LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Monika Danieliūtė
Antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui avių
fermose Lietuvoje naudojant in vitro lervų vystymosi testą
mikro agare (LVTMA)
Anthelmintic resistance to ivermectin in sheep farms in
Lithuania using in vitro micro agar lerval development test
(MALDT)
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof. Habil. Dr. Saulius Petkevičius
2
DARBAS ATLIKTAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Antihelmintinis rezistentiškumas
ivermektinui avių fermose Lietuvoje naudojant in vitro lervų vystymosi testą mikro agare (LVTMA)“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) Monika Danieliūtė (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) Monika Danieliūtė (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) Saulius Petkevičius (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) Saulius Petkevičius (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1) 2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė)
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 ĮVADAS ... 6 1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 81.1 Pagrindiniai avių virškinamojo trakto nematodai ... 8
1.1.1 Teladorsagia spp. ... 8
1.1.2 Trichostrongylus spp. ... 9
1.1.3 Heamonchus contortus ... 10
1.1.4 Cooperia spp. ... 11
1.1.5 Chabertia ovina. ... 12
1.2 Avių helmintozių gydymas ir profilaktika ... 13
1.3 Ivermektinas ir jo veikimo mechanizmas ... 14
1.4 Antihelmintinis rezistentiškumas ... 15
1.4.1 Rezistentiškumo mechanizmas ... 15
2.TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 17
2.1 Kiaušinėlių išskyrimas ... 17
2.2 Modifikuotas Makmasterio metodas ... 19
2.3 Lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA) ... 20
3.TYRIMO REZULTATAI ... 22 4. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 28 IŠVADOS ... 30 PADĖKA ... 31 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 32 PRIEDAI ... 36
4
SANTRAUKA
Antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui Lietuvos avių fermose
naudojant in vitro lervų vystymosi testą mikro agare (LVTMA)
Monika Danieliūtė Magistro baigiamasis darbas
Darbą sudaro: įvadas, literatūros apžvalga, tyrimo metodika, tyrimų rezultatai, rezultatų apibendrinimas, išvados, literatūros sąrašas. Darbo apimtis – 38 puslapiai. Jame yra 2 lentelės, 9 paveikslėliai, 5 grafikai, 3 priedai. Panaudoti 42 literatūros šaltiniai.
Magistriniame darbe aprašomas antihelmintinio rezistentiškumo ivermektinui pasiskirstymas avių ūkiuose Lietuvoje, kuris buvo nustatytas naudojant in vitro lervų vystymosi testą mikro agare (LVTMA).
Darbo literatūros apžvalgoje, trumpai aprašomi pagrindiniai avių virškinamojo trakto parazitai, užsikrėtimo jais gydymas ir profilaktika, ivermektino veikimo principas, antihelmintinis rezistentiškumas, bei jo formavimosi mechanizmas.
Tyrimas buvo atliktas 2013 m. rugpjūčio – 2014 m. lapkričio mėnesį. Buvo atrinkta ir ištirta 17 avių fermų, išsidėsčiusių centrinėje ir pietų Lietuvoje. Tyrimui atrinktos fermos, kuriose per pastaruosius 3-5 metus buvo atliekama profilaktinė/gydomoji dehelmintizacija ivermektino preparatais. Tyrimas buvo vykdomas tik tose fermose, kuriose nuo paskutinės dehelmintizacijos praėjo mažiausiai 10 savaičių. Laboratoriniai tyrimai buvo atliekami LSMU Veterinarijos akademijos Užkrečiamųjų ligų katedros Parazitologijos laboratorijoje. Tyrimams buvo naudojami modifikuotas Makmasterio ir LVTMA in vitro metodai.
Antihelmintinis rezistentiškumas (AR) ivermektinui nustatytas 64,7 proc. tirtų avių ūkių. Tirtuose Lietuvos avių ūkiuose nustatytas vidutinio lygio antihelmintinis rezistentiškumas. AR ivermektinui pagal atskiras avių nematodų rūšis sudarė: Telodorsagia spp. – 45 proc. ir Trichostrongylus spp. – 34 proc., mažiau Cooperia spp. – 16 proc, ir mažiausiai Heamonchus contortus. – 5 proc.
5
SUMMARY
Anthelmintic resistance to ivermectin in sheep farms in Lithuania using in
vitro micro agar lerval development test (MALDT)
Monika DanieliūtėMaster‘s Thesis
The Master thesis consists of the following chapters: Introduction, Literature review, Materials and Methods, Results, Discussion, Conclusions and Reference list. The Thesis consists of 38 pages, it contains 2 tables, 14 figures, 3 attatchments and 42 literature sources.
The Master's thesis describes distribution of anthelminic resistance (AR) to ivermectin in sheep farms in Lithuania, which was determined using an in vitro micro agar lerval development test (MALDT).
The literature review provides a brief description of the main gastrointestinal parasites in sheep, treatment and prevention of gastrointestinal parasites infection, the principles of operation of ivermectin, anthelmintic resistance and its formation mechanisms.
The research was conducted from August 2013 to November 2014. A total 17 farms mainly from Central and Southern Lithuania with previous history of the use of ivermectin for at least of 3-5 years were enrolled in this study. Only the farms where the last antihelmintic treatment was caried out for at least 10 weeks before the start of the study were included. Laboratory tests were performed at the Laboratory for Parasitology, Department of Infectious Diseases, Veterinary Academy, Lithuanian University of Health Sciences. Main methods used in the study were a modified MacMaster technique and in vitro MALDT.
Anthelmintic resistance (AR) to ivermectin was found in 64.7 %. of investigated sheep farms. It was found that in Lithuania sheep farms anthelmintic resistance is in the middle level. According sheep nematode species it was estimated that the highest AR was to Telodorsagia spp. – 45 %. and Trichostrongylus spp. - 34 %, lower to Cooperia spp. – 16 %, and the lowest to Haemonchus contortus - 5 %.
6
ĮVADAS
Avininkystė Lietuvoje per pastaruosius 10 metų sparčiai auga. Remiantis Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro duomenimis, avių skaičius 2014 metais padidėjo 2,24 karto lyginant su 2010 metais. Nuo 2013 metų iki 2014 metų avių laikytojų skaičius padidėjo 20,64 proc., o vidutinės bandos dydis siekia 14 avių [1]. Šie duomenys rodo, jog daugėja mažai avių laikančių avių augintojų. Didėjant avių skaičiui atsiranda vis daugiau problemų susijusių su jų sveikatingumu ir užkrečiamosiomis ligomis. Nustatyta, kad avių virškinamojo trakto parazitozės yra viena didžiausių problemų avininkystėje globaliniu mastu [2].
Užsikrėtimas virškinamojo trakto parazitais yra pagrindinė priežastis, dėl kurios avims skiriami ir profilaktikos tikslais naudojami antihelmintiniai preparatai [2]. Dažnas šių preparatų naudojimas yra vienas iš veiksnių įtakojančių antihelmininio atsparumo vystymąsi [3].
Lietuvoje avims dažniausiai yra naudojami trijų klasių plataus veikimo spektro antihelmintiniai preparatai: makrocikliniai laktonai (ivermektinas), benzimidazolai (fenbendazolas, albendazolas) ir imidazotiazoliai (levamizolas). Ivermektinas – pats populiariausias ir Lietuvoje dažniausiai naudojamas antihelmintikas. Iš benzimidazolų klasės antihelmintikų Lietuvoje registruotas yra tik fenbendazolas. Levamizolas naudojamas rečiausiai, nors prieš kelis dešimtmečius buvo vienas iš dažniausiai naudojamų antihelmintinių preparatų [4].
Antihelmintinio rezistentiškumo nustatymui gali būti naudojami in vitro ir in vivo metodai. Lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA) yra plačiausiai naudojamas in vitro metodas, pagrįstas lervų gebėjimu išgyventi ir vystytis įvairiose antihelmintinių preparatų koncentracijose [2]. Pirmą kartą lervų vystymosi testą, kuriuo buvo galima nustatyti antihelmintinį rezistentiškumą levamizolui ir benzimidazolams, aprašė Coles el al. 1988 metais [5].
Europoje antihelmintinis rezistentiškumas makrocikliniams laktonams (ivermektinas, selamektinas) ir bendzimidazolams (fenbendazolas, albendazolas) avių virškinamojo trakto nematoduose buvo nustatytas Slovakijoje [6], Ispanijoje [7,8], Italijoje [9,10], Graikijoje [11], Didžiojoje Britanijoje [12,13] ir Olandijoje [14].
