Flavonoidų tirpalų su polimerinėmis pagalbinėmis medžiagomis preanalitinių ypatumų tyrimas

DARBAS ATLIKTAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE) PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Flavonoidų tirpalų su polimerinėmis pagalbinėmis medžiagomis preanalitinių ypatumų tyrimas“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

MATAS STASIŪNAS

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

MATAS STASIŪNAS

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

VALDAS JAKŠTAS

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020 05 21 Sonata Trumbeckaitė

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

MATAS STASIŪNAS

Flavonoidų tirpalų su polimerinėmis pagalbinėmis

medžiagomis preanalitinių ypatumų tyrimas

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Prof. Dr. Valdas Jakštas

Kaunas, 2020 m.

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Prof. Dr. R. Morkūnienė

……….

Flavonoidų tirpalų su polimerinėmis pagalbinėmis

medžiagomis preanalitinių ypatumų tyrimas

Magistro baigiamasis darbas

Konsultantas Darbo vadovas ……… Prof. Dr.

Valdas Jakštas Recenzentas Darbą atliko ... Magistrantas ... Matas Stasiūnas

……… ……….

Kaunas, 2020 m.

TURINYS

1.1. Vaistiniai augaliniai preparatai ir jų kaupiami aktyvūs junginiai ... 16

1.1.1 Flavonoidai ... 17

1.2 Polimerinės medžiagos ... 19

1.2.1 Polimerai medicinoje ir farmacijoje ... 19

1.2.2 Geliai ... 20

1.2.3 Hipromeliozė ... 21

1.2.4 Chitozanas ... 22

1.2.5 Carbopol Ultrez 21 ... 23

1.3 Flavonoidų ir polimerų tarpusavio sąveikos ... 24

1.4 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 26

2. TYRIMO METODIKA ... 28

2.1. Tyrimo organizavimas ir planavimas ... 28

2.2. Tyrimo objektas ... 28

2.3. Naudotos medžiagos ir regentai ... 28

2.4. Naudoti aparatai ... 29

2.5. Tiriamųjų tirpalų ruošimas ... 29

2.6. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodika. ... 29

2.7. Statistinė analizė ... 30

3. REZULTATAI ... 31

3.1 Atliktas tyrimas ... 31

3.2. Kvercetino tirpalo koncentracijos kitimas hidroksipropilmetilceliuliozės poveikyje ... 31

3.4. Kvercetino tirpalo koncentracijos kitimas Ultrez 21 poveikyje ... 36

3.5. Rutino tirpalo koncentracijos kitimas hidroksipropilmetilceliuliozės poveikyje ... 39

3.6. Rutino tirpalo koncentracijos kitimas chitozano poveikyje ... 40

3.7. Rutino tirpalo koncentracijos kitimas Ultrez 21 poveikyje ... 42

3.8. Kvercitrino tirpalo koncentracijos kitimas hidroksipropilmetilceliuliozės poveikyje ... 44

3.9. Kvercitrino tirpalo koncentracijos kitimas chitozano poveikyje ... 46

3.10. Kvercitrino tirpalo koncentracijos kitimas Ultrez 21 poveikyje ... 48

3.11 Rezultatų apibendrinimas ... 50

IŠVADOS ... 53

Rekomendacijos ... 55

SANTRAUKA

M. Stasiūno magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas: Prof. Dr. Valdas Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra – Kaunas.

Pavadinimas: Flavonoidų tirpalų su polimerinėmis pagalbinėmis medžiagomis preanalitinių ypatumų tyrimas

Tyrimo objektas ir metodai: Tyrimo objektas – fitofarmaciniuose preparatuose sutinkami flavonoidai: rutinas, kvercetinas, kvercitrinas, kurie buvo tirti išgrynintų etaloninių junginių formoje ir buvo įsigyti iš „Sigma – Aldrich“ (Buchsas, Šveicarija). Tiriamieji tirpalai – flavonoidų bei polimerinių pagalbinių medžiagų tirpalai. Metodas - ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu buvo atliekamas flavonoidų tirpalų koncenctracijos pokyčio stebėjimas. Flavonoidų nustatymui panaudotas skysčių chromatografas „Waters ACQUITY H-class UPLC“ su diodų matricos detektoriumi „ACQUITY UPLC eLambda 800 nm“, chromatografinė kolonėlė „ACQUITY UPLC BEH C18” 2,1x50mm (Waters), kurios sorbento dalelių dydis - 1,7 µm, o aplinkos temperatūra - 30°C. Injekcijos tūris - 1 μl. Chromatografiniam skirstymui buvo naudotas 0,1 % trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas (eliuentas A) ir acetonitrilas (eliuentas B).

Darbo tikslas: ištirti rutino, kvercitrino ir kvercetino tirpalų su pagalbinėmis polimerinėmis medžiagomis preanalitinius ypatumus.

Darbo uždaviniai:

1. Įvertinti polimerinių medžiagų: hidroksipropilmetilceliuliozės, chitozano ir skersiniais ryšiais sujungto poliakrilinės rūgšties polimero Carbopol® Ultrez 21 įtaką rutino, kvercitrino ir kvercetino koncentracijai ruošiant tiriamuosius analitinius tirpalus. 2. Įvertinti flavonoidų: rutino, kvercitrino ir kvercetino ir polimerinių medžiagų tirpinimo trukmės įtaką analičių koncentracijos pokyčiui tiriamuosiuose tirpaluose polimerinių medžiagų: hidroksipropilmetilceliuliozės, chitozano ir skersiniais ryšiais sujungto poliakrilinės rūgšties polimero Carbopol® Ultrez 21 aplinkoje.

1. Nustatyta, kad tirtos polimerinės medžiagos: hidroksipropilmetilceliuliozė, chitozanas ir skersiniais ryšiais sujungtas poliakrilinės rūgšties polimeras Carbopol® Ultrez 21 gali sąlygoti rutino, kvercitrino ir kvercetino koncentracijos pokyčius ruošiant tiriamuosius analitinius tirpalus. Nustatyta, kad dėl skirtingos sąveikos tarp polimero ir analitės ar polimero ir tirpiklio, tirtų polimerinių medžiagų buvimas tirpinimo terpėje greta rutino, kvercitrino ir kvercetino gali skirtingai įtakoti flavonoidų koncentracijos pokytį tiriamajame tirpale.

2. Nustatyta, kad tirpinimo terpėje esant polimerinių medžiagų: hidroksipropilmetilceliuliozės, chitozano ir skersiniais ryšiais sujungto poliakrilinės rūgšties polimero Carbopol® Ultrez 21, flavonoidų: rutino, kvercitrino ir kvercetino tirpinimo trukmė gali sąlygoti rutino, kvercitrino ir kvercetino koncentracijos pokyčius ruošiant tiriamuosius analitinius tirpalus.

SUMMARY

Title: Investigation of preanalytical peculiarities of flavonoid solutions with polymeric excipients.

Object and methods: flavonoids which were found in phytopharmaceuticals: rutin, quercetin, quercitrin, which were tested from purified and reference compounds and were Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland). Test solutions are solutions of flavonoids and polymeric excipients. Method – concentration changes of flavonoids solutions were monitored by ultra-efficient liquid chromatography. For this experiment was used determination of flavonoids, a liquid chromatograph “Waters ACQUITY H-class UPLC” with a diode array detector “ACQUITY UPLC eLambda 800 nm”, chromatographic column “ACQUITY UPLC BEH C18” 2.1x50mm (Waters) with a sorbent particle size of 1,7 µm, and the ambient temperature is 30°C. Injection volume: 1 µl. Aqueous 0,1% trifluoroacetic acid (eluent A) and acetonitrile (eluent B) were used for chromatographic separation.

Aim: To investigate the preanalytical properties of solutions of rutin, quercitrin and quercetin containing polymeric excipients.

Objective:

1. Investigate analytical characteristics of herbal preparations with auxiliary polymeric

substances.

2. Investigate the interaction of plant blanks with selected polymeric materials. Analyze solutions prepared by different methods of preparation of analytical samples.

Results and conclusions:

1. It was found that tested polymeric substances: hydroxypropylmethylcellulose, chitosan and cross-linked polyacrylic acid polymer Carbopol Ultrez 21 can cause changes in the concentration of rutin, quercitrin and quercitin in the preparation of test analythical solutions. It was found that due to the different interactions between the polymer and

the solvent, the presence of the tested polymeric substances in the dissolution medium next to rutin, quercitrin and quercitin can differently influence the change of flavonoid concentration in the test solution.

2. It has been found that in the presence of polymeric substances in the dissolution medium: hudroxypropylmethylcellulose, chitosan and cross-linked polyacrylic acid polymer Carbopol Ultrez 21, flavonoids: rutin, quercitrin and quercetin dissolution time can lead to.

PADĖKA

Už suteiktas darbo sąlygas dėkoju Farmacijos fakulteto Farmacinių technologijų institutui.

SANTRUMPOS

aps/min - apsisukimai per minutę; HPMC – hidroksipropilmetilceliuliozė; g / l – gramai litre;

pav. – paveikslas;

UESC – Ultra Efektyvioji Skysčių Chromatografija; UV – ultravioletiniai spinduliai;

μg – mikrogramai;

ĮVADAS

Biologiškai aktyvūs junginiai, nulemia vaistinių augalų gydomąsias savybes. Vaistiniai augalai gali kaupti: alkaloidus, antracenus, eterinius aliejus, flavonoidus, fosfolipidus, kartumynus, taninus. Vaistinių augalų fitoterapinis aktyvumas priklauso nuo to,

kokį kiekį ir kokias biologiškai aktyvias medžiagas jis kaupia. Flavonoidai yra laikomi nepakeičiamu medicinos, farmacijos, kosmetikos, mitybos

komponentu. Taip yra dėl flavonoidų antioksidacinių, priešuždegiminių, antimutageninių bei antikancerogeninių savybių. Flavonoidai gali būti randami skirtingose augalo dalyse. Augalams flavonoidai yra reikalingi augimui bei apsaugai nuo apnašų, beveik visos flavonoidų grupės gali veikti kaip antioksidantai.

