LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Kristina Mokijčiukaitė
Antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams avių
fermose Lietuvoje, naudojant in vitro (KNT) metodą
Anthelmintic resistance to benzimidazoles in sheep farms
in Lithuania using the in vitro EHT method
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas:
Prof. habil.dr. Saulius Petkevičius
2 DARBAS ATLIKTAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams avių fermose Lietuvoje, naudojant in vitro (KNT) metodą“.
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
Kristina Mokijčiukaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Kristina Mokijčiukaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
Saulius Petkevičius
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE Saulius Petkevičius
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1) Mindaugas Šarkūnas
2) Alvydas Malakauskas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 ĮVADAS ... 6 1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 81.1. Avių virškinamojo trakto parazitozės (nematodozės) ... 8
1.1.1. Chabertiozė ... 8 1.1.2. Ezofagostomozė... 9 1.1.3. Hemonchozė ... 10 1.1.4. Trichostrongiliozė ... 11 1.1.5. Koperiozė ... 12 1.1.6. Ostertagiozė ... 12 1.1.7. Nematodirozė... 13 1.1.8. Strongiloidozė ... 14 1.1.9. Trichurozė ... 15
1.2. Avių virškinamojo trakto nematodozių diagnostika ... 16
1.3. Avių virškinamojo trakto namatodozių gydymas ir profilaktika ... 17
1.4. Antihelmintinis rezistentiškumas ... 19
2.TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 20
2.1. Tyrimų metodika ... 20
2.1.1. Išmatų mėginių paėmimas ... 20
2.1.2. Modifikuotas Makmasterio metodas ... 21
2.1.3. Išmatų plovimas ir kiaušinėlių surinkimas ... 22
2.1.4. KNT – kiaušinėlių nėrimosi testas... 23
3.TYRIMO REZULTATAI ... 24
4.TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 29
IŠVADOS ... 30
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 31
PRIEDAI ... 36
Tyrimo duomenų blanko pavyzdys ... 36
4
SANTRAUKA
Antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams avių fermose Lietuvoje,
naudojant in vitro (KNT) metodą
Kristina Mokijčiukaitė
Magistro baigiamasis darbas
Tyrimo tikslas nustatyti antihelmintinį rezistentiškumą tiabendazoliui avių fermose Lietuvoje, naudojant in vitro metodą. 2014 metų kovo – lapkričio mėnesiais buvo ištirta 20 avių fermų, Vilniaus, Kauno ir Alytaus rajonuose. Pasirinktos tos avių fermos, kuriose pastaruosius 3-5 metus buvo atliekama profilaktinė ir/arba gydomoji dehelmintizacija benzimidazolų grupės antihelmintikais.
Tyrimo pradžioje, nustatant virškinamojo trakto nematodų kiaušinėlių invazijos intensyvumą, buvo naudojamas modifikuotas Makmasterio metodas. Tinkamos pagal kiaušinėlių skaičių avių grupės vėliau tirtos antihelmintinio rezistentiškumo nustatymo metodu in vitro kiaušinėlių nėrimosi testu (KNT). KNT buvo naudojamos skirtingos tiabendazolio koncentracijos ir stebima, kuriose koncentracijose išsivystė įvairios stadijos parazitų lervos ir koks neišsinėrusių lervų procentinis pasiskirstymas kiaušinėlių atžvilgiu.
Tyrimo metu nustatyta, kad 100 procentų tirtų avių fermų turėjo antihelmintinį rezistentiškumą (AR) tiabendazoliui. Rezultatai buvo analizuojami remiantis lervų išsinėrimo iš kiaušinėlių skaičiumi 0,1 μg/ml-1, MIK – mažiausia lervų išsivystymo koncentracija, pagal
rezistentiškumo intervalą ir rezistentiškumo statusą fermose, bei pagal papildomą vertinimo metodiką, naudojant kriterijus: ED50/ED99. ED – kai reikalinga preparato dozė sukelti efektą 50 arba
99 procentams parazitų populiacijos individų.
Dvejose fermose minimali koncentracija, kurioje išsivystė lervos, buvo 0,1 µg/ml-1, 7 fermose – 0,3 µg/ml-1, 3 – 0,5 µg/ml-1 ir 8 fermose – 1,0 µg/ml-1. Ištirta, kad daugumoje fermų pasireiškė
stiprus antihelmintinis rezistentiškumas, net naudojant didžiausią (1,0 µg/ml-1) tiabendazolio
koncentraciją.
Iš dvidešimties fermų, 3 fermose nustatytas labai žemas antihelmintinis rezistentiškumas (AR) (< 10 proc.), 4 fermose – žemas (10 – 20 proc.), 4 fermose – vidutinis (20 – 40 proc.) ir net 9 fermose aukštas AR (> 40 proc.).
5
SUMMARY
Anthelmintic resistance to benzimidazoles in sheep farms in Lithuania using the
in vitro EHT method
Kristina Mokijčiukaitė
Master‘s thesis
Anthelmintic resistance to thiabendazole in sheep farms in Lithuania using the in vitro EHT method was investigated. From March to November 2014 twenty sheep farms, from districts of Vilnius, Kaunas and Alytus were investigated. Only sheep farms where preventive de-worming or therapeutic de-worming with benzimidazoles was performed during the last 3-5 years where included into the study.
The amount of gastrointestinal nematode eggs was determined by modified McMaster technique with sensivity of 20 eggs/gram faeces. To determine anthelmintic resistance (AR) sheep groups with positive nematode eggs counts were investigated using in vitro method egg hatch test (EHT). Different concentrations of thiabendazole were used for EHT. The concentrations of thiabendazole in which various stages of larvae hatched and percentage of distribution of unhatched eggs were estimated.
In 100% of investigated farms the AR to thiabendazole was detected. Results were interpreted on the basis of number of hatched eggs in 0.1 μg/ml-1, the MIC - minimum inhibitory concentration
resistance interval and resistance status in farms. In addition, the method by using a criteria: ED50/ED99. ED was used. ED is efficiency dose, which have 50 or 99 % efficienty on the population
of parasites.
In two farms the minimum inhibitory concentration in which larvae hatched from eggs was 0.1 µg/ml-1, in 7 farms - 0.3 µg/ml-1, in 3 - 0.5 µg/ml-1 and in 8 farms - 1.0 µg/ml-1, respectively. The results showed that in majority of farms AR was estimated using the highest (1.0 µg/ml-1) concentration of thiabendazole. It was shown that from 20 farms - in 3 farms AR status was very low (< 10%), in 4 farms - low (10 - 20%), in 4 farms - medium (20 - 40%) and in 9 farms - high (> 40%), respectively.
6
ĮVADAS
Avininkystė – viena populiariausių, globaliai paplitusių gyvulininkystės šakų. Šiuo metu pasaulyje yra daugiau nei vienas milijardas avių. Avininkystė labai populiari Kinijoje, kur auginamas didžiausias avių skaičius pasaulyje. Taip pat tai yra viena iš pagrindinių gyvulininkystės šakų Indijoje, Australijoje, Šiaurės Afrikoje, Naujojoje Zelandijoje, Jungtinėje Karalystėje, Turkijoje, Ispanijoje. Remiantis Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro duomenimis Lietuvoje avininkystė sparčiai populiarėja.
Avių laikytojų ir pačių avių skaičius per pastaruosius kelis metus ženkliai augo, net 7-9 procentais per metus. 2012 metais avių augintojų skaičius Lietuvoje siekė 4959, o avių – 68543 (1), o 2014 - 2015 metų laikotarpyje įregistruotų avių skaičius sudarė 135 164 vienetų. Per metus avių skaičius padidėjo 33,33 procentais, o avių laikytojų tuo metu buvo įregistruota 9,197 (2).
Avys dažniausiai yra auginamos dėl vilnos, kailio, mėsos ir pieno. Didėjant avių skaičiui, didėja rizika ir įvairių infekcinių bei invazinių ligų plitimui. Avių virškinamojo trakto parazitozės yra viena iš problemų, sukeliančių nemažus ekonominius nuostolius. Virškinamojo trakto parazitozės dažniausiai pasireiškia subklinikinėmis formomis, ko pasekoje gyvuliai liesėja, mažėja priesvoriai ir pieno primilžis, prastėja vilnos kokybė. Pavieniais atvejais virškinamojo trakto parazitozės gali komplikuotis smarkia diarėja, virškinamojo trakto patologijomis, apatija, anemija ir gaišimu (3).
Norint, kad avininkystė Lietuvoje ir toliau augtų, o avys būtų sveikos, reikėtų atkreipti dėmesį į avių virškinamojo trakto parazitozių kontrolę, tinkamą antihelmintikų naudojimą ir gydymo schemų parinkimą (4).
