LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Erika Skrodenienė
GENETINIŲ, IMUNINIŲ IR APLINKOS
VEIKSNIŲ ĮTAKA VAIKŲ SERGAMUMUI
1 TIPO CUKRINIU DIABETU
LIETUVOJE
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
medicina (06 B)
Disertacija rengta 2003–2010 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Endokrinologijos institute.
Mokslinis vadovas
prof. habil. dr. Žilvinas Padaiga (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06 B)
Konsultantai:
prof. habil. dr. Johnny Ludvigsson (Linčiopingo (Švedija) universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06 B)
dr. Dalia Marčiulionytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B)
TURINYS
TURINYS ...3
SANTRUMPOS ...5
ĮVADAS ...7
1. DARBO TIKSLAS, UŽDAVINIAI, MOKSLINIS NAUJUMAS ...9
2. LITERATŪROS APŽVALGA ...11
2.1. Cukrinis diabetas ...11
2.2. Vaikų sergamumas 1 tipo cukriniu diabetu ...11
2.3. Veiksniai, lemiantys 1 tipo cukrinio diabeto atsiradimą ...16
2.3.1. Genetiniai veiksniai ...16
2.3.2. Aplinkos veiksniai ...20
2.4. 1 tipo cukrinis diabetas ir autoantikūnai...24
2.4.1. 1 tipo cukrinio diabeto patogenezė ...24
2.4.2. 1TCD imuniniai žymenys ...28
2.4.3. Autoantikūnai, ikidiabetinė būklė ir aplinkos veiksniai ....30
3. TYRIMO APIMTIS IR METODAI ...31
3.1. Tyrimo apimtis ...31
3.2. Kontingento charakteristika ...33
3.2.1. Kontingento, kuriam atlikti genetiniai tyrimai, charakteristika ...34
3.2.2. Kontingento, kuriam atlikti imunologiniai tyrimai, charakteristika ...36
3.3. Tyrimo metodai ...38
3.3.1. Genetinių tyrimų metodai ...38
3.3.2. Imunologinių tyrimų metodai ...41
3.4. Statistinė analizė ...42
4. REZULTATAI ...43
4.1. HLA DRB1, DQA1, DQB1 aleliai ir haplotipai, didinantys ir mažinantys vaikų 1TCD riziką ...43
4.2. HLA (DR)-DQA1-DQB1 haplotipų ir aplinkos veiksnių derinių įtaka vaikų 1TCD atsirasti...48
4.3. GADA ir IA-2A autoantikūnų paplitimas ir jų ryšys su aplinkos veiksniais ...52
4.4. Aplinkos veiksniai, lemiantys vaikų ikidiabetinės būklės atsiradimą ...60
5. REZULTATŲ APTARIMAS ...66
5.1. HLA II klasės aleliai ir haplotipai, lemiantys 1TCD riziką ...66
5.2. Genetiniai ir aplinkos veiksniai ...69
5.4. Ikidiabetas ir aplinkos veiksniai ... 76
IŠVADOS ... 79
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 80
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 81
SPAUSDINTŲ DARBŲ SĄRAŠAS ... 102
PRIEDAI ... 104
1 priedas ... 104
SANTRUMPOS
AKDS – adsorbuota kokliušo, difterijos, stabligės vakcina APL – antigenus pateikiančios ląstelės
BCŽ – tuberkuliozės skiepas
C – komplementas
CD – (angl. cluster of differentiation) diferenciacijos grupė CTL4 – citotoksinių T limfocitų 4 antigenas
DNR – deoksiribonukleorūgštis
GAD – (angl. glutamic acid decarboxylase) glutamo rūgšties dekarboksilazė
GADA – (angl. glutamic acid decarboxylase antibodies) antikūnai prieš glutamo rūgšties dekarboksilazę
Hib – (angl. Haemophilus influenzae type B vaccine) Haemophilus influenzae B tipo vakcina
HLA – (angl. human leukocyte antigen) žmogaus leukocitų antigenai
IAA – (angl. insulin antibodies) antikūnai prieš insuliną IA-2 – (angl. protein thyrosine phosphatase) baltymas
tirozinfosfatazė
IA-2A – (angl. protein thyrosine phosphatase antibodies) antikūnai prieš baltymą tirozinfosfatazę
ICA – (angl. islet cell antibodies) antikūnai prieš kasos saleles IDF – (angl. International Diabetes Federation) Tarptautinė
diabeto federacija IL – Interleukinas INS – insulino genas
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos
JDF – (JDF, angl. Juvenile Diabetes Foundation) jaunatvinio diabeto finansavimo grupės
K3EDTA – (angl. ethylene diamine tetra acetic acid tribasic
potasium salt) tribazis kalio etileno diamintetraacetatas
mėn. – Mėnuo
MHC – (angl. major histocompatibility complex) pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas
MMR – (angl. measles-mumps-rubella vaccine) tymų, kiaulytės ir raudonukės vakcina
NF-kB – (angl. nuclear factor kB) branduolio veiksnys kB NS – (angl. not significant) statistiškai nereikšminga PI – Pasikliautinasis intervalas
PGR – polimerazės grandininė reakcija proc. – procentai
PSO – Pasaulio sveikatos organizacija SN – standartinis nuokrypis
SNP – (angl. single nucleotide polymorphism) vieno nukleotido polimorfizmas
SSO – (angl. sequence-specific oligonucleotide) seka savitųjų nukleotidų
SSP – (angl. sequence-specific primer) seka savitųjų pradmenų ŠS – šansų santykis
Th – (angl. T helper) T limfocitai pagalbininkai
TNF-α – (angl. tumor necrosis factor-α) alfa navikų nekrozės veiksnys
TNF-β – (angl. tumor necrosis factor-β) beta navikų nekrozės veiksnys
V – standartiniai vienetai
ZnT-8 – (angl. zinc transporter 8) cinko perkėliklis 8
ZnT-8A – (angl. zinc transporter 8 antibodies) antikūnai prieš cinko perkėliklį 8
ĮVADAS
1 tipo cukrinis diabetas (1TCD) yra pasaulinė sveikatos problema. Tai lėtinė liga, kuria dažniausiai serga vaikai arba jauni žmonės. 1TCD – viena iš sunkiausių lėtinių vaikų ligų, keliančių daug visuomenės sveikatos problemų: ši liga gydoma visą gyvenimą, sukeliamos sunkios komplikacijos ir didinamas mirtingumas. Cukrinis diabetas yra didžiulė psichologinė bei ekonominė našta sergančiam žmogui, šalies sveikatos priežiūros sistemai ir visai ekonomikai.
2010 metais pasaulyje cukriniu diabetu sirgo 479 600 tūkstančių 0–14 metų vaikų [92]. Sergamumas 1TCD pasaulyje didėja apie 2–5,5 proc. per metus [91]. Lietuvoje, kaip ir daugelyje pasaulio šalių, vis daugiau vaikų serga 1TCD.
1TCD yra autoimuninė liga, pažeidžianti kasos beta ląsteles. Ardomuosius kasos procesus lemia ir genetiniai, ir aplinkos veiksniai [119]. Manoma, kad dideli sergamumo 1TCD skirtumai tarp įvairių etninių populiacijų priklauso nuo skirtingo genetinių ir aplinkos rizikos veiksnių skirstinio. Gali būti, kad genetiškai skirtingų populiacijų skiriasi ir sukeliamieji aplinkos rizikos veiksniai. Todėl svarbu atlikti epidemio-loginius populiacijų, kurios skiriasi 1TCD sergamumu, tyrimus. Statistiškai reikšmingai įrodyta žmogaus leukocitų antigenų (HLA, angl. human leuko-cyte antigen) įtaka ligai atsirasti [76] ir nustatyti įvairūs veiksniai, galintys sukelti kasos beta ląstelių pažeidimą [205], tačiau 1TCD diabeto etiologija iki šiol nėra visiškai aiški. Įvairių etninių grupių tyrimai parodė, kad didžiausią 1TCD genetinę riziką kaukazoidams lemia DR3-DQ2 ir DR4-DQ8 haplotipai, o riziką mažina – DR2-DQ6 haplotipas [37, 76, 186]. Aplinkos veiksniai gali lemti arba pagreitinti kasos beta ląstelių irimą. Riziką susirgti cukriniu diabetu didina nėštumo toksikozė, cezario pjūvio operacija, trumpas natūralus naujagimio maitinimas ir ankstyvas karvės pieno vartojimas, socialiniai veiksniai – tėvų išsilavinimas, gyvenamoji vieta [2, 176, 205]. Daug epidemiologinių tyrimų rodo virusinių infekcijų ir skiepų svarbą 1TCD patogenezei [106, 132].
Antikūnų prieš kasos saleles (ICA, angl. islet cell antibodies) arba insuliną (IAA, angl. insulin antibodies) nustatymas rodo prasidėjusius imuninius procesus, tai yra ikiklinikinį diabeto laikotarpį arba ikidiabetinę būklę [128]. Vėliau nustatomi ir antikūnai prieš glutamo rūgšties dekar-boksilazę (GADA angl. glutamic acid decarboxylase antibodies) arba antikūnai prieš baltymą tirozinfosfatazę (IA-2A, angl. protein thyrosine phosphatase antibodies) [136].
Sergamumas 1TCD didėja, nors populiacijos genų fondas kinta nedaug. Sergamumas didėja ir populiacijose, kuriose genų, lemiančių 1TCD riziką, dažnis nėra didelis. Konkordiškumas tarp monozigotinių dvynių patvirtina, kad nėra aišku, kurie veiksniai, genetiniai ar aplinkos, yra svarbesni [119]. Tikslios sergamumo didėjimo priežastys nėra žinomos iki šiol.
Nustatyta, kad sergančio 1TCD vaiko pirmosios eilės giminaičiams susirgimo rizika yra apie apie 20 kartų didesnė nei bendros populiacijos, o susirgimo rizika monozigotiniam dvyniui dar didesnė, net 30–50 proc. [6, 9, 96]. Tačiau nėra išskirtos šeimos, kurioms aiškiai nustatytas/atpa-žįstamas 1TCD paveldimumas.
Svarbu nustatyti vaikų 1TCD riziką didinančius ir mažinančius genus Lietuvoje ir kitose šalyse. Tai leistų palyginti riziką didinančių ir mažinančių genų paplitimą tarp šalių bei padėtų nustatant vaikų 1TCD etiologiją.
Nustačius genetinius 1TCD rizikos veiksnius, atsirastų galimybė atrinkti vaikus turinčius genus didinančius susirgimo 1TCD riziką. Šiems vaikams būtų galima patarti vengti aplinkos veiksnių, didinančių susirgimo 1TCD riziką. Šios priemonės galėtų padėti užkirsti kelią ligai atsirasti.
