LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
Eglė Zlatkutė
HIPOFIZĖS ADENOMOS SĄSAJOS SU MMP-1 IR FGFR4-R388
GENŲ POLIMORFIZMAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė dr. Rasa Liutkevičienė
Kaunas
2016
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
PADĖKA ... 6
SUTARTINIAI ŽYMĖJIMAI IR SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
I. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Hipofizės adenoma ... 11
1.1.1. Hipofizės adenomos epidemiologija ... 11
1.1.2. Hipofizės adenomos etiologija ... 11
1.1.3. Hipofizės adenomos klinika ir diagnostika ... 12
1.1.4. Hipofizės adenomos gydymas ... 13
1.2. Imunogenetiniai veiksniai ... 13
1.2.1. Biologiniai markeriai, susiję su hipofizės adenoma ... 13
1.2.2. Fibroblastų augimo faktoriaus receptorius 4 (FGFR4-R388) ... 18
1.2.3. Matrikso metaloproteinazė-1 (MMP-1) ... 189
II. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 20
2.1 Tyrimo planavimas, tyrimo objektas ir tiriamųjų atranka ... 20
2.2. Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas ... 21
2.2.1. DNR išskyrimas naudojant silikagelio kolonėles ... 21
2.2.2. DNR išskyrimas naudojant magnetines daleles ... 22
2.3. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru... 24
2.4. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas TL – PGR metodu ... 24
2.4.1. PGR etapai ... 24
2.4.2. PGR principas ... 24
2.5. Statistinė analizė ... 26
III. REZULTATAI ... 27
3.1. Rs1799750 ir Rs351855 genotipų dažnis pacientams, sergantiemshipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje ... 27
3.2. Rs1799750 ir Rs351855 genotipų dažnis pacientams, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį... 29
3 3.3. Rs1799750 ir Rs351855 genotipų dažnis pacientams, sergantiems hipofizės adenoma ir
kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į hipofizės adenomos invazyvumą ... 31
3.4. Rs1799750 ir Rs351855 genotipų dažnis tiriamiesiems, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į hipofizės adenomos aktyvumą ... 32
3.5. Rs1799750 ir Rs351855 genotipų dažnis tiriamiesiems, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į hipofizės adenomos atkryčius ... 34
IV. REZULTATŲ APTARIMAS ... 366
V. IŠVADOS ... 38
VI. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 39
VII. PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 46
4
SANTRAUKA
Baigiamojo magistro darbo autorė: Baigiamojo magistro
darbo pavadinimas: Vadovė:
Eglė Zlatkutė
Hipofizės adenomos sąsajos su MMP-1 ir FGFR4-R388 genų polimorfizmais dr. Rasa Liutkevičienė
Hipofizė – maža vidaus sekrecijos liauka, sverianti apie 0,5 gramo. Hipofizė yra laikoma pačia svarbiausia žmogaus vidaus sekrecijos liauka, kuri reguliuoja kitų liaukų hormoninę veiklą. Ji yra pleištakaulio kūno viršutinės sienos įduboje. Šioje srityje yra labai daug svarbių nervinių, kraujagyslinių, endokrininių ir kaulinių struktūrų, todėl čia kyla daugybė patologinių procesų. Hipofizės adenoma yra dažniausiai pasitaikantis nepiktybinis turkiabalnio srities navikas, kurio etiopatogenezė nėra visiškai aiški. Pastaruoju metu yra tiriama daug genetinių veiksnių darančių įtaką hipofizės adenomos pasireiškimui, tačiau tikslūs mechanizmai lemiantys hipofizės adenomos atsiradimą nėra žinomi.
Darbo tikslas: Įvertinti MMP-1 ir FGFR4-R388 genų polimorfizmus pacientams, sergantiems hipofizės adenoma.
Tyrimo medžiaga ir metodai: Ištirta 100 asmenų, kuriems nustatyta hipofizės adenoma ir 200 sveikų tiriamųjų. DNR buvo išskirta iš periferinio kraujo leukocitų naudojant komercinius rinkinius. Genotipavimas atliktas naudojant realaus laiko polimerazės grandinės reakcijos metodą. Rezultatai vertinti naudojant „IBM SPSS Statistics" kompiuterinę programą.
Rezultatai: MMP-1 geno 1G/1G polimorfizmas buvo dažnesnis invazyvia HA sergantiems pacientams nei kontrolinėje grupėje: 28,6 proc. vs. 16,5 proc., p=0,044. 1G/2G genotipas buvo dažnesnis kontrolinės grupės moterims nei HA grupės moterims: 50,3 proc. vs. 30,8 proc., p=0,011. 1G/1G genotipas taip pat buvo dažnesnis hormonų atžvilgiu aktyvios HA grupėje nei kontrolinėje grupėje: 28,4 proc. vs. 16,5 proc., p=0,044. Tiriant FGFR4-R388 geną, jokių statistiškai reikšmingų rodmenų, įtakojančių HA pasireiškimą nunustėme.
Išvados: MMP-1 geno 1G/1G genotipas gali turėti įtakos invazyvios ir aktyvios HA pasireiškimui. Darbas atliktas: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Neuromokslų instituto, Oftalmologijos laboratorijoje ir LSMUL Kauno klinikų, Akių ligų klinikoje, Neurochirurgijos klinikoje.
Interesų konfliktas: autoriui interesų konflikto nebuvo.
Raktiniai žodžiai: Hipofizės adenoma, Matrikso metaloproteinazė-1, FGFR4-R388, genų polimorfizmas
5
SUMMARY
The author of Master’s thesis: The title of Master’s thesis:
The Head of thesis:
Eglė Zlatkutė
Pituitary adenoma‘s link to MMP-1 and FGFR4-R388 gene polymorphisms dr. Rasa Liutkevičienė
Pituitary gland is considered to be the most important endocrine gland which regulates the body’s hormones. It weighs about 0,5 grams. Hypophysis is located in the sphenoid body’s superior surface depression, sella turcica. This area is surrounded by very important neural, vascular, endocrinal and osseous structures; therefore many pathological processes can arise in this zone. In sella turcica the most common pathological process is hypophysis adenoma which has unclear etiopathogenesis. Recently many immunogenetic factors which have influence on appearance of hypophysis adenoma have been investigated. However the accurate mechanisms are still unknown. The aim of work: To determine MMP-1, FGFR4-R388 single nucleotide polymorphism and vision functions to patients with pituitary adenoma.
Methods and materials: The study enrolled 100 patients with pituitary adenoma and a random sample of the population n=200 (control group). Samples of DNA from peripheral blood leukocytes were purified by commercial kits. The genotyping test was carried out using the method of real-time polymerase chain reaction. The results were assessed using the statistical analysis method of“IBM SPSS Statistics”.
Results: The polymorphism in MMP-1 gene 1G/1G genotype was more frequent in invasive PA group than in control group: 28.6% vs. 16.5%, p=0.044. 1G/2G genotype was more frequent in females of control group compared to PA group females: 50.3% vs. 30.8%, p=0.011.The polymorphism in MMP-1 gene MMP-1G/MMP-1G genotype was more frequent in active PA group than in control group: 28.4% vs. MMP-16.5%, p=0.044.FGFR4-R388 did not play any predominant role in PA development.
Conclusions: MMP-1 gene 1G/1G may play role in invasive and in active PA development.
Research performed at: Ophthalmology laboratory, Neuroscience Institute, Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences, Department of Ophthalmology and Department of Neurosurgery, Lithuanian University of Health Sciences.
Conflict of interest: the author declares no conflict of interest.
6
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovei dr. Rasai Liutkevičienei už pagalbą, rašant baigiamąjį magistro darbą. Už pagalbą, renkant tiriamųjų grupę, dėkoju doktorantei Brigitai Glebauskienei. Už MRT duomenų analizavimą dėkoju gydytojai radiologei Silvijai Jakštienei. Už pagalbą, renkant kontrolinę grupę, dėkoju doktorantei Renatai Vaičiulienei. Už pagalbą laboratorijoje dėkoju genetikei Alvitai Vilkevičiūtei. Už konsultacijas, rašant baigiamąjį magistro darbą, dėkoju prof. Daliai Žaliūnienei.
7
SUTARTINIAI ŽYMĖJIMAI IR SANTRUMPOS
AIP (angl. aryl hydrocarbon receptor-interacting protein) – su arilo hidrokarbonato receptoriais sąveikaujantis baltymas
AKTH – adrenokortikotropinis hormonas
BMP-4 (angl. bone morphogenetic protein 4) – kaulų morfogenetinis baltymas 4
cAMP – cikloadenozinmonofosfatazė
CNC (angl. The Carney complex) – Carney kompleksas
DAX-1 (angl. dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene
1) – potencialus sėklides slopinantis genas (supresorius), esantis X chromosomoje
DEGs (angl. differentialyexpressed genes) – skirtingai išskirti genai DNR – deoksiribonukleininės rūgšties
EDTA – etilendiamintetraacetatas
ETS (angl. E-Twenty-Six) – transkripcijos genų šeima FAF – fibroblastų augimo faktorius
FGFR4-R388 (angl. fibroblast growth factor receptor) – fibroblastų augimo faktoriaus receptorius 4 – 388 radikalas
FIPA (angl.familial isolated pituitary adenoma) – šeiminė izoliuota hipofizės adenoma GATA-2 – endotelio transkripcijos faktorius 2
GADD45 (angl. growth arrest and DNA-damage-inducible protein) – augimą stabdantis ir DNR pažaidas
sukeliantis baltymas
GHRH (angl. growth hormone releasing hormone) –augimo hormoną išlaisvinantis hormonas HA – hipofizės adenoma
IGFBP3 (angl. insulin-like growth factor-binding protein 3) – į insuliną panašaus augimo faktorių surišantis baltymas 3
IL-17 – interleukinas 17
KEAF – kraujagyslių endotelio augimo faktorius LH – liuteinizuojantis hormonas
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
MEG3a (angl. maternally expressed gene 3a) – motinos išreikštas genas 3a
MEN1 (angl. multiple endocrine neoplasia type 1) - dauginės endokrininės neoplazijos sindromo 1 tipas miRNR – mikroRNR
MMP-1 – matrikso metaloproteinazė-1 MMP-9 – matrikso metaloproteinazė-9
8 mRNR – matricinė RNR
MRT – magnetinio rezonanso tyrimas
NCAM (angl. neural cell adhesion molecule) – neuronų adhezijos molekulė NeuroD1 – neurogeninė diferenciacija 1
NI – neuromokslų institutas
OKT – optinė koherentinė tomografija
p53 – auglio supresoriaus baltymas, kurį koduoja TP53 genas.
