu ... 18
1.4.1. UV- spektroskopija ... 18
1.4.2. UV- spektroskopijos metodikos, taikytinos midazolamo, tramadolio ir paracetamolio identifikavimui. ... 19
2. Eksperimentinė dalis ... 21
2.2. Darbo metodika ... 21
2.2.1. Kokybinis midazolamo, tramadolio, paracetamolio vertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 21
2.2.2. Kokybinis vertinimas UV–spektroskopijos metodu ... 23
2.2.3. Pavyzdţių ruošimas ... 23
2.2.4. Ryškiklio parinkimas chromatografinių plokštelių ryškinimui ... 24
2.2.5. Duomenų apdorojimas ... 25
3. Midazolamo, tramadolio ir paracetamolio tyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu 26 4. Midazolamo, tramadolio ir paracetamolio tyrimas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 30
5. Midazolamo, tramadolio ir paracetamolio tyrimas UV–spektroskopijos metodu ... 32
Išvados ... 37
Praktinės rekomendacijos ... 38
SANTRAUKA
APSINUODIJIMĄ SUKELIANČIO MIŠINIO, SUDARYTO IŠ
MIDAZOLAMO, TRAMADOLIO IR PARACETAMOLIO ANALIZĖ
PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS IR UV- SPEKTROSKOPIJOS
METODU
Gaulės E. magistranto baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. A. Ţevţikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas, 2016.
Raktiniai ţodţiai: midazolamas, tramadolis, paracetamolis, plonasluoksnė chromatografija (PC), UV-spektroskopija, kokybinis vertinimas.
Darbo tikslas: Optimizuoti plonasluoksnės (PC), efektyviosios plonasluoksnės (EPC)
chromatografijos ir UV- spektroskopijos metodikas, tinkamas midazolamo, tramadolio ir paracetamolio kokybiniam įvertinimui.
Tyrimo objektas ir metodai: Optimizuojant metodiką analizuoti etaloniniai 1mg/ml
koncentracijos tramadolio, paracetamolio (metanoliniais) ir midazolamo (etanolinis) tirpalai ir jų mišinys. Tirpiklių sistemoms buvo naudotas etilacetatas, metanolis, koncentruotas amonio hidroksido tirpalas. Dėmių ryškinimui naudota UV šviesos lempa (254nm). Optimizuotos metodikos pritaikytos tiriant metanolinius ir etanolinius tirpalus, pagamintus iš vaistinių preparatų ,,Dormicum„„, ,,Paracetamolis Sanitas„„, ,,Tramadolis KRKA“.
Siekiant pritaikyti EPC metodiką tiriamųjų junginių analizei, buvo tirti etaloniniai 1mg/ml koncentracijos midazolamo, tramadolio ir paracetamolio metanoliniai ir etanoliniai tirpalai ir jų mišinys. Chromatografavimui naudotas Etilacetatas, metanolis ir koncentruotas amonio hidroksido tirpalas. Optimizuota ESC metodika pritaikyta tiriant metanolinius ir etanolinius darbinius tirpalus, pagamintus iš vaistinių preparatų ,,Dormicum“, ,,Paracetamolis Sanitas“, ,,Tramadolis KRKA“.
Rezultatai ir išvados: Tinkamiausios tirpiklių sistemos midazolamo, tramadolio ir
paracetamolio mišinio kokybiniam vertinimui PC ir EPC metodui yra TS–D (Etilacetatas: metanolis: koncentruotas amonio hidroksidas (85:10:5) ir TS–F Metanolis [19-20]. Šios tirpiklių sistemos yra tinkamos tiriamųjų medţiagų mišinio kokybiniam įvertinimui bei jų nustatymui vaistiniuose preparatuose.
Paracetamolio, tramadolio ir midazolamo identifikavimui vaistinėse formose buvo taikytas spektroskopinis metodas. Atliktas spektrų uţrašymas ir palygintas su literatūros
spektrofotometru, naudotos 1 cm storio kvarcinės kiuvetės. Tiriamųjų medţiagų spektrai buvo uţrašomi 200 - 310 nm šviesos bangos ilgio intervale. Gauti spektrai pavaizduoti grafinės išraiškos būdu. Panaudojus plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikas atskirti junginių pavyzdţiai kiekybiškai buvo perkelti iš sorbento ir tirpinti parūgštintame vandens ir metanolio mišinyje (50:50, v/v). Buvo uţrašomi tiriamųjų medţiagų UV spektrai ir palyginti su literatūroje nurodytais standartais.
SUMMARY
POISONING CAUSED MIXTURE, CONSISTING OF MIDAZOLAM, TRAMADOL AND PARACETAMOL ANALYSIS USING TLC AND UV- SPECTROSCOPY METHODS
Key words: midazolam, tramadol, paracetamol, thin-layer chromatography, uv-
spectroscopy, qualitative determination.
Aim: To optimize thin-layer chromatography and UV- spectroscopy methodics for
midazolam, tramadol and paracetamol and their mixture qualitative analysis.
Object and methods: In time of optimization were analyzed standart solutions made of
1mg/ml tramadol, paracetamol,midazolam and mix of it. For solvent system were used ethyl acetate, methanol, concentrated ammonium hydroxide solution. For spot show up was used UV light (245 nm). Optimized methodics was used exploring methanol and ethanol solutions, made of medicinal products,, Dormicum„„, ,,Paracetamolis Sanitas„„, ,,Tramadolis KRKA“.
Results: The most suitable system for tramadol, midazolam, paracetamol PC and EPC methodics is system made of ethyl acetate, methanol, concentrated ammonium hydroxide solution. These systems are suitable for midazolam, tramadol and paracetamol qualitative assessment and testing it in medicinal products.
For paracetamol, midazolam and tramadol identification in medicinal products was used UV spectroscopic method. The spectrums of paracetamol, midazolam and tramadol were compared with standarts found in literature. The spectrums were analyzed in 200-300 nm UV light interval.
Santrumpos
DDD – nustatyta paros vaisto dozė, kuri yra vaisto suvartojimo techninis vienetas Rf – sulaikymo rodiklis
UV – ultravioletinė šviesa ES – Europos Sąjunga
SSNRI – selektyvūs serotonino ir norepinefrino reabsorbcijos inhibitoriai SSRI – selektyvūs serotonino reabsorbcijos inhibitoriai
PC- plonasluoksnė chromatografija
VVPST- Valstybinė visuomenės sveikatos prieţiūros tarnyba prie Sveikatos apsaugos ministerijos JAV- Jungtinės Amerikos Valstijos
EPC- efektyvioji plonasluoksnė chromatografija SN-standartinis nuokrypis
ĮVADAS
Viena iš opiausių šių dienų problemų tampa neracionalus vaistų vartojimas. Vaistų vartojimas mūsų šalyje kasmet didėja. Lietuva pagal suvartojamų vaistų vidutinę paros dozę yra priskiriama prie daugiausia vaistų suvartojančių valstybių Europos Sąjungoje (ES). Remiantis Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos 2014 metais parengta vaistų suvartojimo ataskaita, 2014 metais Lietuvoje parduota 72 302 tūkst. vaistinių preparatų pakuočių, iš kurių 61 % buvo receptiniai vaistiniai preparatai. Nepaisant fakto, kad bendras parduotų pakuočių kiekis 2014 m. sumaţėjo, polifarmacijos didėjimo tendencija išlieka. Atitinkamai vaistinių preparatų suvartojimas Lietuvoje per metus išaugo nuo 826 DDD/1000 gyventojų/per dieną (2010m.) iki 1065 DDD/1000 gyventojų/per dieną (2014 m.) [36].
Pasaulyje ir Lietuvoje vis labiau didėjant neracionaliam vaistų vartojimui daugėja ir apsinuodijimo vaistais atvejų. Ypač padaţnėjo apsinuodijimų vaistų mišiniais, toksikologinių tyrimu metu randami du, trys, net keturi ar penki apsinuodijimą sukėlę komponentai [11]. Daţniausiai ţmonės apsinuodija netinkamai vartodami vaistus: jų išgeria per daug, vaistus dozuoja neteisingu daţniu arba ne pagal paskirtį. Kartu vartojant tarpusavyje nesuderinamus vaistinius preparatus arba jais piknaudţiaujant, gali pasireikšti nepageidaujamos vaistų tarpusavio sąveikos, sukeliančios organizmo apsinuodijimą. Ūmių apsinuodijimų atvejais reikalingi greiti, specifiški ir tikslūs apsinuodijimą sukėlusios ar sukėlusių medţiagų nustatymo metodai. Tiriant apsinuodijimo atvejus taikomi įvairūs instrumentinės analizės metodai, tačiau daţniausiai analizės metodai optimizuojami ir pritaikomi tik panašios ar vienos vaistų grupės mišinių analizei. Šie duomenys rodo, kad cheminei toksikologijai reikalingas naujų vaistų mišinių analizės metodikų kūrimas ir pritaikymas apsinuodijimus sukėlusių medţiagų analizėje.
Mokslinės literatūros šaltiniuose nurodoma, kad midazolamą, tramadolį ir paracetamolį vaistų tabletėse ir biologinėse terpėse galima identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti įvairiais instrumentinės analizės metodais, tačiau metodikos, kaip būtų galima išskirstyti ir identifikuoti šias medţiagas, kuomet jos yra viename mišinyje, literatūros šaltiniuose nerasta. Šiuo magistriniu darbu siekiama pritaikyti UV spektrofotometrijos ir plonas luoksnės chromatografijos metodiką midazolamo, tramadolio ir paracetamolio vaistų mišinio atskirų komponentų identifikavimui ir kiekiniam įvetinimui.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas: Optimizuoti plonasluoksnės ir chromatografijos ir UV- spektroskopijos
metodikas, tinkamas midazolamo, tramadolio ir paracetamolio kokybiniam įvertinimui.
