FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
ERIKA PUIDOKAITĖ
PUSIAU KIETŲ FARMACINIŲ FORMŲ SU SKYSTUOJU
JUODUOGIŲ ŠEIVAMEDŽIŲ (Sambucus nigra L.) ŽIEDŲ
EKSTRAKTU MODELIAVIMAS IR BIOFARMACINIS
VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Prof. dr. Kristina Ramanauskienė
FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
PUSIAU KIETŲ FARMACINIŲ FORMŲ SU SKYSTUOJU
JUODUOGIŲ ŠEIVAMEDŽIŲ (Sambucus nigra L.) ŽIEDŲ
EKSTRAKTU MODELIAVIMAS IR BIOFARMACINIS
VERTINIMAS
Darbo vadovė
Prof. dr. Kristina Ramanauskienė Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Erika Puidokaitė Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Pusiau kietų farmacinių formų klasifikacija ir charakteristika ... 11
1.2. Gelių ir jų komponentų charakteristika ... 13
1.3. Pusiau kietų farmacinių formų kokybės vertinimas ... 15
1.4. Juoduogių šeivamedžių morfologija ir cheminė sudėtis ... 16
1.5. Flavonoidai, jų klasifikacija, biologinis aktyvumas ... 17
1.6. Juoduogių šeivamedžių žiedų biologinis aktyvumas ... 18
1.7. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstrakto pritaikymo galimybės pusiau kietose farmacinėse formose ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 22
2.1. Tyrimų objektas ... 22
2.2. Tyrimų medžiagos ir įranga ... 22
2.2.1. Naudotos medžiagos ... 22
2.2.2. Naudota įranga ... 22
2.3. Tyrimų metodai ... 23
2.3.1. Juoduogių šeivamedžių žiedų skystojo ekstrakto technologija ... 23
2.3.2. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktu gamyba ... 23
2.4. Juoduogių šeivamedžių žiedų preparatų kokybės vertinimo metodai ... 25
2.4.1. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 25
2.4.2. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 25
2.4.3. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 26
2.4.4. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstrakto antibakterinio aktyvumo nustatymas ... 26
2.4.5. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktu fizinių savybių vertinimas ... 27
2.4.6. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktu dinaminės klampos nustatymas ... 27
2.4.7. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktu pH
reikšmės nustatymas ... 27
2.4.8. Veikliųjų junginių atpalaidavimo iš pusiau kietų farmacinių formų tyrimas in vitro ... 27
2.5. Statistinė analizė ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų kokybės vertinimas ... 29
3.1.2. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio vertinimas spektrofotometriniu metodu ... 29
3.1.3. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo vertinimas spektrofotometriniu metodu ... 30
3.1.4. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstrakto antibakterinio aktyvumo įvertinimas ... 31
3.2. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktu kokybės vertinimas ... 32
3.2.1. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktu fizinių savybių vertinimas ... 32
3.2.2. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktu pH reikšmės įvertinimas ... 37
3.2.3. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktu dinaminės klampos įvertinimas ... 38
3.3. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktu biofarmacinis tyrimas ... 39
3.3.1. Akceptorinės terpės parinkimas pusiau kietų farmacinių formų biofarmaciniam tyrimui ... 39
3.3.2. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktu veikliųjų junginių atpalaidavimo tyrimas in vitro ... 40
4. IŠVADOS ... 45
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46
E. Puidokaitės magistro baigiamasis darbas: „Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktu modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas“ / mokslinė vadovė prof. dr. Kristina Ramanauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas: Sumodeliuoti pusiau kietas farmacines formas su juoduogių šeivamedžių (Sambucus
nigra L.) žiedų ekstraktu ir atlikti jų biofarmacinį vertinimą.
Darbo uždaviniai: Pagaminti skystuosius juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktus,
naudojant skirtingos koncentracijos etanolį ir įvertinti jų kokybę; ištirti skystųjų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą ir antibakterines savybes tyrimais in vitro; sumodeliuoti pusiau kietas farmacines formas su juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktu ir įvertinti jų kokybę (pH reikšmę, vienalytiškumą, klampą); ištirti farmacinių veiksnių daromą įtaką veikliųjų junginių atpalaidavimui iš pusiau kietų farmacinių formų su juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktu.
Metodai: Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų kokybė buvo įvertinta nustatant bendrą fenolinių
junginių ir flavonoidų kiekį spektrofotometriškai. Antiradikalinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriškai DPPH radikalų surišimo metodu. Antibakterinis aktyvumas vertintas in vitro difuzijos į agarą metodu. Sumodeliuotų pusiau kietų farmacinių formų dinaminė klampa išmatuota viskozimetru, pH reikšmės nustatytos naudojant pH–metrą, vienalytiškumas vertintas naudojant mikroskopą. Pagamintų pusiau kietų farmacinių formų biofarmacinis tyrimas in vitro atliktas naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes.
Rezultatai: Bendras fenolinių junginių kiekis ekstraktuose buvo nuo 3,78 ± 0,289 mg/ml iki 7,48 ±
0,105 mg/ml, flavonoidų – nuo 1,49 ± 0,245 mg/ml iki 5,11 ± 0,211 mg/ml, priklausomai nuo ekstrahento koncentracijos. Ekstraktai pasižymėjo antiradikaliniu aktyvumu ir bakteriostatiniu veikimu. Pagaminti puskiečiai preparatai buvo vienalytiški. Puskiečių sistemų pH reikšmės buvo nuo 6,71 ± 0,03 iki 7,01 ± 0,02. Dinaminė klampa buvo nuo 1,74 ± 0,01 Pa∙s iki 2,29 ± 0,02 Pa∙s. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis atpalaiduojamas iš hidrogelių, didėjant oleogelio kiekiui dvifaziame gelyje – atpalaiduotų junginių kiekis sumažėja.
Išvados: Rezultatai parodė, kad didžiausias veikliųjų junginių kiekis nustatytas ekstraktuose, kurių
gamybai naudotas 70 proc. (V/V) etanolis. Gauti ekstraktai pasižymi antiradikaliniu aktyvumu ir bakteriostatinėmis savybėmis prieš S. aureus ir B. cereus. Nustatyta atvirkštinė koreliacija tarp bendro atpalaiduoto flavonoidų kiekio po 6 valandų in vitro tyrimo ir preparatų dinaminės klampos.
E. Puidokaitė‘s final thesis for master‘s degree „Modeling And Biopharmaceutical Evaluation Of Topical Semisolid Dosage Forms With Sambucus nigra L. Flower Extract“/ scientific supervisor prof. dr. Kristina Ramanauskienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.
Objective: to model semisolid preparations with Sambucus nigra L. flowers extract and to conduct their
biopharmaceutical evaluation.
Aims: To make liquid Sambucus nigra L. flower extract by using different concentration of ethanol and
to evaluate their quality; to examinate the antiradical activity and antibacterial qualities of liquid extracts using in vitro methods; to model semisolid pharmaceutical forms with Sambucus nigra L. flowers extracts and to evaluate their quality (pH value, homogenity, viscosity); to evaluate the impact of pharmaceutical factors on the release of active compounds from semisolid pharmaceutical forms with
Sambucus nigra L. flower extract.
Methods: The quality of elder flowers extracts were evaluated spectrophotometrically by determining
the total polyphenols and flavonoids content. Antiradical activity was determined using spectrophotometrically DPPH free radical scavening method. Antibacterial activity was determined in
vitro using the agar difusion method. Modeled semisolid pharmaceutical forms dynamic viscosity was
determined by viscosimeter, pH values were determined using pH–meter potenciometrical method, homogenity evaluated using a microscope. Created semisolid pharmaceutical forms biopharmaceutical experiment in vitro was performed by using modified Franz type difusion cells.
Results: Total polyphenols content in extracts was from 3,78 ± 0,289 mg/ml to 7,48 ± 0,105 mg/ml,
flavanoids content was from 1,49 ± 0,245 mg/ml to 5,11 ± 0,211 mg/ml, depending from ethanol concentration. Extracts have bacteriostatic and antiradical activities. Created semisolid preparations were homogeneous. Semisolid preparations pH values were from 6,71 ± 0,03 to 7,01 ± 0,02. Dynamic viscosity was from 1,74 ± 0,01 Pa∙s to 2,29 ± 0,02 Pa∙s. The largest amount of total flavonoid content was released from hydrogels and when oleogel amount in bigel increases – amount of released flavonoids decreases.
Conclusions: Studies showed that the largest content of active compounds was determined in extracts
which were made by using 70% (V/V) ethanol. Extracts have antiradical and bacteriostatic properties against S. aureus and B. cereus. A reverse correlation between released flavonoids content after 6 hours
PADĖKA
Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas, teorinę ir praktinę pagalbą atliekant baigiamąjį darbą „Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktu modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas“ dėkoju Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedros prof. dr. Kristinai Ramanauskienei bei katedros kolektyvui. Už pagalbą įgyvendinant antibakterinio aktyvumo tyrimus dėkoju Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos akademijos, Dr. Leono Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikos gydytojui dr. Aidui Grigoniui.