Pit-1, POU1F1 (angl. POU domain, class 1, transcription factor 1) – augimo hormono faktorius 1 POMK – proopiomelanokortinas
PTTG (angl. pituitary tumor transforming gene) – hipofizės auglį transformuojantis genas
SLFN5 (angl. human schlafen 5) – žmogaus sklafenas 5, baltymas, skatinantys išsiskirti interferonus SF-1 – steroidogeninis faktorius 1
SN – standartinis nuokrypis
STAT (angl. signal transducer and activator of transcription) – transkripcijos signalo keitiklis ir aktyvatorius
TL – PGR – tikro laiko polimerazės grandininė reakcija UV – ultravioletinė šviesa
VNP – vieno nukleotido polimorfizmas
α-GSU (angl. α-glycoprotein subunit) – alfa glikoproteino dalis
9
ĮVADAS
Hipofizė - maža vidaus sekrecijos liauka, sverianti apie 0,5 gramo; moterų paprastai būna kiek didesnė nei vyrų. Hipofizės adenomos sudaro 15 procentų visų galvos smegenų navikų [1]. Hipofizė yra lokalizuota pleištakaulio kūno viršutinės sienos įduboje, turkiabalnyje. Ji sudaryta iš priekinės skilties arba adenohipofizės, sudarančios beveik 80 procentų hipofizės tūrio ir užpakalinės skilties, neurohipofizės. Turkiabalnio sritis yra apsupta labai svarbių nervinių, kraujagyslinių, endokrininių ir kaulinių struktūrų, todėl iš šios zonos gali kilti daugybė patologinių procesų. Dažniausia šios srities patologija yra vadinama hipofizės adenoma (HA). Kliniškai reikšmingos HA pasireiškia 1 iš 1064 gyventojų [2]. Moterys šia liga serga dukart dažniau nei vyrai [3].
Hipofizės adenoma yra gerybinis navikas, augantis iš priekinės hipofizės dalies – adenohipofizės ląstelių. HA pagal hormonų sekreciją, yra skirstoma į sekretuojančią - funkciškai aktyvią ir nesekretuojančią – nefunkcionuojančią. Ilgai trunkanti chiazmos kompresija sukelia pirminę regos nervo atrofiją, ir turi neigiamos įtakos regos funkcijai. Funkcionuojančios HA, dėl jų išskiriamų hormonų, pasireiškia klinikine simptomatika, tačiau regos funkcija yra mažiau pažeidžiama. Hipofizė yra turkiabalnyje, 8-13 mm žemiau regos nervų kryžmės, todėl augdama HA spaudžia regos nervines skaidulas kryžmėje. Esant HA gana dažnai išsivysto regos nervų kryžmės pažeidimas. Mikroadenomos daro mažą įtaką regėjimo sistemai ar kitų liaukų veiklai, tuo tarpu makroadenomos dažniausiai sukelia tam tikrus simptomus [4].
Regėjimo funkcijų sutrikimus lemia HA dydis ir sąlyčio su regos takais vieta. Jei HA maža, regos nervų kryžmės ji gali nesiekti, tuomet regos funkcijų pakitimų nebus. Lokalus uždegimas skatina naviko ląstelių dalijimąsi ir invaziją į audinius. Manoma, kad uždegimo mediatoriai ir genetinės mutacijos (metaloproteinazių, fibroblastų augimo faktorių genų bei kiti) pagreitina aplinkinių audinių ardymą, todėl skatinama naviko invazija ir metastazavimas į aplinkinius audinius. Dėl šių uždegiminių procesų palengvėja karcinogenezės eiga pažeistuose audiniuose. Taigi šio tyrimo metu nustatysime genetinių žymenų (MMP-1, FGFR4-R388) sąsajas su HA pasireiškimu.
10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Įvertinti MMP-1 ir FGFR4-R388 genų polimorfizmus pacientams, sergantiems hipofizės adenoma.
Darbo uždaviniai
1. Nustatyti Rs1799750 (MMP-1) ir Rs351855 (FGFR4-R388) polimorfizmų dažnį ir sąsajas su pacientų, sergančių hipofizės adenoma, ir sveikų tiriamųjų lytimi.
2. Nustatyti MMP-1 ir FGFR4-R388 genų polimorfizmų sąsajas su hipofizės adenomos invazyvumu. 3. Nustatyti MMP-1 ir FGFR4-R388 genų polimorfizmų sąsajas su hormoniniu hipofizės adenomų
aktyvumu.
11
I. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Hipofizės adenoma
Hipofizė – maža vidaus sekrecijos liauka, sverianti apie 0,5 gramo. Hipofizė - svarbiausia žmogaus vidaus sekrecijos liauka, kuri reguliuoja kitų liaukų hormoninę veiklą. Ji yra pleištakaulio kūno viršutinės sienos įduboje. Ji sudaryta iš priekinės skilties arba adenohipofizės, sudarančios beveik 80 procentų hipofizės tūrio ir užpakalinės skilties, neurohipofizės. Šioje srityje yra labai daug svarbių nervinių, kraujagyslinių, endokrininių ir kaulinių struktūrų, todėl čia kyla daugybė patologinių procesų. Hipofizės adenoma yra gerybinis navikas, augantis iš priekinės hipofizės dalies – adenohipofizės ląstelių. HA pagal hormonų sekreciją, yra skirstoma į sekretuojančią - funkciškai aktyvią ir nesekretuojančią – nefunkcionuojančią. Ilgai trunkanti chiazmos kompresija sukelia pirminę regos nervo atrofiją, ir turi neigiamos įtakos regos funkcijai [4].
1.1.1. Hipofizės adenomos epidemiologija
Hipofizės adenoma yra adenohipofizės parenchimos ląstelių gėrybinis navikas. HA sudaro apie 10-25 proc. visų intrakranijinių navikų, o paplitimas bendroje populiacijoje – 16,7 proc. [1]. Kliniškai reikšmingos HA pasireiškia 1 iš 1064 gyventojų [2]. Jungtinėse Amerikos Valstijose HA nustatoma 1 iš 4 žmonių, kuriems atliekama magnetinio rezonanso tyrimas ar autopsija [1]. Didžiojoje Britanijoje sergamumas HA yra nuo 19 iki 28 100000 gyventojų [5]; Belgijoje – 94 žmonėms iš 100000 gyventojų [2]. Moterys šia liga serga dukart dažniau nei vyrai [3]. Tačiau vyrams dažniau yra nustatoma makroadenoma, o moterims – mikroadenoma [6]. Heshmat su kolegomis [7] paskelbė, jog rasė taip pat turi įtakos HA išsivystymui. Buvo ištirta, kad juodaodėms moterims HA išsivysto triskart dažniau nei baltaodėms (toje pačioje amžiaus grupėje sergamumas 0,76 ir 0,22 100000 gyventojų, atitinkamai), o tuo tarpu juodaodžiai vyrai serga keturis kartus daugiau nei baltaodžiai (toje pačioje amžiaus grupėje sergamumas 1,02 ir 0,23 100000 gyventojų, atitinkamai).
1.1.2. Hipofizės adenomos etiologija
HA pasireiškimo mechanizmai iki šiol nėra pilnai ištirti. Manoma, kad tai daugiaveiksnės etiologijos liga, kurios pasireiškimui įtaką daro tiek genetiniai veiksniai, tiek hormoninė stimuliacija, tiek augimo faktoriai ir kt. [8].
Tirti aplinkos veiksniai, kurie galėjo turėti įtakos HA išsivystymui. Mokslininkai tyrė HA ryšį su mobiliųjų telefonų vartojimu, tačiau nepavyko įrodyti šios sąsajos [9]. Taip pat buvo nustatyta, kad rūkymas nedidina HA pasireiškimo rizikos [10].
12 Šiuo metu daugiausiai tyrinėjama genetinių veiksnių įtaka. Išskiriama šeiminė izoliuota HA, kuri paveldima autosominiu dominantiniu būdu ir sudaro apie 4-5 proc. visų HA [11]. Dažniausiai šie navikai yra susiję su dauginės endokrininės neoplazijos sindromo 1 tipu (MEN1), Carney kompleksu (CNC) ir šeimine izoliuota HA (FIPA) [12]. FIPA pirmą kartą buvo nustatyta Šiaurės Airijoje ištyrus keturias šeimas, sergančias HA, kurios nariams buvo rasta vienoda AIP geno mutacija (c.910 C- T) [13, 14].
1.1.3. Hipofizės adenomos klinika ir diagnostika
HA pasireiškia endokrininiais sutrikimais, tai yra hormonų hipersekrecija arba trūkumu, neurologine simptomatika dėl naviko masės ir gali būti atsitiktinis radinys, kai atliekamas galvos smegenų magnetinio rezonanso tyrimas (MRT) dėl kitų indikacijų ir randama HA [15]. Sergant HA didžiajai daliai pacientų, dėl regos nervo kryžmės kompresijos pažeistų regos nervų skaidulų, sutrinka regos funkcijos (regos aštrumas, akiplotis, spalvų juslė, kontrastinis jautrumas) bei stebimi regos nervų diskų pažeidimai, todėl oftalmologiniai tyrimo metodai yra svarbūs ankstyvoje HA diagnostikoje [16].
