LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Rokas Pakalnis
Arklių virškinamojo trakto nematodų kontrolė ir
antihelmintinis rezistentiškumas Aukštaitijos regione
Control and anthelmintic resistance of gastrointestinal
horse nematodes in Aukštaitija region
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. habil. dr. Saulius Petkevičius
2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Arklių helmintų kontrolė ir
antihelmintinis rezistentiškumas Aukštaitijos regiono žirgynuose“:
1) yra atliktas mano paties (pačios);
2) nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3) nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. 2020-12-15 Rokas Pakalnis
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ
Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
2020-12-15 Judita Sakalienė
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui. 2020-12-15 prof. habil. dr. Saulius Petkevičius
(data) (vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os)
vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
prof. dr. Alvydas Malakauskas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Arklių strongilai ... 10 1.1.1. Didieji strongilai ... 10 1.1.2. Mažieji strongilai... 101.1.3. Strongilų invaziją lemiantys veiksniai... 11
1.2. Arklių strongilų paplitimas ... 11
1.2.1. Didžiųjų strongilų paplitimas ... 11
1.2.2. Mažųjų strongilų paplitimas ... 11
1.3. Arklių strongilų kiaušinėlių diagnostika ... 12
1.3.1. Modifikuotas McMaster metodas... 12
1.3.2. Helmintų kiaušinėlių skaičiaus sumažėjimo testas (HKSS) ... 12
1.4. Antihelmintiniai preparatai ... 13
1.4.1. Benzimidazolai ... 13
1.4.2. Makrocikliniai laktonai... 14
1.4.3. Tetrahidropirimidinai ... 14
1.5. Strongilų antihelmintinis rezistentiškumas ... 15
1.5.1. Antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams ... 15
1.5.2. Antihelmintinis rezistentiškumas tetrahidropirimidinams ... 15
1.5.3. Antihelmintinis rezistentiškumas makrocikliniams laktonams ... 16
1.6. Antihelmintinio rezistentiškumo kontrolė ... 16
1.6.1. Bendrosios tvarkos palaikymo ganykloje strategijos ... 16
1.6.2. Rotuojantis nukirminimas ... 17
1.6.3. Selektyvus gydymas ... 17
1.6.4. Kombinuotas gydymas ... 17
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI... 19
4
2.2. Koprologinis tyrimas ... 19
2.3. Tiriamųjų atranka ... 20
2.4. Tiriamieji ... 21
2.5. Tiriamųjų skirstymas į grupes ... 21
2.6. Dehelmintizuojamos ir kontrolinė grupės... 21
2.7. Antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos efektyvumo ir nematodų atsparumo preparatui nustatymas ... 22
2.8. Antihelmintinių medžiagų preparatai, dozės ... 23
2.9. Statistinė analizė ... 23
3. TYRIMO REZULTATAI ... 25
3.1. Užsikrėtimo nematodais lygis ... 25
3.2. Arklių užsikrėtimo nematodais sąsajos su amžiumi, lytimi bei veisle ... 26
3.3. Antihelmintinių preparatų veikliųjų medžiagų efektyvumo tyrimai ... 28
3.3.1. Antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos – pirantelio – efektyvumo ir antihelmintinio rezistentiškumo tyrimas ... 29
3.3.2. Antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos – fenbendazolo – efektyvumo ir antihelmintinio rezistentiškumo tyrimas ... 30
3.4. Antihelmintinių medžiagų – pirantelio ir fenbendazolo – gydymo efektyvumo palyginimas ... 30 REZULTATŲ APTARIMAS ... 32 IŠVADOS ... 35 REKOMENDACIJOS ... 36 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 37 PADĖKA ... 41
5 ARKLIŲ VIRŠKINAMOJO TRAKTO NEMATODŲ KONTROLĖ IR ANTIHELMINTINIS
REZISTENTIŠKUMAS AUKŠTAITIJOS REGIONE Rokas Pakalnis
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Arklių strongilai yra vieni iš labiausiai paplitusių arklių virškinamojo trakto parazitų. Ilgą laiką šių parazitų invazijos kontrolė buvo vykdoma dažna profilaktine dehelmintizacija plačiai paplitusiais ir lengvai prieinamais antihelmintiniais preparatais. Dėl neatsakingo jų naudojimo pradėjo vystytis arklių nematodų atsparumas šioms medžiagoms – dabar tai viena iš svarbiausių problemų veterinarijoje.
Šio darbo tikslas yra ištirti arklių užsikrėtimo strongilais lygį, nustatyti antihelmintinių preparatų – pirantelio (PYR) ir fenbendazolo (FBZ) – efektyvumą ir parazitų rezistentiškumą jiems šešiuose žirgynuose Aukštaitijos regione.
Buvo surinkti ir ištirti arklių išmatų mėginiai (n=97) ir, naudojant modifikuotą McMaster metodą, suskaičiuotas kiekvieno arklio Strongyles kiaušinėlių skaičius 1 g išmatų (KSG 0 d). Visi arkliai (100 proc.) buvo užsikrėtę strongilais ir atitiko įtraukimo į tyrimą kriterijų (KSG ≥ 200): 76,3 proc. nustatytas aukštas, 23,7 proc. – vidutinis užsikrėtimo nematodais lygis (p < 0,001). Nustatytos svarbios arklių užsikrėtimo nematodais sąsajos su amžiumi: jaunų arklių (≤ 5 metų amžiaus), kuriems nustatytas aukštas užsikrėtimo nematodais lygis, buvo reikšmingai daugiau nei suaugusiųjų (> 5 metų amžiaus) (89,8 proc. vs. 62,5 proc., p=0,002; ŠS 5,28; 95 proc. PI 1,768-15,769; p=0,003); arklių amžius atvirkščiai, reikšmingai koreliavo su KSG 0 d. (r=-0,6, p<0,001). Arklių užsikrėtimo nematodais sąsajų su lytimi bei veisle nebuvo nustatyta.
Vėliau arkliai atsitiktine tvarka buvo suskirstyti į 3 grupes: PYR poveikio (n=30), FBZ poveikio (n=30) ir kontrolinę (n=37). Grupės, atsižvelgiant į amžių, lytį, veislę, KSG 0 d. ir užsikrėtimo nematodais lygį nesiskyrė (p > 0,05). Praėjus 14 d. po dehelmintizacijos, buvo pakartotinai surinkti ir ištirti arklių išmatų mėginiai (KSG 14 d.). Pagal apskaičiuotą procentinį helmintų kiaušinėlių skaičiaus sumažėjimą (HKSS) įvertintas bei palygintas dehelmintizacijai naudotų preparatų efektyvumas bei parazitų antihelmintinis rezistentiškumas. Nustatytas labai aukštas PYR (HKSS = 99,89 proc.) ir mažas FBZ (HKSS = 89,04 proc.) efektyvumas, gydant arklių nematodus (p = 0,001), bei strongilų antihelmintinis rezistentiškumas fenbendazolui.
Raktažodžiai: strongilai, McMaster, KSG, antihelmintinis rezistentiškumas, PYR, FBZ, efektyvumas, HKSS, arklių nematodai, antihelmintikai, arkliai.
6 CONTROL AND ANTHELMINTIC RESISTANCE OF GASTROINTESTINAL
HORSE NEMATODES IN THE STABLES OF AUKŠTAITIJA REGION Rokas Pakalnis
Master‘s Thesis
SUMMARY
Equine strongyles are among the most prevalent and most important gastrointestinal parasites in horses. For a long time now, infections with those parasites are solved by anthelmintic treatment. However, careless use of these drugs has resulted in development of worldwide problem in veterinary – anthelmintic resistance (AR).
The aim of this research was to examine the infection level of strongyles in horses, as well as the efficacy of two anthelmintics – pyrantel (PYR) and fenbendazole (FBZ) – and the anthelmintic resistance to both drugs in six stables of Aukštaitija region.
The samples of faeces of each horse (n=97) were taken and investigated using the modified McMaster method, Strongyles faecal egg count (FEC) before treatment was calculated. All horses (100%) were infected and have met the requirements for the study (FEC ≥ 200): 23.7% of the horses had a medium infection level and 76.3% of the horses had a high infection level (p < 0,001). The importance of links with horse age and infection were determined: high infection level was more prevalent in young horses (≤ 5 years old) compared to adults (> 5 years old) (89,8% vs. 62,5%, p=0,002; OR 5,28; 95% CI 1,768-15,769; p=0,003). Horse age correlated inversely with FEC before treatment (r = -0,6, p < 0,001). The significance of horse gender and breed links with FEC before treatment was not detected.
The horses were distributed to three groups in a random order: PYR treatment (n=30), FBZ treatment (n=30), and control (n=37). The groups were not different according to age, breed, gender, FEC before treatment and infection level (p > 0,05). Furthermore, the faecal samples were collected repeatedly, fourteen days after treatment, and using faecal egg count reduction test (FECRT) the efficacies of PYR and FBZ were examined, as well as the AR of the strongyles. PYR efficacy was 99,89%, which is considered as high (FECRT > 98%). FBZ efficacy was 89,04% and is considered of low effectiveness (FECRT 80 – 89%) and AR to FBZ was detected.
Keywords: horse, strongyles, McMaster, FEC, AR, PYR, FBZ, efficacy, FECRT, equine nematodes, anthelmintics.
7
SANTRUMPOS
F – Fišerio kriterijus
FBZ – fenbendazolas
HKSS – helmintų kiaušinėlių sumažėjimo skaičius
KSG – kiaušinėlių skaičius viename grame išmatų
KSG (0 d.) – kiaušinėlių skaičius 1 grame išmatų prieš dehelmintizaciją
KSG (14 d.) – kiaušinėlių skaičius 1 grame išmatų 14 d. po dehelmintizacijos
lls – laisvės laipsnių skaičius
max – didžiausia reikšmė
min – mažiausia reikšmė
n – atvejų skaičius
p – reikšmingumo lygmuo
pav. – paveikslas
PI – 95 proc. pasikliautinasis intervalas
PYR – pirantelis proc. – procentas r – koreliacijos koeficientas SN – standartinis nuokrypis ŠS – šansų santykis V – vidurkis
vs. – palyginti su (angl. versus)
8
ĮVADAS
Arkliai, laikomi žirgynuose ar ganyklose, nuolatos turi riziką užsikrėsti virškinamojo trakto nematodais. Iš šio tipo kirmėlių dažniausiai aptinkamos strongilų (Strongylidae) invazijos, todėl jų sukeliamos strongiliozės yra laikomos svarbiausiomis arklių parazitinėmis ligomis (1, 2).