Lietuvoje yra mažai informacijos apie avių virškinimo trakto parazitų paplitimą, o apie antihelmintinį rezistentiškumą duomenų nėra užregistruota. Atlikus in vivo tyrimus nustatyta, kad Lietuvos avių ūkiuose yra problemų susijusių su silpnu antihelmintikų efektyvumu [3].
7 Magistrinio darbo tikslas:
Naudojant in vitro LVTMA metodą, nustatyti ar Lietuvos avių ūkiuose yra išsivystęs antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui.
Magistrinio darbo uždaviniai :
1. Nustatyti antihelmintinį rezistentiškumą ivermektino aglikonui naudojant in vitro LVTMA metodą.
2. Nustatyti antihelmintinio rezistiškumo ivermektinui paplitimą Lietuvos avių fermose. 3. Įvertinti antihelmintinio rezistentiškumo ivermektinui išsivystymo lygį Lietuvos avių ūkiuose.
4. Nustatyti kokie avių virškinamojo trakto nematodai yra atsparūs ivermektino preparatams Lietuvoje.
8
1.LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Pagrindiniai avių virškinamojo trakto nematodai
1.1.1 Teladorsagia spp.Tai avių šliuže parazituojantys, ploni, iki 14,0 mm ilgio, rausvai rudos spalvos helmintai Teladorsagia circumcincta . Šių helmintų išvaizda ir vystymosi ciklas nesiskiria nuo galvijų šliuže parazituojančių Ostertagia ostertagi. helmintų, skiriasi tik parazito šeimininkas [15].
Šiems nematodams būdingas tiesioginis vystymosi ciklas. Kiaušinėliai būna 80–100 μm ilgio ir 40-50 μm pločio su 8-32 blastomeromis viduje (1 pav.). Kiaušinėliams su išmatomis patekus į aplinką, per dvi savaites iš kiaušinėlio vystosi invazinė L3 stadijos lerva, kuri migruoja ant žolės.
Invazinėms lervoms patekus į avių organizmą, jos prasiskverbia į virškinimo liaukas ir ten neriasi iki L4 stadijos. Šios stadijos lervos gali pereiti į hipobiozės būklę, jei užsikrėtimas būna rudenį, ir
peržiemojusios tęsti savo vystymąsi. Praėjus 18 dienų nuo užsikrėtimo, lervos išlenda iš liaukų, neriasi iki L5 stadijos. Lytiškai subrendę prisitvirtina prie šliužo gleivinės. Lervos besivystydamos
sutrikdo skrandžio liaukų funkcijas ir jos nustoja gaminti skrandžio rūgštį, dėl ko sutrinka pašaro virškinimas [15-17].
1 pav. Teladorsagia circumcincta kiaušinėliai. (Šaltinis :
9 Teladorsagia rūšies helmintai avims sukelia gastritą, intensyvią diarėją, dehidrataciją, mažėja sergančių gyvulių produktyvumas bei priesvoris, o esant stipriai helmintų invazijai, gyvuliai gaišta [16].
Daugelis Teladorsagia L3 stadijos lervų nepatekusių į virškinamąjį traktą, peržiemoja
ganyklose ir tampa užsikrėtimo šaltiniu kitą pavasarį besiganančioms avims. Tačiau iki birželio mėnesio pabaigos lervų skaičius žolėje sumažėja iki minimumo, kadangi pavasarį atšilus orui, dauguma lervų išnaudoja savo maisto atsargas [16].
1.1.2 Trichostrongylus spp.
Pagrindinės rūšys yra Trichostrongylus axei ir T. colubriformis. Šie helmintai yra labai maži, jų ilgis siekia tik 7,0 mm, kūnas siūliškos formos su beveik nesmailėjančiu priekiniu galu ir smailėjančia uodegėle. Jų kiaušinėliai pailgi, simetriškų galų, 70-108 μm ilgio, 30-50 μm pločio, su daugybe viduje sunkiai suskaičiuojamų blastomerų (2 pav.). Trichostongilai parazituoja atrajotojų šliuže, prisitvirtindami prie jo gleivinės ir maitindamiesi krauju. Šiems nematodams būdingas tiesioginis vystymosi ciklas. Palankiomis sąlygomis invazinės L3 stadijos lervos vystosi per 1-2
savaites šliuže ar plonojoje žarnoje. Inkubacinis periodas trunka 2-3 savaites. [15]
2 pav. Trichostrongylus colubriformis kiaušinėlis. (Šaltinis:[17])
Trichostrongylus spp. invazinės lervos mūsų klimato zonoje gali peržiemoti, ir kitą pavasarį tapti užsikrėtimo šaltiniu. Pavasarį išnaudojus maisto medžiagas daug lervų žūva, tačiau spėjus
10 gyvuliams užsikrėsti, liepos viduryje invazinių L3 stadijos lervų ženkliai padaugėja ganyklos žolėje.
Rudenį patekę invazinės lervos į virškinimo traktą, kaip ir ostertagijų lervos, tampa hipobiozės būsenos, tik hipobiozės būsenos tampa L3 stadijos, priešingai nei ostertagijų lervos, kurios į
hipobiozės būklę pereina L4 stadijoje. Trichostrongilai dažniau sutinkami šiltesnėse subtropinėse
zonose, tuo tarpu ostertagijos vėsesnėse [18].
Trichostongilų lervos ženkliai pažeidžia šliužo gleivinę, sukelia kraujavimą ir net perforacines skrandžio opas. Esant smarkiai invazijai avys ima viduriuoti ir netenka svorio. Lengvo užsikrėtimo metu liga gali pasireikšti subklinikine forma [16].
1.1.3 Heamonchus contortus
Pagrindinės nematodų rūšys, parazituojančios avių ir kitų atrajotojų šliuže, yra Haemonchus contortus, H. placei ir H. similis. Suaugę helmintai būna iki 35,0 mm ilgio ir 5,0 mm pločio. Šie parazitai prisitvirtina prie skrandžio gleivinės ir minta siurbdami kraują. Jų kiaušinėliai būna 75 μm ilgio, 45 μm pločio (3 pav.). Šiems nematodams taip pat būdingas tiesioginis vystymasis, be tarpinių šeimininkų. H. contortus patelės gali per dieną išskirti nuo 5000 iki 10000 kiaušinėlių kurie labai greitai vystosi ir iki L3 invazinės stadijos gali išsivystyti per 5 dienas [19]. Patekusios L3 stadijos
lervos į šliužą, lokalizuojasi prie virškinimo liaukų ir neriasi 2 kartus. Esant nepalankioms aplinkos sąlygoms dauguma lervų tampa hipobiozės būsenos ankstyvoje L4 stadijoje, toliau vystymasis
prasideda kitą pavasarį. Prieš paskutinį nėrimąsi, susiformuoja aštrus dantukas, kuriuo prarėžęs gleivinę ir pasiekęs kraujagysles maitinasi. Inkubacinis laikotarpis trunka 2-3 savaites [15,17].
11 H. contortus šiltose ir drėgnose zonose yra laikomas vienu iš dažniausiai pasitaikančių ir daugiausiai ekonominių nuostolių padarančių avių virškinamojo trakto parazitų. Imliausi šiems parazitams yra jauni ėriukai. Suaugusios avys dažniausiai būna atsparios šiam parazitui, bet esant didelei invazijai ir joms gali pasireikšti ligos požymiai. Ligos protrūkis dažniausiai sutampa su ėriavimusi. Lietingomis vasaromis žolės užterštumas invazinėmis lervomis itin padidėja. Tuo metu į besiganančių avių organizmą patenka daug invazinių lervų, todėl atsiranda protrūkio tikimybė [15,19].
Hemonchozė avims pasireiškia priklausomai nuo užsikrėtimo laipsnio. Labai ūmiais atvejais avys tiesiog gaišta, nuo hemoraginio gastrito kurį sukelia didelis helmintų pažeidžiančių skrandžio sieneles kiekis. Mažesnio užsikrėtimo metu, avims pastebima anemija, poliežuvinė edema ir ascitas, tamsios spalvos išmatos, taip pat avims pradeda kristi vilna. Chroniškos hemonchozės metu pasireiškia progresuojantis svorio mažėjimas ir silpnumas, o anemijos ir edemos požymių nebūna [19].
