Titas Petruša 6 kursas, 21 grupė BESIVYSTANČIŲ JUTIMINIŲ NEURONŲ ELEKTRINĖS SAVYBĖS

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS

FIZIKOS, MATEMATIKOS IR BIOFIZIKOS KATEDRA

Titas Petruša

6 kursas, 21 grupė

BESIVYSTANČIŲ JUTIMINIŲ NEURONŲ ELEKTRINĖS

SAVYBĖS

Baigiamasis magistro darbas (Vientisųjų studijų programa- medicina)

Darbo vadovas: Doc. Artūras Grigaliūnas

2

Turinys

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8

6. SANTRUMPOS ... 9

7. SĄVOKOS ... 10

8. ĮVADAS ... 11

9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12

10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13

10.1 TRIŠAKIO NERVO MAZGO JUTIMINIŲ NEURONŲ KILMĖ ... 13

10.2 TRIŠAKIO MAZGO MORFOLOGIJA. ... 13

10.3 NERVŲ AUGIMO FAKTORIAUS VAIDMUO NEURONO AUGIMO METU. ... 14

10.4 TRIŠAKIO MAZGO ANATOMIJA IR INERVUOJAMOS SRITYS. ... 15

10.5 NEURONŲ PLAZMINĖS MEMBRANOS SAVYBĖS. RAMYBĖS BEI VEIKIMO POTENCIALAI. ... 16

10.6 NEURONŲ PLAZMINĖS MEMBRANOS SAVYBĖS. PLAZMINĖS MEMBRANOS VARŽA IR ELEKTRINĖ TALPA. ... 16

10.7 JONINIŲ KANALŲ SAMPRATA, APIBŪDINIMAS. ... 17

10.8 JONINIŲ NATRIO KANALŲ SAVYBĖS. ... 18

10.9 JONINIŲ KANALŲ INAKTYVACIJA. ... 18

10.10 KALCIO KANALŲ STRUKTŪRA BEI VEIKIMAS. ... 19

10.11 MEDŽIAGOS, KEIČIANČIOS JONINIŲ KANALŲ VEIKIMĄ NEURONUOSE. ... 20

11. TYRIMO METODIKA ... 23

11.1 TRIŠAKIO MAZGO NEURONŲ PARUOŠIMAS ... 23

11.2 ELEKTROFIZIOLOGINIAI MATAVIMAI ... 23

3

11.4 DUOMENŲ ANALIZĖ ... 26

12. REZULTATAI ... 27

12.1 NEURONŲ MORFOLOGIJA ... 27

12.2 ELEKTROFIZIOLOGINĖS NEURONŲ SAVYBĖS ... 28

12.3 TRYLIKTOS (E13) IR ŠEŠIOLIKTOS (E16) PAROS EMBRIONŲ TRIŠAKIO NERVO MAZGO ELEKTROFIZIOLOGINIŲ SAVYBIŲ PALYGINIMAS ... 31

12.4 ATVIRKŠTINĖS TRANSKRIPCIJOS POLIMERAZĖS GRANDININĖS REAKCIJŲ REZULTATAI ... 35

13. REZULTATŲ APTARIMAS ... 36

14. IŠVADOS ... 38

4

1. SANTRAUKA

Titas Petruša. „Besivystančių jutiminių neuronų elektrinės savybės“. Magistro darbo vadovas Doc. Artūras Grigaliūnas. Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitetas, Medicinos akademija, Medicinos fakultetas, fizikos, matematikos ir biofizikos katedra. Kaunas, 2020 metai.

Darbo tikslas - Išanalizuoti trylikos parų žiurkės embriono trišakio nervo mazgo neuronų elektrines savybes, bei palyginti gautus rezultatus su šešiolikos parų žiurkės embriono trišakio nervo mazgo neuronų elektrinėmis savybėmis.

Darbo uždaviniai – 1) Aprašyti trišakio nervo mazgo neuronų elektrinių savybių kitimo dinamiką, bręstant embrionui. 2) Nustatyti trišakio nervo mazgo neuronų membranose esančių joninių kanalų savybes, panaudojant joninių kanalų blokatorius. 3) Palyginti trylikos bei šešiolikos parų embrionų trišakio nervo mazgo neuronų elektrines savybes. Analizuoti skirtumų kilmę, esmę, bei panaudojimo medicinoje galimybes.

Tyrimo metodas – tyrimams buvo naudojamos trylikos parų kontroliuojamo nėštumo Sprague Dawley žiurkės, buvo išpreparuoti embrionų trišakio nervo mazgai. Mazgai buvo perpjauti pusiau ir patalpinti į auginimo terpę, kurioje buvo kultivuojami 5-8 dienas, kiekvieną dieną keičiant terpę bei atliekant matavimus. Elektrofiziologiniai matavimai buvo atliekami naudojant visos ląstelės srovės fiksavimo metodiką, duomenys buvo apdoroti naudojant pCLAMP programinę įrangą. RT-PCR buvo atlikta naudojant RNeasy protokolą, RT-PCR duomenys buvo patvirtinti naudojant DNR sekoskaitą.