Autoantikūnai prieš kasos antigenus gali būti nustatomi keletą metų anksčiau nei diagnozuojamas klinikinis 1TCD. Vaikams turintiems genų didinančių susirgimo 1TCD riziką reikėtų atlikti imunologinius tyrimus autoantikūnams prieš kasos antigenus nustatyti. Savalaikis ikidiabetinės būklės nustatymas leistų pradėti ligos profilaktiką.
HLA genotipavimas ir IAA, GADA, IA-2A, ICA autoantikūnų tyrimas gali būti naudojami prognozuoti 1TCD sergančių pirmosios eilės giminaičių ar bendros populiacijos žmonių riziką susirgti cukriniu diabetu ir laiku pritaikyti profilaktikos priemones [114].
1. DARBO TIKSLAS, UŽDAVINIAI, MOKSLINIS
NAUJUMAS
Darbo tikslas
Nustatyti genetinių ir aplinkos veiksnių įtaką vaikų sergamumui 1 tipo cukriniu diabetu Lietuvoje.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti HLA II klasės haplotipus, didinančius ir mažinančius vaikų 1 tipo cukrinio diabeto riziką Lietuvoje.
2. Nustatyti HLA II klasės haplotipų ir aplinkos veiksnių derinių įtaką vaikų 1 tipo cukriniam diabetui atsirasti.
3. Nustatyti GADA ir IA-2A autoantikūnų paplitimą ir jų ryšį su aplinkos veiksniais.
4. Nustatyti aplinkos veiksnius, lemiančius vaikų ikidiabetinės būklės atsiradimą.
Mokslinis darbo naujumas
Aplinkos veiksnių įtaka vaikų 1TCD atsirasti Lietuvoje pradėta tyrinėti 1995 metais. Šis tyrimas yra tęsinys atvejo ir kontrolės tyrimo „Aplinkos veiksnių įtaka vaikų sergamumui 1TCD“, pradėto 1995–1996 m. Švedijos (Linčiopingo universiteto) ir Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Endo-krinologijos instituto mokslininkų. Tyrimas apibūdina visą Lietuvos vaikų, sergančių 1TCD, populiaciją.
Iki šiol buvo ištirta:
– kūdikių mitybos įtaka vaikų susirgimui 1TCD;
– įvertinta skiepų ir persirgtų užkrečiamųjų ligų įtaka vaikų susirgimui 1TCD;
– įvertintas vaikų, sergančių 1TCD, pirmosios eilės giminaičių sirgimas CD, celiakija, reumatinėmis ir skydliaukės ligomis;
– nustatyti aplinkos rizikos veiksniai, lemiantys vaikų sirgimą 1TCD Lietuvoje;
– įvertinta Lietuvos vaikų 1TCD atsiradimo klinikiniai požymiai, kurie palyginti su Švedijos vaikų;
– nustatytas su 1TCD susijusių HLA alelių ir haplotipų (DR3-DQA1*0501-DQB1*0201 ir DR4-DQA1*0301-DQB1*0302) perdavimas Lietuvos šeimose, turinčiose 1TCD sergantį vaiką.
Šiame disertaciniame darbe, tęsiant pradėtą tyrimą, ištirta:
– pirmą kąrtą HLA II klasės genų tipavimas buvo atliktas ne tik sergantiems 1TCD, bet ir kontrolinės grupės vaikams. Vertintas daugelio HLA genų alelių ir haplotipų paplitimas bei jų įtaka 1TCD. Tai padėjo nustatyti ne tik vaikų 1TCD riziką didinačius alelius ir haplotipus, bet ir vaikų 1TCD riziką mažinančius alelius ir haplotipus Lietuvoje;
– tirta vaikų 1TCD riziką didinačių ir mažinančių haplotipų ir tam tikrų aplinkos veiksnių derinių įtaka 1TCD atsirasti;
– nustatytas autoantikūnų (GADA ir IA-2A) dažnis sergančių 1TCD ir sveikų Lietuvos vaikų populiacijoje bei jų ryšys su aplinkos veiksniais;
2. LITERATŪROS APŽVALGA
Mokslo literatūra rinkta biomedicinos mokslo srities duomenų bazėje PubMed www.ncbi.nlm.gov/pubmed/. Dažniausiai vartoti raktiniai žodžiai: type 1 diabetes, children, incidence, pathogenesis, aetiology, autoantibo-dies, autoantigens, islet cell antibodies (ICA), glutamic acid decarboxylase (GAD), protein thyrosine phosphatase (IA-2), glutamic acid decarboxylase antibodies (GADA), protein thyrosine phosphataseantibodies (IA-2A), insulin autoantibodies (IAA), human leukocyte antigen (HLA), environ-mental factors, breastfeeding, cows‘ milk, nutrition.
2.1. Cukrinis diabetas
Cukrinis diabetas yra metabolinių sutrikimų visuma. Liga nustatoma atsiradus lėtinei hiperglikemijai ir angliavandenių, riebalų bei baltymų apykaitos sutrikimams, sukeliamiems daugybės paveldimų ir įgyjamų etio-loginių priežasčių, nulemiančių insulino išsiskyrimo arba/ir jo veikimo sutrikimą [44].
Tarptautinės diabeto federacijos (IDF) duomenimis, 2010 metais cukriniu diabetu sirgo 285 milijonai žmonių. IDF nariai mano, kad 2030 metais cukriniu diabetu sirgs daugiau kaip 438 milijonai žmonių. Ši liga kelia daug visuomenės sveikatos problemų: cukrinis diabetas gydomas visą gyvenimą, liga sukelia sunkias komplikacijas ir didina mirtingumą. Taigi cukrinis diabetas yra didžiulė ekonominė našta ne tik sergančiam individui, bet ir šalies sveikatos priežiūros sistemai, ir visai ekonomikai. Apie 11,6 proc. sveikatos priežiūrai skiriamų pinigų yra išleidžiama cukrinio diabeto priežiūrai. Manoma, kad cukriniam diabetui ir jo komplikacijoms gydyti bei profilaktikai 2010 metais išleista 376 bilijonai Jungtinių Amerikos Valstijų (JAV) dolerių [92].
2.2. Vaikų sergamumas 1 tipo cukriniu diabetu
1TCD sukelia negrįžtamas kasos Langerhanso salelių beta ląstelių išskiriamosios funkcijos išnykimas. Skiriamos autoimuninės ir idiopatinės 1TCD priežastys [46]. 1TCD – tai lėtinė liga, kuria dažniausiai serga vaikai ir jauni žmonės.
IDF duomenimis, 2010 metais 1TCD visame pasaulyje sirgo 479 000 tūkstančiai 0–14 metų vaikų. Kiekvienais metais 1TCD suserga apie 76 000 tūkstančiai vaikų ir šie skaičiai nuolatos didėja [92]. 2.2.1 paveiksle pavaiz-duotas, IDF 2009 metų duomenimis remiantis apskaičiuotas, 2010 metais
sirgsiančių 1TCD 0–14 metų vaikų skaičius pagal regionus. Europos regione 1TCD sergančių vaikų skaičius yra vienas didžiausių pasaulyje [92].
0 20 40 60 80 100 120 Vakarinės Ramiojo vandenyno salos Pietų ir Centrinė Afrika Afrika Vidurio Rytai ir Šiaurės Afrika Šiaurės Amerika ir Karibai Europa Pietų ir Rytų Azija T ū k st a n č ia i
2.2.1 pav. Apskaičiuotasis 2010 metais 1TCD sirgsiančių 0–14 metų vaikų
skaičius pagal regionus [92]
Sergamumas šia liga įvairiose šalyse skiriasi net iki 400 kartų ir nuolatos didėja visame pasaulyje [195]. Esant tokiai didelei sergamumo įvairovei, šalys suskirstytos į labai mažo, mažo, vidutinio, didelio ir labai didelio sergamumo 1TCD šalis (2.2.1 lentelė) [91, 108].
2.2.1 lentelė. Sergamumo 1TCD lygmenys
Sergamumo 1TCD lygmuo
Atvejų skaičius /100 000 populiacijos vaikų per
metus Labai mažas <1 Mažas 1–4,99 Vidutinis 5–9,99 Didelis 10–19,99 Labai didelis ≥20
0–14 metų amžiaus vaikų sergamumas 1TCD pavaizduotas 2.2.2 paveiksle. Mažiausias sergamumas 1TCD išlieka Venesueloje 0,1/100 000 vaikų per metus, Kinijoje 0,73/100 000 vaikų per metus [91] ir Korėjoje 1,1/100 000 vaikų per metus [92]. Didžiausias sergamumas 1TCD yra Suo-mijoje – 64,2/100 000 vaikų per metus [69].
0,1 0,7 1,1 2,4 4,2 5,9 7,4 7,5 7,7 13,0 13,6 15,3 15,4 17,2 19,4 20,8 21,7 22,2 22,4 24,5 27,9 43,9 64,2 14,2 12,1 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 Venesuela Kinija Korėja Japonija Indija Čilė Karelijos sritis Latvija Brazilija Rusija Ispanija Slovakija Lietuva Lenkija Belgija Estija Vokietija JAV Kanada Danija Australija Jungtinė Karalystė Norvegija Švedija Suomija
Sergamumas (100 000 vaikų per metus) labai didelis
didelis
vidutinis
mažas
labai mažas
2.2.2 pav. 0–14 metų vaikų sergamumas 1TCD
Italijoje, Didžiojoje Britanijoje ir Suomijoje stebimi didžiausi sergamu-mo svyravimai šalies viduje [30]. Daugelyje šalių (Europoje, Vidurio Rytuose, Australijoje, Šiaurės Amerikoje) sergamumas 1TCD tarp vaikų didėja 2–5,5 proc. per metus [91, 139]. Pastebėta, kad daugiausia sergamu-mas didėja šalyse, kur yra mažesnis sergamumo lygmuo [52, 195]. Daugelyje populiacijų, kaip ir Lietuvoje, nėra stebima sergamumo skirtumų tarp lyčių [107, 214].
Nustatyta, kad didesnis sergamumas 1TCD yra 10–14 metų vaikų amžiaus grupėje. Tačiau Suomijos, Prancūzijos, Čilės, Estijos, Lenkijos ir kitų šalių mokslininkai rodo, kad greičiausiai sergamumas didėja 0–4 metų vaikų grupėje [14, 36, 69, 94, 206]. Pavyzdžiui, Vokietijoje 2 ir 3 metų amžiaus vaikų grupėje sergamumas didėja, atitinkamai 12 ir 13 proc. per metus [48]. Sergamumas 1TCD labiau didėja išsivysčiusiose šalyse. Pavyz-džiui, Suomijoje per pastaruosius 50 metų sergamumas 1TCD padidėjo daugiau kaip 5 kartus (2.2.3 pav.) nuo 12 iki 64,2 /100 000 vaikų per metus [69, 117]. 12,0 38,0 64,2 0 10 20 30 40 50 60 70 1953 m. 1990–1994 m. 2005 m. S er g am u m as ( 1 0 0 0 0 0 p er m et u s)
2.2.3 pav. 0–14 metų vaikų sergamumo 1TCD kitimas 1953–2005 metais
Suomijoje [69, 117]
Lietuvoje, kaip ir visame pasaulyje, vis daugiau vaikų suserga 1TCD. DIAMOND tyrimo duomenimis (1990–1999 m.), Lietuva buvo priskirta prie vidutinio vaikų sergamumo 1TCD šalių (5–9,99/100 000 vaikų per metus) [91]. Šiuo metu Lietuva jau priklauso didelio sergamumo 1TCD šalims ir sergamumas mūsų šalyje toliau nuolatos didėja.