Polimerai yra didžiulės molekulės ar makromolekulės, kurios yra sudarytos iš daugybės vienodų subvienetų, sujungtų į ilgas grandines. Polimerų savybės priklauso nuo molekulinės struktūros, atomų ir grupių išsidėstymo molekulėse. Polimerinės medžiagos atlieka nepakeičiamą vaidmenį gaminant farmacinius produktus. Jų taikymo sritis apima nuo medžiagų pakavimo iki vaistų sudedamųjų dalių. Farmacijoje naudojami polimerai yra plačiai naudojami produktų skoniui maskuoti, kontroliuoti veikliųjų medžiagų atpalaidavimą, padidinti stabilumą ar pagerinti biologinį prieinamumą.

Hidrofilinių polimerų sistemos yra plačiai naudojamos farmacijos, maisto ir kosmetikos pramonėje bei medicinoje. Hidrofiliniai polimerai plačiai vartojami kaip vaistų pagalbinė medžiaga – tirštiklis ar dengiančioji medžiaga, taip pat kontroliuojamam atpalaidavimo profiliui sukurti vaistų, skirtų peroraliniam ar išoriniam vartojimui formulėse [36, 37].

Hidrofilinės polimero matricos sistemą sudaro hidrofilinis polimeras, vaistas ir kitos pagalbinės medžiagos, pasiskirstę visoje matricoje. Ši dinamiška sistema priklauso nuo polimero drėkinimo, hidratacijos ir tarpmolekulinės sąveikos tarp polimero ir funkcinės medžiagos molekulių. Sąveika tarp medžiagos molekulių ir polimero paprastai pasireiškia skystoje (ypač vandeninėje) terpėje. Tirpiklyje tirpios pagalbinės medžiagos ar vaistinės medžiagos bus sulaikomos erdvėje apie polimerą, pagalbinių medžiagų arba viso vaisto kompozicinį kompleksą. Kartu gali vykti kiti reiškiniai – įvairių mechanizmų nulemtos tarpmolekulinės sąveikos bei tokios tirpiklio ir polimero sąveikos kaip brinkimas. Tarpmolekulinės sąveikos farmacijoje gali turėti skirtingą reikšmę. Vaistų atsipalaidavimo iš

kietų ir puskiečių vaistų formų, nešiklių ir dangų formavimo aspektai pakankamai išsamiai aprašyti mokslinėje literatūroje [37, 38]. Tačiau sąveikos gali vykti ir tokiose farmacijos srityse, kur jos nėra pageidaujamos. Vaistų kokybės užtikrinimas ir kontrolė neatsiejami nuo farmacinės analizės (įskaitant fitochemiją bei bioanalizę). Analitiniai daugiakomponenčių tiriamųjų objektų tyrimai analitikui yra sudėtinga kompleksinė užduotis, kuri neatsiejama nuo eksperimentais grįsto tiriamojo objekto pažinimo. Farmacijoje atliekama daug įvairių tyrimų kokybės užtikrinimo ir kontrolės tikslais. Polimerinė medžiaga, naudojama vaisto gamybai, gali būti įvairi ir parenkama atsižvelgiant į įvairius technologinius tikslus. Analitiškai akivaizdu, kad polimeras turėtų nesąveikauti su analitine ir tiriamojo tirpalo tirpikliu, tačiau farmacijoje prioritetai yra vartojimo uždaviniai, todėl kokybės kontrolei dažnai tenka spręsti komplikuotus uždavinius. Galimos molekulinės sąveikos ypač aktualios vaisto kūrimo metu kuriant tikslias ir atkuriamas analitines motodologijas bei siekiant išorinės vaistinių preparatų kontrolės tyrimus vykdant akredituotose laboratorijose. Tarpmolekulines sąveikas įgalinančios sistemos problematiškumas, kaip ir sprendimų poreikiai, didėja didėjant tirpalo kompleksiškumui, todėl tiek grynų junginių, tiek augalinių ekstraktų ar jų komponentų analitinis tyrimas tokių sistemų aplinkoje yra labai opi analitinė problema. Hiproksipropilmetilceliuliozė, kuri dažniausiai naudojama formuojant hidrofilines vaistų sistemas, yra mišrios sudėties alkilhidroksialkilceliuliozės eteris, kuriame yra metoksilo ir hidroksipropilo grupės [36].

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti rutino, kvercitrino ir kvercetino tirpalų su pagalbinėmis poliemerinėmis medžiagomis preanalitinius ypatumus.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti polimerinių medžiagų: hidroksipropilmetilceliuliozės, chitozano ir skersiniais ryšiais sujungto poliakrilinės rūgšties polimero Carbopol® Ultrez 21 įtaką rutino, kvercitrino ir kvercetino koncentracijai ruošiant tiriamuosius analitinius tirpalus.

2. Ištirti flavonoidų: rutino, kvercitrino ir kvercetino ir polimerinių medžiagų tirpinimo trukmės įtaką analičių koncentracijos pokyčiui tiriamuosiuose tirpaluose polimerinių medžiagų: hidroksipropilmetilceliuliozės, chitozano ir skersiniais ryšiais sujungto poliakrilinės rūgšties polimero Carbopol® Ultrez 21 aplinkoje.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Vaistiniai augaliniai preparatai ir jų kaupiami aktyvūs junginiai

Augalai yra natūralių augalinių junginių šaltinis. Augalinių vaistų vartojimas įvairioms ligoms gydyti bei jų prevencijai yra vadinamas fitoterapija. Fitoterapija yra mokslu pagrįsta medicinos praktika ir todėl išsiskiria iš kitų. Dėl skirtingo požiūrio įvairiose pasaulio šalyse, iškyla diskusijos dėl fitoterapinių preparatų licencijavimo, vienose šalyse manoma, kad šiuos produktus reikia licencijuoti kaip vaistus, tuo tarpu kitose šalyse fitoterapija yra laikoma tradicinės medicinos forma [3]. Tačiau siekiant kontroliuoti šių preparatų vartojimą, daugelis šalių sukūrė reglamentus, skirtus kontroliuoti augalinių preparatų vartojimą. [2]

Fitoterapijos koncepcija kilo iš prancūzų gydytojo Henri Leclarc, kuris pirmą kartą fitoterapijos terminą vartojo 1913m. 1960m. Vokiečių žolininkas Rudolfas Fritzas Weissas išleido leidinį apie fitofarmaciją ir sutelkė dėmesį į tai, kad vėliau buvo apibūdinta kaip įrodymais pagrįsta medicina [3].

Lietuvoje nuo seno buvo vaistinių augalinių žaliavų surinkimo, perdirbimo, vartojimo ir tyrimo tradicijas. 1781m. Vilniuje buvo įkurtas botanikos sodas, kuriame buvo pradėti auginti ne tik vietiniai, bet ir augalai, augantys kitose šalyse. Šį sodą įkūrė botanikas bei medikas prof. Ž. Žiliberas. 1802m. buvo išleistas pirmasis Vilniaus universiteto botanikos sodo augalų katalogas, kuriame buvo nurodyta, jog sode auga 1072 augalai, tarp kurių net 270 vaistinių. 1924m Kauno botanikos sode buvo įkurtas vaistinių augalų skyrius, kuriame buvo auginamos 300 rūšys vaistinių augalų [1]. Šiuo metu Kauno botanikos sode yra auginama apie 470 vaistinių augalų rūšių.

Biologiškai aktyvūs junginiai, kaupiami įvairiose augalo dalyse, nulemia vaistinių augalų gydomąsias savybes. Vaistiniai augalai gali kaupti: alkaloidus, antracenus, eterinius aliejus, flavonoidus, fosfolipidus, kartumynus, taninus. Vaistinių augalų fitoterapinis aktyvumas priklauso nuo to, kokį kiekį ir kokias biologiškai aktyvias medžiagas jis kaupia.

Daugelis sintetinių ir pusiau sintetinių vaistų yra alkaloidų struktūrinės modifikacijos, skirtos sustiprinti ar pakeisti pirminį vaisto poveikį ir sumažinti nepageidaujamą šalutinį poveikį [5]. Alkaloidai yra klasifikuojami pagal heterociklines sistemas, esančias jų struktūrose. Alkaloidų metabolizmo tyrimai yra sutelkti į alkaloidų sintezės būdus [4].

eteriniai aliejai yra randami skirtinguose augalo dalyse, pavyzdžiui, vaistinėje šventagaršvėje (Angelica archangelica), eteriniai aliejai randami šaknyse ir sėklose, ir jie turi skirtingą cheminę sudėtį. Dažniausiai eteriniai aliejai yra koncentruoti hidrofobiniai skysčiai [6]. Eteriniai aliejai padeda kovoti su patogeninėmis bakterijomis, kurios yra atsparios antibiotikams. Antimikrobinis eterinių aliejų efektas buvo demonstruotas su plataus spektro mikroorganizmais [7].

Taninai yra organiniai junginiai, dažniausiai glikozidiniai. Šie junginiai pasižymi rūgštumu ir sutraukiančiu poveikiu. Remiantis atliktais tyrimais, yra manoma, kad taninai jungiasi prie burnos ertmės baltymų, o po to skatina jų denatūraciją, sudaro kompleksus su virškinimo fermentais, dėl to, taninai dažnai yra laikomi nepageidaujamais junginiais. [8].

Fosfolipidai yra būtini augalų biologinių membranų ir signalų perdavimo komponentai. Fosfolipidai taip atlieka reguliavimo funkcijas. Fosfolipidai taip pat yra įprasti membranų komponentai nuo bakterijų ir taip pat yra pagrindiniai lipidai ekstraplastidinėse augalų membranose [9]. Buvo atlikti tyrimai, kuriuose buvo įrodyta, jog papildai su fosfolipidais gali pagerinti mokymosi gebėjimus ir regėjimo funkciją. Taip pat buvo įrodytas fosfolipidų naudingumas kepenų sutrikimams gydyti, kurie atsiranda dėl virusinio hepatito ar alkoholio [10].