1.1.4 Cooperia spp.
Koperijos yra šviesiai rožinės spalvos nematodai, užaugantys iki 9,0 mm ilgio ir parazituojantys avių plonajame žarnyne. Avys gali užsikrėsti Cooperia pectinata, C. surnabada ir C. curticei. Koperijų kiaušinėliai yra elipsės formos, su plonu apvalkalu apie 77-86 μm ilgio, 32-36 μm pločio. Vystymasis – tiesioginis, panašus į daugelio trichostrongilidų (ostertagijų, trichostrongilų). Patekusios į organizmą invazinės L3 stadijos lervos (4 pav.), migruoja į žarnų kriptas, du kartus
neriasi. Subrendusios, prisitvirtina prie žarnų gleivinės. Inkubacinis laikotarpis trunka apie 15-18 dienų [19].
4 pav. L3 stadijos Cooperia spp. lerva. (Šaltinis :
12 Šie nematodai nesukelia rimtų patologijų avims, ir užsikrėtimas dažnai praeina asimptomatiškai. Tačiau gausiai užsikrėtusiems gyvuliams gali sumažėti apetitas, kristi svoris, pasireikšti viduriavimas. Labiausiai jautrūs yra jaunikliai ėriukai, suaugusios avys įgyja dalinį imunitetą pakartotiniam užsikrėtimui [15,19].
Cooperia rūšies nematodams būdinga, kad subrendusiems parazitams, L3 bet L4 stadijos
lervoms sunaikinti, reikalinga skirtinga antihelmintinio preparato dozė. Dėl šios savybės lengvai vystosi antihelmintinis atsparumas, nes vaistai naudojami netinkamomis dozėmis. JAV buvo atlikti tyrimai su veršeliais, kurių metu nustatyta, kad koperijomis užkrėsti atrajotojai neteko 7,4 proc. gyvo svorio lyginant su kontrole. Po bandymo gyvūnai buvo gydomi doromektinu ir fenbendazolu. Doramektinas, skirtas rekomenduotina doze, arba visiškai neveikė arba buvo mažai efektyvus gydant C.punctata užsikrėtimą, o fenbendazolas parodė 100 proc. efektyvumą [19, 20]
1.1.5 Chabertia ovina.
Chabertia ovina – avių ir kitų atrajotojų gaubtinėje žarnoje parazituojantis nematodas, 1,3-2,0 cm ilgio, baltos spalvos, su būdinga didele žiočių kapsule (5 pav.). Šiems nematodams būdingas tiesioginis vystymosi ciklas. Jų kiaušinėliai 90-105 μm ilgio, 50-55 μm pločio. L3 stadijos lervos
patekę į gyvulio organizmą prasiskverbia į plonosios žarnos gleivinę. Po savaitės išsinėrusios į L4
stadijos lervas, jos migruoja į akląją žarną. Per 25 dienas po užsikrėtimo tampa jaunais helmintais. Subręsta, nukeliavę į gaubtinę žarną. Inkubacinis laikotarpis trunka apie 50 dienų [15,19]
5 pav. Chabertia ovina žiočių kapsulė. (Šaltinis :
13 Chabertijos tvirtindamosios žiočių kapsule prie žarnų gleivinės pažeidžia jos vientisumą, susidaro taškinės kraujosruvos. L3 stadijos lervos pažeidžia plonųjų žarnų gleivinę, todėl inkubacinio
periodo metu gali būti pastebimas viduriavimas. Dažnai dėl šios priežasties chabertiozė nediagnozuojama, nes išmatų mėginiuose dar nebūna helmintų kiaušinėlių, o klinikiniai simptomai pasireiškia inkubaciniu periodu. Lengvas užsikrėtimas dažniausiai lieka nepastebėtas, nes simtomų nebūna. Gausiai užsikrėtus pastebima diarėja su kraujo ir gleivių priemaiša, helmintai išmatose, būdinga anemija, hipoalbuminemija, smarkiai mažėja priesvoris [19].
Chabertia ovina lervos aplinkoje vystosi panašiai kaip ir ostertagijų lervos. Vidutinio klimato zonoje L3 stadijos lervos per žiemą gyvena aplinkoje. Šeimininko organizme per žiemą L4 stadijos
lervos gali būti hipobiozės būsenos ir pradėti vystytis tik pavasarį [19].
1.2 Avių helmintozių gydymas ir profilaktika
Kaip gydomoji ir profilaktinė priemonė veterinarijoje yra naudojami antihelmintikai. Juos vartojant mažėja gyvulių sergamumas helmintozėmis, didėja produktyvumas, mažiau gyvulių gaišta, gerėja gyvulininkystės produkcijos kokybė. Nustačius parazituojančią helmintų rūšį, galima tiksliai parinkti reikiamus antihelmintikus ir taikyti atitinkamą profilaktiką. Užsikrėtimo virškinamojo trakto nematodais gydymui dažniausiai naudojami benzimidazolai, imidazotiazoliai, makrocikliniai laktonai ir fosforo organiniai junginiai [21,22].
Preparatų poveikis ir efektyvumas prieš atskirus parazitus yra skirtingas (1 lentelė). Pvz. benzimidazolai veikia nematodus, iš dalies trematodus bei cestodus, tačiau neveikia ektoparazitų. O kitų grupių preparatai veikia tik nematodus. Todėl dehelmintizaciją reiktų atlikti nustačius vyraujančias virškinamojo trakto parazitų rūšis avių bandoje [19].
1 lentelė. Plataus veikimo spektro antihelmintikų grupių veiksmingumas prieš atitinkamus parazitus.
(Šaltinis: [19])
Antihelmintikų grupė Nematodai Trematodai Cestodai Ektoparazitai
Benzimidazolai + +/- +/- -
Imidazotiazoliai + - - -
Tetrahidropirimidinai + - - -
Makrocikliniai laktonai + - - +
Profilaktinę dehelmintizaciją rekomenduojama atlikti ilgai veikiančiais antihelmintiniais preparatais (ivermektinu, moksidektinu, doramektinu). Profilaktinė dehelmintizacija atliekama
14 dviem etapais. Pirmasis etapas vykdomas pavasarį, praėjus 3 savaitėms nuo ganymo pradžios, ir gydymas kartojamas kas tris savaites, pagal schemą 0-3-6-9. Toks dehelmintizavimas apsaugo ne tik pačius gyvūnus nuo virškinamojo trakto parazitų, bet ir ganyklas nuo užsikrėtimo helmintų kiaušinėliais. Antrasis etapas vykdomas rudenį, pasibaigus ganymo sezonui. Rudenį atliekama vienkartinė dehelmintizacija, užkerta kelia parazitų vystymuisi žiemą [23].
Siekiant kontroliuoti avių parazitų lygį fermose ir ūkiuose labai svarbus yra šėrimas, aplinka ir laikymo sąlygos. Tvartuose laikomos avys neturėtų būti šeriamos nuo žemės. Grūdai, šienas ir mineraliniai papildai, turėtų būti paduodami iš specialių šėryklų, ėdžių ir indų, kurie negali būti lengvai užkrečiami išmatomis. Vanduo turi būti švarus ir neužterštas fekalijomis.Naujai įsigytos avys turi būti dehelmintizuojamos ir į bandą įleidžiamos tik po 30 dienų karantinavimo. Turi būti nuolat valomi šėrimo ir girdymo loviai, laiku keičiami pakratai. Garduose neturi būti labai drėgna, kadangi tai puikios sąlygos kiaušinėliams vystytis ir išlikti gyvybingiems ilgą laiką. Ganyklos turi būti švarios ir sausos, be priėjimo prie atvirų vandens telkinių. Kadangi daugiau lervų kaupiasi ant augalų pagrindo arti žemės, avims neturėtų būti leidžiama ganytis ant žolės, trumpesnės nei 2 cm, taip sumažinant tikimybę užsikrėsti invazinėmis helmintų lervomis[24,25].
