LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARINĖS MEDICINOS STUDIJŲ PROGRAMA ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDRA
Erika Foktaitė 6 kursas 2 grupė
PARŠAVEDŽIŲ 4 METŲ AMŽIAUS KIAUŠIDŽIŲ FOLIKULŲ ĮVAIRIŲ STADIJŲ PALYGINIMAS IR CHARAKTERISTIKA
SOWS 4 YEARS AGE OVARIAN VARIOUS STAGES FOLLICLES COMPARISON AND CHARACTERISTIC
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. Dr. V. Lasys KAUNAS, 2014
2
DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Paršavedžių 4 metų amžiaus kiaušidžių folikulų įvairių stadijų palyginimas ir charakteristika"
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3
TURINYS
ĮVADAS ... 5
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 6
1.1 Kiaulių lytinis ciklas ... 6
1.2 Kiaušidė ... 7
1.3 Kiaušidės žiėvė ... 8
1.4 Kiaušidės šerdis ... 9
1.5 Ovogenezė ... 9
1.6 Paršavedžių kiaušidžių folikulai ... 10
1.6.1 Užuomazginiai folikulai ... 11
1.6.2 Pirminiai kiaušidžių folikulai ... 12
1.6.3 Antriniai kiaušidžių folikulai ... 13
1.6.4 Tretiniai kiaušidžių folikulai... 14
2.DARBO METODIKA ... 16
2.1 Mėginių ėmimas ... 16
2.2 Mėginių fiksavimas ... 16
2.3 Tirpalai mėginiams fiksuoti ... 17
2.4 Mėginių paruošimas pjaustymui ... 17
2.5 Parafininių pjūvių technika ... 18
2.5.1 Dehidratavimas ... 18
2.5.2 Skaidrinimas ... 18
2.5.3 Impregnavimas ... 18
2.5.4Parafininių blokų formavimas ... 19
4
2.7 Objektinių stiklelių paruošimas ... 20
2.8 Mėginių dažymas ... 20
2.9 Dažytų pjūvių dengimas ... 21
2.10 Histologinių mėginių tyrimas ... 21
3. TYRIMO REZULTATAI ... 22
3.1 Paršavedžių 4 m. amžiaus kiaušidžių užuomazginių folikulų morfometrinė charakteristika ... 22
3.2 Paršavedžių 4 m. amžiaus kiaušidžių pirminių folikulų morfometrinė charakteristika ... 27
3.3 Paršavedžių 4 m. amžiaus kiaušidžių antrinių folikulų morfometrinė charakteristika ... 32
4. TYRIMŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 38
5. IŠVADOS ... 40
6. SANTRAUKA ... 41
7. SUMMARY ... 42
5
ĮVADAS
Lietuvoje kiaulių auginimas užima didelę reikšmią. Naudojamos kiaulių veislės kaip landrasai, diurokai, jorkšyrai, hempšyrai. Kiekvienas augintojas suinteresuotas, kad paršavedė atvestų kuo daugiau paršelių gyvų, juos visus užaugintų gyvus, po atjunkymo jie gerai augtų. Todėl yra labai svarbu kiekvienos rūšies reprodukcinės savybės, kurias pagerinti trunka ilgai, joms labai didelę įtaką turi laikymo sąlygos, šėrimas, priežiūra. Pagrindinėms reprodukcinėms savybėmsdidelės įtakos turi kiaušidė.
C. J. Bracken tyrė kiaušidžių folikulų diametrus veikiant juos arklių ir žmonių gonadotropinais. Nustatyta, kad po atjunkymo 7 dienos skyrus mišinį arklių ir žmonių gonadotropinų padidina kiaušidžių folikulų augimą ir paršavedėms po gydymo praėjus vienai savaitei pasireiškia ruja (C.J. Brachen ir kt. 2005). Tokie tyrimai padeda pagerenti kiaulių reprodukciją. Mano atlikto tyrimogauti rezultatai tai pat bus naudingi tolesniems paršavedžių reprodukciniams tyrimams atlikinėti.
Tyrimams atlikti buvo paimti 6 Norvegų landrasų paršavedžių kiaušidžių, svoris 170–180 kg.Kergimui atrenkamos 7 – 8 mėnesių kiaulaitės.Dažniausiai yra laikomos 3 – 5 vadas ir išbrokuojamos. Jeigu neina sukergti bent du kartus iš eilės paršavedė yra brokuojama. Brokuotos paršavedės buvo po 4 paršelių vadų kovo 22 d.
Darbo tikslas:
Ištirti 4 metų amžiaus paršavedžių kiaušidžių įvairių stadijų folikulų morfometrinius duomenis Darbo uždaviniai:
1. Ištirti paršavedžių kiaušidžių užuomazginius folikulus ir juose esančius pirminius ovocitus. 2. Ištirti paršavedžių kiaušidžių pirminius folikulų ir juose esančius pirminius ovocitus. 3. Ištirti paršavedžių kiaušidžių antrinius folikulus ir juose esančius pirminius ovocitus.
6
1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1 Kiaulių lytinis ciklas
Dauguma procesų organizme vyksta cikliškai t. y. kartojasi. Cikliškumas būdingas ir vienai svarbiausių organizmo funkcijų – dauginimosi funkcijai.Dauginimosi instinktui sutelktas visas organizmas, bet didžiausi organizmo pokyčiai siejasi su pokyčiais kiaušidėse (Vytuolis Žilaitis ir kt. 2006).
Hormonų poveikyje kiaulių organizme pasireiškia morfologinių ir fiziologinių pokyčių kompleksas, vadinamas lytiniu ciklu. Kiaulių lytinį ciklą reguliuojantys hormonai yra: Gn–RH (gonagotropinis rilyzing hormonas), FSH (folikulus stimuliuojantis hormonas), LH (liuteinizuojantis hormonas), estrogenai (17 β – estradiolis) ir inhibinas (A. Šiukščius ir kt. 2007), visi šie hormonai tarpusavyje sąveikauja. Pagumburio neuro tipo ląstelės į kraują išskiria hormoniną GnRh, kuris per pagumburio–hipofizės kraujagyslių sistemą patenka į priekinę hipofizės dalį ir skatina FSH ir LH hormonų išskyrimą. Gn–Rh, FSH ir LH tiesiogiai veikia kiaušides. Šių hormonų koncentracijos padidėjimas kiaulių kraujyje skatina folikulų augimą ir estrogenų išskyrimą. Estrogenus išskiria augantys ir bręstantys folikulai (A. Šiukščius ir kt. 2007).
Ruja yra svarbiausia lytinio ciklo fazė. Jos metu kiaušinėliai visiškai subręsta ir maždaug antroje rujos pusėje prasideda ovuliacija – plyšta Grafo folikulas, kiaušinėliai patenka į kiaušintakius (I. Jančienė, 2005).
1 lentelė. Paršavedžių lytiniai duomenys (E.S.E. Hafez ir kt. 2008; Vytuolis Žilaitis ir kt. 2006). Gyvulio Rūšis Lytinės brandos laikas Optimalus laikas pirmajam sėklinimui Lytinio ciklo trukmė Rujos trukmė Ovuliacijos laikas Kiaulė 5 – 8 mėn. 8 – 9 mėn. 18–24 paros (21 para) 1–4 paros(2–3 paros) 40–70 val. 30–40 val. nuo rujos pradžios
Kiaulių ruja tęsiasi trimis etapais: priešrujis (proestrus), tikroji ruja (estrus), porujis (diestrus) (A. Šiukščius ir kt. 2007).
7
Laikotarpis nuo paršelių atjunkymo iki rujos požymių pasireiškimo dar vadinamas servis periodu. A. Lemanas (A. Leman) nustatė, kad optimalus kiaulių apvaisinimo laikotarpis yra 3–5 dienos po paršelių atjunkymo. Tačiau atjunkymo–rujos laikotarpio (ARL) trukmę lemia daugiau veiksnių.
Laktacijos laikotarpiu paršavedės būna fiziologinės anoestrus būklės. Jos mechanizmas nėra visiškai išaiškintas. Tačiau laktacijos trukmės įtaką ARL tyrinėjo ne vienas mokslininkas ir nustatė, kad laktacija, kuri tęsiasi trumpiau negu 22 dienas, pailgina ARL, o ilgo laktacijos periodo (4–5 savaičių) įtaka ARL trukmei nebuvo nustatyta (B. Karvelienė, 2010).
Dažnai užsitęsęs ARL yra siejamas su anoestrus būkle, kurios metu kiaušidėse nevyksta jokie fiziologiniai pokyčiai: neauga folikulai, nebręsta kiaušialąstės, nevyksta ovuliacija ir nesusidaro nauji geltonieji kūnai. Tai rodo, kad patelės organizme sutriko lytinių hormonų sintezė ir išskyrimas (B. Karvelienė, 2010).
B. Karvelienė mano, kad pagrindinės lytinių organų neišsivystymo priežastys, anoestrus būklė ir kitos reprodukcijos problemos yra santykinio hormonų kiekio kitimo, sutrikus normaliam jų išsiskyrimui ar tarpusavio ryšiui bei reguliacijai, pasekmė.
D. Vylo (D. Wiel) ir P. Būmano (P. Booman) atlikti tyrimai parodė, kad sumažėjusi LH sekrecija gali būti viena iš priežasčių, lemiančių kiaulių anoestrusbūklę po paršelių atjunkymo. Kiaulių LH koncentracija kinta ciklo eigoje, o esanti žema anoestrinių kiaulių LH koncentracija nesikeičia. Sveikų paršavedžių žindymo–laktacijos metu buvusi žema LH koncentracija po paršelių atjunkymo smarkiai padidėja, o jai nesikeičiant, kiaulei pasireiškia anoestrus būklė (B. Karvelienė, 2010).