Darbo uţdaviniai:
1. Optimizuoti plonasluoksnės ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikas tinkamas midazolamo, tramadolio ir paracetamolio mišinio komponentų atskyrimui ir kokybiniam įvertinimui.
2. Optimizuoti UV-spektroskopijos metodiką, kuri būtų tinkama midazolamo, tramadolio ir paracetamolio ir šių medţiagų mišinio kokybiniam įvertinimui.
3. Pritaikyti optimizuotas plonasluoksnės ir UV-spektroskopijos metodikas midazolamo, tramadolio ir paracetamolio, išskirtų iš vaistinių preparatų, kokybiniam įvertinimui.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Midazolamo, tramadolio, paracetamolio vartojimo paplitimas
1.1.1. Midazolamo, tramadolio, paracetamolio vartojimo paplitimas Lietuvoje
Remiantis vaistų suvartojimo ataskaita, 2014 metais nervų sistemą veikiančių vaistų suvartojimas Lietuvoje siekė 149,584 DDD/1000gyv./per dieną. Lyginant 2010 metus su 2014, nervų sistemą veikiančių vaistų suvartojimas išaugo 26 proc., iš jų bendzodiazepino darinių suvartojimas padidėjo 30 proc. Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos 2014 metais parengtoje vaistų suvartojimo ataskaitoje nurodoma, kad 2010-2014 midazolamo suvartojimas stabiliai didėjo. 2010 metais šio vaisto suvartota 0,162 DDD/1000 gyv./per dieną, o 2014 metais - 0,251 DDD/1000 gyv./per dieną. Šio vaisto suvartojimas 2010-2014 metais išaugo 1,5 karto. [36]
Remiantis anksčiau minėtos ataskaitos duomenimis, opioidinių analgetikų suvartojimas 4 metų ataskaitiniu laikotarpiu sumaţėjo 31 proc., atitinkamai ir tramadolio suvartojimas 2014 metais lyginant su 2010 metais sumaţėjo 45 proc., tačiau išaugo 10 proc., lyginant su 2011 -2013 metais vidutiniškai suvartotu kiekiu.
Paracetamolis, pagal ATC klasifikaciją priskiriamas N02B (kiti analgetikai ir antipiretikai) vaistų pogrupiui buvo daţniausiai Lietuvoje vartojamas šio pogrupio vaistas 2010 – 2014 metais. Gryno paracetamolio suvartojimas Lietuvoje 2010 metais siekė 2,737 DDD/1000 gyv./per dieną, o 2014 metais - 2,546 DDD/1000 gyv./per dieną. Nors ir 2014 metais pastebima paracetamolio suvartojimo recesija lyginant su 2010 metais, tačiau 2011-2013 metais jo vidutiniškai suvartota daugiau - 3, 161 DDD/1000 gyv./per dieną. Paracetamolio, deriniuose su kitomis veikliosiomis medţiagomis, suvartojimas 2014 metais lyginant su 2010 metais sumaţėjo 11 proc. [36]
1.1.2 Midazolamo, tramadolio, paracetamolio vartojimo paplitimas Baltijos
šalyse
Bendradarbiaujant trijų Baltijos šalių vaistų agentūrų specialistams buvo atlikta išsami vaistų suvartojimo Estijoje, Latvijoje ir Lietuvoje 2010-2012 metais analizė [35].
Vertinant duomenis iš Baltijos šalių vaistų suvartojimo ataskaitos galima daryti išvadą, kad midazolamas yra vis daţniau gydytojų paskiriamas ir pacientų vartojamas benzodiazepinų grupės preparatas. Didţiausia nustatyta midazolamo paros dozė tenkantis 1000 gyventojų per dieną
fiksuojamas Estijoje (1 lentelė). Ryškiausias vaisto suvartojimo augimas fiksuojamas taip pat Estijoje. Latvijoje ir Lietuvoje midazolamo suvartojimo didėjimas ne toks staigus [35].
1 lentelė: Midazolamo suvartojimas Baltijos šalyse išreikštas DDD/1000 gyv./dieną Midazolamas
Šalis 2010 metai 2011 metai 2012 metai
Estija 0,27 0,30 0,37
Latvija 0,15 0,17 0,19
Lietuva 0,16 0,19 0,21
Tramadolio suvartojimo tendencijos Baltijos šalyse 2010- 2012 metais skiriasi (2 lentelė). Daugiausia tramadolio kaip ir midazolamo suvartoja Estija - vidutiniškai 1,75 DDD/1000 gyv./per dieną. Vertinant 2010 – 2012 m. tramadolio suvartojimą Estijoje ir Latvijoje matomas nuoseklus vaisto suvartojimo augimas (Estijoje tramadolio suvartojimas išaugo - 11,6 proc., Latvijoje- 15,9 proc.). Tuo tarpu Lietuvoje, 2012 metais tramadolio suvartojimas lyginant su 2010 metais sumaţėjo 58 proc. [35].
2 lentelė: Tramadolio suvartojimas Baltijos šalyse išreikštas DDD/1000 gyv./dieną Tramadolis
Šalis 2010 metai 2011 metai 2012 metai
Estija 1,63 1,68 1,82
Latvija 1,32 1,41 1,53
Lietuva 2,04 0,78 0,85
Paracetamolio suvartojimo įpročiai, lyginant tris Baltijos šalis, skiriasi neţymiai (3 lentelė). Didţiausias ir palaipsniui didėjantis paracetamolio suvartojimas (kaip ir midazolamo bei tramadolio suvartojimo atveju) fiksuotas Estijoje. Šioje šalyje gryno paracetamolio suvartojimas 2010-2012 metais padidėjo 18,9 proc. Lietuvoje ir Latvijoje paracetamolio suvartojama maţiau. Lyginant 2012 metų duomenis, Lietuvoje gryno paracetamolio suvartojama 1,9 karto maţiau nei Estijoje, Latvijoje - 3,3 karto [35].
3 lentelė: Paracetamolio suvartojimas Baltijos šalyse išreikštas DDD/1000 gyv./dieną Paracetamolis
Šalis 2010 metai 2011 metai 2012 metai
Estija 4,77 5,16 5,67
Latvija 1,64 1,81 1,72
Lietuva 2,74 3,14 3,03
1.1.3 Apsinuodijimų midazolamu, tramadoliu, paracetamoliu statistika
Per 2010 metus, Valstybinei visuomenės sveikatos prieţiūros tarnybai pavaldūs visuomenės sveikatos centrai ištyrė 1946 apsinuodijimo atvejus. VVSPT duomenimis, daugiau nei pusė (58,1 proc.) visų apsinuodijimų 2010 metais buvo apgalvoti, vartojant medikamentus ir alkoholį. Apsinuodijimai vaistiniais preparatais yra viena iš daţniausiai pasitaikančių apsinuodijimų prieţasčių Lietuvoje ir pasaulyje.
Daţniausiai apsinuodijama šiomis medikamentų grupėmis: psichotropiniais vaistais, nenarkotiniais analgetikais, nesteroidiniais vaistais nuo uţdegimo bei opioidiniais analgetikais [34]. Apsinuodijimo medikamentais atvejų pasiskirstymas pateiktas 1 pav.
Psichotropiniams vaistams priskiriami benzodiazepinai yra vieni iš daţniausiai apsinuodijimus sukeliančių medikamentų. 2010 – 2014 m. tyrimų duomenimis, iš psichoaktyviųjų medţiagų, nustatytų perdozavusiųjų mėginiuose, benzodiazepinai sudarė 30,8 proc. [32]. Lietuvos Higienos instituto duomenimis, 2014 m. nuo narkotinių ir psichotropinių medţiagų vartojimo mirė 81 asmuo, 72 vyrai ir 9 moterys. Visas šias mirtis sukėlė atsitiktinis apsinuodijimas narkotikais ir psichodisleptikais. Palyginus su 2013 m., šis skaičius sumaţėjo 32 atvejais [14].
2011 m. Europoje mirtingumas nuo narkotinių ir psichotropinių medţiagų perdozavimo vidutiniškai buvo 1,8 atvejo 100 tūkst. 15–64 metų gyventojų. Didţiausias mirtingumas nustatytas Norvegijoje (7,31 atvejo 100 tūkst. gyventojų), Estijoje (13,57 atvejo 100 tūkst. gyventojų) ir Suomijoje (5,33 atvejo 100 tūkst. gyventojų). Gana ţemas mirtingumo lygis yra Vengrijoje (0,2 atvejo 100 tūkst. gyventojų) ir Čekijoje (0,38 atvejo 100 tūkst. gyventojų), o Lietuvoje – 2,09 atvejo 100 tūkst. Gyventojų. JAV paskutiniaisiais metais pranešama apie ypač aukštą mirtingumo nuo psichoaktyviųjų medţiagų lygį – 12,4–15,5 atvejo 100 tūkst. gyventojų [22]. Nacionalio statistikos biuro, paruoštos ataskaitos “Mirtys, susijusios su apsinuodijimų narkotinėmis medţiagomis Anglijoje ir Velse, 2013” duomenimis, mirties atvejų, kuriuos sukėlė apsinuodijimas tramadoliu skaičius nepaliaujamai didėja. 2013 metais fiksuota 220 mirties atvejų, kuriuos sukėlė apsinuodijimas tramadoliu, tai 2,5 karto daugiau nei fiksuota 2009 metais (87 mirtys) [25].
