FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
ASTA OLSZEWSKA
CHLORHEKSIDINO DIGLIUKONATO TIRPALŲ KOKYBĖS IR
STABILUMO TYRIMAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. dr. Vitalis Briedis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
CHLORHEKSIDINO DIGLIUKONATO TIRPALŲ KOKYBĖS IR
STABILUMO TYRIMAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Vitalis Briedis
Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Asta Olszewska
Data Data
Turinys
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
1. SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
DARBO NAUJUMAS IR PRAKTINĖ REIKŠMĖ ... 10
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
2.1. Chlorheksidino digliukonato cheminės, farmakologinės savybės, pritaikymas farmacinų formų gamyboje ... 11
2.1.1. Chlorheksidino digliukonato fizikinės cheminės savybės ... 11
2.1.2. Chlorheksidino stabilumas ... 12
2.1.3. Skilimo procesai ... 13
2.1.4. Farmakologinės savybės ... 16
2.1.5. Veikimo mechanizmas ... 17
2.1.6. Nepageidaujamos reakcijos ... 18
2.1.7. Chlorheksidino farmaciniai produktai ... 19
2.2. Farmacinių preparatų kokybės užtikrinimas ... 19
2.2.1. Bendrieji kriterijai ruošiant produkto specifikaciją ... 21
2.2.2. Specialieji kriterijai ruošiant produkto specifikaciją ... 22
2.3. Apibendrinimas ... 22
3. TYRIMO METODIKA ... 24
3.1. Tyrimo medžiagos ir prietaisai ... 24
3.1.1. Tyrimo medžiagos ... 24
3.1.2. Naudota įranga ... 24
3.2. Chlorheksidino digliukonato tirpalų gamyba vaistinėje ... 25
3.3. Stabilumo tyrimas ... 26
3.4. Chlorheksidino digliukonato 0,02 ir 0,05 proc. tirpalų testavimas po poveikio stresiniais faktoriais ... 27
3.4.1. Rūgščios terpės įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui ... 27
3.4.3. Šilumos poveikis chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui ... 28
3.4.4. Šviesos įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui ... 28
3.5. Analizės metodai ... 28
3.5.1. Chlorheksidino digliukonato kiekybinis įvertinimas UV spektrofotometrijos metodu ... 28
3.5.2. Chlorheksidino digliukonato tapatybės bei priemaišų nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu ... 29
3.5.3. pH nustatymas ... 30
3.5.4. Mikrobiologinis tyrimas ... 30
3.6. Statistinė analizė ... 31
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32
4.1. Chlorheksidino digliukonato kokybės parametrų parinkimas ... 32
4.2. Chlorheksidino digliukonato tirpalų testavimas po poveikio stresiniais faktoriais ... 32
4.2.1. Rūgščios terpės įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui ... 33
4.2.2. Šarminės terpės įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui ... 34
4.2.3. Šilumos įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui ... 35
4.2.4. Dienos šviesos įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui ... 36
4.2.5. Sterilizacijos įtaka vaistinės medžiagos kiekiui tiriamuosiuose tirpaluose ... 36
4.3. Tiriamųjų tirpalų specifikacijos vystymas ... 37
4.4. Chlorheksidino digliukonato 0,02 proc. ir 0,05 proc. tirpalų stabilumo tyrimai ... 39
4.4.1. Ilgalaikis stabilumo tyrimas ... 39
4.4.2. Pagreitintas chlorheksidino digliukonato stabilumo tyrimas ... 41
4.5. Rezultatų apibendrinimas ... 44
5. IŠVADOS ... 46
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 47
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 48
SANTRAUKA
A. Olszewska magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. Vitalis Briedis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Tyrimo tikslas: atlikti chlorheksidino digliukonato tirpalų kokybės tyrimus ir rekomenduoti produktų
tinkamumo terminus.
Uždaviniai: 1. Išanalizuoti mokslinės literatūros duomenis apie chlorheksidino digliukonato fizikines,
chemines, farmakologines savybes ir pritaikymą farmacinių formų gamyboje. 2. Atrinkti kokybės
parametrus chlorheksidino digliukonato tirpalų vertinimui ir suformuluoti kokybės specifikaciją. 3. Atlikti chlorheksidino preparatų kokybės vertinimą, ištirti įvairių faktorių (temperatūros, pH terpės, šviesos) įtaką jų kokybei. 4. Atlikti chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumo tyrimus ir rekomenduoti produktų tinkamumo terminus.
Tyrime tiriami LSMU Kauno klinikų vaistinėje pagaminti sterilūs 0,02 proc. ir 0,05 proc. koncentracijos chlorheksidino digliukonato tirpalai. Atlikti ilgalaikio bei pagreitintomis sąlygomis stabilumo tyrimai bei išorės faktorių (temperatūros, švieos, pH terpės) įtaka preparato kokybei. Chlorheksidino kiekis preparatuose nustatomas UV spektrofotometrijos metodu, priemaišos nustatomos efektyviąja skysčių chromatografija.
Pagamintų chlorheksidino digliukonato tirpalų kokybė vertinta, nustatant išvaizdą – bespalvis, skaidrus skystis, pH reikšmę nuo 5,5 iki 7,0, veikliosios medžiagos kiekį bei sterilumą. Atliekant ilgalaikio stabilumo tyrimus nustatyta, jog praėjus 3 mėnesiams chlorheksidino digliukonato tirpalai išlieka stabilūs ir sterilūs. Atlikus pirminius matavimus po 6 mėnesių I serijos preparatuose nustatytas sumažėjęs chlorheksidino kiekis, kuris siekė apie 15,92 proc. nuo pradinio kiekio. Kitose serijose tokio pokyčio nenustatyta, todėl nuspręsta atlikti pakartotiną tyrimą ir įvertinti gautų rezultatų validumą. Tirpalų rodikliai išlieka nepakitę penkis mėnesius, laikant 40°C temperatūroje ir 75 proc. drėgmei. Įvertinus chlorheksidino digliukonato tirpalus po poveikio stresinais faktoriais paaiškėjo, kad molekulė yra atspari šarminei terpei, 70°C temperatūrai bei dienos šviesai. Chlorheksidino molekulė suskilo per 24 valandas rūgščioje aplinkoje kai pH 2,7 (p<0,05). Remiantis gautais tyrimo rezultatais chlorheksidino digliukonato tirpalai gali būti laikomi kambario sąlygomis, t.y. 25 °C temperatūroje, tinkamumo laikas ne ilgesnis nei 3 mėnesiai.
SUMMARY
Asta Olszewska master‘s thesis.Team paper advisor Prof. Dr. Vitalis Briedis; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. - Kaunas.
The aim of the study: to perform a quality evaluation of chlorhexidine digluconate solutions and
recommend the date of minimum durability for these products.
Objectives of the study: 1. To review previous studies on physical, chemical, pharmacological
characteristics of chlorhexidine digluconate and its application in the manufacture of pharmaceutical products. 2. To select qualitative estimation indicators of chlorhexidine digluconate solutions and define quality specifications. 3. To carry out the quality evalution of chlorhexidine digluconate products, to test the influence of different factors (temperature, pH, light) on quality of chlorhexidine digluconate. 4. To carry out stability test of chlorhexidine digluconate solutions and recommend the date of minimum durability for these products.
In this MA thesisa sterile chlorehexidine digluconate 0,02 % and 0,05 % solution, produced at the pharmacy of LSMU Kaunas clinics, was tested. Long-term and accelerated stability tests were carried out, but also solution under the influence of stress factors was examined. The amount of chlorhexidine was determined using the UV spectrophotometry method, on the other hand, the components in the mixture were identified using denaturing high-performance liquid chromatography (HPLC).
The qualitative indexes of the chlorhexidine digluconate solutions were determined: appearance: colorless, odorless liquid, the value of the pH in interval 5,5 – 7,0, chlorhexidine digluconate amount in the solutions and the sterility tests was also performed. While performing long-term stability tests it was determined that after 3 months chlorhexidine digluconate solutions remain stable and sterile. After performing primary measurements, after 6 months, the lowered cholerhexidine amount was determined in the 1 series of the preparations, which was only 15.92 after the initial quantity. In other series, there was no such change, so it was decided to perform the repeated test and to evaluate the result validity of the tests. The indexes of the solutions remain unchanged for the five months, while keeping it in 40°C temperature and in 75% of humidity. When chlorhexidine digluconate solutions were evaluated after the effect in the stressed factors, it was determined, that the molecule is resistance for the alcaline medium, 70°C temperature and the day light. The chlorhexidine molecule split in 24 hours in the acidic environment, when pH was 2.7 (p<0,05). According to the test results, the chlorhexidine digluconate solutions can be stored at room conditions, i.e. in the 25 °C temperature, the validity period is no longer than the 3 months.
PADĖKA
Už suteiktą teorinę ir praktinę pagalbą, kokybiškas darbo sąlygas atlikti mokslinį tiriamąjį darbą „Chlorheksidino digliukonato tirpalų kokybės ir stabilumo tyrimai“ dėkoju savo darbo vadovui prof. dr. V. Briedžiui bei visam Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui.
Dėkoju LSMU Kauno klinikų vaistinės vedėjai B. Varanavičienei už suteiktą paramą, žinias bei tiriamuosius tirpalus atlikti savo magistro baigiamąjį darbą.
1. SANTRUMPOS
CHD – chlorheksidino digliukonatas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. High –performance liquid chromatography HPLC) FDA – maisto ir vaistų agentūra Jungtinėse Amerkos Valstijose (ang. Food and Drug Administration) LD50 – dozė, kuri sukelė 50 proc. tiriamųjų mirtį
MIC – mažiausioji slopinamoji koncentracija (ang. Minimum Inhibitory Concentration) Ph.Eur. – Europos farmakopėja
proc. - procentai
PSO - Pasaulio sveikatos organizacija (angl. World Health Organization - WHO) SD – standartinis nuokrypis
ĮVADAS
Chlorheksidinas kaip antiseptikas pradėtas naudoti nuo 1954 metų, t.y. naudojamas ilgiau nei 60 metų [1]. Chlorheksidino preparatams būdingos dvi savybės: net mažos koncentracijos preparatai pasižymi antimikrobiniu veikimu ir yra gana nekenksmingi žmonėms, todėl sukurta apie šešiasdešimt įvairių farmacinių preparatų [2]. Dažniausiai chlorheksidinas naudojamas ligoninėse siekiant užkirsti kelią ligų bei infekcijų plitimui. Chlorheksidino preparatais gydomos žaizdos, nudegimai, akių infekcijos, dantų ligos, pvz. periodontitas, gingvitas ir kt. [3]. Chlorheksidinas tenkina visus reikalavimus antiseptinėms medžiagoms: pasižymi plačiu veikimo spektru, atsparus įvairiems fiziniams, cheminiams ir mikrobiologiniams poveikiams, mažai toksiškas, gerai toleruojamas ir kt. [4].
