FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
INGA KRIKŠČIŪNIENĖ
KANABINOIDŲ ĮVERTINIMO TYRIMAI PLUOŠTINĖSE KANAPĖSE
(CANNABIS SATIVA L.) EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ
CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc.dr. Rūta Marksienė
KAUNAS 2018
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr., Ramunė Morkūnienė
Data
KANABINOIDŲ ĮVERTINIMO TYRIMAI PLUOŠTINĖSE KANAPĖSE
(CANNABIS SATIVA L.) EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ
CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc.dr. Rūta Marksienė Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė
Data Inga Krikščiūnienė Data
KAUNAS 2018
TURINYS
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.Pluoštinės kanapės ( Cannabis sativa L.) charakteristika ... 11
2. Farmakologinis kanabinoidų poveikis ... 12
2.1. CB1 receptoriai ... 13
2.2. CB2 receptoriai ... 13
3. Pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) fitocheminė sudėtis. ... 14
4. Kanabinoidų nustatymo kiekybiniai ir kokybiai metodai ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1. Tyrimo objektas ... 23
2.1.1. Pluoštinės kanapės mėginių džiovinimas ir išdžiovintos žaliavos kokybės vertinimas ... 23
2.2. Reagentai ... 23
2.3. Aparatūra ... 24
2.4. Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) mėginių paruošimas ekstrakcijai. ... 24
2.5. Pluoštinių kanapių ( Cannabis sativa L.) ekstraktų ruošimas ESC analizės metodui norint įvertinti kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties koncentracijas. ... 24
2.6. Kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties kiekybinis ir kokybinis įvertinimas (Cannabis sativa L.) ekstraktuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 25
2.7. Statistinė duomenų analizė ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1. Metodikos validacija ... 27
3.1.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos kiekybinio metodo validacija ... 27
3.2. Kanabidiolio kiekio įvairavimo nustatymas. ... 31
3.4. Kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties kiekių vidurkis pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.)
žaliavose ... 36
4. IŠVADOS ... 37
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38
tyrimai pluoštinėse kanapėse (Cannabis sativa L.) efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Mokslinis vadovas: Doc.dr. Rūta Marksienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas, 2018.
Darbo tikslas - efektyvios skysčių chromatografijos metodu atlikti kokybinį ir kiekybinį kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties įvertinimą pluoštinių kanapių ( Cannabis sativa L.) augalinėse žaliavose. Darbo uždaviniai - validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką kanabinoidų kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) žaliavoje. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinti kanabidiolo ir kanabidiolio rūgšties kiekį pluoštinių kanapių (Canabis sativa L.) žaliavos mėginiuose. Įvertinti kanabinoidų pasiskirstymą pluoštinių kanapių ( Cannabis sativa L.) žieduose ir žiedadulkėse. Tyrimo metodika - efektyvioji skysčių chromatografija buvo naudojama kanabidiolio (CBD) ir kanabidiolio rūgšties (CBDA) identifikavimui bei kiekybinei analizei atlikti žaliavos mėginiuose.
Tyrimo rezultatai - efektyviosios chromatografijos metodu pluoštinių kanapių (Cannabis
sativa L.) žiedų bei žiedadulkių mėginiuose pagal sulaikymo laiką buvo identifikuotas kanabidiolis
bei kanabidiolio rūgštis. Validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) esančių kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties kiekio nustatymui. Visi validaciniai parametrai atitiko jiems keliamus reikalavimus. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinus kanabidiolio koncentraciją skirtinguose (Cannabis sativa L.) veislėse nustatyta, jog didžiausia CBD koncentracija yra FINOLA veislės žieduose (0,068 mg/g) bei žiedadulkėse (0,570mg/g). Taip pat nustatyta didžiausia kanabidiolio rūgšties koncentracija BALOBZEVSKY veislės žiedadulkėse (66,178mg/g) bei FINOLA veislės žieduose (16,550mg/g). Nustačius kanabidiolio (CBD) ir kanabidiolio rūgšties (CBDA) vidurkį pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) žaliavose, galima teigti, kad analizuotose žaliavose vidutiniškai CBD kiekis buvo 0,52 ± 0,012 proc., o CBDA kiekis 99,48 ± 0,017proc.
Remiantis atliktu tyrimu, Lietuvoje auginamos pluoštinės kanapės ( Cannabis sativa L.) veislės BALOBZEVSKY žiedadulkės kaupia didžiausią kanabidiolio rūgšties kiekį, todėl šią veislę rekomenduoja auginti tuo atveju, jei žaliavoje reikalingas didelis šio kanabinoido kiekis.
L.) evaluation studies using high performance liquids chromatography method. Academic supervisor:
Assoc. Prof. Rūta Marksienė; Lithuanian University of Health Science, Faculty of Pharmacy, Department of Analythical and Toxicological Chemistry. – Kaunas
The Aim of the work – to carry out a qualitative and quantitave evaluation of cannabidiol and cannabidiolic acid in hemp (Cannabis sativa L.) vegetative stock/staple using method of high performance liquid chromatography. Objectives of the work – to validate the methodology of efficient liquid chromatography for a qualitative and quantitative evaluation of cannabinoids in hemp
(Cannabis sativa L.) To evaluate the ammount of cannabidiol and cannabidiolic acid in hemp (Cannabis sativa L.) stock samples using method of efficient liquid chromatography. To evaluate the
allocation of cannabidiol and cannabidiolic acid in hemp (Cannabis sativa L.) blossoms and pollen. Research methodology - efficient liquid chromatography has been adopted for identifying cannabidiol (CBD) and cannabidiolic acid (CBDA) and carrying out quantitative analysis on stock samples.
Results of the research – adopting the efficient liquid chromatography method, cannabidiol and cannabidiolic acid have been identified in blossom and pollen samples of hemp (Cannabis sativa
L.) according to the containment time. Efficient liquid chromatography methodology for determining
cannabidiol and cannabidiolic acid present in hemp (Cannabis sativa L.) has been validated. All validatory parameters matched the set requirements. After evaluating the concentration of cannabidiol in different (Cannabis sativa L.) breeds by using the method of efficient liquid chromatography, it has been determined that the highest CBD concentration is found in blossoms of FINOLA breed (0,068 mg/g) and pollen (0,570 mg/g). The greatest concentration of cannabidiolic acid has been identified in pollen of BALOBZEVSKY breed (66,178 mg/g) and blossoms of FINOLA breed (p16,55 mg/g). The average of canabidiol (CBD) and canabidiolic acid (CBDA) in cannabis (Cannabis sativa L.) raw materials, it can be stated that the analyzed raw materials have an average CBD content of 0.52 ± 0.012 percent and CBDA of 99.48 ± 0.017 percent.
In the research, the BALOBZEVSKY pollen production of fiber (Cannabis sativa L.), produced in Lithuania, accumulates the highest amount of cannabidiolic acid, therefore it is recommended to grow this breed, if the raw material requires a high amount of this cannabinoid.
PADĖKA
Dėkoju darbo vadovui doc.dr. Rūtai Marksienei už patarimus ir konsultacijas. Dėkoju analizinės ir toksikologinės chemijos katedros lektoriui Mindaugui Marksai už nuoširdžią pagalbą, patarimus, atliekant tyrimus ir analizuojant turimus duomenis.
SANTRUMPOS
CBD – kanabidiolis (angl. cannabidiol)
CBDA – kanabidiolinė rūgštis ( angl.cannabidiolic Acid) CBN – kanabinolis (angl. cannabinol)
CBG – kanabigerolis (angl. cannabigerol) CBGA - kanabigerolinė rūgštis
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
THC – tetrahidrokanabinolis (angl. tetrahydrocannabinol) SSN - santykinis standartinis nuokrypis
ĮVADAS
Centrinėje Azijoje kanapinių šeimos ( Canabinaceae) augalai buvo kultivuojami jau prieš 10,000 metų. Vieni iš pirmųjų įrašų apie medicininį kanapinių šeimos vaistažolių panaudojimą – metraščiai, kuriuose minima kaip žaliava, reumatiniams skausmams malšinti. Pirmasis Vakarų gydytojas, kuris susidomėjo pluoštinėmis kanapėmis kaip vaistu, buvo WB O'Shaughnessy, Kalkutos medicinos kolegijos profesorius, kuris analizavo jų panaudojimą Indijoje. Kanapių ekstraktai buvo užfiksuoti Britanijos, o vėliau - JAV farmakopėjose (1850 m.) dėl pasižyminčių raminamojo ir prieštraukulinio augalo poveikių. XXa. pradžioje, Britanijos ir JAV farmakopėjose kanapių ekstraktai buvo pašalinti dėl augalo preparatų trumpo tinkamumo vartoti bei netikslaus dozavimo [14].