Strongilai yra skirstomi į mažuosius (Cyathostominae) ir didžiuosius (Strongylinae) (3). Pastarieji yra mažiau paplitę, tačiau kelia didelę grėsmę šeimininko organizmui ir jų invazija gali būti letali (4). Mažieji strongilai sukelia ūmų arba lėtinį enteritą, svorio praradimą bei letargiją, tačiau turi išsivysčiusį kur kas stipresnį antihelmintinį rezistentiškumą (5, 6). Užsikrėtimą šiais parazitais lemia daug veiksnių: klimatas, intervalas tarp dehelmintizacijų, amžius, ganymo tvarka bei ganyklos higiena (7).
Kovai su arklių virškinamojo trakto parazitozėmis naudojama nemažai antihelmintinių preparatų, tačiau labiausiai paplitusios ir daugiausia helmintų rūšių veikiančios grupės yra benzimidazolai, tetrahidropirimidinai ir makrocikliniai laktonai (8). Dėl dažno ir nesistemiško šių medžiagų naudojimo pasauliniu mastu pradėjo plisti joms atsparūs arklių parazitai ir tai sukėlė šiuo metu veterinarijoje labai aktualią problemą – antihelmintinį rezistentiškumą (9).
Jau net 1960 metais Jungtinėje Karalystėje pirmą kartą pranešta apie šiuo metu stipriausią ir labiausiai po visą pasaulį paplitusį parazitų atsparumą benzimidazolų grupės preparatams – jie turi platų veikimo spektrą, yra mažai toksiški bei lengvai prieinami, todėl šie antihelmintikai patrauklūs arklių savininkams ir yra dažnai naudojami. Atsparumas tetrahidropirimidinams vystosi dėl neatsakingo arklių šeimininkų elgesio – profilaktiškai kasdien suduodamos pirantelio dozės – ir yra smarkiai paplitęs JAV, Norvegijoje bei Danijoje, o jau 2011 metais, JAV buvo pranešta apie besivystantį atsparumą makrociklinių laktonų grupei, kuris taip pat plinta po Naująją Zelandiją, Argentiną ir Jungtinę Karalystę (10, 11).
Antihelmintinio rezistentiškumo (AR) kontrolei bei profilaktikai yra naudojamos įvairios strategijos, tokios kaip selektyvus stipriausiai užsikrėtusių arklių gydymas, kombinuotas gydymas, naudojant kelias antihelmintines medžiagas vienu metu, ir rotuojantis nukirminimas, kurio metu tam tikrais periodais keičiami antiparazitiniai preparatai (9).
Taip pat AR profilaktikai rekomenduojama kuo dažniau šalinti mėšlą iš ganyklų, tačiau neretai savininkai vengia tai vykdyti ir tai sudaro tolimesnes sąlygas atsparumui plisti. Patariama ir nuolatos stebėti arklių bandos KSG pasitelkiant koprologinį tyrimą, pagal kurį galima nustatyti užsikrėtimo lygį nematodais (žemas, vidutinis, aukštas), bet šeimininkai taip pat į tai žiūri skeptiškai ir nusprendžia to nedaryti arba šį metodą taiko ne visiems laikomiems arkliams (12, 13).
9 Lietuvoje atsparumo antihelmintinėms medžiagoms problema taip pat aktuali, kadangi dauguma arklių savininkų naudojasi pasenusiomis dehelmintizacijos programomis (dukart per metus), o preparatų grupes keičia labai retai, netgi kas 5 metus. Todėl galima spėti, jog ir Lietuvoje yra paplitusių antihelmintikams rezistentiškų arklių nematodų (14).
Visame pasaulyje aktuali nematodų atsparumo antihelmintiniams preparatams problema, tai paaiškina atliekamo tyrimo aktualumą. Šiuo darbu siekiama papildyti žinias apie arklių nematodų paplitimą bei jų rezistentiškumą antihelmintikams Lietuvoje, tikintis, kad tos žinios pasitarnautų kuriant dehelmintizacijos metodines - praktines rekomendacijas.
Darbo tikslas: ištirti arklių užsikrėtimo virškinamojo trakto nematodais lygį, gydymo efektyvumą ir nustatyti naudotų antihelmintinių medžiagų – pirantelio bei fenbendazolo – efektyvumą šešiuose žirgynuose Aukštaitijos regione.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti surinktus arklių išmatų mėginius, taikant modifikuotą McMaster metodą ir įvertinti užsikrėtimo nematodais lygį.
2. Nustatyti arklių užsikrėtimo nematodais sąsajas su amžiumi, lytimi bei veisle.
3. Įvertinti antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos – pirantelio – efektyvumą bei arklių nematodų atsparumą preparatui.
4. Įvertinti antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos – fenbendazolo – efektyvumą bei arklių nematodų atsparumą preparatui.
5. Palyginti tyrime naudotų dviejų antihelmintinių medžiagų (pirantelio ir fenbendazolo) preparatų efektyvumą gydant.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Arklių strongilai
Strongiliozė – viena iš svarbiausių arklių virškinamojo trakto ligų, kuri yra sukeliama Strongylidae šeimos nematodų ir paveikia daugiau nei 80 proc. pasaulio arklių populiacijos (2). Arkliai, kurie ganosi užterštose ganyklose ir nėra gydomi efektyviais antihelmintiniais preparatais, gali sukaupti didelį kiekį šių parazitų (15). Šie nematodai yra skirstomi į dvi pagrindines kategorijas: Strongylinae (kitaip žinomi kaip didieji strongilai) ir Cyathostominae (kitaip žinomi kaip mažieji strongilai) (3). Užsikrėtimas didžiaisiais strongilais gali būti mirtinas, o mažieji strongilai nesukelia tokių stiprių klinikinių požymių, tačiau yra atsparesni antihelmintikams (5).
1.1.1. Didieji strongilai
Išskiriamos trys arklių virškinamajame trakte parazituojančios didžiųjų strongilų rūšys: Strongylus edentatus, Strongylus vulgaris ir Strongylus equinus (16). Pabrėžiama, jog ir lervinės, ir suaugusios didžiųjų strongilų stadijos yra patogeniškos, tačiau pati patogeniškiausia yra S. vulgaris lervinė stadija, migruojanti per kraujotakos sistemą. Šios lervos prilimpa prie kraujagyslių sienelių, dėl to gali išsivystyti aneurizmos, embolai mažose arteriolėse (17). Taip pat gali išsivystyti tokios patologijos kaip žarnyno infarktas, peritonitas, parazitinis arteritas ir trombozė ir pasireikšti tokie klinikiniai požymiai kaip diegliai, šlubavimas, neurologiniai sutrikimai bei širdies, inkstų ir kepenų pažeidimai, kurie gali kelti pavojų gyvybei (18).
Strongylus edentatus lervos migruoja per portalinę kepenų sistemą, vėliau į ventralinėje pilvo dalyje esantį riebalinį audinį ir galiausiai atgal į žarnų sieneles, tad gali sukelti peritonitą ir kepenų pažeidimus (16, 17).
Strongylus equinus parazitai yra retai aptinkami, tačiau ne mažiau pavojingi. Jų lervinė stadija migruoja per pilvo sieną, vėliau per kasą, kepenis ir žarnų sieneles. Šie nematodai taip pat gali sukelti kepenų pažeidimus, pankreatitą (16, 17).
1.1.2. Mažieji strongilai
Cyathostominae pošeimis yra sudėtingas, turintis 51 rūšį nematodų (19). Per pastaruosius dešimtmečius šie parazitai tapo dažniausiai arklių organizme aptinkamomis apvaliosiomis kirmėlėmis, dėl to tai yra labai svarbus patogenas (20).
Ciatostomos pirmoje lervos stadijoje (L1) patenka į aplinką su išmatomis ir, esant palankiai temperatūrai bei drėgmei, vystosi iki patogeniškos stadijos (L3). Į arklių organizmą šios lervos patenka jiems ganantis (per os) ir, sunykus apvalkalui, įsiskverbia bei incistuojasi gaubtinės arba
11 aklosios žarnos gleivinėje. Ten lervos suauga iki paskutinės (L5) stadijos ir patenka į žarnos spindį (20).
Arklių organizme incistavusios mažųjų strongilų lervos sukelia lervinę ciastominozę, kurios metu iš storosios žarnos gleivinės sinchroniškai išsiskiria didelis kiekis šių nematodų lervų ir pasireiškia ūminis arba lėtinis viduriavimas, svorio netekimas ir retais atvejais – mirtis (20). Mirštamumas nuo ciatostomų invazijų siekia 50 proc. (7).
1.1.3. Strongilų invaziją lemiantys veiksniai
Amžius – svarbiausias veiksnys, lemiantis šių parazitų invaziją bei jos stiprumą. Jauni arkliai (iki 5 metų amžiaus) yra labiau linkę užsikrėsti strongilais nei senesni arkliai (6 metų amžiaus ir daugiau). Taip pat, esant strongilų invazijai, suaugusių arklių išmatose nustatomas mažesnis skaičius parazitų kiaušinėlių (21). Klimatas taip pat turi įtakos strongilų invazijai – žiemą vyrauja mažiausia tikimybė užsikrėsti šiais virškinamojo trakto nematodais (22). Prie rizikos užsikrėsti strongilais veiksnių taip pat priskiriamas laikas nuo paskutinės dehelmintizacijos – kuo ilgesnis laikotarpis po paskutinį kartą arkliui vykdytos dehelmintizacijos, tuo didesnė tikimybė užsikrėsti (23). Taip pat įtakos turi arklio ganymo ganykloje dažnumas, ganyklos higienos sąlygos, laukų tręšimas mėšlu, laukų akėjimas, apsodinimas (7, 24).
1.2. Arklių strongilų paplitimas
1.2.1. Didžiųjų strongilų paplitimas
Nuo 2003 iki 2012 metų vykdyto tyrimo Hanoveryje, Vokietijoje, rezultatai parodė, jog didžiųjų strongilų paplitimas arklių populiacijoje yra lygus 30,1 proc. (25).
Švedijoje 2016 ir 2017 metų kovo – birželio mėnesiais rinktų išmatų mėginių tyrimo rezultatai parodė, kad didžiųjų strongilų paplitimas arklių bandose yra 61 proc. Šis rodiklis Švedijos teritorijoje auga, lyginant su 1999 metų rezultatais (14 proc. paplitimas arklių bandose) (26).