1.1.1 Flavonoidai

Flavonoidai yra laikomi nepakeičiamu farmacinių preparatų komponentu. Taip yra dėl flavonoidų antioksidacinių, priešuždegiminių, antimutageninių bei antikancerogeninių savybių. Flavonoidai gali būti randami skirtingose augalo dalyse. Augalams flavonoidai yra reikalingi augimui bei apsaugai nuo apnašų, beveik visos flavonoidų grupės gali veikti kaip antioksidantai. Pagrindiniai flavonoidų šaltiniai gamtoje yra daržovės, vaisių sultys, vynuogės, citrusiniai vaisiai, pupos, šokoladas, svogūnai, obuoliai, špinatai, žalioji arbata, rozmarinai. [11].

Flavonoidai gali būti suskirstyti į skirtingus pogrupius, atsižvelgiant į C žiedo oksidacijos, nesotumo laipsnį bei anglies atomo C žiede prie kurio yra prisijungęs B žiedas. Flavonoidai yra skirstomi į flavonus, flavonolius, flavononus, izoflavonoidus, neoflavonoidus, antocyanidinus, flavan-3-olius [12].

Remiantis žemu augalų auginimo ir cheminės sintezės efektyvumu, buvo atliktas tyrimas, kurio metu tyrimų grupės atkreipė dėmesį į falvonoidų gamybą mikroorganizmuose,

naudodamos metabolizmo inžineriją ir sintetinę biologiją. Cheminei flavonoidų sintezei yra būtinos ekstremalios reakcijos sąlygos ir toksiškos cheminės medžiagos [40, 41].

Rutinas – flavonolių grupės glikozidas. Aukštesniuose augaluose jis yra sintetinamas kaip apsauga nuo UV spindulių. Fenolio molekulės dalis yra susieta su cukrumi (tai yra hidrofilinė molekulės dalis), todėl padidėja molekulės tirpumas vandenyje. Rutino hidrolize, gliukozidazės būdu, gaunami kvercetinas ir rutinozė. Šią fermentinę reakciją atlieka žarnyno mikroflora. Rutinas ir beveik visos flavonoidų grupės pasižymi antioksidaciniu aktyvumu, veikdamos kaip laisvųjų radikalų šalintojos. Rutinas taip pat pasižymi metalų chelatinėmis savybėmis, slopindamas metalų jonų sukeltą peroksidaciją.

Mažas rutino tirpumas vandenyje (0,125 g/l) riboja jo panaudojimą maisto papilduose ir vaistuose. Taip pat yra svarbus rutino stabilumas ir sąveikos su kitais, preparatuose esančiais, junginiais. Rutinas ir antocianinai pasižymi dideliu stabilumu laikymo metu, tačiau gali sąveikauti su kitais polifenoliais ir metalų jonais. Autooksidaciją silpnai šarminiame vandeniniame tirpale padidina metalų jonai. Rutino ir kurkumino derinys gali skatinti kurkumino sąveiką su žmogaus serumo albuminu ir pagerinti jo biologinį prieinamumą.Taip pat rutinas su kitais flavonoidais gali sąveikauti su vaistais, konkuruodamas dėl prisijungimo vietos prie žmogaus serumo albumino [28].

Rutinas turi daug gydomųjų savybių, daugiausia dėl stipraus antioksidacinio ir priešuždegiminio aktyvumo, tačiau aktyvumui įtakos turi rutino kiekis ir biologinis prieinamumas rezorbcijai. Koncentracija įvairiose augalų rūšyse ir konkrečiose augalo dalyse skiriasi. Rutinas yra sunkiai absorbuojamas žarnyno membranose dėl savo glikozilintos struktūros su disacharidu, pagrinde metabolizuojamas storojoje žarnoje [28, 29].

Kvercetinas - priklauso flavonolių grupei. Po absorbcijos kvercetinas metabolizuojamas žarnyne ir kepenyse. Teigiama, kad kvercetinas yra vienas iš plačiausiai naudojamų bioflavonoidų metabolinių ir uždegiminių sutrikimų gydymui. Didžiausia kvercetino koncentracija yra randama daržovėse. Kvercetinas yra kaip prevencinė priemonė nuo osteoporozės, plaučių vėžio bei širdies ir kraujagyslių ligų. Buvo atlikti tyrimai, kuriuose pacientams, kurie daug produktų, kuriuose aptinkama didelė kvercetino koncentracija, sumažėjo širdies ir kraujagyslių ligų rizika. [30, 31].

Kvercitrinas – glikozilintos formos flavonoidas. Kvercitrinas vaistų formose yra naudojamas inkstų akmenų gydymui bei prevencijai. Kvercitrinui nustatyti yra taikomas masių spektrometrijos metodas. Atliktuose tyrimuose kvercitrino kiekybinis nustatymas yra atliekamas žiurkių plazmoje, taikant audinių pasiskirstymo tyrimą [32, 33].

1.2 Polimerinės medžiagos

Polimerai yra didelės molekulės ar makromolekulės, kurios yra sudarytos iš daugybės vienodų subvienetų, sujungtų į ilgas grandines. Polimerų savybės priklauso nuo molekulinės struktūros, atomų ir grupių išsidėstymo molekulėse. Polimerų savybės labai priklauso nuo temperatūros. Polimerai gali būti sintetiniai bei natūralūs ir jie pasižymi skirtingomis savybėmis. Cheminiais būdais gali būti keičiamos gamtinių polimerų struktūra bei savybės. Sintetiniai ir natūralūs polimerai atsidūrė farmacijos ir biomedicinos pramonėje ir jų pritaikymas sparčiai auga [13].

1.2.1 Polimerai medicinoje ir farmacijoje

Polimerai sudaro vieną iš plačiausiai medicinoje naudojamų medžiagų grupių. Polimerinės medžiagos pasižymi daugybe unikalių savybių. Kurios daro jas naudingomis įvairiose srityse, tokiose kaip, ortopedija, stomatologija, kietųjų ir minkštųjų audinių pakaitalai

bei farmaciniai preparatai [14].

Polimerinės medžiagos atlieka nepakeičiamą vaidmenį gaminant farmacinius produktus. Jų taikymo sritis apima nuo medžiagų pakavimo iki vaistų sudedamųjų dalių. Farmacijoje naudojami polimerai yra plačiai naudojami produktų skoniui maskuoti, kontroliuoti veikliųjų medžiagų atpalaidavimą, padidinti stabilumą ar pagerinti biologinį prieinamumą. Idealus polimeras turi būti: inertiškas ir suderinamas su aplinka, netoksiškas, turėtų būti lengvai vartojamas, lengva gamyba, nebrangus.

Tabletėms gaminti, polimerai yra naudojami kaip rišikliai ir suirimą gerinančios medžiagos. Rišikliai, surišantys miltelių daleles drėgnoje masėje, plačiausiai naudojami rišikliai: celiuliozė, krakmolas, želatina, polivinilpirolidinas. Suirimą gerinantys polimerai, krakmolas, alginatai, natrio karboksimetilceliuliozė, sumažina tirpimo laiką ir suteikia greitesnį vaisto poveikį. Kapsulėse įvairūs polimerai yra naudojami kaip plastifikatoriai, nuo jų priklauso želatinos kapsulės stiprumas bei lankstumas [15, 16].

Kietų vaistų formų plėvelės dangoms yra naudojamas chitozanas, taip pat dėl gelio sudarymo savybių jis yra naudingas kietoms vaistų formoms, tokioms kaip granulės, mikro dalelės. Buvo išbandytas teigiamai įkrauto chitozano derinys su neigiamai įkrautomis

biomolekulėmis, tokiomis kaip želatina, algino rūgštis ir hialurono rūgštis, kad būtų gautos naujos matricos, turinčios unikalias savybes kontroliuojamam vaistų atpalaidavimui. Parenteraliai vartojamiems vaistams yra naudojama metakrilo rūgštis, kuri veikia kaip interferono induktorius.

Prailginto atpalaidavimo tabletės yra pavyzdys, kaip prailgintą poveikį užtikrina polimero matricos brinkimas ir erozija. Membranos sistemos gali būti pritaikytos vaisto stabilumui, skonio maskavimui, prailgintam atpalaidavimui. Žarnyne prailginto atpalaidavimo preparatai saugiai praeina skrandį ir atpalaiduoja vaistą aukštesnėje žarnyno pH aplinkoje [17].

1.2.2 Geliai

Tam tikri polimerai įdėti į vandens perteklių, gali greitai išbrinkti ir savo struktūroje sulaikyti didelius kiekius vandens, taip susidaro hidrogeliai. Dažniausiai hidrogeliai yra gaminami iš hidrofilinių polimerų, kurie yra susieti joninėmis, vandenilinėmis ar hidrofobinėmis sąveikomis. Hidrogeliai yra elastingi, net po ilgalaikio tempimo jie gali grįžti į savo pradinę struktūrą. Hidrogelis išsipučia, nes jo linijinis polimeras ištirpsta vandenyje, sudarydamas hidrosolį, kuris cheminiu požiūriu yra vandeninis polimero tirpalas.

Geliai, kurie yra susieti kovalentinėmis jungtimis, vadinami cheminiais geliais. Šie geliai netirpsta vandenyje ar kituose organiniuose tirpikliuose, nebent būtų nutraukti kovalentiniai ryšiai. Brinkimo procese yra svarbi temperatūra, daugelis cheminių gelių geriau brinksta šiltesniuose tirpaluose. Cheminiai geliai yra vadinami termoizoliaciniais.