5,49 6,4 8,15 7,79 8,78 14,29 14,16 0 2 4 6 8 10 12 14 16 1983 1987 1991 1995 1999 2003 2007 Metai S er g am u m as ( 1 0 0 0 0 0 p er m et u s)
2.2.4 pav. 0–14 metų vaikų sergamumo 1TCD kitimas Lietuvoje
1983–2007 metais [214]
0–14 metų vaikų sergamumo 1TCD kitimas Lietuvoje 1983–2007 metais pavaizduotas 2.2.4 paveiksle. Vaikų sergamumas 1TCD Lietuvoje didėja vi-dutiniškai 3,32 proc. per metus. Ryškiausiai sergamumas didėja tarp 0–4 metų vaikų [214]. Šalyse, kurios priklauso Baltijos jūros baseinui, sergamumas 1TCD labai įvairus. Artimiausiose kaimyninėse šalyse nusta-tytas sergamumas 1TCD: Latvijoje – 6,6/100 000 vaikų per metus (1998 metų duomenys) [166], Rusijoje Karelijos srityje – 7,4/100 000 (1990–1999 m.) [121] buvo panašus kaip Lietuvoje 1999 m. (8,8/100 000 vaikų per metus). Šiuo metu sergamumas 1TCD Lenkijoje 15,26/100 000 (2000–2005 m.) vaikų per metus [93] – panašus kaip Lietuvoje, o Estijoje sergamumas didesnis – 17,2/100 000 (1999–2006 m.) vaikų per metus [206]. Palyginant su kitų Baltijos jūros baseino šalių vaikų sergamumu – Suomijos (64,2/100 000 vaikų per metus) [69], Švedijos (43,9/100 000 vaikų per metus) [16], Norvegijos (22,7/100 000 vaikų per metus) [1], Danijos 22,0/100 000 vaikų per metus (1996–2005 m.) [204] ar Vokietijos (19,4/100 000 vaikų per metus) [48] Lietuvos vaikų sergamumas 1TCD – mažesnis 14,2/100 000 vaikų per metus [214].
Sergamumas 1TCD labai įvairuoja ne tik Europoje, bet ir visame pa-saulyje. Tokių didelių sergamumo skirtumų priežastys iki šiol nėra aiškios, ypač gana mažose geografinėse teritorijose.
2.3. Veiksniai, lemiantys 1 tipo cukrinio diabeto atsiradimą 2.3.1. Genetiniai veiksniai
Genai neabejotinai turi svarbią reikšmę 1TCD atsirasti. Nustatyta, kad sergančio 1TCD vaiko pirmosios eilės giminaičiams susirgimo rizika yra apie 6 procentai, tai yra apie 20 kartų didesnė nei bendros populiacijos, o monozigotiniam dvyniui susirgimo rizika yra net 30–50 proc. didesnė [6, 9, 96]. Į 1TCD atsiradimo procesą gali būti įtraukta keliolika genų [165]. 6p21 chromosomos trumpajame petyje yra genai, koduojantys HLA kompleksą, kuris sudarytas iš trijų regionų, tai yra I, II ir III klasių [102] (2.3.1.1 pav.).
2.3.1.1 pav. HLA regionas, esantis 6 chromosomos trumpajame petyje [145]
HLA I klasės antigenai turi HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F ir HLA-G lokusus. Jau apie 1970 metus buvo nustatytas, o vėliau ne kartą patvirtintas ryšys tarp 1TCD ir HLA I klasės A antigenų, paskui – HLA B8 ir B15 antigenų [82, 151, 154]. Pagrindinio audinių suderinamumo komp-lekso (MHC) I klasės regione yra ir MIC genų šeima. MIC genai turi tris tariamuosius genus: MIC-C, MIC-D ir MIC-E ir du funkcionuojančius genus MIC-A ir MIC-B. MIC-A geno polimorfizmas taip pat susijęs su padidėjusia 1TCD rizika ir jaunesniu susirgimo amžiumi [4].
HLA II klasės molekules koduoja DR, DQ, DP ir DM genai. Nustatytas ryšys tarp 1TCD ir HLA II klasės genų [208]. HLA II klasės genai lemia apie 50 proc. genetinės 1TCD rizikos. Nustatyti aleliai (genų formos), hap-lotipai (vienos chromosomos genų rinkiniai) ir genotipai (genų rinkiniai), kurie didina, yra neutralūs, mažina ar labai mažina susirgimo 1TCD riziką [119, 130, 186]. Remiantis tik serologine analize buvo nustatyta, kad
HLA-DR genas turi stipresnį ryšį su 1TCD nei HLA-B genas [164]. Vėliau, remiantis molekuliniais metodais, tarp HLA genų DQB1 geno aleliai buvo pripažinti, kaip turintys didžiausią reikšmę ligai atsirasti. Tačiau riziką neabejotinai lemia ir DQA1 bei DRB1 genų aleliai ir haplotipai [211]. Kaukazoidams (Europos, Šiaurės Amerikos ir kitose šalyse) susirgimo 1TCD riziką didina DR3-DQ2 ir DR4-DQ8 haplotipai, o riziką mažina DR2-DQ6 haplotipas [37, 76, 172, 186]. Naujausi tyrimai patvirtina, kad HLA DR3-DQ2/DR4-DQ8 genotipas yra susijęs su didžiausia 1TCD atsira-dimo rizika [78, 172, 186]. Haplotipai DQ8 (DQA1*0301-DQB1*0302) (74 proc.), DQ2 (DQA1*0501-DQB1*0201) (52 proc.) ir/arba abu yra nu-statyti 89 proc. kaukazoidų, susirgusių 1TCD iki 15 metų amžiaus [152]. Genetinę ligos riziką lemiantys HLA genų aleliai DR3, DR4, DQA1*0301, DQA1*0501, DQB1*0302 bei DQB1*0201 dažniau buvo nustatyti asme-nims, kurie 1TCD susirgo vaikystėje [131]. Vėlesniais tyrimais buvo nustatyta, kad jaunesniems nei penkerių metų vaikams didelę genetinę riziką lemiantis HLA DR3-DQ2/DR4-DQ8 genotipas nustatomas dažniau nei vyresniems vaikams [120]. Tai rodo, kad HLA turi svarbią reikšmę vaikų susirgimui 1TCD, ypač jaunesnio amžiaus vaikams. Genai, lemiantys sir-gimą 1TCD, skiriasi tarp įvairių etninių grupių ir populiacijų [76, 110, 160, 198]. Pavyzdžiui, Japonijoje, didžiausią susirgimo riziką lemia DRB1*0405-DQB1*0401 ir DRB1*0901-DQB1*0303 haplotipai [90, 110]. Tuo metu Korėjoje didžiausia susirgimo rizika siejama su DR3 ir DR9 haplotipais [160]. Keletas tyrėjų Japonijoje nustatė, kad DRB1*0901-DQB1*0303 haplotipas labiau paplitęs tarp vaikų, kurie labai anksti susirgo 1TCD, o DRB1*0405-DQB1*0401 haplotipas tarp vaikų, kurie 1TCD susir-go jau būdami vyresni [158, 202].
HLA II klasės genai ne tik didina, bet ir mažina susirgimo 1TCD riziką. HLA haplotipas DR2-DQ6(DQA1*0102-DQB1*0602) laikomas apsauginiu ir patikimai mažina susirgimo 1TCD riziką daugelyje kaukazoidų ir Azijos šalių populiacijų [31, 78, 118, 162]. Kiti apsauginiai haplotipai: (DR7)-DQA1*0201-DQB1*0303, (DR14)-DQB1*0503, (DR13)-DQB1*0603, (DR11/12/13)-DQA1*05-DQB1*0301, (DR1)-DQB1*0501 taip pat mažina susirgimo 1TCD riziką, tik skirtingai įvairiose populiacijose [31, 32, 62, 78, 118].
DRB1*1501-DQB1*0602 ((DR2)-DQB1*0602) haplotipas, kaip maži-nantis susirgimo 1TCD riziką, yra nustatomas ne tik Europos šalyse, bet ir Tunise, Libane bei Pietų Azijos šalyse, įskaitant ir Japoniją su Korėja. Tunise susirgimo 1TCD riziką dar mažina ir DRB1*0701-DQB1*0201 haplotipas [198]. Libane ir Bahreine apsauginiams haplotipams taip pat priklauso DRB1*0701-DQB1*0201 ir dar DRB1*1101-DQB1*0301 [3].
Korėjiečiams susirgimo 1TCD riziką mažina ne tik DR2, bet ir DR5 genų aleliai [160].
2.3.1.1 lentelėje pateikti HLA (DR)-DQA1-DQB1 haplotipai, didinantys ir mažinantys susirgimo 1TCD riziką kaukazoidų ir Azijos šalių populia-cijose.
2.3.1.1 lentelė. HLA (DR)-DQA1-DQB1 haplotipai, didinatys ir mažinantys
susirgimo 1TCD riziką kaukazoidų ir Azijos šalių populiacijose HLA DRB1(DR)-DQA1-DQB1 haplotipas Populiacijos Literatūros šaltinis Kaukazoidų Azijos šalių (DR1)-DQB1*0501 A A, retas [78, 110] (DR2)-DQA1*0102-DQB1*0602 A A [50, 78, 87, 110, 158, 160] (DR2)-DQA1*0103-DQB1*0601 – A [110, 158] (DR3)-DQA1*0501-DQB1*0201 R R, retas [7, 50, 78, 87, 160] DRB1*0401/02/04/05-DQA1*0301-DQB1*0302 R R, retas [7, 50, 78, 87, 158] DRB1*0403-DQA1*0301-DQB1*0302 A A [50, 78, 158] DRB1*0406-DQA1*0301-DQB1*0302 – A [110] DRB1*0405-DQB1*0401 retas R [50, 87, 110] (DR5) – A [160, 160] (DR7)-DQA1*0201-DQB1*0303 A retas [50, 78] (DR8)-DQA1*0301-DQB1*0302 – R [110, 158] (DR9)-DQA1*0301-DQB1*0303 R, NS R [50, 87, 110, 158] (DR11)-DQA1*0501-DQB1*0301 A A, NS [7, 50, 78] DRB1*1301-DQA1*0103-DQB1*0603 A, NS A, NS [78] DRB1*14-DQA1*0101-DQB1*0503 A A [50, 78, 110]
A – mažinantys susirgimo 1TCD riziką (apsauginiai) haplotipai; R – didinantys susirgimo 1TCD riziką (rizikos) haplotipai, NS – statistiškai nereikšminga.
