Avių virškinamojo trakto nematodų rezistentiškumas antihelmintinėms medžiagoms Marijampolės rajone

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas

Agnė Murauskaitė

Avių virškinamojo trakto nematodų

rezistentiškumas antihelmintinėms medžiagoms

Marijampolės rajone

Anthelmintic resistance of sheep gastrointestinal

nematodes in Marijampole district

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: prof. habil. dr. Saulius Petkevičius

2 DARBAS ATLIKTAS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Avių virškinamojo trakto nematodų rezistentiškumas antihelmintinėms medžiagoms Marijampolės rajone“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (redaktoriaus vardas, pavardė)

(parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė)

(parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė)

3

TURINYS

1.1.Dažniausiai pasitaikantys nematodai avims... .9

1.2.GIN vystymosi ciklas ... 9

1.3.Nematodų vystymąsi įtakojančios aplinkos sąlygos ...11

1.4.Pavojingos avių nematodozės ir jų sukėlėjai ... 11

1.4.1.Hemonchozė ... 11

1.4.2.Teladorsagiozė ... 13

1.4.3.Trichostrongiliozė... 13

1.4.4.Nematodirozė ... 14

1.5.Avių virškinamojo trakto nematodozių gydymas ... 14

1.5.1.Benzimidazolai ... 14

1.5.2.Makrocikliniai laktonai ... 15

1.5.3.Imidazotiazoliai ... 15

1.6.Antihelmintinio rezistentiškumo apžvalga ... 16

1.7.AR atsiradimo mechanizmas ... 17

1.8.AR diagnozavimo metodai ... 17

1.8.1.Kiaušinėlių sumažėjimo testas (KST) ... 17

1.8.2.Kiaušinėlių nėrimosi testas (KNT) ... 18

1.8.3.Lervų vystymosi mikro-agare testas (LVMAT)... 18

1.9.Antihelmintikų naudojimo alternatyvos ... 18

1.9.1. Nematodus veikiančios natūralios medžiagos ... 18

1.9.2.Vakcinacija nuo GIN ... 19

1.9.3.GIN atsparių selektyvus avių veislių kūrimas ... 20

1.9.4.Tinkamai taikomas antihelmintinis gydymas ... 20

2.TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 21

3.TYRIMO REZULTATAI... 26

4.REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 30

IŠVADOS ... 32

PADĖKA ... 33

4

SANTRUMPOS

GIN – gastrointestinaliniai nematodai AR – antihelmintinis rezistentiškumas BZ – benzimidazolai ML – makrocikliniai laktonai TBZ – tiabendazolas LEV – levamizolis IVM – ivermektinas

IVM-Ag – ivermektino aglikonas

FECRT – (angl. the fecal egg count reduction test) išmatų kiaušinėlių sumažėjimo testas LVMAT – lervų vystymosi mikro-agare testas

KST – kiaušinėlių sumažėjimo testas KNT – kiaušinėlių nėrimosi testas

EPG – (angl. eggs per gram) kiaušinėlių skaičius grame išmatų DMSO – dimetilsulfoksidas

5 AVIŲ VIRŠKINAMOJO TRAKTO NEMATODŲ REZISTENTIŠKUMAS

ANTIHELMINTINĖMS MEDŽIAGOMS MARIJAMPOLĖS RAJONE

Agnė Murauskaitė

Magistro baigiamasis darbas

SANTRAUKA

Darbą sudaro: įvadas, literatūros apžvalga, tyrimo metodika, tyrimų rezultatai, rezultatų apibendrinimas, išvados, literatūros sąrašas. Darbo apimtis – 37 puslapiai. Jame yra 1 lentelė, 7 paveikslėliai, 6 grafikai. Panaudoti 42 literatūros šaltiniai.

Šio baigiamojo darbo tyrime buvo stengiamasi išsiaiškinti, koks yra antihelmintinio rezistentiškumo benzimidazolams, ivermektinui, levamizoliui paplitimas bei lygis Marijampolės rajone. Taip pat tyrime buvo identifikuojamos atsparumu pasižyminčios L3 stadijos lervos. Gauti duomenys buvo lyginami su anksčiau atliktais Lietuvos bei užsienio valstybių tyrimų gautais rezultatais.

Tyrimas buvo atliekamas 2019 m. gegužės – lapkričio mėnesiais. Buvo atrinkta ir ištirta 11 avių fermų, išsidėsčiusių Marijampolės rajone. Per pastaruosius 3–5 metus visose fermose buvo atliekama profilaktinė ir/arba gydomoji dehelmintizacija įvairių grupių antihelmintikais. Tyrimui buvo pasirenkamos tik tos fermos, kuriose paskutinis antihelmintinis avių gydymas buvo vykdytas mažiausiai prieš 2 mėnesius. Laboratoriniai tyrimai buvo atliekami LSMU Veterinarijos akademijos Patobiologijos katedros Parazitologijos laboratorijoje, laikantis Lietuvos gyvūnų gerovės taisyklių (Nr. B1-866, 2012; Nr. XI-2271, 2012). Tyrimams buvo naudojami modifikuotas MacMasterio metodas ir lervų vystymosi mikro-agare testas (LVMAT).

In vitro tyrimais (LVMAT) antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui nustatytas 27,3 proc.

tirtų avių ūkių, o tiabendazolui 36,4 proc. ūkių. Levamizoliui antihelmintinis rezistentiškumas nebuvo aptiktas nei vienoje Marijampolės rajono tirtoje fermoje. Tirtuose ūkiuose dažniausiai buvo nustatomas vidutinio lygio antihelmintinis rezistentiškumas. Atlikus in vitro tyrimus nustatyta, kad Marijampolės rajone paplitę atsparūs antihelmintikams nematodai yra Teladorsagia ir

Trichostrongylus.

Raktažodžiai: avys, nematodai, benzimidazolai, ivermektinas, levamizolis, antihelmintinis rezistentiškumas, lervų vystymosi mikro-agare testas.

6 ANTHELMINTIC RESISTANCE OF SHEEP GASTROINTESTINAL NEMATODES IN

MARIJAMPOLE DISTRICT

Agnė Murauskaitė

Master‘s Thesis

SUMMARY

Master‘s Thesis consists of an introduction, literature review, research results and discussion, conclusions and list of references. The work contains 6 graphs, 1 table, 7 pictures and 42 references. Thesis consists of 38 pages.

The objectives of this Master‘s Thesis were to investigate anthelmintic resistance (AR) of sheep gastrointestinal nematodes to benzimidazoles, ivermectins and levamizole in Marijampole district, Lithuania. In addition, the resistant sheep nematodes L3 stage larvae were identified. Study results were compared with previously performed sheep AR studies in Lithuania and worldwide.

The study period was from May till November, 2019. In total eleven sheep farms were selected and investigated in Marijampole district. In all selected sheep farms during the last 3-5 years, but not during the last 2 month, prophylaxis and/or treatment with anthelmintics were performed. The work was carried out at the Laboratory for Parasitology, Department of Veterinary Pathobiology, Veterinary Academy of the Lithuanian University of Health Sciences. The study was performed in compliance with Lithuanian animal welfare regulations (No. B1-866, 2012; No. XI-2271, 2012). The study was performed using a modified MacMaster technique and micro-agar larval development test (MALDT) in vitro methods.

The results from in vitro (MALDT) study shows, that in Marijampole district AR to ivermectin and thiabendazole was registered in 27.3% and 36.4% оf investigated sheep farms. However, no cases of AR to levamisole were detected. The most common nematodes with highest AR in sheep farms were Teladorsagia ir Trichostrongylus. The results from this study showed middle range of AR on investigated sheep farms in Marijampole district.

Key words: sheep, nematodes, benzimidazole, ivermectin, levamisole, antihelmintic resistance, micro-agar larval development test.

7

ĮVADAS

Remiantis Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro (ŽŪIKVC) duomenimis, nuo 2014 metų iki 2019 metų pradžios auginamų avių Lietuvoje daugėja. Per minėtą laikotarpį avių skaičius išaugo 62 951 vnt. Remiantis minėto šaltinio duomenimis, 2019 metų pabaigoje Lietuvoje buvo auginama 163 133 vnt. avių. Nuo 2014 m. padidėjo ir vidutinis avių bandos skaičius, kuris 2019 metais siekė vidutiniškai 15,6 avių bandoje (1).

Virškinimo trakto nematodozės yra vienos labiausiai paplitusių ir reikšmingų parazitinių ligų, pasireiškiančių avių ūkiuose (2). Tai sukelia didelę ekonominę žalą ne tik Lietuvoje, bet ir visame pasaulyje (3). Parazituojantys virškinimo trakte nematodai turi reikšmingos įtakos avių produkcijos mažėjimui (4). Šių parazitų invazijos įtakoja avių augimą, vaisingumą, mėsos kokybę, vilnos ir pieno produkciją (5). Dažniausiai pasitaikantys ir turintys didžiausią reikšmę avių sveikatai yra

Teladorsagia, Trichostrongylus ir Haemonchus, priklausantys trichostrongylidų šeimai (5, 6, 7, 8).

Avių virškinamojo trakto nematodų kontrolė dažniausiai yra atliekama naudojant plataus veikimo spektro antihelmintines medžiagas: levamizolį, benzimidazolus, avermektinus (7). Nepaisant laiku pritaikyto strateginio antihelmintinio gydymo, šis nematodų kontrolės būdas daugeliui atvejų yra nevisiškai efektyvus. Tai lemia išsivystęs nematodų antihelmintinis rezistentiškumas (AR), kuriam įtakos turi per didelių vaistų dozių ir per dažnas jų naudojimas avių nematodozių gydyme (3). Antihelmintinio atsparumo vystymąsi taip pat skatina daugumos ūkininkų netiriamas antihelmintikų efektyvumas, netaikoma tvartų dezinvazija, nenaudojama ganyklų rotacija ir selektyvus gydymas (10).