1.2.2. Mažųjų strongilų paplitimas
Nustatyta, jog įvairios mažųjų strongilų rūšys yra pastebimos Lenkijos, Ukrainos, Jungtinės Karalystės, Prancūzijos, Švedijos, Maroko, Jungtinių Amerikos Valstijų, Brazilijos bei Australijos teritorijose (19).
Visame pasaulyje paplitusių lengviausiai identifikuojamų mažųjų strongilų genčių yra 14: Cyathostomum, Hsiungia, Coronocyclus, Cylicodontophorus, Cylindropharynx, Skrjabinodentus Caballonema, Cylicocyclus, Poteriostomum, Parapoteriostomum, Gyalocephalus, Petrovinema, Tridentoinfundibulum, Cylicostephanus (3).
12 Luizianos valstijoje, JAV, atliktas tyrimas, kurio tikslas buvo diferencijuoti dažniausiai arklinių šeimos atstovų organizme aptinkamus mažuosius strongilus, parodė, jog daugiausia buvo aptikta šių rūšių: Cylicostephanus goldi, Cylicostephanus longibursatus, Cylicostephanus minutus, Cylicostephanus calicatus, Cyathostomum catinatum, Cylicocyclus nassatus, Coronocyclus coronatus, Coronocyclus labiatus, Coronocyclus labratus (27).
1.3. Arklių strongilų kiaušinėlių diagnostika
1.3.1. Modifikuotas McMaster metodas
Plačiai naudojamas, daug išlaidų priemonėms nereikalaujantis metodas yra modifikuotas McMaster tyrimo metodas (modifikavo A. Aagaard bei S. A. Henriksen). Jam reikalingos šviežios išmatos. Šiuo būdu apskaičiuojamas nematodų kiaušinėlių skaičius viename grame išmatų (KSG). Šis metodas gali būti modifikuojamas išmatų kiekiu ir flotacinio tirpalo kiekiu, tačiau standartinis būdas yra 4 g išmatų ir 56 ml flotacinio tirpalo. Vėliau gautas tirpalas filtruojamas per dvisluoksnę marlę, pilamas į dviejų dalių McMaster kamerą, ir po 10 minučių galima pradėti skaičiavimą (14, 28). Kiaušinėliai identifikuojami ir skaičiuojami pagal morfologiją: didieji strongilai išskiria kiaušinėlius, kurie yra kiaušinio formos, 45*80 mikrometrų ploto, plono apvalkalo ir viduje turi morulę, sudarytą iš 16 ląstelių (4). Mažieji strongilai išskiria kiaušinėlius, kurie yra ovalo formos, 50-58*30-34 mikrometrų ploto, plono apvalkalo. Jų morulės ląstelių kiekis varijuoja nuo 2 iki 8 (6).
Atlikus šį tyrimą, pagal arklių parazitų išskiriamų kiaušinėlių skaičių išmatose galima nustatyti užsikrėtimo lygį: <200 KSG – žemas užsikrėtimo lygis, 200-500 KSG – vidutinis užsikrėtimo lygis, >500 KSG – aukštas užsikrėtimo lygis (13).
1.3.2. Helmintų kiaušinėlių skaičiaus sumažėjimo testas (HKSS)
Helmintų kiaušinėlių skaičiaus sumažėjimo (HKSS) testas (angl. Faecal egg count reduction test (FECRT)) yra plačiausiai naudojamas metodas antihelmintinių preparatų veiksmingumui bei antihelmintiniam rezistentiškumui nustatyti (29). Veiksmingumas skaičiuojamas pagal KSG aritmetinio vidurkio sumažėjimą tarp arklio išskirtų nematodų KSG prieš gydymą antihelmintiniais preparatais ir KSG, praėjus 14 d. po gydymo (15, 30).
Taikoma ši formulė:
𝐻𝐾𝑆𝑆 = 100 ∗KSG (0 d. ) − 𝐾𝑆𝐺 (14 𝑑. ) KSG (0d. )
KSG (0 d.) – kiaušinėlių skaičius 1 grame išmatų prieš gydymą.
13 Rezultatai apskaičiuojami procentais, kurie parodo taikyto preparato efektyvumą. Yra daug nuomonių, kaip interpretuoti gautus rezultatus. Remiantis 1985 metų duomenimis, taikyta tokia sistema: daugiau nei 90 proc. – labai veiksmingas preparatas, nuo 75 proc. iki 90 proc. – veiksmingas, nuo 50 proc. iki 75 proc. – silpnas, mažiau nei 50 proc. – neveiksmingas. Šiais laikais naudojama naujesnė ir griežtesnė 1999 metų vertinimo sistema: daugiau nei 98 proc. – labai veiksmingas preparatas, nuo 90 proc. iki 98 proc. – veiksmingas, nuo 80 proc. iki 89 proc. – mažai veiksmingas, 80 proc. ir mažiau – neveiksmingas (14, 32).
Atskirų antihelmintinių preparatų grupių veiksmingumą siūloma vertinti pagal šiuos kriterijus (15):
• Makrocikliniai laktonai veiksmingi, jei apskaičiuotas HKSS >95 proc. • Benzimidazolai veiksmingi, jei apskaičiuotas HKSS >90 proc.
• Tetrahidropirimidinai veiksmingi, jei apskaičiuotas HKSS >90 proc.
1.4. Antihelmintiniai preparatai
Jau bene penkis dešimtmečius antihelmintiniai preparatai yra naudojami arklių parazitų plitimui kontroliuoti bei valdyti. Pagrindinės kovoje su arklių helmintais naudojamos ir plačiai prieinamos antihelmintinių medžiagų grupės yra benzimidazolai, makrocikliniai laktonai ir tetrahidropirimidinai. Kiekvienos iš šių grupių efektyvumas prieš atitinkamai grupei jautrius parazitus patikrintas. Taip pat yra išskiriamos dar keturios antihelmintikų grupės: pro-benzimidazolai, imidazotiazoliai, salicilanilidai ir izokvinolinai, tačiau jos naudojamos rečiau (8). Antihelmintikų naudojimo tikslas yra ne tik išgydyti gyvūnus, sergančius parazitozėmis – jais stengiamasi mažinti aplinkos užterštumo lygį, siekiant užtikrinti, jog gyvūnai neužsikrėstų parazitais. Taip pat greta šių preparatų yra taikomos kasmetinės ganyklos rotacijos su kitomis gyvūnų rūšimis bei reguliarios ganyklų higienos procedūros (33).
1.4.1. Benzimidazolai
Ši dažnai naudojama antihelmintikų grupė turi platų veikimo spektrą ir žemą toksiškumą žinduoliams. Benzimidazolų grupės preparatai, visame pasaulyje patvirtinti arklių virškinamojo trakto parazitinėms invazijoms gydyti, yra šie: tiabendazolas, mebendazolas, oksibendazolas, fenbendazolas, oksfendazolas ir kambendazolas (8).
Nustatyta, jog šios grupės antihelmintikai veikia užkirsdami kelią parazitų mikrotubulių polimerizacijai, prisirišdami prie beta-tubulino ir gaunamas rezultatas yra sunaikinta ląstelės struktūra (8). Kadangi nuo mikrotubulių priklauso ląstelių homeostazės palaikymas, joms nykstant stabdoma daugelis viduląstelinių mechanizmų ir taip parazitai miršta. Taip pat manoma, jog benzimidazolai
14 slopina mitochondrijų fermento (fumarato reduktazės) veiklą, gliukozės perdavimą organizme ir stabdo oksidacinį fosforilinimą. Šie preparatai naikina parazitų kiaušinėlius, lervas ir suaugusius parazitus (34).
Nors šios grupės preparatai yra saugūs, taikant per dideles dozes gali pasireikšti retas teratogeninis poveikis. Pagrindiniai pasireiškę įgimti defektai: sutrikęs ilgųjų, dubens ir pirštų kaulų išsivystymas bei sutrikęs sąnarių išsivystymas (8).
1.4.2. Makrocikliniai laktonai
Makrociklinių laktonų grupei priklauso šios antihelmintinės medžiagos: ivermektinas, abamektinas, moksidektinas, doramektinas, eprinomektinas, selamektinas ir milbemicino oksimas. Šios grupės preparatai pasižymi veiksmingumu net ir skiriant mažomis dozėmis. Makrocikliniai laktonai yra veiksmingi prieš endoparazitus ir ektoparazitus, tačiau šios vaistinės medžiagos nėra veiksmingos prieš cestodus ir trematodus (8).
Ši antihelmintikų grupė veikia ląstelinius chloro kanalus, padidindami chloro laidumą per ląstelės membraną, o tai sukelia hiperpoliarizaciją ir raumenyno paralyžių. Dėl šių veiksnių sutrinka helmintų virškinimo procesas bei apsunkinamas jų gebėjimas įsitvirtinti parazitavimo vietoje, todėl parazitai miršta. Makrocikliniams laktonams jautrūs chloro kanalai specifiškai randami nematodų ir nariuotakojų organizmuose. Kadangi cestodai ir trematodai tokių darinių neturi, šie antihelmintikai jų neveikia (35).
Švelnus toksiškas makrociklinių laktonų poveikis pasireiškia naudojant preparatus 10 kartų didesnėmis dozėmis, nei nurodyta gydymui, todėl ši antihelmintikų klasė laikoma pakankamai saugia. Pasitaikantys šalutiniai poveikiai yra plataus spektro: neurotoksinis poveikis, ataksija, drebėjimas, depresija, akių midriazė, miozė, gąsdinimo reflekso išnykimas, retais atvejais – koma, regėjimo praradimas (8, 35).
1.4.3. Tetrahidropirimidinai
Iš tetrahidropirimidinų grupės tik pirantelis yra patvirtintas gydomajam naudojimui. Jo preparatai (pirantelio tartratas ir pirantelio pamoatas) paplitę oralinės pastos arba granulių pavidalu. 2016 metų duomenimis, pirantelio naudojimas pasauliniu mastu išaugo, kadangi padidėjo antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolų grupės preparatams. Pirantelis yra efektyvus prieš suaugusius nematodus, tačiau rodo žemesnį efektyvumą prieš migruojančias lervas, įsitvirtinusias lervas ir kitas besivystančias formas. Taip pat šis preparatas yra labai efektyvus (95–97 proc.) prieš suaugusius mažuosius strongilus ir didžiųjų strongilų rūšį S. vulgaris, tačiau mažiau efektyvus (70 proc.) prieš S. edentatus (8).