Fizikiniai geliai yra sujungti vandeniliniais ryšiais ir yra kompleksiniai junginiai. Vandenilinės jungtys atsiranda tuomet, kai du elektroneigiami atomai sąveikauja su tuo pačiu vandenilio atomu. Cheminiai ir fizikiniai hidrogeliai reaguoja į aplinkos pokyčius, tokius kaip, pH, temperatūra, druskų koncentracija, slėgis. Būtent šios savybės yra idealios modifikuotoms vaistų pasiskirstymo sistemoms gaminti.[18]

Polimeriniai hidrogeliai yra plačiai naudojami daugelyje sričių, tokių kaip kontroliuojamas vaistų tiekimas, jutiklių sistemos ir kontaktiniai lęšiai. Buvo atlikta tyrimų, kuriais buvo siekiama išspręsti dar išliekančią problemą, susijusią su patikimų hidrogelių gavimu, tyrėjai išbandė daugybę metodų, įskaitant specialų komonomerų pridėjimą ir jų sudėties kitimą bei polimerizacijos sąlygų optimizavimą. Taigi, buvo atliktas išsamus tyrimas, kuriame mokslininkai bandė ištirti skirtingą monomerų sudėties hidrogelių brinkimą,

mechanines savybes bei termodinamines sąveikas, kurias atspindi polimero ir vandens sąveikos parametrai [42, 43]

1.2.3 Hipromeliozė

Hipromeliozė arba hidroksipropilmetilceliuliozė yra iki šiol labiausiai paplitęs celiuliozės esteris, naudojamas matricoms. Tai vandenyje tirpus hidrofilinis nejoninis celiuliozės esteris. Hipromeliozės atsparumas fermentams yra 3,0-11,0 pH diapazone. Hipromeliozė turi polimerinį celiuliozės pagrindą. Daugelis komercinių hipromeliozių yra identifikuojamos kodais, kuris yra susijęs su pakaito laipsniu. Hipromeliozės hidratacijai įtakos turi temperatūra, kuri daro didelę įtaką jos sudaromų gelių savybėms. Padidinus gelio temperatūrą, prarandamas drėkinamasis vanduo, o tai nulemia santykinio klampumo sumažėjimą.

Vaistuose su hipromelioze, pradinis matricos sąlytis su vandeniniais skysčiais yra pats svarbiausias laikas gelio struktūrai susiformuoti, tai yra apie 5 minutes. Po to, jei struktūra nesusiformavo, ji gali greitai suirti. Kai yra pasiekiamas tam tikras polimero lygis, poveikis tokioms savybėms kaip klampumas ar dalelių dydis nėra toks akivaizdus. Buvo ištirtas vaisto ir polimero santykis, nes jis daro didelę įtaką vaisto išskyrimo greičiui. Vaisto atpalaidavimas nukrypo nuo tiesiškumo po to, kai buvo atpalaiduota 70% vaisto. Atlikti tyrimai įrodė, jog polimero kiekis nėra svarbiausias veiksnys kontroliuojantis vaisto atpalaidavimo greitį. Hipromeliozės dalelių dydis daro didelį poveikį polimero hidratacijos greičiui ir vaidina svarbų vaidmenį mažinant vaisto išskyrimą iš hipromeliozės matricų.

Tirpumas vaistams yra labai svarbus veiksnys, kurį reikia atidžiai apsvarstyti kiekvienu konkrečiu atveju. Skirtingos vaisto savybės, tokios kaip didelis ar mažas tirpumas, turi įtakos gelio savybės ir vaisto atpalaidavimui iš vaisto formos. Tirpūs vaistai gali ištirpti difuzijos būdu per gelio matricas. Tačiau išskyrimas vyksta ir dėl gelio matricos erozijos. Teigiama, kad labai tirpūs vaistai taip pat veikia kaip porų formavimosi metu susidarančios mikro ertmės, todėl gelio struktūra tampa porėtesnė ir silpnesnė, todėl padidėja vaisto išskyrimo greitis. Prastai tirpstantys vaistai daugiausia yra išskiriami iš gelio matricos erozijos metu. Tačiau vaisto dalelių dydžio poveikis vaisto išskyrimui iš hipromeliozės matricų yra laikomas minimaliu ir pastebimas tik esant mažesniam hipromeliozės lygiui matricose. Kitas veiksnys, turintis įtakos vaistų išskyrimui greičiui iš hipromeliozės matricų, yra paviršiaus ploto ir tūrio santykis. Tablečių geometrija ir forma gali paveikti vaisto išskyrimą ir daugeliu atveju ryšys tarp

išskyrimo greičio ir paviršiaus ploto yra tiesinis. Vaisto išskyrimo greičiui taip pat įtakos turi hipromeliozės kiekis, pakaitai, klampumo laipsnis bei tabletės paviršiaus plotas.

Neorganinių druskų jonai, turintys didesnį afinitetą vandeniui, gali pašalinti hidratacijos vandenį iš polimero, taip dehidratuodami ir taip ,,išsūdydami“ polimerą. Esant silpniems jonams, gelis nepakinta, tačiau dėl vidutinio jonų stiprumo yra prarandamas gelio vientisumas ir gali būti pastebimas matricos suskaidymas. [19, 20]

HPMC hidratacijos greitis priklauso nuo šių grupių ir molekulinės struktūros. Tiksliau, HPMC hidratacijos greitis padidėja padidėjus hidroksipropilo grupių skaičiui. Tirpumas nepriklauso nuo pH [36]. HPMC gali būti lėtai ištirpinama šaltame vandenyje, kad susidarytų klampus tirpalas, bet blogai tirpsta karštame vandenyje. Be to, ji gali būti ištirpinama daugumoje polinių organinių tirpiklių arba naudojant tokius tirpiklių mišinius kaip chloroformas ir alkoholis [36]. Kadangi šis polimeras netirpsta gryname chloroforme, etanolyje arba eteryje dažnai rekomenduojama pirmiausia paruošti HPMC vandeninius tirpalus naudojant dalį karšto vandens (apie trečdalį viso vandens) [36]. Tačiau analitiniais tikslais kartais gali būti apribota galimybė naudoti aukštą temperatūrą ar specifinius su analite nesuderinamus tirpiklius. Lygiai kaip išorinės akredituotos laboratorijos, neturėdamos negali paprastai pakeisti preanalitinių mėginių ruošimo procedūrų, o dažnai net neturi ir net negali turėti išsamios informacijos apie visus mėginio ingredientus. Tokiu atveju gali būti taikomas tikslinis tirpiklis, parinktas remiantis literatūros žiniomis, sukaupta ,,know-how‘‘ arba eksperimentiškai tiriant galimas analičių ir HPMC bei potencialių lydinčių junginių sąveikas.

1.2.4 Chitozanas

Chitozanas yra svarbiausias chitino darinys, kuris yra gaunamas pašalinant acetato dalį iš chitino. Chitozano polimerinių grandinių sudėtis ir dydis skiriasi, priklausomai nuo jų kilmės ir chitino deacetilinimo metodo. Chitinas, išgaunamas iš natūralių šaltinių, yra sujungtas su baltymais ir mineralais, kurie prieš tai turi būti pašalinti chitozano paruošimui. Chitozanas palengvina tarpląstelinį vaistų pernešimą, didina vaisto skvarbumą. Galima sąveika su gleivėmis, susidaro kompleksas. Chitozano pagrindą galima modifikuoti, norint pakeisti tirpumą ar stabilumą. Chitozanas yra biologiškai suyrantis ir biologiškai skaidomas, todėl nustatyta, kad jį lėtai skaito lizocimo fermentai [21, 24].

Yra keli vaistų išskyrimo iš chitozano dalelių mechanizmai, tokie kaip: polimero brinkimas, absorbuoto vaisto difuzija, vaisto difuzija per polimero matricą, polimero erozija.

Difuzijos būdu atpalaiduojamas vaistas prasiskverbia pro polimerinės matricos vidų į jį supančią terpę. Polimerinės grandinės sudaro difuzijos barjerą, kuris apsunkina vaisto perėjimą, todėl šis barjeras yra kaip vaisto atpalaidavimo greitį ribojanti membrana. Difuzija taip pat gali būti susijusi su polimero brinkimu ar erozija.

Geriamųjų vaistų vartojimo būdas yra patogiausias dėl lengvo vartojimo, tačiau šis vartojimo būdas turi ir neigiamų savybių, kaip kintantis pH. Tam tikri junginiai, pavyzdžiui flavonoidai, turi daugybę naudingų poveikių, jie skaidosi žarnyno skystyje ir yra blogai absorbuojami per žarnyno membranas. Jų absorbciją žarnyne gali būti pagerinta, juos kapsuliuojant chitozano dalelėse [21, 22, 23].

Chitozanas naudojamas siekiant padidinti vaisto stabilumą, taip pat buvo atlikti tyrimai, kad chitozanas dėl savo katijoninio pobūdžio gali būti naudojamas kaip pralaidumą gerinanti medžiaga hidrofiliniams vaistams, kurie gali būti mažiau veiksmingi vartojant juos peroraliai. Ląstelių membranos ir teigiamos polimero sąveikos padidina absorbciją, o tai priklauso nuo pH ir koncentracijos. Be to, padidinus polimero įkrovos tankį, padidės pralaidumas [25].

1.2.5 Carbopol Ultrez 21

Produktai, priklausantys ,,Carbopol“ polimerų šeimai, yra chemiškai panašūs tuo, kad jie visi yra didelės molekulinės masės, kryžmiškai sujungti poliakrilo rūgšties polimerai, tačiau polimerai skiriasi pagal kryžminio jungimo tankį ir gali turėti skirtingas savybes. Laikui bėgant buvo atlikta daugybė šios šeimos polimerų patobulinimų, siekiant padidinti produkto tvirtumą. Buvo pakeista tirpiklių sistema, naudojama polimerų sintezėje, jie yra sintetinami benzene [26]. ,,Carbopol” gelių pranašumai lyginant su kitais geliais:

• gera alternatyva aliejaus pagrindu gaminamoms vaistų formoms; • padeda palaikyti norimą pH;

• didelis klampumas, esant mažai koncentracijai; • platus koncentracijos intervalas;

• puikios bioadhezinės savybės;

• geras suderinamumas su daugeliu veikliųjų medžiagų; • puikios juslinės savybės;

• geras priimtinumas pacientams; • geras šiluminis stabilumas [27].