Vieni šaltiniai nurodo, kad chlorheksidino molekulė susintetinta 1940 metais [8], kiti jog ją atrado britai Imperial Chemical Industries laboratorijoje 1950 metais sintetinant vaistus nuo maliarijos [5]. Pirmą kartą kaip vietinis antiseptikas ir dezinfekuojanti medžiaga chlorheksidinas pavartotas Didžiojoje Britanijoje 1954 metais. Nuo tada chlorheksidino vartojimas sparčiai augo. 1971 metais atrasta, kad chlorheksidino tirpalas apsaugo dantis nuo akmenų susidarymo. 1992 metais sukuriamas kraujagyslių prieigos kateteris, kuris impregnuotas chlorheksidinu ir sidabro sulfadiazinu. 2012 metais FDA patvirtino, jog Periferijoje įdėtas centrinis kateteris (Peripherally Inserted Central Catheter PICC) impregnuotas chlorheksidinu pasižymi antimikrobinėmis savybėmis [5].
Nors chlorheksidino molekulė žinoma pakankamai ilgai, sukurta daug įvairių chlorheksidino preparatų, tačiau ji išlieka patraukli ir toliau naudojama kuriant naujus farmacinius produktus. Šiuo tiriamuoju darbu siekiama atlikti LSMU Kauno klinikų vaistinėje gaminamų chlorheksidino digliukonato tirpalų kokybės vertinimą, suformuluoti kokybės vertinimo specifikaciją. Apžvelgus mokslinę literatūrą ir susipažinus su LSMU Kauno klinikų vaistinėje sterilių vaistų gamyba iškelta tyrimo problema - sterilių vaisto formų gaminamų vaistinėje kokybės analizės išsamumo trūkumas.
Hipotezė – chlorheksidino digliukonato tirpalai išliks stabilūs ne trumpiau nei 3 mėnesius.
Darbo tikslas – atlikti chlorheksidino digliukonato tirpalų kokybės tyrimus ir rekomenduoti produktų tinkamumo terminus.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas: atlikti chlorheksidino digliukonato tirpalų kokybės tyrimus ir rekomenduoti
produktų tinkamumo terminus.
Tyrimo objektas: LSMU Kauno klinikų vaistinėje pagaminti 0,02 proc. ir 0,05 proc.
chlorheksidino tirpalai.
Darbo uždaviniai:
1. Išanalizuoti mokslinės literatūros duomenis apie chlorheksidino digliukonato fizikines, chemines, farmakologines savybes ir pritaikymą farmacinių formų gamyboje.
2. Atrinkti kokybės parametrus chlorheksidino digliukonato tirpalų vertinimui ir suformuluoti kokybės specifikaciją.
3. Atlikti chlorheksidino preparatų kokybės vertinimą, ištirti įvairių faktorių (temperatūros, pH terpės, šviesos) įtaką jų kokybei.
4. Atlikti chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumo tyrimus ir rekomenduoti produktų tinkamumo terminus.
DARBO NAUJUMAS IR PRAKTINĖ REIKŠMĖ
LSMU Kauno klinikų vaistinėje gaminami dviejų koncentracijų chlorheksidino digliukonato tirpalai, kurie naudojami praplovimams operacijų metu. Aktualu įvertinti vaistinėje gaminamų tirpalų kokybę ir stabilumą, parenkant kokybės kriterijus tokius pat kaip pramoniniu būdu gaminamiems vaistams. Vaistinėje dažnai ekstemporaliai gaminami vaistai yra vertinami atliekant vizualinę (išvaizdą) kontrolę, kiekybinę ir kokybinę analizę. Steriliai gaminamiems vaistams vaistinėje vykdoma kontrolė vertinant mechaninį užterštumą, pH reikšmes bei mikrobiologinį tyrimą. Tačiau tokie tyrimai nėra pakankami lyginant su pramonėje gaminamais steriliais preparatais. Pramoniniu būdu gaminamiems vaistams yra taikomas kiekybinis nustatymas.
Ruošiant magistro baigiamąjį darbą mokslinės informacijos ieškota naudojant paieškos sistemas PubMed, Google Scholar.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Chlorheksidino digliukonato cheminės, farmakologinės savybės, pritaikymas
farmacinų formų gamyboje
2.1.1. Chlorheksidino digliukonato fizikinės cheminės savybės
Chlorheksidinas tai katijoninis biguanidas, dar kitaip vadinamas di-D-gliukonatas arba D gliukono rūgštis. Šio junginio molekulinė masė 505,4 g/mol [6]. Farmakopėjinis cheminis pavadinimas 1,1’-(heksan-1,6-diil)bis[5-(4-chlorfenil)biguanido] di-D-gliukonatas [7].
1 pav. Chlorheksidino digliukonato cheminė struktūra [8]
Kaip matyti 1 paveiksle chlorheksidino molekulė simetriška, sudaryta iš dviejų jonizuojamų guanidino liekanų. Vieni autoriai teigia, kad chlorheksidinas turi dvi pKa reikšmes: 2,2 ir 10,3 [9]. Tuo tarpu kiti mokslininkai nurodo kelias pKa reikšmes, kurios pateiktos 1 lentelėje.
1 lentelė. Disociacijos konstantos ir chlorheksidino molekulinė masė [10]
Disociacijos konstanta Molekulinė masė
pKa1 -4,46 505,46 pKa2 2,50 pKa3 3,10 pKa4 9,55 pKa5 10,15
Mokslininkai Musial, Kokol ir Voncina nagrinėjo dviejų polimerų: poliakrilo rūgšties ir metilceliuliozės įtaką chlorheksidino tirpalų pH bei tirpumui. Nustatė, kad tirpalų su metilceliulioze pH reikšmės yra 9,7-9,98, o su poliakrilo rūgštimi pH 5,31-5,72. Pastarasis prilygsta fiziologinei odos pH
reikšmei. Taip pat nustatė pH įtaką chlorheksidino tirpumui. Rūgštinant tirpalą iki pH 5,0 chlorheksidino tirpumas gali siekti 34-36 µg/ml [10].
Chlorheksidinas dažniausiai naudojamas trijų druskų formoje, pvz.: diacetato, dihidrochlorido ir digliukonato. Šioms druskoms būdingas skirtingas tirpumas. Lee su bendraautoriais druskų tirpumą pavaizdavo tokiomis lygtimis:
Digliukonato Ksp(CHX-G2) = K1K2 = [CHX2+][G-]2 Diacetato Ksp(CHX-Ac2) = K3K4 = [CHX2+][Ac-]2 Dihidrochlorido Ksp(CHX-Cl2) = K5K6 = [CHX2+][Cl-]2
Nustatyta, kad dihidrochlorido druskos tirpumas, esant 37ºC temperatūrai, 20 kartų mažesnis nei diacetato. Dažniausiai naudojama digliukonato druska, nes gerai tirpsta vandenyje [9,11].
Kuriant chlorheksidino preparatus svarbu parinkti tinkamą druską, nes nuo jos priklauso medžiagos tirpumas. Dažniausiai naudojama digliukonato druska, kadangi pasižymi didžiausiu tirpumu.
2.1.2. Chlorheksidino stabilumas
Chlorheksidino gliukonato tirpalą gali neutralizuoti kietas vanduo, šie preparatai nederi su muilais bei kitomis anijoninėmis medžiagomis. Chlorheksidino gliukonato 0,05 proc. tirpalas sąveikauja su boratais, karbonatais, citratais, nitratais, chloridais, fosfatais, sulfatais – sumaišius su šiomis medžiagomis gali iškristi nuosėdos. Aktyvumą gali sumažinti kamštiena, alginatai, tragakantai, netirpūs cinko, kalcio, magnio kompleksai. Tačiau skirtingai nei antiseptikai, kurių sudėtyje yra jodidų, chlorheksidino neinaktyvina organinės medžiagos, pvz. kraujas [12].
Chlorheksidinas yra pakankamai atsparus temperatūros poveikiui. Mokslininkai Wannachaiyasit ir Thawatchai 2010 metais tyrinėjo chlorheksidino gelį, į kurio sudėtį įėjo 25 proc. makrogolio, 0,25 proc. chlorheksidino ir 0,1 proc. acesulfamo. Buvo tiriamas chlorheksidino stabilumas šiame gelyje, gelį atšaldant per 24 val. iki 4°C temp. bei laikant 24 val. 40°C temperatūroje, esant 65 proc. drėgmei. Toks temperatūrų keitimas buvo kartotas penkis kartus. Po atšaldymo ir atšildymo procesų chlorheksidino gelis išlaikė savo formą, veikliosios medžiagos atsipalaidavimas siekė apie 96 proc. Tyrimai patvirtino, kad chlorheksidino molekulė yra atspari 40°C temperatūros poveikiui [13].
Chlorheksidino digliukonato tirpalas laikomas 25°C temperatūroje, talpyklėse apsaugotose nuo dienos šviesos poveikio [14]. Rekomenduojama saugoti nuo liepsnos ir kontakto su elektros prietaisais [12].
Apibendrinant galima teigti, kad chlorheksidinas pasižymi pakankamu fizikiniu stabilumu, molekulė lieka nepakitusi aukštesnėje nei kambario temperatūra, tirpalas nereikalauja ypatingų laikymo sąlygų, kas sudaro galimybes kurti stabilius chlorheksidino produktus.