1.3 Ivermektinas ir jo veikimo mechanizmas
Ivermektinas priklauso makrociklinių laktonų grupei. Makrocikliniai laktonai veikia nematodus ir jų lervas, bei ektoparazitus. Jie padidina nematodų nervinių ląstelių ir raumenų ląstelių membranos pralaidumą chloro jonams, veikia gliutamatą, kuris aktyvina chloro kanalus. Gliutamato kontroliuojami chloro kanalai būdingi tik bestuburiams, daugelis gyvūnų jų neturi. Sąveikaujant su gliutamatu atsidaro chloro kanalai ir chloras skverbiasi į ląstelę ir blokuoja nervinio impulso plitimą bei sukelia paralyžių. Trematodai ir cestodai glutamato kontroliuojamų chloro kanalų neturi, todėl jų šios grupės vaistai neveikia [26].
Makrocikliniai laktonai yra efektyviausiai veikianti antihelmintikų grupė. Šiai vaistų grupei priklauso avermektinai ir milbemicinai. Ivermektinas yra žinomiausias šios grupės antihelmintikas. Ivermektinas laikomas vienu saugiausių preparatų, pasižymintis aukštu efektyvumu mažomis dozėmis, yra plataus veikimo spektro, veikia prieš endoparazitus ir ektoparazitus. Šios makrociklinių laktonų savybės lemia dažną jų pasirinkimą parazitinių invazijų gydymui ir kontrolei [15, 26].
Pagrindiniai ivermektino trūkumai yra, jog jis neveikia cestodų bei trematodų ir yra brangesnis, lyginant su kitais Lietuvoje naudojamais antihelmintikais. Taip pat iš organizmo su išmatomis pasišalinantys makrociklinių laktonų likučiai yra toksiški vandens gyvūnams, bei vabzdžiams
15 mintantiems gyvūnų išmatomis, tačiau nekelia grėsmės paukščiams, augalams ir dirvos helmintams [15].
Preparato kainos sumažėjimas galėtų įtakoti šių vaistų naudojimo padidėjimą. JAV, pasibaigus ivermektino naudojimo patentui, rinkoje pasirodė nemažai kitų gamintojų alternatyvių vaistų, kas įtakojo gydymo išlaidų sumažėjimą. Kainos sumažėjimas buvo vienas iš lemiančių veiksnių ivermektino naudojimo padidėjimui, kuris padidino riziką antihelmintinio rezistentiškumo vystymuisi. Antihelmintinis rezistentiškumas makrocikliniams laktonams išsivystė įvairių rūšių gyvūnų organizme parazituojantiems helmintams, bet ryškiausiai ši problema pasireiškė tarp smulkiųjų atrajotojų (avių, ožkų) [27-30].
1.4 Antihelmintinis rezistentiškumas
Antihelmintinis rezistentiškumas - tai helmintų savybė tapti atspariais antihelmintinių preparatų poveikiui. Tai pasireiškia, kai gydymo metu, anksčiau veiksminga vaistų koncentracija ar dozė visiškai nebeveikia helmintų, arba antihelmintiniam efektui pasiekti reikalinga didesnė nei įprasta preparato dozė [31].
Smulkiųjų atrajotojų helmintai, palyginti su galvijų, dažniau būna atsparūs antihelmintikams, kadangi avys ir ožkos dažniau dehelmintizuojamos. Antihelmintinio rezistentiškumo problema užregistruota jau 1954 metais kuomet buvo nustatyta, kad Haemonchus contortus atsparus fenotiazinui. Vėlesniais tyrimais buvo nustatyta, kad tiabendazolui atsparūs Trichostrongylus colubriformis, Ostertagia circumcincta, Nematodirus spp. ir taip pat Haemonchus contortus [32].
1.4.1 Rezistentiškumo mechanizmas
Nustatyti veiksniai nulemiantys rezistentiškumo antihelmintikams formavimąsi:
antihelmintiko naudojimas netikslingomis dozėmis, reguliarus to paties (vienos klasės) antihelmintiko vartojimas ilgą laiką bei per dažnas antihelmintiko naudojimas [3].
Antihelmintinio rezistentiškumo formavimuisi didelę įtaką daro pačių helmintų biologinės savybės. Virškinamojo trakto parazitai pasižymi trumpu vystymosi ciklu ir dideliu palikuonių skaičiumi, tai reiškia, kad per trumpą laiką išsivysto kelios organizmų kartos turinčios daug individų. Tiesioginis vystymosi ciklas, kuomet nėra tarpinio šeimininko užtikrina, kad atsparumo geną pernešančios lervos nebus sunaikintos kartu su rezerviniais šeimininkais [31].
16 1. Preparato veiklioji medžiaga nebeatpažįsta molekulinio taikinio ir vaistas tampa nebeefektyvus.
2. Metabolizmo pasikeitimų, dėl kurių vaistas inaktyvuojamas, pašalinamas arba stabdoma jo aktyvacija.
3.Vaisto pasiskirstymo pasikeitimai helminto organizme, dėl kurių vaistas nepasiekia savo veikimo taikinio.
17
2.TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Tyrimas buvo atliktas nuo 2013 m. rugpjūčio iki 2014 m. lapkričio. Buvo atrinkta ir ištirta 17 avių fermų, išsidėsčiusių centrinėje ir pietų Lietuvoje. Tyrimui atrinktos fermos, kuriose per pastaruosius 3-5 metus buvo atliekama profilaktinė/gydomoji dehelmintizacija ivermektino preparatais. Tyrimas buvo vykdomas tik tose fermose, kuriose nuo paskutinės dehelmintizacijos praėjo mažiausiai 10 savaičių. Fermose laikomų avių skaičius svyravo nuo 40 iki 1000 įvairaus amžiaus individų. Daugiausia fermose buvo laikomos Lietuvos juodgalvės avys, Romanovo bei įvairių veislių mišrūnai. Visose fermose avys buvo ganomos ganyklose nuo balandžio 1-10 dienos iki spalio 15-31 dienos.
Kiekvienoje tyrimui pasirinktoje fermoje buvo atsitiktine tvarka atrinkta 15-20 avių. Iš atrinktų individų tiesiosios žaros buvo imami išmatų mėginiai (5-10g). Surinkti mėginiai iš atskirų individų buvo patalpinami į vieną plastikinį indą, sumaišomi ir užpilami vandeniu, nepaliekant vietos orui. Taip išmatų mėginiai anaerobinėse sąlygose gali būti laikomi iki savaitės laiko. Siekiant išvengti netikslumų, taip paruošti mėginiai buvo laikomi ne ilgiau 2 dienų [33].
2.1 Kiaušinėlių išskyrimas
Tyrime buvo skaičiuojami tik trichostrongilidų kiaušinėliai. Trichostrongilidų kiaušinėliai iš paruoštų mėginių buvo išskirti išmatas plaunant per tris vienas ant kito sudėtus skirtingų akučių dydžių sietus. Sietų akučių dydis, nuo didžiausio, buvo 250, 100 ir 20 µm. Trichostrongilidų kiaušinėliai kartu su nuosėdomis likę ant paskutinio sieto, kurio akučių dydis - 20 µm, buvo išplauti su vandeniu į paprastą stiklinį indą. Šio indo turinys išpilstomas į centrifuginius mėgintuvėlius (6 pav.). Po to į mėgintuvėlius pripilama vandens, kad visuose būtų vienodas kiekis skysčio, tuomet centrifuguojama 2 minutes 1500 aps./min greičiu [34, 35].
18
6 pav. Centrifuginiai mėgintuvėliai, išpilsčius pirminį turinį.
Po centrifugavimo, mėgintuvėlyje susidarydavo nuosėdų sluoksnis, kuriame buvo helmintų kiaušinėliai, ir skysčio sluoksnis, kurį reikėjo nupilti. Nupylus susidariusį skystį, ant likusių nuosėdų buvo pilamas flotacinis cukraus tirpalas, kurio tankis 1,2 g/ml. Pirmiausia tirpalo pripilama tiek, kad būtų galima išmaišyti nuosėdas, o po to mėgintuvėlis pripildomas taip, kad susidarytų skysčio meniskas (7 pav.) Mėgintuvėliai buvo užkemšami ir pakartotinai centifuguojami 2 minutes 1500 aps./min.
7 pav. Centrifūginiai mėgintuvėliai paruošti antrajam centrifugavimui su flotaciniu cukraus
tirpalu.