1.2 Kiaušidė – Lot. Ovarium
Kiaušidės yra porinis organas (I. Jančienė, 2005), jos vidinėje sandaroje skiriamos dvi zonos: periferinė folikulų zona ir centrinė kraujagyslių zona (A. Pabijanskas, 1967). Kiaušidėje dar yra skiriama žievė ir šerdis. Žievė sudaro kiaušidės išorinę dalį, o šerdis – centrinę (A. Padaiga ir kt, 2006).
Kiaušidės paviršių dengia vienasluoksnis kubiškasis epitelis, po kuriuo yra jungiamojo audinio plėvė. Kiaulių kiaušidės ilgis siekia nuo 3 iki 5 cm. Dėl daugelio vienu metu išsivysčiusių folikulų ir geltonųjų kūnų, kiaušidės paviršius nelygus. Kiaulės kiaušidė primena avietės uogą (A. Pabijanskas, 1967).
8
Kiaulių kiaušidžių dydis yra apie 7,3 (+ / - 2,2) cm3 (Gerritse ir kt. 2008), kuri yra labai panaši į žmogaus kiaušidžių dydį 6,5 (+ / - 2,9) cm3 (Munn ir kt. 1986).
Kiaušidė atlieka egzokrininę funkciją – kiaušialąstės arba patelių gametos gamybą, ir endokrininę funkciją – moteriškų lytinių hormonų gamybą. Kiekviena kiaušidė yra padalinta į išorinį parenchiminės zonos žievinędalį ir vidinės kraujagyslių zonos šerdinę dalį (E. A. Fredric ir kt. 2001).
Kiaušidės gaminami moteriškieji lytiniai hormonai yra estrogenas tai pat gamina ir progesterą (endokrininė funkcija) (J. A. Eurell ir kt. 2006).
Kiaušidėje cikliškai formuojasi ovocitai, kiaušidės folikulai, geltonieji kūnai ir sintetiniai hormonai. Čia sintetinami hormonai stimuliuoja ovuliaciją ir gimdos gleivinės pokyčius, susijusius su patelės pasiruošimu nėštumui. Kiaušidės histologinė struktūra priklausomai nuo patelės rūšies, amžiaus ir lytinio ciklo stadijos (A. Padaiga ir kt. 2006).
1. 1 pav. Schematiškai kiaušidė (http://www.pathologyoutlines.com/topic/ovarynontumornormalhistology.html)
1.3 Kiaušidės žievė
Kiaušidės žievė yra plati periferinė zona kurioje yra įvairių vystymosi stadijų folikulų ir geltonkūnių tarp kurių yra jungiamojo audinio stromos (J. A. Eurell ir kt. 2006). Kiaušidės žievės ir
9
šerdies griaučius (stoma ovarii) sudaro intersticinis audinys (puraus kolageninio jungiamojo audinio) (A. Padaiga ir kt. 2006).
Kiaušidę dengia paviršinis epitelis (epithelium superficiale), sudarytas iš mikrogaurelinių kubiškųjų epiteliocitų. Po paviršiniu epiteliu yra iki 100 µm storio, su nedaug kraujagyslių glaudžiojo netaisyklingojo kolageninio jungiamojo audinio balzganasis dangalas (tunica albuginea).
Kiaušidės vartuose šerdies griaučių jungiamasis audinys pereina į kiaušidės raiščio jungiamąjį audinį, o kiaušidės paviršinis epitelis – į šio raiščio paviršinį epitelį.
Kiaušidės žievės (Cortex ovarii) stroma, sudaryta iš puraus kolageninio jungiamojo (intersticinio) audinio, gaubia parenchimos elementus: kiaušidės folikulus, geltonuosius kūnus. Be to, žievės stromoje yra tankus kapiliarų tinklas, kuris maitina ovocitus ir yra svarbus kiaušidės pūsliniam folikului transformuojantis į geltonąjį kūną (A. Padaiga ir kt. 2006).
1.4 Kiaušidės šerdis
Kiaušidės šerdis (medulla ovarii) yra kiaušidės centre (A. Samuelson, 2007). Ji sudaryta iš puraus kolageninio jungiamojo audinio ir neruožuotųjų miocitų viršelių, nusidriekiančių į kiaušidės raištį. Jos griaučių intersticiniame audinyje yra stambių kraujagyslių, limfagyslių ir nervų, įeinančių į kiaušidę pro jos vartus (hilus ovarii). Arterijos susivijusios į spiralę, todėl jos gerai prisitaiko prie kiaušidės apimties pokyčių, kurie vyksta formuojantis kiaušidės folikulams, geltoniesiems kūnams ir ovuliacijos metu (A. Padaiga ir kt. 2006).
1.5 Ovogenezė – Lot. ovogenesis
Ovogenezė vyksta kiaušidėse (I. Jančienė, 2005). Ovogenezė – kiaušinių formavimasis (A.Padaiga ir kt. 2006). Plyšus folikului kiaušinėlis patenka į kiaušintakio piltuvėlį, po to kiaušintakiais į gimdos ragus. Šis procesas vadinamas ovuliacija. Kiaušidžių funkcionavimas (ovogenezė) prasideda nuo kiaulaičių lytinės brandos apie 5–6 mėn. (I. Jančienė, 2005).
Užuomazginės patelių lytinės ląstelės kiaušidėse diferencijuoja į ovogonijas, o ovogenezės metu transformuojasi į subrendusias patelių lytines ląsteles (kiaušinius). Skiriamos dvi ovogenezės stadijos: mitozė ir mejozė. Mitozės stadija – tai vaisiaus vystymasis iki gimimo. Mitozės metu dauginasi užuomazginės lytinės ląstelės – ovogonijos (ovogonium) (A. Padaiga ir kt. 2006).
10
Ovogonijos, nustojusios daugintis mitoziškai, pradeda pirmąjį mejozinį dalijimąsi (I mejozė). Jos diferencijuoja į pirminius ovocitus (ovocytus primarius), kurių branduoliai lieka pirmojo mejozinio dalijimosi vėlyvojoje profazės (diplotenos) fazėje iki ovuliacijos arba iki patelės lytinio ciklo išnykimo. Gimusi patelė, išskyrus mėsėdes ir kumeles, jau turi tam tikrą pirminių ovocitų kiekį visam gyvenimui. Pateliai lytiškai subrendus mejozė tęsiasi. Atrajotojų ir kiaulių ovocitų pirmasis mejozinis dalijimasis baigiasi prieš ovoliaciją, o kiaulių ir kumelių – po ovoliacijos.
Pirmojo mejozinio dalijimosi metu susidaro dvi nevienodo dydžio ląstelės: didesnioji – antrinis ovocitas (ovocytus secundarius) ir mažesnioji – pirminis polocitas (polocytus primarius).
Antrasis mejozinis dalijimasis vyksta po ovoliacijos, ovocitui patekus į kiaušintakį. Jis sustoja metafazėje ir baigiasi tik įvykus apvaisinimui. Pasibaigus mejozei susidaro kiaušinis (ovum) ir trys antriniai polocitai (polocytus secundarius), kadangi pirminis polocitas taip pat dalijasi. Polocitai netrukus žūsta. Antrojo mejozinio dalijimosi metu chromosomų skaičius dukterinėse ląstelėse sumažėje perpus. Chromosomų kiekio sumažėjimas iš diploidinio i haploidinį apsaugo nuo chromosomų rinkinio dvigubėjimo apvaisinimo metu (A. Padaiga ir kt. 2006).
1.6 Paršavedžių kiaušidžių folikulai
Jaunų patelių kiaušidėse yra įvairių formavimosi stadijų kiaušidės folikulų. Jų sumažėja pateliai senstant. Kiekvienas kiaušidės folikulas sudarytas iš pirminio ovocito ir jį gaudančių darinių. Pagal pirminių ovocitų dydį ir juos gaubiančiųjų dangalų išsivystymą, skiriami užuomazginiai, pirminiai, antriniai ir pūsliniai kiaušidės folikulai.
Paršavedžių kiaušidėse visose rujos stadijose yra daug folikulų, kurių skersmuo nuo 1 iki 6 mm (Kähn Wolfgang, 2004).J. H. Killen paršavedžių folikulus suskirsto pagal dydį į mažus (1 – 4 mm), vidutinius (4 – 6 mm) ir didelius (> 6 mm) (J. H. Killen ir kt. 1992)
Buvo atliktas tyrimas C. M. Gee, kurio metu bandyta nustatyti koks folikulų dydis yra gydant paršavedes hormonais. Atrinktos paršavedės buvo suskirtytos į 3 grupes: kontrolės, deksametazonu gydytas ir adenokortikotropinu. visose grupėse po 5 paršavedes. Šio tyrimo metu nustatyta , kad didelė koncentracija gliukokortikoidų gali sutrukdyti grūdėtųjų folikulinių lastelių darbą. Tai parodo tiesioginį hormonų poveikį (C.M. Gee ir kt. 1990).
11
C. J. Bracken tyrė kiaušidžių folikulų diametrus veikiant juos arklių ir žmonių gonadotropinais. Nustatyta, kad po atjunkymo 7 dienos skyrus mišinį arklių ir žmonių gonadotropinų padidina kiaušidžių folikulų augimą ir paršavedėms po gydymo praėjus vienai savaitei pasireiškia ruja (C. J. Brachen ir kt. 2005).
1.6.1 Užuomazginiai kiaušidės folikulai– Lot. folliculus ovaricus primordialis
Pirmiausia susiformuoja užuomazginis folikulas (A. Samuelson, 2007). Jie randami pas mėsėdžius, atrajotojus ir kiaules (Paul W. L. Kwan, 2010). Užuomazginiai folikulai mažiausiai išsivystę, daugiausia jų kiaušidėje yra po tunica albuginea. Kiekvienas iš jų sudarytas iš pirminio ovocito ir apsuptas folikulinių ląstelių. Kaip atsakas į periodišką hormonų stimuliaciją užuomazginiai folikulai vystosi į pirminius folikulus (W. J. Bacha ir kt. 2000). Užuomazginiai folikulai pereina į ramybės būseną, kai susiformuoja embrionas. Po ramybės stadijos užuomazginiai folikulai tampa pirminiais folikulais (Paul W. L. Kwan, 2010).