,,Carbopol“ geliai pasižymi pseudoplastinėmis savybėmis. Polimero grandinės segmentai deformuojasi ir prisitaiko prie srauto krypties. Gelių pseudoplastitnės savybės gali būti paaiškinto tirpiklio – tirpiklio ir tirpiklio – polimero sąveika ir didesniu glicerolio, kaip bendro tirpiklio, klampumu. Šių gelių klampumas bei pH padidėja pridėjus glicerolio.

1.3 Flavonoidų ir polimerų tarpusavio sąveikos

Sąveikos gali būti pageidaujamos bei nepageidaujamos. Sąveikos gali atsirasti tarp veikliųjų medžiagų, tuomet gali atsirasti naujas vaisto poveikis, kuris gali būti naudingas arba nenaudingas. Taip pat sąveikos gali atsirasti tarp veikliųjų medžiagų ir pagalbinių, pavyzdžiui, augliniame preparate esančių flavonoidų ir pagalbinių medžiagų polimerų. Tai gali daryti įtaką vaisto suirimą, poveikio stiprumą, trukmę efektyvumą bei nepageidaujamas reakcijas.

Dalis flavonoidų yra skaidomi žarnyne ir absorbuojami žarnyne. Jų absorbcija gali būti pagerinta juos kapsuliuojant chitozano nanodalelėse [21]. Įtraukus hipromeliozę ir ,,Carbopol“, atsiranda sąveika tarp dviejų skirtingų polimerų, kuri lemia stabilų vaisto išskyrimą ir galimybę sumažinti matricos tablečių dydį ir svorį, jei jos vartojamos nepriklausomai viena nuo kitos. Tačiau dažnai du polimerai gali turėti neigiamas sąveikas, vaisto forma greitai suyra ir lėčiau susidaro polimerų geliai, todėl veikliosios medžiagos poveikis gali būti mažiau efektyvus [20].

Buvo atliktas molekulinio prijungimo tyrimas (Molecular docking), kurio metu buvo bandoma nustatyti sąveikas tarp chitozano ir flavonoidų. Molekulinio prijungimo tyrimas gali būti naudojamas ligandų sąveikoms su polimerais nustatyti, taip pat šis tyrimas yra pagrindinė priemonė siekiant koreguoti ligandų išsidėstymą baltyme. Remiantis chitozano savybėmis ir biologinėmis flavonoidų savybėmis buvo siekiama ištirti flavonoidų (kvercetino, kvercitrino, rutino, armetino) sąveiką su polimeru, siekiant patvirtinti literatūroje plačiai aprašytus eksperimentinius duomenis. Rezultatai parodė, kad flavonoidai, kvercetinas, kvercitrinas ir armetinas stipriausiai sąveikavo su chitozanu. Kvercetinas buvo flavonoidas, kuris sąveikavo stabiliau nei kiti, kai energijos sąnaudos buvo -3,61 kcal / mol. Rutinas buvo vienintelis flavonoidas, kuris silpnai sąveikavo su chitozanu, nes jo surišimo energija buvo 0,49 kcal / mol. Pastebėta, kad rutino sąveika su chitozanu sutrinka dėl jo aukšto sukimo laipsnio. Be Van Der Waals sąveikos, suformuotos tarp flavonoidų žiedų grupių ir chitozano žiedų grupių, taip pat tarp polinių flavonoidų grupių ir polinių chitozano grupių yra suformuoti keli vandeniliniai ryšiai. Pastebėta, kad šiame tyrime naudoti flavonoidai gerai sąveikavo su chitozanu [34].

2 lentelė: Vertės, gautos atliekant molekulinį prijungimą

Kompleksas Laisvo energijos prijungimas (kcal/mol) Elektrostatinės sąveikos energija (kcal/mol)

Van der Waals sąveika ir vandenilio prisijungimo energija (kcal/mol) Sukimo energija (kcal/mol Chitozanas + kvercetinas -3,61 -0,34 -5,05 1,79 Chitozanas + kvercitrinas -2,25 -0,31 -4,92 2,98 Chitozanas + rutinas 0,49 -0,42 -3,86 4,77 Chitozanas + armetinas -2,52 -0,34 -4,27 2,09

Kvercetinas turi nemažai biologinių efektų, kurie yra laikomi naudingi sveikatai, įskaitant antioksidacinį, priešvėžinį ir antivirusinį poveikį. Tačiau kvercetinas mažai tirpsta vandenyje, todėl geriant jį, jo absorbcija yra ribota. Be to, tirpumas ir tirpumo greitis yra du lemiami veiksniai absorbcijos procese. Peroraliai vartojamo mažo tirpumo aktyviojo farmacinio ingrediento biologinis prieinamumas priklauso nuo vaisto formos tirpimo greičio. Todėl buvo skirta daug dėmesio, norint pagerinti vaistinių medžiagų tirpumą ir ištirpimo greitį, būtent, modifikuojant ingrediento fizines savybes, pridedant tirpumą gerinančią medžiagą, formuojant naujus junginius ir kietosios dispersijos sistemą. Be to, kieta dispersijos sistema yra vienalytis vieno ar kelių veikliųjų medžiagų mišinys, inertiškoje matricoje, siekiant pagerinti prastai tirpių vaistinių medžiagų biologinį prieinamumą vartojant juos per burną. Sistema vykdoma tirpinant ir derinant tirpinimo ir ištirpinimo būdus. Lydymosi sukelta dispersija dažniau vadinama lydalu. Atliktas tyrimas parodė, kad vandenyje tirpus nešiklis greitai atpalaiduoja vaistinę medžiagą iš nešiklio [44, 45].

Hidroksipropilmetilceliuliozė, celiuliozės darinys, galintis pagerinti kristalinio vaisto tirpumą. HMPC pasižymi dideliu gebėjimu sudaryti kietą tirpalą su blogai vandenyje tirpiais vaistais. Yra manoma, kad kieta dispersijos sistema, sudaryta iš kvercetino ir

hidroksipropilmetilceliuliozės, gali padidinti kvercetino tirpumą ir ištirpimo greitį. Taigi, šis tyrimas sutelkė dėmesį į kvercetino – hidroksipropilmetilceliuliozės kietosios dispersijos sistemos formavimąsi, siekiant pagerinti kvercetino tirpumą ir biologinį prieinamumą [46]

Buvo atlikti kvercetino tirpumo testai, terminė analizė, infraraudonųjų spindulių spektroskopija, kurių metu buvo nustatyta, jog terpėje ištirpusio kvercetino procentas, naudojant kietąją dispersijos sistemą, padidėjo, pridedant HPMC. Kvercetino ir HPMC santykiu 1:3 parodė aukščiausią kvercetino tirpumą. Šis padidėjimas gali atsirasti dėl kvercetino molekulinės dispersijos arba mikrostruktūrinės dispersijos susidarymo hidrofilinėje matricoje. Micelinės struktūros susidarymas su terpe taip pat gali padidinti kvercetino tirpumą. Micelinės struktūros formavimasi demonstruoja ir kiti vandenyje tirpūs polimerai. Šis tyrimas rodo, jog kvercetinas ir hidroksipropilmetilceliuliozė pasižymi amorfinėmis formomis dėl kristališkumo sumažėjimo, lyginant su grynu kvercetinu, dėl to padidėja tirpumas ir ištirpimo greitis. Šie atradimai gali padėti pagerinti kvercetino biologinį prieinamumą, norint pagerinti vaistų veiksmingumą. [39]

1.4 Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Taigi, biologiškai aktyvūs junginiai, kaupiami įvairiose augalo dalyse, nulemia vaistinių augalų gydomąsias savybes. Vaistiniai augalai gali kaupti: alkaloidus, antracenus, eterinius aliejus, flavonoidus, fosfolipidus, kartumynus, taninus. Vaistinių augalų fitoterapinis aktyvumas priklauso nuo to, kokį kiekį ir kokias biologiškai aktyvias medžiagas jis kaupia. Vieni iš aktyviausių augalų komponentų yra flavonoidai, jie yra laikomi nepakeičiamu medicinos, farmacijos, kosmetikos, mitybos komponentu. Taip yra dėl flavonoidų antioksidacinių, priešuždegiminių, antimutageninių bei antikancerogeninių savybių. Augalams flavonoidai yra reikalingi augimui bei apsaugai, beveik visos flavonoidų grupės gali veikti kaip antioksidantai. Rutinas – flavonolių grupės glikozidas. Aukštesniuose augaluose jis yra sintetinamas kaip apsauga nuo UV spindulių. Kvercetinas - priklauso flavonolių grupei. Po absorbcijos kvercetinas metabolizuojamas žarnyne ir kepenyse. Teigiama, kad kvercetinas yra vienas iš plačiausiai naudojamų bioflavonoidų metabolinių ir uždegiminių sutrikimų gydymui. Kvercitrinas – glikozilintos formos flavonoidas. Kvercitrinas vaistų formose yra naudojamas inkstų akmenų gydymui bei prevencijai.

produktus. Jų taikymo sritis apima nuo medžiagų pakavimo iki vaistų sudedamųjų dalių. Farmacijoje naudojami polimerai yra plačiai naudojami produktų skoniui maskuoti, kontroliuoti veikliųjų medžiagų atpalaidavimą, padidinti stabilumą ar pagerinti biologinį prieinamumą. Polimerų savybės priklauso nuo molekulinės struktūros, atomų ir grupių išsidėstymo molekulėse. Chitozanas palengvina tarpląstelinį vaistų pernešimą, didina vaisto skvarbumą. Galima sąveika su gleivėmis, susidaro kompleksas. Hipromeliozė turi polimerinį celiuliozės pagrindą. Daugelis komercinių hipromeliozių yra identifikuojamos kodais, kuris yra susijęs su pakaito laipsniu. Hipromeliozės hidratacijai įtakos turi temperatūra, kuri daro didelę įtaką jos sudaromų gelių savybėms. ,,Carbopol“ geliai pasižymi pseudoplastinėmis savybėmis. Polimero grandinės segmentai deformuojasi ir prisitaiko prie srauto krypties.