Pluoštinėse kanapėse randama apie 545 medžiagų, iš kurių 105 priskiriamos kanabinoidų grupei. Sintetiniai ar natūraliai išgauti kanabinoidai pasižymi antiemetiniu, apetitą skatinančiu, analgetiniu bei širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančiu poveikiu. Vienas iš galimų medicininių pasiekimų gydant vėžį yra kanabinoidai, nes nustatyta, kad šios medžiagos gali būti taikomos vėžio ląstelėms naikinti [13]. Mokslininkai atlieka bandymus siekdami gydyti autoimunines ligas, išsėtinę sklerozę, Alzheimerio ligą, būtent kanabinoidų pagalba [47]. Kaip saugesnė alternatyva, kanabidiolis (CBD) ir kanabidiolio rūgštis (CBDA), verti platesnių tyrimų dėl panaudojimo medicinos srityje.
Pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) kaupia ne tik kanabinoidus, bet ir amino rūgštis, baltymus, angliavandenius, alkoholius, ketonus, steroidus, terpenus, fenolinius junginius ir kitas medžiagas[35]. Pluoštinės kanapės kaupia tiek daug skirtingų cheminių junginių, dėl kurių žmonės jas panaudoja skirtingos veiklos srityse: žemės ūkyje (pvz.:pašarų gamybai), pramonėje (pvz.:kosmetikos, tekstilės, popieriaus gamybai) bei medicinoje.
Šio tyrimo darbo tikslas - efektyvios skysčių chromatografijos metodu atlikti kokybinį ir kiekybinį kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties įvertinimą pluoštinių kanapių ( Cannabis sativa L.) augalinėse žaliavose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: efektyvios skysčių chromatografijos metodu atlikti kokybinį ir kiekybinį
kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties įvertinimą pluoštinių kanapių ( Cannabis sativa L.) augalinėse žaliavose.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatograijos metodiką kanabinoidų kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) žaliavoje.
2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinti kanabidiolo ir kanabidiolio rūgšties kiekį pluoštinių kanapių (Canabis sativa L.) žaliavų mėginiuose.
3. Įvertinti kanabinoidų pasiskirstymą pluoštinių kanapių ( Cannabis sativa L.) žieduose ir žiedadulkėse.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.Pluoštinės kanapės ( Cannabis sativa L.) charakteristika
Graikų istorikas Herodotas iš Halikarnaso (490-430 m. pr. m. e.) pirmą kartą rašytiniuose šaltiniuose mini, kad skitų gentys pluoštines kanapes naudojo kaip žaliavą pluoštui gauti. Dabartinės Mongolijos teritorijoje archeologai, tyrinėdami skitų laidojimo pilkapius, rado odinių krepšelių, pilnų šių kanapių sėklų, suanglėjusių sėklų likučių [13].
Pirmasis Vakarų gydytojas, kuris susidomėjo kanapėmis kaip vaistu, buvo WB O'Shaughnessy, jaunasis Kalkutos medicinos kolegijos profesorius, kuris analizavo jų panaudojimą Indijoje. Gydytojas, įsitikinęs dėl vaisto saugumo, pradėjo taikyti gydymą pluoštinės kanapės preparatais pacientams, sergantiems reumatitu, turintiems stabligės simptomų. 1839 m. gydytojas pranešė, kad atrado kanapių tinktūrą (alkoholio – kanapės mišinį, vartojamą per burną) pasižyminčią analgetiniu poveikiu. Sugrįžęs O'Shaughnessy į Angliją, pasidalino informacija apie pluoštinę kanapę kaip vaistinį augalą, o gydytojai Europoje ir Jungtinėse Amerikos Valstijose netrukus pradėjo šį augalą skirti dėl įvairių sutrikimų [14].
Europoje pluoštinės kanapės preparatai buvo naudojami XIX a. pabaigoje, siekiant gydyti skausmą, spazmus, astmą, miego sutrikimus, depresiją ir apetito praradimą. XX a. Pirmojoje pusėje vaistinis augalas buvo nebetaikytas gydymo tikslams, dėl to, kad mokslininkai negalėjo nustatyti pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) cheminės sudėties. Tik 1964 m. Stereocheminiu būdu nustatytas (-)-trans-delta-9-tetrahidrokanabinolis (THC), pagrindinis kanapių kanabinoidas [13,14].
Pluoštinė kanapė (Cannabis sativa L.) priklauso magnolijūnų (Magnoliophyta) genčiai, kanapinių (Cannabaceae) šeimai [26]. Pluoštinė kanapės ( Cannabis sativa L.) pagrindinė šaknis yra liemeninė. Derlingoje žemėje jos ilgis gali siekti iki 2 metrų. Iš pagrindinės šaknies į šonus eina pirmos eilės šalutinės šaknys, iš kurių stambiausios pasiekia net 80 centimetrų ilgį. Iš pirmosios eilės šalutinių šaknų išauga antros eilės šaknys. Šalutinės šaknys būna pasiskirsčiusios 20–40 centimetrų gylyje. Durpynuose kanapės įsišaknija giliau – 30–80 cm ir išaugina daug daugiau šoninių šaknų. Stiebas kanapių yra tiesus, neišsišakojęs. Tik retai augančių kanapių stiebai turi tendenciją šiek tiek šakotis. Stiebas padengtas kabliuko pavidalo plaukeliais, kurie suteikia stiebui tam tikrą šiurkštumą [22]. Ant stiebo yra bambliai. Lapai plaštakiškai karpyti, apatiniai yra priešiniai, viršutiniai – pražanginiai, iš abiejų pusių padengti plaukeliais. Sudėtiniai lapai būna nuo trilapių iki devynlapių, viršutiniai dažniausiai trilapiai. Lapai turi lapkočius. Sėjamoji kanapė yra dvinamis augalas; vyriškieji augalai vadinami pleiskėmis, o moteriškieji – grūdinėmis. Vyriškieji augalai yra smulkesni, jie
greičiau auga, žydi ir bręsta. Jų stiebai būna plonesni, tarpubambliai ilgesni, bet lapų pleiskių turi mažiau. Iš jų gaunama apie 12 – 20 proc. pluošto. Moteriškieji žiedai žali, susukti į apyžiedžio makštį ir sudaro tankius varpiškus žiedynus viršutinių lapų pažastyse. Vaisius – apvalus, pilkas arba rudas, kartais juodas, blizgančiu lygiu paviršiumi riešutėlis. Vaisiaus ertmėje yra sėklos. Kanapių žiedai smulkūs, žalsvai balti, susitelkę šluoteliniais žiedynais. Kanapė žydi birželio – liepos mėnesį [15]. Geriausiai vystosi ir auga esant vidutinei paros temperatūrai 12–16oC. Augalo žiedas gali išskirti
įvairų cheminių medžiagų kiekį, priklausomai nuo žemės ūkio ekotipo [3].
1 pav. Pluoštinė kanapė ( Cannabis sativa L.) Kayser O. ir kt.(2014)[5]
2. Farmakologinis kanabinoidų poveikis
Farmakologinis kanabinoidų poveikis priklauso nuo jų sąveikos su receptoriais, esančiais ant ląstelių paviršiaus skirtingose vietose centrinėje nervų sistemoje. Atlikti tyrimai rodo, jog kanabinoidų receptorių aktyvumas slopina adenilatciklazę, kuris stabdo ATP virtimą cikliniu AMP (cAMP). Tokie patys receptoriai buvo nustatyti ir gyvūnuose (žinduoliuose, paukščiuose, žuvyse ir ropliuose) [28]. Daugiausiai kanabinoidai veikia sąveikaudami su konkrečiais receptoriais, kurie yra žmogaus smegenų ląstelėse, tai – CB1 ir CB2.
2.1. CB1 receptoriai
CB1 receptorių yra daugiausiai stuburo smegenyse bei nervų ląstelių smegenyse, tap pat randama pavyzdžiui blužnyje, baltuosiuose kraujo kūneliuose, endokrininėse liaukose, virškinimo trakte ir šlapimo takuose. Daugiausia receptorių yra smegenyse (hipokampo ir pirminio jutimo stuburo smegenų vietose, smegenėlėse), todėl kanabinoidai turi poveikį skausmo reguliavimui bei atminties procesams. Stimuliuojant CB1 receptorius sukeliamas farmakologinis poveikis panašus į marihuanos poveikį organizmui- džiūsta burna ir gerklė, padažnėja širdies ritmas, sutrinka koordinacija ir pusiausvyra, sulėtėja reakcijos laikas, susilpnėja trumpalaikė atmintis. Vidutinės dozės sukelia atsipalaidavimą, skatina fantazijas. Didelės dozės gali sukelti haliucinacijas ir paranoją [26,28]. 2.2. CB2 receptoriai
CB2 receptorių daugiausia yra baltosiose kraujo ląstelėse, blužnyje, tonzilėse, imuninės sistemos ląstelėse [38]. Imuninės ląstelės taip pat turi CB1 receptorių, nors jų yra mažiau nei CB2. Imuninėje sistemoje viena svarbiausių kanabinoidų receptorių funkcijų yra citokinų išskyrimo reguliavimas. Vis labiau populiarūs moksliniuose tyrimuose selektyvūs CB2 receptorių antagonistai, dėl jų galimo priešuždegiminio ir priešvėžinio poveikio [7,38].