2.1.3. Skilimo procesai
Chlorheksidinas laikymo metu gali skilti į para-chloraniliną ir kitas reaktyvias formas. Toksinis ir kancerogeninis chloranilino poveikis patvirtintas žiurkių patinams ir pelėms. Taip pat įrodyta, kad p-chloranilinas sukelia bakterijų DNR pakitimus, nors genų mutacijos tyrimai dar nėra galutinai patvirtinti. Genų mutacija buvo sukelta grybeliams ir žinduolių ląstelėms, tačiau gauti rezultatai nebuvo vienareikšmiai. Eksperimentinių tyrimų metu patvirtintas p-chloranilino kancerogeniškumas gyvūnams, tačiau trūksta įrodymų ar jis kancerogeniškas žmonėms [15]. Vis dėl to Tarptautinė vėžio tyrimų agentūra chloraniliną priskiria prie 2B grupės medžiagų, t.y. galimai kancerogeniškų žmogui medžiagų [15]. p-chloranilinas yra greitai absorbuojamas ir metabolizuojamas, jo reaktyvūs metabolitai gali kovalentiškai jungtis prie hemoglobino, kepenų ir inkstų baltymų. Nustatyta, kad p-chloranilinas pasižymi nefrotoksinėmis ir hepatotoksinėmis savybėmis [16]. Žmonėms p-chloranilino poveikio mechanizmas methemoglobinemijai vystytis nėra tiksliai žinomas. Tuo tarpu atlikti tyrimai su gyvūnais parodė, kad p-chloranilino toksiškumą gali lemti jo metabolitai chlornitrozas ir chlorfenilhidroksilaminas (2 paveikslas), nors ne visi atlikti tyrimai patvirtina šių metabolitų susidarymą [17].
2 pav. A - para-chloranilino struktūra, B - parachloracetanilidas, C - chlorfenilhidroksilaminas, D - chlornitrozo benzenas
Kačmar ir kiti mokslininkai įvertino p-chloranilino toksinį ir imunotoksinį poveikį avių periferinio kraujo leukocitams. Toksinis poveikis nustatytas kai koncentracija 1,0-0,1 mg/ml-1, imunotoksiškumas esant 0,01-0,001 mg/ml-1 koncentracijai. Šie rezultatai patvirtino p-chloranilino slopinamąjį poveikį leukocitams [15].
Kadangi chlorheksidino vartojimą riboja jo degradacijos produktai svarbu žinoti galimus skilimo mechanizmus. Kaip pavaizduota 3-ame paveiksle chlorheksidinas hidrolizės metu gali skilti į para-chloraniliną (3 pav. A variantas), chlorfenil)karbamidą (3 pav. B variantas) ar (para-chlorfenil)guanidiną (3 pav. C variantas) [16].
3 pav. Galimi chlorheksidino skilimo produktai [16]
Mokslininkai Zong ir Kirsch nustatė, kad degradacijos produktų susidarymo greitis priklauso nuo pH reikšmės. Buferiai (fosfatas, acetatas) pagreitina hidrolizės procesus. Rūgštinėje aplinkoje chlorheksidinas iš karto skyla į p-chloraniliną. Kaip pavaizduota 4-ame paveiksle šarminėje terpėje pirmiausiai susidaro p-chlorfenilkarbamidas ir tik vėliau iš šio junginio susidaro p-chloranilinas [16].
4 pav. Para-chlorfenilkarbamido (PCPU) skilimas iki p-chloranilino (PCA) šarminėje aplinkoje [16]
Mokslininkai Lin ir kiti 2014 metais paskelbė duomenis apie acetato buferio, temperatūros bei pakuotės įtaką chlorheksidino digliukonato akių preparatų stabilumui. Produktas gaminamas skiedžiant 20 proc. chlorheksidino digliukonatą tirpalą acetato buferiu kai pH reikšmė 5,9 ir osmaliališkumas 270 mOsmol/kg. Nustatyta, kad chlorheksidino digliukonato 0,02 proc. preparatas yra stabilus šešis mėnesius neatidarius buteliuko ir vieną mėnesį po buteliuko atidarymo kai produktas laikomas 2-25ºC temperatūroje ir steriliame aukšto tankio polietileno buteliuke bei pH reikšmė yra 5,9 [6].
Barbin ir kiti mokslininkai nustatinėjo p-chloranilino kiekį pastoje, pagamintoje iš 2 proc. chlorheksidino tirpalo ir kalcio hidroksido. Kiekis buvo tiriamas tuoj pat po pagaminimo bei po 7 dienų, esant 36,5 °C temperatūrai ir 95 proc. santykinei oro drėgmei. Tyrėjai nustatė, kad p-chloranilino kiekis preparate padidėjo po 7 dienų, lyginant su pradiniu tašku [15].
Yra duomenų patvirtinančių, kad degradacijos produktai sumažina ar iš vis panaikina chlorheksidino antimikrobinį aktyvumą. 2-oje lentelėje pateiktas chlorheksidino bei jo galimų skilimo produktų antimikrobinis aktyvumas atitinkamiems mikroorganizmams [18].
2 lentelė. Chlorheksidino bei galimų degradacijos produktų (CHDI-B ir CHDI-C) antimikrobinis aktyvumas
[18]
Pastaba. CHDI-B
CHDI-C
Chlorheksidino priemaišų susidarymas priklauso nuo tirpalo pH reikšmės ir temperatūros. Pagrindinis skilimo produktas yra p-chloranilinas, kuris priskiriamas 2B grupei, t.y. gali būti kancerogeniškas žmogui. Be to, įvairių priemaišų susidarymas sumažina chlorheksidino digliukonato antimikrobinį aktyvumą, todėl tyrimo metu svarbu nustatyti chlorheksidino molekulės skilimo procesus, rekomenduoti tinkamumo terminą bei laikymo sąlygas.
2.1.4. Farmakologinės savybės
Chlorheksidino digliukonatas tai katijoninis biguanidas, kuris jungiasi su mikroorganizmų ląstelės sienelės komponentais. Tai plataus spektro antimikrobinė medžiaga. Mažos koncentracijos tirpalai pasižymi bakteriostatiniu veikimu, o didesnės koncentracijos chlorheksidino tirpalai veikia bakteriocidiškai gramteigiamus ir gramneigiamus mikroorganizmus, taip pat kai kuriuos grybelius (Candida albicans) ir virusus (raudonukės, tymų, parotito, ŽIV) [19,20,21]. Chlorheksidino digliukonatas nesunaikina tuberkuliozės mikrobakterijų ir sporų, nors dėl poveikio sporoms nėra vienareikšmių duomenų. Vieni autoriai teigia, jog pasižymi mažu aktyvumu, tuo tarpu kiti autoriai skelbia, kad
chlorheksidinas iš vis neveikia sporų. Martindale: The complete drug reference, 35 th ed., 2007 metų leidinyje ir Bambace su bendraautoriais teigia, jog chlorheksidinas sporas veikia tik aukštose temperatūrose [8].
Chlorheksidino poveikis priklauso nuo tirpalo pH reikšmės. Optimalus antimikrobinis aktyvumas būdingas kaip pH nuo 5,5 iki 7,0 [19].
Pawinska ir kiti mokslininkai nagrinėjo gutaperčos antimikrobinį aktyvumą, kurios sudėtyje buvo kalcio hidroksidas ir chlorheksidinas, prieš aerobines ir anaerobines bakterijas. Anaerobinės bakterijos (P.
anaerobius, F. nucleatum, V. parvula, C. sporogenes, A. odontolyticus, P. gingivalis) buvo sėjamos į
Brucello agarą su 5 proc. krauju, aerobinės bakterijos į triptano sojos agarą (TSA - Tryptic Soy Agar). Bakterijų suspensija paskleista ant substratų paviršiaus, vienas šalia kito po tris vienetus sudėtos gutaperčos su chlorheksidinu ir su kalcio hidroksidu. Plokštelės su anaerobinėms bakterijomis inkubuotos 48-72 val., su aerobinėmis bakterijomis 24 val. Rezultatai gauti matuojant atskirų bakterijų slopinimo zonas. Gutaperča su chlorheksidinu pasižymėjo platesniu antimikrobinio veikimo spektru (veiksminga prieš aerobines ir anaerobines bakterijas) ir buvo veiksminga mažiausiai savaitę. Gutaperča su kalcio hidroksidu prieš daugelį aerobinių ir anaerobinių bakterijų buvo neveiksminga [22].
Grare bei kiti mokslininkai in vitro tyrime lygino para-guanidinetilkalikso areno antimikrobinį aktyvumą su chlorheksidino ir heksaamidino. Tyrėjai nustatė, kad chlorheksidinas buvo veiksmingas prieš visas padermes, heksaamidinas mažiau veiksmingas, ypač prieš Gram+ bakterijas. Tuo tarpu p-guanidinetilkalikso arenas buvo veiksmingas tik prieš kai kurias bakterijas, pvz. prieš Staphylococcus
aureus, bet neveikė kitų bakterijų [23].
Chlorheksidino digliukonato veikimo spektras gana platus. Jo veiksmingumą lemia įvairūs faktoriai, pvz. pH reikšmė, naudojami tirpikliai ir kt. Paskelbti duomenys leidžia teigti, kad poveikio veiksmingumui ypač svarbi tirpalo pH reikšmė, kuri turi būti ribose tarp 5,5 – 7,0.
2.1.5. Veikimo mechanizmas
Chlorheksidinas dėl elektrostatinės traukos jungiasi prie bakterijos citoplazmos membranos elementų, turinčių neigiamą krūvį. Taip sutrikdoma bakterinės ląstelės osmosinė pusiausvyra, sukeliamas intraląstelinių medžiagų nuotėkis, ko pasekoje ląstelė žūsta. Manoma, kad bakterijų ląstelės sąveikauja su chlorheksidino struktūroje esančiomis karboksilo grupėmis [8,24].
Chlorheksidino metabolizmą slopina fermentų kompleksas, kuris atsakingas už glikozidų įterpimą į bakterijų ląsteles. Chlorheksidino veikimą inhibuoja nikotino rūgštis, nors tikslus veikimo mechanizmas nėra žinomas. Manoma, kad rūgštis užblokuoja receptorius, prie kurių turėtų jungtis chlorheksidinas [8].