Tyrimo metu naudoti tiriamieji – trylikos parų kontroliuojamo nėštumo Sprague Dawley žiurkių embrionai.

Tyrimo rezultatai – buvo ištirti 48 trišakio mazgo neuronai. Morfologiškai tirti 15 neuronų iš kurių 2 buvo vienpoliai, 8 – dvipoliai, 5 – pseudounipoliniai. Kultivuojant 5-8 dienas, statistiškai reikšmingai pakito šios trylikos parų embrionų trišakio mazgo neuronų elektrinės savybės: membranos talpa, hiperpoliarizacijos amplitudė, sujaudinimo slenkstis, matuojamas pikoamperais (pA). Šie dydžiai statistiškai reikšmingai padidėjo. Kultivuojant 5-8 dienas, šios trylikos parų embrionų trišakio mazgo neuronų elektrinės savybės statistiškai reikšmingai nepakito: membranos ramybės potencialas, įėjimo varža, laiko konstanta, veikimo potencialo amplitudė, laikas, per kurį pasiekiama pusė amplitudės, priekinio ir galinio veikimo potencialo frontų maksimalios reikšmės, sujaudinimo slenkstis, matuojamas

5 milivoltais (mV), hiperpoliarizacijos po veikimo potencialo trukmė.Taip pat iki 6 kultivavimo dienos hiperpoliarizacijos atsako kreivėje nebuvo jokių depoliarizuojančių įlinkimų (depolarizing sag). Tačiau nuo septintos kultivavimo paros šis įlinkimas jau buvo pastebimas daugelyje trišakio mazgo neuronų. Veikiant neuronus tetrodotoksinu, pastebėta, jog tryliktos paros neuronai generuoja TTX atsparius veikimo potencialus. Duomenis patikslinus RT-PCR metodu, E13 neuronuose NaV1.9 kanalų nebuvo rasta, jie atsirado nuo E16 paros, o NaV1.8 buvo tiek E13, tiek E16 neuronuose.

Išvados – 1) Išsiaiškinta, jog tarp tryliktos ir šešioliktos embriogenezės parų keičiasi tam tikros morfologinės bei elektrofiziologinės neuronų savybės. Auga neuronų kūnai, didėja membranos elektrinė talpa. Taip pat keičiasi pats veikimo potencialas – frontai plokštėja, veikimo potencialo trukmė ilgėja. Taip pat atsiranda skirtumų po veikimo potencialo vykstančios hiperpoliarizacijos metu. 2) Kultivuojant trišakio mazgo neuronus 5-8 dienas, hiperpoliarizacijos amplitudė padidėjo, tačiau nekito ramybės potencialas, įėjimo varža, laiko konstanta. 3) Veikiant neuronus tetrodotoksinu, pastebėta, jog tryliktos paros neuronai turi mažiau TTX atsparių Na joninių kanalų 4) Palyginus skirtumus tarp E13 ir E16 trišakio mazgo neuronų elektrinių savybių, nustatyta, jog šiuo embriogenezės periodu keičiasi neuronų dydis, bei su juo susiję elektriniai parametrai. Kinta ir kitos, labiau su veikimo potencialu ir hiperpoliarizacija susijusios elektrinės savybės. E16 neuronų veikimo potencialo forma tapo šiek tiek plokštesnė, prailgėjo veikimo potencialo repoliarizacijos trukmė. Taip pat išaugo veikimo potencialo amplitudė.

6

2. SUMMARY

Titas Petruša. „Electrical properties of developing sensory neurons“. Supervisor of master thesis - Doc. Artūras Grigaliūnas. Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Medicine, department of Physics, mathematics and biophysics. Kaunas, 2020.

Study goals – to analyze the electrical properties of trigeminal ganglia neurons of rat embryos at 13 days of age, and to compare this data with trigeminal ganglia neurons electrical properties at 16 days of age. Study tasks – 1) To describe the changes of electrical properties in developing trigeminal neurons 2) To evaluate properties of membrane ionic channels by means of ion channel blockers. 3) To compare differences in electrical properties of developing trigeminal neurons during 13th and 16th gestational days. To analyze origin of differences and possible applications in modern medicine.

Methodology – timed-pregnancy Sprague Dawley rat embryos at gestational day 13 were extracted. Trigeminal ganglions were dissected and placed on a matrix culture system, they were cultivated for 5-8 days, changing the medium daily and performing measurements at 5th or later day. Measurements were done by means of a whole-cell current clamp method and data analyzed by pCLAMP software. RT-PCR was performed using RNeasy protocol, RT-PCR data was confirmed using DNA sequencing.

Object of the research – embryos of 13-day timed-pregnant Sprague Dawley rats.