Sintetiniai kanabinoidai sintetinami (arba pagaminami) laboratorijoje dirbtiniu būdu. Jų poveikis yra kol kas mažai ištirtas, išskyrus sintetinį psichotropinį delta-9 THC, kuris intoksikuoja žmogaus organizmą. Sintetinis THC dažniausiai naudojamas kaip nelegalus narkotikas svaiginimuisi. Sintetinių kanabinoidų poveikis yra neaiškus. Jų sveikatinančios savybės yra mažai ištirtos ir trūksta duomenų apie jų poveikius [44].
Endokanabinoidinė sistema yra neseniai atrasta signalų perdavimo sistema, susidedanti iš kanabinoidų receptorių CB1 ir CB2, riebalinių ligandų, endokanabinoidų, tokių kaip N-arachidonoiletanolamidas (anandamidas) ir 2- arachidonoilglicerolis ir susijusių fermentinių pagalbinių komponentų (transporterių, biosintezės ir degradacijos fermentų). Išsėtinė sklerozė, nugaros smegenų pažeidimai, neuropatinis skausmas, vėžys, arterosklerozė, miokardo infarktas, hipertenzija, glaukoma, nutukimas/metabolinis sindromas ir osteoporozė yra keletas iš ligų, kurios susiję su sistemos pokyčiais, tuo pagrindžiant naujų gydymo strategijų, paremtų endokanabinoidų sistemos funkcijų atstatymu, kūrimą [17,27].
3. Pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) fitocheminė sudėtis.
Pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) vaisiuje - sėkloje yra maždaug 25% baltymų, 30% angliavandenių, 15% tirpių skaidulų, karotino, fosforo, kalio, magnio, sieros, kalcio, geležies ir cinko, taip pat vitamino E, C, B1, B2, B3, B6. Pluoštinėse kanapėse galima rasti biologiškai aktyvių junginių: flavonoidų glikozidų, flavonoidų, laktonų, steroidų, terpenų, cukrų, azoto turinčių junginių, glikoproteinų, rūgščių (sočiųjų ir paprastųjų) ir kt. [11] Kanapių sėklos yra vienas iš geriausių šaltinių nesočiųjų riebalų rūgščių - omega-3 linoleno rūgšties ir Omega-6-linolo rūgšties.
Remiantis tyrimais, pluoštinė kanapė (Cannabis sativa L.) savo sudėtyje turi apie 545 junginius, iš kurių 105 junginiai yra kanabinoidai [18]. Kanabinoidai – tai grupė cheminių junginių savo struktūroje turinčių 21 C atomą ir priskiriami terpenofenoliniams junginiams. Išradus sintetinius kanabinoidus (deksanabinolio, ajuleminės rūgšties ir kt.) ir atradus endogeninius kanabinoidus (anandamido, 2-arachidonoilglicerolio), kanabinoidai išgauti iš pluoštinės kanapės (Cannabis sativa
L.), vadinami fitokanabinoidais [19]. Pluoštinėje kanapėje reikšmingi penki augale rasti kanabinoidai
(2 pav.) [6].
2 pav. Reikšmingų kanabinoidų cheminės formulės Modifikuotas pav. iš A.Srivastava (2013)[6]
1. Tetrahidrokanabinolis (THC) - pagrindinis kanabinoidas, atsakingas už psichoaktyvų poveikį. Šis junginys yra lengvas analgetikas ir ląstelinis tyrimas parodė, kad pasižymi antioksidaciniu aktyvumu. Manoma, kad THC yra siejamas su neurotransmiteriu – anandamidu, kuris, manoma, dalyvauja skausmo pojūtyje, atminties ir miego procesuose [6,31].
2. Kanabidiolis (CBD). Nustatyta, kad kanabidiolis silpnina traukulius,uždegimus, nerimą, kosulį, pykinimą. Naujausi tyrimai parodė, kad kanabidolis yra toks pat veiksmingas kaip netipiniai antipsichoziniai preparatai šizofrenijos gydymui.[6,8]. Be to, žinoma, kad skydliaukės vėžys yra vienas dažniausių endokrininės sistemos piktybinių navikų. Atlikto tyrimo metu, nustatyta, kad CBD pasižymėjo antiproliferaciniu poveikiu. Šis efektas susijęs su ląstelių ciklo blokavimu G1/S fazės perėjime, o taip pat apoptozės sukėlimu [28].
3. Kanabidiolio rūgštis (CBDA). Rūgštinis kanabinoidas, kuris dekarboksilinimo būdu gali būti paverčiamas į neutralų junginį CBD [6,8].
4. Kanabinolis (CBN). Kanabinolis (CBN) yra terapinis kanabinoidas randamas pluoštinėje kanapėje (Cannabis sativa) ir indinėje kanapėje (Cannabis indica). Kanabinolis yra tetrahidrokanabinolio (THC) skilimo produktas. CBN veikia kaip silpnas CB1 ir CB2 receptorių agonistas,tik mažesnis afinitetas, palyginti su THC [6].
5. β-kariofilenas. Atlikto tyrimo metu nustatyta, kad pluoštinės kanapės junginys β-kariofilenas mažina audinių uždegimą. Buvo įrodyta, kad šis kanabinoidas yra selektyvus CB2 receptorius. β -kariofileno randama 12-35% pluoštinių kanapių eteriniame aliejuje [6].
2014 m. atliktu bandymu su pelėmis nustatyta, kad β -kariofilenas gali būti taikomas gydant nerimą ir depresiją. Tyrimo rezultatai parodė, anksiolitinį ir antidepresinį β -kariofileno poveikį ir veikimo būdą per CB2 receptorius [37].
6. Kanabigerolis. Kaip kanabidiolis, kanabigerolis nėra psichoaktyvus. Manoma, kad kanabigerolis atpalaiduoja intraokulinį spaudimą, todėl šis kanabinoidas gali būti naudingas glaukomos gydymui [6].
3 pav. Biosintezės metu iš kanabigerolinės rūgšties (CBGA) gautų produktų ( CBDA, THCA) vykstant dekarbokslinimui gaunami kanabinoidai kanbidiolis(CBD) ir tetrahidrokanabinolis
( THC)
Schemos autorius Kayser O. ir kt.(2014) [22]
Labiausiai psichoaktyvus kanabinoidas žmogaus organizmui yra ∆-9tetrahidrokanabinolis (THC). Šis pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) komponentas ir jo biologinis aktyvumas, kaip ir sintetinių kanabinoidinių komponentų (sintetinių komponentų, veikiančių kanabinoidinius receptorius) pirmiausiai pasireiškia per CB1 ir CB2 receptorius [11,28]. Pagal ∆-9-tetrahidrokanabinolio (THC) kiekį kanapės skirstomos į 3 fenotipus:
• narkotikinio tipo, turinčios 1–20 proc. THC, gali veikti psichiką ( iš jų gaminami narkotikai marihuana ir hašišas);
• vidutinio tipo, turi 0,3–1,0 proc. THC, neveikia arba šiek tiek gali veikti psichiką;
• pluoštinio tipo, turi <0,3 proc.THC, psichikos neveikia, iš jų gaminamas pluoštas, maistinis aliejus [30].
∆-9-tetrahidrokanabinolio (THC) kintamas pasiskirstymas augalo dalyse: • 10-12 procentų moteriškuosiuose žieduose
• 1-2 procentų lapuose • 0,1-0,3 procento koteliuose • <0,03 procento šaknų [18,19].
Tetrahidrokanabinolio (THC) poveikį apsprendžia agonistinis veikimas kanabinoidų receptoriuose, kuris pasireiškia poveikiu į imuninę ir nervinę sistemas.Vienas iš mechanizmų, antiemetiniam THC poveikiui nulemti yra dėl dalinio poveikio į CB1 receptorius ir 5-HT3A receptorius [19]. Atlikto tyrimo metu vaikams, turintiems įvairių kraujo vėžio susirgimų buvo skiriamas THC (18 mg / m2 kūno svoriui) dvi valandas iki vaistų suleidimo nuo vėžio. Vaistas buvo ištirpinta kukurūzų arba alyvuogių aliejuje (6 mg / ml) ir vartojamas tiesiogiai ant maisto ar užlašinant ant liežuvio. Ta pati dozė buvo kartojama kas 6 val ir 24 val. Rezultatai parodė, kad pacientai išvengė vėmimo po antinavikinių preparatų panaudojimo, todėl leidžiama manyti, kad THC gali tapti nebrangiu antiemetiniu preparatu vėžio gydyme [29].
Bendras organizmo atsakas į THC poveikį :
• Psichika ir suvokimas. Nuovargis, nerimas, euforija, apsvaigimas,
atsipalaidavimas, sutrikę kūno judesiai. Vaistinės medžiagos efektas priklauso nuo dozės, tai didelės tetrahidrokanabinolio (THC) dozės sukelia į nerimą panašius efektus. Tačiau mažos šio kanabinoido dozės turi nerimą mažinantį poveikį.