Šaltesnio klimato vietovėse atsparių nematodų padermių atsiradimo tempas paprastai yra mažesnis lyginant su šiltesnio klimato zonomis. Tačiau šios tendencijos vis labiau kinta dėl tarptautinės prekybos avimis bei vis labiau kintančių klimato sąlygų (9). Avių virškinamojo trakto nematodų antihelmintinis rezistentiškumas yra nustatytas daugelyje regionų: Australijoje, Naujojoje Zelandijoje, Šiaurės ir Pietų Amerikos žemynuose, Azijoje, Afrikoje bei Europoje (2). Svarbu tai, kad antihelmintinis rezistentiškumas yra įgytas visoms antihelmintikų klasėms, išskyrus kai kuriuos neseniai atsiradusius vaistus (pvz.: derkvantelį). Todėl šiuo metu daug dėmesio yra skiriama alternatyvioms kontrolės priemonėms gydant nematodozes (11).

Magistrinio darbo tikslas: Naudojant lervų vystymosi mikro-agare testą nustatyti avių virškinamojo trakto nematodų antihelmintinį rezistentiškumą benzimidazolams, ivermektinui ir levamizoliui Marijampolės rajono avių ūkiuose.

8 Magistrinio darbo uždaviniai:

1. Nustatyti antihelmintinio rezistentiškumo benzimidazolams, ivermektinui ir levamizoliui paplitimą tirtuose Marijampolės rajono avių ūkiuose naudojant in vitro lervų vystymosi mikro-agare testą. 2. Nustatyti mišraus antihelmintinio rezistentiškumo paplitimą tirtuose avių ūkiuose.

3. Įvardinti dažniausiai nustatyto antihelmintinio rezistentiškumo lygį tirtuose avių ūkiuose. 4. Identifikuoti tirtose avių fermose aptiktų rezistentiškų avių virškinamojo trakto nematodų rūšis. 5. Palyginti gautus antihelmintinio rezistentiškumo paplitimo rezultatus su užsienio valstybių tyrimų

9

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Dažniausiai pasitaikantys nematodai avims

Avių šliuže parazituojantys Teladorsagia (Ostertagia) circumcincta ir Haemonchus contortus bei plonojoje žarnoje aptinkami Nematodirus battus yra patogeniškiausi nematodai, kurie gali sukelti gyvulių gaišimus. Tačiau avims yra retai diagnozuojamas vienas nematodozės sukėlėjas, dažniausiai šias ligas sukelia kelios nematodų rūšys (3, 12, 13, 14). Kiti parazitai, kaip Cooperia, Chabertia,

Oesophagostomum ir Marshallagia smulkiesiems atrajotojams yra mažiau pavojingi (6). 1 lentelėje

pateikti avių virškinimo trakte parazituojantys GIN bei patogeniškumo įvertinimas.

1 lentelė. Avių virškinimo trakte aptinkamų nematodų parazitavimo lokalizacija ir patogeniškumo

laipsnis šeimininko organizmui (15)

Mokslinis pavadinimas Parazitavimo vieta Patogeniškumo laipsnis

Haemonchus contortus Šliužas Aukštas

Nematodirus battus Plonoji žarna Aukštas

Teladorsagia circumcincta Šliužas Aukštas

Nematodirus spathiger Plonoji žarna Vidutinis

Trichostrongylus axei Šliužas Vidutinis

Trichostrongylus colubriformis Plonoji žarna Vidutinis

Bunostomum trigononcephalum Plonoji žarna Vidutinis

Trichostrongylus vitrinus Plonoji žarna Vidutinis

Chabertia ovina Storoji žarna Žemas

Cooperia curticei Plonoji žarna Žemas

Nematodirus filicollis Plonoji žarna Žemas

Strongyloides papillosus Plonoji žarna Žemas

Trichuris ovis Storoji žarna Žemas

Oesophagostomum venulosum Storoji žarna Žemas

Invazijos sunkumui didelės įtakos turi į virškinimo traktą patekusių nematodų lervų skaičius, jų rūšis (16). Parazitozių klinikinių simptomų atsiradimą taip pat įtakoja tam tirkos šeimininko ir parazito savybės: gyvulio amžius, imunitetas, lytis ir veislė bei nematodo vystymosi ciklo trukmė, lervų rezistentiškumas aplinkos faktoriams ir parazitavimo lokalizacija šeimininko organizme (3). Prastos kokybės pašarai, mikroelementų trūkumas ir išsivystęs nematodų antihelmintinis rezistentiškumas yra vieni reikšmingiausių faktorių parazitozių pasireiškimui (12).

1.2. Virškinamojo trakto nematodų (GIN) vystymosi ciklas

Daugumos Trichostrongylidae šeimos nematodų vystymosi ciklas yra labai panašus, visi jie vystosi tiesioginiu būdu, be tarpinių šeimininkų (3).

10 Iš su išmatomis į aplinką patekusių kiaušinėlų išsirita lerva, kuri neriasi du kartus kol tampa L3 stadijos lerva (vidutiniškai tai trunka 2–3 savaites) (8). L3 stadijos lerva yra invazinė, kuri turi apsauginį sluoksnį, saugantį nuo aplinkos neigiamų sąlygų. Šeimininkas užsikrečia prarijęs L3 stadijos lervą, kuri skrandyje praranda ją saugantį apvalkalą (3). Trichostrongilų L3 stadijos lervos priklausomai nuo rūšies migruoja į šliužą, plonąją ar storąją žarnas. Ten parazitai praduria gleivinės epitelinį sluoksnį (Haemonchus, Trichostrongylus) ar įsiskverbia į skrandžio liaukas (Teladorsagia) ir toliau vystosi 2-3 dienas kol tampa L4 stadijos lervomis (16). L4 stadijos lerva po 14 dienų tampa jaunu suaugusiu nematodu. Laikotarpis nuo L3 stadijos lervos patekimo į virškinimo traktą iki helminto kiaušinėlių pasirodymo išmatose trunka apie 16-21 dienų (1 pav.). Jeigu gyvulio imuninė sistema yra nusilpusi ir yra nenaudojami antihelmintiniai vaistai, suaugę nematodai avių virškinimo trakte gali išgyventi keletą mėnesių (8, 17).

1 pav. Strongilidų vystymosi ciklo schema: nuo invazinės L3 stadijos lervos susiformavimo

aplinkoje iki nematodų kiaušinėlių pasirodymo išmatose (3)

Esant nepalankioms sąlygoms, dažniausiai avių ganymo sezono pabaigai, kai kurie strongilidai (H. contortus, T. axei, Teladorsagia ir Nematodirus rūšys) tampa hipobiozės būsenos (3). Šių nematodų vystymasis šeimininkų organizme laikinai sustoja ties L4 lervos stadija. Tokiu būdu gyvulių organizme kaupiasi nesubrendę nematodai, kurių kiaušinėlių išmatose nėra aptinkama (8). Hipobiozės būsena baigiasi atėjus kitam ganymo sezonui: Haemonchus lervos vėl aktyvios tampa

11 kitą pavasarį, o Teladorsagia rudenį. Tai dažnai sutampa su ėriavimosi sezonu, kai avių imunitetas yra nusilpęs. Tuo metu ėringų avių išmatose akivaizdžiai padidėja kiaušinėlių skaičius, kuriais yra užkrečiamos ganyklos (3).

Nematodirus battus turi lėčiausią vystymosi ciklą lyginant su kitomis nematodų rūšimis (12).

Pagrindinis N. battus gyvenimo ciklo skirtumas yra tas, kad invazinė lerva vystosi kiaušinėlio viduje, tai trunka apie 2 mėnesius. Prieš išsiritant L3 stadijos lervoms, turi praeiti šaltasis periodas, po kurio seka atšilimas (10°C ir aukštesnė oro temperatūra) (8, 18). Tai reiškia, kad iš vasarą atsiradusio kiaušinėlio lervos išsirita tik sekantį pavasarį, o kartais tai gali įvykti po kelių metų (8). Ilgas kiaušinėlių išgyvenamumas aplinkoje lemia santykinai ilgą nematodų kartos vystymąsi (12).

1.3. Nematodų vystymąsi įtakojančios aplinkos sąlygos

Regionų skirtingos klimato sąlygos: oro temperatūra, žemės drėgmė yra svarbiausi veiksniai, nulemiantys nematodų rūšių epidemiologiją ir jų geografinį pasiskirstymą (3).

Tropinio klimato zonose, kuriose iškrenta daug kritulių ir dažniausiai būna aukšta oro temperatūra, labiausiai paplitusios nematodų rūšys yra H. contortus ir T. colubriformis, o vėsesnio klimato vietovėse – Teladorsagia circumcincta (19). T. circumcincta kiaušinėliai gali išgyventi esant 0-10℃ oro temperatūrai, tačiau H. contortus kiaušinėliai žūsta esant <10℃, o T. colubriformis <5℃ oro temperatūrai (3).

Optimaliausia temperatūra helmintų lervų išsiritimui, jų vystymuisi ir išgyvenimui aplinkoje:

H. contortus – 25℃–37℃; T. colubriformis – 22℃–33℃ ir T. circumcincta yra reikalinga 16℃–

30℃ oro temperatūra. Tačiau kai kurių rūšių nematodų lervos yra prisitaikiusios prie žemos temperatūros ir gali išgyventi aplinkoje visą žiemą (Teladorsagia, Trichostrongylus). Taip pat yra pastebėta, kad pernelyg aukšta oro temperatūra L3 stadijos lervoms yra žalinga. Esant labai aukštai oro temperatūrai labai suaktyvėja medžiagų apykaita ir lervos sunaudoja visas savo organizmo rezervines maisto medžiagas. Tai yra L3 stadijos lervoms pražūtinga, kadangi lervos maitintis gali tik joms patekus į šeimininko virškinimo traktą (8).

Nematodų lervų vystymuisi žemės drėgmė turėtų būti >80 proc. L3 stadijos lerva yra atsparesnė drėgmės trūkumui negu L1 ar L2 stadijos lervos, nes ji turi apsaugą suteikiančią kutikulę, kuri taip pat apsaugo nuo žemos oro temperatūros. Kai kurių helmintų rūšių L3 stadijos lervos gali pereiti į hipobiozinę būseną, kuri padeda išgyventi esant labai žemai oro temperatūrai ir sausrai (8).