15 Tetrahidropirimidinai veikia kaip sinapsinių ir ekstrasinapsinių nikotininių acetilcholino receptorių agonistai parazitų raumenų ląstelėse. Taip jie sukelia raumenų susitraukimus ir galų gale paralyžių, todėl parazitai pasišalina iš gyvūno organizmo (8).
Pirantelio tartrato vidutinė letali dozė yra apie 12 kartų žemesnė nei pirantelio pamoato, todėl pastarasis yra saugesnis vartoti. Arkliams šalutiniai poveikiai pasireiškia 20 kartų viršijus pirantelio pamoato dozę, rekomenduojamą gydymui. Ištinka tokie nepageidaujami reiškiniai, kaip prakaitavimas, apsunkintas kvėpavimas, dusulys ir retais atvejais – mirtis (8).
1.5. Strongilų antihelmintinis rezistentiškumas
Antihelmintinis rezistentiškumas iš esmės apibrėžiamas taip: tai veiksnys, kai antihelmintinis preparatas praranda savo efektyvumą prieš parazitų populiaciją, prieš kurią anksčiau buvo efektyvus, arba parazitų populiacijos jautrumo specifiniam antihelmintikui sumažėjimas, kuris, manoma, yra perduodamas genetiškai (9). Jau daugelį metų arklių helmintų kontrolės strategijos yra orientuotos į nematodų kiaušinėlių skaičiaus mažinimą, taikant dažnas profilaktines dehelmintizacijas, atsižvelgiant į kiaušinėlių pakartotinio pasirodymo laiko intervalus. Plačiai paplitus šioms programoms, arklių virškinamojo trakto parazitozių, ypač sukeltų S. vulgaris, sumažėjo, tačiau dėl dažno antihelmintinių medžiagų naudojimo tarp mažųjų strongilų pradėjo ryškėti antihelmintinis rezistentiškumas. Jau praeitą dešimtmetį buvo publikuoti straipsniai apie po visą pasaulį plintantį ciatostomų antihelmintinį rezistentiškumą benzimidazolų grupės preparatams bei piranteliui. Šiuo metu mažųjų strongilų rezistentiškumas makrociklinių laktonų preparatams vis auga, kadangi gydant šios grupės preparatais vis trumpėja kiaušinėlių pakartotinio pasirodymo laiko intervalas (15, 36).
1.5.1. Antihelmintinis rezistentiškumas benzimidazolams
Iš trijų pagrindinių antihelmintikų grupių rezistentiškumas benzimidazolams yra plačiausiai paplitęs. Daugumoje vietovių atsparumas šios klasės preparatams yra toks dažnas, kad sunku surasti atsparumo benzimidazolams neturinčią ciatostomų populiaciją. Nustatyta, jog jei mažųjų strongilų populiacija tampa atspari vienam iš benzimidazolų grupės antihelmintikų, ji įgyja dalinį rezistentiškumą kitiems tos pačios grupės antihelmintikams, išskyrus oksibendazolą, kuris išlieka efektyvus ribotą laiką. Oksibendazolu gydant arklius su benzimidazolams atspariais mažaisiais strongilais, efektyvumas siekia 95 proc., antrais metais 80 proc., o po 8–10 kartų preparatas tampa nepakankamai efektyvus (11).
1.5.2. Antihelmintinis rezistentiškumas tetrahidropirimidinams
Augantis rezistentiškumas pirantelio pamoatui buvo įtartas 1996 metais Luizianoje, kai nepavyko išgydyti arklių bandos nuo ciatostomų invazijos (9). Atsparumas šios grupės
16 antihelmintikams, manoma, vystosi dėl paplitusio kasdienio pirantelio tartrato naudojimo mažomis dozėmis. Žirgynų savininkai dažnai mano, jog, kasdien suduodant po mažą antihelmintinio preparato dozę, gyvūnai bus apsaugoti nuo virškinamojo trakto nematodų, tačiau dėl šios priežasties išsivysto antihelmintinis rezistentiškumas šioms medžiagoms. Paradoksalu, tačiau mažos pirantelio dozės duodamos arkliams, kurie ,manoma, yra imliausi virškinamojo trakto nematodams, todėl būtent šie gyvūnai dažniausiai ir nukenčia nuo minėtų parazitų invazijų. Taigi, vietose, kuriose išsivysto atsparumas piranteliui, arkliai, kuriems reikia intensyviausios parazitinės kontrolės, neretai gauna prasčiausią (11).
1.5.3. Antihelmintinis rezistentiškumas makrocikliniams laktonams
Makrociklinių laktonų grupės populiariausia vaistinė medžiaga – ivermektinas – naudojamas jau nuo 1981 metų (11). Prireikė daugiau nei 20 metų, kol šiam gydomajam preparatui pradėjo vystytis antihelmintinis rezistentiškumas. Mokslininkai spėja, jog tos pačios parazitų populiacijos rodo skirtingus rezistentiškumo antihelmintinėms medžiagoms lygius skirtingose vystymosi ciklo stadijose, todėl manoma, kad taip galėjo išsivystyti atsparumas ivermektinui. Sumažėję ciatostomų kiaušinėlių pakartotinio pasirodymo laiko periodai, gydant ivermektinu ar moksidektinu, rodo padidėjusį šių parazitų ketvirtos stadijos lervų išgyvenamumą, todėl tai siejama su padidėjusiu rezistentiškumu būtent šioje stadijoje. Taip pat spėliojama dėl pakitusio parazitų metabolizmo ar mutavusių receptorių, tačiau šios spėlionės lieka hipotezės (36).
Nustatyta, jog, gydant ivermektinu, mažųjų strongilų kiaušinėlių pakartotinio pasirodymo laiko periodas buvo lygus 4 savaitėms, o tai yra du kartus trumpiau nuo to laiko, kai ivermektinas paplito pasaulinėje rinkoje. Stebint arklius 5 ir 6 savaites gauti rezultatai, jog ciatostomų kiaušinėlių skaičius tik augo. Todėl manoma, jog makrociklinių laktonų efektyvumas vis mažės (37, 38).
1.6. Antihelmintinio rezistentiškumo kontrolė
1.6.1. Bendrosios tvarkos palaikymo ganykloje strategijos
Praeityje antiparazitinė kontrolė buvo orientuota į parazitų stadijas, besivystančias aplinkoje, kadangi nebuvo išrasti saugūs bei efektyvūs antihelmintiniai preparatai. Todėl pagrindinė apsisaugojimo nuo parazitų priemonė buvo ganyklos tvarkos palaikymas. Vėliau, atsiradus plataus spektro antiparazitiniams preparatams, buvo užmiršta apie aplinkoje besivystančias parazitų stadijas ir ganyklos higieną bei jos svarbą (9, 33, 36, 39).
Nuolatinis ganyklos švaros palaikymas užtikrina mažesnį parazitų paplitimą, todėl invazijos būna silpnesnės ir reikalauja mažiau intensyvaus gydymo. Dėl pastarosios priežasties mažėja ir antihelmintinio rezistentiškumo vystymosi greitis (33).
17 Rekomenduojama nuolatos atlikti visų ganyklos arklių išmatų parazitologinius tyrimus – tai suteikia galimybę stebėti epidemiologinę žirgyno situaciją (9). Taip pat taikytina kasmetinė ganyklos rotacija, keičiant besiganančių gyvūnų rūšis toje pačioje ganykloje (pvz., avis ir galvijus) – tai duoda teigiamų rezultatų (33, 40). Siūloma vengti arklių pertekliaus ganymo metu, arklių šėrimo nuo žemės. Patartina įvesti griežtą arklių izoliaciją prieš pridedant į bandą svetimų arklių bei nuolat šalinti susikaupusias išmatas iš ganyklos teritorijos, tačiau pastarasis procesas žirgynų savininkams yra varginantis ir reikalaujantis daug laiko, todėl tampa nepriimtinas (9).
1.6.2. Rotuojantis nukirminimas
Dauguma tyrėjų rekomenduoja reguliariai keisti antihelmintines medžiagas – naudoti rotuojantį nukirminimą, kuris yra dviejų rūšių: lėtasis ir greitasis. Lėtoji rotuojančio nukirminimo programa yra pagrįsta lėtu perėjimu tarp skirtingų antihelmintinių preparatų grupių mažiau nei 3 kartus per metus. Greitasis rotuojantis nukirminimas yra naudojamas dažniau nei lėtasis, keičiant gydomųjų medžiagų grupes intervalais nuo 3 iki 6 kartų per metus. Spėjama, jog, taikant greitąjį rotuojantį nukirminimą, helmintų rezistentiškumas antihelmintiniams preparatams vystosi lėčiausiai, tad patariama pradėti arklius gydyti makrocikliniais laktonais ir vėliau rotuoti kitų grupių vaistiniais preparatais (9, 41).
1.6.3. Selektyvus gydymas
Jau apie 20 metų mokslininkai pataria naudoti mažesnio intensyvumo antihelmintinį gydymą, norint sulėtinti atsparumo vystymąsi (9). Pastebėta, jog žirgynuose yra nevienodai išsidėsčiusios arklių parazitų populiacijos. Tai nustatoma apskaičiuojant jų kiaušinėlių skaičių viename grame išmatų. Dėl šio pastebėjimo veterinarijos parazitologai apibrėžė vadinamą 20/80 taisyklę, kuri reiškia, kad 20 proc. žirgyno arklių yra atsakingi dėl 80 proc. kiaušinėlių platinimo. Vadovaujantis šia taisykle, galima teigti, jog, selektyviai taikant gydymą stipriai užsikrėtusiems arkliams ir negydant silpnai užsikrėtusių arklių, pasiekiamas bendras parazitų kiaušinėlių sumažėjimo rezultatas (39). Siūloma šį gydymo metodą taikyti arkliams, kurių KSG >200, tačiau dėl amžiaus, lyties, klimato bei metų laikų ši riba gali keistis ir kiekvienai ganyklai rekomenduojama ją nustatyti individualiai. Naudojant 99 proc. efektyvumo antihelmintinį preparatą arkliams, kurių KSG yra daugiau nei 200, gaunamas patenkinamas 95 proc. parazitų kiaušinėlių sumažėjimo rezultatas ganyklos lygyje (9).