Vidinės epitelinės ląstelės atsiskiria dalijimosi metu į ląstelių grupes, centrinė ląstelių grupė tampa ovogonija. Ji pirmo mejozės dalijimosi metu tampa pirminiu ovocitu maždaug 20 µm pas daugumą rūšių.Apie pirminį ovocitą išsidėstę vienu sluoksniu folikulinės ląstelės (J. A. Eurell ir kt. 2006) jį dengia pamatinė membrana (A. Padaiga ir kt. 2006). Kartu šie komponentai sudaro maždaug 40 µm skersmenį (J. A. Eurell ir kt. 2006).
Morfologiškai pirminis ovocitas turi didelį, apvalų branduolį 10 µm skersmens ar didesnį, su branduolėliu. Citoplazma sudaryta iš mitochondrijų, grūdėtojo endoplazminio tinklo, Goldžio komplekso (A. Samuelson, 2007).
12
1.2 pav. Paršavedės užuomazginiai folikulai (nuotrauka iš asmeninio archyvo) 1.6.2 Pirminiai kiaušidės folikulai – Lot. folliculus ovaricus primarius
Pirminis folikulas sudarytas iš pirminio ovocito (J. A. Eurell ir kt. 2006), kurie didesni nei užuomazginių folikulų (Paul W. L. Kwan. 2010) ir apsupti sluoksniu kubiškųjų ląstelių (J. A. Eurell ir kt. 2006), jie remiasi į pamatinę membraną, kuri skiria ovocitą nuo stromos (Paul W. L. Kwan. 2010). Pirminiai ovocitai pradeda pirmą mejozinį dalijimasį, bet jis nesibaigia profazėje, kol neįvyksta ovuliacija. Vadinasi pirminio ovocito dalijimasis profazėje lieka sustabdytas iki gyvūno lytinio subrendimo (H. D. Dellmann ir kt. 1998). Pasiekę lytinę brandą pirminiai ovocitai toliau vystosi (A. Samuelson, 2007). Pirminis ovocitas auga didesnis, todėl didėja ir Goldžio aparatų, mitochondrijų, platėje grūdėtasis endoplazminis tinklas, visi išsidėsto tolygiai citoplazmoje. Per šią vystymosi stadiją ovocito dydis padidėja du ir daugiau kartų (A. Samuelson, 2007), nuo 60µm iki 100 µm net 120 µm skesmenį (E. Aughey ir kt. 2001). Šalia esančios folikulinės ląstelės tampa kubo formos, žemos kolonos vis dar sudaro aplinkinį sluoksnį apie ovocitą (A. Samuelson, 2007).
Keletas šimtų, tūkstančių ar milijonų ovocitų gali būti vienoje kiaušidėje. Tačiau dauguma jų regresuoja prieš arba po gimimo ir tik keli šimtai ovuliuoja per visą gyvenimą (J. A. Eurell ir kt. 2006).
Pirminių kiaušidės folikulų kiekis priklauso nuo patelės amžiaus. Jaunų patelių kiaušidėse pirminių folikulų yra daug. Gyvuliui senstant jų skaičius mažėja, nes tik nedaug ovocitų ovuliuoja, dauguma jų žūna įvairiose formavimosi stadijose (A. Padaiga, 2006).
13
1.3pav. Paršavedės pirminis folikulas (iš asmeninio archyvo)
1.6.3 Antriniai kiaušidės folikulai – Lot. folliculus ovaricus secundarius
Pas paršavedes, mėsedžius ir avis gali išsivystyti net keli ovocitai (J. A. Eurell ir kt. 2006). Antrinių kiaušidės folikulų pirminiai ovocitai ir toliau didėja, tuo pat būdu kaip aprašyti prie pirminių folikulų. Pirminis ovocitas yra apsuptos folikulinių epiteliocitų (A. Samuelson, 2007), kurie dauginasi mitozės būdu ir vadinami grūdėtomis ląstelėmis (Paul W. L. Kwan. 2010). Antrinis folikulas tampa susiformavęs, kai susidaro daug sluoksnių folikulinių epiteliocitų ir jis yra vadinamas daugiasluoksniu (multilaminariniu). Folikuliniai epiteliocitai, tiesiogiai gaubiantys pirminį ovocitą, yra stulpiškieji ir apie jį formuoja vieną stulpiškųjų epiteliocitų sluoksnį – spindulinį vainiką (corona radiata) (A. Padaiga, 2006). Šios ląstelės įgyja receptorius FHS, folikulus stimuliuojančiam hormonui, kuris svarbaus folikulų vystymuisi (Paul W. L. Kwan. 2010). Grūdėtosios ląstelės yra šalia stromos, taip sustorina išorinę pamatinę membraną. Vėliau grūdėtosios ląstelės atsiskiria nuo ovocito (A. Samuelson, 2007), 3–5 µm (J. A. Eurell ir kt. 2006) iki 12 µm (A. Padaiga, 2006), glikoproteino sluoksniu vadinamu skaidriąja zona (zona pellucida) (A. Samuelson, 2007).
Skaidrioji zona yra folikulinis skystis (liquor folliculi), vienalytė medžiaga, sudaryta iš glikoproteinų sluoksnio (Paul W. L. Kwan. 2010), kuriuos gamina pirminį ovocitą gaubiantys folikuliniai epiteliocitai (A. Samuelson, 2007). Ovocitą gaubiantys folikuliniai epiteliocitai turi mikrogaurelius, per kurios sąveikauja ovocitas su skaidriąja zona (A. Samuelson, 2007). Trys pagrindiniai skaidriosios zonos baltymai yra nustatyti, jie yra svarbūs apvaisinimui (Paul W. L. Kwan. 2010).
14
Vystantis antriniam folikului aplink jį esančios stromos ląstelės dalijasi ir sudaro aplink folikulą kraujagyslių tinklą (A. Samuelson, 2007).
Antrinis folikulas išskiria estradiolį, moterišką lytinį hormoną, kuris paruošia gimdos gleivinę apvaisintam kiaušinėliui (E. Aughey ir kt. 2001).
1.4 pav. Paršavedės antrinis folikulas. Juoda rodyklė pažymėtas pirminis ovocitas, balta: grūdėtosios ląstelės (nuotrauka iš asmeninio archyvo)
1.6.4 Tretinis kiaušidės folikulas – Lot. folliculus ovaricus tertiarius
Išantrinio kiaušidės folikulo susiformuoja tretinis kiaušidės folikulas, kuriame pagal patelės rūšį yra 150 µm (A. Padaiga, 2006) –300 µm skersmens pirminis ovocitas (A. Samuelson, 2007). Tretinis folikulas gali būti vadinamas pūsliniu ar Grafo folikulu (J. A. Eurell ir kt. 2006).
Kai tretinis folikulas yra subrendęs, jis išsiplečia per kiaušidės žievę ir yra matomas kiaušidės paviršiuje. Folikulo ertmė ir toliau didėja, grūdėtasis sluoksnis pradeda plonėti. Spindulinio vainiko ląstelės sudaro vieną sluoksnį apie ovocitą, kurios bus išstumtos kartu su ovocitu per ovuliaciją. Prieš ovuliaciją grūdėtosios ląstelės tampa labai plonos prie kiaušidės paviršiaus. Ovocitas apsuptas spindulinio vainiko ląstelių yra išstumiamas iš folikulo į kiaušintakį (J. R. Hoffman, 2000).
Šiuose folikuluose pirminiai ovocitai užbaigia pirmajį mejozinį dalijimasį ir tampa antriniais ovocitais. Antrasis mejozinis dalijimasis prasideda tuoj pat po pirmojo, tačiau jis blokuojamas metafazėje ir baigiasi tik įvykus apvaisinimui (A. Padaiga, 2006).
15
1.5 pav. Paršavedės kiaušidės tretinis folikulas. Juoda rodykle pažymėta: grūdėtasis sluoksnis, mėlyna: rodyklė folikulinė ertmė, pilka: ovocitas (nuotrauka iš asmeninio archyvo)
16
2. DARBO METODIKA 2.1 Mėginių ėmimas
Medžiaga tyrimui imama, tik ką sustojus kraujo apykaitai.Nefiksuotų audinių negalima lėtai šaldyti, nes atsiranda ledo kristalai, kurie sukelia histologinių preparatų artefaktus (O. Kublickienė, 1978).
Paimti audinių ar organų mėginiai histopatologiniam tyrimui turi būti nedelsiant fiksuojami.Jie negali būti sušaldomi, nes jiems atsileidus, labai pakinta audinių histologinė struktūra. Siekiant, kad kiaušidžės būtų geriau fiksuotos jos perpjaunamos per pusę.
Mėginiai tyrimui imami atsižvelgiant į organo histologinę sandarą ir juose esančius pokyčius. (P. Mačiulskis ir kt.2007)
2.2 Mėginių fiksavimas
Fiksavimas – cheminių procesų seka, kurios metu audiniai išsaugomi nuo irimo ir parengiami tolesniems paruošimo etapams. (A. Laurinavičienė ir kt. 2007)
Mėginiai gali būti fiksuojami juos sušaldant ar išdžiovinant arba fiksuojančiais skysčiais.
Dauguma fiksuojančių skysčių sukelia baltymų koaguliaciją – koloidinių dalelių sukibimą į stambesnius darinius. Mėginiai fiksuojami siekiant juos išlaikyti tokioje būklėje, kokioje jie buvo organizme iki gyvulio mirties. Fiksavimas suteikia mėginiams cheminį stabilumą, standina audinius, mažina audinių apimtį, stabdo jų autolizę ir puvimą, didina jų imlumą hisloginiams dažams. Fiksuojančiųjų medžiagų pasirinkimas priklauso nuo histologinio tyrimų uždavinių.