Antihelmintinis rezistentiškumas (AR) yra viena iš pagrindinių, globaliai paplitusių problemų avininkystės sektoriuje. Lietuvoje atlikti tyrimai parodė, kad su šia problema jau yra susiduriama ir pas mus. Globaliniu požiūriu kai kur šalyse, tokiose kaip Australija, Naujoji Zelandija – AR yra pasiekęs kritinę ribą, kur problemą gali išspręsti tik naujai sukurti antihelmintikai (5).
Darbo tikslas: Nustatyti antihelmintinį rezistentiškumą benzimidazolams avių fermose Lietuvoje, naudojant in vitro (KNT) metodą.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti antihelmintinį rezistentiškumą tiabendazoliui avių fermose, naudojant in vitro KNT metodą.
7 2. Palyginti antihelmintinio rezistentiškumo benzimidazolams paplitimą, naudojant dvi skirtingas KNT vertinimo metodikas: pagal išsinėrusių lervų skaičių 0,1 µg/ml-1
koncentracijoje ir pagal ED50/ED99.
3. Išanalizuoti gautus tyrimo rezultatus ir nustatyti avių parazitų AR lygį Lietuvoje. 4. Palyginti gautus tyrimo rezultatus Lietuvoje su situacija užsienio šalyse.
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 . Avių virškinamojo trakto parazitozės (nematodozės)
Pasaulyje avių virškinamojo trakto parazitai yra plačiai paplitę. Dažniausiai susiduriama su apvaliosiomis kirmėlėmis – tai nematodai, kurie parazituoja avių šliuže ir plonosiose žarnose (3). Avys užsikrečia šiais virškinamojo trakto parazitais: dažniausiai Telodorsagia (Ostertagia)
circumcincta, Haemonchus contortus, Trychostrongylus colubriformis (4), rečiau Chabertia ovina, Oesophagostomum columbianum ir Oesophagostomum venulosum, Cooperia pectinata, Cooperia surnabada, Nematodirus battus, Nematodirus filicolis, Strongyloides papillosus ir Trichuris ovis.
1.1.1. Chabertiozė
Chabertia ovina – avių ir kitų atrajotojų gaubtinėje žarnoje parazituojantis nematodas.
Suaugusios patelės būna 1,7-2,0 cm ilgio, o patinėliai 1,2-1,4 cm ilgio (6). Kiaušinėliai būna 90-105 μm ilgio, 50-55 μm pločio. Šiems nematodams būdingas tiesioginis vystymosi ciklas, be tarpinių šeimininkų. L3 stadijos lervos prasiskverbia į plonosios žarnos gleivinę, o po savaitės išsinėrusios į
L4 stadijos lervos, migruoja į akląją žarną. Per 25 dienas po užsikrėtimo tampa nesubrendusiais
helmintais. Subręsta, nukeliavę į gaubtinę žarną. Inkubacinis laikotarpis trunka apie 50 dienų (7). Suaugę helmintai prisitvirtina prie žarnų gleivinės ir tai įtakoja taškinių kraujosrūvų susidarymą, baltymų netekimą ir žarnyno edemą (1 pav.).
1 pav. Gaubtinė žarna su prisitvirtinusiais nematodais Chabertia ovina (8).
Užsikrėtus šiais parazitais išmatos būna skystos, su gleivėmis ar netgi krauju (6).
Vidutinio klimato zonoje L3 stadijos lervos per žiemą gyvena aplinkoje. Šeimininko organizme per
žiemą lervos gali būti hipobiozės būsenos. Europoje buvo užregistruota keletas ožkų ir avių chabertiozės protrūkių (9).
9 1.1.2. Ezofagostomozė
Tai gaubtinėje ir aklojoje žarnose parazituojantis ir jų sienelėse mazgelius formuojantis nematodas. Avių žarnose parazituoja Oesophagostomum columbianum ir O. venulosum. Tai baltos spalvos helmintai, suaugusių ilgis gali siekti 1,4-2,2 cm, kiaušinėlių viduje būna 16-32 blastomeros (5).
Oesophagostomum spp. helmintams būdingas tiesioginis nemigracinis vystymosi ciklas.
Gyvuliui prarijus Oesophagostomum spp. L3 stadijos invazines lervas, jos per virškinamąjį traktą
pasiekia storąsias žarnas, kur prasiskverbia į aklosios arba gaubtinės žarnos sienelę ir toliau vystosi gleivinėje. Žarnų gleivinėje formuoja mazgelius, kuriuose neriasi iki L4 stadijos lervos (2 pav.).
2 pav. Dalis storosios žarnos su Oesophagostomum nematodų sudarytais mazgeliais (10).
Iš mazgelių į žarnų spindį lervos išeina apie 7-10 dieną po invazinių lervų patekimo į virškinamąjį traktą. Jos migruoja į gaubtinę žarną ir ten subręsta. Inkubacinis laikotarpis trunka 40 - 45 dienas.
Pakartotinai užsikrėtus, lervos gali tapti hipobiozės būklės ir L4 stadijoje išbūti iki 1 metų (9).
Parazitų suformuoti mazgeliai (histologiškai – eozinofilinė granulioma) gali būti 0,5-1,0 cm skersmens ir taip pat aptinkami plaučiuose, kepenyse, žarnų pasaite ir jo limfiniuose mazguose. Stipri infekcija gali sukelti viduriavimą, išsekimą, sustingusią eiseną, invaginaciją, avys gali gaišti (6).
Oesophagostomum spp. yra paplitęs visame pasaulyje ir tarp daugybės gyvūnų, įskaitant
smulkius atrajotojus, kiaules, primatus, žmones ir graužikus. Oesophagostomum spp. užsikrėtimas susijęs su žemu imunitetu. Vyresni gyvuliai dėl pirminio užsikrėtimo įgyja pakankamai tvirtą imunitetą kai kurioms rūšims. Daugiausiai problemų kyla jauniems ėriukams ir veršeliams, kurie
10 dar nespėjo įgyti imuniteto. Avys Oe. columbianum imuniteto neįgyja. Dažniausiai užsikrečia oraliniu būdu. Taip pat invazines lervas mechaniškai gali pernešti ir musės. Paprastai ezofagostomų lervos aplinkoje išgyvena apie 3 mėnesius, tačiau esant palankioms sąlygoms gali išgyventi metus ir ilgiau (9).
1.1.3. Hemonchozė
Šią helmintozę sukelia kraujasiurbiai nematodai Haemonchus contortus, H. placei ir H.
similis, kurie parazituoja avių ir kitų atrajotojų šliuže (3 pav.).
3 pav. Suaugę H. cortortus helmintai avių šliuže (11).
Haemonchus contortus patelės yra labai vislios, per dieną padeda tūkstančius kiaušinėlių, iš kurių išsiritusios lervos fermose gali sukelti hemonchozės protrūkius. Suaugusios patelės būna 1,8-3,0 cm ilgio, patinėliai 1,0-2,0 cm ilgio (6).
Šiems nematodams būdingas tiesioginis vystymasis, be tarpinių šeiminkų. Avys praryja L3
stadijos lervas, kurios keliauja į šliužą, ten prisitvirtina ir neriasi du kartus. Prisitvirtindami prie gleivinės ją prarėžia ir maitinasi krauju (12). Inkubacinis periodas trunka 18-21 dieną (13).
Haemonchus spp. nematodai avims sukelia anemiją, hipoproteinemiją, kuri pasireiškia
pažandžių edema (6), silpnumą, suprastėjusią vilnos kokybę, svorio netekimą ir gaišimą (13). Hemonchoze dažniausiai sergama tuose regionuose, kuriuose šiltas ir drėgnas klimatas, nes yra palankios sąlygos vystytis šiems parazitams. Tai viena rimčiausių parazitozių, sukeliančių
11 Nustatyta, kad imliausi šiai ligai yra jaunikliai, suaugusios avys ne tokios imlios. Didžiausias užsikrėtimas vyksta pavasarį ir vasarą, kuomet gyvuliai ganosi ganyklose, žiemą užsikrėtimas mažiausias. Dauguma lervų tampa hipobiozės būsenos ankstyvoje L4 stadijoje, toliau vystymasis
prasideda kitą pavasarį (14). Lietingomis vasaromis žolės užterštumas invazinėmis lervomis itin padidėja (6).