1.6.4. Kombinuotas gydymas
Parazitų kontrolės programose intensyvus ir pakartotinis tos pačios antihelmintikų klasės naudojimas yra gerai žinomas kaip viena iš antihelmintinio rezistentiškumo plitimo priežasčių. Būtent dėl to buvo pradėtas siūlyti gydymas kombinuojant kelias nukirminimo preparatų grupes, ypač tas, kurių veikimo spektras apima panašias parazitų populiacijas. Šis būdas sudaro sąlygas veiksmingai
18 helmintų kontrolei bei lėtina helmintų atsparumo antihelmintiniams preparatams išsivystymo greitį (9).
Preparatų kombinacijos efektyvumui apskaičiuoti išrasta formulė:
𝑝𝑟𝑜𝑐. 𝐸𝑓𝑒𝑘𝑡𝑦𝑣𝑢𝑚𝑎𝑠 𝐴 + 𝐵
= 1 − [(1 − 𝑝𝑟𝑜𝑐. 𝐸𝑓𝑒𝑘𝑡𝑦𝑣𝑢𝑚𝑎𝑠 𝐴) ∗ (1 − 𝑝𝑟𝑜𝑐. 𝐸𝑓𝑒𝑘𝑡𝑦𝑣𝑢𝑚𝑎𝑠 𝐵)]
proc. Efektyvumas A+B – dviejų preparatų kombinuotas efektyvumas procentais,
proc. Efektyvumas A – pirmojo preparato efektyvumas procentais,
proc. Efektyvumas B – antrojo preparato efektyvumas procentais.
Efektyvumas yra išreikštas kaip nužudytų helmintų proporcija arba helmintų kiaušinėlių viename grame išmatų sumažėjimas (42).
Kol kas informacija apie kombinuotą gydymą yra ribota, kadangi šis gydymas labiausiai paplitęs tik Australijoje bei Naujojoje Zelandijoje, nes šiose šalyse komerciškai pasiekiami kombinuoti kelių antihelmintinių medžiagų preparatai. Taip pat baiminamasi, jog kombinuotas gydymas gali sukelti antihelmintinio rezistentiškumo vystymąsi kelioms preparatų grupėms vienu metu (9).
19
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI
Tyrimas buvo atliktas 2019 m. rudenį šešiuose žirgynuose Aukštaitijos regione.
Tyrimo eiga:
1. Surinkti ir modifikuotu McMaster metodu (1.3.1 skirsnis) ištirti visų arklių (n=97) išmatų mėginiai. Pastarieji buvo renkami nuo žolės, ant kurios ganėsi arkliai, arba iš gardų, kadangi arkliai laikomi atskirai. Suskaičiuoti arklių strongilų kiaušinėliai 1 g išmatų (KSG).
2. Atsižvelgiant į gautus KSG rezultatus, arkliai buvo suskirstyti į grupes pagal užsikrėtimo nematodais lygį. Atitikę įtraukimo į tyrimą kriterijų (KSG ≥ 200) arkliai buvo įtraukti į tyrimą.
3. KSG rezultatai vertinti atsižvelgiant į galimus skirtingo užsikrėtimo arklių nematodais lygio predispozicinius veiksnius – amžių, lytį bei veislę.
4. Atsitiktine tvarka arkliai buvo suskirstyti į 3 grupes. PYR ir FBZ poveikio grupių arkliams buvo suduoti skirtingi antihelmintiniai preparatai (atitinkamai pirantelis ir fenbendazolas). Kontrolinės grupės arkliams antihelmintiniai preparatai nebuvo skirti.
5. Praėjus dviems savaitėms po dehelmintizavimo, pakartotinai surinkti ir ištirti arklių išmatų mėginiai, suskaičiuotas KSG 14 d. ir, naudojant HKSS testo metodiką (1.3.2 skirsnis), nustatytas ir palygintas naudotų antiparazitinių preparatų efektyvumas bei įvertintas parazitų antihelmintinis rezistentiškumas kiekvienam preparatui.
6. Pagal apskaičiuotą HKSS ir KSG 14 d. (KSG 14 d. = 0 vs. KSG 14 d. > 0) palygintos PYR poveikio ir FBZ poveikio grupės.
2.1. Tiriamosios medžiagos rinkimas
Tiriamoji medžiaga – išmatų mėginiai – buvo renkami 2019 metais prieš rudeninę dehelmintizaciją ir praėjus 2 savaitėms po jos – atitinkamai 0 d. ir 14 d. Mėginiams rinkti buvo naudojami vienkartiniai polietileniniai maišeliai, kurie, paėmus išmatas, buvo sandariai užrišti, stengiantis kiek įmanoma labiau sumažinti aplinkos oro patekimą į vidų. Išmatos rinktos kuo šviežesnės ir buvo stengtasi jas tokias išlaikyti iki pat tyrimo. Kiekvienas mėginys buvo atitinkamai ženklinamas, dėl atsekamumo nurodant arklio vardą, lytį, veislę ir amžių.
2.2. Koprologinis tyrimas
Visi surinkti arklių išmatų mėginiai (n=97) buvo ištirti. Koprologiniam tyrimui buvo naudotas modifikuotas McMaster metodas:
20 1. Paruošiamas atitinkamas vienkartinių plastikinių puodelių skaičius – po 2 kiekvienam
mėginiui.
2. Pasveriama 4 g šviežių arklių išmatų ir įdedama į plastikinį puodelį. 3. Į indelį su išmatomis įpilama 56 ml vandens.
4. Turinys išmaišomas ir paliekamas 30 min nusistovėti.
5. Po 30 min, puodelio turinys dar kartą gerai išmaišomas ir filtruojamas per marlę į nenaudotą plastikinį puodelį.
6. Filtratą reikia dar kartą išmaišyti, o vėliau 10 ml filtrato pilama į mėgintuvėlį, pritaikytą centrifuguoti.
7. Filtratas centrifuguojamas 7 minutes 1200 aps. per minutę greičiu.
8. Praėjus laikui, nuo centrifuguotų filtratų pipete atsargiai nutraukiamas skystis, o nuosėdos paliekamos mėgintuvėliuose.
9. Į mėgintuvėlius su nuosėdomis pilama 4 ml flotacinio tirpalo.
10. Turinys gerai išmaišomas ir pipete nutraukiama apie 0,5–1,0 ml šio mišinio.
11. Pipete atsargiai užpildomos abi McMaster kameros pusės, stengiantis nesudaryti oro burbulų. Jei oro burbuliukai susidarė, kamera išplaunama, nusausinama ir bandoma pildyti iš naujo.
12. Praėjus 2-3 minutėms, mėginys mikroskopuojamas (padidinat vaizdą 50 kartų). Kiaušinėliai identifikuojami pagal morfologines savybes ir suskaičiuojami. Jeigu daugiau nei pusė kiaušinėlio yra už kameros ribos, jis nėra skaičiuojamas.
13. Suskaičiavus kiaušinėlių skaičių abiejose kamerose, KSG apskaičiuojamas taip: KSG = (kiaušinėlių skaičius I − oje kameroje + kiaušinėlių skaičius II
− oje kameroje) ∗ 20
14. Baigus tyrimą, McMaster kamerą reikia gerai išplauti ir nusausinti.
2.3. Tiriamųjų atranka
Įtraukimo į tyrimą kriterijus buvo vidutinis ir aukštas užsikrėtimo virškinamojo trakto helmintais lygis (KSG ≥ 200), kurį nustačius rekomenduojama dehelmintizacija. Ištyrus visų arklių (n=97) šviežių išmatų mėginius ir suskaičiavus kiekvieno arklio Strongyles kiaušinėlių skaičių viename grame išmatų (KSG), remiantis 1.3.1. skirsnyje aprašyta metodika, visų arklių KSG (0 d.) buvo ≥ 200, tai rodė vidutinį ir aukštą užsikrėtimo virškinamojo trakto helmintais lygį. Remiantis šiais rezultatais, visus arklius rekomenduojama dehelmintizuoti, tad visi 97/97 (100 proc.) arkliai atitiko įtraukimo į tyrimą kriterijų ir buvo įtraukti į tyrimą.
21
2.4. Tiriamieji
Imtį sudarė 97 arkliai: 50 (51,5 proc.) patinų ir 47 (48,5 proc.) patelės. Imtis buvo vienodos sandaros pagal lytį (p > 0,05). Tirtų arklių amžiaus vidurkis buvo 5,7±4,0 (jauniausias – 1 m., seniausias – 22 m.) metai. Į tyrimą buvo įtraukta 16 skirtingų veislių arklių: Trakėnai, Stambieji žemaitukai, Lietuvos sunkieji, Lietuvos jojamieji, Estijos jojamieji, Latvijos jojamieji, Prancūzų ristūnai, Šetlando, Baltijos hanoveriai, Žemaitukai, Budionai, Amerikos mustangai, Holšteinai, Anglų grynakraujai, Arabų arkliai, Hanoveriai.
2.5. Tiriamųjų skirstymas į grupes
Atliekant statistinius skaičiavimus, arkliai buvo suskirstyti į grupes.
Siekiant nustatyti užsikrėtimo nematodais lygį, arkliai pagal KSG 0 d. buvo suskirstyti į 3 grupes: <200 KSG – žemas užsikrėtimo lygis, 200-500 KSG – vidutinis užsikrėtimo lygis, >500 KSG – aukštas užsikrėtimo lygis.
Siekiant nustatyti arklių užsikrėtimo nematodais lygį galėjusius lemti veiksnius, arkliai buvo sugrupuoti taip:
• Pagal amžių – 49 jauni (nuo 1 iki 5 metų) ir 48 suaugę (≥ 6 metų) arkliai. Per penktus gyvenimo metus arkliai pakeičia pieninius dantis nuolatiniais, tad tyrime buvo pasirinkta arklius nuo 6 metų priskirti suaugusių grupei.
• Pagal lytį – 50 patinų ir 47 patelės. • Pagal veislę – 16 arklių veislių.
2.6. Dehelmintizuojamos ir kontrolinė grupės
Visi, įtraukimo į tyrimą kriterijus atitikę, arkliai (n=97) atsitiktine tvarka buvo suskirstyti į 3 grupes:
• PYR poveikio grupė – 30 arklių, dehelmintizuojamų pirantelio preparatu. • FBZ poveikio grupė – 30 arklių, dehelmintizuojamų fenbendazolo preparatu. • Kontrolinė grupė – 37 arkliai, kuriems dehelmintizacija nebuvo taikyta.