1.4. Pavojingos avių nematodozės ir jų sukėlėjai

Haemonchus contortus kiaušinėliai būna 91-101 μm ilgio, 52–62 μm pločio, taisyklingos ovalo

formos ir beveik visas vidus užpildytas blastomeromis (20). Subrendusios patelės ilgis 18-30 mm, patinėlio – 10–20 mm (3).

12

H. contortus yra patogeniškas nematodas, randamas dažniausiai ėriukų šliuže. Šis parazitas yra

paplitęs tropinio ir subtropinio klimato zonose, tačiau keičiantis pasaulio klimatui, šio trichostrongilido paplitimas tampa vis labiau aktualesne problema vidutinio klimato zonose (5).

H. contortus pasižymi aukšta kiaušinėlių gamyba, patelė per dieną gali išskirti apie 10 000

tūkstančių kiaušinėlių, tai lemia greitą ganyklų kontaminaciją. Praėjus 18–21 dienai po invazijos, subrendusi patelė šliuže išskiria kiaušinėlius, kurie su išmatomis patenka į aplinką (3). Nustatyta, kad suaugę helmintai produkuodami kiaušinėlius šeimininko organizme gali išgyventi daugiau negu metus, tai užtikrina populiacijos išsaugojimą (21). Aplinkoje L3 stadijos lerva gali išsivystyti per 5 dienas, tačiau jeigu oro temperatūra yra gerokai žemesnė negu 25 ℃, vystymasis gali užtrukti 2 mėnesius. Hemonchozės protrūkiai dažniausiai būna liepos mėnesio viduryje arba rugpjūčio mėnesį, tačiau tai labiausiai priklauso nuo oro temperatūros ir nuo drėgmės. Taigi jeigu vasaros metu yra aukšta oro temperatūra (>25 ℃) ir yra daug iškritusių kritulių, ligos protrūkis įvyksta anksčiau (8).

H. contortus yra pati patogenišiausia nematodų rūšis, kuri parazituoja 3–7 mėnesių amžiaus

avių organizmuose (12). H. contortus sukeltomis parazitozėmis dažniau ir sunkiau serga šiltesnių, pietinių regionų avys, tačiau dėl globalinio atšilimo šis parazitas vis labiau plinta į šiaurinius Europos plotus. H. contortus pasižymi puikiomis savybėmis prisitaikyti prie aplinkos neigiamų sąlygų. Yra pranešimų, kad ši rūšis buvo aptikta avių, kurios buvo ganomos netoli šiaurinio ašigalio esančiuose plotuose, organizmuose (21).

Patologija yra sukeliama L4 stadijos lervų ir suaugėlių. Prieš paskutinį nėrimąsi lervoms susiformuoja aštri plokštelė, kuria yra prarėžiama gleivinė. Jos pasiekia gleivinės kraujagysles ir maitinasi šeimininko krauju. Dėl vieno helminto daromos žalos, gyvulys per dieną gali netekti 0,05 ml kraujo. Klinikiniai ligos simptomai stebimi kai avies šliuže parazituoja apie 500 suaugusių šių kraujasiurbių helmintų. Taip yra sukeliama sunki anemija, pasireiškianti maždaug po keleto savaičių nuo invazijos pradžios (3, 8). Tai yra pagrindinis hemonchozės klinikinis simptomas, kuomet diarėja gali ir nepasireikšti (12). Kiti hemonchozės galimi požymiai: dehidratacija, diarėja, šiurkšti vilna, depresija, nekordinuoti judesiai, sumažėjęs svoris, skysčių kaupimasis pažandiniuose audiniuose, blyškios gleivinės. Kai kuriais atvejais didelis užsikrėtimas Haemonchus lervomis gali sukelti gyvulių gaišimą (8, 22).

Šiai parazitozei ypač jautrūs yra ėriukai. Diagnozavus hemonchozę jaunikliams, ligą reikia įtarti ir ėriavedėms, kurioms klinikiniai simptomai pasireikš tik kitą pavasarį, kai dėl ėriavimosi nusilps imuninė sistema. H. contortus, esant nepalankioms aplinkos sąlygoms, gali sustabdyti savo vystymąsi. Jei užsikrėtimas L3 stadijos lervomis įvyko vėlai vasarą, klinikiniai simptomai bus stebimi ateinantį pavasarį, išsivysčius L4 stadijos lervoms (12).

13 1.4.2. Teladorsagiozė

Teladorsagiozę avims sukelia Teladorsagia circumcincta. Šis nematodas priklauso

Trichostrongylidae šeimai, tai vienas dažniausių parazitų, aptinkamų šliužo gleivinėje (23).

Suaugusio nematodo ilgis siekia 0,8–1,5 cm (15).

Teladorsagia circumcincta yra vienas iš labiausiai paplitusių avių gastrointestinalinių

nematodų vidutinio klimato ir šiauriniuose regionuose, turinčių didelę įtaką avių sveikatai bei produkcijos sumažėjimui (5, 22, 24). Prieš keletą metų atlikti tyrimai rodo, kad T. circumcincta paplitimas Jungtinės Karalystės ūkiuose yra 100 proc. (5), o Italijoje, Graikijoje, Prancūzijoje tai taip pat labiausiai paplitęs parazitas (14). Liga pasireiškia vasaros pabaigoje arba rudenį. Kartais ligos požymiai gali būti pastebimi pavasarį, kai L4 stadijos lervos vėl suaktyvėja, praėjus hipobiozės būsenai. Nors L3 stadijos lervos taip pat yra prisitaikiusios išgyventi žiemos sąlygas. Kartais ligos simptomai pasireiškia dar prieš nematodų kiaušinėlių pasirodymą išmatose. Taip įvyksta tada, kai ėriukai išgenami į gausiai L3 stadijos lervomis užterštą ganyklą ir įvyksta staigi masinė invazija. Didelis hipobiozinių lervų atsiradimas pavasarį avims taip pat gali sukelti stiprius klinikinius simptomus. Dažniausiai klinikiniai simptomai pasireiškia tada, kai avies šliuže parazituoja 5000

Teladorsagia spp. helmintų (8). Po invazijos praėjus 15–21 dienai išmatose pasirodo T. circumcincta

kiaušinėliai (3).

Invazijos metu yra pastebimi šie simptomai: intermituojanti diarėja, svorio sumažėjimas, apetito stoka. Užsikrėtimo L3 lervomis metu yra tiesiogiai paveikiamos šliužo gleivinės ląstelių funkcijos. Ypač paveikiama pasieninių ląstelių veikla, kurios gamina druskos rūgštį. Todėl praėjus 10–15 dienų po invazijos, padidėja šliužo pH. Esant skrandžio rūgšties trūkumui, didėja gastrino ir pepsinogeno koncentracija kraujyje, išsivysto parazitinis gastroenteritas (8, 16).

1.4.3. Trichostrongiliozė

Avių virškinimo trakte dažniausiai parazituoja T. axei ir T. colubriformis rūšys (24), kurios aptinkamos taip pat ožkų, galvijų organizmuose (8). Paprastai jų kiaušinėliai yra 95–125 µm ilgio ir 51–72 µm pločio (20). Suaugusių T. axei ilgs yra 2–8 mm, o T. colubriformis 4–9 mm (8).

Abi šios Trichostrongylus rūšys parazituoja skirtingose virškinimo trakto dalyse: T.

colubriformis – plonojoje žarnoje, o T. axei – šliuže. Taip pat avių plonojoje žarnoje gali parazituoti

ir kitos rūšys: T. falculatus, T. vitrinus (21).

Trichostrongiliozė kaip ir teladorsagiozė pasireiškia vasaros pabaigoje arba rudenį. Vidutinio klimato zonose Trichostrongylus L3 stadijos lervos taip pat yra gerai prisitaikiusios ganyklose išgyventi žiemos sąlygas (8). Užsikrėtusių šiais parazitais avių išmatose kiaušinėlių galima rasti praėjus 15–23 dienoms po invazijos (3).

T. colubriformis parazituoja dvylikapirštėje ir tuščiojoje žarnose (8). Patologija yra sukeliama

14 formuodamos intraepitelinius tunelius. Tai trunka 10–12 dienų (3). Tokia lervų migracija sukelia dvylikapirštės žarnos gleivinės epitelio eroziją, hiperplaziją, kriptų hipertrofiją, generalizuotą enteritą ir gausią serumo baltymų eksudaciją į žarnų spindį. Kaip pasėkmė šios invazijos, sutrinka virškinimas ir maistinių medžiagų bei mineralų absorbcija. Sergantiems trichostrongilioze ėriukams sutrinka skeleto vystymasis, kaulų mineralizacija, pastebimi odos nuplikimai, pastebimos vandeningos, tamsios spalvos išmatos (21).

T. axei yra mažiau paplitęs, šio parazito sukelta invazija serga nedidelis skaičius avių (3). Ligos

sukeliamos patologijos: pažeidžiamos šliužo liaukinės ląstelės, dėl to padidėja šliužo pH, pepsinogeno koncentracija kraujyje. Taip pat stebimi ir kiti, trichostrongiliozei būdingi, požymiai: diarėja, svorio kritimas, hipoproteinemija (8).

1.4.4. Nematodirozė

Nematodirus battus – tai nematodai parazituojantys avių plonojoje žarnoje. Jų kiaušinėliai yra

dideli (145–264 μm ilgio ir 75–161 μm pločio), elipsės formos su viduje esančiomis 6–8 stambiomis blastomeromis. N. battus kiaušinėliai yra tamsiai rudos spalvos. Tuo tarpu kitų Nematodirus spp. rūšių, galinčių taip pat parazituoti avių virškinimo trakte (N. filicollis, N. spathiger), kiaušinėliai yra bespalviai (20).

Iš visų avių virškinimo trakte parazituojančių Nematodirus spp., patogeniškiausia yra

Nematodirus battus. Tai yra pagrindinis ėriukų parazitozių sukėlėjas šiaurės Europoje (12).