Po centrifugavimo su flotaciniu cukraus tirpalu, visi kiaušinėliai susikaupdavo ant mėgintuvėlio kamštelio. Nuo kamštelių kiaušinėliai buvo išplaunami į stiklinį indą naudojant distiliuotą vandenį (8
19 pav.). Gautas turinys dar kartą perplaunamas per 20 µm dydžio akučių sietą, kad būtų išplautas cukrus. Likusiame turinyje susikaupdavo helmintų kiaušinėliai, kurie buvo naudojami in vitro lervų vystymosi mikro agare testui [34, 35].
8 pav. Kiaušinėlių nuplovimas nuo centrifuginio mėgintuvėlio kamštelio.
2.2 Modifikuotas Makmasterio metodas
Atrenkant fermas tyrimams, taip pat buvo svarbu nustatyti užsikrėtimo parazitais intensyvumą, t.y. kiaušinėlių kiekį išmatose. Dalis iš kiekvienos fermos paimtų išmatų buvo tirta naudojant modifikuotą Makmasterio metodą. Šis metodas atliekamas pasveriant 4,0 gramus šviežių išmatų, kurios sumaišomos su 56,0 ml vandens ( santykis 1,0g išmatų – 14,0ml vandens). Išmatos paliekamos nusistovėti apie 30 minučių. Tada mišinys per retą marlę košiamas į kitą stiklinę, filtratas išmaišomas ir pilamas į 10 ml centrifūginius mėgintuvėlius. Centrifuguojama buvo 7 minutes 1200 aps/min dažniu. Paviršinis skystis nupilamas, o ant nuosėdų pilama 4,0 ml flotacinio tirpalo ir gerai išmaišoma. Šiuo mišiniu, pipete, užpildomos abi Makmasterio kameros pusės. Po 2-3 minučių mikroskopuojama. Kiaušinėlių skaičius 1 grame išmatų gaunamas kiaušinėlių kiekį abiejose kameros pusėse padauginus iš 20. Jei kiaušinėlių išmatų mėginiuose nebuvo rasta, arba jų skaičius nesiekė 100 kiaušinėlių 1 grame išmatų, ferma iš kurios imti šie mėginai buvo pašalinama iš tyrimo.
20
2.3 Lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA)
Lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA) buvo taikytas aptikti antihelmintinį rezistentiškumą ivermektinui. Šiam tyrimui naudojamas ivermektino agikonas, kuris yra labiau tinkamas in vitro tyrimams, nes yra stabilesnis už ivermektiną. Šis testas atliekamas 96 akučių mikrotitro lėkštelėse (9 pav.).
9 pav. Mikrotitiro lėkštelės naudojamos LVMAT metodui.
Ivermektino aglikono tirpalas serijiniu būdu praskiedžiamas su dimetlsulfoksidu (DMSO) santykiu 1 : 2 kol gaunamos 12 koncentracijų nuo 0,084 iki 173,6 ng/ml-1. Vėliau 12 µl paruoštos koncentracijos ivermektino agliukono tirpalo sumaišoma su 150 µl 2% Bakto agaru. Kai agaras sukietėja, 10 µl kiaušinėlių, kurie yra 0,3 mg/ml koncentracijos amfotericino B tirpale (grybelių augimui sustabdyti), sumaišoma su 10 µl mielių ekstrakto ir supilama į agarą. Kiekvienoje lėkštelės akutėje turi būti nuo 50 iki 80 kiaušinėlių. Kontrolei naudojamos akutės be ivermektino agliukono, tik su 1,6 % dimetilsulfoksidu. Taip paruoštos mikrotitro lėkštelės 7 dienas laikomos termostate 27oC
21 temperatūroje. Po 7 dienų lervų vystymasis nutraukiamas į kiekvieną akutę įpilant po 25-50 µl Liugolio tirpalo. Tuomet kiekvienos akutės turinys praskiedžiamas vandeniu ir pilamas ant objektinio stiklelio bei mikroskopuojamas. Skaičiuojami visi kiaušinėliai, L1, L2 ir L3 stadijos lervos. Gauti
rezultatai žymini rezultatų lape (Priedas Nr.1) ir vėliau apdorojami pagal logistinės regresijos modelį [4, 36].
L3 stadijos lervos, rastos ribinėje 21,7 ng/ml-1 (ir didesnėje) ivermektino aglikono
koncentracijoje klasifikuojamos kaip rezistentiškos ivermektinui ir identifikuojamos pagal jų morfologines savybes, naudojantis schema pateikta prieduose (Priedas Nr.2). Taip pat antihelmintinis rezistentiškumas buvo vertinamas skaičiuojant vidutinę letalią koncentraciją (LC50) ir 99 procentų
letalią koncentraciją (LC99). Šioms reikšmėms nustatyti buvo naudojama Microsoft® Excel 2007
programa (skaičiavimo pavyzdys pridedamas prieduose – Priedas Nr. 3). Fermos buvo klasifikuojamos kaip rezistentiškos ivermektinui, jei LC50 reikšmė buvo didesnė nei 15,1 ir LC99
didesnė už 54,7.
Pasikliautinis intervalas buvo 95 proc. (95 proc. PI) apatinės bei viršutinės jo ribos buvo apskaičiuotos remiantis WAAVP rekomendacijomis [36]. Statistiniai skaičiavimai atlikti naudojant Microsoft® Excel 2007 ir IBM SPSS Statistics (Versija 21.0).
Tyrimai buvo atliekami laikantis mokslo ir mokymo tikslais naudojamų gyvūnų laikymo, priežiūros ir naudojimo reikalavimų (Nr. B1-866, 2012; Nr. XI-2271, 2012). Visi laboratoriniai tyrimai buvo atliekami Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Parazitologijos laboratorijoje.
22
3.TYRIMO REZULTATAI
Atlikus tyrimus, antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui buvo aptiktas 11 avių fermų iš 17. Visų fermų tyrimo rezultatai pateikiami 2 lentelėje. Rezistentiškumas buvo nustatomas atsižvelgiant į LC50 ir LC99 reikšmes, bei į L3 stadijos lervų kiekį 21,7 ng/ml-1 ivermektino aglikono
koncentracijoje.
2 lentelė. Antihelmintinio rezistentiškumo tyrimo naudojant LVTMA metodą rezultatų lentelė. Fermos numeris LC50 LC99 L3 Lervų skaičius 21,7 ng/ml-1 koncentracijoje, % Minimali inchibicinė koncentracija ng/ml-1 Atsparumo intervalas, % Antihelmintinio rezistentiškumo statusas 1 2,81 100,71 0 10,9 - Nėra 2 19,03 44,07 31 173,6 >30 Aukštas 3 17,7 17180,8 33 86,6 >30 Aukštas 4 19,5 677,6 27 43,4 10-30 Vidutinis 5 3,34 8436,7 24 43,4 10-30 Vidutinis 6 0,98 35,92 0 10,9 - Nėra 7 0,96 89430,6 10 21,7 10-30 Vidutinis 8 2,8 3084,5 29 43,4 10-30 Vidutinis 9 6,6 23,1 3 21,7 <10 Žemas 10 3,5 13,6 0 10,9 - Nėra 11 10,6 15,1 0 10,9 - Nėra 12 4,5 6,3 0 10,9 - Nėra 13 3 96,7 0 10,9 - Nėra 14 8,6 34,9 1 43,4 <10 Žemas 15 5,08 38 15 43,4 10-30 Vidutinis 16 7,1 111,7 19 43,4 10-30 Vidutinis 17 7,1 89,9 8 43,4 <10 Vidutinis
23
10 pav. Antihelmintinio rezistentiškumo ivermektinui procentinis pasiskirstymas avių ūkiuose.
Remiantis L3 stadijos lervų kiekiu 21,7 ng/ml-1 ivermektino aglikono koncentracijoje,
rezistentiškumas ivermektinui nustatytas 64,7 proc. ( 95 proc. PI 38,3 proc. – 85,8 proc.) tirtų Lietuvos avių fermų, ir 34,3 proc. (95 proc. PI 14,2 proc. - 61,7 proc.) avių ūkių rezistentiškumo ivermektinui neaptikta.
Atsparu 64,7 proc. Jautru
24
11 pav. Avių ūkių, kuriuose nustatytas antihelmintinis rezistentiškumas, pasiskirstymas pagal
rezistentiškumo išsivystymo lygį.