1.1.4. Trichostrongiliozė
Avys dažniausiai užsikrečia Trichostrongylus axei ir T. colubriformis, kurie parazituoja atrajotojų šliuže. Suaugę nematodai yra labai maži, patelės 0,5-0,8 cm ilgio, o patinėliai 0,4-0,7 cm ilgio, siūlo pavidalo, rusvos spalvos (6). Šiems nematodams būdingas tiesioginis vystymosi ciklas. Palankiomis sąlygomis invazinės L3 stadijos lervos vystosi per 10-12 dienų šliuže ar plonojoje
žarnoje (13) (4 pav.).
4 pav. T. axei L3 stadijos lervos mikroskopinis vaizdas (15).
Esant stipriam užsikrėtimui, suaugę jauni helmintai migruodami dvylikapiršte žarna sukelia jos gleivinės pažeidimus, kraujavimą, enteritą su vandeningu viduriavimu, edemą, hipoalbuminemiją ir hipoproteinemiją. Nedidelio užsikrėtimo atveju klinikinių simptomų gali nebūti, arba jie būna nežymūs ir panašūs į požymius, kurie kyla dėl prastos mitybos ar kitų virškinamojo trakto infekcijų (13).
Nustatyta, kad metuose yra du periodai, kurių metu nustatomas didžiausias užsikrėtimas nematodais. Nuo sausio mėnesio po truputį didėjant užsikrėtimui, gegužės – birželio mėnesiais nustatytas pirmasis užsikrėtimo padidėjimas, kuomet užsikrečia ėriukai ir suaugusios avys. Antrasis
12 užsikrėtimo padidėjimas fiksuojamas rudens pabaigoje, lapkritį – gruodį, kai parazitais užsikrečia suaugusios avys (16).
1.1.5. Koperiozė
Cooperia spp. yra nedideli rausvos spalvos nematodai, parazituojantys atrajotojų plonojoje
žarnoje ir užaugantys iki 1,0 cm ilgio (patinėliai 0,6-1,0 cm, o patelės 0,5-0,9 cm ilgio) (6). Avys gali užsikrėsti Cooperia pectinata, C. surnabada ir C. Curticei. Vystymasis - tiesioginis, panašus į daugelio kitų trichostrongilidų (ostertagijų, trichostrongilų), inkubacinis periodas trunka 12-15 dienų (17).
Cooperia spp. nematodai yra plačiai paplitę pasaulyje, tačiau tai dažniausiai sporadinius ir
nepatogeninius ligos atvejus sukeliantys parazitai. Pagrindiniai avių užsikrėtimo požymiai yra gastroenteritas, kuris pasireiškia vandeningu viduriavimu, apetito nebuvimu, svorio netekimu (6).
Per žiemą koperijų lervos būna hipobiozės būklėje L4 stadijoje. Pavasarį - vasarą invazijos su
sunkia klinika dažniausiai pasireiškia ėriukams, o suaugusios avys, turinčios gerą imunitetą, serga subklinikine ligos forma, su išmatomis reguliariai išskirdamos nedidelį kiekį šio parazito kiaušinėlių (17).
1.1.6. Ostertagiozė
Ostertagijos - tai šliuže parazituojantys, ploni, rausvai rudos spalvos helmintai. Suaugusios patelės užauga iki 0,8-1,2 cm ilgio, patinėliai iki 0,7-0,9 cm ilgio. Avių organizme parazituoja O.
circumcincta ir O. trifurcata (6).
Šiems nematodams būdingas tiesioginis vystymosi ciklas. Kiaušinėliams su išmatomis patekus į aplinką, per dvi savaites iš kiaušinėlio išsivystos invazinė L3 stadijos lerva, kuri migruoja
ant žolės. Invazinėms lervoms patekus į avių organizmą, jos prasiskverbia į virškinimo liaukas ir ten neriasi iki L4 stadijos. Praėjus 18 dienų nuo užsikrėtimo, lervos išlenda iš liaukų, neriasi iki L5
stadijos. Lytiškai subrendę prisitvirtina prie šliužo gleivinės (9).
Pradžioje L4 stadijos lervos sukelia minimalią audinio reakciją ir klinikinius požymius.
Vėliau išsivysto skrandžio liaukų hiperplazija, šliužo uždegimas (5 pav.), sutrinka baltymų apykaita, avys viduriuoja, netenka svorio, sumažėja produktyvumas, o esant stipriai invazijai, gaišta (6)
13 .
5 pav. Šliužo uždegimas sukeltas Ostertagia nematodų (18).
Šių parazitų patelės nėra tokios vislios, kaip H. contortus, jos padeda po 100-200 kiaušinėlių per parą. Ostertagiozė pasaulyje paplitusi tuose regionuose, kur yra drėgnesnis bei vėsesnis klimatas. Rudenį į virškinimo traktą patekę invazinės lervos nustoja vystytis ir pereina į hipobiozės būklę ankstyvojoje L4 stadijoje, toliau vystymasis prasideda tik ankstyvą pavasarį. Daugelis Ostertagia spp. L3 stadijos lervų nepatekusių į virškinimo traktą, peržiemoja ganyklose ir tampa
užsikrėtimo šaltiniu kitą pavasarį ganomiems gyvuliams (6).
1.1.7. Nematodirozė
Nematodirus battus, N. filicolis ir N. spathiger – tai nematodai, kurie parazituoja avių
plonojoje žarnoje. Jie yra balsvos spalvos, palyginus su kitais trichostrongilidais, ilgi, patelės užauga iki 1,2-1,8 cm ilgio, patinėliai – 1,0-1,7 cm ilgio. Kiaušinėliai būna 160-230 μm ilgio, 85-120 μm pločio, verpstės formos su stambiomis blastomeromis viduje (6) (6 pav.).
14 Šių nematodų lervos iki invazinės L3 stadijos vystosi kiaušinėlyje, o nėrimasis iš kiaušinėlio
priklauso nuo aplinkos veiksnių. Nematodirus battus kiaušinėlius pirmiau turi paveikti žema temperatūra ir tik po to, pakilus temperatūrai, iš jų išsineria lervos (20).
Šie nematodai nėra patogeniški suaugusioms avims ir užsikrėtus retai pasireiškia klinikiniai požymiai, tačiau jauniems ėriukams jie yra ypač pavojingi (6).
Ėriukai užsikrečia būdami 4-12 savaičių amžiaus, dažniausiai balandžio – gegužės mėnesiais, bet gali ir kitu metu. Ligos požymiai: nuleista galva ir ausys, apetito nebuvimas, viduriavimas ir svorio netekimas. Dėl dehidratacijos gali pasireikšti troškulys, todėl ėriukai ieško vandens.
Nematodirus lervos pažeidžia klubinės žarnos gleivinę, esant stipriai infekcijai ėriukai gali gaišti
(21).
1.1.8. Strongiloidozė
Šią helmintozę sukelia atrajotojų plonojoje žarnoje parazituojantis Strongyloides papillosus. Dažniausiai serga jauni gyvuliai, tačiau rimtų patologijų nesukelia. Suaugę helmintai yra labai maži 0,3-0,6 cm ilgio (6).
Skiriamas parazitinis ir laisvai gyvenančios kartos vystymosi ciklas. Aplinkoje iš partogenezės būdu išskirtų kiaušinėlių, išsineria lervos, vadinamos rabditinėmis. Jos aplinkoje neriasi keturis kartus ir gali tapti laisvai gyvenančios kartos individais. Tam tikromis aplinkybėmis, rabditinės lervos neriasi du kartus ir tampa invazinėmis. Patekusios į virškinimo traktą arba prasiskverbusios per odą, venomis jos migruoja į plaučius. Patekusios į trachėją, atkosimos ir nurytos patenka į plonąjį žarnyną, ten subręsta. Inkubacinis laikotarpis trunka 8-14 dienų (22).
Strongyloides papillosus galima užsikrėsti per odą, per burną ar su motinos pienu.
Prasiskverbusios subkutaniniu būdu, lervos gali sukelti eriteminę odos reakciją. Taip pat ėriukams pasireiškia klinikiniai požymiai kaip anemija, viduriavimas, svorio netekimas, nuovargis, šlubavimas, dusulys (dėl lervų migracijos per plaučius) (6).
Tam, kad galėtų vystytis, šiems nematodams reikalingas drėgnas ir, skirtingai nei ostertagijoms, šiltas klimatas. Invazinės lervos mūsų klimato zonoje gali peržiemoti ir kitą pavasarį tapti užsikrėtimo šaltiniu. Rudenį invazinės lervos (L3 stadijos) patekę į virškinimo traktą tampa
15 1.1.9. Trichurozė
Šią parazitozę sukelia aklojoje ir gaubtinėje žarnoje parazituojantys Trichuris ovis, rečiau T.
skrajabini nematodai. Šie parazitai dėl būdingos išvaizdos dar vadinami plaukagalviais. Suaugę
helmintai yra labai ilgi, 4,0-8,0 cm ilgio, kiaušinėliai būna gelsvai rudos spalvos, citrinos formos, su kamšteliais abiejuose galuose. Subrendę Trichuris ovis nematodai prisitvirtina prie žarnų sienelės ir maitinasi krauju, gleivių polisacharidais ir baltymais (17) (7 pav.).