Lietuvoje, 2011 m. dėl apsinuodijimo paracetamoliu 35 pac. buvo reikalingas stacionarinis gydymas, vienas iš jų mirė, tačiau diagnozuojami ne visi apsinuodijimai ir perdozavimo paracetamoliu atvejai, dėl to, kad nėra galimybių nustatyti paracetamolio koncentracijos plazmoje. Oficiali statistika rodo, kad mirtinai pavojingo apsinuodijimo paracetamoliu atvejų Didţiojoje Britanijoje pasitaiko vidutiniškai du kartus daţniau nei kitose Europos šalyse. Lyginant su Italija, tokių atvejų Jungtinėje Karalystėje būna net 66 kartus daugiau. Olandijoje tokių atvejų pasitaiko aštuonis kartus maţiau, Prancūzijoje – du kartus maţiau. Mokslininkai nustatė, kad Europos mastu vidutiniškai 20 proc. visų kepenų persodinimo atvejų yra susiję su paracetamolio perdozavimu. Airijoje šis rodiklis siekia 52 proc., o Jungtinėje Karalystėje - 28 proc. Švedijoje paracetamolis yra įtrauktas į receptinių vaistų sąrašą dėl augančio skaičiaus apsinuodijimų šiuo preparatu. Paracetamolio preparatai yra populiariausi vaistai ir Jungtinėse Amerikos Valstijose. JAV po apsinuodijimų antidepresantais, analgetikai uţima pirmą arba antrą vietą. Tarp analgetikų vyrauja acetaminofenas (paracetamolis - 46 proc.), o aspirinui tenka apie 24 proc. Šioje šalyje kasmet uţregistruojama apie 100 tūkst. apsinuodijimo paracetamoliu atvejų, 56 tūkst. pacientų į ligoninę patenka jau sunkios būklės, 500 apsinuodijimų baigiasi mirtimi [26].
1.2. Midazolamo, tramadolio, paracetamolio klinikinės indikacijos ir
toksiškumas
1.2.1. Midazolamo klinikinės indikacijos ir toksiškumas
2 pav. Midazolamo struktūrinė formulė [8]
Iupac pavadinimas:
8-chloro-6-(2-fluorophenyl)-1-methyl-4H-imidazo[1,5-a][1,4]benzodiazepinas [8].
Klinikinės indikacijos: Midazolamas priklauso benzodiazepinais vadinamų medţiagų
grupei. Skiriamas kaip trumpo veikimo raminantis (dar vadinamas sedatyviniu preparatu) ir miegą sukeliantis vaistas [9].
Preparatai registruoti Lietuvos Respublikos vaistinių preparatų registre: „Dormicum“,
„FULSED“, „Midazolam B.Braun“, „Mizormic“ [15]
Midazolamo toksiškumas:
Midazolamo pusinės eliminacijos pusperiodis yra 1- 4 val., tačiau senyviems pacientams, taip pat maţiems vaikams ir paaugliams, pusinės eliminacijos laikas yra ilgesnis. Midazolamas yra prastai absorbuojamas per os, ir tik 50 proc. medţiagos patenka į kraują. Dėka citochromo P450(CYP), midazolamas yra metabolizuojamas iki aktyvaus metabolito 1-hidroksimidazolamą, tačiau, aktyvus metabolito kiekis yra labia nedidelis- tik 10 proc. [23].
Apsinuodijus midazolamu gali atsirasti imuninės sistemos sutrikimai (padidėjusio jautrumo reakcijos: odos išbėrimas, bronchų spazmas, širdies ir kraujotakos sutrikimai), psichikos sutrikimai (sumišimas, euforija, haliucinacijos), nervų sistemos sutrikimai (mieguistumas bei ilgesnis raminamasis poveikis, budrumo sumaţėjimas, nuovargis, galvos skausmas, svaigulys, judesių koordinacijos sutrikimas), širdies sutrikimai, kraujotakos sutrikimai ir kiti organizmo funkcijų sutrikimai. [23, 31, 38].
1.2.2. Tramadolio klinikinės indikacijos ir toksiškumas
3 pav. Tramadolio hidrochlorido struktūrinė formulė [33]
Iupac pavadinimas:2-[ Dimethylamino) methyl]-1-(3-methoxyphenyl) cikloheksanolis
[33].
Klinikinės indikacijos: Tai silpnas opioidinių miu-receptorių agonistas, kuris taip pat
inhibuoja serotonino ir norepinefrino reabsosrbciją. Jis sukelia greitą skausmo malšinimą, nors jo poveikis gali būti ir silpnesnis nei stiprių opioidinių analgetikų (pvz. morfino, oksikodono). Tramadolis yra sintetinis vaistas, kuris stimuliuoja opioidų receptorius centrinėje nervų sistemoje, todėl malšina skausmą. Skiriamas esant pooperaciniam dantų, vėţio, raumenų skausmui. Vartojamas kartu su NVNU, sergant osteoartritu [1].
Preparatai registruoti Lietuvos Respublikos vaistinių preparatų registre: „MABRON
RETARD“, „Tramadol Krka“, „Tramadol Lannacher“, „Tramadol Vitabalans“, „Tramadolis SANITAS“, „Tramadolor ID“. Rinkoje parduodami ir tramadolio hidrochlorido preparatai, kurių sudėtyje yra ir paracetamolio: „Clocinol“, „Doreta“[15].
Tramadolio toksiškumas:
75 proc. tramadolio absorbuojama iš virškinamojo trakto. Analgetinė koncentracija susidaro plazmoje per 45 min ir išlieka iki 9 val. Prailginto poveikio tablečių terapinė koncentracija plazmoje susidro po 2 val., maksimali po 4 val., veikimo trukmė 12 val. Tramadolis dėka citochromo P450 2D6 yra metabolizuojamas kepenyse iki aktyvaus metabolito o- desmetiltramadolio. Susidaro ir kiti demetilinimo ir gliukuronidinimo produktai, tačiau jie neaktyvūs (o-desmetiltramadolio gliukuronidas, n- desmetiltramadolis, n,o- didesmetiltramadolis ir kt.). 30 proc. nepakitusios tramadolio formos yra pašalinama per kepenis, o jo metabolitai (60
proc.) per inkstus. Taip pat tramadolis maţina priepuolių slenkstį ir gali sąveikauti su kitais vaistais (pvz. SSRI ir SSNRI), tokiu būdu sukeldamas serotonininį sindromą, kas gali būti mirties prieţastimi. Gydymas tramadoliu paprastai pradedamas nuo 50 mg 1 ar 2 kartus per parą. Dozė palaipsniui didinama iki reikiamo efekto, bet ne daugiau kaip 400 mg/parą [37].
Tramadolio nepageidaujamas poveikis panašus į kitų opioidų nepageidaujamą poveikį. Apsinuodijus tramadoliu gali atsirasti širdies ir kraujagyslių sistemos sutrikimai (širdies tvinkčiojimas, tachikardija, padėties hipotenzija arba kolapsas), nervų sistemos sutrikimai (svaigulys, galvos skausmas, apsvaigimas), virškinimo trakto sutrikimai (pykinimas, vėmimas, vidurių uţkietėjimas, burnos dţiūvimas) [37].
1.2.3. Paracetamolio klinikinės indikacijos ir toksiškumas
4 pav. Paracetamolio struktūrinė formulė [16]
Iupac pavadinimas: N-(4-hydroxyphenyl) ethanamide
N-(4-hydroxyphenyl) acetamidas [16]
Klinikinės indikacijos: Paracetamolis yra nenarkotinis analgetikas, vienas ar mišiniuose,
plačiai naudojamas silpno ir vidutinio stiprumo skausmo malšinimui ir karščiavimo maţinimui [6].
Preparatai registruoti Lietuvos Respublikos vaistinių preparatų registre: „APAP“,
„Askofenas L“, „Coldrex“, „Citramonas L“, „Daleron Cold3“, „Efferalgan“, „Fervex“, „Gripex“, „Panadol“, „Paracetamolis Santitas“, „Saridon“, „Solpadeine“, „Theraflu“, „Ultracod“ ir kt. [15].
Paracetamolio toksiškumas:
Paracetamolis gerai, bet ne visiškai rezorbuojamas iš virškinimo trakto, gali pradėti veikti per 30 min. ir veikia 4–6 val. Maksimali koncentracija plazmoje susidaro maţdaug po 1 val. (prailginto veikimo formų – po 1–2 val.), paracetamolio perdozavus, gali susidaryti ir vėliau. Pasiskirstymo tūris – 0,8–1,0 l/kg, vaistas prasiskverbia pro placentą ir patenka į motinos pieną. 2– 5 proc. nepakitusio paracetamolio ir iki 85 proc. metabolitų pasišalina pro inkstus, gydomųjų dozių šalinimo pusperiodis – 1–3 val., toksinių – 12 val. ir ilgesnis. Paracetamolis metabolizuojamas
kepenyse, apie 90 proc. vaisto skyla į netoksiškus ir neaktyvius metabolitus; paracetamolio gliukuronidą ir sulfonatą, maţdaug 5 proc. – į labai nuodingą hepatotoksišką metabolitą N-acetil-p-benzochinoniminą, kurį organizme neutralizuoja glutationas. Kuo didesnis išgerto paracetamoli o kiekis, tuo didesnė jo dalis virsta N-acetil-p-benzochinoniminu. Išsekus glutationo atsargoms, šis metabolitas tiesiogiai paţeidţia kepenų ląsteles. Taip gali atsitikti ir vartojant gydomąsias dozes, jeigu pacientas yra išsekęs, piktnaudţiauja alkoholiniais gėrimais arba paracetamolį vartoja ilgesnį laiką [27].