Nematodirus battus yra prisitaikę produkuoti didelius kiekius kiaušinėlių, kuriuose vėliau

vystosi invazinės L3 stadijos lervos. Šios lervos išsirita tik kitų metų vėlyvą pavasarį ar vasarą (gegužės–liepos mėnesiais). Tai dažniausiai sutampa su laikotarpiu, kada ėriukai pradeda ėsti žolę (maždaug 6 savaičių amžiaus) (8, 18, 25). Vėlyvą pavasarį/ankstyvą vasarą užterštose ganyklose atvesti ėriukai užsikrečia Nematodirus battus kiaušinėliais. Ėriukų išmatose Nematodirus kiaušinėlių daugiausiai galima aptikti gegužės – liepos ir rugsėjo – spalio mėnesių laikotarpiais (Nematodirus spp. prepatentinis periodas trunka 14–16 dienų). Tačiau ryškūs klinikiniai simptomai pasireiškia tik pavasarį, kai jaunikliai dar neturi imuniteto prieš šiuos parazitus (8, 26).

Ryškiausias nematodirozės simptomas yra ėriukams pasireiškianti sunkus viduriavimas geltonai žaliomis ir vandeningomis išmatomis bei vėliau atsirandanti dehidratacija. Taip pat parazitozės metu išsivysto enteritas ir plonosios žarnos gleivinės gaurelių atrofija (8).

1.5. Avių virškinamojo trakto nematodozių gydymas

Avių virškinimo trakte parazituojantys nematodai dažniausiai yra kotroliuojami šiais plataus veikimo spektrą turinčiais antihelmintikais: levamizolu, benzimidazolais ir avermektinais (7).

1.5.1. Benzimidazolai

Benzimidazolai yra vaistų klasė, kurie naudojami gydant grybelines, pirmuonių, helmintų sukeltas ligas. Šie preparatai neigiamai veikia ne tik nematodus, tačiau ir kai kuriuos trematodus bei

15 cestodus. Benzimidazolai yra plačiai taikomi parazitozių gydymui visame pasaulyje, tai lemia tam tikri jų privalumai: selektyvus veikimas, mažas toksiškumas žinduoliams, platus veikimo spektras, didelis veiksmingumas ir maža vaistų kaina. Toksinė benzimidazolų dozė yra daugiau kaip 8 kartus didesnė už terapinę dozę (27). Šios medžiagos slopina baltymo β-tubulino, kuris kartu su α-tubulinu sudaro mikrovamzdelius, svarbius helminto ląstelių sandarai ir maisto medžiagų transportui, sintezę. Taip pat slopina parazitų mitochondrijų reakcijas (3, 27). Benzimidazolai yra ypač veiksmingi gydant nematodirozę ir kaspinuočių sukeltas ligas (18, 28).

1.5.2. Makrocikliniai laktonai

Makrocikliniams laktonams priklauso avermektinų (ivermektinas, eprinomektinas, doramektinas ir kt.) ir milbemicinų (moksidektinas) grupės antihelmintikai. Šios medžiagos yra mikroskopinių grybų fermentacijos produktai. Jie chemine struktūra yra panašūs į makrolidinius antibiotikus, tačiau antibaktericidiškai ir fungicidiškai neveikia. Šie antihelmintikai veikia nematodus ir kai kuriuos ektoparazitus. Makrocikliniai laktonai yra GASR receptorių–chloro kanalų komplekso antagonistai. Jie padidina nematodų nervinių ląstelių ir ektoparazitų nervinių ir raumenų ląstelių membranos pralaidumą chloro jonams, taip paralyžuodami parazitą (3, 29).

Lietuvoje pirmo pasirenkamumo vaistas parazitozėms gydyti yra ivermektinas. Taip yra dėl jo žemos kainos ir patogaus vaisto administravimo lyginant su fenbendazolu, kuris naudojamas tik oraliai. Dažnai ivermektinas naudojamas kartu su klorsulonu, avių gydime nuo GIN ir Fasciola

hepatica. Manoma, kad tai taip pat įtakoja AR vystymąsi ivermektinui (9). Daugelyje Europos šalių

ivermektinas vaistų prekyboje pasirodė 1980 metais, o moksidektinas 1990 metais (28).

Moksidektinas yra vienas veiksmingiausių makrociklinių laktonų, turinčių prolonguojantį veikimą prieš Teladorsagia ir Haemonchus. Gero gydomojo efekto pasiekiama, kai 35 dienas iš eilės yra naudojamos vaisto poodinės injekcijos, o po to 21 dienas naudojami šio vaisto lašai ant odos (8). Laktuojančių avių gydymas nuo endoparazitų yra sudėtingesnis. Kadangi yra mažai registruotų antihelmintikų tokioms avims gydyti. Pieno liaukos epitelis yra tarsi lipidų barjeras ir daugelis lipofilinių vaistų difuzijos būdu iš plazmos pereina į pieną. Eprinomektinas pasižymi mažesnėmis lipofilinėmis savybėmis nei moksidektinas ar ivermektinas (29). Todėl geriausias pasirinktinas antihelmintikas laktuojančioms avims gydyti būtų eprinomektinas, kuriam nėra taikoma išlauka pienui (13, 29). Jis yra plataus veikimo spektro, tinka gydyti nuo GIN, plaučių helmintų, kai kurių ektoparazitų. 2019 metais Graikijoje atlikti tyrimai parodė, kad naudojant vienkartines eprinomektino poodines injekcijas pieninėms avims, pavyko pasiekti puikaus gydomojo efekto (13).

1.5.3. Imidazotiazoliai

Šiai grupei priklauso levamizolas. Levamizolo toksinė dozė mažai skiriasi nuo terapinės dozės, todėl šio vaisto dozės turi būti skiriamos labai tiksliai. 2005 metai jo gamyba buvo sustabdyta Kanadoje, o 2008 metais ir JAV. Ši medžiaga taip pat yra naudojama žmonių medicinoje, kaip

16 imunomoduliatorius gydant įvairias vėžio formas. Imidazotiazoliai gerai veikia subrendusius nematodus, tačiau prastai veikia jų lervas (8). Šios medžiagos veikia kaip acetilcholinas, sukeldamos parazitų spazminį paralyžių. Vykstant žarnyno peristaltikai žuvę nematodai yra pašalinami kartu su išmatomis (3).

1.6. Antihelmintinio rezistentiškumo apžvalga

Dvidešimto amžiaus antroje pusėje atsiradus antihelmintikams: benzimidazolams, imidazotiazoliams ir makrocikliniams laktonams, jie veiksmingai veikdami gyvulių gastrointestinalinius nematodus, leido žymiai padidinti žemės ūkių gyvulių produkciją pasaulyje atnešant didelę ekonominę naudą. Tačiau po kurio laiko šių vaistų efektyvumas sumažėjo (9). Tam įtakos turi daugumos ūkininkų naudojamos per mažos vaistų dozės GIN ligoms gydyti, netaikomos vaistų rotacijos. Tik 4,8 proc. 2015 metais tirtų Lietuvos avių ūkių taikė antihelmintikų rotaciją (9). 1960–aisias metais pasaulyje pasirodžius tiabendazolui, pirmos benzimidazolų kartos vaistui, buvo sukeltas didelis proveržis gydant parazitines ligas (27). Australijoje šiam vaistui AR pirmąjį kartą nustatytas 1966 metais, praėjus tik metams po jų pasirodymo šiame žemyne (30). 1990–aisiais metais rezistentiškumas benzimidazolams buvo nustatomas daugelyje Europos šalių (28). 2015 metais Lietuvoje atlikus in vitro tyrimus paaiškėjo, kad AR benzimidazolams yra paplitęs visuose tirtuose avių ūkiuose, kurie prieš tyrimą taip pat naudodavo šiuos vaistus GIN ligoms gydyti (9). 2017 metais Brazilijoje atliekant molekulinius tyrimus buvo nustatyta, kad mutacijos, susijusios su atsparumu benzimidazolams, buvo dažniausiai randamos Haemonchus, Ostertagia, Cooperia,

Ancylostoma ir T. trichuria (27). Prancūzijoje ištyrus in vivo metodu 10 ūkių, visuose buvo nustatytas H. contortus rezistentiškumas fenbendazolui. Šio parazito paplitimas tirtuose ūkiuose svyravo nuo 4

iki 80 proc. visų identifikuotų atsparių lervų (14).

Makrocikliniai laktonai vaistų rinkoje atsirado kiek vėliau negu benzimidazolai. Ivermektinas olandų prekyboje pasirodė 1980–aisiais metais, moksidektinas dešimtmečiu vėliau. Iki 2007–ųjų metų Olandijoje šios medžiagos buvo pakankamai efektingos. Ivermektinas rodė ypač gerus rezultatus avių GIN sukeliamų ligų gydyme. Įvairiuose straipsniuose teigiama, kad antihelmintinis rezistentiškumas pirmiausiai išsivystė avermektinų grupės vaistams ir tik vėliau milbemicinams. Todėl lyginant ivermektino ir moksidektino efektyvumą, pastarasis yra veiksmingesnis prieš kai kuriuos ML atsparius nematodus. Nors AR moksidektinui taip pat akivaizdžiai didėja (28, 29). 2012 – 2018 metais Australijoje buvo atliekami in vivo tyrimai, kurių metu paaiškėjo, kad AR moksidektinui nustatyta 10 proc. tirtų avių ūkių, o ivermektinui rezistentiškumas diagnozuotas 67 proc. tirtų ūkių (31).

Taip pat didelį susirūpinimą pasaulyje kelia atsiradęs mišrus nematodų rezistentiškumas antihelmintikams (7). 1988 metais pirmą kartą buvo gauti duomenys, kad H. contortus pasižymi rezistentiškumu kelioms antihelmintikų grupėms. Europoje T. circumcincta antihelmintinis

17 rezistentiškumas IVM, BZ, LEV aprašytas 2001 metais Škotijoje (32). Šiuo metu Europoje gaunama vis daugiau pranešimų apie T. circumcincta, Haemonchus spp. ir Trichostrongylus spp. išsivysčiusį rezistentiškumą kelioms antihelmintikų grupėms (32). Lietuvoje 2014 metais in vitro tyrimais patvirtinta, kad mišrus antihelmintinis nematodų rezistentiškumas yra užfiksuotas ir Lietuvos avių ūkiuose (9).

1.7. AR atsiradimo mechanizmas

Antihelmintinis rezistentiškumas – tai paveldima parazito savybė, toleruoti normaliai efektyvias antihelmintikų dozes (8).