7 pav. T. ovis nematodai prisitvirtinę prie žarnos sienelės (23).
Vystymasis yra tiesioginis, be tarpinių šeimininkų. Dažniausiai užsikrėtimais šiais helmintais būna besimptomis, tačiau esant stipriai invazijai išsivysto aklosios žarnos difterinis uždegimas, pasireiškia viduriavimas. Trichurių kiaušinėliai aplinkoje gali išlikti gyvybingi iki 4 metų (6).
16
1.2. Avių virškinamojo trakto nematodozių diagnostika
Dauguma avių virškinamojo trakto namatodų kontrolės programų yra paremtos kokybiniu ir kiekybiniu parazitozių diagnozavimu. Diagnostikos dėka galima nustatyti antihelmintinio gydymo programų veiksmingumą, atrinkti avių veisles, kurios labiau atsparios tam tikriems parazitams (24).
Dažniausiai naudojamas avių parazitinių susirgimų diagnozavimo metodas yra koproskopinis – parazitų kiaušinėlių skaičiavimas (24). Helmintų lervoms ir kiaušinėliams diagnozuoti taikoma rutininė helmintų kontrolė. Dažniausiai koproskopiniams tyrimams naudojamas kiaušinėlių flotacijos metodas. Modifikuotas Makmasterio metodas padeda nustatyti ne tik parazituojančių helmintų rūšį, bet ir invazijos intensyvumą, t.y. tikslų parazitų kiaušinėlių skaičių grame išmatų (25).
Naudojami ir kiti parazitų diagnozavimo metodai: pagal klinikinius požymius - kai netekus daug kraujo ir pasireiškus anemijai galima intensyvi Hemonchus contortus invazija. Tiksliai diagnozei nustatyti reikia atlikti papildomus tyrimus. Tam naudojamas FAMACHA metodas, kai pagal gleivinės anemijos lygį nustatomas užsikrėtimas hemonchoze (26). Apie užsikrėtimą virškinamojo trakto parazitais taip pat galima spręsti ir iš kraujo morfologinio tyrimo, kadangi parazitų invazijos atvejais išsivysto intensyvi eozinofilija (27). Taip pat naudojami modernūs tyrimo metodai. Tokie kaip fluorescencija, kai yra naudojami fluosrescuojantys lektinai, kurie skirtingai jungiasi prie skirtingų rūšių nematodų kiaušinėlių bei imunologinė diagnostika – imunofermentinė analizė (ELISA) (25).
Daugelio atrajotojų virškinimo trakte parazituojančių nematodų kiaušinėliai yra panašūs, išskyrus Nematodirus spp. ir Strongyloides spp. Kiaušinėlius, todėl juos atskirti galima tik turint pakankamai įgūdžių. Kiaušinėlių rūšį lengviau ir tiksliau galima nustatyti iš jų išauginus invazinių L3 stadijos lervų, kurias nesunku atskirti pagal būdingus morfologinius požymius. Joms išauginti
ruošiamos lervų kultūros (28).
Atliekant koproskopinius tyrimus svarbu teisingai surinkti ir iki tyrimo išlaikyti išmatų mėginius. Kad iš kiaušinėlių nesivystytų lervos ir nebūtų gaunami klaidingai neigiami rezultatai, išmatų mėginiai iki 3 dienų gali būti laikomi +4°C temperatūroje. (29).
17
1.3. Avių virškinamojo trakto namatodozių gydymas ir profilaktika
Avių virškinamojo trakto parazitų neišvengiamai daugėja, todėl kuriamos jų kontrolės strategijos, į kurias įeina antihelmintikai bei kiti parazitus veikiantys veiksniai, kaip klimato atšilimas, mažesnis gyvulių tankis ganykloje arba fermoje. Teisingas ir savalaikis antihelmintikų naudojimas iki šiol yra pagrindinė priemonė padedanti išvengti parazitozių sukeliamų ekonominių nuostolių ir užtikrinančių gyvulininkystės produkcijos kokybę (30).
Tiek medicinoje, tiek veterinarijoje istoriškai yra taip susiklostę, kad pagrindinis dėmesys visada buvo skiriamas antibiotikų kūrimui ir panaudojimui, tuo tarpu antiparazitiniams vaistams buvo skiriamas gerokai mažesnis dėmesys. Paskutiniu metu antiparazitinių preparatų, kurie veikia efektyviai, kuriama vis daugiau. Optimaliam parazitinių ligų gydymui vaistai turi būti lengvai dozuojami, naudojami, saugūs, pakankamai nebrangūs ir, svarbiausia, efektyvūs (31).
Daugelis cheminių junginių ir augalų metabolitų yra toksiški nematodams. Kai kurie anksčiau naudoti preparatai, tokie kaip natrio arsenitas, tetrachloretilenas, anglies tetrachloridas, anglies bisulfidas, vario sulfatas ir nikotino sulfatas, toksiški ne tik parazitams, bet ir avims. Iš antihelmintinių preparatų anksčiausiai buvo atrastas fenotiazinas, vėliau benzimidazolai (tiabendazolis), imidazotiazoliai (levamizolis), makrocikliniai laktonai (ivermektinas, doramektinas), monepantelis, klozantelis, kurie naudojami ir dabar. Antihelmintikų poveikis skiriasi priklausomai nuo jų sudedamųjų dalių (30).
Benzimidazolai - tai plataus spektro antihelmintikai, kaip rodo pavadinimas, jie susideda iš imidazolo ir benzeno žiedų (31). Veikia tiek suaugusius helmintus, tiek lervas. Benzimidazolams būdingos labai įvairios biologinės savybės (31). Jie slopina nematodų gliukozės įsisavinimą ir šie gaišta nuo bado. Kitas benzimidazolų poveikis yra ovocidinis - jie slopina nematodų kiaušinėlių vystymąsi. Dauguma benzimidazolų blogai tirpsta vandenyje, todėl yra duodami per burną suspensijos, pastos arba boliuso pavidalu (33). Naudojami tiabendazolis, fenbendazolis, albendazolis ir kiti (17).
Imidazotiazoliai - priklauso levamizolis ir tetrahidropirimidinai – pirantelis ir morantelis veikia parazitų nervinius ganglijus taip sukeldami jų paralyžių. Gerai veikia suaugusius helmintus, tačiau silpnai nesubrendusius parazitus. Kai kuriose šalyse levamizolis uždraustas, nes nustatytas toksiškumas gyvuliams ir labai mažas skirtumas tarp efektyvios ir toksiškos dozės. Taip pat yra žinoma, kad levamizolis pasižymi imunostimuliaciniu poveikiu bei yra naudojamas žmonių medicinoje, kaip priemonė imuniniam atsakui gerinti gydant kai kurių rūšių onkologinius susirgimus (17).
Makrocikliniai laktonai – jie apima avermektinus (ivermektinas, doramektinas). Šie junginiai gaunami iš Streptomyces genties bakterijų. Jų veikimo spektras labai platus, nes veikia ne tik
18 nematodus, bet ir ektoparazitus (erkes, blusas) (17). Makrocikliniai laktonai susiję su parazitų membranų pralaidumo padidėjimu, kas sąlygoja jų raumenų paralyžių (30). Suleidus šiuos preparatus jie lokalizuojasi riebiajame audinyje ir po truputį išsiskiria taip neigiamai veikdami parazitus (17).
Pagal antihelmintikų rūšį vaistai gali būti švirkščiami po oda, į raumenis arba suduodami per oraliai. Girdomi vaistai yra efektyvesni, nes turi tiesioginį kontaktą su virškinamjo trakto parazitais ir iš karto pradeda veikti. Siekiant pagerinti preparato antihelmintinį poveikį, labai naudingas yra gyvulio trumpalaikis (iki 24h) badavimas. Leidžiami vaistai pradeda veikti po ilgesnio laiko tarpo, tad dėl prailginto subterapinio veikimo gali išsivystyti antihelmintinis rezistentiškumas (17).