Apsinuodijus paracetamoliu gali atsirasti virškinimo trakto sutrikimai (nemalonūs jutimai pilve arba pilvo skausmai, pykinimas, vėmimas, viduriavimas, meteorizmas, vidurių uţkietėjimas), instų ir šlapimo takų sutrikimai, bendrieji sutrikimai (odos paraudimas, galvos skausmas, prakaitavimas, kūno temperatūros sumaţėjimas), kraujo ir limfinės sistemos sutrikimai (trombocitopenija, agranulocitozė, aplazinė anemija), imuninės sistemos sutrikimai (odos b ėrimas, dilgėlinė) ir kiti organizmo funkcijų sutrikimai [3].
1.3. Midazolamo, tramadolio ir paracetamolio kokybinis vertinimas
plonasluoksnės chromatografijos metodu
1.3.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodas (PC)
Plonasluoksnė chromatografija naudojama organinių ir bioorganinių junginių atskyrimui, identifikavimui, valymui juos išekstrahavus iš vaistinių preparatų, biologinių skysčių, įvairių kitų medţiagų. Metodas plačiai taikomas vaistinėms medţiagoms nustatyti tiek pagamintuose vaistuose, tiek gryno pavidalo konkrečios vaisto dalies. PC yra paprastas, patikimas, selektyvus, tikslus, lengvai atliekamas, pigus bei plačiai pritaikomas metodas.
Plonasluoksnės chromatografijos privalumai, lyginant su dujų ir skysčių chromatografija: tyrimams atlikti nereikalinga brangi įranga,
galima naudoti labai įvairias tirpiklių sistemas bei sorbentus,
tiriama medţiaga lieka ant chromatografinės plokštelė IR nesuskyla dėl temperatūros poveikio, nes kaitinimas chromatografavimo metu nėra atliekamas [12].
1.3.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, naudojamos midazolamo,
tramadolio ir paracetamolio identifikavimui
Mokslinėje literatūroje pateikiama įvairių plonaksluoksnės chromatografijos metodikų, kurios naudojamos midazolamui, tramadoliui ir paracetamoliui identifikuoti tiek pagamintuose vaistuose tiek ir biologiniuose pavyzdţiuose. 4 lentelėje pateikiama informacija apie literatūroje aprašytas daţniausiai naudojamas plonasluoksnės chromatografijos tirpiklių sistemas minėtų junginių analizėje.
4 lentelė. Tirpiklų sistemos, naudojamos midazolamo, tramadolio ir paracetamolio identifikavimui Tirpiklių sistema Paracetamolio
Rf reikšmė
Tramadolio Rf reikšmė
Midazolamo Rf reikšmė Etilacetatas: metanolis: koncentruotas
amoniakas (arba konc. amonio hidroksido tirpalas) (85:10:5) [17]
0,45
0,78 0,6
Metanolis [19-20] 0,77 0,30 0,69
Trichlormetanas : metanolis: bevandenė
acto rūgštis (9:2:0,1, v/v/v) [13] - 0,34 -
Trichlormetanas:toluenas:etanolis (9:8:1,
v/v/v) [13] - 0,13 -
Toluenas:etilacetatas:metanolis:skruzdţių
rūgštis ( 5.0: 4.0:1.0:0.01) [4] 0,15 Metanolis: koncentruotas amoniakas (arba
konc. amonio hidroksido tirpalas) (100:1,5) [19-20]
0,95 - 0,72
Cikloheksanas: toluenas: dietilaminas
(75:15:10) [19-20] 0,00 - 0,06
Trichlormetanas: acetonas (80:20) [19-20] 0,15 - 0,13
Etilacetatas [19-20] 0,32 - -
Trichlormetanas: acetonas: koncentruotas amoniakas (arba konc. amonio hidroksido
tirpalas) (80:20:1) [19-20]
0,14 - -
Trichlormetanas: metanolis: bevandenė
acto rūgštis (95:5:2,5) [19-20] 0,24 - -
Etilacetatas [19-20] - - 0,05
Acetonas [19-20] - - 0,19
Metanolis: n–butanolis (60:40) [19-20] - - 0,7
Mokslinėje literatūroje pateikiamų plonasluoksnės chromatografijos analizės metodik os yra taikomos analizuoti individualius arba turinčius panašią cheminę struktūrą bei chemines savybes junginius – daţniausiai tam tikras vaistinių medţiagų grupes (pvz: antidepresantus, antihistamininius vaistus ir kt.). Atlikus literatūros apţvalgą nerasta duomenų apie tyrim us, kurie būtų skirti analizuoti midazolamo, tramadolio ir paracetamolio vaistų mišinį. Iš 4 lentelėje pateiktų duomenų matyti, kad medţiagų sulaikymo rodikliai daugelyje sistemų yra artimi, tačiau yra kelios bendros sistemos visiems trims junginiams ir jų Rf reikšmės nėra gretimos Šios tirpiklių sistemos gali būti pritaikytos tolimesnėje midazolamo, tramadolio ir paracetamolio vaistų mišinio analizėje. Apţvelgus mokslinės literatūros analizę nerasta duomenų, kad šiem vaistiniams preparatams buvo taikoma efektyvioji plonasluoksnė chromatografija.
1.4. Midazolamo, tramadolio ir paracetamolio kokybinis vertinimas UV-
spektroskopijos metodu
1.4.1. UV- spektroskopija
Molekulinė absorbcinė spektrinė analizė, kai tiriamas ultravioletinis ir regimasis spektras, yra vadinama spektroskopija. Šis analizės metodas pagrįstas elektromagnetinės spinduliuotės srauto absorbcija ir taikomas įvairios sudėties medţiagų tapatybei bei cheminei analizei atlikti. Analizuojamos medţiagos daţniausiai būna tirpaluose, kurie gali būti spalvoti ir nespalvoti, todėl spektroskopijos metodas tinka vaistinėms medţiagoms identifikuoti esant jiems vaistiniuose preparatuose. Analizė atliekama ultravioletiniame ir regimajame spektre uţrašant tiriamų medţiagų spektrus bei išmatavus jų absorbciją. Spektroskopinė analizė yra pakankamai tiksli. Šis metodas yra paprastas, nereikalaujantis sudėtingos aparatūros, jautrus, o tiriamas medţiagas galima identifikuoti uţrašius jų šviesos sugerties spektrus [10, 18].
1.4.2. UV- spektroskopijos metodikos, taikytinos midazolamo, tramadolio ir
paracetamolio identifikavimui.
Išnagrinėjus mokslinę literatūrą, rasta įvairių UV- spektrinės analizės metodikų, taikomų midazolamui, tramadoliui ir paracetamoliui identifikuoti tabletėse (5 lentelė). Literatūroje pateikiama UV- spektrinės analizės metodikų tramadolio ir paracetamolio mišiniui įvertinti.
5 lentelė. UV- spektroskopijos metodikos, taikomos midazolamo, tramadolio ir paracetamolio kokybinei analizei
Tiriamoji medţiaga Tirpiklis Šviesos bangos ilgis (nm) Literatūro s šaltiniai Midazolamas Etanolis Tramadolis 0, 1 N NaOH 218 [ 30] Metanolis:vanduo (60:40, v/v) 271 [29] Paracetamolis metanolis 248.8 [28] Metanolis: vanduo (50:50, v/v) 243 [2] 0,1 N HCl:metanolis (1:1) 257 [21] Tramadolis + paracetamolis Etanolis:vanduo (1:9) Tramadolio- 271 Paracetamolio- 249 [5] Tramadolis + paracetamolis Vanduo Tramadolis- 270,5 Paracetamolis- 243,5 [7]
Spektroskopijos metodo taikymą mišinio analizei riboja tiriamajame ekstrakte esančios kelios veikliosios medţiagos bei pagalbinės medţiagos, kurios absorbuoja UV spindulius panašiame šviesos bangų intervale. Tiesiogiai UV- spektroskopiškai ištirti grynųjų medţiagų mišinio tirpalo kokybinės sudėties negalima, nes medţiagų UV-spektrai įvairiuose tirpikliuose
dengia vienas kitą. Dėl šios prieţasties daţniausiai taikomi tikslesni ir atrankesni metodai, tokie kaip PC ar ESC, o spektroskopiniai metodai gali būti taikomi tik pirminiams ekstraktų tyrimams, nesant mišiniuose, kuriems nereikalingas didelis tikslumas. Tolimesniems mūsų tyrimams, medţiagų tapatybei (identifikavimui) patvirtinti pasirinktas UV-spektroskopijos analizės metodas, o vaistų mišinio (midazolamo, tramadolio ir paracetamolio) komponentų atskyrimui bei identifikavimui pritaikėme plonasluoksnės ir efektyviosios chromatografijos metodus.
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS
2.1. Tyrimo objektas
Kokybiniams vaistinių preparatų - paracetamolio, midazolamo, tramadolio ir jų mišinio, tyrimams atlikti, buvo naudojami skirtingų vaistų gamintojų preparatai ir vaistinės formos:
Midazolamas ,,Dormicum“ injekcinis tirpalas (Roche Lietuva 5mg/ml) , „Paracetamolis
SANITAS“ (PharmaSwiss Česka republika s.r.o., Čekija) tabletės (500 mg), ,,Tramadol„„ kapsulės (KRKA, d.d., Novo mesto, Slovėnija50mg).
2.2. Darbo metodika
2.2.1. Kokybinis midazolamo, tramadolio, paracetamolio vertinimas
plonasluoksnės chromatografijos metodu
Palyginamieji (standartiniai) tirpalai
Analizei naudoti standartiniai metanoliniai ir etanoliniai paracetamolio (≥97%, Sigma– Aldrich, JAV), tramadolio (≥99%, Sigma–Aldrich, JAV) ir midazolamo (≥98%, Sigma–Aldrich, JAV) tirpalai.