SANTRUMPOS
°C – laispniai Celsijaus A/V – aliejus vandenyje
DPPH – 2,2–difenil–1–pikrilhidrazilas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija mmHg – gyvsidabrio stulpelio milimetrai ROS – reaktyviosios deguonies formos SPF – apsaugos nuo saulės faktorius UV – ultravioletinė spinduliuotė V/A – vanduo aliejuje
ĮVADAS
Oda yra didžiausias žmogaus organas, kurio viena iš svarbiausių funkcijų – organizmo apsauga nuo išorinių veiksnių. Netinkamai prižiūrint odą, saulės spinduliuotės poveikis gali sukelti jos senėjimą, išsausėjimą ir paskatinti odos vėžio atsiradimo tikimybę. Rinkoje esantys apsauginiai cheminės kilmės preparatai nuo saulės gali sukelti įvairias šalutines reakcijas (alergijas, odos dirginimą) [46]. Odą žaloja ne tik saulės spinduliuotės poveikis, bet ir įvairūs pakitimai, kuriuos sukelia temperatūros pokyčiai, traumos, žaizdos, venų stazė. Dėl šios priežasties odos paviršius gali tapti įvairių bakterijų kolonizacijos vieta. Išsivysčiusios infekcijos gali sukelti audinio uždegimą, imuninį atsaką, įvairių odos ligų atsiradimą, sukelti diskomfortą pacientui [53, 61]. Odos bakterinių infekcijų slopinimui dažnai yra paskiriamas gydymas antibiotikais, kurių netinkamas vartojimas gali pakenkti normaliai odos mikroflorai ir skatinti rezistentiškų mikroorganizmų atsiradimą [29, 61]. Norint apsaugoti odą nuo įvairių kenksmingų faktorių aktualu surasti augalinės kilmės profilaktines priemones, pasižyminčias apsauginiu ir priešbakteriniu poveikiais [46, 67]. Viena iš jų – juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktas. Jo sudėtyje esantys veiklieji junginiai lemia augalo antibakterinį, antioksidacinį ir priešuždegiminį poveikius. Dėl šių savybių aktualu sumodeliuoti pusiau kietas farmacines formas, kurių veiklioji medžiaga šeivamedžių žiedų ekstraktas [30].
Norint gauti efektyvų preparatą, svarbu parinkti tinkamą veikliųjų junginių nešėją. Tam pasirinkti hidrofiliniai ir dvifaziai geliai. Hidrofiliniai geliai lengvai pasiskirsto ant odos, pasižymi vėsinančiu efektu, drėkina raginį odos sluoksnį. Dvifaziai geliai geba prasiskverbti pro lipofilinį odos barjerą. Jų sudėtyje gali būti tiek hidrofilinės, tiek lipofilinės veikliosios medžiagos. Ši farmacinė forma išlieka stabili laikant kambario temperatūroje 6–12 mėnesių [71].
Siekiant moksliniais tyrimais pagrįsto kokybės vertinimo, aktualu atlikti skystojo ekstrakto ir puskiečių preparatų kokybės tyrimus. Planuojama įvertinti ekstrakto savybes: ištirti fenolinių junginių, flavonoidų bendrąjį kiekį spektrofotometriškai, antiradikalinį aktyvumą, skirtingų ekstrahentų įtaką ekstrakto kokybei, taip pat antibakterines savybes. Įvertinus ekstraktų savybes, planuojama įvertinti pusiau kietų farmacinių formų, kurių veiklioji medžiaga skystastis juoduogių šeivamedžių (Sambucus
nigra L.) žiedų ekstraktas, kokybę. Bus nustatoma pH reikšmė, dinaminė klampa, vienalytiškumas. Taip
pat planuojama atlikti biofarmacinį junginių atpalaidavimo tyrimą in vitro, kuris leidžia parinkti tinkamą veikliųjų junginių nešėją ir prognozuoti preparato pritaikymą.
Šio darbo tikslas yra sumodeliuoti pusiau kietas farmacines formas su skystuoju juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktu ir atlikti jų biofarmacinį įvertinimą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo objektas: pusiau kietos farmacinės formos, kurių veiklioji medžiaga skystasis
juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktas.
Darbo tikslas: sumodeliuoti pusiau kietas farmacines formas su skystuoju juoduogių
šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktu ir atlikti jų biofarmacinį vertinimą.
Darbo uždaviniai:
1. Pagaminti skystuosius juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktus, naudojant skirtingos koncentracijos etanolį ir įvertinti jų kokybę;
2. Ištirti skystųjų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą ir antibakterines savybes tyrimais in vitro; 3. Sumodeliuoti pusiau kietas farmacines formas su juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.)
žiedų ekstraktu ir įvertinti jų kokybę (pH reikšmę, vienalytiškumą, klampą);
4. Ištirti farmacinių veiksnių daromą įtaką veikliųjų junginių atpalaidavimui iš pusiau kietų farmacinių formų su juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Pusiau kietų farmacinių formų klasifikacija ir charakteristika
Oda yra didžiausias žmogaus organas, kuris atlieka apsauginę, jutiminę ir termoreguliacinę funkcijas. Ji apsaugo vidaus organus nuo išorinio poveikio, neleidžia mikroorganzimams patekti į organizmo vidų, apsaugo nuo per didelio vandens netekimo, palaiko pastovią organizmo temperatūrą, joje išsidėstę įvairūs receptoriai. Oda yra sudaryta iš trijų sluoksnių – epidermio, dermos ir hipodermos. Epidermyje nėra kraujagyslių, nervinų galūnių, jo sudėtyje esantis raginis sluoksnis atlieka apsauginę funkciją. Dermoje yra išsidėsčiusios riebalų, prakaito liaukos, kraujagyslės, nervų ląstelės, plaukų folikulai, kolageno ir elastino baltymų skaidulos. Hipoderma yra jungiamojo audinio sluoksnis, kurio storis įvairiose kūno vietose skirtingas. Jos pagrindinė funkcija – maisto medžiagų saugojimas, šilumos reguliacija [68]. Norint užtikrinti normalų odos funkcionavimą ir palaikyti jos sveiką būklę, yra naudojami įvairūs puskiečiai preparatai [28, 37]. Pagal Europos farmakopėją puskiečiai preparatai – tai preparatai, skirti naudoti ant odos norint gauti veikliųjų medžiagų vietinį arba sisteminį poveikį. Vietiniu veikimu pasižymi preparatai, veikiantys odos paviršiuje, viršutiniame raginiame sluoksnyje arba preparatai, keičiantys epidermio, dermos funkcijas. Kai veikliosios medžiagos patenka į gilesnius odos sluoksnius, o iš jų į sisteminę kraujotaką, sukeliamas sisteminis preparato poveikis [81]. Puskiečių preparatų efektyvumas priklauso ne tik nuo paciento fiziologinių pokyčių, lemiančių odos būklę, bet ir nuo preparato savybių, kurias lemia gamyboje naudojamos medžiagos [52]. Dažniausiai puskiečių preparatų sudėtyje yra paprastas arba sudėtinis pagrindas, kuriame ištirpintos arba disperguotos viena ar daugiau veikliųjų medžiagų. Pagrindas gali būti sudarytas iš sintetinės arba natūralios kilmės medžiagų, taip pat gali būti vienafazis arba daugiafazis. Gamyboje gali būti naudojamos pagalbinės medžiagos, tokios kaip konservantai, antioksidantai, stabilizatoriai, emulsikliai, tirštikliai, skvarbą gerinančios medžiagos [32].
Pagal Europos farmakopėją (Ph. Eur. 01/2008:0132) puskiečiams preparatams yra priskiriami tepalai, kremai, pastos, šutekliai, pleistrai, geliai [32].
Tepalai – tai pusiau kietos farmacinės formos, kurios naudojamos išoriškai ant odos ar gleivinių. Veikliosios medžiagos dažniausiai yra ištirpinamos, suspenduojamos ar emulguojamos tepalo pagrindine, kuris yra vienafazis. Šie preparatai gali būti skirstomi į hidrofobinius, hidrofilinius ir vandenį emulguojančius tepalus [32, 63]. Taip pat tepalai gali būti klasifikuojami pagal jų skvarbą pro odą [47]: Epidermio tepalai. Tokie tepalai yra naudojami epidermio paviršiuje, siekiant gauti vietinį
produkto poveikį.
Dermos tepalai. Ši tepalų rūšis naudojama norint gauti preparato veikimą gilesniuose odos audiniuose.
Hipodermos tepalai. Tokių tepalų veikliosios medžiagos lengvai prasiskverbia pro odos sluoksnius ir patenka į sisteminę kraujotaką.
Tepalai gali būti klasifikuojami ir pagal jų terapinį poveikį: antibiotikai, priešgrybeliniai, priešuždegiminiai, apsauginiai, keratolitiniai, taip pat tepalai skirti žvynelinės, egzemos gydymui. Dažniausiai šios farmacinės formos yra naudojamos kaip apsauginiai odos preparatai ar emolientai. Jų trūkumas – riebi konsistencija, sunku pašalinti nuo odos, dėl didelės klampos sunku paskirstyti ant pažeisto odos paviršiaus [47].
Kremai yra daugiafaziai pusiau kieti preparatai skirti išoriniam naudojimui. Jie susideda iš lipofilinės ir vandeninės fazių [32]. Kremų sudėtyje yra hidrofiliniai pagrindai dėl kurių juos patogu naudoti ir lengva pašalinti nuo odos. Lyginant su tepalais, jie mažiau riebūs. Kremai skirstomi į hidrofilinius ir lipofilinius. Hidrofiliniai kremai yra laikomi a/v tipo emulsijomis, tačiau jie nėra riebios konsistencijos. Tuo tarpu lipofiliniai kremai yra v/a tipo emulsijos ir yra riebios konsistencijos [47]. Hidrofilinių kremų gamyboje yra naudojamos aliejų vandenyje emulguojančios medžiagos: natrio ar trolamino muilai, sulfatinti riebalų alkoholiai, polisorbatai, polioksilo riebiosios rūgštys ir riebalų alkoholių esteriai. Lipofilinių kremų gamyboje yra naudojamos vandenį aliejuje emulguojančios medžiagos, tokios kaip riebalų alkoholiai, sorbitano esteriai ir monogliceridai. Dažnai pacientai pirmenybę teikia a/v tipo kremams dėl lengvo paskirstymo ant odos ir sudėtyje esančio vandens, kuris užtepus ant odos gali išgaruoti ir nuraminti sudirgusią odą. V/a tipo kremai yra naudingi dėl savo gebėjimo drėkinti ir minkštinti odą [17, 32].