Pagrindinis avių parazitų kontrolės principas yra visiškai sunaikinti parazitus arba sumažinti užsikrėtimą iki minimumo, o tai galima pasiekti laikantis kelių taisyklių. Pirmiausiai reikėtų kontroliuoti gyvūnų tankį fermose ir taip išvengti didesnio avių kontakto su ganykloje esančiomis išmatomis. Laikant ir veisiant avis, svarbu, kad būtų sudarytos ir atskirtos tam tikro amžiaus avių grupės. Taip pat labai svarbus yra avių šėrimo plano/schemos sudarymas ir saugių ganyklų naudojimas parazitų atžvilgiu. Gyvuliai neturėtų būti šeriami nuo žemės ar girdomi nešvariu vandeniu, nes tai sukelia didelę riziką avių užsikrėtimui parazitais. Profilaktiškai reiktų naudoti periodišką dehelmintizaciją, o esant palankioms parazitų vystymosi sąlygoms atlikti strateginę dehelmintizaciją (34).
Norint efektyviai vykdyti parazitų kontrolę, labai svarbu turėti pakankamai žinių apie parazitus, jų biologiją ir epidemiologiją. Taip pat nuolat tobulinti bandos struktūrą ir valdymą (34).
19
1.4. Antihelmintinis rezistentiškumas
Dėl globalinio atšilimo didėja avių užsikrėtimas virškinamojo trakto parazitais. To pasekoje pasaulyje daugėja ir parazitų, turinčių rezistentiškumo genų vienam ar net keliems antihelmintiniams preparatams, kurių poveikis yra silpnas arba visiškai neefektyvus. Smulkių atrajotojų virškinamojo trakto nematodų rezistentiškumas antihelmintiniams vaistams, pasaulyje tapo rimta problema (5,35). Remiantis moksliniais tyrimais antihelmintinis rezistentiškumas pasiekė tokį lygį, kad kai kuriose šalyse buvo nustatytas multirezistentiškumas (atsparumos kelioms antihelmintikų klasėms) (5,36).
Ypač dažnai multirezistentiškumas pasireiškia ten, kur labai išvystyta smulkių atrajotojų industrija: tokiuose žemynuose kaip Australija, Pietų Afrika ir Pietų Amerika (37). Pirmasis pranešimas apie antihelmintinį rezistentiškumą benzimidazolams avių fermoje Australijoje užfiksuotas 1979 metais ir vėliau per sekančius 20 metų AR atvejų skaičius didėjo geometrine progresija (38). Situacija Europoje taip pat panaši, apie avių AR paplitimą buvo pranešta Slovakijoje (39), Ispanijoje (40), Italijoje (41), Graikijoje (41), Jungtinėje Karalystėje (42), Olandijoje ir kitose Europos šalyse (43,44).
FAO (Pasaulinė Maisto ir Žemės Ūkio organizacija) pripažino AR globaline problema ir finansavo plačius tyrimus, kurie buvo atliekami visame pasaulyje, ypač P. Amerikoje (Argentinoje, Brazilijoje Paragvajuje ir Urugvajuje), kur yra labai palankios klimato sąlygos vystytis parazitams, o avių pramonė yra viena iš pagrindinių gyvulininkystės šakų (35).
Lietuvoje atlikti in vivo tyrimai parodė, kad antihelmintinio rezistentiškumo problema avių ūkiuose taip pat egsistuoja (45). Pagrindinės priežastys rezistentiškumui vystytis yra per intensyvus antihelmintikų naudojimas, netikslus jų dozavimas, taip pat to paties antihelmintiko naudojimas daugelį metų iš eilės, neatsižvelgiant į užsikrėtimo lygį, paplitimą ir parazitų rūšį (41,44).
Dažniausiai avių fermose antihelmintinis rezistentiškumas nustatomas benzimidazolams, makrocikliniams laktonams ir imidazotiazoliams (41,44). Benzimidazolai (tiabendazolis) JAV buvo naudojami dar tik trejus metus, kai 1964 metais buvo pranešta apie helmintų rezistentiškumą šiam vaistui. Vėliau JAV buvo nustatyta, kad 90-100 procentų avių fermų nematodai yra rezistentiški benzimidazolams, o 20-40 procentų fermų - levamizolui (46).
Antihelmintinį rezistentiškumą galima nustatyti in vivo ir in vitro metodais. Plačiausiai naudojamas in vivo kiaušinėlių sumažėjimo testas (FECRT), pasiūlytas Pasaulio veterinarinės parazitologijos asociacijos (WAAVP) (43). Tam, kad sumažinti antihelmintinio rezistentiškumo problemą ir užsikrėtimo intensyvumą virškinamojo trakto parazitais, reikėtų laikytis tam tikrų gydymo schemų, teisingai parenkant ir skiriant antihelmintinius preparatus (47,48).
20
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Antihelmintinio rezistentiškumo paplitimo benzimidazolams avių fermose Lietuvoje tyrimas buvo atliktas 2014 metų kovo – lapkričio mėnesiais. Buvo tiriama 20 fermų, esančių Vilniaus, Kauno ir Alytaus rajonuose. Į tyrimą buvo įtrauktos tik tos avių fermos, kuriose per pastaruosius 3-5 metus buvo atliekama profilaktinė ir/arba gydomoji dehelmintizacija benzimidazolių grupės antihelmintikais. Fermose buvo laikoma vidutiniškai 40-1000 avių, daugiausiai Lietuvos juodgalvių, Romanovo veislių ir mišrūnių. Avių ūkiuose ganiava prasidėjo balandžio 1-10 dienomis, baigėsi spalio 15-31 dienomis. Taip pat į tyrimą buvo įtraukti tik tie ūkiai, kuriuose nuo paskutinės dehelmintizacijos turėjo būti praėję bent dešimt savaičių. Antihelmintiniam rezistentiškumui nustatyti naudotas KNT – kiaušinėlių nėrimosi testas.
Visi tyrimai buvo atlikti vadovaujantis Lietuvos gyvūnų gerovės reikalavimais (Nr. B1-866, 2012; Nr. XI-2271,2012) ir patvirtinti Lietuvos veterinarinės medicinos ir zootechnikos mokslų komiteto (Protokolo Nr. 07/2010).
2.1 . Tyrimų metodika
2.1.1. Išmatų mėginių paėmimas
Iš 20 fermų buvo paimta po 15-20 išmatų mėginių iš atsitiktine tvarka atrinktų avių. Išmatos paimtos su pirštine iš tiesiosios žarnos. Į 3 plastikinius indelius buvo po lygiai padalinta išmatų, kad susidarytų 1\3 konteinerio. Tada buvo praskiedžiama su vandeniu ir užsukus kamštį maišoma apie 1 min (8 pav.).
8 pav. Išmatos užpiltos vandeniu
Atsukus kamštį plastikiniai indeliai buvo pripildomi paprastu vandeniu iki viršaus, taip išmatos išlaikomos anaerobinėmis sąlygomis iki 1 savaitės (9 pav.).
21
9 pav. Išmatos sumaišytos su vandeniu.
Išmatų mėginiai anaerobinėmis sąlygomis yra paruošiami ir laikomi tais atvejais, kai nebus ištirti per artimiausias 2-3 valandas. Jei mėginiai švieži, ką tik paimti ir tyrimus ruošiamasi atlikti per 2-3 valandas, ruošti konteinerių nereikia.
2.1.2. Modifikuotas Makmasterio metodas
Tam, jog įsitikintume, kad avių išmatos tikrai užkrėstos parazitų kiaušinėliais ir pakankamu jų skaičiumi (>200 EPG), atlikome Modifikuotą Makmasterio metodą (49).
Priemonės: svarstyklės, flotacinis tirpalas, plastikiniai ar kiti indeliai, koštuvas (reta marlė), Makmasterio kamera, centrifuginiai mėgintuvėliai, centrifuga, pipetės, filtrinis popierius.
Darbo eiga: atsveriama 4, 0 g išmatų 0,1 g tikslumu ir dedama į plastikinį indelį. Ant išmatų užpilama 56,0 ml vandens (1,0 g išmatų – 14,0 ml vandens). Išmatas gerai išmaišyti vandenyje ir palikti stovėti apie 30 min.
Pakartotinai išmatos išmaišomos ir perkošiamos per tinklelį (marlę) į kitą plastikinį ar kitą indelį. Išmaišius filtratą, 10,0 ml mišinio tuojau pat pilti į centrifuginį mėgintuvėlį. Centrifuguoti 1200 aps./min. dažniu 7 minutes ir pipete iš mėgintuvėlio nusiurbti paviršinį skystį, paliekant nuosėdas.
Į mėgintuvėlį su nuosėdomis pilti flotacinio tirpalo iki 4,0 ml, gerai išmaišyti ir iškart pipete šio tirpalo pripildyti abi Makmasterio kameros puses. Mikroskopuoti ne anksčiau nei po 2 – 3 min., didinti 50 kartų.