HLA III klasės regionas koduoja keletą molekulių, kurios atlieka tam tikras funkcijas, tai: komplemento (C) sudedamosios dalys (C4A, C4B, B veiksnys ir C2), alfa navikų nekrozės veiksnys (TNF-α) ir beta navikų nekrozės veiksnys (TNF-β) bei 21-hidroksilazės genai (CYP21P ir CYP21) [147]. Tyrimais nustatyta, kad komplemento stoka (C4A/C4B) gali būti susijusi su padidėjusia 1TCD rizika bei jaunesniu susirgimo amžiumi asmenims, turintiems DR3/DR4 genotipą. Šiuo metu ieškoma 1TCD rizikos sąsajų ir su kitais HLA III klasės regiono genais [217].
Pastaruoju metu buvo tiriama daugybės kitų (ne HLA II klasės) genų sąsajos su 1TCD [5, 83, 144], tačiau tik su keletu iš jų pavyko nustatyti ryšį (2.3.1.2 lentelė). Daugeliu tyrimų buvo įrodyta, kad HLA II klasės ir dar penki genai (2.3.1.2 lentelė) yra patikimai susiję su 1TCD rizika skirtingose populiacijose. Tyrinėjant žmogaus genomą buvo nustatyta daugybė vieno nukleotido polimorfizmo (SNP) atvejų.
2.3.1.2 lentelė. Genai, susiję su 1TCD rizika
Lokusas Chromosoma Genas Funkcija/mechanizmas
IDDM1 6p21 HLA II klasė (DRB1,
DQA1, DQB1)
Antigeno pateikimas
IDDM2 11p15 INS Antigenui savitų T
limfocitų atrinkimas
IDDM5 6q25 SUMO4 NF-kB ir citokinų kontrolė
IDDM10 10p11-q11 IL-2Rβ T limfocitų aktyvinimas
IDDM12 2q33 1p13 CTLA4 PTPN22 T limfocitų aktyvumo reguliacija IDDM18 5q31-33 6p21 IL12B ITPR3 Ikiuždegiminiai citokinai Insulino išsiskyrimas NF-kB – (angl. nuclear factor kB) branduolio veiksnys kB.
Parengta pagal Purohit S. ir She J.X. [168].
Insulino geno (INS)-VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) regiono SNP yra patikimai susijęs su 1TCD atsiradimu tarp kaukazoidų populiacijų [80, 170, 233]. INS yra 11p15 chromosomoje, INS-VNTR aleliai lemia apie 10 proc. genetinės 1TCD rizikos. INS-VNTR I klasės aleliai didina 1TCD riziką, o INS-VNTR III klasės aleliai – mažina riziką ne tik kaukazoidų, bet ir japonų populiacijoje [88, 167].
Citotoksinių T limfocitų 4 antigenas (CTLA4) yra koduojamas geno, esančio 2q33 chromosomoje. CTLA4 turi CD4+ ir CD8+ T limfocitai. CTLA4 slopina limfocitų vešėjimą ir citokinų gaminimą. Manoma, kad CTLA4 svarbus reguliuojant savo audinių toleravimą ir apsaugant nuo auto-imuniteto atsiradimo [61]. CTLA4 geno SNP gali padidinti T limfocitų reaktyvumą ir lemti autoimuninių ligų, tarp jų ir 1TCD, atsiradimą kau-kazoidams [210]. Azijos populiacijose nepavyko nustatyti tiesioginio ryšio tarp CTLA4 ir 1TCD rizikos [86].
PTPN22 genas yra 1p13 chromosomoje, jis koduoja baltymą PTPN22 – limfocitams savitą tirozinfosfatazę N22. Atlikus gyvūnų tyrimus buvo įrodyta, kad genas, analogiškas žmogaus PTPN22 genui, slopina antigenams savitų T limfocitų aktyvinimą, slopindamas (blokuodamas) T limfocitų receptorius [71]. Limfocitams savita tirozinfosfatazė N22 jungiasi su onko-genine tirozinkinaze. Šis kompleksas slopina T limfocitų receptorius ir taip
mažina T limfocitų aktyvinimą [150]. PTPN22 R620W genas ir 1123 G>C SNP susijęs su 1TCD ir kai kuriomis kitomis autoimuninėmis ligomis – reumatoidiniu artritu, sistemine raudonąja vilklige ir Greivso liga kauka-zoidų populiacijose [29, 226]. Tačiau Azijos šalyse nustatytas ryšys tik tarp 1TCD ir PTPN22 1123 G>C SNP [111].
2005 metais Vella ir kt. paskelbė, kad 10p15 chromosomoje esantis IL2RA genas, koduojantis interleukino (IL)-2 receptorių alfa regioną, yra susijęs su 1TCD atsiradimu [221]. Šie receptoriai atsakingi už IL-2 suri-šimą. IL-2 turi didelę įtaką reguliuojant T limfocitų vešėjimą. Vėliau buvo nustatyti du SNP atvejai, susiję su 1TCD rizikos padidėjimu [169].
Neseniai buvo patvirtinta, kad SUMO4 M55V geno, esančio 6q25 chromosomoje, polimorfizmas yra patikimai susijęs su 1TCD atsiradimu Azijos populiacijose, bet nėra susijęs kaukazoidų populiacijose [88, 190].
Daugelyje Europos ir pasaulio šalių aktyviai tiriami genai, didinantys ir mažinantys susirgimo 1TCD riziką [126, 131, 149], nustatomas jų papli-timas skirtingo sergamumo šalyse [163]. Pradedama tyrinėti ir daugybės kitų genų galima įtaka 1TCD atsirasti [89].
Iki šiol Lietuvoje: buvo nustatytas tik (DR4)-DQA1*0301-DQB1*0302 ir (DR3)-DQA1*0501-DQB1*0201 haplotipų dažnis sergančių 1TCD vaikų populiacijoje ir šių haplotipų paveldėjimo dažnis [183].
1TCD yra susijęs su keletu genų grupių. HLA II klasės genai lemia daugiau kaip pusę genetinės 1TCD rizikos. HLA (DR3)-DQA1*0501-DQB1*0201 ir HLA (DR4)-DQA1*0301-DQB1*0302 haplotipai yra susiję su didžiausia 1TCD rizika, o HLA (DR2)-DQA1*0102-DQB1*0602 haplo-tipas mažina 1TCD riziką kaukazoidų populiacijose.
2.3.2. Aplinkos veiksniai
Nustatyta, kad 1TCD suserga apytiksliai tik 10 proc. individų, turinčių didžiausią susirgimo riziką lemiančius HLA genus. Vadinasi, genetiniai veiksniai yra būtina, bet nepakankama sąlyga 1TCD atsirasti. Reikalingi ir kiti papildomi veiksniai, kurie kartu su genetiniais paleistų 1TCD atsiradimo mechanizmą [116]. Manoma, kad didelę įtaką ligos etiologijai turi 1TCD rizikos genų ir tam tikrų aplinkos veiksnių derinys [27].
Kita teorija teigia, kad toks greitas sergamumo 1TCD didėjimas visame pasaulyje negali būti paaiškinamas vien genetiniais populiacijų skirtumais [58, 77, 220]. Priežasčių reikia ieškoti aplinkoje arba aplinkos ir genų sąveikoje. Manoma, kad sergamumą 1TCD lemia ne tik genetiniai, bet aplinkos ir genetinių veiksnių sąveika. Aplinkos veiksniai gali lemti ir/ar pagreitinti jau prasidėjusį autoimuninį beta ląstelių irimą.
Aplinkos veiksniai skirstomi į prenatalinius (nėštumo metu: motinos mityba, persirgtos infekcijos, nervinė įtampa, vartoti vaistai, kraujo grupių nesuderinamumas, toksikozė), perinatalinius (gimimo svoris, cezario pjūvio operacija, mamos amžius, vaiko gimimo šeimoje eiliškumas), postnatalinius veiksnius (natūralus maitinimas, karvės pienas, vitaminas D, kiti maisto produktai (kiaušiniai, grūdai), persirgtos užkrečiamosios ligos, socialiniai veiksniai, nervinė įtampa ir kt.) [138]. Aplinkos veiksnių, dažniausiai minimų mokslo tyrimuose, įtaka 1TCD rizikai pateikta 2.3.2.1 lentelėje.
Greitai didėjantis 0–4 metų vaikų sergamumas [14, 69, 206, 214] leidžia manyti, kad dar nėštumo metu vaisių veikiantys veiksniai gali turėti įtakos 1TCD atsirasti. Atlikta daug tyrimų, kuriais bandyta nustatyti, ar motinos infekcijos nėštumo metu, rūkymas nėštumo metu, motinos ir naujagimio kraujo grupių nesuderinamumas, nėštumo toksikozė, priešlaikinis gimdy-mas, naujagimio gimimo svoris, cezario pjūvio operacija, ir naujagimio ligos gali didinti susirgimo 1TCD riziką [35, 39, 41, 143].
Kūdikio augimas pirmaisiais metais ir ypač greitas svorio prieaugis yra veiksniai, galintys turėti įtakos kasos beta ląstelių pažeidimui [2, 100]. Keletas tyrimų įrodė, kad kūdikiai, kurie nebuvo natūraliai maitinami, greičiau priaugo svorio per pirmuosius gyvenimo metus, nei natūraliai maitinti kūdikiai. Tai gali paaiškinti apsaugantį motinos pieno mechanizmą nuo 1TCD atsiradimo [100].
Naujagimio ir kūdikio mitybos svarba 1TCD patogenezei yra neabe-jotina. Trumpas natūralus maitinimas, kaip ir ankstyvas karvės pieno vartojimas, gali didinti susirgimo 1TCD riziką [42, 229, 230]. Buvo atlikta tyrimų, kurie patvirtino, kad ne tik anksti pradėtas vartoti karvės pienas, bet ir išgeriamas didelis karvės pieno kiekis taip pat gali didinti 1TCD riziką [20, 229]. Kiti mokslininkai mano, kad šie veiksniai neturi reikšmės ligai atsirasti [171].
Kai kurie tyrimai nurodo, kad ir kietųjų produktų – grūdų, kiaušinių – bei vitamino D ankstyvas vartojimas gali turėti įtakos vaikų 1TCD atsirasti [155, 228, 240].