2.1.6. Nepageidaujamos reakcijos
Pirmieji chlorheksidino preparatų sukelti alergijos atvejai aprašomi nuo 1962 metų [25]. Padidinto jautrumo reakcijos pasireiškia gana retai. 2013 metais atliktame tyrime nustatyta, kad vartojant 0,5 proc. chlorheksidino digliukonato tirpalą kontaktinis dermatitas išsivystė 3 proc. tiriamųjų, iš kurių 1 proc. pacientams pasireiškė stipri alerginė reakcija [26]. Vis dažniau mokslinėje literatūroje nurodoma informacija, kad chlorheksidino preparatai sukelia pooperacines alergines reakcijas, todėl prieš procedūras rekomenduojama atlikti odos testą [25,27]. 2012 metais Jungtinėje Karalystėje mokslininkai Nakonecha su bendraautoriais aprašė šešis atvejus kada pasireiškia pooperacinės alerginės reakcijos [1]. Padidinto jautrumo reakcijos, įskaitant hipotenziją, tachikardiją, odos eritemą ar anafilaksiją, pasireiškia tuomet kai chlorheksidino gliukonato preparatai vartojami lokaliai, į nosį ar patekdavo į šlapimo takus [12]. Skalaujant burną gali sukelti metalo skonį burnoje, dantų, liežuvio pageltimą, skonio sutrikimą, ilgalaikis naudojimas gali padidinti akmenų kaupimąsi ant dantų [14,28]. Jo nerekomenduojama vartoti ilgiau kaip 14 dienų [4].
Chlorheksidino preparatai mažai toksiški vartojant per nosį, nes chlorheksidinas blogai absorbuojamas iš virškinamojo trakto. Nustatyta, kad vartojant per burną toksiškumas pelėms yra labai mažas (LD50 1800 mg/kg), bet gyvybei pavojingas suleidus į veną (LD50 22 mg/kg) [29]. Chlorheksidino nerekomenduojama vartoti vidurinės ausies operacijos metu, nes gali sukelti neurosensorinį kurtumą [12]. Nėštumo metu FDA chlorheksidino preparatus priskiria B kategorijai, t.y. tyrimai su gyvūnais patvirtino, kad nesukelia rizikos vaisiui, tačiau trūksta duomenų su nėščiosiomis [30].
Apibendrinant galima teigti, kad chlorheksidino preparatai pasižymi santykinai mažu toksiškumu, todėl gali būti saugiai naudojami kaip antiseptikai.
2.1.7. Chlorheksidino farmaciniai produktai
Chlorheksidino preparatų farmacinių formų įvairovė gana didelė. Tai saugūs, veiksmingi ir pigūs antiseptikai. Gaminami muilai, burnos skalavimo skystis, sterilūs tirpalai, geliai, purškalai, tepalai. Dažnai gydomos žaizdos, nudegimai, akių infekcijos, dantų ligos, pvz. periodontitas, gingvitas, skysčiai kontaktinių lęšių dezinfekavimui [3,16,20,31]. PSO rekomenduoja chlorheksidinu valyti bambos virkštelę, taip sumažėja rizika susirgti Omphalitis liga [8]. Chlorheksidino preparatai sumažina dantų apnašų susidarymo galimybę lyginant su placebo [32]. Wang ir kiti mokslininkai nustatė, kad 2 proc. chlorheksidino gelis ar tirpalas turi panašų antimikrobinį aktyvumą dantų šaknies kanalo dezinfekavimui kaip NaOCl preparatas. Tyrėjai išskyrė keletą chlorheksidino preparatų privalumų lyginant su NaOCl:
• mažiau toksiški,
• ilgiau trunkantis poveikis,
• geriau toleruojamas kvapas ir skonis, • nepasižymi balinančiu poveikiu [19].
Farmacijoje 0,005 proc. chlorheksidinas vartojamas kaip konservantas, ypač akių lašų gamyboje [6]. Veterinarijoje naudojama instrumentų, įrengimų dezinfekavimui, klinikinėje praktikoje chlorheksidino produktai vartojami paciento paruošimui prieš procedūras [8]. Šiuo metu rekomenduojama gydyti žaizdas, nudegimus, tačiau dėl galimos anafilaksinės reakcijos pasireiškimo preparatų koncentracija neturi viršyti 0,05% [6].
Chlorheksidino preparatai pasižymi aukštu antimikrobiniu aktyvumu, nedidelės koncentracijos produktai mažai toksiški, gerai toleruojami odos ar gleivinių, todėl šių preparatų vartojimo spektras yra gana platus.
2.2. Farmacinių preparatų kokybės užtikrinimas
Farmacinių preparatų kokybė užtikrinama įvertinant produkto kokybės rodiklius. Kokybės rodikliai parenkami atsižvelgiant į vaistinei medžiagai ir vaisto formai keliamus reikalavimus. Kokybės parametrų kitimai atspindi galimus preparato nestabilumo pasireiškimus. Norint įvertinti produkto stabilumą, atliekami preparatų stabilumo tyrimai remiantis ICH Q1A gairėmis.
Stabilumo tyrimo tikslas - įrodyti vaistinio preparato pakitimus laikymo metu, veikiant įvairiems aplinkos veiksniams, pvz. temperatūrai, drėgmei, šviesai, taip pat nustatyti tiriamo vaistinio produkto
galiojimo laiką bei rekomenduoti laikymo sąlygas. Stabilumo testo metu atliekami vaistinio preparato tyrimai, vertinant jo fizikinius, cheminius, biologinius, mikrobiologinius rodiklius, kurie užtikrintų preparato kokybiškumą, veiksmingumą bei saugumą. Vaistinio produkto stabilumo testai planuojami remiantis vaistinės medžiagos stabilumo tyrimais bei jos fizikinėmis, cheminėmis savybėmis, nes sisteminiu požiūriu informacija apie vaistinės medžiagos stabilumą yra neatsiejama nuo vaistinio produkto stabilumo įvertinimo [33].
Specifikacijos reikšmė, apibrėžimas ir įvertinimas: specifikacijos formulavimo gairės sukurtos,
siekiant užtikrinti kuriamo produkto kokybę ir procesų nuoseklumą. Šių gairių tikslas padėti kūrėjams sukurti saugią ir veiksmingą naują medžiagą ar produktą, kuris atitiktų nustatytus kriterijus. Gairėse pateikiamos rekomendacijos kaip pasirinkti naujos medžiagos ar produkto, kuris anksčiau nebuvo registruotas Jungtinės Amerkos Valstijose, Europos Sąjungoje ar Japonijoje, identifikavimo, kiekybinio įvertinimo priimtinus kriterijus. Specifikacijos gairėse aprašomi reikalavimai produktui visų vystymo etapų metu, remiantis Geros gamybos praktika, t.y. nustatomi reikalavimai patalpoms, gamybos procesams, žaliavoms, stabilumo tyrimams ir kt. [34].
Specifikacija apibūdinama kaip kriterijų rinkinys, kuriuos turi atitikti nauja medžiaga ar vaistinis preparatas, norint, kad kuriamas produktas būtų kokybiškas, saugus ir veiksmingas [34].
Specifikacija apibrėžiama kaip dokumentas, kuriame pateikiama informacija apie: • medžiagos/produkto kokybės parametrus
• testus parametrams nustatyti • nuorodas į analitines procedūras • kokybės parametrų ribas
Atitiktis specifikacijai parodo ar vaistinė medžiaga ar preparatas, remiantis tyrimų rezultatais, atitinka specifikacijoje nurodytas priimtinumo ribas [34].
Produkto specifikacija formuluojama remiantis bendraisiais Europos farmakopėjos (Ph.Eur.) reikalavimais atitinkamai farmacinei formai ir kitų bendrųjų monografijų reikalavimais. Specifikacijoje kiekvienas analizės metodas bei atitinkami rezultatai turi būti pagrįsti farmacinio vystymo duomenimis, farmakopėjos standartais, klinikiniais tyrimais, ilgalaikio ir trumpalaikio stabilumo tyrimais ir kt. [34].
2.2.1. Bendrieji kriterijai ruošiant produkto specifikaciją
Rengiant produkto specifikaciją reikia patikrinti ar veiklioji medžiaga aprašyta Ph.Eur. Jei medžiaga nurodoma farmakopėjoje specifikacija rengiama remiantis vaistinės medžiagos specifine monografija. Tuo tarpu jei vaistinė medžiaga neaprašyta Ph. Eur. specifikacija rengiama remiantis bendraisiais reikalavimais specifikacijoms (Q6A gairės) ir bendraisiais Ph.Eur. reikalavimais atitinkamai farmacinei formai. Ruošiant specifikaciją būtina atsižvelgti į vaistinio preparato gamyboje naudojamas medžiagas, pvz. dažiklius, konservantus, antioksidantus ir kt. Specifikacijoje nurodomi bendrieji produkto parametrai:
• Išvaizda - apibūdinama produkto spalva, dydis, agregatinė būsena pvz. skysta, kieta. Jei laikymo metu bet kuri iš šių savybių kinta reikia atlikti papildomus tyrimus.
Identifikavimas – tapatybės nustatymui naudojami testai, pvz. ESC. Kiekybinis nustatymas – naudojamas metodas, pvz. ESC ar UV, kuriuo
dažniausiai taip pat identifikuojamos priemaišos. Jei naudojama procedūra nėra specifinė pvz. titravimas, tuomet papildomai reikia atlikti kitą metodą priemaišų nustatymui.
Priemaišos – joms priskiriamos organinės, neorganinės priemaišos bei tirpiklių
likučiai. Vaistiniame produkte priemaišos gali susidaryti: veikliosios medžiagos sintezės proceso metu, priklausomai nuo farmacinės formos, pagalbinių medžiagų, galutinio produkto gamybos metodų, pakuotės, laikymo sąlygų ir laiko [34].