Pastos – tai tirštesnės, standesnės farmacinės formos, lyginant su kitais puskiečiais preparatais. Jų sudėtyje yra disperguotas didesnis negu 25 proc. kietųjų medžiagų kiekis [32]. Odos plote, ant kurio naudojama pasta, yra suformuojama apsauginė danga, todėl pastos yra naudojamos kaip apsauginiai preparatai [47].
Šutekliai yra prepratai, kurių pagrindas pasižymi hidrofilinėmis, šilumą sulaikančiomis savybėmis. Jame disperguojamos kietos arba skystos veikliosios medžiagos [32].
Pleistrai – tai lankstūs preparatai, kurių sudėtyje yra viena ar daugiau veikliųjų medžiagų. Šių preparatų paskirtis yra išlaikyti veikliąsias medžiagas sąlytyje su oda tam, kad medžiagos absorbuotųsi ir būtų pasiektas apsauginis arba keratolitinis poveikis [32]. Pleistrai gali sukelti odos dirginimą, užkimšti prakaito liaukas, dėl to vandens perteklius nėra pašalinamas pro odą. Juos gali būti skausminga nuimti nuo odos ir užklijuotas pleistras gali atrodyti neestetiškai [48].
Geliai – pusiau kietos farmacinės formos, kurias sudaro pagrindas ir gelifikuojanti medžiaga. Šie puskiečiai preparatai pasižymi įvairiomis teigiamomis savybėmis, todėl yra plačiai taikomi kosmetikos ir farmacijos srityse [10].
1.2. Gelių ir jų komponentų charakteristika
Geliai yra pusiau kietos farmacinės formos, kurių sudėtyje esantys komponentai suformuoja trimatę struktūrą. Joje įsiterpęs polinis arba nepolinis tirpiklis. Tam, kad geliai būtų kokybiški, jie turi pasižymėti šiomis savybėmis [10]:
Turi būti inertiški, netoksiški ir suderinami su kitomis pagalbinėmis medžiagomis; Būti stabilūs laikymo sąlygomis;
Turi nepaveikti veikliųjų junginių savybių;
Gelifikuojančios medžiagos, naudojamos gelių gamyboje, taip pat turi būti intertiškos, saugios ir turi nereaguoti su kitomis pagalbinėmis medžiagomis.
Pagal tai, koks pagrindas yra naudojamas gelių gamyboje, jie yra klasifikuojami į hidrofilinius ir lipofilinius gelius. Hidrofilinių gelių sudėtyje yra gelifikuojančių medžiagų, kurioms brinkstant poliniame tirpiklyje, suformuojamos tinklinės struktūros, turinčios skersines jungtis. Dėl šios priežasties hidrogeliai gali absorbuoti didelį kiekį vandens [35]. Veiklieji junginiai iš hidrogelių gali išsiskirti dviem mechanizmais: difuzijos proceso metu arba cheminių veiksnių pagalba. Difuzijos metu dalelės juda pro polimerinį pagrindą ant odos, o cheminių veiksnių pagalba dalelės juda dėl pH ar temperatūros pokyčio, ar dėl atitinkamų fermentų poveikio, kurie sudaro sąlygas veikliajai medžiagai praeiti pro baltymų poras ir patekti į pažeistas audinio vietas. Pastarasis veikliųjų medžiagų patekimo būdas naudojamas audinių inžinerijoje [65]. Hidrogeliai gali būti skirstomi į natūralius, sintetinius ir mišrius, priklausomai nuo gelifikuojančios medžiagos prigimties. Kaip gelifikantai gali būti naudojami pektinas, želatina, agaras, alginato rūgštis, metilceliuliozė, karbomeras, hidroksietilceliuliozė ir kiti. Hidrogelių privalumai yra nealiejinga, lengvai nuo odos nuplaunama konsistencija. Jie lengvai pasiskirsto ant odos, pasižymi vėsinančiu efektu, drėkina odos raginį sluoksnį. Didžiausias hidrogelių trūkumas – prastas suderinamumas su lipofilinėmis vaistinėmis medžiagomis, maža absorbcija pro odos raginį sluoksnį [35, 71].
Oleogeliai yra pusiau kietos farmacinės formos, kurios sudarytos iš nepolinio skysčio, gelifikuoto atitinkama gelifikuojančia medžiaga. Naudojant gelį formuojančią medžiagą, įvyksta fizikinė arba cheminė sąveika ir taip susiformuoja tarpusavyje susipynusios pluoštinės struktūros, sudarydamos trimatę tinklinę struktūrą. Oleogelius sudarančios medžiagos gali būti lecitinas, sorbitano monostearatas, sorbitano monopalmitatas, stearino rūgštis, įvairūs vaškai, o kaip pagrindai oleogelių gamyboje gali būti naudojami įvairūs augaliniai aliejai (migdolų, alyvuogių, saulėgrąžų), vazelino aliejus ir kiti nepoliniai tirpikliai. Daugelis oleogelio komponentų gerina prasiskverbimą pro odos raginį sluoksnį, pavyzdžiui, įvairios riebalų rūgštys, surfaktantai, paviršiaus aktyviosios medžiagos, glikoliai. Oleogeliai pasižymi lengva gamyba, didesniu stabilumu lyginant su kitais geliais, lengvesniu prasiskverbimu pro odą, jie yra atsparūs mikrobams, gamybai nereikalingi konservantai. Šių pusiau kietų
farmacinių formų didžiausias trūkumas yra jų aliejinga konsistencija, lipnumas, dėl ko jas sunku pašalinti po naudojimo ant odos [35].
Pusiau kieti farmaciniai preparatai, kurių sudėtyje yra hidrogelio ir oleogelio mišinys, sudarantis vientisą struktūrą, vadinami dvifaziais geliais. Kadangi hidrogeliai yra poliniai, o oleogeliai nepoliniai, dvifaziai geliai laikomi emulsinėmis sistemomis, kurios turi tiek vidinę, tiek išorinę fazes. Susimaišius dviems skirtingo poliškumo fazėms, gaunama tolygi, ištisinė dvifazių gelių mikrostruktūra, kurią stabilizuoja susijungusios fazių dalelės. Dvifaziai geliai gali būti skirstomi į šias grupes [71]:
1) Oleogelio sistema hidrogelyje (a/v sistema); 2) Hidrogelio sistema oleogelyje (v/a sistema); 3) Dvifazės sistemos.
Pirmoje dvifazių gelių grupėje oleogelio aliejinė fazė yra pasiskirsčiusi vandeninėje hidrogelio fazėje, o antroje – atvirkščiai. Kai dvifazyje gelyje susiformuoja sudėtingų struktūrų sistemos, kuriose sunku identifikuoti komponentų pasiskirstymą gaunama trečioji dvifazių gelių grupė [55, 71]. Dvifaziai geliai yra pranašesnė vaisto forma tiek už hidrogelius, tiek už oleogelius, kadangi geba prasiskverbti pro lipofilinį odos barjerą, jie yra nelipnūs, nepalieka riebalinių žymių. Šių gelių konsistencija gali būti lengvai keičiama parenkant įvairius hidrogelių ir oleogelių santykius. Dvifazių gelių sudėtyje gali būti tiek hidrofilinės, tiek lipofilinės veikliosios medžiagos. Jų gamyba yra paprasta, jie lengvai nuplaunami nuo odos. Dvifaziai geliai gali išlikti stabilūs laikant kambario temperatūroje 6–12 mėnesių. Tačiau dvifaziuose geliuose gali įvykti fazių išsiskyrimas, jie gali būti nestabilūs esant aukštai temperatūrai [54, 83].
Gaminant dvifazius gelius naudojamos įvairios pagalbinės medžiagos:
Karbomeras – tai akrilo rūgšties polimeras, kuris pasižymi hidrofilinėmis, šiek tiek rūgštinėmis
(pKa 6,0 ± 0,5) savybėmis. Tai baltos spalvos purūs milteliai, kurių skersmuo yra maždaug 0,2 μm. Karbomerui išbrinkus vandenyje ir jį neutralizavus susidaro klampi konsistencija. Dėl šios priežasties karbomeras yra dažnai naudojamas puskiečių vaisto formų gamyboje. Taip pat ši medžiaga yra nebrangi, nekenksminga ir ją paprasta naudoti [51].
Trietanolaminas – tai skaidrus, klampus skystis. Jis gali būti bespalvis ar šviesiai geltonos
spalvos, turintis šiek tiek amoniako kvapo. Trietanolaminas lengvai maišosi su vandeniu, metanoliu, acetonu. Jis dažnai naudojamas kosmetikoje kaip surfaktantas, pH reguliatorius, kvepalų ingridientas [34]. Gaminant gelius, kurių gelifikuojanti medžiaga yra karbomeras, yra labai svarbu pasirinkti tinkamą neutralizatorių, kad būtų gaunamas tinkamos klampos bei pH gelis. Tinkamiausios klampos gelis yra tuomet, kai jo pH yra nuo 6,5 iki 7,5. Neutralizatorių veikimas yra paremtas tuo, kad gelifikuojančiai medžiagai (karbomerui) pasiskirsčius vandenyje, molekulės pradeda hidratuoti ir išsivynioti. Norint pasiekti tinkamą gelio konsitenciją ir tirštumą, karbomero rūgštinis polimeras turi būti paverstas į druską.