HA endokrininiai simptomai yra dėl hormonų pertekliaus, dažniausiai dėl hiperprolaktinemijos, akromegalijos ar Kušingo sindromo. Kita endokrininė simptomatika pasireiškia hormonų trūkumu – hipopituitarizmu, dažniausiai hipogonadizmu. Taip yra dėl to, kad netiesiogiai trukdoma išskirti normalų hormoną, dėl tiesioginio hipofizės spaudimo arba pulsacinio liuteinizuojančio hormono (LH) išskyrimo slopinimo, dėl kurio neadekvačiai stimuliuojamos gonados [17]. Klinikinė simptomatika priklauso nuo paciento lyties. Jei pacientė yra moteriškos lyties, tai klinikinei simptomatikai svarbu, ar ji iki ar po menopauzės susirgo HA. Nuovargis ir libido sumažėjimas yra būdingi tiek vyrams, tiek moterims. Vyrai gali turėti erekcijos sutrikimų, o moterys prieš menopauzę – oligomenorėją ar amenorėją [18].
Dažniausi neurologiniai simptomai pacientams, sergantiems HA, yra galvos skausmai ir regėjimo sutrikimai [18]. Neurologinė simptomatika yra dažnesnė sergant nefunkcionuojančiomis HA, nes jos nesekretuoja hormonų, kurie sukeltų endokrininę simptomatiką, ir jų diagnozavimas yra pavėluotas, kol pacientams atsiranda padidėjusios naviko masės simptomai. Galvos skausmai, kurie atsiranda dėl spaudimo į kietąjį dangalą, yra nespecifiški ir nekoreliuoja su naviko dydžiu [19].
Kai navikas padidėja, jis pradeda spausti regos nervų kryžmę, pirmiausiai sukeldamas regėjimo lauko iškritimus, dažniausiai bitemporalinę hemianopsiją. Jei HA didėja lateraliai į akytąjį antį, ji gali pakenkti III (n. oculomotorius), IV (n. trochlearis) ir VI (n. abducens) galvinius nervus. Sumažėjęs regėjimo aštrumas gali atsirasti, jei navikas spaudžia regos nervą ar padidėja spaudimas į jį. Skirtingai nuo galvos skausmų, regėjimo sutrikimai koreliuoja su naviko dydžiu. Dažniausiai jie atsiranda pamažu, todėl dauguma pacientų net nepastebi pasikeitimų, kol nėra ištiriami specifiškai [20]. Kiti neurologiniai simptomai – rinolikvorėja, traukuliai ar hipofizės apopleksija, pasireiškia labai retai [15].
13 1.1.4. Hipofizės adenomos gydymas
HA gydymas yra kompleksinis. Pagrindiniai gydymo metodai yra chirurginis gydymas, radioterapija ir gydymas vaistais. Šiuo gydymu norima sumažinti hormonų hipersekreciją ir sukeltus klinikinius simptomus, sumažinti naviko dydį, kad kartu sumažėtų simptomai dėl masės efekto ir sumažinti hormonų trūkumą [15].
Didžioji dalis hipofizės mikroadenomų yra gydymos konservatyviai, vartojant dopamino agonistus – bromokriptiną ir kabergoliną [21]. Šie vaistai mažina hiperprolaktinemijos simptomus, naviko dydį ir atkuria reprodukcines funkcijas, sumažindami prolaktino išsiskyrimą iš priekinės hipofizės dalies. Atsižvelgiant į mikroadenomos rūšį, galima vartoti somatostatino analogus – oktreotidą ar lanreoridą, kurie sumažina augimo hormono išskyrimą ir somatotropinių ląstelių proliferaciją; somatostatino receptorių antagonistus – pegvisomantą, kuris sumažina į insuliną panašaus augimo faktoriaus-1 sintezę. Jei pacientai yra paliatyvūs ar neoperabilūs, skiriami gliukokortikoidai, siekiant sumažinti naviko sukeltą simptomatiką, tačiau jie neturi jokios tiesioginės įtakos naviko gydymui [15].
Transfenoidalinė mikrochirurgija yra pagrindinis chirurginis gydymo metodas nefunkcionuojančioms mikroadenomoms ir funkcionuojančioms adenomoms, sukeliančioms akromegaliją ar Kušingo ligą [21, 22]. Tyrimų duomenimis, po šių operacijų komplikacijų dažnis neviršija 4 proc., o mirštamumas svyruoja tarp 0 ir 1 proc. [23].
Dauguma hipofizės adenomų visiškai išgydomos – taikant gydymą vaistais arba transfenoidalinės mikrochirurgijos būdu. Tačiau, kai nepavyksta radikaliai pašalinti naviko, po operacijos gali būti taikomas adjuvantinis gydymas radioterapija ar pakartotinai operuojama. Nors radioterapija efektyvi, tačiau dažnai sukelia panhipopituitarizmą [24].
Kuo anksčiau diagnozuojama HA, tuo didesnė tikimybė radikaliai ją pašalinti transfenoidalinės chirurgijos būdu, todėl svarbu kuo anksčiau įtarti šią patologiją ir nuodugniai tikslingai ištirti pacientą.
1.2. Imunogenetiniai veiksniai
Plačiai tyrinėjama biologinių markerių svarba HA patogenezėje. Biologiniams markeriams priklauso chromosominės alteracijos ir miRNR (mikroRNR), proliferacijos markeriai, onkogenai, tumoro supresorių genai, augimo faktoriai ir jų receptoriai, faktoriai, susiję su angiogeneze ar ląstelių adhezija. Tačiau neįrodyta, kad nors vienas „biomarkeris“ yra tinkamas agresyvių - invazinių HA diagnostikai [25].
1.2.1. Biologiniai markeriai, susiję su hipofizės adenoma
Keliuose moksliniuose tyrimuose buvo tirti funkcionuojančių asimptominių adenomų patogeneziniai mechanizmai. Ląstelei specifiški transkripcijos faktoriai yra naudingi HA citogenezės identifikacijai. Priekinės hipofizės dalies ląstelės išsivysto iš priekinės nervinės keteros ir diferenciacija
14 progresuoja dėl hipofizės hormonų genų raiškos [26]. Tpit genas, kuris reguliuoja POMK (proopiomelanokortinas) audinių raišką, yra išskiriamas iš kortikotropinių ir melanotropinių ląstelių ir yra specifinis POMK gaminančių ląstelių žymuo [27]. Atlikus Tpit geno tyrimus nefunkcionuojančiose hipofizės adenomose nustatyti priešingi rezultatai – viename tyrime Tpit genas buvo teigiamas trijose iš keturių adenomų atlikus imunohistocheminį tyrimo metodą, o kitame tyrime parodė žemesnę Tpit geno mRNR ir baltymų kiekio raišką [26].
Be to, transkripcijos faktorius NeuroD1 susijungia su POMK promotoriumi, aktyvuoja POMK transkripciją ir prisideda prie funkcinės adrenokortikotropiną (AKTH) sekretuojančių hipofizės adenomų raiškos ir diferenciacijos, o taip pat ir nefunkcionuojančių adenomų [28]. Steroidogeninis faktorius 1 (SF-1), randamas kiaušidžių, sėklidžių ir antinksčių audiniuose, yra žinomas kaip svarbus endokrininės sistemos vystymosi ir funkcijos reguliatorius [29]. Taip pat SF-1 yra randamas gonadotropinėse ląstelėse, kai sergama nefunkcionuojančia HA. DAX-1, branduolių receptorius, kartu yra ir specifinis ląstelių faktorius gonadotropinių ląstelių diferenciacijai ir yra išreiškiamas nefunkcionuojančių adenomų [30]. Pit-1, kuris priklauso genų šeimai atsakingai už baltymų reguliaciją, aktyvuoja augimo hormono ir prolaktino genus ir sustiprina β-TSH geno transkripciją [31].
Nefunkcionuojančiose somatotropinių, tirotropinių ir laktotropinių ląstelių adenomose Pit-1 ir augimo hormono mRNR raiška buvo panaši į funkcionuojančios HA [32]. Pit-1 ir GATA-2 yra ekspresuojami visų nefunkcionuojančių adenomų tirotropinių ląstelių branduoliuose, panašiai kaip ir funkcionuojančių adenomų. Tai rodo, kad simptomų nebuvimo priežastis atsiranda dėl Pit-1 geno neaktyvumo signaliniame kelyje, kuris sąlygoja hormonų išskyrimą [32].
Cooper ir bendraautorių tyrimo duomenimis buvo nustatyta, kad nefunkcionuojančios kortikotropinės adenomos tikrai atspindi kortikotropinius žymenis, NeuroD1 ir AKTH, taip pat gerai kaip ir gonadotropinius žymenis, DAX-1, SF-1 ir α-GSU [30]. Iš kitos pusės, nefunkcionuojančios kortikotropinės adenomos buvo skirtingos lyginant su kortikotropinėmis ir gonadotropinėmis adenomomis, kaip liudija branduolių Tpit ekspresijos nebuvimas, nors yra randamas citoplazminis ir branduolinis SF-1, atitinkamai [30].
Mokslininkai palygino genų raiškos profiliavimą ir rado skirtingai išskirtus genus (DEGs – angl. Differentialy expressed genes) esant normaliai žmogaus hipofizei ir esant HA augliui, neatsižvelgiant į ląstelių kilmę, naudodami mikrogardelę. Anksčiau atlikti žmogaus HA mikrogardelės tyrimai nustatė daug naujų genų, tokių kaip PTTG, GADD45, MEG3a ir BMP-4 [33].
Žmogaus PTTG (angl. Pituitary Tumor Transforming Gene) genų šeima yra sudaryta bent iš trijų genų: PTTG1, PTTG2 ir PTTG3. Šie genai dalyvauja tumorogenezėje, ląstelių transformacijoje, DNR taisyme, angiogenezėje ir genų reguliacijoje [34].
15 PTTG trūkumas slopina ląstelių proliferaciją, taip mažindamas HA vystymąsi. Iš to tikimasi, kad PTTG raiškos padidėjimas gali sukelti bet kurio tipo naviko išsivystymą. PTTG reguliuoja KEAF (kraujagyslių endotelio augimo faktorius) ir FAF (fibroblastų augimo faktorius) raišką, todėl jie abu padidėja, sergant HA [35].