AR benzimidazolams atsiradimas yra susijęs su β–tubulino geno mutacija, dėl kurios pakinta šio baltymo struktūra. Todėl BZ negali prisijungti prie minėto baltymo ir taip pažeisti parazito ląsteles ir jų funkcijas. AR išsivystymas ML yra iki galo neištirtas, tačiau manoma, kad tai yra susiję su P– glikoproteino geno mutacija, kuri lemia greitesnį antihelmintikų pasišalinimą iš GIN organizmo. Nikotino acetilcholino receptorių, prie kurių jungiasi imidazotiazolai, struktūros pasikeitimas lemia GIN rezistentiškumo išsivystymą šioms medžiagoms (3).

Parazitai gali turėti dvi (homozigotai) arba vieną (heterozigotai) AR genų kopijas. Atsparių antihelmintikams nematodų paplitimą, turinčių tik vieną AR geną, yra galimybė sukontroliuoti, padidinus antihelmintikų dozes. O atspariems homozigotams GIN veiksmingų kontrolės priemonių nėra. Tačiau homozigotinis nematodų AR yra retai pasitaikantis (8).

1.8. AR diagnozavimo metodai

Tai yra in vivo tyrimas, kuris parodo parodo didžiausią helmintų kiaušinėlių kiekį, esančių 1 grame išmatų (KSG), prieš ir po antihelmintinio gydymo. Šis tyrimas yra rekomenduojamas tada, kai avies grame išmatų yra randama >150 kiaušinėlių, o tai nustatoma naudojant Makmasterio metodą (33). Nematodas yra jautrus antihelmintinei medžiagai, kai praėjus tam tikram laikotarpiui po taikyto gydymo, parazitų kiaušinėlių skaičius grame išmatų sumažėja bent 95 proc. Šio laikotarpio trukmė priklauso nuo to, kokia antihelmintine medžiaga gyvulys buvo gydytas. Jeigu buvo naudojamas levamizolas, kiaušinėlių skaičių reiktų nustatyti po 3–7 dienų, nes ši medžiaga yra mažiau efektyvi prieš nematodų lervines stadijas. Naudojus BZ, pakartotinį kiaušinėlių skaičiavimą rekomenduojama atlikti po 8–10 dienų, o ML po 14–17 dienų (28, 33). Tačiau jeigu tyrime yra naudojami visų minėtų grupių vaistai tiriant tą patį avių pulką, pakartotinis mėginių ėmimas yra atliekamas vienu metu, praėjus 14 dienų po gydymo (33).

Tačiau testas turi ir tam tikrų trūkumų: jis brangiai kainuoja, sugaištama daug laiko, o dėl skirtingos medžiagų farmokinetikos avių organizmuose tyrimų rezultatai gali būti netikslūs. Dėl to vis dažniau naudojami in vitro tyrimai, kurie yra pigesni ir yra greičiau atliekami (34).

18 1.8.2. Kiaušinėlių nėrimosi testas (KNT)

KNT yra in vitro metodas, naudojamas nustatyti rezistentiškumą benzimidazolams. Kadangi šios medžiagos naikina nematodų kiaušinėlius, neleisdamos jiems toliau vystytis. Tyrimo esmė yra inkubuoti neišsiritusius kiaušinėlius kartu su skirtingos koncentracijos antihelmintiku, dažniausia tiabendazolu, kadangi jis yra geriausiai tirpstantis vandenyje. Inkubuoti reikia 25℃ temperatūroje 48 valandoms. Vėliau yra apskaičiuojama procentinė išraiška tų kiaušinėlių, kurie išsirito. Tačiau šis testas yra mažai jautrus esant mažesniam negu 25 proc. rezistentiškumui (33, 19).

1.8.3. Lervų vystymosi mikro-agare testas (LVMAT)

LVMAT – in vitro metodas, naudojamas nematodų rezistentiškumui benzimidazolams, makrocikliniams laktonas ir imidazotiazoliams nustatyti. Tačiau didžiausias jautrumas yra tiriant nematodų rezistentiškumą ML. Šis testas yra laikomas, greitu, nebrangiu ir patikimu (19). Lyginant

in vivo kiaušinėlių sumažėjimo testą su LVMAT, pastarasis yra jautresnis (35).

LVMAT atlikimui yra reikalingos L1 stadijos lervos, todėl tai palengvina mėginių surinkimą, kadangi testui nereikalingos šviežios išmatos (19). Šis testas yra pagrįstas lervų sugebėjimu išgyventi ir vystytis veikiant tam tikroms antihelmintikų koncentracijoms. Inkubacijos metu yra užtikrinamos visos sąlygos, reikalingos lervų vystymuisi: drėgmė, temperatūra, maitinimosi terpė. Inkubuojama 25℃ temperatūroje, 7 dienas. Praėjus inkubacijos laikotarpiui, yra vertinamas L3 stadijos lervų skaičius. Antihelmintiniam rezistentiškumui nustatyti pasirenkamos 21,7 ng/ml-1 _ivermektino aglikono, 0,04 µg/ml-1 _{tiabendazolio ir 2 µg/ml}-1 _{levamizolio ribinės koncentracijos (33).}

1.9.

Antihelmintikų naudojimo alternatyvos

Virškinimo trakto nematodų sukeltos ligos atneša didelius nuostolius avininkystėje ir šiuo metu tam sumažinti naudojamų sintetinių cheminių medžiagų efektyvumas dėl išsivysčiusio antihelmintinio rezistentiškumo yra sumažėjęs. Todėl nematodus veikiančios natūralios medžiagos tampa vis populiaresnės avių gydyme (36).

Proteinai, priklausantys įvairioms skirtingoms klasėms, turi didelį potencialą specifiškai paveikti skirtingų stadijų nematodų lervas ar kiaušinėlius, priklausomai nuo nematodo lervos ar kiaušinėlio išorinio sluoksnio baltyminės sudėties. Kutikulė ir kiaušinėlių membrana gali būti paveikta proteazių, lektinų, chitinazių, lipazių ar kolagenazių. Jie gali būti išskiriami iš tam tikrų augalų ir grybų. Vieni tokių augalų yra papajinis melionmedis (lot. Carica papaya). Atlikti in vitro tyrimai parodė, kad jo sudėtyje esantis baltymas papainas gali suardyti Ascaris suum, H. contortus kutikules (36). O chitinazė, kurios yra randama D. flagrans, P. chlamydosporia grybuose, ardo H. contortus kiaušinėlių membraną (37). Tam tikri augaliniai lektinai (kviečių gemalų aglutininas, fitohemaglutininas, konkanavalinas A) sutrikdo avių ir ožkų virškinimo trakte parazituojančių nematodų T.

19 galimybė išgauti nematodus veikiančias makromolekules. Per pastaruosius 10 metų ypač padaugėjo publikacijų, nagrinėjančių baltymų terapines savybes gydant nematodozes. Kaip bebūtų vis dar trūksta mokslinių tyrimų apie nematodo kutikulės struktūrinius baltymus, kurie veikia fermento substratai. Tačiau tai yra ateities perspektyva, kuriant naujus antihelmintinius produktus ir vakcinas nuo nematodų sukeliamų ligų (36).

1.9.2. Vakcinacija nuo GIN

Jau anksčiau buvo pastebėta kai kurių avių imuniteto rezistentiškumas prieš GIN, esant pakartotinei invazijai. Tai leido svarstyti apie alternatyvių priemonių kūrimą gydant nematodozes: selektyvų avių veislių kūrimą arba vakcinų prieš GIN kūrimą. Vakcinų nuo GIN sukeliamų ligų kūrimas yra laikoma patrauklia alternatyva, kadangi tai neskatina AR vystymosi ir yra ekologiškas produktas (21).

Per pastaruosius dešimt metų buvo dedama daug pastangų subvientinių vakcinų nuo T.

circumcincta sukūrimui. Į šių vakcinų sudėtį buvo įtraukti8rekombinantiniai baltymai, kurie veikia kaip imunomoduliatoriai. Buvo atliekami tyrimai, kurių metu avys buvo vakcinuojamos tris kartus, kas tris savaites. Po imunizacijos avys buvo užkrečiamos L3 stadijos lervomis. Užtikrinant duomenų patikimumą, tuo pačiu metu buvo atliekami du tokie patys tyrimai. Vakcinuotų avių kiaušinėlių skaičius grame išmatų buvo mažesnis 92 proc. ir 73 proc. lyginant su kontrolinėmis grupėmis abiejų tyrimų metu (5). Šios vakcinos veikimas lemia ląstelinio ir humoralinio šeimininko imuniteto suaktyvinimą. Vietinė IgA/IgE reakcija įtakoja nematodo vystymąsi ir vaisingumą šeimininko organizme (23).

Antihelmintinis rezistentiškumas H. contortus yra laikomas didžiausia problema jau daugelį metų, todėl šio parazito vakcinos sukūrimas buvo vienas svarbiausių tikslų. Nusilpninta nematodo L3 stadijos lervų kultūra suteikia apsauginį imunitetą suaugusioms avims, tačiau ne ėriukams, dėl to buvo ieškoma kitų vakcinos sukūrimo būdų. Buvo sukurti antigenai (angl. hidden gut membrane antigens), kurių natūraliai yra nematodų žarnyno membranoje. Susikūrę antikūnai patenka į H. contortus organizmą jiems besimaitinant šeimininko krauju. Antikūnai jungiasi prie parazito žarnyno baltymų ir juos pažeidžia. Tokio veikimo vakcina (Barbervax®, WormVaxbuvo) neseniai sukurta Australijoje (5).

Norint sukurti veiksmingas vakcinas ir atsisakyti nematodozių gydymo plataus veikimo spektro antihelmintikais, reikia sukurti tokias vakcinas, kurios veiktų nuo daugelio nematodų rūšių sukeltų invazijų, kadangi dažniausiai avys serga mišriomis parazitozėmis. Taip pat turėtų apsaugoti ne tik suaugusias avis, bet ir jaunus ėriukus (5). Tokių vakcinų kūrimą taip pat apsunkina žinių trūkumas apie parazito ir šeimininko sąveiką molekuliniu lygiu (23).