Įranga ir priemonės:
Analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija) Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV)
Mikrošvirkštas (100 µl; Camag Linomat Syringe, Muttenz, Šveicarija)
20 cm aukščio ir 20 cm pločio stiklinės plokštelės (silikagelis 60F254 ; Merck, Vokietija) 10 cm aukščio ir 10 cm pločio stiklinės plokštelės (silikagelis 60F254 ; Merck, Vokietija) Stiklinė, dvivietė, plonasluoksnės chromatografijos kamera su metaliniu dangčiu (Camag, Muttenz, Šveicarija)
Pusiau automatinis mėginių uţnešėjas Camag Linomat 5 (Camag, Muttenz, Šveicarija) Plonasluoksnės chromatografijos visualizatorius (Camag, Muttenz, Šveicarija)
Q-Max membraninis filtras (PTFE 25 mm diametro, 0,45 µm dydţio poros, Frisenette, Knebel, Vokietija)
Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedford, MA)
Spektrofotometras - Halo DH – 20 UV – Vis Dinamika GmbH (Šveicarija) Ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Mavajai, JAV)
UV lempa 254 nm, (Camag, Šveicarija) Grūstuvė ir piestelė
Tirpikliai
Vaistinių preparatų analizei buvo naudojami analitinio švarumo tirpikliai:
Etilacetatas gradient grade (>99,9%, Sigma-Aldrich, Toluca, Meksika)
Metanolis (>99,9%, Sigma-Aldrich, Seelze, Vokietija)
Amoniakas (25%, Merck KGaA, Vokietija)
Etanolis (96%, Vilniaus degtinė)
Išgrynintas vanduo
Ekstrakcijos metodika
Palyginamieji (standartiniai) tirpalai gaminami naudojant standartų medţiagas įsigytas iš Sigma –Aldrich. Gaminti 1 mg/ml standartiniai tirpalai: paracetamolis ekstrahuotas metanolio ir išgryninto vandens mišiniu (50:50, v/v); tramadolis - taip pat metanolio ir išgryninto vandens mišiniu (60:40, v/v), o midazolamo standartas buvo ištirpintas etanolyje. Pagaminti tirpalai sonifikuojami 10 minučių ultragarso vonelėje. Po ekstrakcijos ultragarsu tirpalai filtruojamas per PTFE membraninį filtrą (0,45 µm).
Tiriamieji tirpalai gaminami iš: Midazolamas ,,Dormicum“ (injekcinis tirpalas ( Roche Lietuva 5mg/ml), „Paracetamolis SANITAS“ (PharmaSwiss Česka republika s.r.o., Čekija) tablečių (500 mg), ,,Tramadol„„ kapsulės (KRKA, d.d., Novo mesto, Slovėnija50mg). Midazolamas plonasluoksnės chromatografijos metodo tyrimo metu naudotas tieisiai iš ampulės, spektroskopiniame tyrime skiestas etanoliu iki 5 ml tikslaus tūrio kolbutėje. Paracetamolio vienos tabletės masė tirpinta 50 ml metanolio ir išgryninto vandens mišinyje (50:50, v/v). Tramadolio kapsulės masė tirpinta 10 ml metanolio ir išgryninto vandens mišinyje (60:40, v/v). Tirpalai sonifikuojami 10 minučių ultragarso vonelėje. Po ekstrakcijos ultragarsu tirpalas filtruojamas per PTFE membraninį filtrą (0,45 µm).
Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos
Eliuentų (tirpiklių) chromatografinė sistema sudaryta iš etilacetato, metanolio ir koncentruoto amonio hidroksido tirpalo (85:10:5). Naudotos 20/20 cm ir 10/10 cm chromatografinės plokštelės. Plonasluoksnei chromatografijai atlikti pusiau automatinio mėginių uţpurškimo sistema ant plokštelės buvo uţnešami tirpikliai po 10 µl. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikoje po 2 µl. Gautos dėmės ryškinamos UV- šviesos spinduliuose (254 nm) bei vizualizacinės Camag sistemos fotokameros pagalba. Analizės metu gautos plokštelių fotonuotraukos ir apskaičiuotos medţiagų Rf reikšmės.
2.2.2. Kokybinis vertinimas UV–spektroskopijos metodu
Paracetamolio, tramadolio ir midazolamo identifikavimui vaistinėse formose buvo taikytas UV-spektroskopinis metodas. Atliktas atskirų vaistinių medţiagų spektrų uţrašymas ir
palygintas su literatūros duomenimis. UV-pektroskopinis tyrimas atliktas su Halo DH – 20
UV/Vis spektrofotometru, naudotos 1 cm storio kvarcinės kiuvetės. Tiriamųjų medţiagų spektrai buvo uţrašomi 200 – 310 nm šviesos bangos ilgio intervale. Gauti spektrai pavaizduoti grafinės išraiškos būdu. Panaudojus plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikas atskirti junginių pavyzdţiai kiekybiškai buvo perkelti iš sorbento ir tirpinti parūgštintame vandens ir metanolio mišinyje (50:50, v/v). Buvo uţrašomi tiriamųjų medţiagų UV spektrai ir palyginti su literatūroje nurodytais standartais.
2.2.3. Pavyzdţių ruošimas
Prieš pradedant veikliųjų medţiagų išskyrimą iš vaistinių preparatų formų, buvo atlikta išsami literatūros analizė. Ši analizė buvo atlikta siekiant išsiaiškinti kokie ekstrahentai yra geriausi šių veikliųjų medţiagų išgavimui iš tiriamųjų objektų. Literatūros apţvalgoje pateiktoje 5 lentelėje nurodyti tirpikliai ar jų mišiniai, kuriuose galima išgauti veikli ąsias medţiagas iš vaistinių formų.
Standartinių (palyginamųjų) tirpalų ruošimas
Pirmiausiai pagaminami standartiniai (palyginamieji) tirpalai, naudojant medţiagas-standartus, įsigytus iš Sigma –Aldrich. Gaminti 1 mg/ml standartiniai tirpalai: paracetamolis ekstrahuotas metanolio ir išgryninto vandens mišiniu (50:50, v/v); tramadolis - taip pat
metanolio ir išgryninto vandens mišiniu (60:40, v/v); o midazolamas – tirpintas etanolyje.
Medţiagos atsveriamos analitinėmis svarstyklėmis (sveriant po 10 mg kiekvienos iš medţiagų) ir perkeliamos į 10 ml tikslaus tūrio kolbutę. Į kolbutę su atsvertomis medţiagomis pilamas atitinkamas tirpiklis ir paruoštas tirpalas 10 minučių sonifikuojamas ultragarso vonelėje. Po ekstrakcijos ultragarsu tirpalas praskiedţiamas iki tikslaus tūrio, gerai sumaišomas ir filtruojamas per membraninį filtrą (0,45 µm). Paruošti tirpalai naudojami plonasluoksnės chromatografijos analitiniams tyrimams atlikti.
Tiriamųjų (darbinių) tirpalų ruošimas
Darbiniai tiriamųjų medţiagų tirpalai buvo ruošti naudojant Lietuvos vaistinėse parduodamus vaistinius preparatus. Midazolamo darbinis tirpalas (A1) buvo pagamintas iš vaistinio preparato ,,Dormicum“ ( Roche Lietuva 5mg/ml)
Midazolamas plonasluoksnės chromatografijos analitiniams tyrimams buvo naudojamas tiesiai iš ampulės. Spektroskopiniuose tyrimuose ampulės turinys buvo perkeliamas į 5 ml tikslaus tūrio kolbutę ir praskiedţiamas iki brūkšnio, po to gerai sumaišoma.
Paracetamolio darbinis tirpalas (P1) buvo pagamintas iš vaistinio preparato „Paracetamolis SANITAS“ (PharmaSwiss Česka republika s.r.o., Čekija) tablečių, kuriose yra 500 mg paracetamolio. 1 tabletė grūstuvėje piestelės pagalba susmulkinama iki miltelių ir visa tabletės masė perkialiama į 100 ml tikslaus tūrio kolbutę, uţpilama metanolio ir vandens mišiniu (50:50, v/v), po to laikoma ultragarso vonelėje 10 min. Po sonifikacijos ultragarsu tirpalas
praskiedţiamas iki tikslaus tūrio, filtruojama per membraninį filtrą (PTFE 0,45µm), gautas 5
mg/ml darbinis tirpalas naudojamas tolimesniuose tyrimuose.
Darbinis tramadolio tirpalas (T1) paruoštas iš vaistinio preparato ,,Tramadol„„ kapsulės (KRKA, d.d., Novo mesto, Slovėnija50mg). Ekstrakto gamybai imamas vienos kapsulės turinys, perkelama į 10 ml kolbutę, taip pat kaip ir paracetamolio atveju, uţpilama metanolio ir vandens mišiniu (60:40, v/v) ir sonifikuojama 10 min ultragarso vonelėje. Po sonifikacijos ultragarsu tirpalas praskiedţiamas iki tikslaus tūrio, filtruojama per membraninį filtrą (PTFE 0,45µm), gautas 5 mg/ml darbinis tirpalas naudojamas tolimesniems tyrimams. Iš pagamintų darbinių vaistinių preparatų tirpalų pagaminamas vaistinių medţiagų tirpalų mišinys, sumaišant juos lygiomis dalimis. Gautas mišinys naudojamas tolimesniems tyrimams.