Organinės priemaišos gali susidaryti gamybos (sintezės) proceso metu ar laikymo metu. Organinės priemaišos yra skirstomos į identifikuotas ir neidentifikuotas, lakias ir nelakias. Organinėms priemaišoms priskiriamos: pradinės medžiagos, pašaliniai ir tarpiniai sintezės produktai, skilimo produktai, reagentai, ligandai, katalizatoriai bei vaistinei medžiagai panašios medžiagos [35,36].
Neorganinės priemaišos gali susidaryti gamybos (sintezės) proceso metu. Jos yra žinomos ir identifikuotos. Neorganinėms priemaišoms priskiriami reagentai, ligandai ir katalizatoriai, sunkieji metalai, neorganinės druskos bei kitos medžiagos pvz. filtravimo medžiagos, aktyvinta anglis [35,36]. Tirpikliais gali būti organiniai ir neorganiniai skysčiai, kurie naudojami gamybos proceso metu. Tirpiklių toksiškumas dažniausiai yra žinomas, leistinas likutis reglamentuojamas gairėse. Skiriamos trys tirpiklių klasės:
I klasė – labai toksiški, pvz. benzenas, anglies tetrachloridas; II klasė – mažiau toksiški, pvz. metanolis, acetonitrilas; III klasė – dar mažiau toksiški, pvz. etanolis, acetonas [37].
Priemaišos nustatomos atliekant stabilumo tyrimus (ilgalaikio ir pagreitinto stabilumo tyrimo sąlygomis), gamybos procesų vystymo metu tiriant pagamintų serijų kokybę bei atliekant įprastinę serijų analizę [34].
2.2.2. Specialieji kriterijai ruošiant produkto specifikaciją
Produkto specialieji parametrai gali būti įtraukti į specifikaciją kai bendrieji testai (išvardyti aukščiau) įtakoja vaistinio preparato kokybę tyrimų metu. Ruošiant vaistinio preparato specifikaciją specialieji parametrai parenkami atsižvelgiant į vaisto farmacinę formą, pvz. skystoms vaistų formoms papildomai gali būti atliekami dozuočių vienodumo, pH, mikrobinio užterštumo testai; parenteraliniams preparatams – sterilumo, osmoliariškumo testai ir kt. [34].
Gairių specifikacijai ruošti pritaikymas užtikrina, kad sukurtas produktas bus kokybiškas, saugus ir veiksmingas.
2.3. Apibendrinimas
Chlorheksidinas kaip antiseptinė medžiaga pradėta vartoti nuo XX amžiaus antros pusės. Mažos koncentracijos tirpalai pasižymi bakteriostatiniu veikimu, o didesnės koncentracijos chlorheksidino tirpalai veikia bakteriocidiškai Gram+ ir Gram- mikroorganizmus, taip pat kai kuriuos grybelius ir virusus [19,20]. Laikymo metu chlorheksidinas gali skilti į įvairias reaktyvias formas, kurios įtakoja preparato veiksmingumą [15]. Priemaišų susidarymą labiausiai įtakoja preparato pH reikšmė ir laikymo temperatūra [6,18]. Pagrindinis skilimo produktas yra p-chloranilinas, kuris priskiriamas 2B grupei, t.y. gali būti kancerogeniškas žmogui [15]. Kitos laikymo metu susidarusios priemaišos gali sumažinti preparatų antimikrobinį aktyvumą [18]. Tačiau naudojant mažos koncentracijos chlorheksidino preparatus ir išlaikant optimalias pH reikšmes, t.y. nuo 5,5 – 7,0, toksiškų medžiagų susidarymo galimybė yra maža.
Chlorheksidino tirpumas priklauso nuo naudojamos druskos. Didžiausiu tirpumu pasižymi chlorheksidino digliukonato druska, todėl skystų farmacinių produktų gamyboje dažniausiai naudojama chlorheksidino digliukonatas.
Remiantis atlikta literatūros apžvalga chlorheksidino preparatų gausų vartojimą sąlygoja pakankamas chlorheksidino molekulės stabilumas, nesudėtingos laikymo sąlygos, platus veikimo spektras bei santykinai mažas toksiškumas.
Vaistinio preparato stabilumo tyrimai leidžia nustatyti produkto kitimus laikymo metu, taip pat įvertinti įvairių veiksnių, pvz. šviesos, temperatūros įtaką preparato patvarumui. Atliekant stabilumo tyrimus suformuluojami kokybiniai rodikliai, pagal kuriuos vertinamas produktas. Laikantis specifikacijoje nurodytų kokybės rodiklių ribų užtikrinamas preparato kokybiškumas, veiksmingumas bei saugumas.
Išanalizavus mokslinę literatūrą sudarytas tyrimo planas:
Kokybės parametrai
Pagamintų tirpalų analizė
Pagaminto produkto kokybės pirminė specifikacija Stabilumo tyrimai Galutinė produkto specifikacija Išvaizda pH reikšmė Chlorheksidino kiekis Sterilumas
Ilgalaikis stabilumo tyrimas
3. TYRIMO METODIKA
3.1. Tyrimo medžiagos ir prietaisai
3.1.1. Tyrimo medžiagos
• 20 proc. chlorheksidino digliukonato tirpalas
• Acto rūgštis - grynumas ≥ 99,8 proc. (Sigma–Aldrich, Vokietija) • Metanolis – grynumas ≥ 99,9 proc. (Sigma–Aldrich, Vokietija) • 0,1 M chloro rūgštis (Sigma–Aldrich, Vokietija)
• Natrio hidroksidas (Sigma–Aldrich, Vokietija)
3.1.2. Naudota įranga
• 1 ml ir 5 ml automatinės pipetės Eppendorf Research plus
• Spektrofotometras Agilent 8453 UV-Vis (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV) • Skysčių chromatografas Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV) • pH metras – Knick pH – Meter 766, Calimatic
• Klimato kameros – Binder, GmbH • Šilumos kamera
3.2. Chlorheksidino digliukonato tirpalų gamyba vaistinėje
LSMU Kauno klinikų vaistinėje gaminami sterilūs 0,02 proc. ir 0,05 proc. koncentracijos chlorheksidino digliukonato tirpalai. Gamyba vykdoma pagal Geros vaistinių praktikos standartus. Preparatai gaminami pagal bendrą vaistinės sterilių serijinių tirpalų gamybos schemą, kuri pateikta 1 priede. Visa informacija apie gaminamų vaistų serijas surašoma serijos gamybos aprašymuose, kurie užpildyti yra registruojami sterilių vaistų serijos gamybos aprašymo dokumentų apskaitos žurnale.
Didelis kiekis tirpalo gaminamas 1000 litrų oro talpos slėginiame inde, tūrio metodu. Dieną prieš gamybą yra atliekami paruošiamieji darbai: plovimo mašinose išplaunamas reikiamas kiekis kamščių bei butelių, vėliau jie sterilizuojami. Gamybos dieną plaunamas reikiamas kiekis 500 ml tūrio butelių. Prieš gamybą analitikė atlieka injekcinio vandens fizikinę cheminę kontrolę. Gavus atsakymą apie vandens tinkamumą, tuščia metalinė 1000 l tirpalų gamybos talpa užpildoma injekciniu vandeniu apie 2/3 jos tūrio. Atmatuojamas ir supilamas reikiamas vaistinės medžiagos kiekis (Sol. Chlorhexidini digluconatis 20 proc.). Chlorheksidinas atmatuojamas atskirioje patalpoje, matavimo procese dalyvauja du darbuotojai, vienas matuoja reikiamą kiekį medžiagos, kitas stebi, t.y. matavimo procesas vykdomas stebint „keturioms akims“. Į tirpalą iki žymės pripilamas reikalingas injekcinio vandens tūris ir tirpalas maišomas 10 min. Pagamintas tirpalas paimamas fizinei cheminei kontrolei.
Į nerūdijančio plieno filtro laikiklį įdedamas filtras su priešfiltriu. Naudojami membraniniai metilceliuliozės filtrai ir priešfiltriai: filtro skersmuo – 293 mm, porų dydis 0,45 µm, priešfiltrio skersmuo – 257 mm. Kiekvienos serijos gamybos aprašyme būtina nurodyti filtro ir priešfiltrio markę: filtro markė HAWP 29325 205 Nº H6AN40224, priešfiltrio markė HP 1525 725, R6AN36134. Gavus atsakymą apie tirpalo pH reikšmę, pradedamas filtravimas ir išpilstymas į švarius bespalvius stiko butelius. Pirmasis užpildytas butelis atskiriamas nuo gaminamos produkto serijos. Vėliau buteliai užkamšomi. Po šio proceso atliekama išpilstymo kontrolė: prieš šviesą tikrinamas kas 30-as produkto butelis ir būtinai paskutinis. Buteliai užtvirtinami metaliniais gaubteliais. Tirpalai ruošiami sterilizavimui: buteliai dedami ant lentynų ir ant kiekvienos butelių eilės užklijuojamas cheminės sterilizacijos kontrolės indikatorius (juosta) su užrašytu pagaminto tirpalo pavadinimu, koncentracija, tūriu ir serijos numeriu. Patikrinama ar ant kiekvienos butelių eilės yra cheminiai sterilizacijos kontrolės indikatoriai. Penkiuose kritiniuose taškuose į butelius įdedami kontroliniai jutikliai ir paleidžiama sterilizacijos programa. Įvertinami kiekvieno sterilizacijos ciklo kritiniai parametrai, pridedami jų kitimo registracijos lapai prie serijos gamybos aprašymo dokumentų. Sterilizacijos registravimo lapuose nurodomas sterilizacijos pradžios ir pabaigos laikas, proceso temperatūra. Po sterilizavimo atliekama vizualinė kontrolė: tirpalų mechaninis
užterštumas tikrinamas prieš juodą foną. Vėliau tirpalų buteliai ženklinami. Keli buteliai paliekami produkto kontrolei, likusieji vežami į karantino patalpas.
Tirpalų kontrolei atliekama:
A) Tirpalų sterilumas – LSMU ligoninės VŠĮ KK mikrobiologijos laboratorijoje – 3 buteliai (po vieną iš kiekvienos sterilizacijos įkrovos)
B) Nustatomos fizikinės cheminės savybės
• Beveik bespalvis arba blankiai – gelsvas skystis (nustatoma stebint) • Maišosi su vandeniu (maišoma)
• Tirpus acetone ir etilo alkoholyje (tirpinama)
C) Nustatoma chlorheksidino digliukonato tirpalo pH reikšmė. Praskiedžiama 5,0 ml digliukonato tirpalo injekciniu vandeniu iki 100 ml. Matuojamas pH reikšmės turi būti 5,5 – 7,0.