Identifikuojamas ir skaičiuojamas kiekvienas kiaušinėlis. Kiekvienos helmintų rūšies, rastas kiaušinėlių skaičius abiejose Makmasterio kameros pusėse, yra dauginamas iš 20. Taip apskaičiuojamas kiaušinėlių skaičius viename grame išmatų.
22 Ištyrus mėginį, Makmasterio kamera gerai išplaunama vandeniu ir nusausinama filtriniu popieriumi. Atliekant šį tyrimo metodą, labai svarbu gauti gerai homogenizuotą išmatų bei vandens mišinį, gerai jį išmaišyti, kamerą pripildyti, nepaliekant oro burbuliukų. Tikslius tyrimo rezultatus galima gauti griežtai laikantis nurodymų.
2.1.3. Išmatų plovimas ir kiaušinėlių surinkimas
Šiam procesui buvo naudojami trys skirtingo akučių dydžio plovimo sietai. Pirmas 0.250 mm, antras 0.100 mm, trečias 0,025 mm (25 µm). Sietai sustatomi taip, kad stambiausias būtų viršuje, smulkiausias apačioje. Į viršutinį sietą supilamas visų 3 konteinerių turinį (vienos grupės), plaunamas su paparasto vandens srove keletą kartų (10 pav.).
10 pav. Sietai, per kuriuos plaunamos išmatos.
Iš paskutinio sieto likučiai supilami į stiklinę, ji dedama į šaldytuvą, kad turinys nusistovėtų (15-20 min.). Kai turinys nusistovi, skystis nupilamas, paliekamos tik nuosėdos. Gautas turinys supilamas į centrifuginius mėgintuvėlius, kiekvienam mėginiui po 2-3 mėgintuvėlius, priklausomai nuo turinio kiekio. Centrifuguojama 2 minutes 1500 apsisukimų per minutę greičiu. Po centrifugavimo skystis nupilamas, paliekamos tik nuosėdos. Ant jų pilamas flotacinis tirpalas, pagamintas iš cukraus ir vandens (tankis turi būtu pamatavus 1200 su tankio matuokliu). Flotacinis tirpalas sumaišomas su nuosėdomis, kad jos nebūtų dugne. Vėliau flotacinis tirpalas pilamas iki pat viršaus, kad susidarytų meniskas. Uždedami kamštukai ir vėl centrifuguojama 2 min. 1500 aps./min. Po centrifugavimo kamšteliai nuimami ir nuo jų nuplaunamas turinys kartu su nuosėdomis į stiklines.
23 Nuosėdose lieka visi kiaušinėliai. Vėl per 20µm storio sietą, turinys išplaunamas nuo cukraus naudojant dionizuotą vandenį ir supilamas į stiklinę, kad būtų apie 10 ml. Sumaišoma, tuomet skaičiuojamas kiaušinėlių kiekis 5 arba 10 µl iš 5 lašų mikroskopu, po to suskaičiuojamas vidurkis. Kad butų patogiau vidurkis paskaičiuojamas vnt/10µl.
2.1.4. KNT – kiaušinėlių nėrimosi testas
Naudojamas specialiai paruoštas tiabendazolis su penkiomis skirtingomis koncentracijomis (0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 1,0) ir 24 šulinėlių lėkštelės (11 pav.), o gauti duomenys surašomi specialiai pasiruoštame blanke (1 priedas).
11 pav. KNT naudojamos lėkštelės.
Į pirmas akutes pilama po 10 μl dimetilsulfoksido, kuris bus naudojamas kaip kontrolė. Į visas kitas akutes, atitinkamai po 10 μl skirtingų koncentracijų tiabendazolio. Į kiekvieną akutę įpilama po 2 ml dionizuoto vandens, kurio kiekviename mililitre yra apie 150 vnt. kiaušinėlių
Užpildytos lėkštelės inkubuojamos 48 valandas, 27 laipsnių temperatūroje. Po inkubacijos į kiekvieną akutę įlašinama po 25 μl Lugolio tirpalo. Bandymas atliekamas su skirtingomis koncentracijomis po du kartus. Apskaičiuota ED50/ED99 pagal logistinės regresijos modelį.
24
3. TYRIMO REZULTATAI
1 lentelė. Antihelmintinio rezistentiškumo benzimidazolams tyrimo rezultatai.
Fermos nr. ED50 ED99 Lervų sk. 0,1 µg/ml -1 % MIK µg/ml-1 Rezistentiškumo intervalas % AR statusas fermose 1 0,33 24,24 70 1.0 > 40 A 2 0,37 4,84 79 1.0 > 40 A 3 0,38 2,25 86 1.0 > 40 A 4 1,11 1,18 48 0.5 > 40 A 5 0,06 0,97 47 0.3 > 40 A 6 0,13 1,23 61 0.3 > 40 A 7 0,55 3,58 67 1.0 > 40 A 8 0,05 0,23 14 0.1 10 - 20 Ž 9 0,05 0,28 10 0.3 10 - 20 Ž 10 0,02 1,23 4 0.5 < 10 LŽ 11 0,08 0,57 31 0.3 20 - 40 V 12 0,03 0,15 2 0.1 < 10 LŽ 13 0,03 0,71 6 1.0 < 10 LŽ 14 0,08 0,3 26 0.3 20 - 40 V 15 0,31 9,73 74 1.0 >40 A 16 0,11 8,71 40 1.0 20 - 40 V 17 0,06 0,24 13 0.3 10 - 20 Ž 18 0,06 0,22 14 0.3 10 - 20 Ž 19 0,1 3 50 1.0 > 40 A 20 0,07 2,86 39 0.5 20 - 40 V
Atlikus KNT buvo gauti tokie tyrimų rezultatai (1 lentelė). Iš jų matyti, jog dvidešimtyje fermų iš dvidešimties buvo nustatytas antihelmintinis rezistentiškumas (100% KI - 95% (86,1-100)).
25 Priklausomai nuo aptiktų lervų skaičiaus procentais 0,1 µg/ml-1 ir minimalios lervų
išsivystymo koncentracijos (MIK) nustatytas antihelmintinio rezistentiškumo lygis avių fermose (12 pav.).
12 pav. Avių fermos su skirtingu atsparumo tiabendazoliui intervalu.
Iš dvidešimties fermų, trejose fermose (15%; KI - 95% (3,2-37,9)) nustatytas labai žemas antihelmintinio rezistentiškumo lygis (< 10 proc.), keturiose fermose (20%; KI - 95% (5,7-43,7)) – žemas (10 – 20 proc.), keturiose fermose (20%; KI - 95% (5,7-43,7)) – vidutinis (20 – 40 proc.) ir net devyniose fermose (45%; KI - 95% (23,1-68,5)) - aukštas AR lygis (> 40 proc.)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 < 10 10 - 20 20 - 40 > 40 Fe rmų ska ičius Atsparumo intervalas %
26
13 pav. Minimalios tiabendazolio koncentracijos, kuriose išsivystė lervos skirtingose
fermose.
Tyrimo metu buvo nustatyta, kad dvejose fermose (10%; KI - 95% (1,2-31,7)) minimali koncentracija, kurioje išsivystė lervos, buvo 0,1 µg/ml-1, septyniose fermose (35%; KI - 95%
(15,4-59,2)) – 0,3 µg/m-1, trejose (15%; KI - 95% (3,2-37,9)) – 0,5 µg/ml-1 ir aštuoniose fermose (40%; KI
- 95% (19,1-63,9)) – 1,0 µg/ml-1 koncentracija (13 pav.). Rezultatai rodo, jog 40 procentų fermų
nustatytas aukštas antihelmintinis rezistentiškumas net ir didžiausioje (1,0 µg/ml-1) tiabendazolio koncentracijoje. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.1 0.3 0.5 1.0 Fer m ų sk ai či us Tiabendazolio koncentracija %
27
14 pav. Sąlyginio rezistentiškumo pasiskirstymas tarp kitų atsparių ūkių
Tarp kitų atsparių ūkių buvo nustatytas „sąlyginis rezistentiškumas“, t.y. žemas, lengvai kontroliuojamas arba gauti galimai klaidingai teigiami rezultatai, dėl tam tikrų sąlygojančių tyrimą veiksnių (14 pav.). Iš dvidešimties fermų nustatytos 18 (90%; KI - 95% (68,3-98,8)), kuriose MIK buvo > 0,1 µg/ml-1, kurioje išsivystė lervos, o dvejose fermose (10%; KI – 95% (1,2-31,7)) MIK buvo 0,1 µg/ml-1, kas reikštų „sąlyginį" arba labai žemą atsparumą.
2
18
0.1 µg/ml¯1 > 0.1 µg/ml¯1
28
15 pav. Antihelmintinio rezistentiškumo pasiskirstymas remiantis ED50 ir ED99.