Tai galima pasiekti naudojant neutralizatorius, pavyzdžiui, natrio hidroksidą ar trietanolaminą. Gaminant gelius, kuriuose yra didesnis alkoholio kiekis, rekomenduojama naudoti trietanolaminą [79].
Skystasis parafinas – tai sočiųjų alifatinių bei ciklinių angliavandenių mišinys, kuris yra gautas
iš naftos. Jis yra plačiai naudojamas farmacinių formuluočių gamyboje. Skystasis parafinas bespalvis, skaidrus ir klampus sksystis, kuris netirpsta vandenyje [12].
Sorbitano monostearatas (span 60) – tai nejoninis surfaktantas, kurio hidrofilinis–lipofilinis
balansas (HLB) yra 4,7. Jo dėka gali būti suformuotos v/a tipo emulsijos. Sorbitano monostearatas nedirgina odos, yra lengvai suderinamas su kitomis medžiagomis, todėl dažnai naudojamas kosmetikos, farmacijos pramonėje. Oleogeliai, kurių sudėtyje yra sorbitano monostearato, gali kontroliuoti aktyvių medžiagų išsiskyrimą iš puskiečių preparatų [69].
1.3. Pusiau kietų farmacinių formų kokybės vertinimas
Suformulavus puskiečius preparatus yra įvertinama jų kokybė. Ji gali būti vertinama [22, 42]: Įvertinus preparatų organoleptines savybes – išvaizdą, spalvą, kvapą;
Įvertinus preparatų mikrostruktūras, homogeniškumą;
Išmatavus pusiau kietų farmacinių formų pH reikšmę. Tai svarbu, nes pH veikia puskiečių formų stabilumą, fizikines ir chemines savybes, veikliųjų bei pagalbinių medžiagų veiksmingumą. Esant netinkamai puskiečio preparato pH reikšmei gali būti dirginama oda;
Išmatavus pusiau kietų farmacinių preparatų klampą. Klampa yra reikšmingas rodiklis, nes ji turi įtakos puskiečio preparato susilaikymui odoje ir skvarbai pro odą. Klampa gali būti nustatoma viskozimetru arba reometru. Reometro pagalba gali būti nustatyta ne tik preparato klampa, bet ir jo takumas, preparato deformacija esant skirtingoms sąlygoms, taip pat veiksniai, kurie gali turėti įtakos preparato konsistencijai. Reologinių savybių tyrimas taip pat naudingas siekiant įvertinti puskiečių preparatų tepumą ant odos ir plastiškumą.
Vienas iš svarbiausių pusiau kietų farmacinių formų kokybės vertinimo tyrimų yra veikliųjų junginių atpalaidavimas in vitro. Šis tyrimas yra naudingas norint sužinoti, kiek farmakologiškai aktyvios veikliosios medžiagos išsiskiria iš preparato praėjus atitinkamam laikui. In vitro veikliųjų junginių išsiskyrimas iš pusiau kietų farmacinių formų gali būti atliekamas naudojant Franz tipo difuzines celes. Celė sudaryta iš dviejų terpių – donorinės ir akceptorinės, kurias skiria pusiau laidi membrana. Atliekant in vitro tyrimą būtina parinkti tinkamą membraną. Ji turi imituoti odos savybes. Tam naudojamos sintetinės membranos, kurios turi būti chemiškai inertiškos tiek akceptorinei terpei, tiek tiriamajam produktui. Taip pat membranos turi būti lengvai sudrėkinamos, turėti didelį pralaidumą, minimalų storį. Nors sintetinės membranos negali imituoti odos lipidinio barjero savybių, tačiau jos yra
lengviau prieinamos, pigesnės ir gali būti naudojamos įvairiuose tyrimuose [72]. Tyrimo metu veikliosios medžiagos difuzijos proceso pagalba difunduoja iš didesnės koncentracijos donorinės terpės į mažesnės koncentracijos akceptorinę terpę. Difuzijos procesui turi įtakos tarpmolekulinių jėgų sąveika tarp tirpiklio ir tirpalo. Akceptorinės terpės savybės ir sudėtis gali tiesiogiai paveikti molekulės tirpimą ir išsiskyrimą iš pusiau kietų farmacinių formų. Dėl šios priežasties yra svarbu parinkti tinkamą akceptorinę terpę, kurioje veiklioji medžiaga maksimaliai ištirptų ir kuri atitiktų fiziologines odos savybes, nepasižymėtų dideliu klampumu. Bandymo metu parenkama temperatūra, kuri turi būti panaši į odos temperatūrą – 32 ± 0,5 °C. Priklausomai nuo preparato naudojimo paskirties, ji gali skirtis, pavyzdžiui, atliekant vaginalinių pusiau kietų farmacinių formų veikliųjų medžiagų nustatymą (tokiu atveju naudojama temperatūra 37°C). Tyrimui taip pat svarbi ir akceptorinės terpės pH, kurios reikšmė rekomenduojama 5–6. Tyrimą reikia atlikti mažiausiai 6 valandas. Atsipalaidavusios į akceptorinę terpę medžiagos kiekis gali būti nustatomas įvariais metodais, pavyzdžiui, spektrofotometriškai ar efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [25, 57, 75]. In vitro atpalaiduotų junginių procesą galima apibūdinti matematiniu Higuchi modeliu. Jis pagrįstas kreive, kuri gaunama y ašyje atidėjus medžiagos kiekį, kuris atpalaiduotas per ploto vienetą ir x ašyje atidėjus laiko kvadratinę šaknį. Gautos kreivės tiesiškumas parodo, kaip efektyviai yra atplaiduojami veiklieji junginiai [38].
Preparato kokybė gali būti vertinama ir panaudojus skvarbos pro odą ex vivo tyrimą. Šio tyrimo metu galima prognozuoti, kiek veikliosios medžiagos ir kuriame odos sluoksnyje bus panaudojus puskietį preparatą ant odos. Tyrimo metu naudojama žmonių (pilvo, krūtinės ar nugaros srities oda) arba gyvūnų oda. Dėl histologinių panašumų tam tinkama žiurkių, kiaulių oda. Atliekant tyrimus su oda ex
vivo, rekomenduojama atkreipti dėmesį į tai, kad naudojant skirtingų kūno vietų odą gali skirtis raginio
sluoksnio storis, hidratacija ir lipidų sudėtis Jei pagamintas puskietis preparatas yra skirtas vartoti žmonėms, tinkamiausias būdas įvertinti jo efektyvumą būtų tyrimai in vivo, tačiau dėl etinių, ekonominių ir praktinių priežasčių šis būdas nėra naudojamas preparato ankstyvuoju vystymo metu [31].
1.4. Juoduogių šeivamedžių morfologija ir cheminė sudėtis
Juoduogis šeivamedis (Sambucus nigra L.) priklauso ūksmininių (Adoxaceae L.) šeimai. Tai daugiametis krūmas arba nedidelis medis, kurio aukštis siekia nuo 3 iki 10 metrų [82]. Kamieno skersmuo gali siekti iki 30 cm. Jaunų šakų žievė gali būti žalsva su karputėmis, o stiebų ir senų šakų dažniausiai yra rudai pilkšvos spalvos, sueižėjusi. Subrendę ūgliai yra šviesiai rudos ar pilkšvos spalvos, o senesni – rudos spalvos. Augalo šerdis yra balta ir minkšta. Lapai yra priešiniai, trumpakočiai, neporomis plunksniški. Lapeliai kiaušiniškai pailgi, pjūkliškai dantytais kraštais, juos sutrynus – nemaloniai kvepia. Lapelių viršutinė pusė tamsiai žalia, o apatinė yra šviesesnės spalvos, pilka,
pagrindinės gyslos yra šiek tiek plaukuotos. Žiedynas yra skėtiškas, plokščias, tankus, o žiedai yra gelsvos arba baltos spalvos, maloniai kvepiantys. Vaisiai yra juodai violetinės spalvos, blizgūs į uogas panašūs kaulavaisiai, 3–5 mm diametro, taip pat su 3–5 sėklomis. Minkštimas yra rudas, sultingas bei saldžiarūgštis. Dauginasi sėklomis ir šaknų atžalomis [23, 56].
Pagal Europos farmakopėją (Ph. Eur. 01/2008:1217) naudojama augalo vaistinė žaliava – šeivamedžių žiedai. Jie yra apibūdinami kaip stipraus, aromatingo ir charakteringo kvapo bei saldaus, šiek tiek kartaus, gleivingo skonio. Juoduogių šeivamedžių žieduose yra įvairių organinių rūgščių (acto, valerijonų, obuolių), eterinių aliejų, fenolinių rūgščių (chlorgeninės, kavos, ferulo), kalio, taip pat taninų, sterolų, alkanų, gleivių, pektinų, baltymų, cukrų. Daugiausiai žaliavoje yra flavonoidų. Pagrindiniai yra rutinas, astragalinas, hiperozidas, izokvercitrinas, kemferolis ir kvercetinas. Flavonoidų kiekis žaliavoje yra daugiau negu 3 proc. [49].