Grupės pagal amžių, lytį ir veislę nesiskyrė (p > 0,05). Grupių charakteristikos pateiktos 1 lentelėje.
22 1 lentelė. Tirtų arklių charakteristikų pasiskirstymas, atsižvelgiant į grupes
Charakteristika Grupė PYR-poveikio, n=30 FBZ-poveikio, n=30 Kontrolinė, n=37 Amžiaus V± SN, metai 5,0±3,3 6,3±4,3 5,7±4,2 p reikšmė F=0,759, lls=2, p=0,471
Amžius, metai, n (proc.): ≤5 >5 17(56,7) 13(43,3) 13(43,3) 17(56,7) 19(51,4) 18(48,6) p reikšmė χ2=1,083, lls=2, p=0,582 Lytis, n (proc.): patinai patelės 15(50,0) 15(50,0) 16(53,3) 14(46,7) 19(51,4) 18(48,6) p reikšmė χ2=0,068, lls=2, p=0,967 Veislės, n (proc.): Žemaitukai Stambieji žemaitukai Lietuvos sunkieji Lietuvos jojamieji Baltijos hanoveriai Latvijos jojamieji Estijos jojamieji Prancūzų ristūnai Šetlendo Trakėnai Budionai Amerikos mustangai Holšteinas Anglų grynakraujis Arabų arkliai Hanoverio 2(6,7) 1(3,3) 8(26,7) 3(10,0) 1(3,3) 0 1(3,3) 3(10,0) 2(6,7) 2(6,7) 2(6,7) 0 4(13,3) 1(3,3) 0 0 2(6,7) 2(6,7) 3(10,0) 5(16,7) 2(6,7) 0 1(3,3) 3(10,0) 3(10,0) 4(13,3) 1(3,3) 1(3,3) 1(3,3) 0,0 0 2(6,7) 2(5,4) 2(5,4) 5(13,5) 7(18,9) 2(5,4) 3(8,1) 0 0 0 5(13,5) 4(10,8) 0 4(10,8) 0 2(5,4) 1(2,7) χ2=31,468, lls=30, p=0,397 (Monte Carlo) V – vidurkis, SN – standartinis nuokrypis, n – atvejų skaičius, F – Fišerio kriterijus, lls – laisvės laipsnių skaičius, p – reikšmingumo lygmuo; χ2 – chi-kvadrato kriterijus
2.7. Antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos efektyvumo ir
nematodų atsparumo preparatui nustatymas
Siekiant nustatyti antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos efektyvumą ir nematodų atsparumą preparatui apskaičiuotas ir vertintas helmintų kiaušinėlių skaičiaus sumažėjimas (HKSS), išreikštas procentais (1.3.2 skirsnis). Palyginti apskaičiuoti HKSS rezultatai ir arklių pasiskirstymas pagal veikliosios medžiagos veiksmingumą tarp grupių: PYR poveikio ir kontrolinės bei FBZ poveikio ir kontrolinės. Pasirinkti šie antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos veiksmingumo vertinimo kriterijai: labai veiksminga (HKSS > 98 proc.), veiksminga (HKSS 90–98 proc.), mažai veiksminga (HKSS 80–89 proc.), neveiksminga (HKSS < 80 proc.).
23
Antihelmintinis rezistentiškumas buvo vertintas atsižvelgiant į Amerikos arklių augintojų asociacijos 2019 m. peržiūrėtus ir patvirtintus antihelmintinio rezistentiškumo vertinimo kriterijus atskiroms antihelmintikų grupėms:
• PYR: HKSS > 90 proc. – nėra rezistentiškumo įrodymų, HKSS = 85–90 proc. – įtariamas rezistentiškumas, HKSS < 85 proc. – nustatomas antihelmintinis rezistentiškumas;
• FBZ: HKSS > 95 proc. – nėra rezistentiškumo įrodymų, HKSS = 90–95 proc. – įtariamas rezistentiškumas, HKSS < 90 proc.– nustatomas antihelmintinis
rezistentiškumas (43).
Siekiant palyginti tyrime naudotų dviejų antihelmintinių medžiagų gydymo efektyvumą, apskaičiuoti HKSS rezultatai palyginti tarp PYR ir FBZ poveikio grupių.
Apie antihelmintinį rezistentiškumą galvota ir dehelmintizacija vertinta kaip nesėkminga, kai 14 dieną po dehelmintizacijos arklių išmatose buvo aptikta Strongyles kiaušinėlių (KSG 14 d. > 0).
2.8. Antihelmintinių medžiagų preparatai, dozės
PYR poveikio grupės arkliai buvo dehelmintizuojami antihelmintiniu preparatu EMBOTAPE – 400 mg/g geriamoji pasta arkliams ir poniams (veiklioji medžiaga pirantelio embonatas). Šio antihelmintiko buvo skiriama rekomenduojama vienkartinė 19 mg/1 kg dozė, per os, švirkščiant pastą ant liežuvio ir palaukiant, kol arklys nuris preparatą.
FBZ poveikio grupės arkliai buvo dehelmintizuojami antihelmintiniu preparatu PANACUR granulės. Tai granulės 222 mg/g (veiklioji medžiaga fenbendazolas). Šio antihelmintiko buvo skiriama rekomenduojama vienkartinė 7,5 mg/1 kg dozė, per os, sumaišant granules su arklio pašaru.
2.9. Statistinė analizė
Statistinė analizė atlikta programos SPSS (angl.– Statistical Package for the Social Science for Windows; Čikaga, JAV) 22.0 paketu. Tikrinant statistines hipotezes, reikšmingumo lygmuo p pasirinktas 0,05.
Naudojant aprašomosios statistikos metodus, buvo apskaičiuoti kokybinių požymių reikšmių dažniai ir santykiniai dažniai, išreikšti procentais. Kiekybiniai požymiai aprašyti nustatant aritmetinį vidurkį (V) ir standartinį nuokrypį (SN), medianas, 25-75 procentiles, minimalias (min) ir maksimalias (max) reikšmes.
Hipotezė, kad kiekybiniai požymiai tiriamųjų grupėse turi normalųjį skirstinį, tikrinta taikant Kolmogorovo Smirnovo testą.
24 Dviejų nepriklausomų grupių kiekybinių kintamųjų vidurkiams palyginti taikytas parametrinis Stjudento t arba neparametrinis Mano Vitnio kriterijus, o daugiau nei dviejų grupių – parametrinė ir neparametrinė dispersinė analizė (ANOVA ir Kruskalio Voliso kriterijus). Visų parametrinių kriterijų rezultatai aprašyti pateikiant kiekybinio požymio reikšmių V ir SN lyginamosiose tyrimo imtyse. Visų neparametrinių kriterijų taikymo rezultatai aprašyti pateikiant kiekybinio požymio reikšmių medianą (min – max reikšmes) lyginamosiose tyrimo imtyse.
Kokybinių kintamųjų tarpusavio priklausomumas vertintas chi-kvadrato (χ 2 ) kriterijumi. Priklausomai nuo imčių dydžio buvo taikytas tikslus (Monte-Carlo) ir asimptominis χ 2 kriterijus.
Nustatant sąsajas tarp kategorinių požymių, apskaičiuotas šansų santykis (ŠS) ir jo 95 proc. pasikliautinasis intervalas (PI). Prognozavimui taikyta binarinė logistinė regresinė analizė.
Spirmeno koreliacinę analizę taikėme sąsajai tarp arklių amžiaus ir Strongyles kiaušinėlių skaičiaus prieš dehelmintizaciją (KSG 0 d.) įvertinti.
25
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Užsikrėtimo nematodais lygis
Nustatyta, kad visoje imtyje (n=97) Strongyles kiaušinėlių skaičiaus mediana prieš dehelmintizaciją (KSG 0 d.) buvo 740,0 (260–2420).
KSG 0 d. mediana PYR poveikio grupėje buvo 800,0 (280–2420), FBZ poveikio grupėje – 730,0 (260–2240), kontrolinėje grupėje 740,0 (260–1420). Remdamiesi neparametriniu Kruskalio Voliso testu nustatėme, kad KSG 0 d., atsižvelgiant į grupes, reikšmingai nesiskyrė (χ2=1,723, lls=2, p=0,423).
Žemas užsikrėtimo nematodais lygis (KSG < 200) prieš gydymą nebuvo nustatytas nė vienam arkliui. Vidutinis užsikrėtimo nematodais lygis (KSG 200–500) nustatytas 23 (23,7 proc.), o aukštas (KSG > 500) – 74 (76,3 proc.) arkliams (p < 0,001) (1 pav.).
Prieš dehelmintizaciją vidutinio ir aukšto užsikrėtimo lygio pasiskirstymas, atsižvelgiant į grupes, reikšmingai nesiskyrė (χ2=2,667, lls=2, p=0,264). Aukštas užsikrėtimo nematodais lygis nustatytas 26 (86,7 proc.) PYR poveikio, 21 (70,0 proc.) FBZ poveikio ir 27 (73,0 proc.) kontrolinės grupių arkliams (2 pav.).
23 (23,7%) 74 (76,3%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Vidutinis (KSG 200–500) Aukštas (KSG >500) A tv ej ų ska ič ius n ( pr o c. ) Užsikrėtimo lygis (KSG 0 d.)
26
3.2. Arklių užsikrėtimo nematodais sąsajos su amžiumi, lytimi bei veisle
Nustatyta, kad jaunų arklių (≤ 5 metų amžiaus) KSG 0 d. mediana buvo 880,0 (260–2420), suaugusių arklių (> 5 metų amžiaus) – 620,0 (260–1020) (p < 0,001). Jaunų arklių KSG 0 d. mediana buvo 41,9% didesnė nei suaugusių arklių.
Aukštas užsikrėtimo nematodais lygis (KSG > 500) nustatytas 44 (89,8 proc.) jauniems (≤ 5 metų amžiaus) arkliams ir 30 (62,5 proc.) suaugusių (> 5 metų amžiaus) arklių. Jaunų arklių, kuriems nustatytas aukštas užsikrėtimo nematodais lygis, buvo reikšmingai daugiau nei suaugusiųjų (p=0,002). Užsikrėtimo nematodais lygis, atsižvelgiant į amžiaus grupes, pateiktas 3 pav.