2.2.4. Ryškiklio parinkimas chromatografinių plokštelių ryškinimui
Optimizuojant plonasluoksnės chromatografijos metodiką, kuri leistų atskirti ir identifikuoti midazolamą, tramadolį ir paracetamolį, esant jiems mišinyje, vienas iš svarbių punktų yra plokštelių ryškinimo metodikos parinkimas. Tam gali būti naudojami cheminiai reagentai ar UV- šviesos lempa, kurios darbiniai rėţimai yra (254 nm, 366 nm). Mūsų tyrimų metu po plokštelės chromatografavimo, ryškinimui pasirinkome naudoti UV- šviesos lempą, nes tai yra greitas, paprastas ir nesudėtingas ryškinimui naudojamas metodas, kuris nereikalau ja papildomų reagentų. Patalpinus plokštelę po UV- šviesos lempa, naudojant 254 nm rėţimą, visų veikliųjų junginių dėmės buvo puikiai matomos, dėl šios prieţasties cheminių ryškiklių analizei nenaudojome.
2.2.5. Duomenų apdorojimas
Tyrimų duomenys apdoroti Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV), bei Camag WinCats programiniais paketais. Visi bandymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis (SN).
3. MIDAZOLAMO, TRAMADOLIO IR PARACETAMOLIO
TYRIMAS PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS
METODU
Siekiant parinkti optimaliausias plonasluoksnės chromatografijos metodo sąlygas, vienas iš svarbiausių metodikos punktų yra tinkamos chromatografavimo sistemos parinkimas. Norint parinkti chromatografavimo sistemą būtina atlikti išsamią literatūros analizę. Atliekant literatūros apţvalgą atskiroms medţiagoms (paracetamoliui, tramadoliui, midazolamui) buvo sudaryta lentelė (literatūros apţvalgoje pateikta 4 lentelė), kurioje nurodomos tirpiklių sistemos bei minėtų medţiagų Rf reikšmės. Pagrindinis kokybinis vertinimo kriterijus plonasluoksnėje chromatografijoje yra sulaikymo rodiklis (Rf), kuris parodo medţiagos dėmės padėtį ant chromatografinės plokštelės.
Rf reikšmė yra tiriamosios medţiagos fronto poslinkio atstumo (L1) santykis su tirpiklių fronto poslinkio atstumu (L2). Iš lentelės matyti, kad yra dvi tirpiklių sistemos, kurios yra tinkamos visų trijų veikliųjų medţiagų identifikavimui, kaip atskiriems vienetams, šios sistemos pateikiamos sutrauktoje 4 lentelės versijoje (6 lentelė).
6 lentelė. Tirpiklių sistemos, tinkamos paracetamolio, midazolamo, tramadolio identifikavimui Tirpiklių sistema Paracetamolio
Rf reikšmė
Tramadolio Rf reikšmė
Midazolamo Rf reikšmė Etilo acetatas: metanolis: koncentruotas
amonio hidroksidas (85:10:5) [17] 0,45 0,78 0,6
Metanolis [19-20] 0,77 0,30 0,69
Pirmiausia tyrimai atlikti su standartiniais (palyginamaisiais) tramadolio, midazolamo ir paracetamolio tirpalais.
Pirminės analizės atliktos su grynu metanoliu, kurį naudojome kaip eliuentų sistemą. Į chromatografinę kamerą supilama 100 ml metanolio ir kamera paliekama 20 min įsisotinimui. Tuo tarpu ant stiklinės plokštelės (20/20 cm) pusiau automatiniu mėginių uţnešėju Camag Linomat 5, azoto srovės pagalba, uţpurškiamos brūkšnelio pavidalo veikliosios medţiagos, po 10 µl tirpalo. Chromatografinė plokštelė dţiovinama ir įdedama į paruoštą kamerą, prieš tai paţymėjus finišo liniją 15 cm nuo mėginių uţnešimo vietos. Kai eliuentų sistema pasislenka 15 cm atstumu,
plokštelė ištraukiama ir dţiovinama traukos spintoje, kol nugaruoja tirpiklis. Išdţiovinta plokštelė pernešama į Camag vizualizacijos sistemą ir apšvitinama 254 nm bangos ilgio šviesa, o apšvitinta plokštelė fotografuojama (5 pav.).
5 pav. Chromatografavimas, atliktas eliuentu naudojant metanolį: (1) paracetamolis Rf=0,82, (2) tramadolis Rf=0,32, (3) midazolamas Rf=0,66
Iš pateikto 5 paveikslo matyti, kad medţiagų atsiskyrimas viena nuo kitos yra galimas, nes dėmių Rf reikšmės skirtingos, dėl to jos viena kitos neuţdengia, tas leistų atlikti jų identifikavimą ir mišinyje. Bet iš pateikto pavyzdţio matome, kad dėmės nesukoncentruotos, ištįsusios ir nesimetriškos. Dėl šių prieţasčių nuspręstą tyrimus atlikti ir su antrąja tirpiklių-eliuentų sistema.
Kita tirpiklių-eliuentų sistema sudaryta iš etilacetato, metanolio ir koncentruoto amonio hidroksido tirpalo (85:10:5). Chromatografinė kamera paruošiama taip pat, kaip aprašyta prieš tai analizę atliekant su eliuentu metanoliu. Ant stiklinės plokštelės uţnešamos tos pačios standartinės medţiagos po 10 µl ir atliekama plonasluoksnės chromatografijos analizė. Finišo linija paţymima 15 cm nuo mėginių uţnešimo vietos. Po chromatografavimo plokštelė ištraukiama ir dţiovinama traukos spintoje. Išdţiovinta plokštelė pernešama į Camag vizualizacijos sistemą ir apšvitinama 254 nm bangos ilgio šviesa. Apšvitinta plokštelė fotografuojama. Gautoje nuotraukoje vaizdas kardinaliai skyrėsi nuo pirminės eliuentų sistemos (metanolis), taip pat Rf reikšmės buvo skirtingos, medţiagos viena nuo kitos pilnai atsiskyrusios. Nustačius, kad veikliosios medţiagos atsiskiria viena nuo kitos ir dėmės gaunamos simetriškos ir sukoncentruotos, ši metodika buvo
pakartota tris kartus ir suskaičiuotas standartinis nuokrypis Rf reikšmėms, rezultatai pateikiami 7 lentelėje.
7 lentelė Veikliųjų medţiagų Rf reikšmės atlikus chromatografavimą etilacetato, metanolio ir koncentruoto amonio hidroksido eliuentų sistemoje.
Veiklioji medţiaga Rf (vid.) reikšmės Standartinis nuokrypis
Paracetamolis 0,58 0,02
Tramadolis 0,93 0,02
Midazolamas 0,83 0,02
Pasirinkus tinkamiausias (optimizuotas) chromatografavimo sąlygas ant plokštelės po standartinių medţiagų tirpalų bei vaistinių preparatų, įsigytu Lietuvos vaistinėse, veikliųjų medţiagų tirpalų uţnešimo, uţneštas, iš vaistinių preparatų veikliųjų medţiagų tirpalų paruoštas mišinys. Standartinių tirpalų ir vaistinių preparatų tirpalų mišinys uţpurškiamas ant plokštelės po 10 µl. Plokštelės pernešamos į chromatografinę kamerą, po analizės ištraukiamos ir dţiovinamos, tada nufotografuojamos apšvitinus 254 nm UV- šviesa. Gauti rezultatai nurodomi 6 pav.
6 pav. PC (1) paracetamolis, (2) tramadolis, (3) midazolamas , (4) vaistinių preparatų mišinys
Pateiktame 6 paveiksle matyti, kad vaistinėse įsigytų preparatų veikliujų junginių Rf reikšmės mišinyje sutampa su Rf reikšmėmis atskirai uţneštų standartinių tirpalų. Šis atliktas
tyrimas leidţia mums identifikuoti paracetamolį, midazolamą ir tramadolį, kaip atskirus vienetus, bei atlikti jų mišinio analizę.
Apibendrinant plonasluoksnės chromatografijos tyrimą nustatyta, kad tinkamiausia eliuentų sistema paracetamolio, tramadolio ir midazolamo mišinio analizei yra: etilacetato, metanolio ir koncentruoto amonio hidroksido (85:10:5), ryškinimą atliekant UV- šviesos lempa (254 nm), tirpiklius uţnešant ant plokštelės 10 µl kiekiu. Ši metodika yra tinkama paracetamolio, tramadolio ir midazolamo identifikavimui, bei jų mišinių analizei įvairiuose vaistiniuose preparatuose. Naudojant šią metodiką pavyksta ne tik nustatyti šias tris medţiagas, bet ir atskirti jas joms esant mišinyje.
4. MIDAZOLAMO, TRAMADOLIO IR PARACETAMOLIO
TYRIMAS EFEKTYVIOSIOS PLONASLUOKSNĖS
CHROMATOGRAFIJOS METODU
Atlikus plonasluoksnės chromatografijos analitinius tyrimus ir parinkus tinkamiausias sąlygas midazolamo, tramadolio ir paracetamolio mišinio tyrimams, buvo nuspręsta tą pačia metodiką (su tam tikromis modifikacijomis) išbandyti tyrimus atliekant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu (EPC).