• Širdies ir kraujagyslių sistema. Padidėja širdies susitraukimų dažnis, padidėja deguonies poreikis, vazodilatacija.
• Hormonų sistema. Įtakoja testosterono, prolaktino, somatotropino pokyčius, pagreitėja gliukozės skaidymas, mažina spermatozoidų skaičių ir spermos judrumą. • Kita: antinavikinis aktyvumas, slopinima DNR ir RNR sintezė. Vaisiaus smegenų
vystymosi pažeidimai, augimo sulėtėjimas. [20,43]
Pramonines kanapes nuo 1998 m. kovo 13 d. leista auginti Kanadoje, jos pasėtos 1998 metų vasarą. Įstatymu reglamentuota, jog pramoninės kanapės turi turėti mažiau kaip 0,3 % THC, t.y. net 10 kartų mažiau nei THC kiekis marihuaninėse kanapėse. Taip pat įstatymas nurodo, jog iš pramoninių kanapių pagamintuose maisto produktuose ir kosmetikoje THC koncentracija turi būti mažesnė nei 10 dalių vienam milijonui (ppm). Pagrindinis kanapių pluoštui ir sėkloms augintojas ES – Prancūzija – augina 54 % viso auginamo ploto, Vokietija – 11 %, Didžioji Britanija – 9 %, Lenkija
ir Italija – po 6 %, Ispanija – 4 %. Šiuo metu kanapių su mažu THC kiekiu auginimo plotai ES šalyse išlieka santykinai pastovūs – svyruoja apie 10-12,5 tūkst. ha. [1].
Kanabidiolis (CBD) vienas iš 105 aktyvių kanabinoidų randamų kanapėse. Tai vienas
pagrindinių fitokanabinoidų, kurio augalo ekstrakte randamas iki 40%. Medicinoje CBD taikomas plačiau negu tetrahidrokanabinolis (THC). Skirtingai nuo pagrindinio psichoaktyvaus kanabinoido (THC) CBD nesukelia euforijos. Euforijos poveikį THC sukelia jungdamasis su CB1 receptoriais. Kanabidiolis (CBD) turi labai mažą jungimąsi su šiais receptoriais (100 kartų mažesnis nei THC), todėl nesukelia organizmo atsako [45]. Kiekviename žmogaus organizme yra riebalų rūgštis - amido hidrolazė (FAAH), fermentas, ardantis neurotransmiterį anandamidą, kuris susijęs su motyvacija ir malonumu, o taip pat nervų vystymusi ankstyvose embriono stadijose. Kanabidiolis susilpnina FAAH veikimą, taip padidindamas anandamido kiekį, kuris veikia kanbinoidinius receptorius CB1, kurie koncentruojasi centrinėje nervų sistemoje. Be to, kanabidiolis stimuliuoja 2-AG gamybą- endokanabinoido, kuris veikia abu - CB1 ir CB2 receptorius. Šie receptoriai vaidina pagrindinį vaidmenį reguliuojant nuotaiką, apetitą, miegą ir uždegimo mažinimą. Dėl šios priežasties CBD gali sumažinti smegenų uždegimą, kuris susijęs su autoimuminėmis ligomis, kurios gali lemti neuronų riebalinio audinio pažeidimus. Kaip smegenų uždegimą mažinanti priemonė, CBD tinka gydyti neuropatinį skausmą, kurį sukelia somatosensorinė nervų sistema [46,47].
Remiantis tyrimų duomenis, nustatyta, kad kanabidiolis (CBD) pasižymi prieštraukuliniu poveikiu. Atliekamuose tyrimuose su gyvūnais norima suprasti pagrindinius mechanizmus ir optimizuoti sąlygas, pagal kurias CBD būtų taikomas epilepsijai gydyti [ 42, 33]. Tyrime, kuriame dalyvavo vaikai – atsparūs vaistiniams preparatams epilepsijai gydyti, nustatyta, kad vartojant kanabidiolį (CBD) 89 proc. pacientų pajuto mažesnį traukulių dažnį. Pastebėta, kad vaikai jautė didesnį budrumą, geresnę nuotaiką [41].
Atlikti tyrimai taip pat rodo, kad kanabinoidai ir opioidai pasižymi skirtingais mechanizmais siekiant sumažinti skausmą ir kad jų poveikis gali būti adityvus, o tai rodo, kad derinių terapija gali būti sukurta, sumažinant opioidų gydymo pavojų [10].
Tyrimai parodė, kad CBD žymiai sumažino nerimą ir diskomfortą, viešojo kalbėjimo metu, bei sumažino nerimą pavartojus tetrahidrokanabinolį. Rezultatai parodė, kad kanabidiolis gali būti efektyvus preparatas panikos sutrikimui, obsesiniam - kompulsinui sutrikimui ir potrauminiam stresui, gydyti [9].
2006 m. atliktas tyrimas parodė, kad CBD stipriai ir selektyviai sustabdė įvairių krūties vėžio ląstelių augimą. Manoma, kad kanabidiolis (CBD) susijęs su tiesiogine aktyvacija ir/ar netiesiogine aktyvacija, taip pat oksidacinio streso sukėlimu. Rezultai tap pat parodė, kad be proliferacijos, CBD taip pat susijęs su kitais esminiais krūties vėžio progresijos, invazijos ir metastazavimo etapais. Iš
trijų skirtingų testuotų kanabinoidų grupių (fitokanabinoidai, veikiantys CB1 ir CB2 receptorius, fitokanabinoidai, be pastebimo CB1 ir CB2 receptorių veikimo ir sintetiniai kanabinoidai, veikiantys CB1 ir CB2 receptorius), CBD buvo efektyviausias žmogaus krūties vėžio ląstelių proliferacijos mažintojas, analogiškai kaip THC, mažinant tam tikras vėžio ląsteles. Įdomu tai, kad CBD reguliuoja pagrindinių genų, susijusių su ląstelių proliferacija ir invazija raišką, per pagrindinių spiralės-kilpos-spiralės (angl. helix-loop-helix) transkripcijos faktorių mažinimą, kurių per didelė raiška lemia krūties vėžio ląstelių proliferaciją, migraciją ir invaziją. Todėl gebėjimas sumažinti ląstelių ekspresiją krūties vėžio ląstelėse yra tiesiogiai susiję su vėžio agresyvumo mažinimo efektyvumu [32,43].
Kanabidiolinė rūgštis yra cheminis junginys, randamas pluoštinių kanapių liaukuose (trichomuose). CBDA yra kanabidiolio (CBD) pirmtakė. Kanabidiolinė rūgštis yra neaktyvus junginys, veikiant šviesai ar temperatūrai, virsta į kanabidiolį ( CBD).
Kanabidiolinė rūgštis (CBDA) pasižymi šiais poveikiais:
• Antibakterinis: CBDAkovoja ir stabdo bakterijų augimą, įskaitant tokias ligas, kaip ausų infekcijos, gonoreja, meningitas [25].
• Anti-emetinis: CBDA padeda sumažinti ir net pašalinti pykinimą ir vėmimą [12]. • Priešuždegiminis: CBDA padeda sumažinti uždegimą, ypač sergant tokiomis ligomis
kaip artritas ir Krono liga [40].
4. Kanabinoidų kiekybiniai ir kokybiai nustatymo metodai
Augalo morfologinės savybės ir kitimas priklauso nuo sėklų padermės, taip pat aplinkos veiksnių tokių kaip šviesos, vandens, maistinių medžiagų kiekio ir temperatūros. Pluoštinę kanapę (Cannabis sativa L.) galima atpažinti pagal mikroskopines struktūras ant augalo paviršiaus, pagal trichomas t.y. plaukeliai - ,, iškyšuliai“ iš augalo ląstelių epidermio ( 4 paveikslas). Trichomos gali būti aptiktos apatinėje lapo dalyje, žieduose, pažiedėse. Mikroskopavimo metu matosi trichomos kotelis bei sekrolitinė viršūnėle. Taip pat atliekant mikroskopinę analizę, pluoštinės kanapės žaliava gali turėti kalcio karbonato kristalų. [6,24]
4 pav. Mikroskopinė pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) trichomų nuotrauka Paveikslo autorius Kayser O. ir kt.(2014)[5]
Tapatybės testai nurodo tiriamojoje medžiagoje esančių medžiagų galimybę.
Vienas iš būdų yra greitasis ,, Corinth V salt“ testas. Jo metu naudojant skirtingus reagentus ant filtravimo popieriaus, kuriame įdėta tiriamoji medžiaga, atsiranda violetiškai raudonos spalvos dėmės, kurios leidžia suprasti THC, CBN buvimą tirtoje žaliavoje.
Taip pat greitas Duquenois-Levine bandymas, kuriuo metu, naudojant tam tikrus reagentus nurodytus metadologijoje, gaunamas naudoto trichlormetano sluoksnis violetinės spalvos, kuris patvirtina kanabinoidų galimumą medžiagoje [16]. Kanabinoidų tapatybės nustatyme gali būti naudojama efektyvioji plonasluoksnė chromatografija bei branduolio magnetinio rezonanso spektroskopija [24].