Atlikti tyrimai kai kuriuos genus identifikavo kaip HA tumorogenezės veiksnius, kurie priklauso GADD45 genų šeimai, o GADD45 geno raiškos trūkumas buvo nustatomas, sergant įvairiais tumorais. Buvo įrodyta, kad didelis ar mažas GADD45G geno raiškos trūkumas yra nustatomas daugumoje HA dėl promotoriaus metilinimo [36]. GADD45B, tirtas mikrogardelėje, patvirtintas polimerazės grandininės reakcijos (PGR) ir imunobloto metodais, taip pat in vitro eksperimentais, identifikuotas kaip tumoro supresorius. Cheunsuchon ir bendraautoriai nurodė, kad MEG3 nebuvo identifikuotas, tiriant nefunkcionuojančias HA, o tai rodo, kad jo inaktyvacija sukelia nefunkcionuojančių hipofizės adenomų išsivystymą [37]. Kiti genai, POU1F1, IGFBP3 ir CCNB1, taip pat koreliuoja su HA [38].
p53 yra tumoro supresoriaus baltymas, kurį koduoja TP53 genas. Jis svarbus ląstelių proliferacijai, apoptozei ir genomo stabilumui. p53 raiška yra siejama su agresyviais hipofizės navikais. Thapar ir bendraautoriai ištyrė, kad neinvazinės ir invazinės adenomos ir hipofizės karcinomos atveju nustatomas p53 perteklius [39]. Nors kelios mokslininkų grupės nustatė, kad p53 koreliuoja su lokaliu HA recidyvu [40], „agresyvus-invazinis“ prolaktiną gaminantis navikas sintetino daugiau p53 [41], bet reikšminga koreliacija su invaziniu augimu nebuvo stebėta [42]. Šie priešingi rezultatai rodo, kad p53 nėra nepriklausomas prognostinis veiksnys, padedantis nustatyti HA invazyvumą [25].
MikroRNR (miRNR) reguliuoja genų raišką potranskripciniame lygmenyje, skylant mRNR arba slopinant baltymų sintezę. MiRNR taip pat svarbūs kaip tumoro supresorių genai ar onkogenai [43]. Netipinė miRNR raiška yra siejama su hipofizės neoplazija. Stilling ir bendraautoriai nustatė skirtingą miR-122 raišką kortikotropinėse adenomose lyginant su kortikotropinėmis karcinomomis [44]. MiR-145, miR-21, miR-141, let-7a, miR 150, miR-15a, miR-16, and miR-145 raiškos trūkumas rastas AKTH sekretuojančiose adenomose. Nors, miRNR raiška nekoreliavo su naviko dydžiu, bet mažesnė miR-141 raška koreliavo su pooperacine remisija pacientams, sirgusiems kortikotropine adenoma [45].
Nustatyta, kad uždegimas padeda naviko ląstelių invazijai. Manoma, jog uždegimo mediatoriai (IL-1, IL-6, IL-8, TNFα ir MMP-9) pagreitina aplinkinių audinių ardymą, o tai skatina naviko invaziją ir metastazavimą. Šie uždegiminiai procesai sustiprina karcinogenezę pažeistuose organuose [46].
Interleukinas-17 (IL-17) yra sintezuojamas T ląstelių „helperių“-17 (Th-17) ir yra priskiriamas citokinams, kurie dalyvauja vėlesnėse uždegimo kaskadose, padidindami chemokinų gamybą ir sutelkdami monocitus ir neutrofilus į uždegimo židinį. Nustatyta, kad esant daugeliui lėtinių neinfekcinių susirgimų, kuriuose dalyvauja uždegiminis atsakas, nustatoma padidėjusi IL-17 koncentracija [47].
16 Mokslinių tyrimų duomenimis nustatyta, jog tam tikromis sąlygomis, interferonas-gama (IFNγ) sustiprina Th-17 ląstelių uždegiminį atsaką [48]. Be to, Th-17 ląstelių kiekiai teigiamai koreliuoja su naviko mikrokraujagyslių tankiu [46].
IL-17 receptoriai (IL-17R) yra visuose iki šiol tirtuose audiniuose, įskaitant ir hipofizės audinį, todėl IL-17 padidėjimas lemia jo receptorių padaugėjimą [46]. Esant navikiniam susirgimui audinyje, prie šių receptorių jungiasi specifinis citokinas, dėl kurio atsiranda naujadarės mikrokraujagyslės [49], kurių įtakoje sudaromos palankios sąlygos augti navikui [46].
1 lentelė. Imunogenetinių veiksnių įtaka hipofizės adenomos pasireiškimui [50]
Imuno-genetiniai veiksniai
Poveikis Patogenezinis mechanizmas
Literatū-ros šal-tinis FGFR4/NC AM/N-kadherino/β -katenino kompleksas Bet kurios dalies pažaida
FGFR4/NCAM/N-kadherino/β-katenino komplekso vientisumas yra reikalingas, kad būtų išlaikytas normalus neuroendokrininių ląstelių fenotipas ir jų sąveika su ekstraceliuliniu matriksu.
1, 8
AIP genas Mutacija AIP yra tumoro supresorius, bet jis veikia susijungdamas su specifiniais (AIP) receptoriais hipofizėje ir ten aktyvuoja hipofizės adenomos vystymosi mechanizmą. Dabar manoma, kad AIP genas užima cAMP kelią ir, būdamas ląstelių paviršiuje, keičia integrino funkcijas.
13, 14
Tpit genas Trūkumas Reguliuoja POMK audinių raišką ir yra specifinis POMK gaminančių ląstelių žymuo. Tpit geno trūkumas sutrikdo POMK sintezę ir audinių raišką, todėl išsivysto nefunkcionuojanti HA.
26, 27, 30
NeuroD1 Trūkumas NeuroD1 yra transkripcijos faktorius, kuris susijungia su POMK promotoriumi, aktyvuoja POMK transkripciją ir prisideda prie funkcinės AKTH sekretuojančių adenomų raiškos ir diferenciacijos, o taip pat ir nefunkcionuojančių adenomų.
28, 30
SF-1 Perteklius Žinomas kaip svarbus endokrininės sistemos vystymosi ir funkcijos reguliatorius. Randamas gonadotropinėse ląstelėse, kai sergama nefunkcionuojančia hipofizės adenoma.
17 Pit-1 genas Inaktyvacija Geno inaktyvacija signaliniame kelyje sukelia hormonų (augimo
hormono, prolaktino) neišskyrimą.
30 - 32
DAX-1 Perteklius Yra specifinis ląstelių faktorius gonadotropinių ląstelių diferenciacijai ir yra išskiriamas nefunkcionuojančių adenomų.
30
PTTG Perteklius PTTG trūkumas slopina ląstelių proliferaciją, taip mažindamas HA vystymąsi. Manoma, kad PTTG raiška padidina bet kurio tipo naviką, paveikdama KEAF ir FAF raišką.
34, 35
MEG3 Inaktyvacija Jo inaktyvacija ir sukelia nefunkcionuojančių hipofizės adenomų išsivystymą.
37, 38
GADD45B Trūkumas GADD45B yra tumoro supresorius ir jo trūkumas sukelia greitesnį HA augimą.
38
GADD45G Trūkumas GADD45G geno raiškos trūkumas atsiranda dėl promotoriaus metilinimo.
36
p53 Perteklius p53 yra tumoro supresoriaus baltymas, kurį koduoja TP53 genas. Jis svarbus ląstelių proliferacijai, apoptozei ir genomo stabilumui. p53 raiška yra siejama su agresyviais hipofizės navikais.
39 - 42
miRNR Trūkumas MiRNR taip pat svarbūs kaip tumoro supresorių genai ar onkogenai. Netipiška miRNR raiška yra siejama su hipofizės neoplazija. Daugelio miRNR raiškos trūkumas rastas AKTH sekretuojančiose adenomose.
43 - 45
IL-17 Perteklius IL-17 padidėjimas lemia IL-17 receptorių padaugėjimą. Esant navikiniam susirgimui audinyje prie šių receptorių jungiasi specifinis citokinas, dėl kurio atsiranda mikrokraujagyslės.
46, 49
MMP-9 genas
Perteklius Uždegimo mediatoriai (MMP-9) pagreitina aplinkinių audinių ardymą, o tai skatina naviko invaziją ir metastazavimą. Šie uždegiminiai procesai sustiprina karcinogenezę pažeistuose organuose. MMP-9 yra potencialus biologinis markeris invazinėms HA diagnozuoti. 46 FGFR4-R388 (fibroblastų augimo faktoriaus Vienintelio nukleotido polimorfiz-mas (VNP)
Šis alelis neseniai buvo susietas su mitochondriniu STAT3 (angl.
Signal tranducer and activator of transcription 3) geno serino
fosforilinimu, kuris palengvina augimo hormono ląstelių tumorogenezę.
18 1.2.2. Fibroblastų augimo faktoriaus receptorius 4 (FGFR4-R388)
Fibroblastų augimo faktoriaus receptorius 4 yra baltymas, kurį koduoja FGFR4 genas. Šis baltymas priklauso fibroblastų augimo faktorių receptorių šeimai, kurios nariai skiriasi vieni nuo kitų ligandų giminingumu ir pasiskirstymu audiniuose. FGFR4 yra svarbus ląstelių dalijimuisi, ląstelių augimo ir brendimo reguliavimui, kraujagyslių formavimuisi, žaizdų gijimui ir embriono vystymuisi. Šis baltymas susijungia su specifiniais augimo faktoriais ir taip perduoda signalą iš ląstelės išorės į branduolį. Priklausomai nuo signalo iš aplinkos, branduolys įjungia ar išjungia tam tikrus genus, kurie atsakingi už dalijimąsi, augimą ar brendimą (51).
Tateno su bendraautoriais atliko tyrimą, kuriame FGFR4 transmembraniniame domene pakeitė arginino radikalą į glicino ir taip pakeitė hipofizės ląstelių augimą ir hormonų gamybą. Gauti rezultatai rodo, kad FGFR4-R388 skatina adenohipofizę gaminti augimo hormoną, o pakeitus radikalą į glicino (FGFR4-G388) – gaminamas prolaktinas. Taigi pakeitus vieną radikalą kitu ar pridėjus glicino radikalą (FGFR4-R388G) galima sumažinti augimo hormono sintezę ir sekreciją ir taip mažėja hipofizės adenomos keliami simptomai (51).
receptorius 4) NCAM (angl. neural cell adhesion molecule)
Perteklius Susijungusių su polisialo rūgštimi (inaktyvintas NCAM, kuris negali prisijungti prie gretimos membranos) neuronų adhezijos molekulių kiekis koreliuoja su HA augimu su invazyvumu.