Results – 48 trigeminal neurons were tested electrophysiologically, 15 were morphologically described. 2 of them were unipolar, 8 – bipolar, 5 – pseudounipolar. After 5 to 8 days of cultivation, the following electrical properties of trigeminal neurons have changed: electrical membrane capacity, afterhyperpolarization amplitude, threshold of excitation, measured in picoamperes (pA). Those properties increased in statistically relevant boundaries. After 5 to 8 days in culture, the following properties of trigeminal neurons did not change: resting membrane potential, input resistance, time constant, amplitude of action potential, duration at half-amplitude, maximal right and left slopes, threshold of excitation, measured in millivolts (mV), duration of afterhyperpolarization. In addition, during hyperpolarization, there was no depolarizing sag present until 6th _{day of cultivation. However, it} was present in most trigeminal neurons since 7th _{cultivation day. After applying TTX, it was noticed that}

7 13th _{day trigeminal neurons generate TTX-resistant action potentials. After confirming data with} RT-PCR, it was found that NaV1.9 channels are not present in E13 neurons, but develop in E16, in comparison to NaV1.8 type, which is present in both E13 and E16 trigeminal neurons.

Conclusions - 1) Neuron morphological and electrical properties change overtime. Neuron soma size increases, membrane electrical capacity becomes larger. Action potential changes also – slopes get more flat, and the action potential duration increases. There are also changes in depolarization curve during the afterhyperpolarization. 2) During cultivation for 5 to 8 days, action potentials of trigeminal ganglion neurons showed increased afterhyperpolarization amplitude, however resting membrane potential, input resistance, time constant did not change overtime. 3) After applying tetrodotoxin to trigeminal neurons, the measurement results showed that trigeminal ganglia in 13 days of gestation do not have as much TTX resistant ionic channels formed yet. 4) After comparing the differences in electrical properties of 13th and 16th gestational day trigeminal neurons, it was shown, that during this period, neuron soma increases in size, membrane capacity and time constant increase as well. Properties, related to action potential and hyperpolarization change as well. 16th gestational day neurons have more flat action potentials, action potential decay time increased. Action potential amplitude also increased.

8

3. PADĖKA

Dėkoju LSMU MA medicinos fakulteto, fizikos, matematikos ir biofizikos katedros docentui Artūrui Grigaliūnui už visapusišką pagalbą tyrimo ir jo aprašymo metu.

4. INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui interesų konflikto nebuvo.

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Atlikto tyrimo duomenys buvo gauti asmeniniu sutikimu iš Doc. Artūro Grigaliūno. Tyrimui, bei jo duomenų aprašymui etikos komiteto leidimas nebuvo reikalingas.

9

6. SANTRUMPOS

NK1 receptoriai – neurokino 1 receptoriai NAF – nervų augimo faktorius

TrkA receptoriai – tropomiozino valdomos kinazės A receptoriai TNF – tumoro nekrozės faktorius

5-HT3 – 5-hidroksitriptaminas GABA – gama-aminosviesto rūgštis CNS – centrinė nervų sistema

Cdk5 – nuo ciklino priklausoma kinazė 5

TTX, TTX-R, TTX-S – tetrodotoksinas, tetrodotoksinui nejautrus kanalas, tetrodotoksinui jautrus kanalas

CGRP – su kalcitoninu genu susijęs baltymas BDNF – iš smegenų išskirtas neurotrofinis faktorius EGTA – etazino rūgštis

10

7. SĄVOKOS

Ekstraląstelinė terpė – už ląstelės membranos ribų esanti terpė, dažniausiai užpildanti tarpus tarp ląstelių. Svarbi metabolizmui, bei elektrinei ląstelės veiklai.

Genetinis splaisingas – eukariotinių ląstelių gebėjimas nuskaičius vieną geną pagaminti skirtingus produktus, pakeičiant matricinės RNA struktūrą po transkripcijos.

Hidrofobinė poros ertmė – vieta joninio kanalo poroje, kurioje vandens molekulės dėl įvairių krūvių sąveikos yra stumiamos.

Intratekalinės injekcijos – vaistų suleidimo metodika, kuomet preparatas patenka į nugaros smegenų kanalą ar į povoratinklinį tarpą ir pasiekia smegenų skystį. Dažnai naudojamas skausmo malšinimui arba spinalinei nejautrai sukelti.

Kondensatorius – elektrinės grandinės elementas, leidžiantis sukaupti elektros krūvį.

Ligando valdomi joniniai kanalai – joniniai kanalai, kurių atsidarymas bei užsidarymas priklauso nuo tam tikros molekulės – ligando – prisijungimo.

Sensibilizacija – audinių įsijautrinimas, esant prailgintam pažeidimo veikimui. Sensibilizacija svarbi kalbant apie lėtinio skausmo išsivystymą.

Sinapsinių receptorių plastiškumas – sinapsių gebėjimas laikui bėgant padidinti ar sumažinti receptorių jautrumą neurotransmiteriams.

Substancija P – neuropeptidas, veikiantis į neurokino 1 receptorius. Dažniausiai substanciją P išskiria ląstelės, reaguojančios į pažeidimą.

Visos ląstelės registravimas – elektrofiziologijoje taikomas metodas, kuomet elektrodų pagalba yra fiksuojama suminė ląstelės membranoje esančių struktūrų elektrinė veikla.