Mėginių fiksavimo trukmė yra nevienoda ir priklauso nuo fiksuojančio skysčio sudėties ir temperatūros. Aukštesnėje temperatūroje mėginių fiksacija vyksta greičiau nei žemesnėje temperatūroje. Paprastai mėginiai fiksuojami kambario temperatūroje. Fiksuojant mėginius aukštesnėje temperatūroje intensyvėja autolizė.
Prieš fiksavimą negalima mėginių plauti vandeniu, nes jie gali pabrinki. Jeigu mėginiai padengti krauju arba kitais nešvarumais, indelyje, kuriame jie fiksuojami, reikia pakeisti fiksuojantį skystį. Fiksuojančio skysčio turi būti 15 – 20 kartų didesnis už fiksuojamųjų mėginių tūrį. Į indo dugną,
17
kuriame fiksuojami mėginiai, galima įdėti vatos arba marlės, kad mėginiai neliesto indo dugno ir prie jo nepriliptų. Tas pats fiksuojantis skystis mėginių fiksacijai naudojamas vieną kartą.Perpjovus nepakankamai fiksuotus mėginius, jų viduryje matomas rausvos spalvos audinys. Gerai fiksuotuotų mėginių spalva yra vienoda (P. Mačiulskis ir kt. 2007).
Mėginiai fiksuoti 10% neutraliu formalino tirpalu 7 dienas vienkartiniuose indeliuose.
2.3 Tirpalai mėginiams fiksuoti
Formalinas yra bespalvis, aštraus kvapo, prisotintas vandeninis formaldehido tirpalas, kuriame yra 37 – 40% formaldehido.Fiksavimui naudojamas 10%, 15% ir 20% vandeninis formalino tirpalas.Fiksuojant formalinu mėginiai turi būti laikomi tamsoje, nes šviesoje iškrenta paraformaldehido nuosėdos (P. Mačiulskis ir kt. 2007).
2.4 Mėginių paruošimas pjaustymui
Ruošiant mėginius pjaustymui iš jų pašalinama fiksuojančioji medžiaga, vanduo ir jie pamerkiami į juos standinančias medžiagas. Priklausomai nuo fiksavimo būdo, fiksuojantieji mėginiai plaunami vandenyje arba etilo spirite. (P. Mačiulskis ir kt. 2007)
Mėginiai buvo sudėti į biopsines kasetes ir pamerkus į šaltą, tekantį vandenį plauti 24 val., kad neliktų mėginiuose formalino.
Po plovimo iš mėginių turi būti pašalintas vanduo, todėl jie sudedami į audinių įmirkymo procesorių „Shandon Pathcentre, USA“.
Tam, kad mėginiai nebūtų deformuoti ir nepakistų audinių histologinė sandara, vanduo iš mėginių šalinamas didėjančios koncentracijos etilo spiritu.
Fiksuotieji mėginiai, prieš pradedant juos pjaustyti, sustandinami parafinu. Fiksuotieji mėginiai, kurie pjaustomi šalduomuoju mikrotomu, sušaldomi.
Parafinas yra standi, netirpstanti spirite, šarmuose ir rūgštyse, tirpstanti chloroforme, ksilene, benzole ir eteryje medžiaga. Mėginių standinimui naudojamas parafinas, kurio lydymosi temperatūra yra 50 – 54 oC. Parafinu sustandinti mėginiai gali būti supjaustomi 1 – 2 mikronų storio gabalėliais.
18
Parafinu sustandinti mėginiai šiek tiek susitraukia. Prieš dažymą parafiną reikia pašalinti iš mėginio. (P. Mačiulskis ir kt. 2007)
2.5 Parafininių pjūvių technika
Parafininių pjūvių technika pagal A. Laurinavičienę sudaryta iš kelių etapų:
Mėginys Dehidratavimas Skaidrinimas Impregnavimas Parafino blokas
2.5.1 Dehidratavimas
Parafininių pjūvių technika pradedama audinių dehidratavimu. Dehidratavimas – tai vandens pašalinimas, kuris atliekamas dviejose histotechnologinio proceso grandyse. Pirma, vandenį iš audinių svarbu pašalinti prieš mėginių impregnavimą bevandenėmis terpėmis ir antra – prieš dažytų mikropjūvių dengimą permanentine (ilgalaike) dengiamąja medžiaga (A. Laurinavičienė ir kt. 2007).
Mėginių dehidratavimui naudota 600, 800 ir 960 etilo alkoholyje po 2,3 val. ir izopropanolio alkoholiu po 1,3 val.
2.5.2 Skaidrinimas
Audinių skaidrinimas, kaip ir dehidratavimas, atliekamas dviejuose audinių paruošimo etapuose: parafininės technikos eigoje ruošiant audinius impregnavimui ir pjūvių dažymo metu. Šių procedūrų metu naudojami tirpalai, kurie sąveikauja tiek su dehidratuojančiomis, tiek su audinius impregnuojančiomis medžiagomis. Naudojamų medžiagų aukštas refrakcijos indeksas artimas baltymų indeksui, todėl audiniai, prisotinti šiais tirpalais, tampa skaidrūs, dažnai peršviečiami. Dėl šių savybių šis audinių apdorojimo etapas vadinamas "audinių skaidrinimu" (A. Laurinavičienė ir kt. 2007).
Savo mėginius skaidrinau chloroforme po 1,3 val. 2.5.3 Impregnavimas
Po dehidratavimo ir skaidrinimo audiniai impregnuojami tvirtinamosiomis–standinamosiomis medžiagomis. Gerai impregnuoti audinių mėginiai (blokai), net ir pjaustant juos plonais pjūviais, išlaiko audinių būdingą ląstelių ir tarpląstelinių struktūrų padėtį. Dažniausiai praktikiniame darbe pasirenkami parafino vaškai, kurių lydimosi temperatūra yra nuo +55 0C iki +58 0C. Formuojant audinių blokus, kai impregnuoti audiniai formelėse užpilami–užliejami karštu parafinu, taip pat svarbu,
19
kokia impregnuojamosiosnmedžiagos temperatūra naudojama. Perkaitintas parafinas audinių struktūrai nepakenks, bet stipriai nulems mėginių pjaustymo kokybę (A. Laurinavičienė ir kt. 2007).
2.5.4 Parafininių blokų formavimas
Parafininės technikos baigiamasis etapas – impregnuotų mėginių tvirtinimas parafino bloke (blokavimas). Šiuo metu naudojami parafino blokų formavimo centrai, sudaryti iš trijų modulių: šaldymo plokštės, parafino dozatoriaus ir šiltos talpos impregnuotiems mėginiaims bei blokavimo formelėms laikyti.
Svarbiausias momentas, formuojant parafino blokus, tinkamas mėginių orientavimas – mėginio išdėstymas parafino bloke. (A. Laurinavičienė ir kt. 2007)
Mėginiai buvo įliejami į parafininius blokus naudojant audinių įliejimo įranga "Tes 99".
2.1 pav. Kiaušidė parafine, paruošta pjaustymui (nuotrauka iš asmeninio archyvo) 2.6 Mėginių pjaustymas
Mėginiai pjaustomi mikrotomais. Mikrotomas yra mechaninis prietaisas, kuris naudojamas atpjauti plonus audinių gabaliukus mikroskopijai. Mėginiai pjaustomi plieniniais peiliais. Sustandinti parafinu mėginiai pjaustomi roginiu ir rotaciniu mikrotomais.
Šiais mikrotomais audinius galima supjaustyti 2 – 25 mikrometrų storio gabaliukais (P. Mačiulskis ir kt. 2007).
20
Pjaustymui naudotas „Sakura Accu-Cut® SRM ™, Japonija“ pusiau automatinis rotacinis mikrotomas. Atpjautas pjūvis dedamas adatėlėmis į 37 0C temperatūros termostatinę vandens vonelę, ten pjūviai ištiesinami ir atskiriami.Pasirinktas pjūvis dedamas ant objektinio stiklelio.tokie objektiniai stikleliai perkeliami 5 val. ant kaitinimo plokštės „Thermo Scientific Hotplate“, kurios temp. 37 0C. Vėliau objektiniai stikleliai sudedami į „Binder“termostatą 24 val. 37 0C.
2.7 Objektinių stiklelių paruošimas
Mikroskopijai mėginiai uždedami ant objektinio stiklelio.Objektiniai stikleliai gali būti valomi 96% etilo spirito ir eterio mišiniu. Jie apdorojami kiaušinio baltymo, Elmer klijais ar kalio chromo alūno ir želatinos tirpalu, kad ant jų laikytųsi audinių gabalėliai.
2.8 Mėginių dažymas
Pjūvio deparafinavimas ksilenu - 13 min., jo metu yra pašalinamas parafinas iš pjūvio;
Pjūvio dehidravimas izopropanolio alkoholiu - 2 min., 96° etilo alkoholiu - 4 min. Prieš dažymą skalaujama vandeniu, kuris pašalina alkoholį;
Pjūvio dažymas hematoksilinu - 10 min., merkiamas į vandenį - 5 min., etilo alkoholis 96°- 2 min., vanduo - 5 min., eozino dažai - 5 min., vanduo - 1 min.;
Pjūvių dehidratavimas 96° etilo alkoholiu - 1 min., izopropolio alkoholiu - 1 min.; Pjūvių skaidrinimui naudojamas ksilenas - 1 min.
Mėginiai yra dažomi siekiant išryškinti arba išskirti audinių komponentus, ląstelių organoidus bei kitas sudėtines dalis. Histologiniai dažai pagal chemines savybes yra skirstomi į tris pagrindines dalis: bazinius (dažančius branduolius), rūgštinius (dažančius citoplazmą) ir neultralius. Mėginiai histologiniam tyrimui pirmiausia dažomi baziniais dažais.