Socialiniai veiksniai – mamos ir tėvo išsilavinimas, darbovietė, gyvena-moji vieta – turi įtakos gyvensenai, įpročiams, žinioms apie sveikatą ir tokiu būdu gali lemti ligos atsiradimą [21, 103, 135]. 1TCD atsirasti įtakos turi ir rūkymas vaiko aplinkoje [97].
2.3.2.1 lentelė. Veiksniai, susiję su 1TCD rizika Veiksnys Tyrimo vieta Vaikų skaičius. 1TCD/ kontroliniai
ŠS (95 proc. PI) Pirmas autorius, literatūros šaltinis
Nėštumo toksikozė Jungtinė
Karalystė
315/1525 1,48 (1,05–2,10) Jones M.E., [101]
Nėštumo toksikozė 7 centrai
Europoje
892/2291 1,49 (1,11–1,99) Dahlquist G., [43]
Nėštumo toksikozė Jungtinė
Karalystė 196/325 1,6 (1,01–2,54) McKinney P.A., [143] Kraujo grupių nesuderinamumas 7 centrai Europoje 892/2291 3,78 (2,17–6,58) Dahlquist G., [43] Cezario pjūvio operacija 20 centrų Europoje ir Kinija 9938 1,23 (1,15–1,32) Cardwell C.R., [35] Natūralus maitinimas ≥3 mėn. 20 centrų Europoje ir Kinija 3874 0,84 (0,72–0,98) Cardwell C.R., [35] Natūralus maitinimas ≥5 mėn. Vokietija 760/1871 0,57 (0,45–0,72) Rosenbauer J., [176] Natūralus maitinimas Italija 100/100 0,41 (0,19–0,91) Meloni T., [146] Natūralus maitinimas Jungtinė Karalystė 196/325 0,65 (0,45–0,94) McKinney P.A., [143] Karvės pieno vartojimas ≥3 mėn. Danija 602/1490 0,7 (0,4–0,9) Svensson J., [203] Karvės pieno vartojimas <3 mėn. Australija 217/258 1,52 (1,04–2,24) Verge C.F., [223] Vitamino D vartojimas 7 centrai Europoje 820/2335 0,67 (0,53–0,86) EURODIAB, [207]
Nervinė įtampa Graikija 107/153 2,49 (1,14–5,42) Karavanaki K.,
[104]
Nervinė įtampa Švedija 338/528 1,82 (1,09–3,03) Hagglof B., [65]
Skiepai: MMR AKDS Hib B hepatitas JAV 252/768 1,36 (0,70–2,63) 0,28 (0,07–1,06) 1,14 (0,51–2,57) 0,81 (0,52–1,27) DeStefano F., [45]
Skiepai: MMR Italija 136/272 0,38 (0,20–0,80) Altobelli E., [8]
Skiepai: tymai Švedija 339/528 0,69 (0,48–0,98) Blom L., [22]
Virusinės infekcijos per 1 gyvenimo metus Jungtinė Karalystė 367/4579 1,03 (0,79–1,34) CardwellC.R., [33] Virusinės infekcijos, pastaruosius 3 mėn. Australija 217/258 2,92 (1,96–4,35) Verge C.F., [223] Virusinės infekcijos, >2 infekcijos
Nervinė įtampa – tai aplinkos veiksnys, galintis didinti susirgimo 1TCD riziką. Keli tyrimai patvirtino, kad trumpalaikė nervinė įtampa ankstyvoje vaikystėje ar pusė metų iki ligos yra susijusi su padidėjusia susirgimo 1TCD rizika [65, 174]. Švedų mokslinikai nustatė, kad psichologinė įtampa gali ne tik pagreitinti diabeto atsiradimą, bet ir nulemti autoimuninius procesus, susijusius su 1TCD atsiradimu [193].
Daug epidemiologinių tyrimų rodo skiepų ir virusinių infekcijų svarbą 1TCD patogenezei [45, 106, 132]. Iki šiol nėra vienos nuomonės dėl skiepų. Vieni mokslininkai teigia, kad skiepai apsaugo nuo 1TCD atsiradimo [8, 85]. Kiti autoriai neabejoja, kad skiepai didina susirgimo riziką [106], o tretieji mano, kad skiepai neturi įtakos susirgimo 1TCD rizikai [45, 53].
Virusinės infekcijos šiuo metu yra laikomos vienu iš realiausių aplinkos veiksnių, didinančių susirgimo 1TCD riziką. Tai infekcijos, kurias sukelia enterovirusai, raudonukės, kiaulytės virusai, rotavirusai ir citomegalovirusai ir kt. [79, 132, 218]. Vieni virusai nurodomi kaip tiesioginė 1TCD priežas-tis, nes sukelia tiesioginį kasos beta ląstelių pažeidimą ir mirtį. Kiti virusai paleidžia imunopatogenetinius mechanizmus sukelia, T limfocitų reaktyvu-mą ir citokinų gamybą, nulemiančią 1TCD [84]. Treti virusai, turintys baltymų, panašių į žmogaus baltymus (mimikrija), žmogaus organizme pradeda autoimuninius procesus [70].
„Higienos hipotezė“ teigia, kad imuninei sistemai subręsti reikalinga stimuliacija [56]. Vadinasi, ankstyvoje vaikystėje nepaveikus infekciniams veiksniams gali didėti imuninės sistemos nesubrendimo, o vėliau – ir 1TCD atsiradimo rizika [33]. Kiti mokslinikai teigia, kad virusų sukeltas ląstelinis imunitetas ir uždegimas gali pažeisti tam tikrus organus ir sukelti auto-imuninių procesų pradžią organizme [24, 218]. Anglų mokslininkai nustatė, kad vienkartinės virusinės infekcijos neturi įtakos 1TCD atsirasti [59].
Atlikus tyrimą Lietuvoje buvo nustatyta, kas 1TCD riziką didina trumpa natūralaus maitinimo trukmė [95, 181] bei ankstyvas kiaušinių, mėsos ir vitamino D vartojimas [95]. Vaikų susirgimo 1TCD riziką taip pat didina vaiko gyvenimas kaime, užkrečiamosios ligos ir nervinė įtampa šešis mėnesius iki ligos diagnozavimo. 1TCD riziką mažino persirgti vėjaraupiai, raudonukė ar skiepijimas kiaulytės vakcina [95].
Skirtingų šalių mokslininkai, tyrinėję aplinkos veiksnių įtaką 1TCD atsirasti, nustato prieštaringus rezultatus, tačiau aplinkos veiksniai neabejotinai turi įtakos 1TCD rizikai.
2.4. 1 tipo cukrinis diabetas ir autoantikūnai 2.4.1. 1 tipo cukrinio diabeto patogenezė
Kasoje yra 100 tūkstančių – 2,5 milijonų Langerhanso salelių. Langer-hanso salelėse 70–90 proc. endokrininių ląstelių sudaro beta ląstelės. Endo-krininės kasos Langerhanso salelių ląstelės gamina gliukagoną, somatosta-tiną ir kasos polipeptidą. Kasos Langerhanso salelių beta ląstelės gamina proinsuliną, iš kurio veikiant fermentams – prohormono konvertazei ir karboksipeptidazei – bei atskilus C peptidui susidaro insulinas [199].
Imuninė sistema – tai organų ir audinių sistema, sauganti organizmą nuo kenksmingų mikroorganizmų, svetimų baltymų ir kitokių svetimkūnių. Imuninės sistemos ląstelės taip pat padeda atsikratyti užkrėstų, senų ar sergančių organizmo ląstelių, įskaitant vėžines ląsteles. Norėdama apsaugoti organizmą nuo „svetimo“, imuninė sistema turi atpažinti skirtumus tarp „savo“ ir „svetimo“. Sutrikus atpažinimo vyksmui, prasideda ataka prieš sa-vo audinius ir organus – autoimuninė reakcija, kuri juos pažeidžia. Prasideda
autoimuninė liga.
1TCD yra autoimuninė liga, kurią sukelia atrankus (selektyvus) kasos salelių beta ląstelių irimas [12]. Šio pažeidimo priežastis buvo neaiški, kol nebuvo atrasti ICA. Vėliau buvo nustatyti kiti autoantikūnai, kurie gaminosi prieš kasos autoantigenus – glutamo rūgšties dekarboksilazę (GAD, angl. glutamic acid decarboxylase), baltymą tirozinfosfatazę (IA-2, angl. protein thyrosine phosphatase) ir insuliną [136]. Pastaruoju metu nustatytas dar vienas galimas autoantigenas – tai kasos beta ląstelėms savitas cinko perkė-liklis 8 (ZnT-8, angl. zinc transporter 8) ir antikūnai prieš jį (ZnT-8A, angl. zinc transporter 8 autoantibodies) [235]. Autoantikūnai patys tiesiogiai nepažeidžia kasos beta ląstelių. Jie laikomi 1TCD ligos žymenimis.
Autoimuninį organizmo procesą, sukeliantį autoantikūnų gamybą, gali nulemti genetiniai ar aplinkos veiksniai (2.4.1.1 pav.).
Iš genetinių veiksnių labai svarbūs HLA II klasės genai. HLA II klasės genų koduojamos molekulės yra ląstelių paviršiuje ir dalyvauja pateikiant kasos ląstelių antigenus (CD4+) T limfocitams.
Kiti genai (INS-VNTR, CTL4, PTPN22, IL2RA, SUMO4 ir kt.) sutrikdo imuninę reguliaciją ir todėl susergama 1TCD.
2.4.1.1 pav. Autoimuninio 1 tipo cukrinio diabeto patogenezė [127] Iš aplinkos veiksnių neabejotinai svarbi virusinių infekcijų įtaka. Virusai yra absoliutieji ląstelės parazitai, kurie dauginasi užkrėstose ląstelėse. Todėl galutinis imuniteto tikslas yra pašalinti virusą ir ląsteles – kaip viruso šaltinį. Organizme su virusine infekcija kovoja ir humoralinis, ir ląstelinis imunite-tai. Humoralinis imunitetas naikina virusus, dar nepatekusius į ląsteles. Infekcija sukelia antikūnų, pirmiausia IgM vėliau IgA ir IgG, gamybą. Ląstelinis imuninis atsakas naikina virusais užkrėstas ląsteles. Pagrindinės ląstelinio atsako ląstelės – (CD4+) T limfocitai ir citotoksiniai (CD8+) T
limfocitai [236]. Apsaugos nuo virusų mechanizmai gali sukelti ir nepagei-daujamas reakcijas, tarp jų ir imunopatologines.