4 (13,3%) 9 (30%) 10 (27%) 26 (86,7%) 21 (70%) 27 (73%) 0 5 10 15 20 25 30
PYR poveikio gr. FBZ poveikio gr. Kontrolinė gr.
A tv ej ų ska ič ius n ( pr oc .) Grupės Vidutinis (KSG 200–500) Aukštas (KSG >500) 5 (10,2%) 18 (37,5%) 44 (89,8%) 30 (62,5%) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A tv ej ų sk ai či us n (pr oc .) Amžiaus grupė Vidutinis (KSG 200–500) Aukštas (KSG >500)
Jauni arkliai (≤ 5 m.) Suaugę arkliai (> 5 m.)
2 pav. Užsikrėtimo nematodais lygis atsižvelgiant į poveikio grupes (p>0,05)
27 Remdamiesi binarine logistine regresine analize, galime prognozuoti, kad aukšto užsikrėtimo nematodais lygio galimybių santykis jauniems (≤5 metų amžiaus) arkliams yra didesnis 5,3 (ŠS 5,28; 95 proc. PI 1,768-15,769; p=0,003) negu suaugusiems (>5 metų amžiaus) arkliams.
Remdamiesi neparametrine Spirmeno koreliacine analize, gavome, kad arklių amžius, atvirkščiai, reikšmingai koreliavo su KSG 0 d. (r = -0,6, p<0,001, r – koreliacijos koeficientas) (4 pav.).
Paveikslėlyje matome, kad, didėjant arklio amžiui, Strongyles kiaušinėlių skaičius 1 g. išmatų mažėja.
Nustatyta, kad KSG 0 d. mediana patinų grupėje buvo 760,0 (260–2020), patelių – 740,0 (260–2420). Remdamiesi neparametriniu Mano Vitnio testu dviem nepriklausomoms imtims, gavome, kad Strongyles kiaušinėlių skaičius 1 g išmatų prieš dehelmintizaciją (KSG 0 d.), atsižvelgiant į arklių lytį, nesiskyrė (p=0,931).
Aukštas užsikrėtimo nematodais lygis (KSG > 500) nustatytas 41 (82,0 proc.) patinui ir 33 (70,2 proc.) patelėms, vidutinis (KSG 200–500) – atitinkamai 9 (18,0 proc.) ir 14 (29,8 proc.). Užsikrėtimo nematodais lygis prieš dehelmintizaciją, atsižvelgiant į arklių lytį, nesiskyrė (p = 0,173). Atsižvelgiant į arklio veislę, Strongyles kiaušinėlių skaičius prieš dehelmintizaciją (KSG 0 d.) reikšmingai nesiskyrė (χ2=18,993, lls=15, p=0,205; remiantis chi-kvadrato Monte Karlo kriterijumi).
4 pav. Strongyles kiaušinėlių skaičiaus prieš dehelmintizaciją KSG (0 d.) koreliacija su arklių amžiumi (r = -0,6, p < 0,001)
28
3.3. Antihelmintinių preparatų veikliųjų medžiagų efektyvumo tyrimai
Visoje imtyje po dehelmintizacijos 52 (53,6 proc.) arklių išmatose buvo aptikta strongilų kiaušinėlių (KSG 14 d. > 0): PYR poveikio – 1 (3,3 proc.), FBZ poveikio – 14 (46,7 proc.), kontrolinėje – 37 (100 proc.) arkliams.
Nustatyta, kad strongilų kiaušinėlių skaičiaus visoje imtyje (n=97) mediana po dehelmintizacijos (KSG 14 d.) buvo 80,0 (0–1620).
Remdamiesi neparametriniu Kruskalio Voliso testu, gavome, kad KSG 14 d., atsižvelgiant į grupes, reikšmingai skyrėsi (χ2 = 76,193, lls = 2, p < 0,001): KSG 14 d. mediana PYR poveikio grupėje buvo 0 (0–40; vidurkis 1,33), FBZ poveikio grupėje – 0 (0–480; vidurkis 98,00), kontrolinėje grupėje – 880,0 (120–1620; vidurkis 824,86). Visi daugkartiniai palyginimai (PYR vs. kontrolinė; FBZ vs. kontrolinė; PYR vs. FBZ), remiantis Mano Vitnio testu, buvo reikšmingi (p<0,001) (5 pav.).
Apskaičiuotas helmintų kiaušinėlių skaičiaus sumažėjimas (HKSS) visoje imtyje, neatsižvelgiant į grupes, buvo 52,24 ± 56,64 procentų.
Remdamiesi parametrine dispersine analize ANOVA nustatėme, kad HKSS, atsižvelgiant į grupes, skyrėsi reikšmingai (F=515,234, lls=2, p<0,001): PYR poveikio grupėje buvo 99,89 ± 0,59
5 pav. Strongyles kiaušinėlių skaičiaus 1 g išmatų (KSG 14 d.) po dehelmintizacijos stačiakampė diagrama, atsižvelgiant į grupes (minimali reikšmė, pirmasis kvartilis, mediana, trečiasis kvartilis, maksimali reikšmė, reikšmė, nutolusi mažiau kaip ½ tarpkvartilinio skirtumo nuo trečiojo kvartilio, ir reikšmė,
nutolusi daugiau kaip ½ tarpkvartilinio skirtumo nuo trečiojo kvartilio; abcp<0,0012, remiantis neparametriniu Mano Vitnio testu)
29 proc.; FBZ poveikio grupėje – 89,04 ±15,35; kontrolinėje grupėje (-16,23 ± 22,91) procentų. Visi poriniai palyginimai, remiantis daugkartinio palyginimo Bonferoni testu, buvo reikšmingi: PYR vs. kontrolinė (p < 0,001); FBZ vs. kontrolinė (p < 0,001); PYR vs. FBZ (p = 0,038) (6 pav.).
3.3.1. Antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos – pirantelio – efektyvumo ir antihelmintinio rezistentiškumo tyrimas
PYR poveikio grupėje strongilų kiaušinėlių skaičius 1 g išmatų po dehelmintizacijos (KSG 14 d.) buvo reikšmingai mažesnis, palyginti su kontroline grupe (5 pav.).
Apskaičiuotas helmintų kiaušinėlių skaičiaus sumažėjimas (HKSS) PYR poveikio grupėje buvo 99,89 ± 0,59 proc. Antihelmintinio preparato veiklioji medžiaga – pirantelis – buvo labai veiksminga gydant arklių strongilų invaziją (HKSS > 98 proc.).
Atsižvelgdami į apskaičiuotą HKSS, remdamiesi antihelmintinio rezistentiškumo piranteliui vertinimo kriterijais atskiroms antihelmintikų grupėms, arklių nematodų rezistentiškumo nenustatėme (HKSS > 90 proc. – rezistentiškumo įrodymų nėra).
6 pav. Helmintų kiaušinėlių skaičiaus procentinio sumažėjimo (HKSS) pasiskirstymas, atsižvelgiant į grupes
(F=515,234, lls=2, p<0,001, remiantis parametrine dispersine analize ANOVA, F – Fišerio kriterijus; *,**,***p<0,05, remiantis daugkartinio palyginimo Bonferoni testu)
30 3.3.2. Antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos – fenbendazolo – efektyvumo ir
antihelmintinio rezistentiškumo tyrimas
FBZ poveikio grupėje strongilų kiaušinėlių skaičiaus 1 g išmatų po dehelmintizacijos (KSG 14 d.) buvo reikšmingai mažesnis, palyginti su kontroline grupe (5 pav.).
Apskaičiuotas helmintų kiaušinėlių skaičiaus sumažėjimas (HKSS) FBZ poveikio grupėje buvo 89,04 ± 15,35 proc. Antihelmintinio preparato veiklioji medžiaga – fenbendazolas – buvo mažai veiksminga gydant arklių strongilų invaziją (HKSS = 80–89 proc.).
Atsižvelgiant į apskaičiuotą HKSS, remiantis antihelmintinio rezistentiškumo vertinimo kriterijais atskiroms antihelmintikų grupėms, fenbendazolui pasireiškė antihelmintinis rezistentiškumas ( HKSS < 90 proc. – nustatomas rezistentiškumas).
3.4. Antihelmintinių medžiagų – pirantelio ir fenbendazolo – gydymo
efektyvumo palyginimas
PYR poveikio grupėje strongilų kiaušinėlių skaičius 1 g išmatų po dehelmintizacijos (KSG 14 d.) buvo reikšmingai mažesnis, palyginti su FBZ poveikio grupe (χ2 = 76,193, lls = 2, p < 0,001) (5 pav.).
Apskaičiuotas helmintų kiaušinėlių skaičiaus sumažėjimas (HKSS) PYR poveikio, FBZ poveikio ir kontrolinėje grupėse skyrėsi reikšmingai (F = 515,234, lls = 2, p < 0,001) (6 pav.).
PYR poveikio grupėje HKSS taip pat buvo reikšmingai didesnis, palyginti su FBZ poveikio grupe (atitinkamai 99,89 ± 0,59 proc. vs. 89,04 ±15,35; p = 0,001). Remiantis gautais rezultatais, galima daryti išvadą, kad antihelmintinio preparato veiklioji medžiaga – pirantelis – buvo veiksmingesnė gydant arklių strongilų invaziją, palyginti su fenbendazolu.
Po dehelmintizacijos PYR ir FBZ poveikio grupėse kartu sudėjus 15/60 (25 proc.) dehelmintizuotų arklių išmatose dar buvo aptikta strongilų kiaušinėlių (KSG 14 d. > 0): PYR poveikio grupėje 1/30 (3,3 proc.) arkliui, FBZ poveikio – 14/30 (46,7 proc.) arklių. PYR poveikio grupėje po dehelmintizacijos arklių išmatose strongilų kiaušinėliai buvo aptikti reikšmingai rečiau, palyginti su FBZ poveikio grupe (atitinkamai 3,3 proc. vs 46,7 proc.; p < 0,001). Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, kad antihelmintinis rezistentiškumas FBZ poveikio grupėje buvo dažnesnis, palyginti su PYR poveikio grupe (7 pav.).