Baziniais dažais nusidažančios histologinės struktūros, dažniausiai ląstelių branduoliai, vadinamos bazofilinėmis.
Histologiniam tyrimui naudojamas hematoksilinas, kuris nudažo branduolius mėlyna spalva. Eozinas, rūgštus fuksinas ir pikrinino rūgštis yra dažniausiai naudojami rūgštiniai dažai. Iš dviejų pastarųjų gaminamas dažų mišinys, vadinamas pikrofuksinu arba van Gizono mišiniu. Eozinas audinius nudažo raudona spalva.
21
Pikrofuksinas jungiamąjį audinį nudažo ryškiai raudona spalva, o skersaruožius ir lygiuosius raumenis – geltona spalva. Nudažyti pikrofuksinu audiniai greitai išblunka (išnyksta raudona fuksino spalva), todėl visi audiniai pasidaro vienodos gelsvos spalvos.
Neultralūs dažai yra įvairių rūgščių ir bazinių dažų junginiai.Nudažyti mėginiai skaidrinami ksilenu.
Mėginiai dažomi naudojant automatinį histologinių pjūvių džymo įrenginį „Sakura Tissue-Tek® DRS ™, Japonija“.
2. 9 Dažytų pjūvių dengimas
Dengiamieji stikleliai prie pjūvio tvirtinami naudojant dengiamają medžiagą, kuri gali būti tirpi vandenyje arba organiniuose tirpikliuose (natūralios arba sintetinės dervos).
Savo mėginiams naudojau „Thermo Shandon Consul-Mount histology formulatio“.
2.10 Histologinių mėginių tyrimas
Histologiniai preparatai mikroskopuoti mikroskopu OLYMPUS CX31, fotografavimui naudotas fotoaparatas OLYMPUS N547.
Folikulai tirti naudojant UTHSCSA Image Tool 1. 28 Version kompiuterinę programą. Folikulai yra skirstomi į tris rūšis: užuomazginius, pirminius ir antrinius.
Tyrimui atrinktos 6 paršavedžių kiaušidės. Iš kiekvienos kiaušidės išmatuota po 5 užuomazginius, pirminius ir antrinius:
folikulų diametrus, plotą ovocitų diametrus, plotą
ovocitų branduolio diametrus, plotą
3 folikulinės ląstelės (iš kiekvieno folikulo) pamatinės membranos storis
22
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1 Paršavedžių 4 metų amžiaus kiaušidžių užuomazginių folikulų morfometrinė charakteristika Ištyrus 4 metų amžiaus 6 paršavedžių užuomazginius folikulus nustatyta, kad jų folikulų diametras nežymiai skiriasi (P≥0,05). Paršavedės Nr. 5 užuomazginių folikulų diametras yra didžiausias (41,89±1,32 μm). Paršavedžių užuomazginiai folikulai Nr. 2 (41,56±0,53μm),Nr. 3(41,48±0,46μm), Nr. 1 (41,22±0,09 μm) ir Nr. 6 (41,38±0,42 μm) yra panašaus diametro. Mažiausias užuomazginio folikulo diametras yra paršavedės Nr. 4 (40,56 ±1,32 μm) (3.1 pav.).
3.1 pav. 4 metų amžiaus paršavedžių užuomazginių kiaušidžių folikulų diametrai, µm
Šių paršavedžių kiaušidžių užuomazginių folikulų plotas pas visas paršavedės buvo panašus (P≥0,05), jis didžiausias buvo pas paršavedę Nr. 5 (1156,93±19,1 μm²). Mažesnius užuomazginių folikulų plotus turėjo paršavedės Nr. 2 (1156,66±27,2 μm²), Nr. 3 (1154,74±32,5 μm²) ir Nr 1 (1156,13 ±32,3 μm²). Mažiausias folikulų plotas kaip ir folikulų diametras pas paršavedę Nr. 4 (1152,47±39,8 μm²) (3.2 pav.). 35 36 37 38 39 40 41 42 41,22 41,56 41,48 40,56 41,89 41,38 μ m
3.1 pav. Užuomazginių folikulų diametrai, μm
Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6
23
3.2 pav. 4 metų amžiaus paršavedžių užuomazginių kiaušidžių folikulų plotai, µm²
Tai pat išmatuoti buvo užuomazginių paršavedžių folikulų pirminių ovocitų diametrai. Nustatyta, kad jų diametrai tarpusavyje nežymiai skyrėsi (P≤0,05). Didžiausias pirminio ovocito diametras pas paršavedę Nr. 5 (35,23 ±0,8 μm). Mažesni pirminiai ovocitai pas paršavedes Nr. 1 (33,17 ±4,8 μm), Nr. 3 (34,04 ±1,6 μm), Nr. 4 (34,58 ±0,7 μm) ir Nr. 6 (34,83 ±1,4 μm). Mažiausias pirminis ovocitas pas paršavedę Nr. 2 (37,72 ±3,2 μm) (3.3 pav.). 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1156,13 1156,66 1154,74 1152,47 1156,93 1154,8 μ m ²
3.2 pav. Užuomazginių folikulų plotai, μm²
Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 33,17 31,72 34,04 34,58 35,23 34,83 μ m
3.3 pav. Užuomazginių folikulų pirminių ovocitų diametrai, μm Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6
24
3.3 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių užuomazginių kiaušidžių folikulų pirminių ovocitų diametrai, µm
Ištyrus užuomazginių folikulų pirminių ovocitų plotą naustatyta, kad jie tarpusavyje žymiai nesiskyrė (P≤0,05). Didžiausias užuomazginių folikulų plotas buvo pas paršavedę Nr. 5 – 975,10 ±45,3μm². Pas paršavedes Nr. 1 buvo 901,76 ±71,7 μm², Nr. 3 – 911,34 ±84,4 μm², Nr. 4 – 939,09 ±36,5 μm², Nr. 6 – 954,08 ±78,7 μm². Mažiausias pas paršavedę Nr. 2 – 802,73 ±16,5 μm² (3.4 pav.).
3.4 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių užuomazginių kiaušidžių folikulų pirminių ovocitų plotas, µm² Išmatavus paršavedžių kiaušidžių užuomazginių folikulų pirminių ovocitų branduolio diametrą nustatyta, kad jis buvo tarpusavyje panašus (P≥0,05). Didžiausias pirminio ovocito branduolys Nr. 2 – 15,57 ±1,7 μm. Panašūs Nr. 1 –15,49 ±1,1 μm, Nr. 3 –15,51 ±0,8 μm, Nr. 5 – 15,53 ±0,8 μm, Nr. 6 – 15,53 ±0,1 μm. Mažiausias Nr. 4 – 15,43 ±1,9 μm (3.5 pav.). 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 700,00 800,00 900,00 1000,00 901,76 802,73 911,34 939,09 975,10 954,08 μ m ²
3.4 pav. Užuomazginių folikulų pirminių ovocitų plotas, μm²
Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6
25
3.5 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių užuomazginių kiaušidžių folikulų pirminių ovocitų branduolių diametrai, µm
Kaip pirminių ovocitų diametras buvo tarpusavyje panašus visų paršavedžių taip ir pirminių ovocitų branduolio plotas irgi tarpusavyje panašus (P≥0,05). Pas paršavedę Nr. 6 yra didžiausias (204,88 ±17,5 μm²). Mažesni pas Nr. 1 (203,57 ±26,6 μm²), Nr. 2 (204,51 ±2,9 μm²), Nr. 3 (202,22 ±19,5 μm²) ir Nr. 5 (203,80 ±19,2μm²). Mažiausias Nr. 4 (199,55 ±46,5 μm²) (3.6 pav.). 14,00 14,20 14,40 14,60 14,80 15,00 15,20 15,40 15,60 15,80 16,00 15,49 15,57 15,51 15,43 15,53 15,53 μ m
3.5 pav. Užuomazginių folikulų pirminių ovocitų branduolių diametrai, μm Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6 25,00 50,00 75,00 100,00 125,00 150,00 175,00 200,00 225,00 203,57 204,51 202,22 199,55 203,80 204,88 μ m ²
3.6 pav. Užuomazginių folikulų pirminių ovocitų branduolių plotai, μm² Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6
26
3.6 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių užuomazginių kiaušidžių folikulų pirminių ovocitų branduolių plotai, µm²
Paršavedžių kiaušidžių užuomazginių folikulų pirminius ovocitus apsupa folikulinės ląstelės. Vieno užuomazginio folikulo pirminio ovocito tirta 3 folikulinės ląstelės. Jų plotis daug didesnis nei aukštis (P≤0,05). Nr. 5 paršavedės folikulinių ląstelių plotis didžiausias (6,42 ±0,1 μm), o aukštis (4,37 ±0,1 μm) nežymiai skiriasi nuo kitų paršavedžių (P≥0,05). Kitų panašios tarpusavyje išskyrus, mažiausiu folikulinių ląstelių pločiu pasižymėjo paršavedė Nr. 6 – 5,42 ±0,1 μm (3.7 pav.).