20 1.9.3. GIN atsparių selektyvus avių veislių kūrimas

Vienas iš alternatyvų, norint sumažinti antihelmintinių vaistų naudojimą, yra genetiškai atsparių gastrointestinaliniams nematodams avių veislių selektyvus veisimas. Kaip indikatorius tokioms veislėms atrinkti, buvo nustatomas kiaušinėlių skaičius išmatose (38). Yra pastebėta, kad kai kurios avių veislės yra atsparesnės GIN negu kitos (24).

Prieš daugiau negu dešimt metų Kanarų salose buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo tiriamas dviejų vietinių veislių rezistentiškumas H. contortus: Kanarų plaukuotųjų (ang. Canaria Hair Breed) ir Kanarų avių veislės. Pirmoji jų buvo atsparesnė nematodų invazijoms. 2019 metais buvo įrodyta, kad Kanarų plaukuotųjų veislių rezistentiškumas T. circumcincta L3 stadijos lervoms yra didesnis 78 proc. negu Kanarų veislės avių (p=0,038) (24).

Tačiau avių, turinčių rezistentiškumą ne vienai GIN rūšiai, kūrimas ir veisimas trunka ilgai ir daug kainuoja. Taip pat sėkmingam tokių avių selektyvaus veisimo taikymui trukdo tai, kad norint atlikti koprologinius tyrimus avys turi būti dirbtinai užkrečiamos nematodais. Vis dar trūksta molekulinių tyrimų ir metodų, kurie leistų perkelti molekulinę informaciją, lemiančią rezistentiškumą nematodams (38).

1.9.4. Tinkamai taikomas atihelmintinis gydymas

Dažnai avių augintojams trūksta žinių apie tinkamą avių antihelmintinį gydymą, AR išsivystymo priežastis (9). Dėl to ūkiuose turėtų imtasi tam tikrų priemonių, kurios padėtų sumažinti rezistentiškumo antihelmintikams vystymąsi ir plitimą:

 reguliariai atlikti FECRT tyrimus;

 pasirūpinti, kad būtų nustatyta tiksli parazitologinė diagnozė;  nustayti jautrumą antihelmintikams prieš ėriavimąsi ir po jo;

 periodiškai sverti gyvulius, kad būtų išvengta gydymo per mažomis vaistų dozėmis;  vykdyti kiekvienais metais antihelmintinių vaistų rotaciją;

 gydyti antihelmintiniais vaistais ne trumpesniais kaip 28 dienos intervalais (10, 27);  atsisakyti profilaktinės dehelmintizacijos ar gydymo, kai užsikrėtimo lygis yra žemas;  vengti avių pervarymo į švarią ganyklą iškart po dehelmintizavimo;

 importuotoms avims taikyti karantiną ir gydyti naujesnių klasių vaistais (monepantelis, derkvantelis). Taip bus išvengta atsparių antihelmintikams nematodų įvežimo į ūkį;  sezono viduryje gydyti ėriukus naujesnės kartos vaistais. Taip bus sumažintas atsparių

21

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

Tyrimas buvo atliekamas 2019 m. gegužės – lapkričio mėnesiais. Buvo atrinkta ir ištirta 11 avių fermų, išsidėsčiusių Marijampolės rajone. Per pastaruosius 3–5 metus visose fermose buvo atliekama profilaktinė ir/arba gydomoji dehelmintizacija įvairių grupių antihelmintikais. Tyrimui buvo pasirenkamos tik tos fermos, kuriose paskutinis antihelmintinis avių gydymas buvo vykdytas mažiausiai prieš 2 mėnesius. Fermose laikomų avių skaičius svyravo nuo 50 iki 150 įvairaus amžiaus individų. Daugiausia tirtose fermose auginamų avių veislės buvo: Lietuvos juodgalvės, Romanovo, Sufolkai bei įvairių veislių mišrūnai. Visose fermose avys buvo ganomos ganyklose balandžio – spalio mėnesiais.

Atsitiktine tvarka kiekviename avių pulke buvo pasirenkama 10–15 individų. Iš kiekvieno individo tiesiosios žarnos su pirštine buvo paimami išmatų mėginiai (10–15 g). Neištyrus mėginių per 2–3 valandas nuo jų paėmimo, atskirai kiekvieno ūkio išmatų mėginiai buvo padalinami į 3 plastikinius indelius (turėjo užimti 1/3 indelio) ir praskiedžiami paprastu vandeniu, nepaliekant indelyje vietos orui. Tokiomis sąlygomis mėginiai galėjo išbūti savaitę laiko.

Visi išmatų mėginiai, surinkti tame pačiame avių pulke, buvo plaunami vandens srove per trimis aukštais esančius sietus. Sietų akutės buvo skirtingų dydžių: 0,250 mm, 0,100 mm, 0,025 mm. Sietai buvo sustatomi taip, kad su didžiausio dydžio akutėmis sietas būtų viršuje, o su mažiausiomis (0,025 mm) apačioje. Mėginiai per sietą plaunami keletą kartų, likučiai nuo apatinio sieto supilami į stiklinę, kuri paliekama nusistovėti (2 pav.).

2 pav. Trijų aukštų sietas, per kurį plaunamos išmatos (A). Apatino sieto likučių nuplovimas ir

supilimas į stiklinę (B) (autorės nuotrauka)

Po 10–15 min. viršutinis skystis nupilamas, o nuosėdos supilamos į centrifuginius mėgintuvėlius (vieno ūkio mėginių nuosėdos supilamos į 2–3 mėgintuvėlius). Taip pat įpilama

22 vandens, kad turinio lygis visuose mėgintuvėliuose būtų vienodas. Centrifuguojama 2 min. 1500 apsisukimų per minutę greičiu. Po centrifugavimo nupilamas skystis, paliekant tik nuosėdas. Ant nuosėdų pilamas flotacinis tirpalas, pagamintas iš cukraus ir vandens. Nuosėdos su flotaciniu gerai išmaišomi. Vėliau flotacinis tirpalas pilamas iki pat viršaus, kad net susidarytų meniskas. Uždedami kamšteliai ir vėl centrifuguojama 2 min. 1500 aps./min. (3 pav.).

3 pav. Centrifuginiai mėgintuvėliai, kuriuose nuosėdos yra sumaišytos su flotaciniu tirpalu (autorės

nuotrauka)

Po centrifugavimo kamšteliai nuimami ir nuo jų nuplaunamas turinys, kuriame yra susikaupę kiaušinėliai (4 pav.).

4 pav. Helmintų kiaušinėlių nuplovimas nuo centrifuginių mėgintuvėlių kamštelių (autorės

23 Šis turinys dar kartą perplaunamas per 20 µm dydžio akučių sietą, kad būtų išplautas cukrus ir stiklinėje liktų tik helmintų kiaušinėliai, kurie bus naudojami in vitro lervų vystymosi mikro–agare testui (5 pav.).

5 pav. Nuo kamštelių nuplauto turinio pakartotinis plovimas per 20 µm dydžio akučių sietą (autorės

nuotrauka)

Taip pat dalis iš kiekvienos fermos paimtų išmatų mėginių buvo tirti Modifikuotu Makmasterio metodu (39). Buvo norėta įsitikinti, kad avių išmatose tikrai yra atitinkamas skaičius nematodų kiaušinėlių (>100 EPG) ir vėliau atlikti LVMAT bus tikslinga. Šio tyrimo esmė yra suskaičiuoti kiaušinėlių skaičių 1 g išmatų. Tam tikslui buvo pasveriama 4 g išmatų, kurios dedamos į stiklinę ir užpilamos 56 ml vandens. Viskas gerai išmaišoma ir paliekama nusistovėti 30 min. Vėliau mišinys dar kartą išmaišomas ir košiamas per tinklelį į kitą stiklinę. 10 ml šio mišinio pilama į mėgintuvėlį ir centrifuguojama 1200 aps./min. dažniu, 7 minutes. Paviršinis skystis nusiurbiamas pipete, o nuosėdos užpilamos iki 4 ml flotacinio tirpalo. Mišinys gerai išmaišomas ir naudojamas užpildyti abi Makmasterio kameros puses. Mikroskopuojama ne anksčiau nei po 2–3 min., didinama 50 kartų. Kiaušinėlių skaičius 1 grame išmatų buvo apskaičiuojamas padauginus kiaušinėlių kiekį abiejose kameros pusėse iš 20. Visų fermų tirtuose mėginiuose kiaušinėlių skaičius viršijo 100 kiaušinėlių skaičių grame išmatų.

Lervų vystymosi testai buvo atlikti nustatyti antihelmintinį rezistentiškumą tiabendazolui (TBZ), levamizoliui (LEV) ir ivermektinui (IVM). Norint ištirti AR ivermektinui atliekant LVMAT buvo naudojamas ivermektino agikonas (IVM–Ag), kuris yra labiau tinkamas in vitro tyrimams, nes yra stabilesnis už IVM. Testui buvo naudojamos 96 akučių mikrotitravimo plokštelės.

24 Pirmiausiai buvo paruošta 12 galutinių koncentracijų, kurios buvo skirtingos kiekvienai antihelmintinei medžiagai: nuo 0,0006 iki 1,28 µg/ml-1 _{tiabendazolio (TBZ), nuo 0,084 iki 173,6} ng/ml-1 ivermektino aglikono (IVM-Ag) ir nuo 0,0156 iki 32 µg/ml-1 levamizolio (LEV). Pradiniai tiabendazolo bei ivermektino aglikono tirpalai serijiniu būdu buvo praskiesti su dimetilsulfoksidu (DMSO), santykiu 1:2. Levamizolio hidrochlorido tirpalas praskiestas su dejonizuotu vandeniu, santykiu 1:2. Į lėkštelę įpilama po 12 µl kiekvienos koncentracijos tirpalo. Kiekvienai vaisto grupei naudojama 3 eiles: 2 eilės – antihelmintikų tirpalams su skirtingomis koncentracijomis ir 1 eilė – kontrolei (DMSO). Kad nesimaišytų tirpalai su skirtingomis koncentracijomis, buvo naudojama daugiapipetė (6 pav.). Likusių lėkštelės eilių (pirmos ir paskutinės) akutės užpildomos 200 µl paprasto vandens, kad būtų palaikoma drėgmė (9).