Dažniausiai hidrogeliai yra gaminami iš hidrofilinių polimerų, kurie yra susieti joninėmis, vandenilinėmis ar hidrofobinėmis sąveikomis. Hidrogeliai yra elastingi, net po ilgalaikio tempimo jie gali grįžti į savo pradinę struktūrą. Hidrogelis išbrinksta, nes jo linijinis polimeras ištirpsta vandenyje, sudarydamas hidrosolį, kuris cheminiu požiūriu yra vandeninis polimero tirpalas.

2. TYRIMO METODIKA

2.1.Tyrimo organizavimas ir planavimas

Siekiant organizuoti tyrimą buvo analizuojama literatūra ir susijusios mokslinės publikacijos apie aktyvius vaistinių augalų komponentus, jų gamybai naudojamas polimerines medžiagas bei galimas aktyvių ir pagalbinių medžiagų tarpusavio sąveikas. Prieš pradedant tyrimą, buvo sudarytas darbo planas, iškeltas tyrimo tikslas, numatyti uždaviniai bei pasirinkti tyrimo atlikimo metodai.

2.2.Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – fitofarmaciniuose preparatuose sutinkami flavonoidai: rutinas, kvercetinas, kvercitrinas, kurie buvo tirti išgrynintų etaloninių junginių formoje ir buvo įsigyti iš „Sigma – Aldrich“ (Buchsas, Šveicarija). Tiriamieji tirpalai – flavonoidų bei polimerinių pagalbinių medžiagų, hidroksipropilmetilceliuliozės, chitozano bei Ultrez 21 tirpalai.

2.3.Naudotos medžiagos ir regentai

• Išgrynintas vanduo, ruoštas laboratorijoje distiliavimo būdu.

• Dejonizuotas vanduo, ruoštas laboratorijoje iš išgryninto vandens filtravimo būdu naudojant Milli – Q („Millipore“, Bedforfas, JAV) vandens gryninimo sistemą.

• 96 proc. (v/v) etanolis, įsigytas iš „Vilniaus degtinė“ (Vilnius, Lietuva).

• Trifluoracto rūgštis (99,8 proc.) ir acetonitrilas (99,9 proc.) įsigyti iš „Sigma – Aldrich“ (Buchsas, Šveicarija).

• Hidroksipropilmetilceliuliozė (Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija).

• Vidutinės molekulinės masės polimeras chitozanas (Sigma Aldrich, Vokietija). • Carbopol Ultrez 21 (Lubrizol, JAV).

2.4. Naudoti aparatai

Flavonoidų bei polimerų svėrimui buvo panaudotos analitinės svarstyklės („Sartorius CP64 – OCE“, Getingenas, Vokietija). Siekiant atskirti neištirpusį polimerą nuo skystos tirpalo fazės, buvo naudojami 2 ml. talpos centrifūginiai mėgintuvėliai ir centrifuga, SIGMA3-18KS (Vokietija). Norint tiksliai paimti flavonoido tirpalus buvo naudojamos automatinės pipetės (Ependorf, Didžioji Britanija). Flavonoidų koncentracijos pokyčio polimerinių medžiagų poveikyje vertinimui buvo naudota ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodika (žr. 2,6,) ir chromatografinė sistema Waters ACQUITY (Milford, JAV).

2.5. Tiriamųjų tirpalų ruošimas

Flavonoidų tirpaluose buvo tirpinamos polimerinės medžiagos: hidroksipropilmetilceliuliozė, chitozanas, Ultrez 21. Gaminant tiriamąjį flavonoido tirpalą buvo paimta po 2 ml anksčiau paruošto kontrolinio rutino, kvercitrino ar kvercetino tirpalo, ištirpinto 70% v/v etanolio-vandens mišinyje, kuriame buvo 20 mikrogramų flavonoido. Prie 2 ml flavonoido tirpalo buvo pridėta 50 mikrogramų polimerinės medžiagos. Tirpalai buvo laikomi 15 min. bei 60 min. kambario temperatūroje. Praėjus numatytam laikotarpiui, atitinkamai po 15 min. bei 60 min., tirpalai buvo centrifuguoti 8500 apsisukimų per minutę greičiu, centrifuguota buvo 12 minučių, 3°C temperatūroje. Centrifūguoti tirpalai buvo dekantuoti į chromatografinius buteliukus, kurie patalpinti į chromatografą ir tirti UESC metodu. Tiriamieji tirpalai po paruošimo laikyti šaldytuve 4°C aplinkos temperatūroje ne ilgiau 24 h; tyrimo metu tiek tiriamieji, tiek kontroliniai mėginiai termostatuoti chromatografe 4°C aplinkos temperatūroje.

2.6. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodika.

Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu buvo atliekamas flavonoidų tirpalų koncenctracijos pokyčio stebėjimas. Flavonoidų nustatymui panaudotas skysčių chromatografas „Waters ACQUITY H-class UPLC“ su diodų matricos detektoriumi „ACQUITY UPLC eLambda 800 nm“, chromatografinė kolonėlė „ACQUITY UPLC BEH C18” 2,1x50mm (Waters), kurios sorbento dalelių dydis - 1,7 µm, o aplinkos temperatūra -

30°C. Injekcijos tūris - 1 μl. Chromatografiniam skirstymui buvo naudotas 0,1 % trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas (eliuentas A) ir acetonitrilas (eliuentas B). Gradiento tirpalų srauto debitas - 0,6 ml/min. Gradientinis tirpalų sudėties kitimas pateiktas lentelėje.

Laikas (min) A (%) B (%) 0,00 80 20 0,05 80 20 0,50 40 60 0,70 20 80 0,90 80 20 2,50 80 20

Analičių kiekybiniam įvertinimui eliuato tirpale spektrofotometriniu būdu naudota 360,0±1,2 nm UV absorbcijos sritis, detektoriaus dažnis 80 taškų per sekundę. Rutino analitės sulaikymo trukmė siekė vidutiniškai 0,52 min, kvercitrino - 0,63 min, kvercetino - 1,00 min. Kaip kiekybinis rodiklis buvo vertintas analičių smailių plotas. Duomenų apdorojimui ir statistinių rodiklių įvertinimui taikyta programinė įranga ,,Empower 3” (Waters). Tirpalo chromatografiniai tyrimai kartoti 3-5 kartus.

2.7. Statistinė analizė

Gauti rezultatai apdoroti naudojant programinę įrangą ,,Empower 3” (Waters) bei „Microsoft Office Excel“ (Microsoft) kompiuterinę programą. Apskaičiuotas duomenų vidurkis, standartinis nuokrypis ir variacijos koeficientas. Tyrimo rezultatų įvertinimui ir analizei panaudotas aprašomasis ir grafinis metodai, taikytas Stjudento analizės metodas. Duomenims patikrinti taikytas statistinio reikšmingumo lygmuo p, kai p<0,05 rodiklių skirtumai laikyti statistiškai reikšmingais.

3. REZULTATAI

3.1 Atliktas tyrimas

Atliktas polimerinių medžiagų: hidroksiporpilmetilceliuliozės, chitozano, Ultrez 21 ir flavonoidų: kvercetino, rutino bei kvercitrino, tirpalų tarpusavio sąveikos tyrimas parodė, jog tarp tirtų polimerinių medžiagų ir flavonoidų tirpalų vyksta įvairios analitiškai reikšmingos tarpmolekulinės sąveikos.

3.2. Kvercetino tirpalo koncentracijos kitimas

hidroksipropilmetilceliuliozės poveikyje

Tiriamojo hidroksipropilmetilceliuliozės ir kvercetino tirpalo gamyba:

Paimta 2 ml. kontrolinio kvercetino tirpalo, kuriame yra 20 mikrogramų kvercetino, ir sumaišyta su 50 mg. hidroksipropilmetilceliuliozės. Buvo pagaminti 6 tiriamieji tirpalai. Trys iš šių tirpalų buvo laikyti 15 min. kambario temperatūroje, kiti trys mėginiai laikyti 60 min. taip pat kambario temperatūroje. Praėjus numatytam laikotarpiui, atitinkamai po 15 min. bei 60 min., tirpalai buvo centrifuguoti 8500 apsisukimų per minutę greičiu, centrifuguota buvo 12 minučių, 3°C temperatūroje. Tuomet išcentrifuguotas tirpalas buvo perkeltas į chromatografinius buteliukus, kurie patalpinti į chromatografą ir tirti UESC metodu.

1 pav. Kvercetino tirpalo koncentracijos kitimas hidroksipropilmetilceliuliozės poveikyje po 15 ir 60 min.

Kvercetino koncentracijos lygio kitimas skirtingą periodą išlaikant po HPMC pridėjimo atskleistas 1 paveiksle pateiktoje diagramoje. Diagramoje pateikti rezultatai išreikšti kvercetino koncentracijos atkuriamumo dydžiais, išreikštais kontrolinio kvercetino tirpalo (tirpiklis – vandens ir etanolio mišinys) koncentracijos procentiniais ekvivalentais, nustatomais tiriamojo kvercetino tirpalo smailės ploto santykį su kontrolinio tirpalo kvercetino smailės plotu padauginus iš šimto procentų. Tyrimui naudotas kvercetino tirpalas, kurio koncentracija buvo 10 μg/ml. Gautas vidurkis yra 83%, standartinis nuokrypis 0,132.