Taip pat taikomas kanabidiolio tapatybės nustatymas plonasluoksnės chromatografijos metodu, UNODC (2009) [24] rekomendacijomis. Analizės tyrimo metu, užnešamas ekstraktas bei standartinis kanabidiolio tirpalai ant chromatografinės plokštelės naudojant CAMAG linomat 5 pusiau automatinį mėginių užnešėją. Nuo chromatografavimo plokštelės apačios, pradžios linija buvo 20 mm, tarpai tarp mėginių uždėjimo juostų – 28 mm, mėginio atstumas nuo
chromatografinės plokštelės krašto – 30 mm, finišo linija – 10 cm nuo starto linijos.
Mobilios fazės sudėtis plonasluoksnės chromatografijos analizėje buvo metanolis : vanduo santykiu 75:25 (v/v), bei 0,1% koncentruota acto rūgštis. Į prisotintą chromatografavimo kamerą CAMAG buvo dedama chromatografinė plokštelė su užneštais standarto ir ekstrakto mėginiais ir laukiama, kol tirpiklių sistema užkils iki pabaigos linijos. Vėliau chromatografinė plokštelė traukos spintoje džiovinama nustatytoje temperatūroje.
Atliktas chromatografinės plokštelės ryškinimo optimizavimas Fast blue salt B reagentu. Ryškinant su Fast blue salt B CBD nusidažo oranžinė spalva.
Vykdant ryškinimą chromatografinės plokštelės buvo apipurškiamos ryškinimo reagentu. Kanabidiolio tapatybė patvirtinama aptikus oranžinės spalvos dėmes, kurių Rf reikšmės sutapo su CBD standartinio tirpalo reikšme.
Galimi pluoštinės kanapės ( Cannabis sativa L.) kiekybinės analizės metodai:
• Efektyvioji skysčių chromatografija – tai chromatografijos metodas, naudojamas mišinių junginiams atskirti,kuriuo remiantis skirtingomis junginių sulaikymo trukmėmis, kai judria faze (eliuentu), kurioje būna ištirpęs tiriamasis medžiagų mišinys, pereina per sorbentą kolonėlėje. Visas mišinio atskyrimas vyksta dėl skirtingos fizikinės – cheminės sąveikos su nejudria ir judria fazėmis. Chromatografinę analizę sudaro bandinio įleidimas, skirstymas, atskirų analičių detekcija ir gautų duomenų apdorojimas bei įvertinimas. Šis metodas yra greitas, ekonomiškas, nes galima aptikti ir išskirti mažus medžiagų kiekius, todėl ypač taikomas kiekybiniam identifikavimui [2,5].
5 pav. Efektyvios skysčių chromatografijos analitinė sistema. Ivinska O. (2016)[2]
• Skysčių chromatografijos metodas tinkamas nustatinėjant rūgštinius ir neutralius kanabinoidus, tiriant bendrą jų kiekį ir pavienius junginius. Gauti rezultatai lengviau nustatomi dėl išvengiamo kanabinoidų dekarbokslinimo[5,24].
• Dujų chromatografija taikoma analizėje kartu su liepsnos jonizacijos ar masių
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – Lietuvoje auginamų, pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) žiedai ir žiedadulkės veislių: FENILA, FINOLA, SEQUENY JUBILEJUM, USO, BALOBZEVSKY,
CARMAGNOLA, VIRTUS, TISZA
Augalinė žaliava buvo renkama pasirenkant atsitiktinį augalą. Mėginiai buvo surinkti žydėjimo laikotarpyje Molėtų rajone.
2.1.1. Pluoštinės kanapės mėginių džiovinimas ir išdžiovintos žaliavos kokybės vertinimas Surinkta augalinė žaliava buvo džiovinama gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių, kambario temperatūroje, paskleidžiant augalinės žaliavos mėginius plonu sluoksniu. Išdžiovinta augalinė žaliava buvo laikoma sausoje, gerai vėdinamoje vietoje, ne aukštesnėje kaip 25 0C temperatūroje.
Sudžiovintos žaliavos kokybė buvo vertinama vizualiai ir pagal drėgmės kiekį. Tyrimams buvo naudojama žaliava, kurios drėgmės kiekis neviršijo 15% [18].
2.2. Reagentai
Naudojami reagentai tyrimams atlikti:
• Acetonitrilas (≥99,9%, Sigma-Aldrich, Izraelis). • Metanolis (≥99,8% Sigma-Aldrich, Izraelis).
• Trichlormetanas (≥99% Sigma-Aldrich, Missouri, JAV), • Kanabidiolis (99,8% THC Pharm, Germany).
• Kanabidiolio rūgštis ( ≥95% Sigma – Aldrich, JAV) • Distiliuotas vanduo
2.3. Aparatūra
Augalo ekstrakte atskirti kanabidiolį bei kanabidiolio rūšgtį buvo naudojamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodo Waters 2695 atskyrimo modulis (Milford, JAV). Kolonėlė YMC, kurios ilgis 150mm, vidinis diametras 4,6 mm,sorbento dalelių dydis 3 µm. Detekcija buvo vykdoma naudojant fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 (Milford, JAV).
Ekstrakcijai, norint nustatyti kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties koncentracijas mėginyje, buvo naudojama ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Ohio, JAV).
Išdžiovintos žaliavos vertinimui ir tiksliam pasiruošimui, buvo naudojama aparatūra:
• Drėgmės kiekis buvo įvertintas naudojant DBS (KERN) v1.0 moisture analyser (Balingen,
Vokietija) prietaisą.
• Vandens gamybai buvo naudojama MILIPORE (Darmstadt, Vokietija) vandens gryninimo sistemą.
• Žaliavos malimui buvo naudojamas D-47906 Clatronic (Kempen, Vokietija) laboratorinis malūnėlis.
• Medžiagų pasvėrimui buvo naudojamos Shimadzu AUW120D (Duisburg, Vokietija) svarstyklės.
2.4. Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) mėginių paruošimas ekstrakcijai.
Augalinė žaliava buvo susmulkinama laboratoriniu malūnėliu. Smulkinimo laikas buvo apie 1 minutes. Susmulkinus žiedus, žiedadulkes buvo gaunami atskyri miltelių konsistencijos mėginiai, kuriuose nebuvo matoma heterodispersinių dalelių.
2.5. Pluoštinių kanapių ( Cannabis sativa L.) ekstraktų ruošimas ESC analizės
metodui norint įvertinti kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties koncentracijas.
Pluoštinių kanapių ( Cannabis sativa L.)ekstraktų ruošimas ESC analizės metodui buvo atliekamas remiantis ElSohly M. ir kt. (2013) monografija [18].
Prieš ekstrakciją buvo paruošiamas ekstrahentas sumaišant 9 dalis metanolio ir 1 dalį trichlormetano. Ant aliuminio folijos buvo atsveriama 200 mg susmulkintos žaliavos, kuri buvo suberiama į 10ml tūrinę kolbutę, po to paruoštas ekstrahentas užpilamas iki žymos. Kolbutė buvo užkemšama plastikiniu kamščiu ir dedama į ultragarso vonią 30 minučių. Gautas ekstraktas buvo filtruojamas pro Albet 400 (Dublinas, Airija) filtravimo popierių (porų dydis 38-43 µm) į tamsaus
stiklo buteliuką. Nufiltruotas ekstraktas buvo filtruojamas pro 0,45 µm filtrą į chromatografijai skirtus buteliukus. Ekstrakcija buvo atliekama po 3 kartus naudojant skirtingus, vienodos masės žaliavos svėrinius.
2.6. Kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties kiekybinis ir kokybinis įvertinimas
(Cannabis sativa L.) ekstraktuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Kiekybinis ir kokybinis įvertinimas ekstraktuose buvo vykdomas efektyviosios skysčių chromatografijos būdu. Chromatografavimo sąlygos buvo pasirinktos remiantis UNODC (2009) rekomendacijomis [24]. ESC analizės parametrai pateikti 1 lentelėje. Eliuentų kiekybinės sudėties kitimo priklausomybė nuo laiko pateikta 2 lentelėje
1 lentelė. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) analizės parametrai ir jų reikšmės
Parametras Reikšmė
Eliuentai A – acetonitrilas, B – skruzdžių rūgštis (0,1 proc.)
Eliucijos rėžimas Gradientinis
Tekmės greitis 1ml/min
Injekcijos tūris 10 µl
Temperatūra kolonėleje 50 o C
2 lentelė. Gradientinis eliuentų tėkmės kitimas
Laikas (min) A tirpalas (proc.) B tirpalas (proc.)
0 25 75
6 0 100
9 0 100
Kanabidiolio (CBD) ir kanabidiolio rūgšties (CBDA) koncentracijos buvo apskaičiuojama remiantis gradavimo grafikais. Gradavimo grafikai buvo sudaryti iš pagaminto kanabidiolio standartinio metanolinio tirpalo, bei kanabidiolio rūgšties standartinio metanolinio tirpalo.