8 GHRH (angl. growth hormone releasing hormone)
Mutacija Augimo hormoną sekretuojančioms adenomoms trūksta didelio cAMP kiekio, kuris rodo, kad jos turėtų atsakyti į gydymą somatostatino analogais, bet vietoj atsako į gydymą, jie pakeičia STAT (angl. Signal tranducer and activator of transcription) signalinį kelią, kuris priskiriamas somatinei augimo hormono receptoriaus mutacijai. Ši mutacija pakenkia glikozilinime dalyvaujančių receptorių apdorojimui ir pateikimui.
25 MMP-1 genas Vienintelio nukleotido polimorfiz-mas (VNP)
MMP-1 geno promotoriaus VNP įterpia guaniną (G) į 1607 poziciją ir iškelia jį į naują ETS (angl. E-Twenty-Six – transkripcijos genų
šeima) atpažinimo lokusą (5′-GGA-3′). 90 proc. invazyvių HA rasta
pacientams, kurie yra MMP-1 VNP alelio homozigotai.
19 2 pav. 5 žmogaus chromosoma ir FGFR4 geno lokalizacija
(http://ghr.nlm.nih.gov/gene/FGFR4)
1.2.3. Matrikso metaloproteinazė-1 (MMP-1)
Fermentas matrikso metaloproteinazė-1 (MMP-1, dar vadinamas kolagenaze 1) yra pagrindinis viduląstelinio matrikso kolageno pluoštų keitiklis. MMP-1 geno promotoriaus regione buvo rastas papildomai įterptas guanino radikalas. Maždaug dukart padidėjus MMP-1 kiekiui, kartu esant guanino radikalo įterpimui, palengvėjo MMP-1 sukeliama auglio invazija ir padaugėjo metastazių. Todėl manoma, kad MMP-1 genas dalyvauja auglio išplitime (52). Moksliniame tyrime nustatyta, kad esant dviem įterptiems guanino aleliams padidėja hipofizės adenomos pasireiškimo tikimybė (53).
1 pav. 11 žmogaus chromosoma ir MMP-1 geno lokalizacija (http://ghr.nlm.nih.gov/gene/MMP1)
20
II. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1 Tyrimo planavimas, tyrimo objektas ir tiriamųjų atranka
Magistro baigiamojo darbo tyrimai atlikti LSMU NI Oftalmologijos laboratorijoje. Planuojant magistro baigiamojo darbo tyrimus, pirmiausiai buvo išsiaiškintas problemos aktualumas, duomenų bazėse buvo ieškoma informacijos apie hipofizės adenomos sąsajas su matrikso metaloproteinazės 1 (MMP-1) ir fibroblastų augimo faktoriaus receptoriaus 4 (FGFR4-R388) genų polimorfizmais. Analizavome ankščiau vykdytus mokslininkų darbus, kurie teigia, jog hipofizės adenomai išsivystyti reikalingi įvairūs imunogenetiniai veiksniai. Antrame tyrimo planavimo etape buvo įvertintos laboratorijos techninės galimybės, užsakomi reikalingi reagentai. Suplanavus tyrimą ir gavus reikiamus reagentus, buvo pradėti magistro baigiamojo darbo tyrimai.
Tyrimo metu buvo ištirti rs1799750, c.-1607 2G (MMP-1) ir rs351855, G>A (FGFR4-R388) polimorfizmai, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinei grupei.
Tiriamoji imtis sudaryta pagal šiuos įtraukimo kriterijus: 1) nustatyta ir MRT patvirtinta hipofizės adenoma; 2) gera paciento būklė; 3) pacientų raštinis sutikimas; 4) ≥18 metų; 5) smegenų ar kitos lokalizacijos navikų nebuvimas.
Visos hipofizės adenomos buvo išanalizuotos gydytojo radiologo pagal MRT duomenis. Supraseliarinis išsiplėtimas ir invazija į pleištakaulio antį buvo klasifikuojama pagal Hardžio klasifikaciją, pakoreguotą Vilsono [54]. Plitimo virš ir po turkiabalniu laipsnis buvo nustatytas į A-E stadijas. Turkiabalnio apatinės sienos erozijos laipsniai buvo suskirstyti į I-IV lygius. I-II lygis nurodo, kad apatinė siena yra nepažeista ir tai buvo priskirta prie neinvazyvių HA, III lygis nurodė lokalizuotą apatinės sienos pažeidimą ir IV lygis – difuziškai pasiskirsčiusią apatinės sienos destrukciją. Taigi III ir IV lygiai nurodo invazyvią HA. Pagal Knosp klasifikacijos sistemą buvo skaičiuojama invazija į kaverninį antį. 0 lygis rodo, kad nėra jokio pažeidimo ir yra laikoma norma; 1 ir 2 lygiai rodo, kad auglys stumia medialinę kaverninio ančio sieną, bet nepereina hipotetinės linijos besitęsiančios tarp vidinės miego arterijos dviejų segmentų centrų (1 lygis) arba pereina šią ribą, tačiau neliesdamas pačios arterijos kraštų (2 lygis); 3 lygis – auglys plinta lateraliai pagal vidinę miego arteriją iki kaverninio sinuso; 4 lygis – visiškas intrakaverninės miego arterijos užspaudimas [55]. Pagal Knosp klasifikaciją, tik 3 ir 4 lygio augliai yra invazyvūs.
Kontrolinė imtis sudaryta pagal šiuos įtraukimo kriterijus: 1) gera paciento būklė; 2) pacientų raštinis sutikimas; 3) ≥18 metų; 4) smegenų ar kitos lokalizacijos navikų nebuvimas.
Ištirta 100 asmenų, sergančių HA, ir 200 sveikų tiriamųjų. Tiriamąją grupę sudarė 65 moterys ir 35 vyrai, o kontrolinę – 151 moteris ir 49 vyrai su MMP-1 genu ir 147 moterys ir 53 vyrai su FGFR4 genu.
21 2.2. Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas
Deoksiribonukleininės rūgšties (DNR) išskyrimui kraujas buvo surinktas į vakuuminius mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamintetraacetatu), kad nesusidarytų mikrokrešuliai ir DNR būtų apsaugota nuo degradacijos. Tyrime naudojama genominė DNR buvo išskirta iš periferinio kraujo baltųjų kraujo ląstelių – leukocitų, naudojant dviejų tipų rinkinius: ,,Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification
Kit’’ ir ,,Thermo Scientific MagJET Genomic DNA Kit’’.
2.2.1. DNR išskyrimas naudojant silikagelio kolonėles
Naudojant rinkinį ,,Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit’’ DNR buvo išskirta silikagelio kolonėlių metodu. Naudojant šį rinkinį aukštos kokybės DNR išskiriama greitai, efektyviai ir yra tinkama tolimesniems TL – PGR tyrimams.
Rinkinio sudedamosios dalys:
Skaidymo tirpalas (Digestion solution) Lizavimo tirpalas (Lysis solution) Plovimo buferis I (Wash buffer I) Plovimo buferis II (Wash buffer II) Eliucijos buferis (Elution buffer) Proteinazės K tirpalas
RNazės A tirpalas Silikagelio kolonėlės DNR išskyrimo etapai: Ląstelių lizė
Pirmiausia į sterilų, 2 ml tūrio, Eppendorf tipo mėgintuvėlį įpilama 200 µl veninio kraujo, 400 µl lizavimo tirpalo ir 20 µl proteinazės K tirpalo. Mėginys gerai išmaišomas ir inkubuojamas 10 min. 56 ºC temperatūroje. Lizavimo tirpalas suardo išorinę ląstelių membraną. Proteinazė K suardo ląstelės baltymus, branduolio membraną ir inaktyvuoja nukleazes, ardančias DNR.
22 DNR nusodinimas ant silikagelio kolonėlės membranos
Į lizatą įpilama 200 µl 96 proc. etanolio, mėginys sumaišomas. Dėl sąveikos su etanoliu DNR precipituoja ir negali pereiti per kolonėlės membraną, todėl lieka ant jos. Visas turinys perkeliamas į surenkamąjį mėgintuvėlį ir centrifuguojamas 1 min. 6000 aps./min. greičiu. DNR prisitvirtina prie kolonėlės membranos.
DNR išvalymas nuo baltyminių liekanų, druskų ir reagentų, panaudotų ląstelių lizavimui
DNR išvalymui naudojami du buferiai – į kolonėlę įpilama 500 µl plovimo buferio I, mėginys centrifuguojamas 1 min. 8000 aps./min. greičiu; tada pilama 500 µl buferio II, centrifuguojama 3 min. 12000 aps./min.greičiu.
DNR išplovimas iš kolonėlės
Nukleorūgšties išskyrimas kolonėlėje pagrįstas adsorbcija ant kieto paviršiaus. Lizuojamos biologinio objekto ląstelės prisitvirtina ant filtrų dėl aukštos joninės jėgos chaotropinių tirpalų, o nuo filtro nuplaunamos pateikiamu buferiu. Sąveika priklauso nuo pH ir druskų, esančių eliucijos buferyje. Įpilama 75 µl eliucijos buferio, inkubuojama 2 min. kambario temperatūroje ir centrifuguojama 1 min. 8000 aps./min.greičiu. Eliucijos buferyje ištirpusi DNR surenkama į kriomėgintuvėlius ir saugoma -20 ̊ C temperatūroje.
2.2.2. DNR išskyrimas naudojant magnetines daleles
Rinkinio ,,Thermo Scientific GenJET Genomic DNA Purtification Kit’’ technologija pagrįsta magnetinėmis dalelėmis, šios technologijos pagalba išskiriama aukštos kokybės DNR. Išskirta DNR tinkama naudoti tolimesniems molekuliniams tyrimams, tokiems kaip kokybinė ar TL – PGR.