1.5. Flavonoidai, jų klasifikacija, biologinis aktyvumas
Flavonoidai – tai grupė gamtinių junginių, kurių struktūrinį pagrindą sudaro anglies atomų C6– C3–C6 sistema. Struktūroje yra du žiedai (A ir B), kurie sujungti per heterociklinį pirano (C) žiedą [44]. Flavonoidų struktūrinė formulė pateikiama 1 paveiksle.
1 pav. Flavonoidų struktūrinė formulė [44]
Atsižvelgiant į struktūroje esančio C žiedo oksidacijos laipsnį ir cheminę junginio struktūrą, flavonoidai yra klasifikuojami į flavonus, flavonolius, flavanonus, flavan-3-olius, izoflavonus, antocianidinus, auronus, chalkonus [85].
Flavonoidai pasižymi įvairiomis farmakologinėmis savybėmis. Viena iš jų – antioksidacinis poveikis. Flavonoidų antioksidacinio poveikio mechanizmai yra susiję su reaktyvių deguonies formų (ROS) slopinimu veikiant fermentus arba chelatuojant mikroelementus, susijusius su laisvųjų radikalų gamyba. Antioksidacinis aktyvumas didesnis, kai junginio molekulėje yra dviguba jungtis tarp C2 ir C3, keto grupė prie C4, hidroksilo grupės B žiede bei kuo mažesnis prisijungusių cukrų skaičius prie aglikono [50, 85].
Flavonoidai pasižymi antibakteriniu ir antivirusiniu veikimu. Antibakterinis aktyvumas gali būti paremtas kompleksų sudarymu su baltymais veikiant vandeniliniams ryšiams, hidrofobinėms
sąveikoms bei kovalentiniams ryšiams. Taip pat antibakterinis aktyvumas gali būti susijęs su flavonoidų gebėjimu inaktyvuoti mikrobų adhezines medžiagas, ląstelių apvalkalo transporto baltymus. Lipofiliniai flavonoidai taip pat gali paveikti mikroorganizmų membranų struktūras. Pagal literatūrą, antivirusinis flavonoidų mechanizmas yra paremtas viruso polimerazės, nukleorūgšties arba kapsidės baltymų slopinimu. Tam, kad būtų pasiektas priešvirusinis aktyvumas, flavonoidų struktūroje reikalinga hidroksi grupė C3 padėtyje [26, 88].
Flavonoidai gali paveikti fermentų sistemas, dalyvaujančias uždegimo procese, ypač tirozino ir serino-treonino baltymų kinazes ir veikti priešuždegimiškai. Taip pat literatūros duomenimis flavonoidai gali slopinti azoto oksido sintazę, ciklooksigenazę ir lipooksigenazę, kurios yra atsakingos už azoto oksido, prostaglandinų, leukotrienų ir kitų, uždegime dalyvaujančių, mediatorių sintezę [80].
Flavonoidai mažina kasos beta ląstelių apoptozę, skatina proliferaciją, insulino sekreciją ir taip pasižymi antidiabetiniu poveikiu. Taip pat šie junginiai mažina atsparumą insulinui, uždegiminius procesus ir oksidacinį stresą raumenų ląstelėse [84, 89].
Flavonoidai pasižymi kardioprotekciniu poveikiu, kuris yra siejamas su antioksidacinėmis šių junginių savybėmis. Daugelis flavonoidų pasižymi antihipertenzinėmis, trombocitų agregaciją slopinančiomis savybėmis ir teigiamu poveikiu endotelio funkcijoms [41, 59, 78]. Taip pat flavonoidai dėl savo antioksidacinių savybių sumažina lipidų peroksidaciją biologinėse membranose, kas yra labai svarbu aterosklerozės vystymuisi [36].
Flavonoidai turi įtakos vėžio vystymuisi ir progresavimui [21]. Jie gali moduliuoti ląstelių apoptozę, vaskuliarizaciją, ląstelių diferencijaciją ir proliferaciją. Taip pat kai kurie flavonoidai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu slopinant angiogenezę [14].
Flavonoidai pasižymi antibakteriniu, priešvirusiniu, priešuždegiminiu, antidiabetiniu, kardioprotekciniu, priešvėžiniu poveikiais, todėl svarbu išnagrinėti šiuos junginius kaupiančių augalinių žaliavų teigiamą poveikį žmogaus sveikatai.
1.6. Juoduogių šeivamedžių žiedų biologinis aktyvumas
Jau nuo seniausių laikų juoduogis šeivamedis buvo žinomas kaip vaistinis augalas. Apie gydomąsias augalo savybes savo darbuose rašė Dioskoridas ir Hipokratas [70]. Augalo žiedai naudojami alerginių simptomų palengvinimui, virškinamojo trakto veiklos pagerinimui. Žiedų preparatai taip pat gali būti naudojami kaip šlapimą varanti priemonė, pagalbinė priemonė užkietėjus viduriams, esant viršutinių kvėpavimo takų infekcijoms [23, 56].
Juoduogių šeivamedžių žiedų milteliai yra naudojami kaip sudėtinė dalis preparato Sinupret®
atliktame tyrime buvo nustatyta, kad vartojant Sinupret® Forte tabletes pagerėjo tiriamųjų pacientų savijauta. Preparatas buvo saugus vartoti ir pasižymėjo sekretolitiniu ir priešuždegiminiu poveikiais [58].
Literatūros duomenimis, šeivamedžių žiedai gali būti naudojami kaip pagalbinė priemonė esant vidurių užkietėjimui. P. D. Picon ir kt. (2010) atliko klinikinį tyrimą su pacientais, kuriems nustatytas lėtinis vidurių užkietėjimas. Tiriamieji turėjo vartoti arbatą, kurios sudėtyje yra anyžinių ožiažolių (Pimpinella anisum L.) vaisiai, paprastųjų pankolių (Foeniculum vulgare L.) vaisiai, juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) ir aštrialapių kasijų (Cassia angustifolia L.) žiedai. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad vartojant arbatą išmatos iš žarnyno pasišalino greičiau negu vartojant placebą (atitinkamai 15,7 val. ir 42,3 val.). Pagal tyrimų duomenis, augaliniai preparatai, sudėtyje turintys šeivamedžių žiedų, gali būti naudojami esant obstipacijoms [60].
Juoduogių šeivamedžių žiedai pasižymi teigiamu poveikiu, sergant cukriniu diabetu. S. Bhattacharya ir kt. (2013) atliko tyrimą, kurio metu siekė išsiaiškinti šeivamedžių žiedų įtaką gliukozės įsisavinimui raumenų ląstelėse ir riebalų sankaupų sumažėjimui. Tam buvo panaudotas apvaliosios kirmėlės Caenorhabditis elegans genomas. Nustatyta, kad stimuliuojant raumenų skaidulines ląsteles, buvo skatinamas gliukozės metabolizmas. Manoma, kad šį poveikį sukelia augalo žieduose esantis flavonoidas naringeninas [16].
Vartojant juoduogių šeivamedžių žiedų infuzijas į vidų, nustatytas augalo diuretinis poveikis. Atliekant bandymus su pelėmis, pastebėta, kad skiriant 20 ml/kg žiedų infuzijos, pasireiškė stipresnis diuretinis poveikis lyginant su teofilinu, kurio buvo skirta 5 mg/kg. Manoma, kad šį poveikį lemia augalo žiedų sudėtyje esantys flavonoidai ir kalis [86].
Mokslinėje literatūroje yra duomenų, kad juoduogių šeivamedžių preparatai yra tinkama priemonė norint sureguliuoti kraujospūdį. C. Chrubasik ir kt. (2008) atliko tyrimą, kurio metu 80 tiriamųjų vartojo juoduogių šeivamedžių uogų sultis ir žiedų ekstraktą, taip pat tabletes, kurių sudėtyje yra šeivamedžių uogų ir žiedų sausieji ekstraktai. Preparatuose buvo nustatyta 1 mg antiocianinų, 370 mg flavonolių glikozidinių formų ir 150 mg hidroksicinamatų. Tiriamieji taip pat vartojo vaistinių smidrų (Asparagus officinalis L.) miltelių tabletes, kurių sudėtyje 19 mg saponinų. Atlikus tyrimą
paaiškėjo, kad sureguliavus mitybos įpročius ir naudojant minėtus augalinius preparatus, galima sumažinti padidėjusį kraujospūdį. Tiriamųjų pacientų vidutinis sistolinis kraujospūdis sumažėjo nuo 129 ± 13 mmHg iki 122 ± 13 mmHg, o diastolinis nuo 80 mmHg ± 9 iki 78 ± 9 mmHg. Šeivamedžių žiedų ir uogų sudėtyje esantys veiklieji junginiai pasižymi antioksidaciniu aktyvumu. Jie turi teigiamą poveikį ne tik kraujospūdžiui, bet ir kraujagyslių endotelio ląstelėms, tai gali padėti išvengti aterosklerozės vystymosi. Dėl šių priežasčių šeivamedžių žiedų ir uogų preparatai gali būti naudojami kaip pagalbinė priemonė, siekiant išvengti širdies ir kraujagyslių ligų [24].
Juoduogių šeivamedžių žiedų preparatai yra plačiai naudojami per os, siekiant pagerinti pacientų sveikatos būklę, išvengti įvairių susirgimų. Dėl sudėtyje esančių veikliųjų junginių žiedų ištraukos taip pat galėtų būti pritaikytos vietinių preparatų gamyboje.