11

8. ĮVADAS

Neuronai yra mūsų nervų sistemos pamatinis vienetas. Jų darni veikla užtikrina begalę procesų, leidžiančių mums suvokti mus supantį pasaulį. Iš viso žmogaus organizme yra dvylika galvinių nervų, iš kurių vienas – trišakis nervas. Didžioji dalis trišakio nervo skaidulų yra jutiminės, tik viena iš trijų šio nervo atšakų turi motorinių skaidulų (1). Viena iš kliniškai svarbiausių trišakio nervo jutiminių neuronų funkcijų yra skausmo suvokimas. Šių neuronų, bei juose esančių joninių kanalų tyrinėjimas molekuliniame lygmenyje yra svarbus uždavinys, siekiant sukurti naujus farmacinius preparatus skausmui malšinti. Tyrinėjimai su žiurkių neuronuose esančių joninių kanalų genais leido suprasti, jog tam tikrų genų, susijusių su joniniais kanalais, ekspresija gali būti siejama su patologinį skausmą sukeliančiomis ligomis (2). Analizuojant naujausius tyrimus, galima pastebėti, jog kalbant apie galvos skausmą, migreną, daug dėmesio yra skiriama aktyvuojančio ir slopinančio pobūdžio trišakių neuronų veikimui. Tai tiesiogiai siejama su tų neuronų membranose esančių joninių kanalų aktyvumu. Teigiama, jog tam tikrų kanalų disfunkcija gali lemti šį disbalansą, bei sąlygoti patologinį klinikinį ligos pasireiškimą (3). Pilnai suvokus, kuriems kanalams vystymosi eigoje tapus disfunkciniams, pasireiškia ligos, galima sukurti itin efektyvius vaistus, kurių taikiniai būtų labai specifiniai jonų kanalai. Šio tyrimo metu buvo tirti tryliktos paros žiurkių embrionų trišakio mazgo neuronai. Taip pat duomenys buvo lyginami su šešiolikos parų embrionų neuronais. Šis periodas pasirinktas todėl, jog būtent tuo metu neuronai formuoja kelius iš trišakio mazgo į audinius-taikinius. Tikėtina, jog šiame periode tarp tryliktos ir šešioliktos embriogenezės parų, formuojasi joniniai kanalai, galimai keisdami kanalus blokuojančių farmacinių preparatų poveikį neuronams. Tyrinėjamos yra ne tik trišakio mazgo besivystančių neuronų elektrofiziologinės savybės. Tiriant neuronų augimą, pastebėta, jog žiurkių nugaros smegenų užpakaliniuose raguose esančių neuronų kalcio kanalų elektrinis aktyvumas stabdo aksonų augimą, o inaktyvavus šiuos kalcio kanalus, augimo inhibavimas sustoja (4). Tai leidžia užduoti klausimus apie pažeistų aksonų regeneraciją, nervų atauginimą. Ateityje galime tikėtis, jog šių tyrinėjimų klinikinis rezultatas bus susijęs su neurodegeneracinių ligų progresavimo stabdymu arba po įvairių traumų prarastų funkcijų atgavimui. Kita didelė besivystančių neuronų tyrinėjimo sritis yra susijusi su insulino receptorių savybėmis. Kai kurių neurologinių ligų, pavyzdžiui, šizofrenijos, tuberozinės sklerozės (Burnevilio ligos) patogenezės susijusios su insulino receptorių veiksnumu. Išsiaiškinta, jog pacientui sergant šizofrenija, po mirties tiruose galvos smegenų neuronuose buvo sumažėjęs insulino receptorių sudarančio baltymo kiekis. Taip pat Burnevilio ligos atveju, mutavęs tumoro supresijos genas TSC1 arba TSC2

12 skatina neurologinių patologijų, tokių kaip epilepsija, protinis atsilikimas ar autizmas išsivystymą. TSC genų disfunkcija lemia pakitimus per mTOR signalizavimo kelią, o jis savo ruožtu tiesiogiai susijęs su insulino receptorių veiklą galvos smegenyse (5).

Taigi, neuronų vystymosi tyrinėjimas yra ypač plati sritis, apimanti daugybę patologijų, defektų, bei simptomų. Šiame darbe pabrėžiama viena iš šių sričių – trišakio mazgo neuronų savybės embriologiniu laikotarpiu tarp tryliktos ir šešioliktos parų. Tikėtina, jog su šių neuronų pakenkimu labiausiai siejamas skausminis sindromas, todėl ir ateities klinikinės medicinos perspektyvos turėtų būti siejamos su lėtinio ar ūminio skausmo gydymu, pasitelkiant genetinius receptorių moduliavimo metodus, arba specifinius neuronų membranose esančių joninių kanalų blokatorius.

9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas:

Išanalizuoti trylikos parų žiurkės embriono trišakio nervo mazgo neuronų elektrines savybes, bei palyginti gautus rezultatus su šešiolikos parų žiurkės embriono trišakio nervo mazgo neuronų elektrinėmis savybėmis.

Uždaviniai:

1. Aprašyti trišakio nervo mazgo neuronų elektrinių savybių kitimo dinamiką, bręstant embrionui. 2. Nustatyti trišakio nervo mazgo neuronų membranose esančių joninių kanalų savybes, panaudojant joninių kanalų blokatorius.