3.7 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių užuomazginių kiaušidžių folikulų, folikulinių ląstelių pločiai ir aukščiai, µm
Ištyrus paršavedžių kiaušidžių užuomazginių folikulų pamatinės membranos storį nustatyta, jog didžiausią užuomazginių folikulų pamatinės membranos storį turėjo paršavedė Nr. 2 – 5,04 ±0,4 μm, panašus Nr. 1 – 5,02 ±0,4 μm (P≥0,05). Mažesnės pamatinės membranos buvo Nr. 5 - 4,96 ±0,3 μm, Nr. 4 – 4,93±0,2 μm, o pas Nr. 6 – 4,86 ±0,3 μm. Mažiausia pamatinė membrana paršavedės Nr. 3 – 4,81 ± μm ( 3.8 pav.). 0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 6,01 6,21 6,3 6,32 6,42 5,42 4,41 3,7 4,36 4,32 4,37 3,96 μ m
3.7 pav. Užuomazginių folikulų folikulinės ląstelės, μm
Plotis Aukštis
27
3.8 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių užuomazginių kiaušidžių folikulų pamatinės membranos storiai, µm
3.2 Paršavedžių 4 metų amžiaus kiaušidžių pirminių folikulų morfometrinė charakteristika Išmatuotas paršavedžių 4 metų amžiaus pirminiu folikulų diametras, vienos paršavedės 5 pirminiai folikulai, jų diametras tarpusavyje nežymiai skyrėsi (P≤0,05). Didžiausi pirminiai folikulai buvo Nr. 6 (81,77 ±0,9 μm) ir Nr. 5 (81,29 ±1,8 μm). Mažesni buvo Nr. 1 (78,35 ±2,6 μm), Nr. 2 (76,74 ±2,8 μm) ir Nr. 4 ( 75,49 ±1,4 μm). Mažiausi Nr. 3 (73,89 ±1,6 μm) (3.9 pav.).
3.9 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių kiaušidžių pirminiai folikulų diametrai, µm
4,00 4,50 5,00 5,50 5,02 5,04 4,81 4,93 4,96 4,86 μ m
3.8 pav. Užuomazginių folikulų pamatinės membranos storiai, μm Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 78,35 76,74 73,89 75,49 81,29 81,77 μ m
3.9 pav. Pirminių folikulų diametrai, μm
Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr. 6
28
3.10 paveikslas parodo, kad visų paršavedžių kiaušidžių pirminių folikulų plotas skiriasi (P≤0,05). Mažiausias pirminių folikulų plotas Nr. 2 (3928,76 ±106,5 μm²). Didesni Nr. 3 – 4130,72 ±106,5 μm² ir Nr. 4 – 4304,91 ±110,9 μm². Didžiausi pirminių folikulų plotai Nr. 1 – 4982,06 ±104,2 μm², Nr 5 – 5266,37 ±97,1 μm² ir Nr. 6 – 5432,67 ±86,1 μm² (3.10 pav.).
3.10 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių pirminių kiaušidžių folikulų plotai, µm²
Iš 3.11 paveikslo matyti paršavedžių kiaušidžių pirminių folikulų pirminio ovocito diametrai. Visų paršavedžių morfometriniai duomenys panašūs (P≥0,05). Nr. 1 – 66,22 ±1,5 μm, didžiausi pirminiai ovocitai Nr. 2 – 67,63 ±1,6 μm ir Nr. 4 – 67,30 ±0,9 μm. Mažesni Nr. 3 – 66,45 ±1,1 μm ir Nr. 5 – 65,52 ±0,9 μm. Mažiausi pirminiai ovocitai Nr. 6 – 65,24 ±0,9 μm (3.11 pav.).
0,00 2000,00 4000,00 6000,00 4982,06 3928,76 4130,72 4304,91 5266,37 5432,67 μ m ²
3.10 pav. Pirminių folikulų plotai, μm²
Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr. 6
29
3.11 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių pirminių kiaušidžių folikulų pirminių ovocitų diametras, µm 4 metų amžiaus paršavedžių kiaušidžių pirminiuose folikuluose pirminių ovocitų plotas tai pat nežymiai skyrėsi (P≥0,05). Didžiausi Nr. 2 – 4243,84 ±180,3 μm² ir Nr. 4 – 3574,14 ±109,2 μm². Mažesnis pirminių ovocitų plotas Nr. 3 – 3468,10 ±111,8 μm² ir Nr. 4 – 3392,75 ±78,2 μm². Mažiausias Nr. 6 – 3341,91 ±89,9 μm² ir Nr. 1 – 3290,44 ±75,3 μm² (3.12 pav.).
3.12 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių pirminių kiaušidžių folikulų pirminių ovocitų plotai, µm²
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 66,22 67,63 66,45 67,30 65,52 65,24 μ m
3.11 pav. Pirminio folikulų pirminių ovocitų diametrai, μm Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr. 6 100,00 1100,00 2100,00 3100,00 4100,00 3290,44 4243,84 3468,10 3574,14 3392,75 3341,91 μ m ²
3.12 pav. Pirminių ovocitų plotai, μm²
Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr. 6
30
Atlikus pirminių ovocitų branduolių diametro matavimus nustatyta, kad visų paršavedžių pirminių ovocitų branduolių diametras skyrėsi nežymiai (P≤0,05). Matomas didesnis branduolių diametras Nr. 2 – 38,18 ±2,1 μm, Nr. 4 – 38,07 ±0,7 μm ir Nr. 3 – 37,27 ±0,6 μm. Mažesni Nr. 1 – 36,08 ±1,3 μm ir Nr. 4 – 35,69 ±1,1 μm. Mažiausias branduolio diametras Nr. 6 – 34,49 ±1,3 μm (3.13 pav.).
3.13 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių kiaušidžių pirminių folikulų pirminių ovocitų branduolių diametrai, µm
Išmatavus paršavedžių kiaušidžių pirminių folikulų, pirminių ovocitų esančių branduolių plotainelabai panašūs tarpusavyje (P≤0,05). Galima išskirti šiek tiek didesniu branduolio plotu Nr. 2 – 1156,20 ±137,3 μm² ir Nr. 4 – 1138,20 ±36,5 μm². Mažesni branduolių plotai Nr. 1 – 1129,00 ±93,2 μm² ir Nr. 3 – 1087,53 ±35,7 μm². Mažiausi branduolių plotai buvo Nr. 5 – 1080,89 ±79,3μm² ir Nr. 6 – 1079,01 ±20,4 μm² (3.14 pav.). 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 36,08 38,18 37,27 38,07 35,69 34,49 μ m
3.13 pav. Pirminių ovocitų branduolių diametrai, μm
1 2 3 4 5 6
31
3.14 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių pirminių kiaušidžių folikulų pirminių ovocitų branduolių plotai, µm²
Paršavedžių kiaušidžių pirminiuose folikuluose esančius pirminius ovocitus supa 2 sluoksniai kubiškųjų folikulinių ląstelių. Kaip matoma 3.15 paveiksle folikulinių ląstelių plotis labai panašus į jų aukštį (P≥0,05). Galima būtų išskirti folikulinių ląstelių didžiausią paršavedės Nr. 2 plotį (4,91 ±0,2 μm) ir aukštį (4,61 ±0,3 μm). Mažiausiu pirminių folikulų folikulinių ląstelių skirtumu tarp pločio (4,51 ±0,2 μm) ir aukščio (4,42 ±0,2 μm) turėjo paršavedė Nr. 4.
500,00 600,00 700,00 800,00 900,00 1000,00 1100,00 1200,00 1129,001156,20 1087,531138,201080,89 1079,01 μ m ²
3. 14 pav. Pirminių ovocitų branduolių plotai, μm²
Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr. 6 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 1 2 3 4 5 6 4,76 4,91 4,89 4,51 4,81 4,79 4,40 4,61 4,32 4,42 4,33 4,45 μ m
3.15 pav. Pirminių folikulų folikulinių ląstelių diametrai, μm
Plotis Aukštis
32
3.15 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių pirminių folikulų folikulinių ląstelių pločiai ir aukščiai, µm Tarp šios amžiausgrupės paršavedžių pamatinės membranos storis žymiai siskiria (P≤0,05). Didžiausias pamatinės membranos storis Nr. 2 – 4,42 ±0,3 μm ir Nr. 1 – 4,25 ±0,2 μm. Šiek tiek mažesnius pamatinės membranos storius turėjo paršavedės Nr. 3 – 4,08 ±0,1 μm ir Nr. 4 – 3,92 ±0,4 μm, o mažiausiais palyginus su kitomis paršavedėmis turėjo Nr. 5 – 3,72 ±0,3 μm ir Nr. 6 – 3,63 ±0,4 μm.
3.16 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių kiaušidžių pirminių folikulų pamatinių membranų storiai, µm
3.3 Paršavedžių 4 metų amžiaus kiaušidžių antrinių folikulų morfometrinė charakteristika
Išmatavus visų 6 paršavedžių kaušidžių po 5 antrinius folikulus nustatyta, kad visų paršavedžių antrinių folikulų diametras labai panašus (P≥0,05). Didesnius folikulų diametrus turėjo paršavedės Nr. 3 (187,01 ±3,1 μm), Nr. 6 (186,41 ±2,1 μm) ir Nr. 2 (185,66 ±3,7 μm). Mažesnius Nr. 1 (185,08 ±0,1 μm), Nr. 3 (185,66 ±3,8 μm) ir mažiausias diametras Nr. 5 (184,81 ±2,6 μm) (3.17 pav.).
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 4,25 4,42 4,08 3,92 3,72 3,63 μ m
3.16 pav. Pirminių folikulų pamatinės membranos storiai, μm
Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6
33
3.17 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių antrinių kiaušidžių folikulų diametrai, µm
Palyginus visų paršavedžių kiaušidžių antrinio folikulų plotą nustatyta, kad paršavedžių Nr. 6 (17748,98 ±28,2 μm²), Nr. 1 (17626,54 ±23,7 μm²) ir Nr. 2 (17646,54 ±34,9 μm²). Mažesnį antrinių folikulų plotą turi paršavedės Nr. 4 (17558,10 ±32,8 μm²) ir Nr. 5 (17460,24 ±33,7 μm²), o mažiausias plotas Nr. 3 – 17414,97 ±25,3 μm² (P≥0,05) (3.18 pav.).