Rinkinio sudedamosios dalys:
Skaidymo tirpalas (Digestion solution) Lizavimo tirpalas (Lysis solution) Plovimo buferis I (Wash buffer I) Plovimo buferis II (Wash buffer II)
23 Eliucijos buferis (Elution buffer)
Proteinazės K tirpalas RNazės A tirpalas Magnetinės dalelės Magnetinis stovelis DNR gryninimo etapai: Ląstelių lizė
Pirmiausia į sterilų, 2 ml tūrio, Eppendorf tipo mėgintuvėlį įpilama 200 µl veninio kraujo, 200 µl skaidymo tirpalo 20 µl proteinazės K tirpalo. Mėginys gerai išmaišomas ir inkubuojamas 10 min. 56ºC temperatūroje. Skaidymo tirpalas suardo išorinę ląstelių membraną. Proteinazė K suardo ląstelės baltymus, branduolio membraną ir inaktyvuoja nukleazes, ardančias DNR.
RNR inaktyvacija
Naudojamas RNazės A tirpalas. Į lizatą įpilama 20 µl RNazės A, gerai sumaišoma ir inkubuojama 10 min. kambario temperatūroje.
DNR surišimas su magnetinėmis dalelėmis
Į mėginį įpilama 300 µl lizės buferio ir sumaišoma. Mėginys su lizės buferiu perpilamas į naują mėgintuvėlį, kuriame yra 400 µl 96 proc. etanolio ir 25 µl magnetinių dalelių. Mėginys vėl sumaišomas ir įstatomas į magnetinį stovelį, kur laikomas 3 minutes. DNR su magnetinėmis dalelėmis prikimba prie mėgintuvėlio sienelės, esančios prie magneto.
DNR išvalymas nuo baltyminių liekanų, druskų ir reagentų, panaudotų ląstelių lizavimui
DNR išvalymui naudojami du buferiai – į mėginį įpilama 800 µl plovimo buferio I, mėginys sumaišomas; mėginys plaunamas du kartus, naudojant 800 µl plovimo buferio II. Po kiekvieno plovimo mėginys įstatomas 2 – 3 min. į magnetinį stovelį.
DNR išgryninimas
Naudojamas eliucijos buferis. Į mėginį įpilama 75 µl eliucijos buferio, mėginys gerai sumaišomas ir inkubuojamas 72ºC temperatūroje 5 min. Eliucijos buferyje ištirpusi DNR surenkama į kriomėgintuvėlius ir saugoma -20 ̊ C temperatūroje.
24 2.3. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru
Prieš atliekant TL – PGR, būtina išmatuoti išskirtos DNR koncentraciją, tyrimo metu ji buvo išmatuota spektrofotometru ,,Agilent Technologies, Cary 60 UV – Vis“. DNR, RNR, oligonukleotidų ir mononukleotidų kiekis nustatomas vandeniniuose tirpaluose, matuojant tirpalo absorbciją (optinį tankį) ultravioletinių bangų ilgyje. Nukleino rūgščių nustatymas vykdomas naudojant 260 nm UV šviesos bangos ilgio spindulius. Baltyminės tirpalo priemaišos įvertinamos, išmatuojant optinių tankių santykį, esant260 nm ir 280 nm UV šviesos bangos ilgiams. Jei DNR gryna, jos santykis turi būti apie 1,8.
2.4. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu Genų polimorfizmų tyrimairs1799750, c.-1607 2G ir rs351855, G>A buvo atlikti tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu.
2.4.1. PGR etapai
Pirma, vyksta iniciacijos etapas, kurio metu vyksta Taq polimerazės aktyvacija. Reakcija vykdoma 95ºC temperatūroje, 10 min. Po to vyksta cikliškai pasikartojantys etapai:
1. Pirmas etapas – DNR denatūracija. Šis etapas vyksta 92ºC temperatūroje, 15 sek. Jo metu, nutrūksta vandenilinės jungtys tarp azotinių bazių ir DNR grandinės atsiskiria viena nuo kitos.
2. Antras etapas – pradmenų hibridizacijair elongacija vykdoma 60ºC temperatūroje, 1 min. Pradmenys šio etapo metu vandenilinėmis jungtimis jungiasi prie jiems komplementarių dauginamos DNR sričių.Reakciją katalizuoja fermentas Taq polimerazė. Šio etapo metu polimerazė sintetina komplementarią matricinei DNR grandinę.DNR kiekis, kartojant denatūraciją, hibridizaciją ir elongaciją didėja eksponentiškai.
2.4.2. PGR principas
600 mėginių genotipavimas buvo atliekamas tikro laiko PGR gausintuvu ,,Rotor – Gene Q“. Genotipavimui skirti pradmenys ir molekuliniai žibukai buvo sukurti kompanijos ,,Applied Biosystems“. Kiekvienai reakcijai buvo naudojama 2 µl genominės DNR (~10 ng) ir 10 µl PGR reakcijos mišinio, kurio sudėtis nurodoma 2 lentelėje. PGR vykdyta pagal 3 lentelėje aprašytas sąlygas.
25 2 lentelė. Realaus laiko PGR mišinio paruošimas
Reagentai 1 pvz., µl 76 pvz., µl
TaqMan Universal Master Mix II (,,Applied Biosystems‘‘, Lietuva)
6,25 µl 475 µl
„Applied Biosystems“ genotipavimo rinkiniai (rs1799750, c.-1607 2G ir rs351855 G>A)
0,625 µl 47,5 µl
Sterilus ddH2O
(,,Thermo Fisher Scientific’’, Lietuva)
3,5 µl 266 µl
Viso (PGR mišinio) 10,375 µl 788,5 µl
DNR 2 µl
Viso 12 µl
3 lentelė. Optimalios genotipavimo reakcijos sąlygos, nustatant rs1799750, c.-1607 2G ir rs351855, G>A genotipus tikro laiko PGR gausintuvu ,,Rotor – Gene Q“
Genotipavimo rinkinys PGR sąlygų
protokolai
Produkto dydis
Rs1799750,
c.-1607 2G “Applied Biosystem” patentas. 95ºC 10
min 40 ciklų: 92ºC 15s 60ºC 60s Nenurodyta Rs351855, G>A
“Applied Biosystem” patentas.
95ºC 10 min 40 ciklų: 92ºC 15s 60ºC 60s Nenurodyta Metodas:
1. Paruošiamas PGR mišinys 76 mėginiams.
2. Mišinys išpilstomas po 10 µl į 0,1 ml tūrio mėgintuvėlius.
3. Į 71 mėgintuvėlį įpilama po 2 µl DNR, o paskutiniame šulinėlyje, kaip neigiama kontrolė, įpilamas sterilus vanduo.
4. Mėgintuvėliai sudedami į specialų, 72 mėgintuvėliams skirtą diską ir ant jo uždedamas apsauginis žiedas.
5. Nustatoma programa vieno iš polimorfizmų nustatymui.Genotipuojant naudota ,,Alelių nustatymo“ programa (angl. Allelic Discrimination).
6. Po 2,5 val. programa baigia darbą. Gauti genotipavimo rezultatai, kaip pavyzdys pateikiamas 3 paveikslas. Pagal skirtingų detektorių fluorescencijos intensyvumo santykį, programa nustato individų genotipus. Jų nustatymui naudojami fluorescenciniaisVIC ir FAM dažais žymėti molekuliniai žibukai. Gauti rezultatai toliau naudojami statistiniams skaičiavimams.
26 3 pav. „Alelių nustatymo“ programos rezultatų diagrama.
2.5. Statistinė analizė
Statistinė duomenų analizė buvo atliekama naudojant kompiuterinę programą „IBM SPSS Statistics“. Duomenys pateikiami kaip realieji skaičiai (procentai), vidutiniai dydžiai ir standartiniai nuokrypiai (SN). Tarp dviejų nepriklausomų grupių skirtumams nustatyti naudotas Mann-Whitney U kriterijus, tarp kelių skirtingų grupių – Kruskal-Wallis H kriterijus. MMP-1 ir FGFR4-R388 genų polimorfizmo pasiskirstymas sergantiems HA ir referentinėje grupėje vertintas pagal Hardy – Weinberg ekvilibriumą (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml). Sergančiųjų hipofizės adenoma ir referentinės grupės MMP-1 ir FGFR4-R388 genų polimorfizmo pasiskirstymo homogeniškumo palyginimui taikytas χ² ir Fisher vienpusio ir dvipusio kriterijų skaičiavimas (http://www.graphpad.com/quickcalcs/contingency1.cfm). Skirtumai vertinti kaip statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
27
III.
REZULTATAI
Tyrimo metu buvo suformuotos dvi tiriamųjų grupės vienam genui. Pirmą grupę sudarė 100 hipofizės adenoma sergančių asmenų: iš jų 35 vyrai (35 proc.) ir 65 moterys (65 proc.), tiriamųjų amžiaus vidurkis – 51,38 metai. Kontrolinę grupę sudarė 200 asmenų, 49 vyrai (24,5 proc.) ir 151 (75,5 proc.) moteris, amžiaus vidurkis siekė 49,47 metus MMP-1 genui, o FGFR4-R388 genui – kontrolinę grupę sudarė 200 asmenų, 47 vyrai (23,5 proc.) ir 153 moterys (76,5 proc.), tiriamųjų amžiaus vidurkis – 48,87 metai. Tiriamųjų charakteristika pateikta 4 ir 5 lentelėse.
4 lentelė. Tiriamųjų charakteristika (MMP-1)
Charakteristika Tiriamieji sergantys HA (I grupė) n = 100 Kontrolinė grupė (II grupė) n = 200 Vyrai, n (proc.) 35 (35) 49 (24,5) Moterys, n (proc.) 65 (65) 151 (75,5) Amžiaus vidurkis 51,38 49,47
5 lentelė. Tiriamųjų charakteristika (FGFR4)
Charakteristika Tiriamieji sergantys HA
(I grupė) n = 100 Kontrolinė grupė (II grupė) n = 200 Vyrai, n (proc.) 35 (35) 47 (23,5) Moterys, n (proc.) 65 (65) 153 (76,5) Amžiaus vidurkis 51,38 48,87
3.1 Rs1799750 ir Rs351855 genotipų dažnis pacientams, sergantiemshipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje
Buvo įvertintas MMP-1 geno (c.-1607 2G) Rs1799750 ir FGFR4-R388 geno (G>A) Rs351855 polimorfizmų dažnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje (6 lentelė). Rs351855 abi tiriamųjų grupės atitiko Hardžio-Veinbergo dėsnį (p>0,05). Statistiškai reikšmingų skirtumų, lyginant sergančius tiriamuosius su kontroline grupe, nebuvo nustatyta. Rs1799750 kontrolinė grupė neatitiko Hardžio-Veinbergo dėsnio (p<0,05), o tiriamieji, sergantys hipofizės adenoma, atitiko (p>0,05). Statistiškai reikšmingų skirtumų, lyginant sergančius tiriamuosius su kontroline grupe, nebuvo nustatyta.