Penkiolikoje fermų buvo nustatytas antihelmintinis rezistentiškumas (75% KI – 95% (50,9– 91,3)), o penkiose fermose (25% KI – 8,7-49,1)) jautrumas tiabendazoliui. Tai nustatyta pagal ED50/ED99 duomenis: kai fermose ED50 buvo žemiau 0,1, o ED99 žemiau 0,3 – buvo laikoma jautru,
o kur viršyjo 0,1 ir 0,3 ribas – rezistentiška.
1 3 5 7 9 11 13 15 17 Jautru Rezistentiška Fe rmų ska ičius
29
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS
Atlikus kiaušinėlių nėrimosi testą (KNT), parazitų AR benzimidazolų grupės antihelmintikams buvo nustatytas 100 procentų tirtų avių fermų. Palyginus šiuos rezultatus su kitų šalių atliktais tyrimais, galima teigti, jog antihelmintinio rezistentiškumo problema Lietuvoje šiuo metu egzistuoja ir yra aukštame lygyje.
2004 – 2007 metais Čekijos Respublikoje 14 avių fermų buvo atliekamas AR benzimidazolams nustatymas in vivo ir in vitro tyrimo metodais. Nustatyta, kad AR egzistavo, tačiau tik trejose fermose jis siekė iki 98 procentų (50).
Šiaurės Vakarų Ispanijoje 2006 - 2011 metais buvo atliekami avių AR tyrimai. In vivo (KST – kiaušinėlių sumažėjimo testas) ir in vitro (KNT) tyrimais nustatytas AR benzimidazolams, imidazotiazoliams ir makrocikliniams laktonams. Ištyrus 22 fermas KST metodu, antihelmintinis rezistentiškumas buvo nustatytas albendazoliui - 13,6 procentai, o atlikus KNT, AR siekė – 35,3 procentus visų tirtų fermų (51). Palyginus šiuos duomenis su mūsų atliktu tyrimu, matomas didelis skirtumas, nes Lietuvoje AR nustatytas visose 20 tirtų avių fermų (100 procentų).
Pietų Indijoje 2009 metais trejose fermose buvo atlikti antihelmintinio rezistentiškumo benzimidazolams ir levamizoliui tyrimai. Skirtingai nei mūsų tyrime, kiaušinėlių nėrimosi testui buvo naudojamos keturios tiabendazolio koncentracijos: 0,05; 0,1; 0,3 ir 0,4. Trijų fermų ED50 buvo
0.627, 0.678 ir 0.388 μg/mL (5). Antihelmintiniam rezistentiškumui Bulgarijoje nustatyti taip pat buvo naudojamas KNT. Tyrimo metu nustatyta, kad ED50 buvo nuo 0,0114 iki 0,2023 μg/ml
tiabendazolio (52). Tuo tarpu mūsų tyrime ED50 fermose svyravo nuo 0,02 iki 1.11 μg/mL.
2011 metais Airijoje buvo atliekami tyrimai su benzimidazolais, levamizoliu ir makrocikliniais laktonais, lyginant su mūsų tyrimu buvo nustatytas kiek mažesnis, tačiau panašus antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams (> 88 procentų bandų) (53).
Slovakijoje 2014 metais buvo atlikti in vitro tyrimai antihelmintiniam rezistentiškumui nustatyti. Gauti rezultatai panašūs į šio tyrimo, nes iš 27 tirtų fermų, visose nustatytas rezistentiškumas benzimidazolams. Skirtumas tik tas, kad 2 fermose buvo aukštas rezistentiškumo lygis (> 40 procentų išsiritusių lervų), 3 – vidutinis (20-40 procentų išsiritusių lervų), o kitose 22 fermose – žemas (< 20 procentų išsiritusių lervų) (39). Mūsų tyrimo metu nustatyta 9 fermos su aukštu rezistentiškumu, o kitos fermos su vidutiniu, žemu arba labai žemu rezistentiškumo lygiu.
30
IŠVADOS
1. Naudojant in vitro kiaušinėlių nėrimosi testą, 20 avių fermų nustatytas antihelmintinis rezistentiškumas tiabendazoliui.
2. Pagal ED50/ED99 metodiką iš 20 tirtų avių fermų – 15 nustatytas antihelmintinis
rezistentiškumas benzimidazolams.
3. Pagal lervų skaičių 0,1 µg/ml-1 koncentracijoje visose 20 tirtų avių fermų nustatytas antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams. Todėl šis metodas buvo jautresnis atliekant avių AR benzimidazolams tyrimus.
4. Ištirta, kad avių anthelmintinio rezistiškumo problema Lietuvoje egzistuoja ir atitinka situaciją esančią kitose Europos bei pasaulio valstybėse, kuriose auginamos avys.
5. Atsižvelgiant į mūsų atlikto tyrimo rezultatus, galima teigti, jog Lietuvoje avių antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams yra aukšto lygio. Tai įrodo tyrimo metu helmintų lervų išsivystymas net ir didesnėse tiabendazolio koncentracijose (0,1 – 1,0 µg/ml).
31
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. VĮ Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centras,2012. 2. ŽŪIKVC (Ūkinių gyvūnų registras), 2015.
3. Torina A., Dara S., Marino A.M., Sparagano O.A., Vitale F., Reale S., Caracappa S. Study
of gastrointestinal nematodes in Sicilian sheep and goats. 2004. Annals of the New York Academy of sciences. T. 1026. P. 94-187.
4. Pezzanite L., Neary M.,Hutchens T., Sharko P. Common Diseases and Health Problems in Sheep and Goats. 2014.
5. Easwaran, C., Harikrishnan, T. J., Raman, M. Multiple anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes of sheep in Southern India. 2009. Veterinarski arhiv 79. P. 611-620
6. Stephen C., Love J., and Hutchinson W. G. Pathology and diagnosis of internal parasites in ruminants. 2003. Post Graduate Foundation in Veterinary Science. T. 350. P. 309-338. 7. Hansen J., Perry B. The epidemiology and control of helminth parasites of ruminants.
Ireland, 1994. P. 171.
8. Wormboss. http://www.wormboss.com.au/worms/roundworms/largemouthed-bowel-worm.php. Prieiga per internetą 2015-11-29.
9. Urquhart G. M., Armour J., Duncon J. L., Dunn A. M., Jennings F. W. Veterinary parasitology. Blackwell Science. 1996. P. 10 – 39.
10. Boomker J. Infections of the gastro-intestinal tract.
http://www.afrivip.org/sites/default/files/Helminths-wildlife/ant-gastro.html. Prieiga per internetą 2015-11-29.
11. The path of most resistance.
https://naturallyspeakingpodcast.wordpress.com/2015/04/14/the-path-of-most-resistance/. Prieiga per internetą 2015-11-29.
12. Bowie E.A. Alternative Treatments For Haemonchus Contortus in Sheep: Testing of a Natural Dewormer and Literature Review of Management Methods [PhD thesis]. Carlisle, PA; Dickinson College. 2014.
13. Roeber F., Jex A.R., Gasser R.B. Impact of gastrointestinal parasitic nematodes of sheep, and the role of advanced molecular tools for exploring epidemiology and drug resistance - an Australian perspective. 2013.Parasites and vectors. T. 153.
14. Qamar M. F., Maqbool A., Khan M.,S., Ahmad N., Muneer M.A. Epidemiology of Haemonchosis in sheep and Goats under different managemental conditions. 2007. Veterinary world. P. 413-417.
32 15. Atlas of livestock parasites digitized collection of microscopical preparations. http://parasites.czu.cz/parasites/parasite.php?idParasite=37.Prieiga per internetą 2015-11-29. 16. Sharp M., The Merk Veterinary Manual.
http://www.merckvetmanual.com/mvm/digestive_system/gastrointestinal_parasites_of_rumi nants/gastrointestinal_parasites_of_cattle.html. Prieiga per internetą 2015-11-08.
17. Handbook for the Control of Internal Parasites of Sheep and Goats.2012, pages 19-21; 44-45. http://www.uoguelph.ca/~pmenzies/Handbook_Home.html. Prieiga per internetą 2015-11-08.
18. https://www.studyblue.com/notes/note/n/path-exam-4/deck/4743022. Prieiga per internetą 2015-11-29.
19. The RVC/FAO guide to veterinary diagnostic parasitology.
http://www.rvc.ac.uk/review/parasitology/RuminantEggs/Nematodirus.htm. Prieiga per internetą 2015-11-29.
20. Akkari H., Gharbi M., Darghouth M.A. Dynamics of infestation of tracers lambs by gastrointestinal helminths under a traditional management system in the North of Tunisia. 2012. Parasite. T. 19. P.407-15.