3. Palyginti skirtumus tarp trylikos bei šešiolikos parų embrionų trišakio nervo mazgo neuronų elektrinių savybių. Analizuoti skirtumų kilmę, esmę, bei panaudojimo medicinoje galimybes.

13

10. LITERATŪROS APŽVALGA

10.1

Trišakio nervo mazgo jutiminių neuronų kilmė

Formuojantis embrionui, ektodermos išorinės dalies ląstelės gali diferencijuoti į nervinius prekursorius. Ar diferenciacija įvyks, ar ne, nulemia mezodermos, esančios iškart po ektoderma, ląstelių išskirtas neuroninis induktorius. Tai yra molekulės, kurios prisijungusios prie ektodermos ląstelių nukreipia jas tapti neuronais. Tos ląstelės, kurios, dėl daugelio kaskadinių reakcijų, nulemiančių diferenciaciją, tampa nervinio audinio ląstelėmis, turi toliau diferencijuoti į neuronus arba glijos ląsteles, taip pat diferencijuotis į smegenų žievę, nugaros smegenis, arba smegenų kamieną (6). Šį etapą lemia faktoriai, vadinami morfogenais. Morfogenai pagrinde atsakingi už lokalų audinių organizavimą, reguliuoja bręstančios ląstelės vietą audinyje, proliferaciją bei žūtį. Kai kurios ląstelės apeina diferenciacijos bei augimo periodus ir tampa kamieninėmis. Kamieninės ląstelės turi potencialą dalinimosi metu tapti bet kuria organizmo ląstele. Kamieninėje ląstelėje yra baltymas Numb, kuris ląstelės dalinimosi metu gali pasiskirstyti nevienodai, tokiu atveju ląstelė gali tapti kitos ląstelės, pavyzdžiui, neurono, pirmtake ir vėliau pilnai diferencijuotį į neuroną. Tam kad pirmtakės neuronams ląstelės atsirastų reikiamoje vietoje, jos turi migruoti. Pagrindinis migracijos vaidmuo atitenka žvaigždinėms glijos ląstelėms, kurių citoplazminės išaugos nusitęsia per visą smegenų žievę ir sudaro karkasą neuronams migruoti (7). Neuronai, atsidūrę reikiamoje lokalizacijoje, gali toliau diferencijuotis į įvairią funkciją atliekančias nervinio audinio ląsteles. Trišakio mazgo užuomazgos žiurkių embrionuose randamos jau iki 10-os gestacijos dienos. Mazgo ląsteles galima aptikti kaudaliai nuo vidurinių smegenų, rostraliai nuo rombinių smegenų. Periferinės trišakio mazgo projekcijos ilgainiui tampa akies, viršutinio bei apatinio žandikaulio nervais (8). Nors bręstant embrionui, trišakio mazgo ląstelės auga, jų skaičius statistiškai reikšmingose ribose nesikeičia ir jų yra apie 52372 (9).

10.2

Trišakio mazgo morfologija.

Tai yra sensorinis mazgas, kuris yra smilkinkaulio olos viršūnėje, trišakio mazgo įduboje, apdengtas kietuoju smegenų dangalu. Kitaip ši vieta vadinama Mekelio urvu (10). Šį mazgą pagrinde sudaro pseudounipoliniai neuronai, kurie įeina į akies, viršutinio bei apatinio žandikaulio nervų sandarą. Šie neuronai gali būti klasifikuojami, atsižvelgiant į neuronų kūno dydį. Pagal tai neuronai skirstomi į

14 mažus (<22,18µm dešinėje, <22,28µm kairėje), vidutinio dydžio (22,18µm -29,1µm dešinėje, 22,28µm -28,88µm kairėje) ir didelius neuronus (>29,1µm dešinėje, >28,88µm kairėje) (10). Ši klasifikacija svarbi, nes esant audinių pažeidimui, skirtingų grupių neuronai veikia skirtingai. Kai yra pažeidžiami audiniai, veikimo potencialai kyla mažo dydžio neuronuose, ir jų ataugomis plinta iki neuronų, esančių trišakiame mazge. Tuo tarpu audinių dirginimas nekenksmingu dirgikliu plinta didelio dydžio neuronų ataugomis (11). Tai svarbu kalbant apie skausmo susidarymą, plitimą, bei stiprėjimą uždegimo atveju. Esant uždegimui trišakio mazgo inervuojamose zonose, iš neuronų kūnų išsiskiria substancija P. Ji veikia ne tik kaip skausmo signalizatorius, tačiau veikia ir į neuronus, kurie nėra atsakingi už skausmo signalų perdavimą į trišakį mazgą. Šie neuronai inervuoja veido odą, o jų sinapsėse yra neurokino 1 (NK1) receptoriai. Ši teorija paaiškina ektopinį skausmo atsiradimą veido srityje, kuomet uždegimas yra kitur. (11) Už skausmo plitimą atsakinguose neuronuose dėl nuolatinio dirginimo atsiranda hipersensibilizacija. Ji vystosi dėl įtampa valdomų kalio kanalų supresijos trišakio mazgo neuronuose. Manoma, jog dėl sensibilizacijos mechanizmo gali vystytis hiperalgezija (11).