Įvertinus Kauno klinikų vaistinėje vykdomus sterilių serijinių tirpalų gamybos etapus sudaryta nauja gamybos schema (2 priedas), kuri papildyta keliais kontrolės etapais. Rekomenduotina tarpiniui produktui be pH reikšmių matavimo atlikti chlorheksidino kiekio nustatymą, įvertinti išvaizdą. Galutiniam produktui siūloma atlikti ne tik mikrobiologinio užterštumo kontrolę, bet taip pat veikliosios medžiagos kiekio nustatymą, įvertinti pH reikšmę bei išvaizdą.
3.3. Stabilumo tyrimas
Remiantis ICH Q1A gairėmis stabilumo tyrimui buvo naudojamos trys chlorheksidino digliukonato tirpalų serijos. Pagamintos serijos buvo išpilstomos į talpykles, kuriose yra tiekiamos vartojimui. Tyrimas atliktas dviejų koncentracijų chlorheksidino digliukonato tirpalams. Stabilumo tyrimai vykdyti dvejomis sąlygomis:
• Ilgalaikis stabilumo tyrimas. Tirti dviejų koncentracijų 0,02 proc. ir 0,05 proc. chlorheksidino digliukonato tirpalai. Tirpalai laikyti klimatinėje kameroje 25±2°C temperatūroje, esant 60±5 proc. santykinei drėgmei. Laikymo metu stebėta tirpalų išvaizda, fizikiniai rodikliai: pH, priemaišos, chlorheksidino digliuokonato kiekio kitimai, mikrobiologinis užterštumas.
• Pagreitintas stabilumo tyrimas. Taip pat tirti dviejų koncentracijų 0,02 proc. ir 0,05 proc. chlorheksidino digliukonato tirpalai. Klimatinėje kameroje sukuriamos kontroliuojamos aplinkos sąlygos: 40±2°C temperatūra, esant 75±5% santykinei drėgmei. Laikymo metu stebėta tirpalų išvaizda, fizikiniai rodikliai: pH, priemaišos, chlorheksidino digliuokonato kiekio kitimai.
Stabilumo tyrimas vykdytas pusė metų. Ilgalaikio tyrimo metu chlorheksidino digliukonato preparatai buvo testuojami tuoj pat po pagaminimo, praėjus mėnesiui, vėliau kas tris mėnesius. Pagreitinto stabilumo sąlygomis tiriamieji tirpalai buvo tiriami kas mėnesį nuo pagaminimo datos. Tyrimų atlikimo periodiškumo lentelės pateiktos prieduose (3 ir 4 priedai).
3.4. Chlorheksidino digliukonato 0,02 ir 0,05 proc. tirpalų testavimas po poveikio
stresiniais faktoriais
Apžvelgus mokslines publikacijas ir įvertinus paskelbtus duomenis apie chlorheksidino digliuokonato tirpalų stabilumą atliktas tiriamųjų preparatų testavimas stresinėmis sąlygomis, siekiant nustatyti galimus skilimo mechanizmus bei produktus. Kaip nurodo gairės tyrimui stresinėmis sąlygomis atlikti pasirinkta viena vaistinio produkto serija [33]. Įvertintas tiriamųjų tirpalų stabilumas šarminėje ir rūgštinėje terpėje, paveikus šviesa bei šiluma [39].
3.4.1. Rūgščios terpės įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui
Chlorheksidino digliuokonato tirpalų parūgštinimui naudota 0,1 M HCl rūgštis. 20 ml tiriamojo tirpalo įpilama į kolbutę ir matuojamas pH. Pradedama lašinti HCl rūgštis kol pH reikšmė bus apie 2,7. Parūgštintas tirpalas paliktas 24 val. kambario temperatūroje, apsaugotoje nuo šviesos vietoje. Tirpalai vertinti atlikus spektrofotometrinę analizę pradiniu momentu t.y. prieš parūgštinimą, po parūgštinimo bei praėjus 24 val.
3.4.2. Šarminės terpės įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui
Tirpalo pH reikšmės buvo keičiamos pridedant 0,1 M NaOH tirpalą, kuris pagamintas iš 0,796 g NaOH ir 200 ml išgryninto vandens. Į kolbutę įpilta 20 ml tiriamojo tirpalo ir matuotas pH reikšmės. 0,1 M NaOH lašinta iki tiriamiojo tirpalo pH pasiekia 9,7 reikšmę. Tiriamasis mėginys paliktas 24 val. kambario temperatūroje, apsaugotoje nuo nuo šviesos vietoje. Tirpalai vertinti atlikus spektrofotometrinę analizę pradiniu momentu t.y. prieš šarminimą, po šarminimo bei praėjus 24 val. nuo šarminimo.
3.4.3. Šilumos poveikis chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui
Šilumos poveikis chlorheksidino tirpalams buvo vertinamas tiriant tris chlorheksidino tirpalų pavyzdžius. Talpyklės su chlorheksidino tirpalais buvo sandariai užsuktos ir laikomos klimatinėje kameroje prie 70°C temp. Tirpalai vertinti atlikus spektrofotometrinę analizę pradiniu momentu, po dienos, po 3 dienų ir po savaitės.
3.4.4. Šviesos įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui
Vienas 500 ml chlorheksidino digliukonato tirpalo butelis buvo laikomas neapsaugotoje nuo dienos šviesos vietoje. Tirpalai vertinti atlikus spektrofotometrinę analizę po 3 dienų, praėjus savaitei bei po keturių savaičių.
3.5. Analizės metodai
3.5.1. Chlorheksidino digliukonato kiekybinis įvertinimas UV spektrofotometrijos
metodu
Kiekybinei chlorheksidino digliukonato tirpalų analizei naudotas UV-Vis spektrofotometras Agilent Technologies. Tirpalų mėginiai buvo pilami į stačiakampes kvarcinio stiklo kiuvetes. Kaip lyginamasis tirpalas naudotas išgrynintas vanduo. Absorbcija matuojama esant 253 nm bangos ilgiui. Chlorheksidino digliukonato kiekiui nustatyti buvo pagaminti chlorheksidino standartiniai tirpalai ir sudaryta kalibracinė kreivė. Viskas kartota penkis kartus (n=5), iš gautų vidutinių reikšmių sudaryta kalibracinė kreivė (5 pav.).
Kalibracinės kreivės sudarymui buvo pagaminti 5, 10,15, 25,35 µg/ml chlorheksidino tirpalai. Pirmame etape pagamintas 5 proc. chlorheksidino tirpalas: automatine pipete atmatuota 2,5 ml 20 proc. chlorheksidino ir praskiesta išgrynintu vandeniu iki 10 ml (tirpalas A). Iš šio tirpalo pagamintas 0,02 proc. chlorheksidino tirpalas (tirpalas B): atmatuota 0,04 ml tirpalo A ir praskiesta iki 10 ml. Norint gauti reikalingas kalibracinei kreivei sudaryti chlorheksidino tirpalo koncentracijas, atitinkamai paimta 0,25 ml,
0,5 ml, 0,75 ml, 1,25 ml ir 1,75 ml tirpalo B (0,02 proc./200µg/ml) ir matavimo kolbutėse praskiesta iki 10 ml.
5 pav. Chlorheksidino digliukonato koncentracijos ir optinio tankio priklausomybės kreivė
Chlorheksidino digliukonato kiekiui nustatyti paruošiami tiriamieji tirpalai. Imama 0,75 ml 0,02 proc. tiriamojo tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Atitinkamai 0,05 proc. tiriamojo tirpalo imama 0,3 ml ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Naudojantis sudaryta kalibracine kreive spektrofotometro pagalba nustatyta chlorheksidino digliukonato kiekis tiriamuosiuose tirpaluose. Matavimai kartoti tris kartus (n = 3). Jei tyrimų metu chlorheksidino kiekis neatitinka specifikacijoje nustatytų ribų, tiriamasis tirpalas tiriamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, siekiant nustatyti p-chloraniliną ir kitas priemaišas.
3.5.2. Chlorheksidino digliukonato tapatybės bei priemaišų nustatymas efektyviosios
skysčių chromatografijos (ESC) metodu
Chlorheksidino kokybinis įvertinimas bei priemiašų nustatymas buvo atliekamas naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją (ESC). Naudota kolonėlė C18, kurios ilgis 25 cm, skersmuo 0,5 mm, dalelių dydis 5 µm. Mobili fazė sudaryta iš 1 proc. acto rūgšties vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir metanolio (eliuentas B). Mobilios fazės tekėjimo greitis 10,00 µl/min. Injekcijos tūris 0,2 µl. UV detekcija vykdyta prie 275 nm bangos ilgio. Analizės atlikimo temperatūra 25°C. Visi mėginiai filtruoti pro 0,20
µm membraninius filtrus. Medžiagos identifikuotos pagal jų sulaikymo trukmę bei lyginant su mokslinėje publikacijoje nurodytais laikais [16,18].
3.5.3. pH nustatymas
Chlorheksidino digliukonato tirpalų pH matuota naudojant Knick pH – Meter 766, Calimatic. Chlorheksidino tirpalų pH matavimas buvo atliekamas produkto tirpaluose tiesiogiai iš butelių.
3.5.4. Mikrobiologinis tyrimas
Mikrobiologinis tyrimas atliktas LSMU Kauno klinikų Mikrobiologijos laboratorijoje, pagaminus tirpalus bei pasibaigus nustatytam tirpalų galiojimo laikui, t.y. praėjus 3 mėn. po pagaminimo. Mikrobiologinio tyrimo metu nustatytas tiriamų tirpalų sterilumas ir grybelių nebuvimas. Sterilumas tirtas tioglikolinėje terpėje, o grybelių nebuvimas Sabūro bulijone. Į mėgintuvėlį su tioglikoline terpe ir į kitą mėgintuvėlį su Sabūro bulijonu įpilama po 1 ml tiriamojo tirpalo. Abu mėginiai inkubuoti 7 dienas termostate 35°C temperatūroje ir vertintas mikroorganizmų augimas, stebint ar mėginiai nedrumstėja.