Nustatytas skirtingas antihelmintinio rezistentiškumo išsivystymo lygis ivermektinui avių fermose. Daugiausiai – 6 iš 11 fermų kuriose buvo nustatytas rezistentiškumas ivermektinui buvo nustatytas vidutinis rezistentiškumo lygis (rezistentiškumo intervalas 10 – 30 proc. L3 stadijos lervų
rastų 21,7 ng/ml-1 konc.). Tai rodo, kad 54,5 proc. ( 95 proc. PI 23,4 proc. – 83,3 proc.) rezistentiškų
ivermektinui fermų yra vidutinis antihelmintinio rezistentiškumo lygis. Žemas antihelmintinis rezistentiškumas (rezistentiškumo intervalas <10 proc.) buvo nustatytas 27,3 proc. (95 proc. PI 6,0 proc. – 61,0 proc.) fermų. Aukštas atsparumo lygis ( rezistentiškumo intervalas >30 proc. L3 stadijos
lervų rastų 21,7 ng/ml-1 konc.) nustatytas 2 iš 11 avių fermų, tai sudaro 18,2 proc. nuo bendro ištirto
skaičiaus (95 proc. PI 2,3 proc. – 54,8 proc.)
0 1 2 3 4 5 6 7 <10 10-30 >30 Fe rmų ska ičius Rezistentiškumo intervalas (%)
25
12 pav. Avių fermų kuriose buvo aptiktas antihelmintinis reziztentiškumas ivermektinui
pasiskirstymas pagal minimalią inhibicinę koncentraciją.
Antihelmintinio rezistentiškumo išsivystymo lygis gali būti vertinamas ir pagal minimalią inhibicinę koncentraciją. Minimali inhibicinė koncentracija – tai mažiausia antihelmintiko koncentracija stabdanti helmintų vystymąsi. Nustatyta, kad skirtingose fermose yra skirtingas atsparumo lygis (12 pav.). Fermoje Nr.2 nustatytas pats aukščiausias rezistentiškumo lygis. Mėginiuose iš šios fermos helmintų lervoms paveikti reikėjo net 173,6 ng/ml-1 ivermektino aglikono
koncentracijos, tai rodo labai didelį atsparumo laipsnį. Fermoje Nr.3 nustatytas aukštas atsparumo lygis, šioje fermoje mažiausia ivermektino aglikono koncentracija, veikianti helmintus buvo 86,6 ng/ml-1. Daugiausia fermų buvo nustatytas vidutinis atsparumo lygis, ir jose minimali ivermektino aglikono koncentracija buvo 43,4 ng/ml-1. Mažas atsparumo lygis nustatytas 2 fermose (Nr.7 ir Nr.9), kur minimali ivermektino koncentracija buvo 21,7 ng/ml-1.
173,6 86,6 43,4 43,4 21,7 43,4 21,7 43,4 43,4 43,4 43,4 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 2 3 4 5 7 8 9 14 15 16 17 Mini mali inc hibi cinė konc entra cij a ng /m l-1 , Fermos numeris
26
13 pav. Identifikuotų rezistentiškumu ivermektinui pasižyminčių helmintų lervų procentinis
pasiskirstymas Lietuvos avių ūkiuose.
Nustatinėjant antihelmintinį rezistentiškumą ivermektinui, ir skaičiuojant L3 stadijos lervas
21,7 ng/ml-1 ivermektino aglikono koncentracijoje, taip pat buvo identifikuojama lervų rūšis. Iš visų ištirtų rezistentiškumu ivermektinui pasižyminčių lervų, daugiausia identifikuota buvo Telodorsagia spp. – 45 proc. ( 95 proc. PI 35,0 proc. – 55,3 proc. P<0,05) ir Trichostrongylus spp. – 34 proc. ( 95 proc. PI 24,8 proc. – 44,2 proc.), vidutinis lygis nustatytas Cooperia spp. – 16 proc. ( 95 proc. PI 9,4 proc. – 24,7 proc.), ir žemiausias Heamonchus contortus. – 5 proc. ( 95 proc. PI 1,6 proc. – 11,3 proc.). Heamonchus contortus 5% Cooperia spp. 16% Tichostrongylus spp. 34% Teladorsagia spp. 45%
27
14 pav. Dviejų skirtingų antihelmintinio rezistentiškumo skaičiavimo metodų palyginimas.
Ištirtas, dviejų antihelmintinio rezistentiškumo nustatymo metodų skirtumas (14 pav.). Naudojant metodą, kai buvo vadovaujamasi tik LC50 ir LC99 reikšmėmis, rezistentiškumas nustatytas
10 iš 17 fermų, tai sudarė 58,8 proc. (95 proc. PI 32,9 proc. – 81,6 proc.). Taikant metodą, kai remiamasi ar yra išsivysčiusių L3 stadijos lervų ribinėje 21,7 ng/ml-1 ivermektino koncentracijoje,
rezistentiškumas ivermektinui aptiktas 11 iš 17 fermų, tai sudarė 64,7 proc. (95 proc. PI 38,3 proc. – 58,8 proc.) Palyginus šių dviejų metodų rezultatus, pirmuoju metodu, kai skaičiuojamos L3 stadijos
lervos 21,7 ng/ml-1 ivermektino aglikono koncentracijoje, buvo rasta 5,9 proc. (95 proc. PI 0,1 proc.
– 28,7 proc.) daugiau rezistentiškumo atvejų, negu antruoju metodu, kai remiamasi LC50 ir LC99
28
4. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS
Atliktais in vitro tyrimais nustatyta, kad avių antihelmintinis rezistentiškumas (AR) ivermektinui Lietuvoje yra aktuali problema. Net 64,7 proc. tirtų avių ūkių buvo aptiktas antihelmintis rezistentiškumas ivermektinui. Labai aukštas AR ivermektinui atsirado avių fermose ilgą laiką naudojant ivermektino preparatus. Papildoma aukšto AR priežastis galėtų būti, metodas, kai iš tyrimo buvo pašalintos avių fermos, kuriose bendras parazitų kiaušinėlių skaičius išmatose buvo nepakankamas in vitro tyrimams atlikti.
Anksčiau atliktuose in vivo tyrimuose naudojant FECRT (angl. faecal egg count reduction test) metodą, Lietuvoje antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui buvo nustatytas 12,5 proc. fermų [4]. Slovakijoje 2006 metais antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui buvo nustatytas 23 proc. tirtų avių fermų [37], o Ispanijoje atsparumas makrocikliniams laktonams siekė 16 proc. [7]. Taip pat, 2007 metais Italijoje atliktais tyrimais nustatytas antihelmintinis rezistentiškumas 2 fermose iš 3 tirtų ir tai sudarė 66,7 proc. [9]. Palyginus įvairių tyrimų rezultatus su Lietuvoje atliktais tyrimais nustatyta, kad Lietuvoje AR lygis buvo panašaus lygio kaip Italijoje, tačiau ženkliai didesnis nei Slovakijoje ir Ispanijoje. Tačiau skirtingi tyrimai buvo atlikti naudojant in vivo metodus, kurie nėra tokie jautrūs kaip in vitro lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA), naudotas mūsų tyrime, kuris gali aptikti ir žemesnį AR [38].
Suskirsčius avių ūkius, kuriuose buvo aptiktas AR ivermektinui į grupes pagal rezistentiškumo intervalą, buvo nustatyta, kad daugiausia 54,5 proc. ( 95 proc. PI 23,4 proc. – 83,3 proc.) ūkių priklausė vidutinio lygio atsparumo intervalui, mažiau - 27,3 proc. (95 proc. PI 6,0 proc. – 61,0 proc.) ūkių priklausė žemam atsparumo intervalui, bei mažiausiai - 18,2 proc. (95 proc. PI 2,3 proc. – 54,8 proc.) vidutinio atsparumo intervalui. Remiantis atliktų tyrimų rezultatais nustatyta, kad AR ivermektinui Lietuvos avių ūkiuose yra žemo arba vidutinio lygio., kurį galima kontroliuoti, naudojant didesnes antihelmintikų dozes, bei pakeičiant naudojamų antihelmintikų grupę. Esant aukštam antihelmintinio rezistentiškumo lygiui yra tikimybė AR vystymuisi kitoms antihelmintikų grupėms, kurį kontroliuoti yra sunku.