10.3

Nervų augimo faktoriaus vaidmuo neurono augimo metu.

Nervų augimo faktorius (NAF) yra vienas iš geriausiai ištyrinėtų neurotrofinių hormonų šeimos narių. Neurotrofiniai hormonai yra atsakingi už tam tikrų organizmo ląstelių išgyvenamumą. Didelis nervų augimo faktoriaus vaidmuo pasireiškia kontroliuojant simpatinių ir sensorinių neuronų augimą arba apoptozę. NAF poveikis neuronams pasireiškia dvejopai. NAF aktyvinamasis poveikis pasireiškia per tropomiozino valdomos kinazės A (TrkA) receptorius. TrkA receptoriai savo ruožtu aktyvina renino-angiotenzino sistemą, fosfatidylinositolio-3-kinazę, fosfolipazę C-γ1. Visi šie metaboliniai procesai veikdami kartu užtikrina, jog nebus įjungta neuronų apoptozė. NAF taip pat gali veikti per neurotrofinų receptorių p75NTR_{, kuris yra TNF receptorių šeimos atstovas, taip sukeldamas apoptozę. NAF vaidmuo} besivystančiuose neuronuose yra labai svarbi. Kad būtų užtikrintas tinkamas neurono augimas, NAF retrogradiškai plūsta į neurono somą (12). Tuose neuronuose, kuriuose susiformuoja ši NAF srovė, vyksta augimas, o tuose, kuriuose nesusiformuoja – prasideda degeneracija (13). Šio faktoriaus išskyrimą reguliuoja nervo inervuojami audiniai, tai reiškia, kad audiniai patys reguliuoja kiek tankiai jie yra inervuojami. Audiniuose išsiskyręs NAF, kaip minėta ankščiau, retrogradine srove juda link neurono somos. Būtent tai užtikrina tinkamą nervinio audinio formavimą ir modeliavimą (14).

15

10.4

Trišakio mazgo anatomija ir inervuojamos sritys.

Šis mazgas yra trišakio nervo sudedamoji dalis. Žmogaus trišakio mazgo dydis – apie 2 mm. Mazgas yra apvalus. Trišakio nervo mazgas yra didžiausias iš visų galvinių nervų mazgų. Jis surenka sensorinę informaciją iš galvos ir veido odos, taip pat inervuoja motorinėmis skaidulomis kramtomuosius raumenis. Yra trys dideli juntamieji nervai, susijungiantys į vieną mazgą - trišakį. Tai yra akies nervas (n. Ophthalmicus), viršutinio žandikaulio nervas (n. Maxillaris), ir apatinio žandikaulio nervas (n. Mandibularis). Po to skaidulos iš mazgo patenka į smegenų kamieną ties smegenų tiltu ir po to kyla aukštyn link galvos smegenų (15). Akies nervo skaidulos inervuoja skalpo odą, kaktos odą, viršutinį voką, junginę ir rainelę, krumplyną, ašarų liauką, nosį, jos gleivinę, priekinius sinusus, etmoidalinius sinusus ir dalį kietojo smegenų dangalo. Prieš nervui išeinant iš akiduobės per viršutinį akiduobės plyšį, nuo jo atskyla šaka, kuri savo ruožtu dalijasi tris dalis. Skaidulos iš šio nervo patenka į trišakio nervo išgaubtąją dalį (16). Viršutinio žandikaulio nervo juntamosios skaidulos inervuoja apatinio voko odą, skruosto odą, šnerves, viršutinę lūpą, viršutinius dantis, bei viršutines dantenas (16). Apatinio žandikaulio nervas yra didžiausia trišakio nervo atšaka. Ji turi ir sensorinių, ir motorinių skaidulų. Motorinės skaidulos inervuoja kramtymo raumenis, burnos dugno, minkštojo gomurio bei būgnelio raumenis. Sensorinės skaidulos inervuoja kietąjį smegenų dangalą, žando odą, krūminius dantis, galvos šono odą, du priekinius liežuvio trečdalius bei apatines dantenas. Neretai medicininėje praktikoje susiduriama būtent su apatinio žandikaulio nervo neuralgija, kuri pasireiškia ypatingai stipriu ir intensyviu apatinio žandikaulio vienos pusės, arba abipusiu skausmu (17).

16

10.5

Neuronų plazminės membranos savybės. Ramybės bei

veikimo potencialai.