Gautos kalibracinės kreivės formulės : CBDA - Y=1.68*103x+9.71*102 CBD - Y=2.08*103 x+1.02*103
kai y – chromatografinės smailės plotas, x- kanabidiolio/ kanabidiolio rūgšties koncentracija išreikšta µg/ml.
2.7. Statistinė duomenų analizė
Duomenys buvo apdorojami naudojant statistinius duomenų analizės paketą Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV), ESC duomenys apdoroti Empower 2 programinio paketo pagalba. Kiekybinio nustatymo eksperimentai kartoti tris kartus, o rezultatai išreikšti vidurkiais ± standartine išraiška. Pasirinktas reikšmingumo lygmuo α = 0,05
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Remiantis atliktu tyrimu, I.Popos magistro baigiamuoju darbu (2015) [4], kiekybiniui ir kokybiniui kanabidiolių įvertinimui buvo pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Skirtingai, nei atliktame tyrime, naudota kita kolonėlė ( YMC), įvestas gradientinis kitimas, naudota kita tirpiklių sistema, kolonėlės temperatūra, dėl to atlikta metodikos validacija. Kanabidiolio bei kanabidiolio rūgšties kokybinis nustatymas buvo įvertintas pagal sulaikymą kolonėlėje ir gauti spektriniai duomenys buvo lyginami su standartiniais duomenimis.
3.1. Metodikos validacija
Metodikos tinkamumas įrodomas ją validuojant. Remiantis ICH (International Conference on
Harmonisation) analitinių procedūrų validacijos gairėmis buvo pasirinkti ir įvertinti šie parametrai
[45]:
1. Specifiškumas (angl. Specificity)
2. Rezultatų glaudumas (angl. Precision): rezultatų pakartojamumas (angl. Repeatability); rezultatų tarpinis preciziškumas (angl. Intermediate Precision)
3. Tiesiškumas (angl. Linearity)
4. Ribos (angl. Range) aptikimo riba (angl. Limit of detection) nustatymo riba (angl. Limit of quantitation)
3.1.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos kiekybinio metodo validacija
3.1.1.1.Specifiškumas
Vertinant specifiškumą buvo lygintos standartinio tirpalo ir analizuojamų tirpalų chromatogramos bei smailių sulaikymo laikai. Chromatogramose matoma, kad pagal sulaikymo laiką standartinio tirpalo bei tiriamojo tirpalo smailės sutampa, todėl galima teigti, kad metodas specifiškas (6pav.).
A
B
6 pav. A – CBDA ir CBD standartinio tirpalo chromatograma; B – CBDA ir CBD tiriamajame tirpale chromatograma (λ = 270,0 nm)
3.1.1.2. Glaudumas
Glaudumas yra nustatomas vertinant metodikos pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą. Pakartojamumas įrodomas nustatytomis sąlygomis atliekant kelis to pačio mėginio matavimus ir apskaičiavus santykinį standartinį nuokrypį (SSN). Nustatytas kanabidioliui SSN sulaikymo laikui (proc.) = 0,5.
Tarpinis preciziškumas įrodomas nustatytomis sąlygomis naudojant tą patį mėginį ir atliekant analizę dvi dienas iš eilės. Po dviejų bandymų apskaičiuotas CBDA SSN sulaikymo laikui (proc.) = 1,2, o CBD = 1,0 (proc.).
Įvertinus ESC metodo pakartojamumo ir tarpinio preciziškumo gautus santykinio standartinio nuokrypio rezultatus galima teigti, kad metodas atitinka glaudumo reikalavimus ir yra tinkamas kiekybiniam kanabidiolių nustatymui tiriamuosiuose tirpaluose.
3.1.1.3. Tiesiškumas
Norint įrodyti tiesiškumą yra sudaromas gradavimo grafikas. Jam sudaryti buvo naudojamas standartinis kanabidiolio tirpalas. Iš gautos kalibracinės kreivės matoma, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška (7,8 pav.).
8 pav. CBD kalibracinis grafikas
Norint įvertinti tiesiškumą, koreliacijos koeficientas (𝑅2) turi būti kuo artimesnis vienetui. Analizuojamo CBDA gradavimo grafiko koreliacios koeficientas 𝑅2 = 0,999970, o CBD gradavimo grafiko koreliacijos koeficientas 𝑅2= 0,999889. Remiantis šiuo rodikliu galima teigti, kad metodas
atitinka tiesiškumo parametrus.
3.1.1.4.Aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba yra apibūdinama kaip mažiausias medžiagos kiekis, kuris aptinkamas mėginyje. Nustatymo riba – mažiausias medžiagos kiekis, kuris gali būti kiekybiškai įvertintas [45]. ESC metodo validacijos metu nustatytos kanabidiolių aptikimo ir nustatymo ribos:
• CBD aptikimo riba – 0,8 µg/ml; • CBD nustatymo riba – 1,5 µg/ml; • CBDA aptikimo riba – 0,5 µg/ml; • CBDA nustatymo riba – 1,0 µg/ml;
3.2. Kanabidiolio kiekio įvairavimo nustatymas.
Potencialius junginius, tokius kaip kanabidiolį (CBD) galima gauti iš kanapių trichomų, kanabidiolio rūgšties biotransformacijų, naudojant grybelines, bakterines ar augalų ląsteles. Kananbidolis (CBD) sudaro iki 40% pluoštinės kanapės augalo ekstraktų. Tačiau CBD koncentracijos yra labai skirtingos ir priklauso nuo augimo sąlygų, skirtingų veislių ir analizuojamos augalo dalies [8].
Vertinant pluoštinės kanapės ( Cannabis sativa L.) žaliavą – žiedus, nustatyta, kad didžiausia kanabidiolio koncentracija (0,068mg/g ± 0,011) yra FINOLA veislės žieduose, kuri 8,5 karto didesnė, nei mažiausią reikšmę kaupiančioje SEQUENY JUBILEJUM veislės žaliavoje (0,008mg/g ± 0,001) (p> 0,05). Kanabidiolio koncentracijos kitimas pateiktas 9 paveiksle.
9 pav. CBD koncentracijos kitimas pluoštinių kanapių žieduose (SSN ≤ 7,88%, n = 3)
Nustačius kanabidiolio (CBD) koncentracijos variacijas žiedadulkėse skirtingose veislėse, galima teigti, kad didžiausia kanabidiolio koncentracija FINOLA veislės žiedadulkėse (0,570mg/g ±0,011 ). Įvertinus gautus rezultatus, nustatyta, kad pluoštinės kanapės veislės SEQUENY JUBILIEJUM žiedadulkėse yra mažiausias (0,017mg/g ± 0,005) kanabidiolio kiekis, tačiau nustatytos reikšmės yra statistiškai nereikšmingos ( p>0,05). Kanabidiolio kiekio įvairavimas žiedadulkėse pavaizduotas 10 paveiksle.
0,068±0,011 0,008±0,001 0,025±0,009 0,012±0,002 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 0,070 0,080
FINOLA žiedai SEQUENY
JUBILEJUM žiedai
BALOBZEVSKY žiedai USO žiedai
C B D k once nt rac ij a m g /g
10 pav. Kanabidiolio koncentracijos kitimas pluoštinių kanapių žiedadulkės ( SSN ≤ 6,74 %, n = 3)
Kanabidiolio (CBD) kiekio įvairavimas sėjamųjų kanapių veislių žiedų bei žiedadulkių mėginiuose. Didžiausia kanabidiolio koncentracija nustatyta FINOLA veislės žiedadulkėse (0,570mg/g ± 0,011). Didesni kiekiai nustatyti FENILA veislės (0,216mg/g ± 0,014) bei BALOBZEVSKY veislės ( 0,374mg/g ± 0,012) žiedadulkėse. Mažiausia koncentracija nustatyta SEQUENY JUBILEJUM veislės žieduose (0,008mg/g ± 0,001) ( p>0,05). Kanabidiolio kiekio įvairavimas augalinėse žaliavose pavaizduotas 11 paveiksle.
0,216±0,014 0,570±0,011 0,017±0,005 0,073±0,011 0,374±0,012 0,080±0,010 0,174±0,0150,156±0,016 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 C B D k oncentr aci ja m g /g
11 pav. Kanabidiolio koncentracijos kitimas skirtingose pluoštinių kanapių veislėse ( SSN ≤ 7,62%, n =3 )
3.3. Kanabidiolio rūgšties kiekio įvairavimo nustatymas.
Fitokanabinoidai kaupiasi liaukų trichomų sekretorinėje ertmėje, kurios dažniausiai pasitaiko moteriškose pluoštinės kanapės žieduose. Jie taip pat aptikti kitose augalo dalyse, įskaitant sėklas [34] šaknis [39] ir žiedadulkes [35]. Be to, šių junginių koncentracija priklauso nuo augalo amžiaus, veislės, augimo sąlygų (mitybos, drėgmės, šviesos lygio) [34].