Vertinant antihelmintinio atsparumo išsivystymo lygį individualiuose ūkiuose, buvo atsižvelgiama į minimalią inhibicinę koncentraciją. Aukščiausia nustatyta Fermoje Nr.2, kur ivermektino aglikono koncentracija buvo- 173,6 ng/ml-1. Ištirta, kad norint išgydyti užsikrėtimą virškinamojo trakto parazitais šioje fermoje, reikia maksimalios vaistų dozės. Tačiau makrociklinių laktonų grupės preparatai ir labai didelėmis dozėmis nebeveiks šioje fermoje esančių helmintų populiacijos, nes nustatyta, kad parazitai pasižymintys rezistentiškumu vienam iš makrociklinių
29 laktonų, kaip pavyzdžiui ivermektinui, dažniausiai yra atsparūs ir kitiems tos pačios grupės preparatams [31]. Tai, kad daugumoje fermų minimali inhibicinė koncentracija buvo 43,4 ng/ml-1,
rodo, kad daugumoje avių fermų AR yra kontroliuojamas. Ištirta, kad avių bandoje AR ivermektinui yra labai individualus ir tai gali būti dėl vieno ar keleto individų su labai aukšto AR lygiu įtakos visos bandos antihelmintinio rezistentiškumo situacijai.
Lietuvos avių fermose antihelmintiniu rezistentiškumu ivermektinui pasižymėjo šių rūšių virškinamojo trakto helmintai: Teladorsagia spp. – 45 proc., Trichostrongylus spp. - 34 proc., Cooperia spp. - 16 proc. ir Heamonchus contortus - 5 proc.
Teladorsagia spp. yra dominuojanti helmintų rūšis pasižyminti rezitentiškumu ivermektinui Ispanijoje [39]. Jungtinėje Karalystėje ir Italijoje antihelmintinis rezistentiškumas dažniausiai buvo nustatytas Trichostrongylus spp ir Teladorsagia spp. [9, 40]. Graikijoje vyravo Trichostrongylus spp. bei Heamonchus contortus [11]. Švedijoje antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui nustatytas tik Heamonchus spp. rūšies nematodams, o Šveicarijoje ir Vokietijoje Heamonchus contortus yra dažniausiai AR ivermektinui pasižymintis parazitas [41, 42]. Olandijoje aukščiausią AR ivermektinui nustatė Cooperia curticei rūšies populiacijoje [14]. Palyginus užsienio valstybių mokslininkų nustatytus rezultatus galima teigti jog, Lietuvoje vyraujančios ivermektinui rezistentiškos helmintų rūšys (Teladorsagia spp. ir Trichostrongylus spp.) atitinka situaciją esančią Ispanijoje, Jungtinėje Karalystėje ir Italijoje.
Tyrimo metu antihelmintinis rezistentiškumas buvo nustatomas dviem metodais : 1) apskaičiuojant LC50 ir LC99 reikšmes ir 2) remiantis ribinėje 21,7 ng/ml-1 koncentracijoje rastų
išsivysčiusių L3 stadijos lervų buvimu. Palyginus šiais metodais nustatytus AR rezultatus galima
teigti jog antruoju metodu AR aptikta 5,9 proc. daugiau ūkių negu naudojantis pirmuoju AR nustatymo metodu. Atliekant statistinę duomenų analizę nustatyta, jog pirmuoju metodu (LC50,LC99)
užtrunkama ilgesnį periodą, nes reikalinga suskaičiuoti visuose mikrotitro lėkštelės akutėse esančius kiaušinėlius, ir visų išsivystymo stadijų parazitų lervas. Antruoju metodu, nustatant antihelmintinį rezistentiškumą, užtenka patikrinti ribinės koncentracijos akutės turinį, ir radus išsivysčiusias L3
stadijos lervas, ūkis arba kitas tyrimo objektas klasifikuojamas kaip rezistentiškas. Dėl to, jog yra vertinama tik viena akutė ir nereikia atlikti sudėtingų skaičiavimų, tyrimams sutaupoma daug laiko, o rezultatai yra tikslesni, nei skaičiuojant LC50 ir LC99 reikšmes. Nustatyta, kad šis metodas
atsižvelgiant į lervų vystymąsi ribinėje koncentracijoje yra tikslesnis siekiant nustatyti antihelmintinį rezistentiškumą.
30
IŠVADOS
1. Pritaikius in vitro LVTMA metodą, buvo nustatytas avių parazitų antihelmintinis rezistentiškumas ivermektino aglikonui.
2. Antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui nustatytas 64,7 procentuose tirtų ūkių. 3. Nustatyta, jog Lietuvos avių ūkiuose antihelmintinis rezistentiškumas yra vidutinio lygio.
4. Ištirta, kad pagal atskiras avių helmintų rūšis antihelmintinį rezistentiškumą ivermektinui turėjo: Teladorsagia spp. – 45 proc. ir Trichostrongylus spp. – 34 proc., Cooperia spp. – 16 proc. ir Haemonchus contortus – 5 proc.
5. Nustatyta, kad avių antihelmintinis rezistentiškumas Lietuvoje yra panašaus arba aukštesnio lygio negu kitose Europos valstybėse, t.y. Italijoje, Ispanijoje ir Slovakijoje.
31
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju už pagalbą ir patarimus ruošiant baigiamąjį magistrinį darbą, savo darbo vadovui prof. habil. dr. Sauliui Petkevičiui.
Už pagalbą renkant mėginius, atliekant tyrimus, renkant literatūrą ir už nuoširdų bendradarbiavimą dėkoju LSMU VA Užkrečiamųjų ligų katedros veterinarinės parazitologijos doktorantui Tomui Kupčinskui.
32
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centras. LIETUVOS ŽEMĖS ŪKIS Faktai ir
skaičiai. Vilnius. 2014. T. 40 P. 34
2. Várady M., Papadopoulos E., Dolinská M., Königová A. Anthelmintic resistance in parasites of small ruminants: sheep versus goats. Helminthologia. 2011. T. 48. P. 137 – 144.
3. Gilleard, J.S., Understanding anthelmintic resistance: The need for genomics and genetics. Int. J. Parasitol. 2006. T.36. P. 1227–1239.
4. Kupčinskas T., Stadalienė I., Trusevičius P., Varady, M., Petkevičius S. Worm-control practices and prevalence of anthelmintic resistance using in vivo FECRTs on smallholder sheep farms in Lithuania. Helminthologia. 2015. (in press)
5. Coles G.C., Tritschler II J.J., Giordano D.J., Laste N.J., Schmidt A.L. A larval development test for detection of anthelmintic resistant nematodes. Res. Vet. Sci. 1988. T.45. P. 50-53.
6. Čerñanská D., Várady M., Čudeková P., Čorba J. Worm control practices on sheep farms in the Slovak Republic. Vet. Parasitol. 2008. T.154. P. 270 – 276.
7. Alvarez-Sanchez M.A., Perez-Garcia J., Cruz-Rojo M.A., Rojo-Vasquez F.A. Anthelmintic resistance in trichostrongylid nematodes of sheep farms in Northwest Spain. Parasitol. Res. 2006. T.99. P. 78-83.
8. Álvarez-Sánchez, M.A., Mainar-Jaime, R.C., Pérez-García, J., Monteagudo-Rodríguez, M., Martín-Gómez, S., Rojo-Vázquez, F.A. : Anthelmintic resistance in small-ruminant flocks in Spain: extension in the Leon province (NW). In Abstracts to the 18th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology, August. 2001. P.155
9. Traversa D., Paoletti B., Otranto D., Miller J. First report of multiple drug resistance in trichostrongyles affecting sheep under field conditions in Italy. Parasitol. Res. 2007. T.101. P. 1713 – 1716.
10. Zanzani S. A., Gazzonis A. L., Cerbo A. D., Varady M., Manfredi M. T. Gastrointestinal nematodes of dairy goats, anthelmintic resistance and practices of parasite control in Northern Italy. BMC Veterinary Research. 2014. T.10. P. 114.
11. Papadopoulos E. Anthelmintic resistance in sheep nematodes.. Small Rumin. Res. 2008. T.76. P. 99–103
33 12. Taylor M.A., Learmount J., Lunn E., Morgan C., Craig B. H. Multiple resistance to anthelmintics in sheep nematodes and comparison of methods used for their detection. Small Rumin. Res. 2009. T.86. P. 67 – 70.