Remiantis gautais rezultatais, nustatyta, jog lyginant su kontroliniu kvercetino tirpalu, didžiausi neigiami kvercetino koncentracijos pokyčiai pasireiškia tiriamuosiuose, kurie buvo laikyti 15 min. kambario temperatūroje. Viename iš 15 min. laikytų mėginių nustatyta kvercetino koncentracija buvo net 42% mažesnė lyginant su kontroliniu tirpalu. Kituose tirpaluose, kurie buvo laikyti 15 min., kvercetino koncentracijos mažėjimas varijuoja nuo 13,4% iki 20,2%. Tokie rezultatai gali būti paaiškinami stipria ir greita kvercetino ir HPMC polimero tarmolekuline sąveika etanolio – vandens mišinio aplinkoje. Tokia sąveika ir jos tikėtinas mechanizmas mokslinės literatūros šaltiniuose dar neaprašytas. Pažymėtina, kad buvo skelbta mokslinių rezultatų apie kvercetino atsipalaidavimo į parūgštintą vandeninę terpę

100% 86,60% 58,40% 79,80% 85,70% 91,50% 95,90% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%

Kontrolė 15min. Nr.1 15min. Nr.2 15min. Nr.3 60min.Nr. 1 60min. Nr.2 60min. Nr.3

Ko nc en tr ac ija % Mėginiai

padidėjimas naudojant HPMC [39]. Vertinant mūsų gautų ir Dwi Setyawan su kolegomis (2017) skelbtų tyrimų skirtumus galima suformuoti hipotezę, kad greitos kvercetino sąveikos su HPMC pobūdi priklauso nuo aplinkos (tirpiklio ir, galimai, pH). Tačiau nepriklausomai nuo taikomos terpės aptikta sąveika yra ypatingai svarbus kritinis veiksnys vystant preanalitines sąlygas įvairių farmacinių formų su kvercetinu ir HPMC. Galima analitės ir polimero sąveika turi būti įvertinta ir plėtojant akredituotus tokių medžiagų tyrimus.

Kvercetino koncentracija tirpaluose, kurie buvo laikyti 60 min., buvo reikšmingai didesnė nei 15 min. laikytuose mėginiuose, tačiau koncentracija vis tiek išliko mažesnė nei kontrolinio tirpalo. Didžiausias koncentracijos sumažėjimas buvo 14,3%, lyginant su kontroliniu tirpalu. Likusiuose tirpaluose kvercetino koncentracijos sumažėjimas svyravo nuo 4,1% iki 8,5%. Koncentracijos didėjimas ilgiau laikytuose tirpaluose gali būti nulemtas tų pačių veiksnių, kuriuos aptiko Dwi Setyawan su kolegomis (2017), kurie aptiko kvercetino koncentracijos didėjimu mišiniuose su HPMC 15-30 min. laikotarpyje [39]. Atsižvelgiant į koncentracijos didėjimą ilgesnio laikotarpio metu, tikslinga tirti mėginio laikymo ilgesnius periodus. Taip pat yra tikslinga ištirti tikrą modelinę kietos vaisto formos sistemą, kurioje tiek kvercetinas, tiek HPMC būtų drėkinami ir tirpinami vienu metu.

Taigi, atsižvelgiant į paveiksle 1 pateiktus duomenis, galima daryti išvadą, kad tarp flavonoido kvercetino ir polimero hidroksipropilmetilceliuliozės vyksta analitiškai reikšmingos tarpmolekulinės sąveikos, kurios ypač ryškiai yra pastebimos trumpalaikio poveikio mėginiuose, kurie buvo laikyti 15 minučių periodą.

Remiantis gautais rezultatais, lyginant su kontroliniu kvercetino tirpalu, didžiausi kvercetino koncentracijos pokyčiai yra pastebimi analitiniuose mėginiuose, kurie buvo laikyti 15min. kambario temperatūroje, viename iš šių mėginių, kvercetino koncentracija tirpale sumažėjo net 42% lyginant su kontroliniu tirpalu. Kituose tirpaluose, kurie buvo laikyti 15min., kvercetino koncentracijos sumažėjimas svyruoja nuo 13,4% iki 20,2%.

Kvercetino koncentracija mėginiuose, kurie buvo laikyti kambario temperatūroje 60 min., reikšmingai nesumažėjo, didžiausias koncentracijos sumažėjimas buvo 14.3%, lyginant su kontroliniu tirpalu. Likusiuose 60 min. tirpaluose kvercetino koncentracijos sumažėjimas svyruoja nuo 4,1% iki 8,5%.

Taigi, atsižvelgiant į 1 pav. pateiktus duomenis, galima daryti išvadą, kad tarp flavonoido kvercetino ir polimero hidroksipropilmetilceliuliozės atsiranda sąveikos su polimerais, kurios ypač ryškiai yra pastebima mėginiuose, kurie buvo laikyti 15 minučių.

Tačiau, atsižvelgiant į gautus rezultatus, sąveikos tarp flavonoido ir polimero yra grįžtamo pobūdžio, kadangi mėginiuose, kurie buvo laikyti 60 minučių aptikta didesnė kvercetino koncentracija tirpale.

3.3. Kvercetino tirpalo koncentracijos kitimas chitozano poveikyje

Paimta 2 ml. kontrolinio kvercetino tirpalo, kuriame yra 20 mikrogramų kvercetino, ir sumaišyta su 50 mg. chitozano. Buvo pagaminti 6 tiriamieji tirpalai. Trys iš šių tirpalų buvo laikyti 15 min. kambario temperatūroje, kiti trys mėginiai laikyti 60 min. taip pat kambario temperatūroje. Praėjus numatytam laikotarpiui, atitinkamai po 15 min. bei 60 min., tirpalai buvo centrifuguoti 8500 apsisukimų per minutę greičiu, centrifuguota buvo 12 minučių, 3°C temperatūroje. Tuomet išcentrifuguotas tirpalas buvo perkeltas į chromatografinius buteliukus, kurie patalpinti į chromatografą ir tirti UESC metodu.

2 pav. Kvercetino tirpalo koncentracijos kitimas chitozano poveikyje po 15 ir 60 min.

100% 52,30% 55,20% 65,20% 38,40% 13,70% 30,90% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%

Kontrolė 15min. Nr.1 15min. Nr.2 15min. Nr.3 60min.Nr. 1 60min. Nr.2 60min. Nr.3

Ko nc en tr ac ija % Mėginiai

Kvercetino koncentracijos lygio kitimas skirtingą periodą išlaikant po chitozano pridėjimo atskleistas 2 paveiksle pateiktoje diagramoje. Diagramoje pateikti rezultatai išreikšti kvercertino koncentracijos atkuriamumo dydžiais, išreikštais kontrolinio kvercetino tirpalo (tirpiklis – vandens ir etanolio mišinys) koncentracijos procentiniais ekvivalentais, nustatomais tiriamojo kvercetino tirpalo smailės ploto santykį su kontrolinio tirpalo kvercetino smailės plotu padauginus iš šimto. Tyrimui naudotas kvercetino tirpalas, kurio koncentracija buvo 10 μg/ml. Gautas vidurkis yra 42,62%, standartinis nuokrypis 0,18.

Chitozanas naudojamas siekiant padidinti vaisto stabilumą, taip pat buvo atlikti tyrimai, kad chitozanas dėl savo katijoninio pobūdžio gali būti naudojamas kaip pralaidumą gerinanti medžiaga hidrofiliniams vaistams, kurie gali būti mažiau veiksmingi vartojant juos peroraliai. Ląstelių membranos ir teigiamos polimero sąveikos padidina absorbciją, o tai priklauso nuo pH ir koncentracijos. Be to, padidinus polimero įkrovos tankį, padidės pralaidumas [25].

Remiantis gautais rezultatais, nustatyta, jog lyginant su kontroliniu kvercetino tirpalu, didžiausi neigiami kvercetino koncentracijos pokyčiai pasireiškia tiriamuosiuose, kurie buvo laikyti 60 min. kambario temperatūroje. Viename iš 60 min. laikytų mėginių nustatyta kvercetino koncentracija buvo net 86,3% mažesnė lyginant su kontroliniu tirpalu. Kituose tirpaluose, kurie buvo laikyti 60 min., kvercetino koncentracijos mažėjimas varijuoja nuo 61,6% iki 69,1%.

Tokie rezultatai gali būti paaiškinami stipria ir greita kvercetino ir chitozano polimero tarpmolekuline sąveika etanolio – vandens mišinio aplinkoje. Pažymėtina, kad buvo skelbta mokslinių rezultatų apie chitozano ir kvercetino sąveiką, atliekant molekulinio prijungimo tyrimą ir gauti rezultatai įrodė, jog chitozanas stabiliausiai reaguoja su kvercetinu. Vertinant mūsų gautų ir San Ignacio Universiteto mokslininkų (2017) skelbtų tyrimų skirtumus galima suformuoti hipotezę, kad greitos kvercetino sąveikos su chitozanu pobūdi priklauso nuo aplinkos [34]. Nors palyginti tyrimai ne visiškai atitinka, tačiau abu tyrimai atitinka tą pačią tendenciją ir problematiką. Tačiau nepriklausomai nuo taikomos terpės aptikta sąveika yra ypatingai svarbus kritinis veiksnys vystant preanalitines sąlygas įvairių farmacinių formų su kvercetinu ir chitozanu tyrumui. Galima analitės ir polimero sąveika turi būti įvertinta ir plėtojant akredituotus tokių medžiagų tyrimus. Kvercetino koncentracija tirpaluose, kurie buvo laikyti 15 min., buvo reikšmingai didesnė nei 60 min. laikytuose mėginiuose, tačiau koncentracija išliko mažesnė nei kontrolinio tirpalo. Didžiausias koncentracijos sumažėjimas buvo 47,8%, lyginant su kontroliniu tirpalu. Likusiuose tirpaluose kvercetino koncentracijos

sumažėjimas svyravo nuo 34,8% iki 44,8%. Taigi, atsižvelgiant į 2 pav. pateiktus duomenis, galima daryti išvadą, kad tarp falvonoido kvercetino ir polimero chitozano vyksta analitiškai reikšmingos tarpmolekulinės sąveikos, kurios ypatingai ryškiai yra pastebimos ilgalaikio poveikio mėginiuose, kurie buvo laikyti 60 minučių periodą.

Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, jog lyginant su kontroliniu kvercetino tirpalu, didžiausi kvercetino koncentracijos pokyčiai yra pastebimi analitiniuose mėginiuose, kurie buvo laikyti 60 min. kambario temperatūroje, viename iš šių mėginių sumažėjo net 86,3% lyginant su kontroliniu tirpalu. Kituose tirpaluose, kurie buvo laikyti 60 min., kvercetino koncentracijos sumažėjimas svyruoja nuo 61,6% iki 69,1%. Kvercetino koncentracija mėginiuose kurie buvo laikyti kambario temperatūroje 15 min., taip pat reikšmingai sumažėjo, didžiausias koncentracijos sumažėjimas buvo 47,8%, lyginant su kontroliniu tirpalu. Likusiuose tirpaluose kvercetino koncentracijos sumažėjimas svyravo nuo 34,8% iki 44,8%.

Taigi, atsižvelgiant į 2. pav. Pateiktus duomenis, galima daryti išvadą, kad tarp flavonoido kvercetino ir polimero chitozano atsiranda sąveikos, kurios ypač ryškiai pastebimos mėginiuose, kurie buvo laikyti 60 minučių. Tačiau, atsižvelgiant į rezultatus, sąveikos tarp flavonoido ir polimero yra stiprios, kadangi mėginiuose, tiek laikytų 15 min., tiek laikytų 60 min., yra pastebima daug šių sąveikų, remiantis žymiai mažesne kvercetino koncentracija tirpale. Taigi, daugiau sąveikų susidarys, juos laikant ilgesnį laiką, nei trumpesnį laiko tarpą.

3.4. Kvercetino tirpalo koncentracijos kitimas Ultrez 21 poveikyje

Paimta 2 ml. kontrolinio kvercetino tirpalo, kuriame yra 20 mikrogramų kvercetino, ir sumaišyta su 50 mg. Ultrez 21. Buvo pagaminti 6 tiriamieji tirpalai. Trys iš šių tirpalų buvo laikyti 15 min. kambario temperatūroje, kiti trys mėginiai laikyti 60 min. taip pat kambario temperatūroje. Praėjus numatytam laikotarpiui, atitinkamai po 15 min. bei 60 min., tirpalai buvo centrifuguoti 8500 apsisukimų per minutę greičiu, centrifuguota buvo 12 minučių, 3°C temperatūroje. Tuomet išcentrifuguotas tirpalas buvo perkeltas į chromatografinius buteliukus, kurie patalpinti į chromatografą ir tirti UESC metodu.

3 pav. Kvercetino tirpalo koncentracijos kitimas Ultrez 21 poveikyje po 15 ir 60 min.

Flavonoido kvercetino koncentracijos kitimas po polimero Ultrez 21 pridėjimo atskleistas 3 paveiksle pateiktoje diagramoje. Diagramoje pateikti rezultatai išreikšti kvercertino koncentracijos atkuriamumo dydžiais, išreikštais kontrolinio kvercetino tirpalo (tirpiklis – vandens ir etanolio mišinys) koncentracijos procentiniais ekvivalentais, nustatomais tiriamojo kvercetino tirpalo smailės ploto santykį su kontrolinio tirpalo kvercetino smailės plotu padauginus iš šimto. Tyrimui naudotas kvercetino tirpalas, kurio koncentracija buvo 10 μg/ml. Gautas vidurkis yra 116,57%, standartinis nuokrypis 0,02.

Remiantis gautais rezultatais, nustatyta, jog lyginant su kontroliniu tirpalu, kvercetino koncentracijos pokyčiai pasireiškia visuose tiriamuosiuose, kurie buvo laikyti 15 min. kambario temperatūroje bei 60 min. Visuose mėginiuose buvo pastebėtas kvercetino koncentracijos padidėjimas, kuris didžiausias užfiksuotas mėginyje, kuris buvo laikytas 60 min. ir tai buvo net 19,4% daugiau, lyginant su kontroliniu kvercetino tirpalu.

Dėl didėjančios kvercetino koncentracijos, galime teigti, kad vyksta polimero brinkimas, sugeriant vieną iš tirpiklio komponentų, ar net patį tirpiklį. Brinkimas yra susijęs su dimencine amplifikacija, kai dalelės didėja visomis kryptimis, stumdamos gretimus komponentus. Buvo nustatyta koreliacija tarp dezintegracijos jėgos kitimo greičio ir dezintegracijos laiko. Šio proceso metu dalelės deformuojasi ir dalijasi, tuo tarpu tarpląsteliniai

100% 116,70% _{114,80% 113,80%} 117,40% 119,40% 117,30% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%

Kontrolė 15min. Nr.1 15min. Nr.2 15min. Nr.3 60min.Nr. 1 60min. Nr.2 60min. Nr.3

Ko nc en tr ac ija % Mėginiai

ryšiai yra sutrikdomi. Atsistatymas yra grįžtamasis viskoelastinis deformacijos procesas. Remiantis šia teorija, suspausti dezintegrantai, kurie liečiasi su vandenine terpe, įvyksta mechaninė dezintegrantų polimerų grandinių aktivacija, kuri padeda iš dalies atgauti pradinę formą [35].

Taigi, toks koncentracijos pokytis yra labai svarbus analitiniu požiūriu. Vystant ir taikant kokybės užtikrinimo bei kontrolės metodologijas tiek vidinėms, tiek išorinėms laboratorijoms yra būtina tokio reiškinio pasireiškimo galimybę įvertinti rengiant preanalitines procedūras. Analitinio mėginio ruošimo metu nėra tikslinga ekstrakcinį tirpinimą vykdyti matavimo induose ar ekstrakcijai taikyti tikslų tūrį tirpiklio, vėiau nepamatuojant gauto tirpalo tūrio. Būtina tirpinimo procedūrą vykdyti taip, kad galutiniame analitinio mėginio ruošimo žingsnyje gautas tirpalo tūris būtų įvertintas volumetriškai : jei reikia, tūris privedamas prie pastovaus reikalingo, arba tūrio pokytis įvertinamas vykdant apskaičiavimus.

Remiantis gautais rezultatais, galiu teigti, jog lyginant su kontroliniu kvercetino tirpalu, didžiausi kvercetino koncentracijos pokyčiai yra pastebimi analitiniuose mėginiuose, kurie buvo laikyti 60 min. kambario temperatūroje, viename iš šių mėginių, kvercetino koncentracija tirpale padidėjo 19,4% lyginant su kontroliniu tirpalu. Kituose tirpaluose, kurie buvo laikyti 60 min., kvercetino koncentracijos padidėjimas svyruoja nuo 17,3% iki 17,4%.

Kvercetino koncentracija mėginiuose, kurie buvo laikyti kambario temperatūroje 15 min., taip pat padidėjo, tačiau mažiau, lyginant su 60 min. bandiniais, didžiausias koncentracijos padidėjimas buvo 16,7%, lyginant su kontroliniu tirpalu. Likusiuose 15 min. tirpaluose kvercetino koncentracijos padidėjimas svyruoja nuo 13,8% iki 14,8%.

Taigi, atsižvelgiant į 3 pav. pateiktus duomenis, galima daryti išvadą, kad tarp flavonoido kvercetino ir polimero chitozano atsiranda sąveikos, kurios ypač ryškiai pastebimos visuose mėginiuose. Tačiau, atsižvelgiant į rezultatus, sąveikos tarp flavonoido ir polimero yra labai svarbios, nes atsiranda kvercetino tirpalo koncentracijos padidėjimas, todėl reikia atkreipti dėmesį į šio reiškinio svarbą biologiniam pasisavinimui. Gauti duomenys leidžia daryti prielaidą, kad kartu su kietos vaisto formos preparatu suvartoto skysčio tūris gali būti svarbus veiksnys biologiniam įsisavinimui ir galbūt net bioekvivalentiškumo vertinimui. Toks reiškinys gali įtakoti galutinę veikliosios medžiagos koncentraciją atskirame virškinamojo trakto segmente, o kartu ir vaisto prasiskverbimo greitį ir procentinę dalį per biologines membranas.

3.5. Rutino tirpalo koncentracijos kitimas hidroksipropilmetilceliuliozės

poveikyje

Tiriamojo hidroksipropilmetilceliuliozės ir rutino tirpalo gamyba:

Paimta 2 ml. kontrolinio kvercetino tirpalo, kuriame yra 20 mikrogramų rutino, ir sumaišyta su 50 mg. hidroksipropilmetilceliuliozės. Buvo pagaminti 6 tiriamieji tirpalai. Trys iš šių tirpalų buvo laikyti 15 min. kambario temperatūroje, kiti trys mėginiai laikyti 60 min. taip pat kambario temperatūroje. Praėjus numatytam laikotarpiui, atitinkamai po 15 min. bei 60 min., tirpalai buvo centrifuguoti 8500 apsisukimų per minutę greičiu, centrifuguota buvo 12 minučių, 3°C temperatūroje. Tuomet išcentrifuguotas tirpalas buvo perkeltas į chromatografinius buteliukus, kurie patalpinti į chromatografą ir tirti UESC metodu.

4 pav. Rutino tirpalo koncentracijos kitimas hidroksipropilmetilceliuliozės poveikyje po 15 ir 60 min.

Rutino koncentracijos lygio kitimas skirtingą periodą išlaikant po polimerinės medžiagos hidroksipropilmetilceliuliozės pridėjimo atskleistas 4 paveiksle pateiktoje

100% _97,00% 95,70% 96,30% _{92,70% 93,80%} 96,00% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%

Kontrolė 15min. Nr.1 15min. Nr.2 15min. Nr.3 60min.Nr. 1 60min. Nr.2 60min. Nr.3

Ko nc en tr ac ija % Mėginiai