28 6 lentelė. MMP-1 (c.-1607 2G) Rs1799750 ir FGFR4-R388 (G>A) Rs351855 polimorfizmų dažnis
pacientams, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje
Genas Genotipas/ alelis Dažnis (proc.) Kontrolinė grupė N(proc.) (n=200) p vertė HWE HA grupė N(proc.) (n=100) p vertė HWE p vertė MMP-1 (c. -1607 2G) Rs1799750 Genotipas 1G/1G 1G/2G 2G/2G Iš viso Alelis 1G 2G 33 (16,5) 94 (47) 73 (36,5) 200 (100) 160 (40,00) 240 (60,00) 0,768 25 (25) 38 (38) 37(37) 100 (100) 88 (44,00) 112 (56,00) 0,022 0,155 FGFR4 (G>A) Rs351855 Genotipas G/G G/A A/A Iš viso Alelis G A 95 (47,5) 92 (46) 13 (6,5) 200 (100) 282 (70,5) 118 (29,5) 0,134 45 (45,00) 49 (49,00) 6 (6,00) 100 (100) 139 (69,5) 61 (30,5) 0,119 0,885
HA – hipofizės adenoma, p vertė – reikšmingumo lygmuo, p vertė HWE – reikšmingumo lygmuo pagal Hardžio-Veinbergo dėsnį, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
Taip pat atlikta dvinarė logistinė regresinė analizė, tiriamųjų, sergančių HA, ir kontrolinėje grupėse, pavaizduota 7 lentelėje. Rs1799750 ir Rs351855 polimorfizmų analizėje statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo.
7 lentelė. MMP-1 (c.-1607 2G) Rs1799750 ir FGFR4 (G>A) Rs351855 genotipų dvinarė logistinė
regresijos analizė
Modelis Genotipas GS (95proc. PI) p reikšmė AIC
MMP-1 Kodominantinis 1G2G 1G1G 0,798 (0,462;1,377) 1,495 (0,778;2,872) 0,417 0,228 384,253 Dominantinis 1G/2G+2G/2G 0,979 (0,595;1,610) 0,932 385,901 Recesyvinis 1G/1G 0,593 (0,330;1,066) 0,081 382,911 Overdominantinis 1G2G 0,691 (0,423;1,128) 0,140 383,702 Adityvinis --- 1,162 (0,836;1,615) 0,370 385,105 FGFR4 Kodominantinis GA 1,124 (0,685;1,846) 0,643 387,665 AA 0,974 (0,348;2,730) 0,961
29
Dominantinis G/A+A/A 1,106 (0,683;1,790) 0,682 385,741
Recesyvinis A/A 1,089 (0,401;2,956) 0,867 385,880
Overdominantinis GA 1,128 (0,697;1,824) 0,624 385,668
Adityvinis --- 1,056 (0,711;1,567) 0,788 385,836
GS–galimybių santykis, AIC-akaike, p–reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
3.2 Rs1799750 ir Rs351855 genotipų dažnis pacientams, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
Rs1799750 polimorfizmas, moterų grupėje buvo nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05). Rs1799750 1G/2G genotipas buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis sveikoms moterims, nei sergančioms HA: 50,3 proc. vs. 30,8 proc., p=0,011. Tiriant Rs351855 polimorfizmo dažnį pagal tiriamųjų lytį statistiškai reikšmingų rodmenų nenustatėme. Duomenys pateikti 8 lentelėje.
8 lentelė. MMP-1 (c.-1607 2G) Rs1799750 ir FGFR4-R388 (G>A) Rs351855 polimorfizmų dažnis
pacientams, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį MMP-1 (c.-1607 2G) Rs1799750 genotipų dažnis pacientams, sergantiems hipofizės adenoma ir
kontrolinės grupės, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
Genotipas Vyrai P Reikšmė Moterys P Reikšmė HA grupė n (proc.) (n=35) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=49) HA grupė n (proc.) (n=65) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=151) 1G1G (proc.) 8 (22,9) 10 (20,4) 0,794 17 (26,2) 23 (15,2) 0,053 1G2G (proc.) 18 (51,4) 18 (36,7) 0,190 20 (30,8) 76 (50,3) 0,011 2G2G (proc.) 9 (25,7) 21 (42,9) 0,165 28 (43,1) 52 (34,4) 0,282 Alelis 1G 2G 34 (48,57) 36 (51,43) 38 (38,78) 60 (61,22) 54 (41,54) 76 (58,46) 122(40,40) 180(59,60)
FGFR4 (G>A) Rs351855 genotipų dažnis pacientams, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinės grupės, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
HA grupė n (proc.) (n=35) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=47) P Reikšmė HA grupė n (proc.) (n=65) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=153) P Reikšmė GG (proc.) 21 (60,0) 20 (42,6) 0,258 24 (36,9) 75 (49,0) 0,105 GA (proc.) 12 (34,3) 23 (48,9) 0,259 37 (56,9) 69 (45,1) 0,138 AA (proc.) 2 (5,7) 4 (8,5) 0,697 4 (6,2) 9 (5,9) 1 Alelis G A 54 (77,14) 16 (22,86) 63 (67,02) 27(32,98) 85(65,38) 45(34,62) 219(71,57) 87(28,43)
30 Atlikus dvinarę logistinę regresiją, Rs1799750 polimorfizmo dažnis moterų imtyje vyravo kodominatinis (p=0,037) ir overdominantinis (p=0,009) modeliai, o vyrų imtyje statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo (p>0,05). Lyginant Rs351855 polimorfizmo dažnius, statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo (p>0,05). Duomenys pateikti 9 lentelėje.
9 lentelė. MMP-1 (c.-1607 2G) Rs1799750 ir FGFR4(G>A) Rs351855 genotipų dvinarė logistinė
regresijos analizė pagal lytį
Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p
reikšmė AIC MMP-1 Moterys Kodominantinis 1G2G 0,489 (0,249;0,958) 0,037 262,394 1G1G 1,373 (0,631;2,986) 0,424 Dominantinis 1G/2A+1G/1G 0,694 (0,383;1,258) 0,229 266,792 Recesyvinis 1G/1G 0,507 (0,250;1,031) 0,061 264,804 Overdominantinis 1G2G 0,439 (0,237;0,812) 0,009 261,029 Adityvinis --- 1,045 (0,699;1,562) 0,831 268,186 Vyrai Kodominantinis 1G2G 2,333 (0,843;6,459) 0,103 117,289 1G1G 1,867 (0,554;6,286) 0,314 Dominantinis 1G/2G+1G/1G 2,167 (0,841;5,579) 0,109 115,438 Recesyvinis 1G1G 0,865 (0,302;2,476) 0,787 118,032 Overdominantinis 1G2G 0,312 (0,076;1.284) 0,107 51,33 Adityvinis --- 0,312 (0,792;2,582) 0,236 116,679 FGFR4 Moterys Kodominantinis GA 1,676 (0,911;3,081) 0,097 268,847 AA 1,389 (0,392;4,918) 0,611 Dominantinis G/A+A/A 1,643 (0,906;2,979) 0,102 268,936 Recesyvinis A/A 0,953 (0,283;3,213) 0,938 269,650 Overdominantinis GA 1,609 (0,896;2,888) 0,111 267,098 Adityvinis --- 1,408 (0,869;2,281) 0,165 267,722 Vyrai Kodominantinis GA 0,497 (0,196;1,258) 0,140 115,456 AA 0,476 (0,078;2,894) 0,420 Dominantinis G/A+A/A 0,494 (0,203;1,202) 0,120 113,458 Recesyvinis A/A 1,535 (0,265;8,894) 0,633 115,677 Overdominantinis GA 0,544 (0,221;1,342) 0,187 114,138 Adityvinis --- 0,585 (0,281;1,217) 0,151 113,767
31 3.3 Rs1799750 ir Rs351855 genotipų dažnis pacientams, sergantiems hipofizės adenoma ir
kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į hipofizės adenomos invazyvumą
MMP-1 geno 1G/1G polimorfizmas buvo dažniau stebimas invazyvios hipofizės adenomos grupėje, lyginant su kontroline grupe: 28,6 proc. vs. 16,5 proc., p=0,044. Taip pat 1G/2G polimorfizmas dažnesnis kontrolinėje grupėje nei neinvazyvios HA grupėje: 47 proc. vs. 27 proc., p=0.030. Neinvazyvios HA grupė atitiko Hardžio-Vainbergo dėsnį (p=0,02), o kontrolinė ir invazyvios HA grupės neatitiko (p>0,05). Tarp FGFR4 geno polimorfizmų statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo (p>0,05). Nei viena grupė neatitiko Hardžio-Vainbergo dėsnio (p>0,05). Duomenys pateikti 10 lentelėje.