Keletas virusinių infekcijų yra susijusios su 1TCD atsiradimu. Manoma, kad yra keletas mechanizmų, kaip virusai pažeidžia kasos beta ląsteles [218]. Pirmasis – virusai gali tiesiogiai pažeisti kasos beta ląsteles. Antrasis
mechanizmas – kasos beta ląsteles gali pažeisti antikūnai, susidarę prieš vi-rusus (dėl antigenų mimikrijos). Pavyzdžiui, Koksakio virusai turi antigenų, labai panašių į kasos beta ląstelių fermentą – GAD. Tokiais atvejais dėl kryžminio reaktyvumo kasos beta ląstelės tampa citotoksinių T ir B limfocitų taikiniais. Prasideda autoimuninis mechanizmas, sukeliantis 1TCD [147]. Trečia, virusinė infekcija gali aktyvinti T limfocitus, tarp jų ir autorektyviuosius T limfocitus, kurie veikia kasos beta ląsteles [218].
2.4.1.1 pav. aplinkos veiksniai suskirstyti į dvi dideles grupes – mikro-biologiniai ir cheminiai bei kiti. 1TCD patogenezei neabejotinai svarbi ir kitų aplinkos veiksnių įtaka, pavyzdžiui, naujagimio mityba (susirgimo rizi-ką didina trumpa natūralaus maitinimo trukmė ir ankstyvas karvės pieno vartojimas), psichologiniai, socialiniai ir ekonominiai veiksniai [176, 205].
Remiantis gyvūnų tyrimų duomenimis nustatyta, kad prasidėjus auto-imuniniam procesui kasos salelėse atsiranda makrofagų, T limfocitų: citotoksinių (CD8+) T limfocitų ir pagalbininkų (CD4+) T limfocitų, B lim-focitų bei ląstelių žudikių. Autoimuninis procesas aktyvina T limfocitus, kurie veikia kasos beta ląstelių autoantigenus. (CD4+) ir (CD8+) T limfoci-tai tiesiogiai pažeidžia kasos beta ląsteles, limfoci-taip pat gamina citokinus ir laisvuosius radikalus, kurie sukelia programuotą beta ląstelių mirtį – apop-tozę [127].
Antigenus pateikiančių ląstelių (APL) II klasės HLA molekulės pateikia kasos beta ląstelių savituosius autoantigenus (CD4+) T limfocitams. Makrofagai išskiria IL-12, kuris skatina (CD4+) T limfocitus. (CD4+) T limfocitai išskiria INF-γ ir IL-2. INF-γ skatina kitus makrofagus, kurie aktyvina citokinus (IL-1, TNF-α) ir laisvuosius radikalus. Citokinai ir lais-vieji radikalai yra toksiški kasos beta ląstelėms. Citokinai sukelia beta ląste-lėms savitų (CD8+) T limfocitų judėjimą. APL HLA I klasės molekulės pa-teikia beta ląsteles (CD8+) T limfocitams, kurie sukelia jų pažeidimą ir apoptozę.
Citokinų pusiausvyros sutrikimas turi didelę įtaką cukriniam diabetui atsirasti. (CD4+) T limfocitai pagalbininkai skiriami į (CD4+) T limfocitus pagalbininkus (Th) 1 ir Th2. Th1 ląstelės išskiria IFN-γ ir IL-2, skatina ląstelinį imunitetą. Tuo metu Th2 ląstelės gamina IL-4, IL-10 ir mažina Th1 ląstelių aktyvumą. Jos daugiausia yra susijusios su humoraliniu imunitetu. Imuninis atsakas pats save reguliuoja išlaikydamas pusiausvyrą tarp Th1 ir Th2 ląstelių gaminamų citokinų. Manoma, kad Th1 ląstelės skatina cukrinio
diabeto atsiradimą, o Th2 ląstelės apsaugo. Vadinasi, Th2 stoka gali suteikti galimybę suardyti beta ląsteles ir sukelti cukrinį diabetą [109].
Kasos pažeidimas tiesiogiai susijęs su autoimuninio proceso trukme. Ligos pradžioje kasos dydis būna nepakitęs, vėliau kasos dydis ir svoris mažėja, jos liaukinis audinys perauga jungiamuoju, atsiranda tarpaudininė fibrozė. Jau ligos pradžioje pablogėja beta ląstelių funkcija, paskui sumažėja jų skaičius ir galiausiai kasos beta ląstelių nelieka.
Daugumai pacientų nustatomos keturios 1TCD stadijos: 1. Ikidiabetinė būklė.
2. Klinikinio diabeto pradžia. 3. Laikinasis ligos atoslūgis.
4. Nustatytas diabetas ir ūminės ar lėtinės komplikacijos [128].
Ikidiabetinė būklė – tai 1TCD stadija: kasos salelės yra infiltruotos makrofagais ir limfocitais, o kraujyje cirkuliuoja autoantikūnai – IAA, GADA, IA-2A ir ICA. Šios stadijos metu pažeista mažiau kaip 80 proc. kasos beta ląstelių ir dar nėra klinikinių diabeto požymių, sukeliamų insulino stokos. Ikidiabetinės būklės trukmė labai įvairi: keli mėnesiai (dažniau kūdikiams ir mažiems vaikams) – daugiau kaip 10 metų [115]. IAA, GADA, IA-2A ir ICA autoantikūnai yra laikomi autoimuninio proceso žymenimis. Didelių šių autoantikūnų titrų nustatymas yra patikimas autoimuninio proceso ir ikidiabetinės būklės žymuo. Klinikinių požymių atsiradimas rodo ikidiabetinės būklės pabaigą ir klinikinio cukrinio diabeto pradžią. Klinikinis 1TCD dažniausiai atsiranda mirus 80–90 proc. kasos beta ląstelių [12].
Vieno ar kelių autoantikūnų nustatymas sveikam (nesergančiam CD) tiriamam individui yra siejamas su padidėjusia 1TCD rizika. Tyrimais įrodyta, kad nustatytų autoantikūnų skaičius tiesiogiai susijęs su 1TCD atsiradimo tikimybe 1TCD sergančių pacientų šeimos nariams ir bendrai populiacijai [239]. Tiriamajam nustatyti trys ar keturi autoantikūnai didino cukrinio diabeto atsiradimo tikimybę 60–100 proc. per 5–10 metų [19].
Stebėjimo tyrimai atlikti pirmosios eilės cukriniu diabetu sergančių pacientų giminaičiams ir sveikiems vaikams parodė, kad 1TCD rizika tiesio-giai susijusi su nustatytų autoantikūnų skaičiumi [222, 237]. Bingley ir kt., tirdami 1TCD sergančių vaikų šeimos narius, nustatė, kad jei sveikam šeimos nariui nustatyti 3 ar 4 autoantikūnai, susirgimo rizika per 5–10 metų
padidėja iki 60–100 proc. [115]. Pirmosios eilės giminaičiams dažniausiai nustatomas didesnis autoantikūnų skaičius [196]. Jiems dažniau nustatomi GADA (6,3 proc.) ir IA-2A (4,4 proc.) [192] nei sveikiems populiacijos nariams. Tiriant 1TCD sergančių vaikų pirmosios eilės giminaičius buvo nustatyta, kad antikūnų dažniai didesni tarp brolių, seserų nei tarp tėvų, atitinkamai GADA 8,0 ir 4,5 proc., IA-2A 4,5 ir 1,9 proc. [191].
Vieno iš autoantikūnų nustatymas rodo, kad autoimuninis procesas yra dar nežalingas ir neprogresuoja, o dviejų ir daugiau – procesas jau progre-suoja ir tik retais atvejais gali regresuoti [116]. IAA, GADA ir IA-2A tyrimas gali turėti reikšmės gydytojui praktikui diagnozuojant ir stebint 1TCD eigą pacientams [55, 148].
Autoimuniai procesai kasoje gali prasidėti labai anksti vaikui ar net prenataliniu laikotarpiu. Didžiausi autoantikūnų dažniai nustatomi 3 mėne-sių – 3 metų vaikams, nors didžiausias vaikų sergamumas 1TCD stebimas paauglystėje. Tai tik patvirtina, kad ikidiabetinė būklė trunka keletą metų [68, 113].
Genetiniai ir aplinkos veiksniai gali sukelti autoimuninius mecha-nizmus organizme, o tai gali lemti autoimuninio 1TCD atsiradimą.
2.4.2. 1TCD imuniniai žymenys
Antikūnai prieš insuliną. IAA yra nustatoma 64,5 proc. naujai susir-gusių 1TCD vaikų, apie 20 proc. susirsusir-gusių 1TCD suaususir-gusių pacientų [170] bei apie 0,9 proc. sveikų vaikų populiacijoje [122, 129].
IAA pasigamina pirmieji ir dažniau nustatomi mažiems vaikams (iki 5 metų) ikidiabetinėje ligos stadijoje [113]. Šių antikūnų nustatymas įrodo prasidėjusį kasos beta ląstelių irimą. Vieni tyrėjai teigia, kad IAA daž-niausiai nustatomi vaikams, susirgusiems 1TCD jaunesniems nei 5 metai [25]. Kiti – didžiausias IAA dažnis (62 proc.) vaikams iki 10 metų, didėjant amžiui dažnis mažėja [179]. Tačiau visi tyrimai įrodo, kad IAA dažnesni vaikams, o didėjant amžiui IAA dažnis mažėja [80, 170, 219]. Didesni IAA titrai nustatomi jaunesnio amžiaus žmonėms [179]. IAA susiję ir su lytimi. Nustatyta, kad IAA dažniau nustatomi mergaitėms ir moterims nei vyriš-kosios lyties individams [113].
Antikūnai prieš glutamo rūgšties dekarboksilazę. GADA yra nu-statoma 70–90 proc. naujai susirgusių 1TCD pacientų (vaikų ir suaugusių), 7,4 proc. pirmosios eilės giminaičių [196] ir 0,5 proc. sveikų vaikų populiacijos [122, 129]. Šis autoantikūnas dažniau nustatomas vyresnio amžiaus vaikams. GADA dažnis didžiausias tarp vaikų, vyresnių nei 10 metų [178, 179].
Estijos mokslininkai nustatė, kad jaunesniems nei 15 metų vaikams, ser-gantiems 1TCD, GADA dažnis yra 83,9 proc. ir didėjant amžiui mažėja [170].
GADA ir didesni jų titrai dažniau nustatomi mergaitėms ir moterims [113,224]. Nustatyta, kad didesni GADA titrai dažniau nustatomi vyres-niems vaikams ar suaugusiems žmonėms [179].
Čekų tyrime buvo nustatyta, kad GADA antikūnų nustatymas susijęs su HLA DRB1*03 alelio turėjimu, tačiau GADA antikūnų nebuvimas nebuvo susijęs su jokiu HLA DRB1*03 aleliu [156]. Panašius rezultatus nustatė Krokowski ir kt. [125] bei Caillat-Zucman ir kt. [32].