13. McMahon, C., Bartley, D.J., Edgar, H.W.J., Ellison, S.E., Barley, J.P., Malone, F.E., Hanna, R.E.B., Brennan, G.P., Fairweather, I. Anthelmintic resistance in Northern Ireland (I): Prevalence of resistance in ovine gastrointestinal nematodes, as determined through faecal egg count reduction testing. Vet. Parasitol. 2013. T.195. P. 122– 130.
14. Borgsteede F.H. M., Dercksen D.D., Huijbers R. Doramectin and albendazole resistance in sheep in the Netherlands. Vet. Parasitol. 2007. T.144. P. 180–183.
15. Bowman D.D., Coles T.B., Eberhard M.L., Lighttowler M.W., Lynn R.C., Little S.E. Georgis‘ parasitology for veterinarians 10th edition. Sant Louis. 2014. P. 162-166.
16. Shapiro L. S. Pathology and Parasitology for Veterinary Technicians, Second Edition. New York. 2010. P. 162-180.
17. Indre D., Dărăbus G.H., Oprescu I., Morariu S., Mederle N., Ilie M.S., Hotea I., Imre K., Balint A. Morphometrical studies on some eggs of gastrointestinal nematodes from sheep. Lucrări stiinłifice medicină veterinară. 2010. T. 43 P. 30-35.
18. Kao R.R., Leathwick D.M., Roberts M.G., Sutherland I. A. Nematode parasites of sheep: survey of epidemiological parameters and their application in a simple model. Parasitology. 2000. T. 121. P. 85 – 103.
19. Taylor M.A., Coop R.L., Wall R.L. Veterinary parasitology third edition.Oxford. 2007. P. 404-404, 414-422, 433-434, 1777-1782.
20. Stromberg B.E., Gasbarre L.C., Waite A, et al: Cooperia punctata: effect on cattle productivity? Vet Parasitol. 2012. T.183:284
21. Matusevičius A., Špakauskas V. Antimikrobinės ir antiparazitinės vaistinės medžiagos ir vaistai veterinarijoje. Kaunas. 2005. P. 250 – 329, 391 – 416.
22. Špakauskas V., Matusevičius A., Perlinienė V. Ivermektino ir levamizolio hidrochlorido efektyvumas gydant kiaules nuo helmintų. Veterinarija ir zootechnika (Vet Med Zoot). 2009. T. 48 (70). P. 77 – 85.
23. Bliss D.H. Strategic “0 – 3 – 6 - 9” Parasite Control for Small Ruminants Designed to Reduce Environmental Contamination. MidAmerica Ag Research Verona, WI (Prieiga internetu 2015.11.27
http://www.midamericaagresearch.net/documents/Strategic%20Deworming%20for%20Small%20R uminants.pdf )
34 24. Waller P.J. Sustainable nematode parasite control strategies for ruminant livestock by grazing management and biological control. Animal Feed Science and Technology. 2006. T.126. P.277-289.
25. Pisseri F., de Benedictis C., Roberti di Sarsina P., Azzarello B.. Sustainable animal production, systemic prevention strategies in parasitic diseases of ruminants. Alternative and Integative Medicine, 2013. T.2(106) P.1-7
26. Wolstenholme A.J., Rogers A.T. Glutamate-gated chloride channels and the mode of action of the avermectin/milbemycin anthelmintics, Parasitology. 2005. T.13 P.85.
27. Almeida G.D., Feliz D.C., Heckler R.P., et al. Ivermectin and moxidectin resistance characterization by larval migration inhibition test in field isolates of Cooperia spp. in beef cattle, Mato Grosso do Sul, Brazil. Vet Parasitol 2013.T.191. P.59.
28. Geary T.G., Bourguinat C., Prichard R.K. Evidence for macrocyclic lactone anthelmintic resistance in Dirofilaria immitis. Top Companion Anim Med. 2011. T.26. P.186
29. Traversa D, von Samson-Himmelstjerna G, Demeler J, et al. Anthelmintic resistance in cyathostomin populations from horse yards in Italy, United Kingdom and Germany. Parasit Vector. 2009.
30. Kaplan R.M., Vidyashankar A.N. An inconvenient truth: global worming and anthelmintic resistance, Vet Parasitol 2012. T.186. P.70
31. Wolstenholme A. J., Fairweather I., Prichard R., Samson-Himmelstjerna G., Sangester N. C. Drug resistance in veterinary helminths. Trends in Parasitology. 2004. 20. P. 469-473.
32. Sangster N.C., Whitlock H.V., Russ L.G., Gunaran M., Griffin D.L., Kelly J.D. Trichostrongylus colubriformis and Ostertagia circumcincta resistant to levamisole, morantel tartrate and thiabendazole: occurence of field strains. Res. Vet. Sci. 1979. T. 27. P. 106-110.
33. Dolinska M., Königová A., Letková V., Molnár L., Várady M. Detection of ivermectin resistance by a larval development test – Back to the past or step forward? Vet Parasitol. 2013. T. 198. P. 154-158.
34. MAFF (Ministry of Agriculture, Fisheries and Food) Manual of veterinary parasitology laboratory techniques, 3rd ed. gb, London. 1986.
35. Varady M., Čerñanská D., Čorba J. Use of two in vitro methods for the detection of anthelmintic resistant nematode parasites on Slovak sheep farms. Vet. Parasitol. 2006. T. 135. P. 325-331.
36. Coles, G. C., Bauer, C., Borgsteede, F. H. M., Geerts, S., Klei, T. R., Taylor, M. A., Waller, P. J. World Associaton for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.) methods for the dtection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance. Vet. Parasitol., 1992. T.44 P.35 – 44.
35 37. Čerñanská, D., Várady, M., Čorba, J., A survey on anthelmintic resistance in nematode parasites of sheep in the Slovak Republic. Vet. Parasitol. 2006. T.135. P.39 – 45.
38. Varady M., Čerñanská D., Čorba J. Use of two in vitro methods for the detection of anthelmintic resistant nematode parasites on Slovak sheep farms. Vet. Parasitol. 2006. T. 135. P. 325-331.
39. Díez-Banos P., Pedreira J., Sánchez-Andrade R., Francisco I., Suárez J.L.,Díaz, P., Panadero R., Arias M., Painceira A., Paz-Silva A., Morrondo P. Field evaluation for anthelmintic-resistant ovine gastrointestinal nematodes by in vitro and in vivo assays. J. Parasitol. 2008. T.94. P.925–928.
40. Bartley D. J., Nonnan A. A., Jackson E., Sargison N., Mitchell G. B. B., Jackson F. A small scale survey of ivermectin resistance in sheep nematodes using the faecal egg count reduction test on samples collected from Scottish sheep. Vet. Parasitol. 2006. T.137. P.112 – 118.
41. Höglund J., Gustafsson K., Ljungström B. L., Engström A., Donnan A., & Skuce P. Anthelmintic resistance in Swedish sheep flocks based on a comparison of the results from the faecal egg count reduction test and resistant allele frequencies of the β-tubulin gene. Veterinary parasitology. 2009. T.161. P.60-68.
42. Scheuerle M. C., Mahling M., & Pfister K. Anthelminthic resistance of Haemonchus contortus in small ruminants in Switzerland and Southern Germany. Wiener klinische Wochenschrift. 2009. T.121. P.46-49.
36
PRIEDAI
Priedas Nr.1 Rezultatų lapas (pavyzdys).Lervų vystimosi testo mikro agare rezultatų lentelė Informasija apie vietovę, pavadinimas:
Tyrimo data, laikas:
IVM-Ag LC50 -
LC99
-12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Veiklioji medžiaga Koncentracija ng/ml-1 173,6 86,6 43,4 21,7 10,85 5,42 2,71 1,35 0,68 0,34 0,169 0,085
IVM-Ag A Kiaušinėliai L1+L2 L3 Viso: IVM-Ag Koncentracija ng/ml-1 173,6 86,6 43,4 21,7 10,85 5,42 2,71 1,35 0,68 0,34 0,169 0,085 B Kiaušinėliai L1+L2 L3 Viso: Kontrolė 1,25 % DMSO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Kontrolė Kiaušinėliai L1+L2 L3 Viso:
IVM-Ag – Ivermektino anglikonas; DMSO- dimetilsulfoksidas ; IVM-Ag slenkstis 10,9 ng/ml-1. L3 21,7 ng/ml-1 konc. rodo rezistentiškumą esant
37
38