Tioglikolinės terpės paruošimas: tioglikolinė terpė gaminama iš Thioglycollate Medium Brewer
miltelių. Atsveriama 20 g miltelių, atmatuojamas 1 litras vandens. Medžiagos supilamos į talpą, kaitinamos maišant iki užvirimo. Paruoštas tirpalas autoklavuojamas 15 min. 121°C temperatūroje. Vėliau po 5,2 ml išpilstomas į mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai su tioglikoline terpe laikomi kambario temperatūroje, tinkamumo laikas 3 mėnesiai.
Sabūro bulijono paruošimas: Sabūro terpė gaminama iš Sabouraud Dextrose broth miltelių.
Atsveriama 30 g miltelių ir atmatuojamas 1 litras vandens. Medžiagos supilamos į talpą, kaitinamos maišant iki užvirimo. Paruoštas tirpalas autoklavuojamas 15 min. 121°C temperatūroje. Vėliau tirpalas išpilstomas į mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai su Sabūro bulijonu laikomi šaldytuve, tinkamumo laikas 3 savaitės.
3.6. Statistinė analizė
Gautų duomenų apdorojimui taikyta Microsoft® Office Excel 2007 programa, apskaičiuojant rezultatų vidurkius, standartinius nuokrypius. Rezultatų skirtumų reikšmingumas nustatytas pagal Student‘s t testą. Skirtumai yra reikšmingi tuomet, kai p < 0,05.
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
4.1. Chlorheksidino digliukonato kokybės parametrų parinkimas
Pirmame tyrimo etape, remiantis Europos farmakopėja, parinkti kokybės parametrai: išvaizda - bespalvis, skaidrus skystis, pH reikšmė intervale 5,5 – 7,0, chlorheksidino kiekis bei produktų sterilumas. Kiekinei chlorheksidino digliukonato analizei Europos farmakopėjos straipsnis rekomenduoja atlikti potenciometrinį titravimą. Tačiau taikant šį metodą nebuvo galima nustatyti ekvivalentinio taško. Atlikus mokslinės literatūros apžvalgą kiekiniam nustatymui pasirinktas efektyvesnis metodas -
spektrofotometrinė analizė [8]. Pirminiai tyrimų rezultatai pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Chlorheksidino digliukonato 0,02 proc. ir 0,05 proc. tirpalo pirminio tyrimo rezultatai
CHD tirpalų koncentracija
Išvaizda pH reikšmės Chlorheksidino kiekis
Sterilumo testas
0,02 proc. Skaidrus,
bespalvis skystis 5,84 0,0201±0,0003 Sterilus
0,05 proc. Skaidrus,
bespalvis skystis 5,65 0,0508±0,0005 Sterilus
Iš 3 lentelės pateiktų duomenų matyti, kad chlorheksdino digliukonato kiekis neįtakoja preparatų pH reikšmėms. Visi tirpalai yra sterilūs, chlorheksidino kiekis preparate priklauso nuo gaminamo tirpalo koncentracijos. Parinkti kokybės parametrai leidžia įvertinti chlorheksidino digliukonato tirpalų kokybę.
4.2. Chlorheksidino digliukonato tirpalų testavimas po poveikio stresiniais faktoriais
Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad veikiant fiziniams, cheminiams faktoriams chlorheksidino molekulė yra nestabili ir susidaro priemaišos [13,16]. Todėl buvo atliktas tyrimas veikiant stresiniais faktoriais ir įvertintas chlorheksidino kiekio pokytis. Gal nėra aktualu tiriamiesiems preparatams, tačiau svarbu formuojant kitas vaisto formas su chlorheksidino medžiaga, pvz. kuriant puskietes vaisto formas svarbu įvertinti gelifikanto ar tirpiklio pH reikšmę, nes chlorheksidino molekulės stabilumas priklauso nuo pH reikšmės. Rekomenduojama prieš kuriant naujus produktus įvertinti sudėtinių medžiagų pH vertes, kas leis numatyti ilgesnį kuriamo produkto tinkamumo laiką.
4.2.1. Rūgščios terpės įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui
Vertintas chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumas rūgštinėjė terpėje (pH 2,7). Rūgštinės terpės poveikio tyrimas paruoštas kaip aprašyta sk. 3.4.1. Gauti rezultatai pateikti 6 pav.
6 pav. Chlorheksidino digliukonato kiekio kitimas parūgštintame tirpale
Chlorheksidino digliukonato kiekis po parūgštinimo skyrėsi nei prieš paveikus rūgštimi, tačiau skirtumas neviršijo ±7,5 proc. ribų, todėl galima daryti prielaidą, kad chlorheksidino molekulė išliko stabili, neatsirado priemaišų. Praėjus 24 val. nustatytas reikšmingas veikliosios medžiagos kiekio sumažėjimas, kuris viršijo ±7,5 proc. ribas (p<0,05). Chlorheksidino digliukonato kiekis po 24 val. pakito apie 16,34 proc. lyginant su pradine taško reikšme. Veikliosios medžiagos kiekio sumažėjimą patvirtino ir spektro pokytis (7 pav.).
Įtariant, kad per 24 val. vyko chlorheksidino skilimas ir susidarė priemaišos, parūgštinti tirpalai buvo tirti ESC metodu. Chlorheksidino digliukonato 0,02 proc. tirpalo chromatograma pateikta 8 pav.
8 pav. Parūgštinto chlorheksidino digliukonato tirpalo chromatograma po 24 val.
Remiantis moksline literatūra manome, jog 4-5 min. atsirado p-chlorfenilguanidinas (PCPG), 5-6 min chlorheksidinas, 9-10 min. p-chlorfenilkarbamidas (PCPU), 28-29 min. p-chloranilinas (PCA) [16].
4.2.2. Šarminės terpės įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui
Vertintas chlorheksidino digliukonato kiekis tirpaluose šarminėje terpėje kai tirpalų pH 9,7. Naudota metodika pateikta sk. 3.4.2. Gauti rezultatai pateikti 9 pav.
Chlorheksidino digliukonato kiekis šarminėje aplinkoje nereikšmingai pasikeitė lyginant su pradiniu tašku (p>0,05). Medžiagos kiekio kitimui įtakos neturėjo laikymo trukmė. Iškart pašarminus ir praėjus 24 val. tiriamosios medžiagos kiekio pokytis neįvyko. Kadangi chlorheksidino digliukonato kiekis reikšmingai nepakito, daroma išvada, kad chlorheksidino produktai yra stabilūs, neįvyko molekulės skilimas.
4.2.3. Šilumos įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui
Norint įvertinti šilumos įtaką chlorheksidino digliukonato kiekiui tiriamuosiuose tirpaluose, mėginiai buvo laikomi savaitę laiko klimatinėje kameroje, esant 70°C temperatūrai. Mėginiai buvo tiriami pradiniame taške, po dienos, po 3 dienų ir po savaitės. Naudota metodika pateikta sk. 3.4.3. Gauti rezultatai pateikti 10 pav.
10 pav. Chlorheksidino digliukonato kiekio kitimas tirpaluose, laikant 70°C temperatūroje
Laikant 70°C temperatūroje chlorheksidino digliukonato kiekis tirpale kito nežymiai (p>0,05). Praėjus 24 val. medžiagos kiekis nesumažėjo lyginant su pradiniu tašku. Nereikšmingas pokytis užregistruotas po trijų ir septynių laikymo dienų. Po trijų dienų medžiagos pokytis laikymo metu apie 0,5 proc., o po savaitės apie 2 proc. lyginant su pradine reikšme. Iš gautų rezultatų galima daryti išvadą, kad chlorheksidino digliukonato preparatai bent savaitę atsparūs 70°C temperatūrai. Tyrimo rezultatai patvirtino mokslinės literatūros duomenis, jog chlorheksidinas suskyla aukštesnėje nei 70°C temperatūroje [13].
4.2.4. Dienos šviesos įtaka chlorheksidino digliukonato tirpalų stabilumui
Chlorheksidino digliukonato tirpalai mėnesį laiko buvo laikomi dienos šviesoje natūraliomis sąlygomis. Tiriamosios medžiagos pokyčiai stebėti pradiniame taške, po trijų dienų, po savaitės ir po 4 savaičių. Naudota metodika pateikta sk. 3.4.4. Rezultatai pateikti 11 pav.
11 pav. Dienos šviesos įtaka chlorheksidino digliukonato kiekio pokyčiams
Vertinant dienos šviesos įtaką chlorheksidino digliukonato kiekiui tirpaluose statistiškai reikšmingo pokyčio (p>0,05) bei kitimo tendencijos nenustatyta. Po trijų dienų medžiagos kiekis nepakito, po septynių dienų sumažėjo apie 0,99 proc., po mėnesio vėl padidėjo apie 0,49 proc. lyginant su pradine reikšme (p>0,05). Tokį rezultatų išbarstymą gali sąlygoti skiedimo paklaida. Visais atvejais chlorheksidino digliukonato kiekis reikšmingai nepakito, neviršijo ±7,5 proc. ribos. Galima teigti, kad chlorheksidino digliukonato tirpalai nereikalauja specialių laikymo sąlygų ir ženklinime nereikia nurodyti ypatingų laikymo sąlygų.
4.2.5. Sterilizacijos įtaka vaistinės medžiagos kiekiui tiriamuosiuose tirpaluose
Buvo vertinta sterilizacijos įtaka pH reikšmėms bei vaistinės medžiagos kiekiui pagamintuose chlorheksidino digliukonato tirpaluose. Prieš sterilizaciją buvo tirtas kiekvienos pagamintos serijos vienas butelis, įvertinant kiekio bei pH reikšmių pokyčius. Gauti duomenys lyginti su sterilizuotų tiriamųjų tirpalų rezultatais (4 lentelė).