Standartiniai vaistinių medţiagų tirpalai bei iš vaistinių preparatų išskirtų veikliųjų medţiagų pagaminti tiriamieji tirpalai buvo naudoti tie patys kaip ir plonasluoksnės chromatografijos metodikoje. Chromatografinė eliuentų sistema supilama tokiu pačiu santykiu, kaip prieš tai naudotoje metodikoje, į aukšto efektyvumo chromatografavimo kamerą supilama 50 ml pagaminto eliuento (tirpiklių mišinio) ir paliekama įsisotinimui. Ant aukšto efektyvumo stiklinės chromatografinės plokštelės (10/10 cm) uţnešami standartiniai tirpalai ir vaistinių preaparatų mišinys po 2 µl. Nuo veikliųjų junginių uţnešimo vietos paţymima finišo linija (7 cm). Paruošta plokštelė įnešama i kamerą, po chromatografavimo ištraukiama ir dţiovinama traukos spintoje. Vizualizacijos sistemos pagalba plokštelė fotografuojama apšvitinus UV- šviesa (254 nm). Gauti rezultatai pateikiami 7 pav.
7 pav. EPC (1) paracetamolis, (2) tramadolis, (3) midazolamas , (4) vaistinių medţiagų mišinys
Remantis gautais rezultatais daroma prielaida, kad kaip ir plonasluoksnėje chromatografijoje medţiagos pilnai atsiskiria ir galimas pilnas junginių identifikavimas ir atskyrimas esant jiems mišinyje. Gautos vid. Rf reikšmės ir standartiniai nuokrypiai pateikiamos 8 lentelėje.
8 lentelė EPC, veikliųjų medţiagų vid. Rf reikšmės po chromatografavimo etilacetato, metanolio ir koncentruoto amonio hidroksido eliuntų sistema.
Veiklioji medţiaga Rf vid. reikšmės Standartinis nuokrypis
Paracetamolis 0,58 0,01
Tramadolis 0,91 0,02
Midazolamas 0,80 0,01
Apibendrinus rezultatus galima daryti išvadą, kad paracetamolio, tramadolio ir midazolamo junginių identifikavimui ir atskyrimui, esant jiems mišinyje, galima taikyti PC ir EPC tyrimų metodus. Visgi EPC laiko atţvilgiu yra greitesnė ir efektyvesnė, sunaudojama maţiau tirpiklių, bet finansiniu atţvilgiu yra brangesnė. Šios abi metodikos yra tinkamos medţiagų išskirtų iš vaistinių preparatų mišinio analizei.
5. MIDAZOLAMO, TRAMADOLIO IR PARACETAMOLIO
TYRIMAS UV–SPEKTROSKOPIJOS METODU
Atliekant veikliųjų medţiagų (paracetamolio, tramadolio ir midazolamo) spektrinę analizę buvo naudojami tiriamieji vaistinių preparatų pavyzdţiai, išskirti iš vaistinių preparatų – t.y. pagaminti prieš tai aprašytomis sąlygomis. Tyrimo metu buvo uţrašomi atskirų veikliųjų medţiagų UV- spektrai, kurie buvo lyginami su literatūros šaltiniuose nurodytais duomenimis. Pagal spektrinius duomenis buvo atliekama tiriamųjų medţiagų identifikacija vaistinėse formose. Atlikus tyrimus, nustatyta, kad: spektroskopinis metodas šių junginių mišinio analizei nėra tinkamas, kadangi veikliųjų medţiagų spektrai yra panašiose spektro dalies ribose ir jie vienas kitą perkloja (persidengia). Dėl šios prieţasties identifikuoti paracetamolio, midazolamo ir tramadolio mišinyje neįmanoma. Iš mišinio atskirti šiuos tris junginius buvo pritaikytos PC ir EPC metodikos, o išskirti junginiai kiekybiškai buvo perkelti iš sorbento, tirpinti parūgštintam metanolio ir vandens mišinyje (50:50) vv ir uţrašius šių medţiagų spektrus jie buvo palyginti su literatūroje pateiktais standartais.
Tyrimo eiga
Pirmiausiai spektrofotometro Halo DH – 20 UV/Vis pagalba uţrašytas paracetamolio spektras, jis pateikiamas 8 pav.
Paracetamolio UV spektre matosi, kad rūgštinėje aplinkoje absorbcijos maksimumas yra 245 nm. Sulyginus šiuos duomenis su 9 pav. uţrašytu spektru galime teigti, kad tiriamoji medţiaga tikrai yra paracetamolis.
9 pav. Paracetamolio UV spektras. (Clarke„s analysis of drugs and poisons)
Sulyginus spektrinius duomenis su literatūroje pateiktais nustatėme, kad spektriniai parodymai sutampa, bei šios medţiagos absorbcijos maksimumas yra toks pat, dėl to galime teigti, kad tiriamoji medţiaga yra paracetamolis.
Kitas tiriamasis objektas buvo midazolamas (10 pav.).
10 pav. Midazolamo UV spektras
Iš pateikto spektro matome, kad absorbcijos maksimumas rūgštinėje aplinkoje yra 220 nm, o spektriniai parodymai sutampa su pateikiamais literatūroje (11 pav.).
11 pav. Midazolamo UV spektras. (Clarke„s analysis of drugs and poisons)
Sulyginus spektrinius duomenis su literatūroje pateiktais (ţr.11 pav.) nustatėme, kad spektriniai parodymai sutampa, dėl to galime teigti, kad tiriamoji medţiaga yra midazolamas. Absorbcijos maksimumas yra 220 nm, kas sutampa su literatūroje pateiktais duomenimis. Tai leidţia daryti išvadą, kad identifikuota medţiaga yra midazolamas.
Tas pats tyrimas buvo atliktas su tramadolio tiriamuoju tirpalu 12 pav.
12 pav. Tramadolio UV spektrai
Tramadolio UV spektre matosi, kad rūgštinėje aplinkoje absorbcijos maksimumas yra 270 nm, o spektras sutampa su pateiktu literatūroje (13 pav.)
13 pav. Tramadolio UV spektras. (Clarke„s analysis of drugs and poisons)
Sulyginus spektrinius duomenis su literatūroje pateiktais nustatėme, kad spektriniai parodymai sutampa, dėl to galime teigti, kad tiriamoji medţiaga yra tramadolis. Absorbijos
maksimumas yra 270 nm. Sulyginus šiuos duomenis su literatūroje pateiktais duomenimis galima daryti išvadą, kad identifikuota medţiaga yra tramadolis. Šių junginių spektrų absorbcijos maksimumai sutapo su 5 lentelėje nurodytais maksimumais literatūros apţvalgoje.
Sulyginus mokslinės literatūros šaltiniuose pateiktus spektrus su spektrais, gautais atliekant tyrimą, galima daryti išvadą, kad identifikuojant junginius gauti UV spektrai sutampa su literatūros šaltiniuose pateiktais spektrais.
Apibendrinant gautus tyrimų rezultatus galime teigti, jog taikant spektroskopinį metodą galimas pavienių veikliųjų medţiagų identifikavimas įvairiose vaistų formose. Mūsų tyrimuose buvo analizuotos tabletės, kapsulės ir injekcinis tirpalas, kuriuose sėkmingai identifikavome gamintojų nurodytas veikliąsias medţiagas. Bet šių junginių mišinio analizė yra negalima, kadangi spektrai vienas kitą perkloja (persidengia) ir tai apsunkina medţiagų identifikavimą.
IŠVADOS
1. Atlikus mokslinės literatūros šaltinių analizę, nerasta duomenų apie plonasluoksnės chromatografijos metodiką, skirtą midazolamo, tramadolio ir paracetamolio mišinio kokybiniam įvertinimui. Eksperimentiniu būdu nustatyta, jog tinkamiausios tirpiklių sistemos, analizuojamų medţiagų mišiniui išskirstyti, yra TS–D (Etilacetatas: metanolis: koncentruotas amonio hidroksidas (85:10:5) ir TS–F Metanolis [19-20] . Po pakartotinės etaloninių tirpalų analizės nustatytos vidutinės tiriamųjų medţiagų Rf reikšmės: TS -D: midazolamas (Rf = 0,83), tramadolis (Rf = 0,93), paracetamolis (Rf = 0,58); TS-F: midazolamas (Rf = 0,86), tramadolis (Rf = 0,30), paracetamolis (Rf = 0,77); Vykdant pakartotinę analizę tiriamųjų medţiagų Rf atsikartojamumo paklaidos neviršijo leistinos p < 0,05 ribos. Midazolamo, tramadolio ir paracetamolio dėmės ant chromatografinės plokštelės ryškintos UV šviesa (254 nm;365 nm). Optimizuotos PC ir EPC metodikos yra tinkamos midazolamo, tramadolio ir paracetamolio mišinio komponentų atskyrimui ir kokybiniam įvertinimui.
2. Nustačius optimalias analizės sąlygas, naudojant plonasluoksnę ir efektyviąją plonasluoksnę chromatografiją, optimizuota metodika pritaikyta tiriamųjų medţiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų „Dormicum“ ( Roche Lietuva 5mg/ml) ,,Paracetamolis SANITAS“ (PharmaSwiss Česka republika s.r.o., Čekija) tabletės 500 mg“ ir „Tramadol„„ kapsulės (KRKA, d.d., Novo mesto, Slovėnija 50mg)“ kokybiniam įvertinimui. Atlikus analizę nustatyta, kad tiriamųjų medţiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, vidutinės Rf reikšmės atitiko pasikliautinųjų intervalų, nustatytų sistemoms reikšmes, todėl optimizuotos PC metodikos yra tinkamos midazolamo, tramadolio ir paracetamolio nustatymui vaistiniuose preparatuose.