Vertinant pluoštinės kanapės žaliavą – žiedus, nustatyta, kad didžiausia kanabidiolio rūgšties (CBDA) koncentracija (16,550mg/g ± 0,012) yra FINOLA veislės žaliavos mėginiuose. Mažiausias CBDA kiekis nustatytas USO veislės žieduose (1,182 mg/g ± 0,022 ). Statistiškai reikšmingų skirtumų nėra (p> 0,05). Kanabidiolio rūgšties koncentracijos kitimas pateiktas 12 paveiksle. 0,216±0,014 0,068±0,011 0,570±0,011 0,008±0,001 0,017±0,005 0,012±0,002 0,073±0,011 0,025±0,009 0,374±0,012 0,080±0,010 0,174±0,0150,156±0,016 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 Konc entra cij a m g /g
12 pav. CBDA koncentracijos kitimas pluoštinių kanapių žieduose ( SSN ≤ 7,56 %, n = 3)
Įvertinus CBDA koncentracijos variacijas žiedadulkėse skirtingose veislėse, galima teigti, kad didžiausia nustatyta kanabidiolio rūgšties koncentracija BALOBZEVSKY veislės žiedadulkėse ( 66,178mg/g ± 0,013). Mažiausias kanabidiolio rūgšties kiekis yra SEQUENY JUBILIEJUM veislės žiedadulkėse (7,702mg/g ± 0,022), tačiau nstatytos reikšmės yra statistiškai nereikšmingos (p> 0,05). Kanabidiolio rūgšties koncentracijos kitimas pateiktas 13 paveiksle.
13 pav.CBDA koncentracijos kitimas pluoštinių kanapių žiedadulkėse ( SSN ≤ 6,85%, n =3 ) 16,550±0,012 3,800±0,021 8,987±0,018 1,182±0,022 0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 14,000 16,000 18,000
FINOLA žiedai SEQUENY JUBILEJUM
žiedai BALOBZEVSKY žiedai USO žiedai
C B D A k oncentr aci ja m g /g
Pluoštinių kanapių veislės
51,171±0,014 65,217±0,016 7,702±0,02210,521±0,017 66,178±0,013 12,860±0,017 47,535±0,015 27,486±0,018 0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 C B D A k oncentr aci ja m g /g
Kanabidiolio rūgšties (CBDA) kiekio įvairavimas sėjamųjų kanapių veislių žiedų bei žiedadulkių mėginiuose. Didžiausias kanabidiolio rūgšties kiekis nustatytas BALOBZEVSKY veislės žiedadulkėse ( 66,178 mg/g ± 0,013). Mažiausias kiekis CBDA nustatytas USO veislės žieduose ( 1,182mg/g ±0,022) (p> 0,05). Kanabidiolio rūgšties kiekio įvairavimas augalinėse žaliavose pavaizduotas 14 paveiksle.
14 pav. CBDA koncentracijos kitimas skirtingose pluoštinių kanapių veislėse. (SSN ≤ 7,21%, n=3 ) 51,171±0,014 16,550±0,012 65,217±0,016 3,800±0,021 7,702±0,022 1,182±0,022 10,521±0,017 8,987±0,018 66,178±0,013 12,860±0,017 47,535±0,015 27,486±0,018 0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 K onc entr ac ija m g /g
3.4. Kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties kiekių vidurkis pluoštinės kanapės
(Cannabis sativa L.) žaliavose
Kanabinoidai klasifikuojami į dvi rūšis: neutralūs kanabinoidai ir kanabinoidinės rūgštys, priklausomai nuo to, ar jie turi karboksilo grupę, ar ne. Žinoma, kad šviežioje augalo žaliavoje neutralių kanabinoidų koncentracija yra daug mažesnė nei kanabinoidų rūgščių koncentracija. Taigi THC ir CBD yra iš rūgščių pirmtakių - tetrahidrokanabinolio rūgšties (THCA) ir kanabidiolio rūgšties (CBDA), nefermentinio dekarboksilinimo produktai [45].
Nustačius kanabidiolio (CBD) ir kanabidiolio rūgšties (CBDA) vidurkį pluoštinės kanapės ( Cannabis sativa L.) žaliavose, galima teigti, kad analizuotose žaliavose vidutiniškai CBD kiekis buvo 0,52 ± 0,012 proc., o CBDA kiekis 99,48 ± 0,017proc. Įvertinus CBD ir CBDA procentinę sudėtį nustatytas statistiškai reikšmingas (p = 0,001) skirtumas. Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, kad augalinės žaliavos kaupia ženkliai skirtingus kanabinoidų kiekius. Procentinis kanabidiolio ir kanabidiolio rūgšties kiekių įvairavimas augalinėse žaliavose pavaizduotas 3 lentelėje.
3lentelė. Procentinis CBD ir CBDA kiekių vidurkis pluoštinėse kanapės (Cannabis sativa L.) veislėse ( SNN ≤ 4,8%, n= 3)
Veislė/augalinė žaliava CBD kiekis % CBDA kiekis %
FINILA žiedadulkės 0,43 ±0,014 99,57 ± 0,014 FINOLA Žiedai Žiedadulkės 0,41 ± 0,011 0,86 ± 0,011 99,59 ± 0,012 99,14 ± 0,016 SEQUENY JUBILEJUM Žiedai Žiedadulkės 0,21 ± 0,001 0,22 ± 0,005 99,79 ± 0,021 99,78 ±0,022 USO Žiedai Žiedadulkės 1,01 ±0,002 0,68 ± 0,011 98,99 ± 0,022 99,31 ±0,017 BALOBZEVSKY Žiedai Žiedadulkės 0,28 ± 0,009 0,56 ± 0,010 99,72 ±0,018 99,43 ± 0,013 CARMAGNOLA žiedadulkės 0,62 ± 0,017 99,38 ± 0,017 VIRTUS žiedadulkės 0,37 ± 0,015 99,63 ± 0,015 TISZA žiedadulkės 0,57 ± 0,016 99,43 ± 0,018 Vidurkis: 0,52 ± 0,012 99,48 ± 0,017
4. IŠVADOS
1. CBD ir CBDA kokybiniam ir kiekybinaim įvertinimui pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) žiedų bei žiedadulkių mėginiuose parinkta tinkamiausia ESC metodika bei atlikta jos validacija. Visi validavimo parametrai atitiko jiems keliamus reikalavimus.
2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinus kanabidiolio koncentraciją skirtinguose pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) veislėse nustatyta, jog didžiausia CBD koncentracija yra FINOLA veislės žieduose (0,068 mg/g) bei žiedadulkėse (0,570mg/g). Taip pat nustatyta didžiausia kanabidiolio rūgšties koncentracija BALOBZEVSKY veislės žiedadulkėse ( 66,178mg/g) bei FINOLA veislės žieduose (16,550mg/g).
3. Nustačius kanabidiolio (CBD) ir kanabidiolio rūgšties (CBDA) vidurkį pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) žaliavose, galima teigti, kad analizuotose žaliavose vidutiniškai CBD kiekis buvo 0,52 ± 0,012 proc., o CBDA kiekis 99,48 ± 0,017proc. Atliktais tyrimais nustatyta, kad CBDA yra vyraujantis kanabinoidas analizuotose kanapės augalinėse žaliavose. Įvertinus CBD ir CBDA procentinę sudėtį nustatytas statistiškai reikšmingas (p = 0,001) skirtumas.
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Atlikto tyrimo metu validuota ESC metodika yra tinkama įvairių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) veislių tyrimams, norint įvertinti CBD ir CBDA kokybinius ir kiekybinius parametrus.
Remiantis atliktu tyrimu, Lietuvoje auginamos pluoštinės kanapės ( Cannabis sativa L.) veislės BALOBZEVSKY žiedadulkės kaupia didžiausią kanabidiolio rūgšties kiekį, todėl šią veislę rekomenduoja auginti tuo atveju, jei žaliavoje reikalingas didelis šio kanabinoido kiekis.
LITERATŪRA
1. Gruzdevienė E. Tetrahidrakanabinolio dinamikos tyrimai sėjamosios kanapės pluoštinių veislių augaluose ontogenezės eigoje Lietuvos sąlygomis. Upytė, 2011; p. 6
2. Ivinska O. Flavonolių nustatymas maisto papilduose skysčių chromatografijos metodu. Magistrinis baigiamasis darbas. Vilnius, 2016; p. 20, p.18;
3. Markevičiūtė G. Cannabis sativa l. Morfogenezės indukcija in vitro. Magistro baigiamasis darbas. Kaunas, 2013. p. 15;
4. Popa I. Lietuvoje kultivuojamos pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) ekstrakto antioksidacinio aktyvumo ir kanabidiolio dinamikos įvertinimas. Magistro baigiamasis darbas. Kaunas, 2015; p.23-24
5. Aizpurua A. O, Omar J, Navarro P, Olivares M, Etxebarria N, Usobiaga A. Identification and quantification of cannabinoids in Cannabis sativa L. plants by high performance liquid chromatography-mass spectrometry. Spain, 2014; 406(29):7549-60;
6. Ankit Srivastava and Yadav VK. Microscopical and Chemical Study of Cannabis sativa. India, 2013; doi 10.4172/2157-7145.1000210;
7. Baker D, Pryce G, Davies WL, Hiley CR. In silico patent searching reveals a new cannabinoid receptor. Trends Pharmacol Sci 2006;27(1):1-4.