21. Hynes F. Internal Parasites of Young Lambs. 2015.
22. Kassai T. Veterinary helminthology. Oxford: Butterworth – Heinemann. 1999. P. 260. 23. Sharp M. The Merk veterinary manual.
http://www.merckvetmanual.com/mvm/multimedia/v4732775.html. Prieiga per internetą 2015-11-29.
24. Preston S.J.M., Sanderman M., Gozalez J., Piedrafita D. Current Status for Gastrointestinal Nematode Diagnosis in Small Ruminants: Where Are We and Where Are We Going? 2014. Journal of Immunology Research. P. 1-12.
25. Pereckienė A., Petkevičius S., Šarkūnas M., Šalomskas A. McMaster metodo modifikacijų palyginimas diagnozuojant avių trichostrongiliozę. Veterinarija ir zootechnika. T. 39 (61). 2007. P. 46 – 52.
26. Fonseca de Macedo F.A., Lourenco F.J., Santello G.A., Nunes Martins E., Mora N., Mexia A.A. Accuracy of the FAMACHA method in ewes fed different levels of crude protein. 2014. Animal Sciences. T. 36. P. 209-214.
27. Alba-Hurtado F., Muñoz-Guzmán M.A. Immune Responses Associated with Resistance to Haemonchosis in Sheep. 2012. BioMed research international. P.158-162.
28. Kao R. R., Leathwick D. M., Roberts M. G., Sutherland I. A. Nematode parasites of sheep: survey of epidemiological parameters and their application in a simple model. Parasitology 2000. T. 121. P. 85 – 103.
33 29. Lemma D., Abera B. Prevalence of ovine gastrointestinal nematodes in and around Asella, South Eastern Ethiopia. 2013. Journal of Veterinary Medicine and Animal Health. T. 5(8). P. 222-228.
30. Sargison N.D. Pharmaceutical treatments of gastrointestinal nematode infections of sheep— Future of anthelmintic drugs. 2012. Veterinary Parasitology. T. 189. P. 79-84.
31. Kenneth J. R., Ray C.G., Sherris Medical Microbiology, 2004. 6edition, chapter 51, P. 702, 706-707.
32. R. Vaickelionienė, B. Sapijanskaitė, V. Mickevičius. 4-(1Н-Benzimidazol-2-il)-1-[3-(trifluormetil)fenil]-2-pirolidinono sintezė ir transformacijos. 2012. Cheminė technologija. T. 60. P. 37-43.
33. Sharp M., The Merk veterinary manual.
http://www.merckvetmanual.com/mvm/pharmacology/anthelmintics/benzimidazoles.html. Prieiga per internetą 2015-11-27.
34. FAO Corporate Document Repository.
http://www.fao.org/wairdocs/ilri/x5492e/x5492e09.htm#7.1 principles of control: nematodes. Prieiga per internetą 2015-11-16.
35. Thomaz-Soccol V., Souza F.P., Sotomaior C., Alcântara Castro E., Milczewski V., Mocelin G., Carmo Pessoa e Silva M. Resistance of Gastrointestinal Nematodes to Anthelmintics in Sheep (Ovis aries). 2004. Brazilian archives of biology and technology. T. 47. P. 41-47. 36. Burke J. Management of Barber pole Worm in Sheep and Goats in the Southern U.S. 2005.
mall Farms Research Update.
37. Varady, M., Černaška, D., Čorba, J. Use of two in vitro methods for the detection of anthelmintic resistant nematode parasites on Slovak sheep farms. 2006. Veterinary parasitology. T. 135. P. 325-331.
38. Waghorn T.S., Leathwick D.M., Rhodes A.P., Lawrence K.E., Jackson R., Pomroy W.E., West D.M., Moffat J.R. Prevalence of anthelmintic resistance on sheep farms in New Zealand. 2006. New Zealand veterinary Journal. T. 54. P. 271-277.
39. Dolinská M., Ivanišinová O., Königová A, and Várady M. Anthelmintic resistance in sheep gastrointestinal nematodes in Slovakia detected by in-vitro methods. 2014. BMC veterinary research. T. 10. P. 233.
40. Alvarez-Sánchez M.A., Pérez-García J., Cruz-Rojo M.A., Rojo-Vázquez F.A. Anthelmintic resistance in trichostrongylid nematodes of sheep farms in Northwest Spain. 2006. Parasitology research. T. 99. P. 78-83.
41. Geurden T., Hoste H., Jacquiet P., Traversa D., Sotiraki S., Frangipane di Regalbono A., Tzanidakis N., Kostopoulou D., Gaillac C., Privat S., Giangaspero A., Zanardello C., Noé
34 L., Vanimisetti B., Bartram D. Anthelmintic resistance and multidrug resistance in sheep gastro-intestinal nematodes in France, Greece and Italy. 2014. Veterinary parasitology. T. 201. P. 59-66.
42. Sargison N.D., Jacksonb F., Bartleyb D.J., Wilsona D.J., Stenhouseb L.J., Penny C.D. Observations on the emergence of multiple anthelmintic resistance in sheep flocks in the south-east of Scotland. 2014. Veterinary parasitology. T. 145. P. 65-76.
43. Borgsteede F.H.M., Derckseno D.D., Huijbers R. Doramectin and albendazole resistance in sheep in The Netherlands. 2006. Veterinary parasitology. T. 144. P. 180-183.
44. Kupčinskas T., Stadalienė I., Trusevičius P., Varady, M., Petkevičius S. Worm-control practices and prevalence of anthelmintic resistance using in vivo FECRTs on smallholder sheep farms in Lithuania. 2014. Veterinarija ir zootechnika. T. 72. P. 21-24.
45. Kupčinskas T., Stadalienė I., Šarkūnas M., Riškevičienė V., Varady M., Hoglund J., Petkevičius S. Anthelmintic resistance in sheep farms in Lithuania detected by in vitro micro-agar larval development test. 2015. Acta Veterinaria Scandinavica. T. 57. P. 1-6. 46. Tritschler J. Internal Parasite Control in Grazing Ruminants. 2015.
47. Leathwick D.M., Miller C.M., Atkinson D.S., Haack N.A., Waghorn T.S., Oliver A.M., Managing anthelmintic resistance: untreated adult ewes as a source of unselected parasites, and their role in reducing parasite populations. 2008. N.Z. Veterinary journal. T. 56. P. 184-95.
48. Anthelmintic Resistance in Sheep Management.
http://www.moredun.org.uk/research/research-@-moredun/parasitic-worms/anthelmintic-resistance/management (Prieiga per internetą 2015-11-22).
49. Roepstorff A., Nansen P. Simple McMaster technique. Epidemeology, diagnosis and control of helminth parasites of swine. 1998. Food and agriculture organization of the united nations. Rome. P. 47–56.
50. Vernerova E., Vondrova R., Kisova H., Svobodova V., Hera A. Detection of benzimidazole resistance in gastrointestinal nematode parasites of sheep in the Czech Republic. 2009. Veterinarni Medicina. T. 10. P. 467-472.
51. Martínez-Valladares M., Martínez-Pérezb J.M., Robles-Pérezb D., Cordero-Pérezb C.,. Famularob M.R, Fernández-Patob N., Castañón-Ordóñezb L., Rojo-Vázquez F.A. The present status of anthelmintic resistance in gastrointestinal nematode infections of sheep in the Northwest of Spain by in vivo and in vitro techniques. 2012. Veterinary parasitology. T. 191. P. 177-81.
35 52. Iliev P., Prelezov P., Ivanov A., Kirkova Z. Investigation on the benzimidazole resistance in gastrointestinal strongylids of sheep in Southeastern Bulgaria. 2014. Trakia journal of sciences. T. 2. P. 189-192.
53. Good B., Hanrahan J.P., Waal D.T., PattenT., Kinsella A., Lynch C.O. Anthelmintic-resistant nematodes in Irish commercial sheep flocks - the state of play. 2012. Irish Veterinary Journal. T. 65. P. 21.
36
PRIEDAI
1 priedas
Tyrimo duomenų blanko pavyzdys
Data: LD50:
Gyvulio rūšis: LD99
Bandos nr. Lervų išsiritimas %
Koncentracija L (lervos) K (kiaušinėliai) L (lervos) K (kiaušinėliai) Kontrolė 0,05 0,1 0,3 0,5 1,0 Data: LD50: Gyvulio rūšis: LD99
Bandos nr. Lervų išsiritimas %
Koncentracija L (lervos) K (kiaušinėliai) L (lervos) K (kiaušinėliai) Kontrolė 0,05 0,1 0,3 0,5 1,0
37