Neurono plazminėje membranoje galima rasti daug skirtingų joninių kanalų rūšių. Geriausiai ištyrinėti kanalai yra specifiniai praleisti kalio ar natrio jonams iš bei į ląstelę. Tai tikriausiai patys svarbiausi kanalai, kalbant apie membranos veikimo bei ramybės potencialų susidarymą. Kai kurie kalio kanalai būna uždari tol, kol ląstelėyra ramybės būsenoje. Šie kanalai turi daug potipių. Vienas jų – kalio nuotėkio kanalas, kuris yra praviras net esant ramybės potencialui. Tai leidžia palaikyti membranos potencialą, nes yra nuolatinis pralaidumas kalio jonams (18). Paprastai neurono vidus, ekstraląstelinės terpės atžvilgiu turi neigiamą krūvį, kuris yra apie -60mV ramybės potencialo metu. Taip pat membranoje esantys natrio nuotėkio kanalai, elektrocheminio gradiento būdu praleidžia natrio jonus į ląstelę. Kuomet membranos potencialas mažėja, t. y. tampa mažiau neigiamu ekstraląstelinės terpės atžvilgiu, yra pasiekiama slenkstinė riba, atsidaro membranoje esantys nuo įtampos priklausomi natrio kanalai. Dėl to įvyksta depoliarizacija ir prasideda veikimo potencialas (19). Veikimo potencialas vyksta trimis etapais, tai yra depoliarizacija, repoliarizacija, bei hiperpoliarizacija. Depoliarizacija vyksta, kuomet membranos potencialas kinta nuo maždaug -60mV iki +40mV. Depoliarizacijos metu natrio jonai juda į ląstelės vidų. Kai pasiekiama apie -55mV slenkstinė riba, prasideda „griūtinė“ depoliarizacija. Repoliarizacijos metu, kalio jonai juda iš ląstelės, o natrio kanalai būna užsidarę. Kai kurioms ląstelėms membrana repoliarizuojasi šiek tiek neigiamiau ramybės potencialo, todėl įvyksta hiperpoliarizacija. Hiperpoliarizaciją kompensuoja ankščiau minėtieji kalio nuotėkio kanalai, kurie grąžina membranos potencialą į ramybės lygį. Veikimo potencialo metu negali kilti kitas veikimo potencialas (19).

10.6

Neuronų plazminės membranos savybės. Plazminės

membranos varža ir elektrinė talpa.

Plazminė membrana skiria dvi terpes, kuriose juda krūvius turinčios dalelės, t. y. terpes, kurios yra laidininkai, todėl ląstelių plazminė membrana atlieka kondensatoriaus funkciją. Membranos elektrinė talpa priklauso nuo membranos paviršiaus ploto ir yra apskaičiuojama paviršiaus plotą padauginus iš specifinės membranos talpos, kuri dažniausiai išreiškiama µF/cm2_{. Faradas (F) yra kondensatoriaus} talpos vienetas (20). Membranos elektrinė talpa priklauso ir nuo membranos ploto, todėl augančių

17 neuronų elektrinė talpa keičiasi. Tai yra svarbu tiriant embrionų neuronų elektrines savybes. Nuo membranos talpos priklauso neurono membranos laiko konstanta – kuo didesnė membranos talpa C, tuo didesnė membranos laiko konstanta Tm. Laiko konstanta nurodo laiką, per kurį depoliarizuota (arba nepasiekusi slenkstinio potencialo), ar hiperpoliarizuota membrana grįžta į ramybės potencialo lygį. Todėl praktiškai laiko konstanta turi įtakos per kiek laiko po nervinio impulso, neurono ataugomis vėl galės plisti nerviniai impulsai (20). Plazminės membranos varža – tai gebėjimas priešintis elektros srovės tėkmei. Už plazminės membranos varžą atsakingi joje esantys bei ją kertantys baltymai (joniniai kanalai). Jų užsidarymas ir atsidarymas trikdo elektros impulso tėkmę membrana, tokiu būdu didėja varža (21). Membranos laiko konstanta Tm priklauso tiek nuo membranos kaip kondensatoriaus talpos C, tiek nuo membranos varžos R, kuri matuojama omais Ω. Tiek membranos varža, tiek membranos talpa yra fizikiniai dydžiai, nuo kurių priklauso biologiniai procesai, tokie kaip nervinio impulso susidarymas bei plitimas. Neuronams bręstant embriologiniu periodu, šie dydžiai taip pat kinta, automatiškai keisdami neuronų savybes perduoti nervinius impulsus.

10.7

Joninių kanalų samprata, apibūdinimas.

Joniniai kanalai yra dėl įvairių baltymų erdvinės struktūros susidarę tarpai ląstelių membranoje. Joniniai kanalai pagal savo veikimo kinetiką yra skirstomi į nešiklius ir į poras. Poros struktūros kanalai yra vandens pripildyti tuneliai, pralaidūs tam tikriems jonams ir smulkioms molekulėms. Tuo tarpu nešikliai skirstomi į ligando valdomus kanalus, tokius kaip acetilcholino, GABA kanalai ir elektros įtampos valdomus kanalus, pavyzdžiui kalcio, kalio, natrio kanalai; kitus kanalus, tokius kaip akvaporinai, chlorido kanalai, jonoforai ir kiti (22). Joninių kanalų svarba nervinės ląstelės atliekamoje funkcijoje atsispindi veikimo potencialų susidaryme bei veikimo potencialų slopinime. Teigiamą krūvį turinčių dalelių srautai per joninius kanalus sukelia postsinapsinį veikimo potencialą, o neigiamą krūvį turinčių dalelių srautas – slopinamąjį postsinapsinį potencialą. Kalcio jonai nuo kitų jonų skiriasi tuo, kad gali ne tik keisti membranos potencialą, bet ir veikti kaip signalizuojančios dalelės. Pasikeitus membranos potencialui, atsidarę kalcio jonų kanalai sukelia kalcio jonų tėkmę į ląstelę, o dėl padidėjusios intraląstelinės kalcio jonų koncentracijos, yra aktyvuojami įvairūs procesai, tokie kaip genų transkripcija, neurotransmiterio išsiskyrimas, nuo kalcio priklausomų baltymų aktyvavimas.