1.7. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstrakto pritaikymo galimybės pusiau kietose
farmacinėse formose
Odos sužalojimai, sukelti temperatūros, įvarių traumų, lėtinių išopėjimų ar venų stazės, pažeidžia odą, todėl ji gali tapti įvairių bakterijų kolonizacijos vieta [61]. Infekcijas dažniausiai sukelia
Staphylococci ir Streptococci mikroorganizmai. Įvairūs patogeniniai mikroorganizmai, esantys ant odos,
gali sukelti uždegimines reakcijas audinyje, organizmo imuninį atsaką, paskatinti odos ligų atsiradimą [53, 61]. Esant odos infekcijoms dažniausiai yra skiriamas vietinis arba sisteminis gydymas antibiotikais. Vartojant šiuos preparatus, gali išsivystyti odos hiperjautrumo reakcijos, įvairios alergijos, taip pat gali būti sutrikdoma normali odos mikroflora [29, 61]. Vienas iš didžiausių antibiotikų vartojimo trūkumų – rezistentiškų mikroorganzimų atsiradimas, ypač vartojant vaistus vietiškai. Didelis kiekis bakterijų ir virusų odos paviršiuje sudaro tinkamas sąlygas geno, lemiančio rezistentiškumą antibiotikams, transdukcijai. Virusų pagalba transdukcijos metu bakterijų DNR molekulėse esanti genetinė medžiaga, lemianti atsparumą antibiotikams, gali būti perduodama kitoms bakterijoms. Išsivystęs mikroorganizmų rezistentiškumas gali prailginti ligos ir gydymo trukmę, mažinti įvairių infekcijų gydymo efektyvumą. Siekiant išspręsti šią problemą, labai svarbu surasti naujų veiksmingų antimikrobinių preparatų [87]. C. Hearst ir kt. (2010) atliko tyrimą, kurio metu buvo tiriamas juoduogių šeivamedžių žiedų, lapų ir uogų antibakterinis aktyvumas. Tyrėjai nustatė, kad etanoliniai juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktai pasižymėjo stipriausiu antibakteriniu poveikiu lyginant su lapų ir uogų ekstraktais. Sambucus nigra L. žiedų ekstraktas sustabdė meticilinui atsparaus auksinio stafilokoko (MRSA), Bacillus cereus,
Salmonella poona ir Pseudomonas aeroginosa augimą [40]. Augalo sudėtyje esantys flavonoidai
pasižymi antibakteriu poveikiu dėl savo gebėjimo kompleksiškai susijungti su ekstraceliuliniais, tirpiais baltymais ir taip sunaikinti bakterijos sienelę sąveikaujant su fermentais, atsakingais už ląstelės struktūrą. Taip pat antibakterinis poveikis gali pasireikšti dėl sudėtyje esančių junginių gebėjimo pažeisti membraną, sukeliant perforaciją arba keičiant membranos takumą. Dėl minėtų priežasčių augalo žiedų ekstraktai galėtų būti naudojami kaip veiklioji medžiaga pusiau kietose formose, skirtose odos infekcijų prevencijai [61].
Nuolatinis saulės spinduliuotės poveikis gali sukelti priešlaikinį odos senėjimą, sausumą, kapiliarų išsiplėtimą jos paviršiuje, kolageno praradimą ir paskatinti odos vėžio atsiradimo tikimybę. Augalų sudėtyje esantys fenoliniai junginiai absorbuoja platų UV spinduliuotės spektrą, įskaitant UVB
ir UVA zonas. Be to, jie sumažina saulės spinduliuotės skvarbą į odą, uždegimą, oksidacinį stresą ir kenksmingą poveikį DNR. Fenoliniai junginiai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, kurios slopina kenksmingą laisvųjų radikalų poveikį odai [46]. Dėl šių priežasčių juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktas galėtų būti naudojamas pusiau kietų farmacinių formų, skirtų apsaugai nuo UV spindulių, gamyboje. A. Jarzycka ir kt. (2013) atliktame tyrime buvo pagamintos įvairių variacijų emulsijos su smiltyninių šlamučių (Helichrysum arenarium L.), juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) ir vienapiesčių gudobelių (Crataegus monogyna L.) žiedų ekstraktais. Emulsija, kurios sudėtyje buvo juoduogių šeivamedžių ir vienapiesčių gudobelių žaliavų ištraukos, pasižymėjo stipriausiu antioksidaciniu poveikiu, gauta apsaugos nuo saulės faktoriaus (SPF) reikšmė 18,21 ± 5,24. Juoduogių šeivamedžių žiedų ištraukos, kaip veiklioji medžiaga, galėtų būti naudojamos apsauginių preparatų nuo saulės gamyboje [46].
Augalo žiedų ekstraktas, kaip veiklioji medžiaga, puskietėse formose taip pat gali būti naudojamas išoriškai sumažinti akių paraudimą, odos sudirginimui ir uždegimui mažinti, taip pat esant nedidelėms žaizdoms. Augalo ekstrakto sudėtyje yra gleivių, dėl kurių jis galėtų būti naudojamas pusiau kietų preparatų, turinčių emoliento savybių, gamyboje. Šeivamedžių žiedų ekstrakto sudėtyje yra flavonoidų, kurie pasižymi priešuždegiminiu, kraujotaką stimuliuojančiu efektu. Dėl šios priežasties ekstraktas, kaip veiklioji medžiaga, gali būti naudojamas celiulito prevencijai, sumažinti apatinių galūnių sunkumo ir nuovargio jausmą, vartojant išoriškai [19].
Mokslinės literatūros duomenimis, juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktas, kaip veiklioji medžiaga, gali būti pritaikomas formuluočių gamyboje, kurios pasižymėtų antibakterinėmis, apsauginėmis ir priešuždegiminėmis savybėmis.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Pusiau kietos farmacinės formos su skystuoju juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų ekstraktu.
2.2. Tyrimų medžiagos ir įranga
2.2.1. Naudotos medžiagos
Smulkinti juoduogių šeivamedžių žiedai: LSMU vaistinė, Lietuva; Etanolis 96,6 proc.: AB „Stumbras“, Lietuva;
Aliuminio trichlorido heksahidratas (AlCl3×6H2O): Sigma–Aldrich® Chemie GmbH, Vokietija;
Karbomeras 980: Fagron, JAV;
Trietanolaminas: AppliChem GmbH, Vokietija;
Skystasis parafinas: Sigma–Aldrich® Chemie GmbH, Vokietija;
Sorbitano monostearatas (span 60): Sigma–Aldrich® Chemie GmbH, Vokietija;
Folin–Ciocalteu phenol reagentas: Sigma–Aldrich®, Šveicarija;
Natrio karbonatas (Na2CO3): Sigma–Aldrich®, Prancūzija;
Acto rūgštis ≥ 99,8 proc.: Sigma–Aldrich® Chemie GmbH, Vokietija;
DPPH (2,2–difenil–1–pikrilhidrazilas): Sigma–Aldrich®, Vokietija;
Rutino trihidratas: Sigma Aldrich®, Vokietija;
Miulerio–Hintono agaras: Oxoid, Anglija;
Bakterijų kultūros: referentinės Stapyloccocus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus ATCC 11778, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ir klinikinės Stapyloccocus aureus, Bacillus
cereus, Pseudomonas aeruginosa.
2.2.2. Naudota įranga
pH–metras – Knick pH–Meter, 766 Calimatic, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija;
Viskozimetras – Vibro viscometer SV– 10, A&D Company ltd, Japonija; Svarstyklės – Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija;
Magnetinė maišyklė su kaitinamuoju paviršiumi – IKA C–MAG HS7, IKA–Werke GmbH & Co. KG, Vokietija;
Spektrofotometras su diodų matricos detektoriumi – Agilent 8453 UV–Vis, Agilent Technologies, JAV;
Mikroskopas – Motic B3, Motic China Group Co., Ltd., Kinija.
2.3. Tyrimų metodai
2.3.1. Juoduogių šeivamedžių žiedų skystojo ekstrakto technologija
Etanoliniai juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktai buvo gaminami maceracijos būdu, remiantis bendrosiomis ekstraktų gamybos taisyklėmis [66].
Kaip ekstrahentas buvo naudojamas 40, 70 ir 80 proc. (V/V) etanolis. Ektrahento kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:
V = V1 + PK, kur V1 – ekstrakto kiekis, kurį reikia pagaminti; P – žaliavos kiekis; K – žaliavos
sugerties koeficientas. Gaminant ekstraktus žaliavos ir ekstrahento santykis 1:1 [66].
Ruošiant ekstraktą pirmiausia pasveriamas atitinkamas kiekis susmulkintos juoduogių šeivamedžių žiedų žaliavos. Pasverta žaliava sudedama į indą. Po to žaliava užpilama atitinkamu kiekiu reikiamos koncentracijos etanoliu. Žaliava užpilta ekstrahentu laikoma kambario temperatūroje 7 paras, retkarčiais pamaišant. Praėjus 7 paroms ištrauka nupilama ir juoduogių šeivamedžių žiedų žaliava spaudžiama, perplaunama nedideliu kiekiu grynojo tirpiklio, o po to dar kartą spaudžiama. Surinktas ekstraktas laikomas vėsiai (šaldytuve) 24 val. ir po to filtruojamas pro popierinį filtrą. Gaunamas specifinio kvapo, rudos spalvos, skaidrus skystasis ekstraktas.