4 lentelė. Sterilizuotų ir nesterilizuotų chlorheksidino digliukonato tirpalų tyrimų rezultatai
Prieš sterilizaciją Po sterilizacijos
Tirpalų
koncentracija 0,02 proc. 0,05 proc. 0,02 proc. 0,05 proc.
Analizės metodas CHD kiekis±SD pH CHD kiekis±SD pH CHD kiekis±SD pH CHD kiekis±SD pH I serija 0,0201± 0,0001 5,96 0,0501± 0,0005 5,62 0,0201± 0,0003 5,84 0,0503± 0,0005 5,65 II serija 0,0201± 0,0001 5,85 0,0503± 0,0001 5,64 0,0202± 0,0001 5,96 0,0499± 0,0005 5,84 III serija 0,0201± 0,0001 6,07 0,0503± 0,0004 5,84 0,0203± 0,0001 6,01 0,0507± 0,0005 5,87 Serijų Nr. 0,02 proc.: I serija 2361409, II serija 2901410, III serija 3321411.
0,05 proc.: I serija 2251409, II serija 2931410, III serija 3641412.
Pateikti rezultatai patvirtino, kad sterilizacija neturi įtakos chlorheksidino digliukonato kiekiui pagamintuose tirpaluose. Taip pat pH reikšmių pokyčiai nėra reikšmingi tarp sterilizuotų ir nesterilizuotų tiriamųjų tirpalų. Gauti rezultatai rodo, kad technologija yra tinkama ir nereikalauja sterilios filtracijos.
4.3. Tiriamųjų tirpalų specifikacijos vystymas
Sukonstruota chlorheksidino digliukonato tirpalų specifikacija remiantis ICH Q6A gairėmis [34], Ph. Eur. 7.0th ed. [7] ir Britų Vol. III farmakopėja [38]. Svarbu parinkti ne tik kokybės rodiklius,
standartizavimo kriterijus, bet ir leistinas ribas. Šiai užduočiai atlikti vykdytas chlorheksidino digliukonato 0,02 proc. tirpalų kiekybinio nustatymo tyrimas (12 pav).
12 pav. Pirminio tyrimo chlorheksidino digliukonato 0,02 proc. tirpalo kiekybinio nustatymo rezultatai
Remiantis pateiktais tyrimo rezultatais parinktos veikliosios medžiagos leistinos ribos. Iš 12 pav. pateiktų duomenų matyti, kad chlorheksidino digliukonato kiekis visų matavimų metu neviršijo ±5 proc., t.y. buvo ribose 0,019 – 0,021 proc. Nurodyta riba taip pat atitinka Europos farmakopėjoje pateiktą ribą [7]. Dėl galimų degradacijos produktų, galiojimo pabaigoje pasirinkta ±7,5 proc. leistina riba.
Remiantis tyrimo rezultatais suformuluota produkto specifikacija (5 lentelė), pagal kurią vertinta chlorheksidino digliukonato tirpalų kokybė.
„Reikšmingas kokybinių rodiklių pasikeitimas“ 0,02 proc. ir 0,05 proc. chlorheksidino digliukonato preparatams nustatomas tada kai:
1) Kokybės rodikliai pakito 5 proc. ar 7,5 proc. nuo pradinės reikšmės; 2) Atsirado skilimo produktai;
3) Pasikeitė išvaizda, fizikinės savybės; 4) pH vertės neatitinka nustatytų ribų; 5) Iškrito nuosėdos [33].
5 lentelė. 0,02 proc. ir 0,05 proc. chlorheksidino digliukonato tirpalų pirminė ir galutinė specifikacija
Parametras Leistinos ribos Standartizavimo kriterijai Pagaminus tirpalą Galiojimo
pabaigoje Išvaizda
Skaidrus, bespalvis skystis. Vizualinis metodas
Identifikavimo testai
ESC Turi atitikti sulaikymo trukmę Ph.Eur. 2.2.29
Kiekybinė analizė Chlorheksidino kiekis 0,02 proc. 0,019-0,02-0,021 0,05 proc. 0,0475-0,05 – 0,0525 (95% – 105%) 0,02 proc. 0,0185-0,02-0,0215 0,05 proc. 0,046-0,05-0,05375 (92,5% – 107,5%) Ph.Eur. 2.2.25 Grynumo testas p-chloranilinas - ≤0,50% Ph. Eur. 2.2.29 pH 5,5 – 7,0 Ph. Eur 2.2.3 Mikrobiologinis užterštumas
Sterilumo testas Turi būti sterilus Ph. Eur. 2.6.1
Bendrieji testai vaisto formai
Tūrio vienodumas,
ml Ne mažiau kaip 500 ml
Gamintojo reikalavimai
4.4. Chlorheksidino digliukonato 0,02 proc. ir 0,05 proc. tirpalų stabilumo tyrimai
Stabilumo tyrimas atliktas ilgalaikio stabilumo tyrimo sąlygomis bei pagreitintomis stabilumo tyrimo sąlygomis. Stabilumo tyrimų metu gauti rezultatai lyginti su rodikliais, kurie nustatyti ruošiant chlorheksidino digliuokonato specifikaciją. Jei tyrimų rezultatai atitinka nustatytas ribas daroma išvada, kad chlorheksidino digliukonato tirpalai išlieka kokybiški ir bus saugūs vartojimui.
4.4.1. Ilgalaikis stabilumo tyrimas
Pagaminti chlorheksidino digliukonato tirpalai buvo laikomi klimatinėse kamerose. Sukurtos įprastinės laikymo sąlygos, t.y. 25±2°C temperatūra, esant 60±5 proc. santykinei drėgmei. Chlorheksidino
digliukonato kiekybinio nustatymo rezultatai pateikti 6-oje ir 7-oje lentelėse. III serijos tiriamųjų preparatų tyrimo rezultatai pateikti trijų mėnesių, nes po šešių mėnesių tyrimų terminas yra 2015.06.02.
6 lentelė. Chlorheksidino digliukonato 0,02 proc. tirpalų stabilumo rodikliai, laikant 25±2°C temperatūroje ir 60±5 proc. santykinei drėgmei
Matavimai Pradinis taškas Po 1 mėn. Po 3 mėn. Po 6 mėn. I serija
pH 5,84 5,98 6,23 6,21
Kiekis±SD 0,0201±0,0003 0,0203±0,0002 0,0201±0,0002 0,0169±0,0001
Sterilumo testas Sterilus - Sterilus -
II serija
pH 5,96 6,23 6,54 6,39
Kiekis±SD 0,0202±0,0001 0,0201±0,0004 0,0203±0,0003 0,0189±0,0006
Sterilumo testas Sterilus - Sterilus -
III serija
pH 6,01 6,35 6,4 -
Kiekis±SD 0,0203±0,0001 0,0200±0,0004 0,0202±0,0003 -
Sterilumo testas Sterilus - Sterilus -
7 lentelė. Chlorheksidino digliukonato 0,05 proc. tirpalų stabilumo rodikliai, laikant 25±2°C temperatūroje ir 60±5 proc. santykinei drėgmei
Matavimai Pradinis taškas Po 1 mėn. Po 3 mėn. Po 6 mėn. I serija
pH 5,65 6,25 6,26 6,31
Kiekis±SD 0,0508±0,0005 0,0506±0,0004 0,0501±0,0003 0,0428±0,0011
Sterilumo testas Sterilus - Sterilus -
II serija
pH 5,84 6,35 6,52 6,32
Kiekis±SD 0,0499±0,0005 0,0501±0,0006 0,0508±0,0009 0,0477±0,0012
Sterilumo testas Sterilus - Sterilus -
III serija
pH 5,87 6,24 6,88 -
Kiekis±SD 0,0507±0,0005 0,0505±0,0003 0,0505±0,0002 -
Sterilumo testas Sterilus - Sterilus -
Įvertinus tyrimų rezultatus per pirmuosius tris mėnesius abiejų koncentracijų tirpaluose nebuvo nustatyti reikšmingi išvaizdos, kiekio bei pH reikšmių pokyčiai ir išliko priimtinose ribose (p>0,05). Po šešių mėnesių I serijoje nustatytas statistiškai reikšmingas chlorheksidino kiekio sumažėjimas, kuris siekė apie 15,92 proc. nuo pradinio kiekio (p<0,05), nors išvaizda, pH reikšmės nepakito. II serijos chlorheksidino kiekio tyrimų rezultatai parodė pokytį (p<0,05), tačiau chlorheksidino kiekio sumažėjimas
neviršijo ±7,5 proc. ribų. III serijos tyrimų rezultatų nėra, nes ši serija buvo vėliau pagaminta ir tyrimo terminas yra 2015.06.02. Kadangi po šešių mėnesių tyrimų rezultatai nėra vienareikšmiai būtina ištirti III serijos tirpalus.
Europos farmakopėja nurodo, kad chlorheksidino digliukonato tirpalai didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymi kai pH reikšmės yra intervale nuo 5,5 iki 7,0 [7]. Iš gautų tyrimų duomenų matyti, jog LSMU Kauno klinikų vaistinėje pagamintų chlorheksidino digliukonato tirpalų pH reikšmės yra intervale nuo 6,02 iki 6,27, todėl galime daryti prielaidą, kad pagaminti tirpalai yra veiksmingi bent 6 mėnesius.
Iš lentelėse pateiktų rezultatų matome, kad chlorheksidino digliukonato preparatai pagaminus ir po trijų mėnesių išliko sterilūs, nei viename mėginyje neišaugo bakterijos, grybeliai, kas patvirtina preparato mikrobiologinį saugumą ir veiksmingumą naudojimui praėjus trims mėnesiams.
4.4.2. Pagreitintas chlorheksidino digliukonato stabilumo tyrimas
Vertinant chlorheksidino kiekius produktuose tiriamieji tirpalai buvo laikomi klimatinėje kameroje 40±2°C temperatūroje, esant 75±5% santykinei drėgmei. Tyrimas vykdyts 6 mėnesius. Tyrimų rezultatai pateikti 8-oje ir 9-oje lentelėse. III serijos tiriamųjų preparatų tyrimo rezultatai pateikti penkių mėnesių, nes po šešių mėnesių tyrimų terminas yra 2015.06.02.