3.18 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių kiaušidžių antrinių folikulų plotai, µm²
100,00 120,00 140,00 160,00 180,00 200,00 185,08 185,66 184,97 187,01 184,81 186,41 μ m
3.17 pav. Antrinių folikulų diametrai, μm
Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6 15000,00 15500,00 16000,00 16500,00 17000,00 17500,00 18000,00 17626,54 17646,54 17414,97 17558,10 17460,24 17748,98 μ m ²
3.18 pav. Antrinių folikulų plotai, μm²
Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6
34
Išmatavus 4 m. amžiaus paršavedžių antrinių folikulų pirminių ovocitų diametrą nustatyta, kad didžiausi pirminiai ovocitai paršavedžių Nr. 1 – 91,06 ±0,4 μm ir Nr. 6 – 91,02 ±1,2 μm. Mažesni Nr. 2 – 89,42 ±0,4 μm, Nr. 4 – 89,94 ±0,7 μm ir Nr. 5 – 89,14 ±0,4 μm. Mažiausi Nr. 3 – 89,09 ±0,2 μm (P≥0,05) (3.19 pav.).
3.19 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių kiaušidžių antrinių folikulų pirminių ovocitų diametrai, µm Iš paveikslo 3.20 matoma, kad pirminių ovocitų plotas Nr. 1 (6570,44 ±94,9 μm²) ir Nr. 6 (6662,91 ±31,6 μm²) yra didžiausi. Mažesni paršavedžių Nr. 4 (6484,90 ±80,3 μm²) ir Nr. 5 (6556,21 ±19,5 μm²). Mažiausi antrinių folikulų pirminių ovocitų plotai Nr. 2 (6327,95 ±74,4 μm²) ir Nr. 3 (6378,45 ±23,8 μm²) (P≤0,05) (3.20 pav). 70,00 75,00 80,00 85,00 90,00 95,00 100,00 91,06 89,42 89,09 89,94 89,14 91,02 μ m
3.19 pav. Antrinių folikulų ovocitų diametrai, μm
1 2 3 4 5 6
35
3.20 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių kiaušidžių antrinių folikulų pirminių ovocitų plotai, µm² Išmatavus branduolių diametrus nustatyta, kad visų paršavedžių nežymiai skiriasi (P≤0,05). Didesni paršavedžių Nr. 2 (25,85 ±0,6 μm), Nr. 4 (26,15 ±0,5 μm) ir Nr. 6 (26,10 ±0,6 μm). Mažesni Nr. 1 (24,58 ±0,8 μm), Nr. 3 (24,20 ±0,3 μm) ir Nr. 5 (24,30 ±0,5 μm) (3.21 pav.).
3.21 pav.4 m. amžiaus paršavedžių kiaušidžių antrinių folikulų pirminių ovocitų branduolių diametrai, µm 5000,00 5400,00 5800,00 6200,00 6600,00 6570,44 6327,95 6378,45 6484,906556,21 6662,91 μ m ²
3.20 pav. Antrinių folikulų pirminių ovocitų plotai, μm² Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 24,58 25,85 24,20 26,15 24,30 26,10 μ m
3.21 pav. Antrinių folikulų ovocitų branduolių diametrai, μm Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6
36
Iš paveikslo 3.22 matyti, kad pirminių ovocitų branduolių plotas nežymiai skiriasi (P≤0,05). Didesni branduolių plotai paršavedžių Nr. 2 – 531,376 ±22,4 μm², Nr. 4 –532,81 ±18,7 μm² ir Nr. 6 – 532,522 ±18,5 μm². Mažesnius antrinių kiaušidės folikulų pirminių ovocitų branduolių plotus turi paršavedės Nr. 1 – 515,67 ±28,4 μm², Nr. 3 – 499,428 ±26,9μm² ir Nr. 5 – 509,23 ±17,07 μm² (3.22 pav).
3.22 pav.4 m. amžiaus paršavedžių kiaušidžių antrinių folikulų pirminių ovocitų branduolių plotai, µm²
Aplinkui pirminį ovocitą išsidėstę nuo 6 iki 7 sluoksnių kubiškųjų folikulinių ląstelių. Iš 3.23 paveikslo matoma, kad folikulinių ląstelių plotis šiek tiek didesnis už aukštį (P≤0,05). Didžiausiu folikulinių ląsteliu pločiu (4,45 ±1,3 μm) ir aukščiu (4,04 ±0,2 μm) pasižymi paršavedė Nr. 2. Mažiausiu folikulinių ląstelių pločiu (3,98 ±0,3 μm) ir aukščiu (3,44 ±0,2 μm). Kitų paršavedžių antrinių kiaušidžių folikulų neišsiskyrė (3.23 pav.).
400,000 450,000 500,000 550,000 515,670 531,376 499,428 532,810 509,230 532,522 μ m ²
3.22 pav. Antrinių folikulų ovocitų branduolių plotai, μm² Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 Nr.6
37
3.23 pav. 4 m. amžiaus paršavedžių antrinių folikulų folikulinių ląstelių pločiai ir aukščiai, µm Iš paveikslo 3.24 galima matyti, kad paršavedžių 4 m. amžiaus antrinių kiaušidės folikulų pamatinių membranų storis nežymiai skyrėsi (P≥0,05). Galima būtų išskirti didžiausių pamatinių membranų storį turinčias dvi paršavedes Nr. 2 (2,59 ±0,3 μm) ir Nr. 4 (2,55 ±0,6 μm). Mažesnius pamatinės membranos storius turėjo paršavedės Nr. 1 (2,47 ±0,3 μm), Nr. 5 (2,28 ±0,2 μm). Mažiausios pamatinės membranos storiai paršavedžių Nr. 3 (2,27 ±0,3 μm) ir Nr. 6 (2,27 ±0,3 μm).
3.24 pav.4 m. amžiaus paršavedžių kiaušidžių antrinių folikulų pamatinių membranų storiai, µm
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 1 2 3 4 5 6 4,25 4,45 4,27 4,32 4,18 3,98 3,99 4,04 3,55 3,55 3,71 3,44 μ m
3.23 pav. antrinių folikulų folikulinių ląstelių diametrai, μm Plotis Aukštis 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 2,47 2,59 2,27 2,55 2,28 2,27 μ m
3.24 pav. Antrinių folikulų pamatinių membranį storis, μm
1 2 3 4 5 6
38
4. TYRIMO REZULTATŲ APIBENDRINIMAS
Paršavedžių folikulus suklasifikavome į keturias klases, pagal folikulinių ląstelių skaičių, supantį pirminį ovocitą.
Pirmai klasei priskyrėme mažiausius folikulus vadinamus užuomazginiais folikulai (A. Samuelson, 2007). Pas paršavedes nustatytas kiaušidžių diametras nuo 40,56 ±1,3 μm iki 41,89 ±1,2 μm (P≥0,05). Tokių folikulų pirminiai ovocitai apsupti vienu sluoksniu plokščiųjų ląstelių ir pamatinės membranos (W. J. Bacha ir kt. 2000).
Antrai klasei priskyrėme kiaušidžių folikulus vadinamus pirminiais folikulais (J. A. Eurell, 2006). Paršavedėms pagal dydį pirminiai folikulai nustatyti nuo 73,89 ±1,6 μm iki 81,77±0,9 μm (P≤0,05). Šių folikulų pirminiai ovocitai apsupti 2 sluoksnių kubiškųjų folikulinių ląstelių ir pamatinės membranos. Trečiai klasei priskyrėme kiaušidžių folikulus vadinamus antriniais folikulais. Paršavedėms nustatyti antrinių folikulų diametrai svyravo nuo 184,87 ±2,6 μm iki 187,01 ±3,1 μm (P≥0,05). Juose esantys pirminiai ovocitaituri skaidriąją zoną (J. A. Eurell, 2006), ir yra apsupti nuo 6 iki 7 eilių kubiškųjų folikulinių ląstelių ir pamatinės membranos.
Ketvirtos klasės kiaušidžių folikulai yra tretiniai ar pūsliniai. Pas paršavedes šie folikulai nebuvo tirti. Apie paršavedžių kiaušidžių folikulų histologinius tyrimus, kurie būtų atlikti specialiai nustatyti paršavedžių folikulus dydį nėra jokių duomenų.
4 metų amžiaus paršavedžių kiaušidžių užuomazginių folikulų pirminiams ovocitams nustatyti diametrai buvo nuo 31,72 ±3,2 μm iki 35,23 ±0,8 μm (P≤0,05). Pirminių ovocitų branduolių diametras buvo nuo 15,43 ±1,9 μm iki 15,57 ±1,7 μm (P≥0,05).
Paršavedžių 4 metų amžiaus kiaušidžių pirminių folikulų pirminių ovocitų diametras yra nuo 65,24 ±0,9 μm iki 67,63 ±1,6 μm (P≥0,05), šių ovocitų branduolių diametrai svyravimo nuo 34,49 ±1,3 μm iki 38,18 ±2,1 μm (P≤0,05).
Paršavedėms antrinių folikulų pirminių ovocitų nustatytas diametras buvo nuo 89,09 ±0,2 μm iki 91,06 ±0,4 μm (P≥0,05), jų branduolių diametras svyravo nuo 24,20 ±0,3 μm iki 26,15 ±0,5 μm (P≤0,05). Tai pat nustatinėjau kokie folikulų, pirminių ovocitų ir branduolių plotai.
39
Tarp 4 metų amžiaus paršavedžių kiaušidžių užuomazginių folikulų plotai svyravo nuo 1152,47 ±39,8 μm² iki 1156,93 ±19,1 μm² (P≥0,05). Šių folikulų pirminių ovocitų nustatytas plotas nuo 802,73 ±16,5 μm² iki 975,10 ±45,3 μm² (P≤0,05), o jų branduolių plotai buvo iki 204,88 ±17,5 μm² nuo 199,55 ±46,5 μm² (P≥0,05).