2.3.2. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų
ekstraktu gamyba
1. Hidrofilinių gelių gamyba. Pirmiausia buvo gaminami karbomeriniai hidrogeliai (N1–N3), kuriuose ekstrakto kiekis – 15 proc., 20 proc. bei 30 proc. Kaip karbomerą neutralizuojanti medžiaga buvo naudojamas trietanolaminas [79]. Gamyba pradedama pamatuojant atitinkamą tūrį išgryninto vandens, kuris supilamas į grūstuvę. Atsvėrus 1 g karbomero, jis plonu sluoksniu beriamas ant vandens ir maišoma tol, kol susidaro vienalytė masė ir nebelieka karbomero gumulėlių. Į grūstuvę supilamas juoduogių šeivamedžių žiedų ekstrakto atitinkamas kiekis ir maišoma, kol ekstraktas tolygiai pasiskirsto
karbomero gelyje. Neutralizuojama trietanolaminu tol, kol gelio pH pasiekia 7 ir gaunamas tinkamos konsistencijos gelis [45]. Maišoma iki vienalytės masės.
2. Dvifazių gelių gamyba. Dvifazių gelių gamyba pradedama nuo oleogelio paruošimo. Į porcelianinę lėkštelę pasveriamas atitinkamas kiekis skystojo parafino ir šildoma ant vandens vonios. Šildant skystame parafine ištirpinamas atitinkamas kiekis span 60. Kaitinama ir maišoma iki vienalytės masės. Kuomet susidaro vienalytė masė, oleogelis perkeliamas į indą ir kambario temperatūroje maišant, vėsinama. Į pagamintą karbomero gelį, kuriame yra veiklioji medžiaga, įterpiamas atvėsintas oleogelis. Maišoma iki vienalytės masės.
Gaminant dvifazius gelius santykiai tarp hidrogelio ir oleogelio buvo 1:1 (N4–N6), 7:3 (N7– N9) bei 9:1 (N10–N12). Iš viso buvo gaminama po 100 g kiekvieno puskiečio preparato. Kiekviename preparate atitinkamai pagal santykį buvo 50 g, 70 g ir 90 g hidrogelio, taip pat 50 g, 30 g ir 10 g oleogelio. Ekstraktas buvo įterpiamas į hidrogelį. Jo kiekis puskiečiuose preparatuose buvo 15 proc., 20 proc., arba 30 proc. Pagamintų hidrogelių ir dvifazių gelių sudėtys pateiktos 1 lentelėje.
1 lentelė. Pusiau kietų preparatų sudėtys (100 g)
Tiriamasis pavyzdys Skystasis juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktas (ml) Karbomeras 980 (g) Išgrynintas vanduo (ml) Trietanolaminas Skystasis parafinas (g) Span 60 (g) N1 30 1 67 qs ad pH = 7 – – N2 20 77 N3 15 82 N4 30 18,5 42,5 7,5 N5 20 28,5 N6 15 33,5 N7 30 38,5 25,5 4,5 N8 20 48,5 N9 15 53,5 N10 30 58,5 8,5 1,5 N11 20 68,5 N12 15 73,5
Pastaba: N1, N2, N3 – hidrofiliniai geliai, N4, N5, N6 – dvifaziai geliai (1:1), N7, N8, N9 – dvifaziai geliai (7:3) N10, N11, N12 – dvifaziai geliai (9:1).
Pagaminti puskiečiai preparatai pakuojami į plastikinius indelius. Ženklinama pagaminimo data, gamybos serija, nurodomas pagamintas kiekis.
2.4. Juoduogių šeivamedžių žiedų preparatų kokybės vertinimo metodai
2.4.1. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų bendro fenolinių junginių kiekio
nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas naudojant Folin–Ciocalteu reagentą. Tyrimo metu matuojama absorbcija 765 nm bangos ilgyje su Agilent 8453 UV–Vis spektrofotometru. Reakcijos metu fenoliniai junginiai geba reaguoti su Folin–Ciocalteu reagentu suformuojant mėlynos spalvos kompleksinius junginius [18].
Pirmiausia yra paruošiami juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų tirpalai santykiu 1:50. Į matavimo kolbutę, kurios tūris 50 ml, pilamas 1 ml skystojo šeivamedžių žiedų ekstrakto ir skiedžiama tirpikliu, kuris buvo naudotas ekstrakto gamyboje [7].
Pagaminus tirpalus į 10 ml kolbutę yra pilama 3 ml išgrynintojo vandens, 1 ml Folin–Ciocalteu reagento ir 1 ml pagaminto ekstrakto tirpalo. Supylus suplakama, laikoma 2–3 minutes. Vėliau supilama 1,5 ml vandeninio Na2CO3 tirpalo, kurio koncentracija 20 proc. Praskiedžiama iki kolbutės žymės
išgrynintu vandeniu. Praskiedus laikoma tamsiai, kambario temperatūroje 30 minučių. Fenolinių junginių koncentracija nustatoma naudojant kalibracinį grafiką pagal p-kumaro rūgštį [7, 77].
2.4.2. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų bendro flavonoidų kiekio
nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras flavonoidų kiekis nustatomas atliekant reakciją su AlCl3 rūgščioje aplinkoje ir
matuojant absorbciją 415 nm bangos ilgyje su Aligent 8453 UV–Vis spektrofotometru. Ši reakcija yra pagrįsta tuo, kad AlCl3 rūgščioje aplinkoje reaguoja su flavonų ir flavonolių C4 keto grupe ir C3/C5
hidroksi grupe, taip pat gali suformuoti ir nestabilius kompleksus su orto–dihidroksilo grupėmis flavonoidų A ir B žieduose [15].
5 ml juoduogių šeivamedžių žiedų ekstrakto įpilama į 25 ml matavimo kolbutę ir praskiedžiama 96 proc. (V/V) etanoliu iki žymės. Iš gauto tirpalo į 25 ml matavimo kolbutę atmatuojamas 1 ml tirpalo, įpilama 10 ml 96 proc. (V/V) etanolio, 2 ml AlCl3 tirpalo, įlašinamas lašas praskiestos acto rūgšties.
Kolbutės turinys atidžiai išmaišomas, po 20 minučių praskiedžiama 96 proc. (V/V) etanoliu iki žymės. Bendras flavonoidų kiekis buvo nustatomas pagal rutino kalibracinį grafiką. Gautas atsakymas buvo dauginamas iš eksperimento metu vykdomo skiedimo skaičiaus [6].
2.4.3. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo
nustatymas spektrofotometriniu metodu
Ekstraktų antiradikalinis aktyvumas nustatytas naudojant DPPH radikalų surišimo metodą. Šis metodas paremtas tuo, jog DPPH gali priimti elektroną iš antioksidanto. Gavęs elektroną DPPH redukuojasi ir pakeičia spalvą iš violetinės į geltoną [73].
Norint nustatyti antioksidacinį aktyvumą 24 val. prieš tyrimą buvo pagamintas 0,1 mmol/l DPPH tirpalas 96 proc. etanolyje. Tirpalas visą laiką buvo laikomas tamsioje, vėsioje vietoje. Atliekant šį metodą 0,1 ml ekstrakto yra sumaišoma su 2,9 ml DPPH tirpalo ir po 30 minučių yra matuojama gauto tirpalo absorbcija spektrofotometru 518 nm bangos ilgyje [9].
Siekiant įvertinti antiradikalinį aktyvumą naudojama formulė [2]:
Inaktyvuotas DPPH kiekis (proc.) = [𝐴𝑜−𝐴𝑡
𝐴𝑜 ] × 100
Kur: Ao – DPPH palyginamojo tirpalo absorbcija, At – tiriamojo tirpalo absorbcija.
2.4.4. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstrakto antibakterinio aktyvumo nustatymas
Juoduogių šeivamedžių žiedų skystojo ekstrakto (E2) antibakterinės savybės vertintos in vitro, difuzijos į agarą metodu. Tam buvo naudotas Miulerio–Hintono agaras. Antibakterinis tyrimas buvo atliekamas naudojant gramteigiamas referentines bei klinikines Staphylococcus aureus, Bacillus cereus ir gramneigiamas Pseudomonas aeruginosa bakterijų padermes. Paruoštas skystas Miulerio–Hintono agaras buvo išpilstytas į Petri lėkšteles po 35 ml į kiekvieną ir paliktas horizontalioje padėtyje tam, kad sutirštėtų. Kai terpė sustingsta, ant paviršiaus paskleidžiamos bakterijų padermės. Petri lekštelėse buvo padaryti 6 šulinėliai, į kiekvieną pilama po 0,1 ml E2 skystojo ekstrakto ir kontrolinių meginių – 70 proc. (V/V) etanolio ir 1 proc. chlorheksidino gelio. Kiekvienai tiriamajai medžiagai buvo skirta po du šulinėlius. Lėkštelės buvo inkubuojamos 24 val. 36 °C temperatūroje [1].
Norint nustatyti juoduogių šeivamedžių žiedų skystojo ekstrakto antibakterinį aktyvumą in
vitro, po 24 valandas trukusio kultivavimo, buvo apskaičiuojamas inhibuotų zonų skersmuo (mm), kuris
susidarė aplink šulinėlius. Jeigu susidaro skaidri zona – medžiaga pasižymi bakteriocidiniu poveikiu tiriamosioms bakterijoms. Jeigu susidaro skirtingo skersmes zona, kurioje pastebimos vos matomos kolonijos, pasižyminčios lėtu augimu – tiriamoji medžiaga pasižymi bakteriostatiniu poveikiu prieš tyrimui naudotas bakterijas [1].