10 lentelė. MMP-1 (c.-1607 2G) Rs1799750 ir FGFR4 (G>A) Rs351855 genotipų dažnis tiriamiesiems, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į hipofizės adenomos invazyvumą
Genas Genotipas/ alelis Dažnis (proc.) Kontrolinė grupė N(proc.) (n=200) p vertė HWE Neinvazyvios HA grupė N(proc.) (n=37) p vertė HWE Invazyvios HA grupė N(proc.) (n=63) p vertė HWE MMP-1 (c.-1607 2G) Rs17997 50 Genotipas 1G/1G 1G/2G 2G/2G Iš viso Alelis 1G 2G 33* (16,5) 94** (47) 73 (36,5) 200 (100) 160 (40,00) 240 (60,00) 0,768 7 (18,9) 10** (27,0) 20 (54,1) 37 (100) 24 (32,43) 50 (67,57) 0,020 18* (28,6) 28 (44,4) 17 (27) 63 (100) 64 (50,79) 62 (49,21) 0,379 FGFR4 (G>A) Rs35185 5 Genotipas G/G G/A A/A Iš viso Alelis G A 95 (47,5) 92 (46) 13 (6,5) 200 (100) 282 (70,5) 118 (29,5) 0,134 17 (45,9) 17 (45,9) 3 (8,1) 37 (100) 51 (68,92) 23 (31,08) 0,659 28 (44,4) 32 (50,8) 3 (4,8) 63 (100) 88 (69,84) 38 (30,16) 0,102
HA-hipofizės adenoma, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05. *p=0.044
**p=0.030
Atlikus dvinarę logistinę regresiją, Rs1799750 polimorfizmo dažnis invazyvios HA grupėje buvo overdominantinis (p=0,028) modelis, o invazyvios HA grupėje – dominantinis (p=0,037) ir adityvinis (p=0,039). Lyginant Rs351855 polimorfizmo dažnius, statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo (p>0,05). Duomenys pateikti 11 lentelėje.
32 11 lentelė. MMP-1 (c.-1607 2G) Rs1799750 ir FGFR4 (G>A) Rs351855 genotipų dvinarė logistinė
regresijos analizė pagal hipofizės adenomos invazyvumą
Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p
reikšmė AIC MMP-1 Neinvazyvi HA Kodominantinis 1G2G 1G1G 0,502 (0,177;1,425) 1,292 (0,498;3,353) 0,195 0,599 207,767 Dominantinis 1G/2G+1G/1G 0,489 (0,241;2,992) 0,047 205,381 Recesyvinis 1G/1G 1,181 (0,478;2,914) 0,718 209,199 Overdominantinis 1G2G 0,418 (0,192;2,908) 0,028 204,051 Adityvinis --- 1,069 (0,998;1,145) 0,057 205,705 Invazyvi HA Kodominantinis 1G2G 0,546 (0,268;1,114) 0,096 290,891 2G2G 0,427 (0,196;0,931) 0,032 Dominantinis 1G/2G+2G/2G 0,494 (0,255;0,958) 0,037 289,406 Recesyvinis 2G/2G 0,634 (0,344;1,203) 0,167 291,610 Overdominantinis 1G2G 0,902 (0,511;1,594) 0,723 293,465 Adityvinis --- 0,658 (0,442;0,978) 0,039 289,267 FGFR4 Neinvazyvi HA Kodominantinis GA AA 0,801 (0,206;3,113) 0,775 (0,200;3,013) 0,748 0,713 211,196 Dominantinis G/A+A/A 0,788 (0,213;2,913) 0,721 209,203 Recesyvinis A/A 0,939 (0,465;1,899) 0,862 209,295 Overdominantinis GA 0,998 (0,494;2,017) 0,995 209,326 Adityvinis --- 0,920 (0,522;1,622) 0,773 209,243 Invazyvi HA Kodominantinis GA AA 1,507 (0,403;5,632) 0,542 295,013 1,277 (0,340;4,801) 0,717 Dominantinis G/A+A/A 1,390 (0,383;5,044) 0,616 293,324 Recesyvinis A/A 0,884 (0,500;1,562) 0,672 293,411 Overdominantinis GA 1,212 (0,687;2,136) 0,507 293,150 Adityvinis --- 0,964 (0,604;1,541) 0,880 293,568
GS–galimybių santykis, AIC-akaike , p–reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05. 3.4 Rs1799750 ir Rs351855 genotipų dažnis tiriamiesiems, sergantiems hipofizės adenoma ir
kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į hipofizės adenomos aktyvumą
MMP-1 geno 1G/1G polimorfizmas buvo dažniau stebimas aktyvios hipofizės adenomos grupėje, lyginant su kontroline grupe: 28,4 proc. vs. 16,5 proc., p=0,044. Aktyvios HA grupė atitiko Hardžio-Vainbergo dėsnį (p=0,04) o kontrolinė ir neaktyvios HA grupės neatitiko (p>0,05). Tarp FGFR4 geno polimorfizmų statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo (p>0,05). Nei viena grupė neatitiko Hardžio-Vainbergo dėsnio (p>0,05). Duomenys pateikti 12 lentelėje.
33 12 lentelė. MMP-1 (c.-1607 2G) Rs1799750 ir FGFR4 (G>A) Rs351855 genotipų dažnių, tiriamųjų
sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinės grupės, atsižvelgiant į hipofizės adenomos aktyvumą
Genas Genotipas/ alelis Dažnis (proc.) Kontrolinė grupė N(proc.) (n=200) p vertė HWE Neaktyvios HA grupė N(proc.) (n=33) p vertė HWE Aktyvios HA grupė N(proc.) (n=67) p vertė HWE MMP-1 Rs1799750 Genotipas 1G/1G 1G/2G 2G/2G Iš viso Alelis 1G 2G 33* (16,5) 94 (47) 73 (36,5) 200 (100) 160 (40,00) 240 (60,00) 0,768 6 (18,2) 13 (39,4) 14(42,4) 33 (100) 25 (37,88) 41 (62,12) 0,349 19* (28,4) 25 (37,3) 23(34,3) 67 (100) 63 (47,01) 71 (52,99) 0,040 FGFR4 Rs351855 Genotipas G/G G/A A/A Iš viso Alelis G A 95 (47,5) 92 (46) 13 (6,5) 200 (100) 282 (70,5) 118 (29,5) 0,134 14 (42,4) 18 (54,5) 1 (3,0) 33 (100) 46 (69,7) 20 (30,3) 0,094 31 (46,3) 31 (46,3) 5 (7,5) 67 (100) 93 (69,4) 41 (30,6) 0,464
HA-hipofizės adenoma, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05. *p=0,049
Atlikus dvinarę logistinę regresiją, Rs1799750 polimorfizmo dažnisaktyvios HA grupėje gautaskodominantinis (p=0,035) ir dominantinis (p=0,036) modeliai, o neaktyvios HA grupėje statistiškai reikšmingų rezultatų nebuvo (p>0,05). Lyginant Rs351855 polimorfizmo dažnius, statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo (p>0,05). Duomenys pateikti 13 lentelėje.
13 lentelė. MMP-1 (c.-1607 2G) Rs1799750 ir FGFR4 (G>A) Rs351855genotipų dvinarė logistinė regresijos analizė pagal HA aktyvumą
Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p
reikšmė AIC MMP-1 Neaktyvi HA Kodominantinis 1G2G 0,721 (0,319;1,628) 0,431 195,412 2G2G 0,948 (0,335;2,685) 0,920 Dominantinis 1G/2G+1G/1G 0,780 (0,369;1,648) 0,515 193,668 Recesyvinis 1G/1G 1,125 (0,431;2,938) 0,811 194,031 Overdominantinis 1G2G 0,733 (0,346;1,554) 0,418 193,422 Adityvinis --- 0,918 (0,543;1,553) 0,749 193,985 Aktyvi HA Kodominantinis 1G2G 0,462 (0,226;0,946) 0,035 301,334 2G2G 0,547 (0,263;1,140) 0,107 Dominantinis 1G/2G+1G/1G 0,499 (0,261;0,956) 0,036 300,600
34 Recesyvinis 1G/1G 0,909 (0,509;1,625) 0,749 304,732 Overdominantinis 1G2G 0,671 (0,380;1,184) 0,169 302,910 Adityvinis --- 0,768 (0,525;1,122) 0,172 302,971 FGFR4 Neaktyvi HA Kodominantinis GA AA 2,543 (0,313;20,682) 0,383 194,832 1,916 (0,232;15,801) 0,546 Dominantinis G/A+A/A 2,225 (0,281;17,598) 0,449 193,377 Recesyvinis A/A 0,814 (0,387;1,714) 0,589 193,793 Overdominantinis GA 1,409 (0,672;2,951) 0,364 193,259 Adityvinis --- 0,957 (0,520;1,760) 0,887 194,067 Aktyvi HA Kodominantinis GA AA 0,876 (0,289;2,655) 0,815 306,751 0,848 (0,280;2,570) 0,771 Dominantinis G/A+A/A 0,862 (0,295;2,515) 0,786 304,763 Recesyvinis A/A 0,952 (0,547;1,657) 0,861 304,804 Overdominantinis GA 1,011 (0,580;1,761) 0,970 304,834 Adityvinis --- 0,944 (0,602;1,479) 0,800 304,771
GS–galimybių santykis, AIC-akaike, p–reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
3.5 Rs1799750 ir Rs351855 genotipų dažnis tiriamiesiems, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į hipofizės adenomos atkryčius
MMP-1 geno 1G/1G polimorfizmas buvo dažniau stebimas hipofizės adenomos be atkryčių grupėje, lyginant su kontroline grupe: 27,7 proc. vs. 16,5 proc., p=0.034. HA be atkryčių grupė atitiko Hardžio-Vainbergo dėsnį (p=0,013), o kontrolinė ir HA su atkryčiais grupės neatitiko (p>0,05). Tarp FGFR4 geno polimorfizmų statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo (p>0,05). Nei viena grupė neatitiko Hardžio-Vainbergo dėsnio (p>0,05). Duomenys pateikti 14 lentelėje.
14 lentelė. MMP-1 (c.-1607 2G) Rs1799750 ir FGFR4 (G>A) Rs351855 genotipų dažnių, tiriamųjų
sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinės grupės, atsižvelgiant į hipofizės adenomos atkryčius
Genas Genotipas/ alelis Dažnis (proc.) Kontrolinė grupė N(proc.) (n=200) p vertė HWE HA be atkryčių grupė N(proc.) (n=83) p vertė HWE HA su atkryčiais grupė N(proc.) (n=17) p vertė HWE MMP-1 Rs1799750 Genotipas 1G/1G 1G/2G 2G/2G Iš viso Alelis 1G 2G 33* (16,5) 94 (47) 73 (36,5) 200 (100) 160 (40,00) 240 (60,00) 0,768 23* (27,7) 30 (36,1) 30(36,1) 83 (100) 76 (45,78) 90 (54,22) 0,013 2 (11,8) 8 (47,1) 7 (41,2) 17 (100) 12 (35,29) 22 (64,71) 0,900