Antikūnai prieš baltymą tirozinfosfatazę. IA-2A nustatomi 55–79
proc. 1TCD susirgusių vaikų ir apie 48 proc. suaugusių pacientų [74, 179]. Broliams ir seserims IA-2A antikūnų dažnis 5,2 proc. [196]. Sveikos popu-liacijos vaikams autoantikūnų dažnis 0,6 proc. [122, 129]. Šie antikūnai, dažniau nustatomas vaikams, anksti susirgusiems 1TCD (jaunesnio amžiaus) [179]. IA-2A antikūnų nustatymas gali būti siejamas su greitu 1TCD progresavimu [38].
Estai nustatė, kad jaunesniems nei 15 metų vaikams, sergantiems 1TCD, IA-2A dažnis siekia 80,6 proc. ir matams bėgant mažėja [170].
IA-2A dažniau nustatomi mergaitėms ir moterims nei vyriškosios lyties individams [113]. IA-2A titrai nuo paciento amžiaus nepriklauso [113, 179]. Suomijos mokslininkai nustatė sąsajas tarp IA-2A dažnio ir didesnių titrų bei DRB1*04-DQB1*0302 haplotipo [140].
Antikūnai prieš kasos saleles. ICA buvo pirmasis autoantikūnas, nustatytas sergantiems 1TCD pacientams. Susirgus cukriniu diabetu, dau-giau nei 70 proc. pacientų nustatoma ICA [28]. ICA antikūnai ir susirgimo 1TCD diabetu amžius siejami įvairiai. Vieni tyrėjai nurodo, kad pacientai, kuriems nustatyti ICA antikūnai, susirgo jaunesni nei tie, kuriems nenusta-tyti ICA [179, 216]. Estai nustatė, kad jaunesniems nei 15 metų vaikams, sergantiems 1TCD, ICA dažnis 67,7 proc. ir didėjant amžiui mažėja [170]. Kiti mokslininkai, atlikę tyrimus, gavo priešingus rezultatus [73]. Treti mano, kad ICA dažnis toks pats tarp suaugusiųjų ir vaikų [105].
Estijos mokslininkai nustatė, kad antikūnų skaičius ir amžius turi neigia-mąją koreliaciją. Tris ar daugiau autoantikūnus turėjo, atitinkamai 71,0 proc. <15 metų, 45,5 proc. 15–30 metų ir 28,6 proc. >30 metų amžiaus 1TCD ser-gančių pacientų [170]. Panašius rezultatus nustatė ir Suomijos mokslininkai
– 70 proc. vaikų ir 36 proc. suaugusiųjų nustatyti trys ar daugiau autoanti-kūnai [179].
Anglijos mokslininkai nustatė tiesioginį ryšį tarp antikūnų titro ir ligos sunkumo [137].
Autoantikūnai IAA, GADA, IA-2A ir ICA laikomi 1TCD imuniniais žymenimis. Jie atsiranda dar ikidiabetinės būklės metu. Dažniau nusta-tomi vaikams. Autoantikūnų dažnis didesnis tarp pirmosios eilės gimi-naičių nei sveikos populiacijos.
2.4.3. Autoantikūnai, ikidiabetinė būklė ir aplinkos veiksniai
Pradinis cukrinio diabeto periodas, atsirandus pirmiesiems kasos beta ląstelių pažeidimams, vadinamas ikidiabetine būkle [128]. Autoantikūnų IAA, GADA, IA-2A ir ICA nustatymas kraujyje yra susijęs su padidėjusia 1TCD atsiradimo rizika, ypač ligonių, sergančių cukriniu diabetu, pirmosios eilės giminaičiams [26], paaugliams [185] ir labai mažiems vaikams [120]. Kai kurie autoriai teigia, kad ICA nustatymas, labiau nei kitų autoantikūnų, yra susijęs su cukrinio diabeto atsiradimu [238].
ICA dažnis tarp sveikų vaikų ir pirmosios eilės giminaičių yra didesnis nei naujų susirgimų 1TCD dažnis. Vadinasi, kai kuriems asmenims ikidia-betinė būklė niekada nepereina į diabetą [115].
1TCD lemia genetinė rizika ir aplinkos veiksniai. Aplinkos veiksniai, dažniausiai siejami su 1TCD atsiradimu yra – trumpas natūralus maitinimas, ankstyvas įtraukimas į kūdikio mitybą karvės pieno ir kietųjų maisto pro-duktų – grūdų, kiaušinių ir vitamino D [143, 181, 230]. Kiti veiksniai, galin-tys turėti reikšmės cukriniam diabetui atsirasti, yra motinos išsilavinimas [21] ir gyvenamoji vieta [135]. Tyrimai rodo, kad motinos amžius gimdymo metu, nėštumo eiga, naujagimio ligos [41, 143] ar skiepijimas [21] taip pat gali būti svarbūs ligai prasidėti. Imuninį kasos procesą gali sukelti užkrečia-mosios ligos [21] ar nervinė įtampa [104, 215].
Aplinkos veiksniai, lemiantys 1TCD atsiradimą, gali turėti įtakos ir autoantikūnams atsirasti bei ikidiabetinei būklei prasidėti.
3. TYRIMO APIMTIS IR METODAI
3.1. Tyrimo apimtis
Tyrimą sudaro dvi dalys. Tyrimo struktūra ir apimtis pavaizduota 3.1.1 paveiksle.
I tyrimo dalis
Ši darbo dalis yra tęsinys atvejo ir kontrolės tyrimo „Aplinkos veiksnių įtaka vaikų sergamumui 1TCD“, pradėto 1995–1996 m. Švedijos (Linčio-pingo universiteto) ir Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Endokrinologijos instituto mokslininkų.
Tyrimui buvo gautas Kauno medicinos akademijos Nepriklausomos etikos komisijos leidimas, vėliau – Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto pritarimas protokolo pataisoms/pakeitimams 2005-12-06 (protokolo Nr. P1-35/1996, 1 priedas).
Dalyvauti tyrime Lietuvoje buvo kviesti visi 0–15 metų vaikai, kuriems 1TCD diagnozuotas 1996-08-01–2000-08-01. 1TCD diagnozuotas, remian-tis Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) kriterijais [173]. Pirmosios insuli-no injekcijos data registruota kaip ligos diaginsuli-nozės data.
Vaiko gydomo ligoninėje tėvai pildė klausimyną (2 priedas). Jį sudarė kelios klausimų grupės: 1) socialinė šeimos padėtis (tėvų išsilavinimas, darbas, gyvenamoji vieta); 2) nėštumo ir gimdymo eiga (nėštumo toksikozė, priešlaikinis gimdymas, naujagimio gelta ir kiti sveikatos sutrikimai); 3) vaiko mityba kūdikystėje (natūralaus ir mišraus maitinimo trukmė, karvės pieno, kruopų košių, mėsos, kiaušinių, vitamino D vartojimo pradžia ir sunkumai, kilę pradėjus vartoti šiuos produktus); 4) šeimos sudėtis, pirmosios ir antrosios eilių giminaičių sergamumas 1 ir 2 tipo CD, celiakija, reumatinėmis ir skydliaukės ligomis; 5) skiepai, 6) užkrečiamosios vaiko ligos; 7) užkrečiamosios ligos ir nervinė įtampa per pastaruosius 6 mėne-sius; 8) ankstyvųjų 1TCD simptomų atsiradimas ir trukmė iki diagnozės nustatymo.
Kiekvienam susirgusiam vaikui parinkti trys Lietuvos vaikų populiaciją atitinkantys kontrolinės grupės vaikai. Naudota dviejų pakopų atranka. Nustačius naują vaikų susirgimo 1TCD atvejį kiekvieną kartą iš visų Lietuvoje dirbančių pediatrų ir bendrosios praktikos gydytojų atsitiktinės atrankos būdu buvo parenkamas vienas gydytojas, kurio telefonu paprašoma atsiųsti savo apylinkės vaikų, atitinkančių susirgusio vaiko amžių ir lytį, sąrašą. Iš šio sąrašo atsitiktinės atrankos būdu buvo atrenkami trys, 1TCD nesergantys, kontrolinės grupės vaikai. Šiems vaikams paštu buvo siunčiami tie patys klausimynai (tik be klausimų apie 1TCD simptomų atsiradimą ir
trukmę). Negavus atsakymo, pakartotinai klausimynai siųsti dar du kartus. Neatsakyti ar nevisiškai atsakyti klausimai buvo tikslinami telefonu.
3.1.1 pav. Tyrimo struktūra ir apimtis
Genetiniams ir imunologiniams tyrimams buvo imtas sergančių ir kontrolinės grupės vaikų veninis kraujas.
Visų tyrime dalyvavusių vaikų tėveliai (globėjai) pasirašė sutikimo formas.
II tyrimo dalis
1994–1998 metais 3053 sveikiems moksleiviams (1449 berniukams ir 1604 mergaitėms), gyvenantiems Kaune, buvo paimti kraujo ėminiai [141]. Vaikų amžiaus vidurkis buvo 11,7 metų, amžiaus ribos 5,5–15 metų.
Tirti šių vaikų ICA antikūnai. ICA nustatyti netiesioginės imunofluo-rescencijos metodu [26]. Mėginių galinio taško titrai buvo perskaičiuoti į Jaunatvinio diabeto finansavimo grupės (JDF, angl. Juvenile Diabetes Foundation) vienetus. Ribinė teigiamojo rezultato reikšmė buvo ≥ 4 JDF vienetai. Tyrimo jautrumas 81 proc., o specifiškumas 86 proc. [225].
ICA antikūnų tyrimas buvo atliktas Bristolio universiteto Diabeto ir metabolizmo medicinos skyriuje, Jungtinėje Karalystėje.
Visi vaikai, kuriems nustatyti ICA, ir atsitiktinai atrinkti vaikai, kuriems nenustatyti ICA (kontrolinė grupė), buvo pakviesti dalyvauti tyrime.
1998–1999 metais tyrime sutikusių dalyvauti vaikų tėvai pildė klausi-myną, kuris aprašytas anksčiau (2 priedas).
Visų tyrime dalyvavusių vaikų tėveliai/globėjai pasirašė sutikimo formas.
3.2. Kontingento charakteristika I tyrimo dalis
Per ketverius tyrimo metus 1TCD Lietuvoje susirgo 287 vaikai. Tyrime dalyvavo ir į anketos klausimus atsakė 286 (99,7 proc.) vaikai (153 mer-gaitės ir 133 berniukai). Į kontrolinę grupę buvo įtraukti 858 sveiki vaikai. Tyrime dalyvavo ir į anketos klausimus atsakė 813 (94,7 proc.) kontrolinės grupės vaikų.
1TCD sergančių ir kontrolinės grupės vaikų veninio kraujo ėminių ir atliktų tyrimų skaičius pateiktas 3.2.1 lentelėje.
3.2.1 lentelė. Veninio kraujo ėminių ir atliktų tyrimų skirstinys
Tiriamųjų grupės Paimti veninio kraujo ėminiai, n Atliktas HLA genotipavimas, n Atlikti imunologiniai tyrimai, n 1TCD sergantys vaikai 274 124 271 Kontrolinės grupės vaikai 289 78 289
Tiriamieji vaikai buvo suskirstyti į grupes pagal amžių (0–4, 5–9 ir 10–15 metų).