2.4.5. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų
ekstraktu fizinių savybių vertinimas
Buvo atliktas pagamintų pusiau kietų farmacinių formų mikroskopinis vienalytiškumo ir fizinis įvertinimas. Mikroskopinio tyrimo metu buvo naudotas mikroskopas Motic (Motic B3, Motic China Group Co., Ltd., Kinija), naudota kamera – Moticam 1000 1.3 Pixel (Motic China Group Co., Ltd., Kinija). Pirmiausia labai plonas pagaminto puskiečio preparato sluoksnis užtepamas ant objektinio stiklelio, kuris uždengiamas dengiamuoju stikleliu ir užlašinamas aliejaus lašas. Toliau ant mikroskopo darbinio paviršiaus pritvirtinamas objektinis stiklelis ir nuleidžiamas mikroskopo objektyvas. Mikroskopu mėginiai buvo didinami 400 kartų, kompiuterio ekrane buvo stebimos mikroskopinės nuotraukos, kurių vaizdas fotografuojamas [8].
2.4.6. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų
ekstraktu dinaminės klampos nustatymas
Pagamintų hidrogelių ir dvifazių gelių klampa buvo išmatuota naudojantis viskozimetru Vibro viscometer SV– 10 (A&D Company ltd, Japonija). Apie 40 g tiriamojo puskiečio preparato įdedama į viskozimetro celę, tuomet nuleidžiama sensorinė plokštelė ir išmatuojama dinaminė klampa. Matavimai atliekami kambario temperatūroje [3].
2.4.7. Pusiau kietų farmacinių formų su skystuoju juoduogių šeivamedžių žiedų
ekstraktu pH reikšmės nustatymas
Pagamintų puskiečių preparatų pH reikšmės buvo nustatytos naudojant pH–metrą, kuris yra skirtas specialiai pusiau kietų farmacinių formų pH reiškmės nustatymui (pH–meter 766 su elektrodu Knick SE 104N). Atitinkamas kiekis tiriamo gelio patalpinamas į stiklinėlę, tuomet matuojama pH reikšmė. Po kiekvieno matavimo elektrodai nuplaunami su išgrynintu vandeniu [5].
2.4.8. Veikliųjų junginių atpalaidavimo iš pusiau kietų farmacinių formų tyrimas
in vitro
Buvo atliktas pagamintų puskiečių preparatų biofarmacinis tyrimas in vitro. Jo metu naudotos modifikuotos Franz tipo difuzinės celės. Jos sudarytos iš dviejų terpių – akceptorinės ir donorinės. Terpes skiria pusiau laidi membrana. Prieš pradedant biofarmacinį tyrimą, celiuliozinė membrana turi
būti pamerkiama į išgrynintą vandenį ir laikoma kambario temperatūroje 24 val. Tyrimo metu kaip akceptorinė terpė buvo naudotas 25 ml 70 proc. (V/V) etanolis. Donorinė terpė – pagaminti hidrogeliai ir dvifaziai geliai, kurių naudojama 1,0 ± 0,05 g. Puskiečiai preparatai patalpinami į cilindro formos plastikinius indelius su stūmokliu, uždedama celiuliozinė membrana ir dedama į indelius, kuriuose yra 25 ml akceptorinės terpės. Tyrimo metu palaikoma pastovi temperatūra – 32 ± 0,5 oC, siekiant imituoti
žmogaus odos temperatūrą. Tam naudojama vandens vonelė, kuri patalpinama ant magnetinės maišyklės. Naudojant magnetinę maišyklę palaikomas pastovus akceptorinės terpės maišymas. Mėginiai imami po 1, 2, 4 ir 6 val. Imama po 1 ml mėginio ir toks pats kiekis akceptorinės terpės grąžinamas atgal [7, 57].
Gauti mėginiai analizuojami spektrofotometriškai pagal rutino kalibracinį grafiką, siekiant nustatyti bendrąjį flavonoidų kiekį [6].
2.5. Statistinė analizė
Visi tyrimai buvo kartoti tris kartus. Statistinė analizė atlikta naudojant Microsoft Office Excel 2013 ir IBM SPSS 20.0 programas. Buvo apskaičiuoti rezultatų vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai, tyrimo rezultatų skirtumų reikšmingumas įvertintas naudojant vieno faktoriaus disperinės analizės modelį (One–way ANOVA), reikšmingumo lygmuo p<0,05. Rezultatų koreliacija įvertinta Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientu.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų kokybės vertinimas
3.1.2. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų bendro fenolinių junginių ir
flavonoidų kiekio vertinimas spektrofotometriniu metodu
Pirmame eksperimentinių tyrimų etape pagaminti skystieji juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktai – žaliavos ir ekstrahento santykis (1:1). Siekiant parinkti tinkamą ekstrahentą veikliųjų junginių išekstrahavimui iš šeivamedžių žiedų, ekstraktų gamyboje tirpikliu naudotas 40, 70 ir 80 proc. (V/V) etanolis. 2 lentelėje pateikiami šeivamedžių žiedų skystųjų ekstraktų kokybės tyrimo rezultatai.
2 lentelė. Juoduogių šeivamedžių žiedų skystųjų ekstraktų kokybės tyrimo rezultatai
Skystasis ekstraktas Ekstrahentas Žaliavos ir ekstrahento santykis Pagaminto ekstrakto išvaizda Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/ml) Bendras flavonoidų kiekis (mg/ml) E1 40 proc. (V/V) etanolis 1:1 Rudai žalios spalvos, specifinio kvapo skystis 3,78 ± 0,289 1,49 ± 0,245 E2 70 proc. (V/V) etanolis 7,48 ± 0,105 5,11 ± 0,211 E3 80 proc. (V/V) etanolis 5,21 ± 0,227 4,10 ± 0,149
Tyrimų rezultatai parodė, kad skystųjų ekstraktų išvaizdai etanolio koncentracija įtakos neturėjo, visiems ekstraktams būdinga rudai žalia spalva, jie taip pat pasižymi specifiniu kvapu. Vertinant veikliųjų junginių kiekį, didžiausias bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis nustatytas ekstraktuose, kai žaliavos ekstrahavimui buvo naudotas 70 proc. (V/V) etanolis. Tarp bendrojo junginių kiekio ekstraktuose E1, E2 ir E3 nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05). Lyginant eksperimentiškai gautus rezultatus su S. A. Socaci ir kt. (2015) tyrimo rezultatais, bendras flavonoidų kiekis juoduogių šeivamedžių žiedų ištraukose buvo 4,31 mg/ml, o fenolinių junginių – 5,43 mg/ml. Gauti rezultatai galėjo skirtis dėl reagentų, žaliavos augimo vietos, geografinių, klimato veiksnių, kadangi tyrimo metu buvo naudoti šeivamedžių žiedai iš Rumunijos Kluža-Napoka miesto [76].
Siekiant sumodeliuoti kokybiškas pusiau kietas farmacines formas, kaip veiklioji medžiaga, pasirinktas skystasis šeivamedžių žiedų ekstraktas E2, kuriame nustatytas didžiausias veikliųjų junginių kiekis.
3.1.3. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo vertinimas
spektrofotometriniu metodu
Planuojant gaminti puskietes farmacines formas, kurioms būdingas apsauginis poveikis, vienas iš tyrimo uždavinių – įvertinti pagamintų juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą. Antiradikalinis aktyvumas vertintas DPPH radikalų surišimo metodu. Tyrimų rezultatai pateikiami 2 paveiksle.
2 pav. Inaktyvuoto DPPH kiekis (proc.) naudojant skirtingus ekstraktus
Rezultatai yra pateikiami kaip inaktyvuoto DPPH kiekis procentais. Ekstraktas E2, kurio gamyboje kaip ekstrahentas buvo naudotas 70 proc. (V/V) etanolis, sudėtyje turėjo didžiausią flavonoidų bei fenolinių junginių kiekį ir pasižymėjo statistiškai reikšmingai (p<0,05) didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu. Lyginant su ekstraktais (E1, E3), kurių sudėtyje buvo mažesnis bendras veikliųjų junginių kiekis, atitinkamai buvo mažesnis inaktyvuoto DPPH kiekis procentais. Nustatytas Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientas tarp veikliųjų junginių kiekio ir antiradikalinio aktyvumo r = 1,000. Remiantis statistine analize galima teigti, kad ekstraktų antiradikalinės savybės yra tiesiogiai susijusios su fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiais, esančiais ekstrakte. Didėjant veikliųjų junginių kiekiui – didėja antiradikalinis aktyvumas. Eksperimentiškai gautus duomenis lyginant su I. Stoilova ir kt. (2007) rezultatais, buvo nustatyta, kad juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktas inaktyvavo 97,7 proc. DPPH tirpalo [77]. A. L. Dawidowicz ir kt. (2006) taip pat atliko tyrimą, kurio metu buvo vertinamas juoduogių šeivamedžių žiedų, lapų ir uogų antiradikalinis aktyvumas, naudojant DPPH radikalų surišimo metodą. Tyrimo metu nustatyta, kad didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymėjo augalo žiedai, inaktyvuotas DPPH kiekis procentais 91,95 ± 0,12 proc. Beveik dvigubai mažesniu antiradikaliniu aktyvumu pasižymėjo augalo uogos – 50,25 ± 0,80 proc. Mažiausias inaktyvuotas DPPH kiekis buvo nustatytas lapuose – 16,76 ± 0,32 proc [27]. Gauti tyrimo rezultatai patvirtina literatūros duomenis, jog juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktai pasižymi antiradikaliniu aktyvumu [27, 77].
25,68 74,69 60,02 0 10 20 30 40 50 60 70 80 E1 E2 E3 Inak tyvuoto DP PH k iek is (proc.) Skystasis ekstraktas