31 7 pav. Strongyles kiaušinėlių skaičiaus po dehelmintizacijos KSG 14 d. palyginimas PYR ir
FBZ poveikio grupėse 29 (96,7%) 16 (53,3%) 1 (3,3%) 14 (46,7%) 0 5 10 15 20 25 30 35 A tv ej ų ska ič ius n (pr oc .) Grupė KSG = 0 KSG > 0
32
REZULTATŲ APTARIMAS
Šiuo metu pasaulyje besivystantis arklių virškinamojo trakto parazitų (Strongyles) rezistentiškumas labiausiai paplitusiems antihelmintiniams preparatams yra vienas iš aktualiausių uždavinių, kurį bando išspręsti veterinarai (2). Manoma, jog tai išsivystė dėl neatsakingo antihelmintikų naudojimo, todėl veterinarijos gydytojai atlieka tyrimus žirgynuose ir nuolat stengiasi informuoti arklių augintojus apie nesistemiško šių medžiagų naudojimo riziką ir ilgainiui sukeliamą žalą (9). Ne išimtis ir Lietuvos žirgynai – čia antihelmintinis rezistentiškumas vystosi dėl atsakingumo stokos keičiant antihelmintines medžiagas ir dėl dehelmintizacijos dukart per metus (14).
Naudodami McMaster metodą, ištyrėme arklių išmatų mėginius ir statistiškai išanalizavome strongilų kiaušinėlių kiekio sąsajas su amžiumi, lytimi bei veisle – buvo įtarta, jog šie rodikliai gali daryti įtaką arklių užsikrėtimui virškinamojo trakto nematodais bei jo lygiui. Tačiau labiausiai buvo koncentruotasi į aktualiausią šio darbo tikslą – ištirtas abiejų antihelmintinių medžiagų – pirantelio ir fenbendazolo – efektyvumas ir antihelmintinis rezistentiškumas šiems preparatams.
Visų (n=97) arklių išmatų mėginių tyrimai parodė, jog 100 proc. arklių buvo užsikrėtę virškinamojo trakto nematodais. Ispanijoje atliktame tyrime 206 iš 207 (99,5 proc.) arklių buvo užsikrėtę strongilais (44). Prancūzijoje atliktame tyrime nustatyta, kad strongilų paplitimas skirtingose fermose svyravo nuo 9 iki 83 proc. (45). Atlikę šių rezultatų analizę, išsiaiškinome, jog visų arklių išskiriamas KSG buvo aukštesnis nei 200. Tai parodo, kad visi tirti arkliai turėjo vidutinį (KSG 200 – 500) arba aukštą (KSG > 500) užsikrėtimo nematodais lygį, o žemo užsikrėtimo lygio (KSG < 200) neturėjo nė vienas.
Remdamiesi statistine analize, apskaičiavome strongilų invazijos sąsajas su tiriamų arklių amžiumi. Gavome rezultatus, jog jaunų (≤ 5 metų amžiaus) arklių išmatose prieš dehelmintizaciją rastas 41,9 proc. didesnis KSG nei suaugusių (> 5 metų amžiaus) arklių išmatose. Apskaičiavome šansų santykį, kuris parodė, jog jauni arkliai turi 5,3 didesnį šansą aukštam užsikrėtimo lygiui strongilais nei suaugę arkliai. Gavome rezultatus, jog arklių amžius atvirkščiai koreliuoja su KSG 0d. (koreliacijos koeficientas r = -0,6, p < 0,001), ir tai rodo, jog suaugę arkliai turi mažesnį KSG. Arklių amžiaus įtaka buvo reikšminga nematodų kiaušinėlių kiekiui. JAV atlikto tyrimo duomenimis, aukštą užsikrėtimo lygį (KSG > 500) turėjo mažiau nei 30 proc. arklių, kurie buvo vyresni nei 3 m. (7). Tyrimas, atliktas Lenkijoje parodė, jog 63 proc. gausesnis strongilų paplitimas buvo tarp jaunesnių nei 3 metų arklių, o išskiriamas kiaušinėlių skaičius išmatose mažėjo augant amžiui (21). Mūsų gauti rezultatai atitinka literatūroje publikuotus duomenis. Galima teigti, kad jauni arkliai yra imlesni strongilų invazijoms ir kad suaugę arkliai dažniau turi žemesnį KSG.
33 Atlikti strongilų invazijos sąsajų su lytimi tyrimai parodė, jog patelių grupės mediana prieš dehelmintizaciją buvo 740 (260-2420) KSG, o patinų – 760 (260-2020) KSG. Tačiau šie duomenys nebuvo statistiškai reikšmingi (p=0,931). Duomenys, nustatant arklių užsikrėtimo lygio sąsajas su lytimi, taip pat nebuvo reikšmingi (p=0,173). Minėtame tyrime, atliktame Lenkijoje, buvo lygintos KSG sąsajos su lytimi: aptikta, jog nežymiai daugiau strongilų kiaušinėlių išskyrė patelės, tačiau statistiškai duomenys buvo nereikšmingi (p=0,55) (21).
Literatūroje nepavyko rasti duomenų apie užsikrėtimo nematodais sąsajas su arklio veisle. Tą patvirtino ir mūsų tyrimas.
Atliekant antihelmintinių medžiagų – pirantelio ir fenbendazolo – efektyvumo ir antihelmintinio rezistentiškumo tyrimą, pagal KSG 0 d. ir KSG 14 d. buvo apskaičiuotas HKSS. Be to, PYR poveikio grupėje HKSS buvo lygus 99,89 proc., todėl ši antihelmintinė medžiaga, pagal prieš tyrimą pasirinktus antihelmintinio preparato veikliosios medžiagos veiksmingumo vertinimo kriterijus, buvo priskirta prie labai veiksmingų (HKSS > 98 proc.) antihelmintinių preparatų. Pagal Amerikos arklių augintojų asocijacijos rekomendacijas (43), kai HKSS svyruoja tarp 85–90 proc. reikia įtarti antihelmintinį rezistentiškumą piranteliui, o kai HKSS < 85 proc., nustatomas antihelmintinis rezistentiškumas piranteliui. Mūsų tyrimas parodė, kad strongilai buvo jautrūs piranteliui.
Kitose šalyse atliktų tyrimų duomenimis, gydant arklių strongilų invaziją, Prancūzijoje pirantelio efektyvumas siekė 94,7 proc., Ispanijoje – 94–100 proc., Vokietijoje – daugiau nei 90 proc. (44-46). Palyginus mūsų gautus rezultatus su kitų šalių tyrimais, galima teigti, jog pirantelis Aukštaitijos regiono žirgynuose vis dar yra labai veiksmingas preparatas gydant arklių virškinamojo trakto nematodus ir gali būti vartojamas dehelmintizacijai.
Apskaičiuotas HKSS FBZ poveikio grupėje buvo 89,04 proc. todėl jį priskyrėme prie mažai veiksmingų (HKSS = 80–89 proc.) antihelmintinių preparatų. Mūsų gauti rezultatai atitinka A. Vyšniausko ir kt. pateikiamus duomenis, kad 2002 metais Lietuvoje fenbendazolas taip pat buvo mažai veiksmingas gydant arklių nematodus – jo efektyvumas siekė 86 proc. (14). Rumunijoje 2015 metais atliktas tyrimas parodė, jog fenbendazolas buvo neveiksmingas dehelmintizuojant arklius – gautas tik 75,4 proc. efektyvumas (47). Kitose šalyse nustatytas fenbendazolo efektyvumas dar mažesnis: Pietų Anglijoje – 65,8 proc., o Prancūzijoje – tik 57 proc. (45, 48). Minėtose šalyse fenbendazolas yra priskiriamas neveiksmingų antihelmintinių medžiagų grupei. Remiantis rekomendacijomis (43), antihelmintinio rezistentiškumo fenbendazolui slenkstis yra aukštesnis: įtariamas, kai HKSS 90–95 proc., nustatomas, kai HKSS < 90 proc. Mūsų atliktas tyrimas parodė
34 mažą fenbendazolo veiksmingumą ir antihelmintinį rezistentiškumą Aukštaitijos regione, todėl reikėtų susimąstyti apie tolimesnį fenbendazolo vartojimą šio regiono žirgynuose.
Pagal apskaičiuotą HKSS palyginome abiejų tyrime vartotų antihelmintinių medžiagų efektyvumą ir nustatėme, jog pirantelis buvo veiksmingesnis gydant strongilų invaziją nei fenbendazolas (atitinkamai 99,89 proc. vs. 89,04 proc., p = 0,001). Tai atitinka literatūros duomenis. Prancūzijoje atliktas tyrimas parodė net 94,4 proc. antihelmintinį rezistentiškumą fenbendazolui ir 10 proc. piranteliui (45). Ispanijoje atliktame tyrime įtartas 30 proc. atsparumas piranteliui (44). Publikuoti Škotijoje atlikto tyrimo rezultatai rodo 100 proc. arklių nematodų rezistentiškumą fenbendazolui (efektyvumas 45 proc.) (49). Kadangi nėra standartizuotų antihelmintinio rezistentiškumo vertinimo kriterijų, tyrimų rezultatus palyginti sunku. Mūsų gauti rezultatai parodė, kad Aukštaitijoje strongilai yra atsparūs fenbendazolui, jautrūs piranteliui. Tai atitinka literatūros duomenis.
Dehelmintizacija buvo nesėkminga – išmatose po dehelmintizacijos buvo rasta strongilų kiaušinėlių – PYR poveikio grupėje tik 1/30 (3,3 proc.) arkliui, o FBZ poveikio grupėje – 14/30 (46,7 proc.) šios grupės arklių. Apie antihelmintinį rezistentiškumą iš dalies galima spręsti ir palyginus PYR ir FBZ poveikio grupių arklių skaičių, kuriems dehelmintizacija buvo nesėkminga (KSG 14 d. > 0) (atitinkamai 3,3 proc. ir 46,7 proc. p < 0,001). Didesnį nesėkmingos dehelmintizacijos atvejų skaičių FBZ poveikio grupėje galimai lėmė strongilų antihelmintinis rezistentiškumas.
Nenustatyta, ar atlikto tyrimo rezultatams įtakos neturėjo skirtingi antihelmintiko vartojimo būdai: pirantelio preparatas buvo suduodamas švirkščiant pastą ant liežuvio ir palaukiant, kol arklys nuris preparatą, o fenbendazolo preparato granulės buvo sumaišomos su arklio pašaru. Siekiant atsakyti į šį klausimą, ateityje reikia atlikti papildomų tyrimų.
Kontrolinėje grupėje KSG padidėjo 16,23 proc. Šioje grupėje tyrimo metu nebuvo taikomi jokie antihelmintiniai preparatai. Šį rezultatą galima interpretuoti kaip invazijos augimo žirgynuose rodiklį 14 d. intervale.