Visų tirtų paršavedžių nustatytas ir pirminių folikulų plotas, kuris svyravo nuo 3928,76 ±106,5 μm² iki 5432,67 ±86,1 μm² (P≤0,05). Juose esantys pirminiai ovocitai turėto plotus nuo 3290,44 ±75,3 μm² iki 4243,84 ±180,3 μm² (P≥0,05). Pirminių ovocitų branduolių plotai svyravo nuo 1079,01 ±20,4 μm² iki 1156,20 ±137,3 μm² (P≤0,05).
Antrinių folikulų tarp 4 metų amžiaus paršavedžių nustatyti plotai svyravo tarp 17414,97 ±25,3 μm² ir 17748,98 ±28,2 μm² (P≥0,05). Jų pirminiai ovocitai turėjo plotus nuo 6327,95 ±74,4 μm² iki 6662,91 ±31,6 μm² (P≥0,05), o jų branduoliai siekė plotus nuo 499,428 ±26,9 μm² iki 532,81 ±18,7 μm² (P≤0,05).
Šie nustatyti duomenys yra specifiniai ir tinka tik paršavedėms, jų lyginti su kitomis gyvulių rūšimis negalima. Kitų duomenų apie paršavedžių kiaušidžių folikulų morfometrinius duomenis nebuvo rasta.
40
5. IŠVADOS
1. Ištyrus 4 metų amžiaus paršavedžių užuomazginius kiaušidžių folikulų gautus duomenis nustatyta, kad:
1.1 Gauti duomenys iš folikulų, pirminių ovocitų, jų branduolių diametrų ir plotai nežymiai skyrėsi (P≥0,05), pamatinės membranos storis taip pat panašus visų tirtų paršavedžių (P≥0,05).
1.2. Folikulinių plokščiųjų ląstelių, kurios gaubia pirminius ovocitus vienu sluoksnis plotis yra didesnis už aukštį (P≤0,05), tačiau tarpusavyje skirtumas nežymus (P≥0,05).
2. 4 metų amžiaus paršavedžių pirminių kiaušidės folikulų morfometriniai duomenys parodė, kad: 2.1. Pirminių folikulų, pirminių ovocitų ir jų branduolių diametras, bei plotas ir tirtos pamatinės membranos storis yra panašūs (P≥0,05).
2.2. Folikulinių kubiškųjų ląstelių, apgaubiaunčių pirminį ovocitą dviem sluoksniais plotis šiek tiek viršijo aukštį, bet rezultatai buvo tarpusavyje panašus (P≥0,05)
3. 4 metų amžiaus paršavedžių antrinių kiaušidės folikulų gauti morfometriniai duomenys nustatyta, kad:
3.1. Antrinių kiaušidės folikulų, pirminių ovocitų ir jų branduolių diametrai, bei pamatinės membranos storis buvo panašūs (P≥0,05), tačiau ovocitų branduolių plotai tarpusavyje skyrėsi (P≥0,05).
3.2. Antrinių kiaušidės folikulų pirminius ovocitus gaubiantys 6 – 7 sluoksniai folikulinių kubiškųjų ląstelių plotis labai nežymiai viršijo aukštį ir jie buvo tarpusavyje panašūs (P≥0,05).
41
6. SANTRAUKA
Tiriamasis darbas atliktas nuo 2013 m. kovo 20 d. iki rugsėjo 1 d.
Darbo tikslas buvo nustatyti 4 metų amžiaus pašavedžių kiaušidžių užuomazginių, pirminių ir antrinių folikulų morfometrinius duomenis.Tyrimui buvo paimti Norvegų landrasų veislės 6 paršavedžių kairė ir dešinė kiaušidės.
Folikulai yra skirstomos į tris rūšis: užuomazginius, pirminius ir antrinius. Todėl iš vienos pašavedės kiaušidžių mėginių išmatuoti 5 užuomazginiai, 5 pirminiai ir 5 antriniai folikulai. Nustatyti folikulų diametrai, plotai, kiekvieno folikulo ovocito diametras, plotas, tai pat ovocito branduolio diametras, plotas ir folikulinių ląstelių matmenys, bei pamatinės membranos storis mikrometrais.
Paršavedžių kiaušidžių tyrimai parodė, kad užuomazginių, pirminių ir antrinių folikulų, ovocitų jų branduolių diametras bei plotas, pamatinės membranos storis priklausomai nuo folikulų rūšies nežymiai skiriasi (P≥0,05). Užuomazginiuose folikuluose ovocitai apsupti vieno sluoksnio plokščių folikulinių ląstelių, kurių plotis didesnis nei aukštis (P≤0,05). Pirminiuose kiaušidės folikuluose ovocitai jau apsupti 2 sluoksniį kubiškųjų folikulinių ląstelių, kurių aukštis nežymiai viršija plotį (P≥0,05). Antriniuose kiaušidės folikuluose ovocitai apsupti nuo 6 iki 7 sluoksnių kubiškųjų folikulinių ląstelių, kurių aukštis ir plotis skyrėsi mažai (P≥0,05).
42
7. SUMMARY
Job title: Sows 4 years age ovarian various stages follicles comparison and characteristic
The research work was accomplished in 2013 from March to September. Volume of the research work – 44 pages, 1 tables, 29 pictures.
The aim of the Master Thesis is to investigate the morphometric data of primordial, primary and secondary follicles of 4-years-old sows ovaries. For the research, left and right ovaries from 6 Norwegian Landrace sows were collected.
The follicles are divided into three categories: primordial, primary and secondary. From ovaries of one sow, 5 primordial, 5 primary and 5 secondary follicles were taken as the samples. The diameters of follicles, areas, oocyte diameter of each follicle, nuclear diameter, areas of oocytes, measurements of follicular cells and the thickness of underlying membrane (micrometre) were investigated.
The result of this study demonstrated that the primordial, primary and secondary follicles, diameter of oocyte nuclears and areas, the thickness of underlying membrane according to the type of follicles are similar (P≥0,05). The oocytes of primordial follicles are environed by a single layer of a flat follicular cells which width is greater than a height (P≤0,05). The oocytes of primary follicles are enclosed by 2 layer cubical follicular cells which height slightly exceeds its width (P≥0,05). The oocytes of secondary follicles are surrounded by 6 – 7 layers cubical follicular cells which height and width are similar (P≥0,05).
43
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. A. Laurinavičienė, R. Smaliukienė, Histologinių technologijų vadovas, Vilnius, 2007 m. 2. A. Pabijanskas, Žemės ūkio gyvulių anatomija, 238 psl
3. A. Padaiga, V. Lasys, A. Sederevičius, Naminių gyvūnų mikroskopinė anatomija, 2006 m. 159 – 168 psl.
4. A. Šiukščius ir kt.,Gyvulininkystės vadovas, Kiaulių reprodukcija, 2007 m. 257 – 259 psl. 5. B. Karvelienė, Kiaulių reprodukcija ir jos sutrikimai, Mano ūkis, 2010 m./ 7
6. C. M. Gee, H. D. Geissinger, R. M. Liptrap, Morphometric and steroid hormone changes associated with ezperimental anovulatory follicles in the sow, 1990 m.
7. C. J. Bracken, PhD, J. S. Seaman–Bridges, MSc, T. J. Safranski, PhD, M. C. Lucy, PhD, Ovarian follicular development, estrus, and ovulation in seasonally anestrous sows treated seven days post weaning with equine and human chorionic gonadotropins, 2005 m.
8. Dr. Paul W. L. Kwan Tufts universitety school of medicine, Female reproductive system, 2010 m.
9. Don. A. Samuelson, Textbook of veterinary histology, 2007m. 455 psl.
10. E. Aughey, F. L. Frye, Comparative veterinary hislotogy with clinical correlates, 2001 m., 183 psl.
11. Gerritse, R., C. C. Beerendonk, M. S. Tijink, A. Heetkamp, J. A. Kremer, D. D. Braat, J. R. Westphal, Optimal perfusion of an intact ovary as a prerequisite for successful ovarian cryopreservation. Hum Reprod, 2008 m.
12. H.Dieter Dellmann, Jo Ann Eurell, Textbook of veterinary histology, 1998 m. 248 psl 13. I. Jančienė, Kiaulininkystė, 2005 m. 65 psl.
14. John R. Hoffman, Female reproductive system lab guide, Histology Beaver College, 2000 m. 15. J. H. Killen, R. K Christenson, J. J. Ford, Ovarian follicular changes after weaning in sows,
1992 m.
16. J. A. Eurell, B. L. Frappier, Dellmann's textbook of veterinary histology, sixth edition, 2006 m. 256 psl.
17. Kähn Wolfgang, Veterinary reproductive ultrasonography: horse, cattle, sheep, goat, pig, dog, cat; english translation and revision Dietrich Volkmann, Robert M. Kenney, 2004 m. 215 psl. 18. Marija Stankevičienė, Vytuolis Žilaitis,Dainius Šumskas, Romas Maruška, Veterinarijos
44
19. Munn, C. S., L. C. Kiser, S. M. Wetzner, J. E. Baer. Ovary volume in young and premenopausal adults: US determination. Work in progress. Radiology, 1986 m.
20. Milan Milenkovic, Cesar Díaz-Garcia, Mats Brännström. Review on Ovarian Cryopreservation inLarge Animals and Non-Human Primates, Current Frontiers in Cryopreservation, 2012 m. 21. O. Kublickienė, Histologinė technika ir praktinė histochemija, Mokslas, 1978 m., 8 psl
22. P. Mačiulskis, A. Aniulienė, A. pockevičius, N. Juodžiukynienė, Makroskopiniai ir mikroskopiniai organų ir audinių tyrimai, Naujasis lankas, 2007 m., 40 psl.
45
PADĖKA
Labai didelę padėką norėčiau pareikšti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Patologijos centro darbuotojams, Gretai Cikanavičiūtei už suteiktą pagalbą darant mėginius, taip pat savo darbo vadovui už pagalbą tiriant mėginius.