3. Taikant spektroskopinį metodą galimas pavienių veikliųjų medţiagų identifikavimas įvairiose vaistų formose. Mūsų tyrimuose buvo analizuotos tabletės, kapsulės ir injekcinis tirpalas, kuriuose sėkmingai identifikavome gamintojų nurodytas veikliąsias medţiagas. Bet šių junginių mišinio analizė yra negalima, kadangi spektrai vienas kitą perkloja (persidengia) ir tai apsunkina medţiagų identifikavimą.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Atsiţvelgiant į gautus tyrimo rezultatus, optimizuotos plonasluoksnės chromatografijos ir EPC metodikos yra tinkamos midazolamo, tramadolio ir paracetamolio kokybiniam nustatymui vaistiniuose preparatuose jiems esant pavieniui arba mišinyje. Plonasluoksnės chromatografijos metodas yra pigus, greitas ir patogus naudoti kasdieniame, nedidelės vaistų analizės laboratorijos darbe.
Siekiant optimizuotas metodikas plačiau taikyti toksikologinės analizės praktikoje yra tikslinga atlikti išsamius tyrimus, kurių metu būtų įvertintas metodikų efektyvumas nustatant tiriamąsias medţiagas biologiniuose skysčiuose.
Tyrimų metu buvo orientuojamasi į kokybinį midazolamo, tramadolio ir paracetamolio nustatymą, todėl tolimesnis metodikų optimizavimo etapas galėtų būti jų pritaikymas kiekybei tiriamųjų medţiagų analizei pavyzdţiuose.
LITERATŪRA
1. Babul, N., Noveck, R., Chipman, H., Roth, S. H., Gana, T., Albert, K. Efficacy and safety of extended-release, once-daily tramadol in chronic pain: a randomized 12-week clinical trial in osteoarthritis of the knee. Journal of pain and symptom management. 2004, 28(1): 59-71. 2. Behera, S., Ghanty, S., Ahmad, F., Santra, S., Banerjee, S. UV-visible spectrophotometric
method development and validation of assay of paracetamol tablet formulation. Journal of Analytical Bioanalytical Techniques.2012, 3(151):1-6
3. Daly, F. F., Fountain, J. S., Murray, L., Graudins, A., Buckley, N. A. Gui delines for the management of paracetamol poisoning in Australia and New Zealand-explanation and elaboration. Medical journal of Australia. 2008, 188(5): 296-301.
4. Dighe, V., Sane, R., Menon, S., Tambe, H., Pillai, S., Gokarn, V.Simultaneous determination of diclofenac sodium and paracetamol in a pharmaceutical preparation and in bulk drug powder by high-performance thin-layer chromatography. JPC-Journal of Planar Chromatography-Modern TLC. 2006,19(112): 443-448.
5. El-Zinati, A. M., Abdel-Latif, M. S. Simultaneous Determination of Paracetamol and Tramadol in Pharmaceutical Tablets by Derivative UV-Vis Absorption Spectrophotometry. The Open Analytical Chemistry Journal. 2015, 8(1):1-6.
6. Fomčenko, I., Masaitienė, R., Kasiulevičius, V. Neuropatinio skausmo gydymo p rincipai. Sveikatos Mokslai. 2011, 21(2): 19-25
7. Gharge, D., & Dhabale, P. Simultaneous estimation of tramadol hydrochloride and paracetamol by UV spectrophotometric method from tablet formulation. International Journal of PharmTech Research, (2010). 2(2), 1119-23.
8. Ghorbani, N., Hosseinzadeh, S., Pashaei, S., Hosseinzadeh, A., & Hamidi, H. A. The Effect of Produce Conditions for Preparation of Potentiometric Carbon Paste Sensor for Determination of Midazolam in Pharmaceutical. International Journal of Electrochemical Science. 2014, 9:3772-3783.
9. Kalibatienė, L., Kalibatas, V., Macas, A., Trepenaitis, D. An evaluation of the effectiveness and safety of midazolam in children undergoing dental surgery. Medicina. 2015, 51:180-186. 10. Kazlauskienė, D., Vainauskas P., Marksienė R. ir kt., Vaistų mišinio UV- spektrofotometrinis
tyrimas ūminių apsinuodijimų atvejais. Medicina. 2003, 39(2):137- 141.
11. Kazlauskienė, D., Vainauskas, P., Kazlauskas S. Psichotropinių vaistų mišinio tyrimas aukšto slėgio skysčių chromatografijos metodu ūminių apsinuodijimų atvejais. Medicina. 2002, 38 (10): 1014-1017.
12. Kazlauskienė, D., Vainauskas, P., Rakauskaitė, D. Vaistų mišinio komponentų identifikavimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ūminių apsinuodijimų atvejais. Medicina. 2003, 39 (2): 132- 136.
13. Krzek, J., Starek, M. Quality assessment for tramadol in pharmaceutical preparations with thin layer chromatography and densitometry.Biomedical Chromatography. 2004,18(8): 589 -599. 14. Lietuvos Higienos institutas. [ţiūrėta 2015 -10 -15]. Prieiga per internetą:
http://www.hi.lt/sveikatos-statistika.html
15. Lietuvos Respublikos vaistinių preparatų registras. VVKT; [ţiūrėta 2015 -10 -15]. Prieiga per internetą: http://extranet.vvkt.lt/paieska/
16. Luţnik, J., Pirnat, J., Jazbinšek, V., Lavrič, Z., Srčič, S., Trontelj, Z. The Influence of Pressure in Paracetamol Tablet Compaction on 14N Nuclear Quadrupole Resonance Signal. Applied Magnetic Resonance. 2013, 44(6):735-743.
17. Meyyanathan, S. N., Kumar, P. and Suresh, B. Analysis of tramadol in pharmaceutical preparations by high performance thin layer chromatography. Journal of. Separation Science. 2003, 26: 1359–1362.
18. Mickevičius D. Cheminės analizės metodai. Ţiburys, Vilnius 1998.
19. Moffat A. C., Osselton M.D., Widdop B. Clarke`s Analysis of Drugs and Poisons, 4th Edition. Pharmaceutical Press; 2011 m.
20. Moffat A. C., Osselton M.D., Widdop B. Clarke`s Analysis of Drugs and Poisons, 3th Edition. Pharmaceutical Press; 2007 m.
21. Murtaza, G., Khan, S. A., Shabbir, A., Mahmood, A., Asad, M. H. H. B., Farzana, K., et al. Development of a UV-spectrophotometric method for the simultaneous determination of aspirin and paracetamol in tablets. Scientific research and Essays. 2011, 6(2):417-421.
22. Narkotikų, tabako ir alkoholio kontrolės departamentas.NTAKD, [ţiūrėta 2015 -10 -15]. Prieiga per internetą: http://www.ntakd.lt/index.php/statistika
23. Nordt, S. P., Clark, R. F. Midazolam: a review of therapeutic uses and toxicity. The Journal of emergency medicine.1997,15(3):357-365.
24. Norrbrink C, Lundeborg T. Tramadol in neuropathic pain after spinal cord injury: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. The Clinical Journal of Pain. 2009; 25(3):177-184.
25. Office for National Statistics, Statistical Bulletin, Deaths Related to Drug Poisoning in England and Wales, 2013.
26. Reingartienė, D., Laţauskas, R. Apsinuodijimas salicilatais. Medicina, 2006, 42(1):79 -83. 27. Riordan, S. M., Williams, R. Alcohol exposure and paracetamol‐induced
28. Rote, A. R., Kumbhoje, P. A., Bhambar, R. S. UV-visible spectrophotometric simultaneous estimation of paracetamol and nabumetone by AUC method in combined tablet dosage form. Pharmaceutical methods. 2012, 3(1):40-43.
29. Sayed, M., GauriBapat, N. Development of UV spectrophotometric methods and validation for estimation of Tramadol hydrochloride in bulk and tablet dosage form by absorbance maxima and area under the curve method. Journal of Applied Pharmacy. 2014, 6(2): 210 -216.
30. Sawant, R., Bhangale, L., Joshi, R., Lanke, P. Validated spectrophotometric methods for simultaneous estimation of Paracetamol, Domperidone and Tramadol HCl in pure and tablet dosage form. Journal of chemical metrology. 2010, 4(1):21-27.
31. Schmidt, A. P., Valinetti, E. A., Bandeira, D., Bertacchi, M. F., Simoes, C. M., Auler, J. O. C. Effects of preanesthetic administration of midazolam, clonidine, or dexmedetomidine on postoperative pain and anxiety in children.Pediatric Anesthesia. 2007,17(7):667-674.
32. Šniepienė, G., Vitkus, D., Slatvickis A. Mirtingumo nuo apsinuodijimo psichoaktyviosiomis medţiagomis tendencijos Klaipėdos apskrityje 2010–2014 M., Visuomenės sveikata, 2015, 1:96-101.
33. Tramadol. Update review report. Agenda item 6.1 Expert Committee on drug Dependence. Thirty-six meeting. Geneva, 2014,16-20, .
34. Umbrasienė N. Ţmonių apsinuodijimų, išanalizuotų 2007 – 2011 metais, lyginamoji analizė. VVSPT., Vilnius; 2012 m.
35. Valstybinė vaistų kontrolės tarnyba.VVKT. 2010-2012 m. vaistų suvartojimo Baltijos valstybėse statistika (Baltic Statistics on Medicines 2010-2012).
36. Valstybinė vaistų kontrolės tarnyba.VVKT. Vaistų suvartojimo 2014 m. ataskaita.
37. Vazzana, M., Andreani, T., Fangueiro, J., Faggio, C., Silva, C., Santini, A., Souto, E. BTramadol hydrochloride: Pharmacokinetics, pharmacodynamics, adverse side effects, co -administration of drugs and new drug delivery systems. Biomedicine & Pharmacotherapy.2015,70:234-238.
38. Wenzel, R. R., Bartel, T., Eggebrecht, H., Philipp, T., Erbel, R. Central-nervous side effects of midazolam during transesophageal echocardiography. Journal of the American Society of Echocardiography. 2002,15(10):1297-1300.