6 pav. Antihelmintikų tirpalų su skirtingomis koncentracijomis perpilimas į tyrimo lėkštelę

naudojant daugiapipetę (autorės nuotrauka)

Kiekviena akutė, kurioje yra 12 μl antihelmintiko tirpalo, užpilama 150 μl 2 % +45℃ temperatūros Bacto agaro ir gautas mišinys laikomas +4 °C temperatūroje apie 5 min. Tam, kad būtų sustabdytas grybelio augimas, 10 μl kiaušinėlių suspensijos (galutinis kiaušinėlių skaičius vienoje akutėje – 50) buvo sumaišyta su 0,3 mg/ml-1 _{amfotericino B tirpalu ir 10 μl mielių ekstraktu. Tuomet} supilta į akutes su agaru. Kontrolinėse akutėse naudota tik 1,3 % dimetilsulfoksido (9).

Paruoštos plokštelės inkubuotos 7 dienas esant 27 °C temperatūrai. Procesas sustabdytas naudojant 25–50 µl Liugolio jodido (7 pav.).

25

7 pav. Lervų vystymosi mikro agare testo lėkštelė po 7 dienų inkubavimo. Kiekvienoje akutėje yra

įpilta Liugolio tirpalo lervų vystymuisi sustabdyti (autorės nuotrauka)

Galiausiai neišsinėrę kiaušinėliai, L1–L2 ir L3 stadijos lervos suskaičiuotos mikroskopuojant. Antihelmintiniam rezistentiškumui nustatyti naudota 21,7 ng/ml-1 _{ivermektino aglikono, 0,04 µg/ml} -1 _{tiabendazolio ir 2 µg/ml}-1 _{levamizolio ribinės koncentracijos. Minėtose medžiagų koncentracijose} rastos L3 stadijos lervos rodo rezistentiškumą tai medžiagai. L3 stadijos lervos buvo identifikuojamos pagal jų morfologines savybes, vadovaujantisVan Wyk ir E. Mayhew aprašymais bei schemomis (40).

Tyrimai atlikti 2019 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Veterinarinės Patobiologijos katedros Parazitologijos laboratorijoje. Tyrimai atlikti laikantis Lietuvos gyvūnų gerovės taisyklių (Nr. B1-866, 2012; Nr. XI-2271, 2012).

Statistinio patikimumo intervalai apskaičiuoti remiantis WAAVP (World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology) rekomendacijomis (30). Konfidencialumo intervalams (CI 95 proc.) apskaičiuoti naudotas Wilson metodas. Aprašomoji statistika apskaičiuota naudojantis

Microsoft® Excel 2007 ir IBM SPSS Statistics (Version 21.0). Statistiškai reikšmingi duomenys

26

3. TYRIMO REZULTATAI

Buvo ištirta 11 avių ūkių, išsidėsčiusių Marijampolės rajone. Lervų vystymosi mikro-agare testas (LVMAT) buvo atliekamas norint nustatyti antihelmintinį rezistentiškumą benzimidazolams (BZ), ivermektinui (IVM) ir levamizoliui (LEV). Gavus tyrimo rezultatus paaiškėjo, kad nei viename tirtame ūkyje nebuvo nustatytas antihelmintinis rezistentiškumas levamizoliui (p<0,01). Tai reiškia, kad atlikus su visų ūkių mėginiais LVMAT, nebuvo rasta L3 stadijos lervų 2 µg/ml-1 _levamizolio koncentracijoje.Tačiau nematodų rezistentiškumas benzimidazolams ir ivermektinui buvo nustatytas. Nematodų rezistentiškumui benzimidazolams nustatyti buvo pasirinkta ribinė tiabendazolo 0,04 µg/ml-1 koncentracija, kur rastos L3 stadijos lervos rodė rezistentiškumą. Buvo nustatyta, kad antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams išsivystęs 4 avių ūkiuose (36,4 proc., 95 proc. KI: 15,2–64,6 proc.) (8 pav.). 7 ūkiuose avių ūkiuose rezistentiškumo BZ nerasta (63,6 proc., 95 proc. KI: 35,4–84,8 proc.). Tačiau tiriant nematodų AR benzimidazolams pasiskirstymą tirtuose 11 avių ūkiuose gauti duomenys nebuvo statistiškai patikimi (p>0,05).

8 pav. Antihelmintinio rezistentiškumo tiabendazolui pasiskirstymas tirtuose ūkiuose, proc.

GIN rezistentiškumas ivermektinui nustatytas skaičiuojant L3 stadijos lervas ribinėje 21,7 ng/ml-1 ivermektino aglikono koncentracijoje. Atlikus LVMAT paaiškėjo, kad ivermektinui rezistentiškumas išsivystęs 3 ūkiuose (27,3 proc., 95 proc. KI: 9,7–56,6 proc.). 8 avių ūkiuose rezistentiškumas IVM nediagnozuotas (72,7 proc., 95 proc. KI: 43,4–90,3 proc.) visų 11 tirtų ūkių. Tačiau IVM rezistentiškumo ir jautrumo nustatymo duomenys minėtuose ūkiuose nėra statistiškai patikimi (p>0,05) (9 pav.).

36.4%

63.6%

Atsparu Jautru

27

9 pav. Antihelmintinio rezistentiškumo ivermektino aglikonui pasiskirstymas tirtuose ūkiuose,

proc.

Taip pat atliekant tyrimus norėta išsiaiškinti kiek tirtų ūkių turi išsivysčiusį AR kelioms antihelmintinėms medžiagoms. Rezistentiškumas tiabendazolui ir ivermektinui aptiktas 2 avių fermose (18,2 proc., 95 proc. KI: 5,1–47,7 proc.). Antihelmintinis rezistentiškumas tik tiabendazolui buvo rastas 2 avių fermose (18,2 proc., 95 proc. KI: 5,1–47,7 proc.). AR tik ivermektinui nustatytas 1 ūkyje (9,1 proc., 95 proc. KI: 1,6–37,7 proc.). 6 avių ūkiuose antihelmintinis rezistentiškumas nebuvo diagnozuotas nei vienai tyrime naudotai antihelmintinei medžiagai (54,5 proc., 95 proc. KI: 28,0–78,7 proc.). Tačiau AR pasiskirstymo avių fermose rezultatai nėra patikimi (p>0,05). Minėti duomenys pateikti 10 paveiksliuke.

10 pav. Antihelmintinio rezistentiškumo tiabendazolui (TBZ), ivermektino aglikonui (IVM-Ag)

pasiskirstymas tirtuose ūkiuose, proc.

27.3% 72.7% Atsparu Jautru 18.2% 9.1% 18.2% 54.5% Atsparu TBZ Atsparu IVM-Ag Atsparu TBZ + IVM-Ag Nėra atsparumo nei vienai medžiagai

28 Pagal išsivysčusių L3 stadijos lervų skaičių procentais 0,04 µg/ml-1 _{tiabendazolo koncentracijoje} buvo nustatytas AR išsivystymo lygis tirtuose ūkiuose. 9,1 proc. (95 proc. KI: 1,6–37,7 proc.) tirtų ūkių buvo nustatytas žemas (<10 proc. L3 stadijos lervų 0,04 µg/ml-1 _{tiabendazolo konc.)} antihelmintinis rezistentiškumas tiabendazolui. Vidutinio lygio rezistentiškumas (10-25 proc. rezistentiškumo intervalas) rastas 18,2 proc. (95 proc. KI: 5,1-47,7 proc.) ūkių, aukštas rezistentiškumas tiabendazolui (>25 proc. rezistentiškumas) rastas 9,1 proc. (95 proc. KI: 1,6–37,7 proc.). visų ūkių. Rezistentiškumas benzimidazolams nebuvo nustatytas 63,6 proc. avių fermų (95 proc. KI: 35,4–84,8 proc.) (11 pav.). (p<0,05)

11 pav. Tirtų avių ūkių pasiskirstymas pagal antihelmintinio rezistentiškumo tiabendazolui

intervalus, proc.

Antihelmintinio rezistentiškumo lygis ivermektinui ūkiuose buvo nustatomas pagal išsivysčiusių L3 stadijos lervų kiekį procentais 21,7 ng/ml-1 _{ivermektino aglikonokoncentracijoje (12} pav.). Žemo antihelmintinio rezistentiškumo (<10 proc. L3 lervų) ivermektinui nebuvo rasta nei viename ūkyje. Vidutinis antihelmintinis rezistentiškumas (10–25 proc. rezistentiškumo IVM intervalas) diagnozuotas 18,2 proc. (95 proc. KI: 5,1–47,7 proc.) visų tirtų fermų. Aukštas antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui (>25 proc. rastų L3 stadijos lervų 21,7 ng/ml-1 _konc.) nustatytas 9,1 proc. (95 proc. KI: 1,6–47,7 proc. avių ūkių). AR ivermektinui nebuvo diagnozuotas 72,7 proc. tirtų fermų ( 95 proc. KI: 43,4–90,3 proc.). Aptarti duomenys buvo statistiškai reikšmingi (p<0,01). 7 1 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Atsparumo nėra <10 10-25 >25 Ū ki ų sk ai či us

29

12 pav. Tirtų ūkių pasiskirstymas pagal antihelmintinio rezistentiškumo ivermektino aglikonui

intervalus, proc.

Nustatinėjant GIN rezistentiškumą antihelmintinėms medžiagoms, taip pat buvo identifikuojama L3 stadijos lervų rūšis (12 pav.).

13 pav. Identifikuotų rezistentiškumu ivermektinui ir benzimidazolams L3 stadijos lervų rūšis ir jų

skaičius

21,7 ng/ml-1 ivermektino anglikono koncentracijoje 100 proc. (95 proc. KI: 72,2-100 proc.) rastų atsparių L3 stadijos lervų buvo Trichostrongylus spp. (p<0,01). Tiabendazolo 0,04 µg/ml-1 koncentracijoje 73,7 proc. (95 proc. KI: 51,2–88,2 proc.) rastų lervų buvo Trichostrongylus spp., o 26,3 proc. – Teladorsagia spp. (p<0,05, 95 proc. KI: 11,8–48,4 proc.).