8. Bergamaschi MM, Queiroz RH, Alexandre J, Crippa S, Zuardi W. Safety and Side Effects of Cannabidiol, a Cannabis sativa Constituent. Brazil,2011; 36(6): 1219–1226;
9. Blessing EM, Steenkamp MM, Manzanares J, Marmar CR. Cannabidiol as a Potential Treatment for Anxiety Disorders. Neurotherapeutics. Spain, 2015;12(4):825-36
10. Bradford A.C., Bradford W.D. Medical marijuana laws reduce prescription medication use in medicare part d. Health Affairs. 2016; 230-1236;
11. Brenneisen R. Chemistry and Analysis of Phytocannabinoids and Other Cannabis Constituents. New Jersey, 2009;p. 17-29;
12. Bolognini D, Rock E.M, Cluny N.L, Cascio M.G,Limebee C.L r, Duncan M, Stott C.G,Javid F.A, Parker L.A, and Pertwee R.G. Cannabidiolic acid prevents vomiting in Suncus murinus and nausea-induced behaviour in rats by enhancing 5-HT1A receptor activation. UK, 2013;
168(6):1456-70;
13. Butrica G, James L. The Medical Use of Cannabis Among the Greeks and Romans. Journal of Cannabis Therapeutics. 2006;p.55-59
14. Craker L, Grinspoon L. History of Cannabis as a Medicine. DEA statement, United States, 2005; 2-4;
15.Cristiana MVM, Cattivelli L, Ranalli P, Mandolino G. The sexual differentiation of Cannabis
sativa L.: a morphological and molecural study. Euphytica. 2004; 140:95-106
16. Cole M. D. The Analysis Of Drugs Of Abuse: An Instruction Manual– An Instruction Manual. Britain, p. 41-42;
17. ElSohly M. Grotenhermen F, Russo E. Cannabis and cannabinoids. Pharmacology, toxicology, and therapeutic potential. Binghamton/New York: Haworth Press, 2002. p. 27-36.
18. ElSohly M, Chandra S, Lata H, Williamson E, Upton R, Slade D. Cannabis inflorescence. American Herbal Pharmacopoeia; 2013.
19. Husni A.S, Cutler S.J. Phytocannabinoids. USA. 2012; 276-277;
20. Hausman A, Guerriero A. Cannabis sativa: The Plant of the Thousand and One Molecules. Luxembourg,2016; doi: 10.3389/fpls.2016.00019;
21. Izzo A.A, Borrelli F, Capasso R, Marzo V, Mechoulam R. Non-psychotropic plant cannabinoids: new therapeutic opportunities from an ancient herb. Italy, 2009; (10):515-27;
22. Kayser O, Kolodziej H. Cannabinoids production in Cannabis sativa L.: An in vitro approach. Dortmund, 2014; p.3-4,p.9-12;
23. Kazuyoshi FTS, Yoshikai ST, Morimoto S. Cannabidiolic-acid synthase, the chemotype-determining enzyme in the fiber-type Cannabis sativa. Japan, 2007; doi:10.1016/j.febslet.2007.05.043;
24. Laboratory and Scientific Section United nations office on drugs and crime Vienna. Recommended Methods for the Identification and Analysis of Cannabis and Cannabis Products. New York, 2009; p.27; p. 36;
25. Leizer C, Ribnicky D, Poulev A, Dushenkov S, Raskin I. The Composition of Hemp Seed Oil and Its Potential as an Important Source of Nutrition. 2004; p. 36-37;
26.Madras B. K. Update of Cannabis and its medical use. Belmont, 2015; 4-5;
27. Marzo V, De Petrocellis L. Plant, synthetic, and endogenous cannabinoids in medicine. Annu Rev Med 2006;57:553-74.
28. Massi P, Solinas M, Cinquina V, Parolaro D. Cannabidiol as potential anticancer drug. Italy, 2012; 75(2): 303–312.
29. Mechoulam R., L Hanu. The cannabinoids: An overview. Therapeutic implications in vomiting and nausea after cancer chemotherapy, in appetite promotion, in multiple sclerosis and in neuroprotection. Pain Res Manage 2001;6(2):67-73.
30. Pacifico D, Miselli F, Micheler M, Carboni A, Ranalli P, Mandolino G. Genetics and Markerassisted Selection of the Chemotype in Cannabis sativa L. Molecular Breeding, 2006; 17(3): 257–268.
31. PaciWco D., F. Miselli, A. Carboni, A. Moschella · G. Mandolino. Time course of cannabinoid accumulation and chemotype development during the growth of Cannabis sativa L. Italy, 2007;140:95-106;
32. Parolaro D, Massi P, Solinas M, Cinquina V. Cannabidiol as potential anticancer drug. Busto Arsizio (VA), Italy,2012; 75(2): 303–312;
33. Pickut BA ,Van Hecke W, Kerckhofs E, Mariën P, Vanneste S, Cras P, Parizel PM. Mindfulness based intervention in Parkinson's disease leads to structural brain changes on MRI: a randomized controlled longitudinal trial. Belgium, 2013; 115(12):2419-25;
34.Ross SA, Mehmedic Z, Murphy TP, Elsohly MA. GC-MS analysis of the total delta9-THC content of both drug- and fiber-type cannabis seeds. USA, 2000; (8):715-7;
35. Ross SA, ElSohly MA, Sultana GN, Mehmedic Z, Hossain CF, Chandra S. Flavonoid glycosides and cannabinoids from the pollen of Cannabis sativa L. USA, 2005; 16(1):45-8;
36. Russo E, Lynn M, Byrne A, Velin R, Bach P. J, Juan S.R, Kirlin A.Chronic Cannabis Use in the Compassionate Investigational New Drug Program. 2002; p. 3-6;
37.Schier M, Ribeiro O, Coutinho S, Antidepressant-like and anxiolytic-like effects of cannabidiol: a chemical compound of Cannabis sativa. Rio de Janeiro. 2014;13(6):953-60
38. Starowicz K, Malek N, Przewlocka B. Cannabinoid receptors and pain. Krakow, Poland; 2013, 2:121–132.
39. Stout JM, Boubakir Z, Ambrose SJ, Purves RW, Page JE.The hexanoyl-CoA precursor for cannabinoid biosynthesis is formed by an acyl-activating enzyme in Cannabis sativa trichomes. Canada, 2012; 71(3):353-65;
40. Takeda S, Misawa K, Yamamoto I, Watanabe K. Cannabidiolic Acid as a Selective Cyclooxygenase-2 Inhibitory Component in Cannabis. Japan, 2008; 36 (9) 1917-1921;
41. Tzadok M, Siboni S.U, Linder I, Kramer U, Epstein O. CBD-enriched medical cannabis for intractable pediatric epilepsy The current Israeli experience. Israel. 2016; 41–44;
42. Wilkinson JD, Williamson EM. Cannabinoids inhibit human keratinocyte proliferation through a non-CB1/CB2 mechanism and have a potential therapeutic value in the treatment of psoriasis. UK,2007; ;45(2):87-92;
43. Copeland J, Clement N. The use of cannabis for medical purposes.[ Internetinis šaltinis] 2007 cituota [2017-10-05] Internetinė prieiga: https://cannabissupport.com.au/media/1931/the-use-of-cannabis-for-medical-purposes.pdf
44. Audrey Lefebvre, Cannabis as Medicine: How CBD (Cannabidiol) Benefits the Brain and Nervous System. [Internetinis šaltinis],2015. Prieiga per internetą:https://wakeup- world.com/2016/03/20/cannabis-as-medicine-how-cbd-cannabidiol-benefits-the-human-brain-and-nervous-system/
45. ICH Harmonised Tripartite Guideline. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2 (R1) [Internetinis šaltinis] 2005 cituota [2017-11-08]. Prieiga per internetą: https://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step 4/Q2_R1__Guideline.pdf
46. Lefebvre A. Cannabis as Medicine: How CBD (Cannabidiol) Benefits the Brain and Nervous System. [ Internetinis šaltinis] 2016 cituota [2017-10-09]. Internetinė prieiga : https://wakeup- world.com/2016/03/20/cannabis-as-medicine-how-cbd-cannabidiol-benefits-the-human-brain-and-nervous-system/
47. Ripley E. Evidence indicates cbd is beneficial for alzheimer’s disease, review finds. [ Internetinis šaltinis] 2017 cituota [ 2017-10-25]. Internetinė prieiga: https://news.medicalmarijuanainc.com/evidence-indicates-cbd-beneficial-alzheimers-disease-review-finds/