3.2.1. Kontingento, kuriam atlikti genetiniai tyrimai, charakteristika Genetiniai tyrimai buvo atlikti 78 sveikiems kontrolinės grupės vaikams (amžiaus vidurkis 11,04±3,29 metai): 35 mergaitėms, bei 43 berniukams. Tyrimų duomenys palyginti su 124 1TCD sergančių vaikų (amžiaus vidurkis 9,69±3,89 metai): 69 mergaičių bei 55 berniukų, genetiniais tyrimais (žr. 3.2.1.1 lentelę).
3.2.1.1 lentelė. Vaikų, kuriems atlikti genetiniai tyrimai, amžiaus ir lyties
charakteristikos
Požymis Tiriamųjų grupės
1TCD sergantys vaikai Kontrolinės grupės vaikai
Skaičius, n 124 78
Amžiaus vidurkis ± SN,
metai 9,69±3,89 11,04±3,29
Amžiaus ribos, metai 0,4–15,9 1,5–15,0
Mergaičių skaičius, n 69 35
Mergaičių amžiaus vidurkis
± SN, metai 9,92±3,54 10,87±2,88
Mergaičių amžiaus ribos,
metais 0,9–15,9 4,0–15,0
Berniukų skaičius, n 55 43
Berniukų amžiaus vidurkis
± SN, metai 9,41±4,31 11,18±3,62
Berniukų amžiaus ribos,
metai 0,4–15,9 1,5–15,0
SN – standartinis nuokrypis.
1TCD sergančių ir sveikų kontrolinės grupės vaikų, kuriems atlikti genetiniai tyrimai, amžiaus ir lyties skirstinys pavaizduotas atitinkamai 3.2.1.1 ir 3.2.1.2 paveiksluose.
n=6 n=11 n=28 n=16 n=35 n=28 0 10 20 30 40 50 60 P ro c e n ta i 0–4 m. 5–9 m. 10–15 m. mergaitės berniukai
3.2.1.1 pav. 1TCD sergančių vaikų, kuriems atlikti genetiniai tyrimai,
amžiaus ir lyties skirstinys
n=1 n=4 n=11 n=5 n=23 n=34 0 10 20 30 40 50 60 70 80 P ro c e n ta i 0–4 m. 5–9 m. 10–15 m. mergaitės berniukai
3.2.1.2 pav. Sveikų kontrolinės grupės vaikų, kuriems atlikti genetiniai
3.2.2. Kontingento, kuriam atlikti imunologiniai tyrimai, charakteristika
Imunologiniai tyrimai, GADA ir IA-2A antikūnų nustatymas, atlikti 271 1TCD sergančiam vaikui (amžiaus vidurkis 9,94±3,84 metai): 144 mergai-tėms ir 127 berniukams. Tie patys tyrimai atlikti ir 289 sveikiems kontro-linės grupės vaikams (amžiaus vidurkis 10,92±2,94 metai): 162 mergaitėms ir 127 berniukams.
Sergančių ir sveikų vaikų, kuriems atlikti imunologiniai tyrimai, amžiaus ir lyties skirstinys pavaizduotas atitinkamai 3.2.2.1 ir 3.2.2.2 paveiksluose bei 3.2.2.1 ir 3.2.2.2 lentelėse. n=19 n=19 n=48 n=33 n=77 n=75 0 10 20 30 40 50 60 P ro c e n ta i 0–4 m. 5–9 m. 10–15 m. mergaitės berniukai
3.2.2.1 pav. 1TCD sergančių vaikų, kuriems atlikti imunologiniai tyrimai,
amžiaus ir lyties skirstinys
3.2.2.1 lentelė. 1TCD sergančių vaikų, kuriems atlikti imunologiniai tyrimai,
amžiaus ir lyties skirstinys Amžiaus
grupė
Mergaitės Berniukai Visi
n vidurkis±SN n vidurkis±SN n vidurkis±SN
0–4 5–9 10–15 19 48 77 3,40±1,14 7,81±1,60 12,60±1,58 19 33 75 3,06±1,33 7,58±1,41 13,01±1,63 38 81 152 3,23±1,23 7,72±1,52 12,80±1,62 Visi 144 9,79±3,65 127 10,11±4,06 271 9,94±3,84 SN – standartinis nuokrypis.
n=5 n=7 n=43 n=24 n=114 n=96 0 10 20 30 40 50 60 70 80 P ro c e n ta i 0–4 m. 5–9 m. 10–15 m. mergaitės berniukai
3.2.2.2 pav. Sveikų kontrolinės grupės vaikų, kuriems atlikti imunologiniai
tyrimai, amžiaus ir lyties skirstinys
3.2.2.2 lentelė. Sveikų kontrolinės grupės vaikų, kuriems atlikti imunologiniai
tyrimai, amžiaus ir lyties skirstinys Amžiaus
grupė
Mergaitės Berniukai Visi
n vidurkis±SN n vidurkis±SN n vidurkis±SN
0–4 5–9 10–15 5 43 114 2,20±1,10 7,72±1,14 12,30±1,38 7 24 96 3,07±1,02 7,83±1,00 12,51±1,62 12 67 210 2,71±1,10 7,76±1,09 12,39±1,50 Visi 162 10,77±2,85 127 11,10±3,06 289 10,92±2,94 SN – standartinis nuokrypis. II tyrimo dalis
Dalyvauti tyrime sutiko 100 proc. vaikų, kuriems nustatyti ICA: 13 moksleivių (6 berniukai ir 7 mergaitės) amžiaus vidurkis buvo 15,6±2,1 metai, ir 76,5 proc. vaikų, kuriems nenustatyti ICA, 199 moksleiviai (95 berniukai ir 104 mergaitės) amžiaus vidurkis 15,3±2,2 metai.
3.3. Tyrimo metodai 3.3.1. Genetinių tyrimų metodai
Genetiniai tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Klinikinės chemijos ir genetikos laboratorijoje ir Molekulinės imunogenetikos skyriuje Karolinskos institute, Stokholmas, Švedija. Atliktas II klasės HLA genotipavimas, nustatyti HLA-DRB1, DQA1 ir DQB1 aleliai.
Kraujas šiam tyrimui buvo imtas standartinėmis sąlygomis periferinės venos punkcijos būdu į vakuuminius mėgintuvėlius, turinčius 0,072 ml 7,5 proc. koncentracijos K3EDTA (Vacutainer ®, BD, JAV). Kraujas buvo
už-šaldytas, laikytas ir gabentas –20 ºC temperatūroje.
Deoksiribonukleorūgštis (DNR) iš kraujo leukocitų išskirta, naudojant standartinį etanolio ir chloroformo metodą [67].
HLA alelių genotipavimas 1TCD sergantiems vaikams atliktas taikant polimerazės grandininės reakcijos sekai savitųjų oligonukleotidų (SSO) metodą [188]. Amplifikuoti produktai buvo rankiniu metodu perkelti ant nailono membranų. Sintetiniai SSO zondai buvo pažymėti taikant žymėjimą αP32-dCTP 3‘ gale. Žymėti zondai naudoti hibridizacijai, paskui atlikta radio-grafija [175].
HLA alelių genotipavimas kontrolinės grupės vaikams atliktas taikant polimerazės grandininės reakcijos sekai savitųjų pradmenų (PGR-SSP) metodą. HLA-DRB1 aleliams genotipuoti naudotas PROTRANS HLA-SSP Cyclerplate System mažos skiriamosios gebos HLA-DRB1 reagentų rinkinys (PROTRANS Medizinische Diagnostische Produkte GmbH, Vokietija). DQA1 ir DQB1 aleliams genotipuoti – PROTRANS HLA-SSP Cyclerplate System didelės skiriamosios gebos HLA-DQA1, -DQB1 reagentų rinkinys (PROTRANS Medizinische Diagnostische Produkte GmbH, Vokietija). Tiriamosios DNR amplifikacija atlikta, naudojant temperatūros ciklerį Mastercycler gradient EPPENDORF (EPPENDORF AG, Hamburgas, Vokietija) pagal gamintojo rekomendacijas. Griežtai kontroliuojamomis PGR sąlygomis, tiriamosios DNR nukleotidų seką atitinkančios pradmenų poros lėmė DNR amplifikaciją, tai yra teigiamą rezultatą. Jei pradmenų poros neatitiko tiriamosios DNR nukleotidų sekos – DNR amplifikacija nevyko. PGR reakcijos metu gauti produktai atskirti elektroforezės būdu, 2 proc. agarozės gelyje, naudojant dažymą etidžio bromidu. Gelis analizuotas šviečiant ultravioletinei spinduliuotei, vaizdai dokumentuoti, naudojant Chemi Doc gelių analizės ir dokumentavimo sistemą (BioRad Laboratories, Hercules, CA, JAV). Rezultatų vertinimas grindžiamas savitojo amplifikuoto DNR fragmento buvimu ar nebuvimu. Rezultatai laikyti teigiamais, jei
elektroforezės metu gautas produktas atitiko gamintojo nurodytą produkto specifikaciją.
DNR fragmentų po amplifikacijos ir elektoroforezės nuotraukos patei-kiamos 3.3.1.1–3.3.1.5 paveiksluose.
3.3.1.1 pav. HLA DRB1 geno DRB1*03, DRB1*15 ir DRB1*15 alelių DNR
fragmentų elektroforezės nuotrauka
Mėginio 001 elektroforezės metu nustatytas DRB1*03 alelis. Mėginio 002 elektroforezės metu nustatyti DRB1*14 ir DRB1*15 aleliai.
3.3.1.2 pav. HLA DRB1 geno DRB1*07, DRB1*12 ir DRB1*04 alelių DNR
fragmentų elektroforezės nuotrauka
Mėginio 003 elektroforezės metu nustatyti DRB1*07 ir DRB1*12 aleliai. Mėginio 004 elektroforezės metu nustatytas DRB1*04 alelis.
3.3.1.3 pav. HLA DQA1 geno DQA1*0102, DQA1*0103 ir DQA1*0505 alelių DNR fragmentų elektroforezės nuotrauka
Mėginio 001 elektroforezės metu nustatyti DQA1*0102 ir DQA1*0103 aleliai. Mėginio 002 elektroforezės metu nustatytas DQA1*0505 alelis.
3.3.1.4 pav. HLA DQA1 geno DQA1*0301, DQA1*0102 ir DQA1*0201
alelių DNR fragmentų elektroforezės nuotrauka
Mėginio 003 elektroforezės metu nustatyti DQA1*0301 ir DQA1*0102 aleliai. Mėginio 004 elektroforezės metu nustatyti DQA1*0301 ir DQA1*0201 aleliai.