8 0 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Atsparumo nėra <10 10-25 >25 Ū ki ų sk ai či us

Antihelmintinio rezistentiškumo intervalas, proc.

10 14 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Atsparu IVM-Ag Atsparu TBZ

L3 st ad ijo s le rv ų sk ai či us Trichostrongylus spp. Teladorsagia spp.

30

4. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS

Atlikto in vitro tyrimo (LVMAT) rezultatai parodė, kad 45 proc. tirtų 11 avių ūkių Marijampolės rajone buvo aptiktas antihelmintinis rezistentiškumas bent vienai tyrime naudotai medžiagai. Rezistentiškumas nustatytas ivermektinui ir tiabendazolui, levamizolis buvo veiksmingas visuose tirtuose ūkiuose.

2014 metais pranešta, kad Australijoje, kur levamizolis yra plačiausiai naudojamas antihelmintikas, AR šiai medžiagai atliekant in vivo tyrimus buvo nustatytas 73 proc. ūkių (41). Jungtinėje Karalystėje AR šiai medžiagai nustatyta 40 proc. ūkių (9). 2015 metais Olandijoje AR levamizoliui nebuvo nustatytas (42). 2016 metais Lietuvoje AR levamizoliui nustatytas 33,4 proc. ūkių (9). Tačiau mūsų tyrimo metu nei viename ūkyje nebuvo nustatytas rezistentiškumas LEV (p<0,01). Tokie rezultatai galėjo būti dėl to, kad Lietuvoje levamizolis yra retai naudojamas.

Naudojant kiaušinėlių nėrimosi testą (KNT) 2014 metais Lietuvoje nustatyta, kad AR benzimidazolams buvo paplitęs visuose tirtuose ūkiuose, išsidėsčiusiuose pietinėje ir centrinėje Lietuvoje (9). Kiek vėliau, 2015 metais, atliekant FECRT tyrimus Olandijoje AR benzimidazolams nustatytas 73,3 proc. tirtų ūkių (28). 2017 metais Brazilijoje naudojant in vivo metodą ištirta, kad AR benzimidazolams paplitimas yra 75,7 proc. (28). Rezistentiškumas benzimidazolams taip pat nustatytas Jungtinėje Karalystėje, Graikijoje, Šiaurės Airijoje, Norvegijoje, Prancūzijoje, Ispanijoje (14). Mūsų tyrimo metu AR šios klasės antihelmintikams taip pat aptiktas. Išsiaiškinta, kad Marijampolės rajone rezistentiškumas benzimidazolams nustatytas 36,4 proc. tirtų avių fermų. Ištirtas rezistentiškumo BZ paplitimas yra daug mažesnis lyginant su anksčiau atliktų Lietuvoje ir užsienio valstybėse tyrimų rezultatais. Tačiau šio tyrimo metu gauti rezistentiškumo TBZ paplitimo duomenys nėra informatyvūs, nes rezultatai yra statistiškai nepatikimi (p>0,05).

Naudojant LVMAT 2014 metais pietų ir centrinėje Lietuvoje buvo nustatyta, kad atsparumas ivermektinui išsivystęs 61,9 proc. tirtų avių ūkių (iš viso ištirta 21 ūkiai) (9). Olandijoje naudojant FECRT metodą rezistentiškumas ivermektinui aptiktas 78,3 proc. tirtų ūkių (28). Australijoje 2012 – 2018 metais taip pat taikant in vivo tyrimą AR ivermektinui nustatytas 67 proc. tirtų ūkių (p<0,05) (31). Palyginus užsienio valstybių įvairiais tyrimo metodais nustatytą rezistentiškumą IVM su mūsų tyrimo gautais rezultatais stebimas didelis skirtumas. Šio tyrimo metu AR ivermektinui rastas 27,3 proc. tirtų ūkių, tai yra daugiau kaip 2 kartus mažesnis AR paplitimas lyginant su kitų tyrimų duomenimis. Tačiau šio tyrimo gauti rezultatai nebuvo statistiškai patikimi (p>0,05).

2014 metais Lietuvoje 38,5 proc. avių ūkių buvo nustatytas rezistentiškumas abiejoms vaistų grupėms: ML ir BZ. Taip pat mišrus rezistentiškumas (angl. multidrug resistance) yra išsivystęs Slovakijoje, Ispanijoje, Italijoje, Graikijoje, Jungtinėje Karalystėje, Olandijoje (9). Atlikus šiuos tyrimus nustatyta, kad rezistentiškumas abiems antihelmintikas (BZ ir IVM) aptiktas 18,2 proc. tirtų

31 ūkių Marijampolės rajone. Tai yra mažesnis mišraus AR paplitimas lyginant su Lietuvoje 2014 metais atlikto tyrimo duomenimis. Tačiau gauti rezultatai yra statistiškai nepatikimi (p>0,05), kad būtų galima spręsti apie dabartinę situaciją tirtame regione.

2014 metais Lietuvoje, naudojant kitus in vitro tyrimus (KNT), aukštas rezistentiškumo lygis TBZ buvo nustatytas 36 proc. tirtų ūkių, vidutinis – 24 proc. ūkių, likusiuose ūkiuose (40 proc.) buvo aptiktas žemas rezistentiškumo lygis (9). Mūsų tyrimo metu (LVMAT) aukštas AR lygis rastas 9 proc., vidutinis 18 proc. ūkių, 9 proc. avių fermų rastas žemas rezistentiškumo lygis ir net 64 proc. avių fermų rezistentiškumo TBZ nebuvo aptikta (p<0,05). Tam įtakos gali turėti naudoti skirtingi in

vitro metodai. Kadangi moksliniuose straipsniuose rašoma, kad KNT yra mažiau jautrus negu

LVMAT esant mažesniam nei 25 proc. rezistentiškumui (19, 33). Ankstesniojo tyrimo rezultatai nebuvo statistiškai patikimi (p>0,05), dėl to lyginti abiejų tyrimų rezultatus yra netikslu.

Jau minėto Lietuvoje vykdyto tyrimo metu 2014 metais buvo bandoma išsiaiškinti AR ivermektinui lygį avių ūkiuose. Nustatyta, kad aukštas AR (>30 proc. L3 lervų) paplitęs 10 proc., žemas (<30 proc. L3 lervų) – 52 proc., AR nebuvo rasta – 38 proc. ūkių (p>0,05) (9). Mūsų atlikto tyrimo metu aukštas AR (>25 proc. L3 stadijos lervų) nustatytas 9 proc. avių ūkių, vidutinis antihelmintinis rezistentiškumas (10-25 proc. L3 lervų) – 18 proc. ir net 73 proc. tirtose fermose AR ivermektinui nebuvo diagnozuotas (p<0,01). Žemas (<10 proc. L3 lervų) antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui nebuvo aptiktas nei viename ūkyje. 2014 metais vykdyto tyrimo rezultatai nebuvo statistiškai patikimi (priešingai negu mūsų tyrimo gauti duomenys). Taip pat rezistentiškumo kategorijos pagal aptiktų L3 stadijos lervų skaičių ribinėje koncentracijoje nėra vienodai suskirstytos, dėl to abiejų tyrimų duomenis nėra tikslu lyginti.

Brazilijoje benzimidazolams atspariausi nematodai: H. contortus, Teladorsagia spp., Cooperia (27). Kadangi Brazilijoje ir Australijoje yra panašus klimatas, todėl pastarajame žemyne yra paplitusios beveik tos pačios, AR pasižyminčios, nematodų rūšys: T. circumcincta, Trichostrongylus spp. ir H. contortus (41). Airijoje ir Jungtinėje Karalystėje atspariausia rūšis – T. circumcincta (14, 32). Prancūzijoje labiausiai paplitusi atspari fenbendazolui nematodų rūšis yra Teladorsagia spp., antra pagal paplitimą – Trichostrongylus spp. (14). Mūsų tyrimo metu visų AR ivermektinui pasižyminčių lervų buvo identifikuota Trichostrongylus spp., o TBZ visų atsparių lervų buvo identifikuota 73,7 proc. Trichostrongylus spp. ir 26,3 proc. Teladorsagia spp. Atlikus šį tyrimą buvo išsisaiškinta, kad Lietuvoje, kaip ir daugelyje Europos šalių nustatytos tos pačios nematodų rūšys (p<0,05).

32

IŠVADOS

1. Atlikus lervų vystymosi mikro-agare testą antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams nustatytas 4 ūkiuose (36,4 proc.), ivermektinui – 3 tirtuose ūkiuose (27,3 proc.), o levamizoliui antihelmintinis rezistentiškumas Marijampolės rajono avių ūkiuose nebuvo aptiktas.

2. Mišrus antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui ir benzimidazolams nustatytas 2 tirtuose avių ūkiuose (18,2 proc.) Marijampolės rajone.

3. Išsiaiškinta, kad Marijampolės rajono avių ūkiuose dažniausiai nustatomas antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams ir ivermektinui yra vidutinio lygio.

4. Atlikus in vitro tyrimus nustatyta, kad Marijampolės rajono avių ūkiuose atsparios antihelmintikams nematodų rūšys – Teladorsagia ir Trichostrongylus.

5. Nustatyta, kad užsienio valstybėse antihelmintinio rezistentiškumo benzimidazolams, ivermektinui bei levamizoliui paplitimas avių fermose yra žymiai didesnis negu visuose ištirtuose Marijampolės rajono avių ūkiuose.

33

PADĖKA

Dėkoju už pagalbą ir patarimus ruošiant baigiamąjį magistrinį darbą savo darbo vadovui prof. habil. dr. Sauliui Petkevičiui.

Nuoširdžiai dėkoju LSMU VA Patobiologijos katedros veterinarinės parazitologijos doktorantei Agnei Beleckei, už pagalbą renkant mėginius, atliekant tyrimą, patarimus rašant baigiamąjį darbą bei nuoširdų bendradarbiavimą.

Taip pat esu dėkinga LSMU VA Patobiologijos katedros lektoriui, VF prodekanui dr. Tomui Kupčinskui, kuris geranoriškai konsultavo rezultatų statistikos apskaičiavimo klausimais.