18

10.8

Joninių natrio kanalų savybės.

Nuo įtampos priklausomi natrio kanalai yra koduojami SCN1A-SCN11A genų, kurių pagalba yra produkuojami natriui selektyvūs kanalai NaV1.1 – NaV1.9 (23). Visi kanalų tipai gali būti randami CNS, išskyrus NaV1.4. Funkciškai jie yra labai panašūs, tačiau skirtingi kanalų tipai yra skirtingų CNS ligų, pvz.: epilepsijos, smegenų navikų, išsėtinės sklerozės, patogenezės dalis, todėl yra svarbu juos atskirti ir tyrinėti atskirai (24). Panašus į įtampos valdomus natrio kanalus yra Nax kanalas, kuris nėra priklausomas nuo įtampos, o yra tiesiogiai priklausomas nuo ekstraląstelinės natrio koncentracijos. Kuomet membrana yra ramybės potencialo būsenoje, nuo įtampos priklausomi natrio kanalai yra uždari. Kuomet vyksta depoliarizacija, kanalai atsidaro, sukeldami natrio tėkmę į ląstelę. Natrio kanalai būna atviri vos keletą milisekundžių, po kurių įvyksta greitoji inaktyvacija. Daugumoje neuronų, greitoji inaktyvacija visiškai neuždaro natrio kanalų, todėl kelias dešimtis sekundžių jie gali būti atviri, kol būna visiškai uždaromi (23). Natrio kanalų molekulinė struktūra glaudžiai susijusi su šio kanalo funkcija. Šį kanalą sudaro keturi homologiniai subvienetai (I-IV), o kiekvieną subvienetą sudaro šeši transmembraniniai segmentai (S1-S6) bei membraną kertanti porinė kilpa tarp S5 ir S6 segmentų. Kiekvieno subvieneto S1-S4 segmentai sudaro kanalo įtampai jautrią sritį, o S5-S6 segmentai, bei tarp jų esanti porinė kilpa sudaro kanale esančią porą, kuri yra išorinėje kanalo dalyje (25). Tyrimuose, atliktuose su varlių oocitais yra detaliau aprašomi šio kanalo struktūriniai ypatumai. Mokslininkai ištyrė, jog kanalo atsidarymas įvyksta tuomet, kai prasiskiria S6 segmentų suformuoti persidengimai intraląstelinėje kanalo dalyje. Atsidarius kanalui, β4 segmentas veikia kaip atviros poros blokatorius, neleisdamas kanalui savaime užsidaryti, tai vyksta dėl to, jog šis subvienetas stabdo elektros krūvio plitimą porą sudarančiomis struktūromis. Kuomet pasibaigia veikimo potencialas, kanaluose įsijungia inaktyvacijos mechanizmai, kurių pagalba yra uždaromi nuo įtampos priklausomi natrio kanalai (26). Tai yra N tipo inaktyvacija ir C tipo inaktyvacija.

10.9

Joninių kanalų inaktyvacija.

Kanalų N tipo greitoji inaktyvacija paremta kamuolio bei grandinės principu, o C tipo lėtesnė inaktyvacija yra labiau intraceliulinės ir ekstraceliulinės matricos pasikeitimų nulemtas procesas (27). Kalio kanale N tipo inaktyvacijos metu kanalą sudarančio baltymo N- gale esančios molekulės veikia kaip kamuolys, mechaniškai uždarantis vidinę poros dalį. Tai įvyksta dėl krūvių skirtumo. Šios molekulės turi teigiamą krūvį ir patenka į hidrofobinę poros ertmę, todėl nutrūksta jonų tekėjimas kanalu (28). Šis inaktyvacijos modelis svarbus ir klinikiniame darbe, nes tai yra potenciali vaistų veikimo vieta,

19 siekiant reguliuoti ląstelių membranos jautrumą ir veikimą. Tuo tarpu natrio kanalas kiek skiriasi savo struktūra – kalio kanalo subvienetai yra vienodi, o natrio kanalo subvienetai šiek tiek skiriasi. Natrio kanale N tipo inaktyvacija vyksta tokiu pačiu principu, tačiau ji prasideda dėl S4 subvienete esančio įtampos sensoriaus judėjimo. Dėl to teigiama, jog S1-S3 natrio kanaluose svarbesni aktyvacijai, o S4 svarbesnis inaktyvacijai (29). C tipo inaktyvacija lieka pilnai neištyrinėta, apie šį mechanizmą duomenų nėra daug. Yra manoma, jog už C tipo inaktyvaciją yra atsakingas selektyvus filtras, kuris praleidžia tik tam tikras molekules ar jonus tiek intraceliulinėje, tiek ekstraceliulinėje kanalo dalyse. Kai šis filtras nustoja veikti, prasideda C inaktyvacija (30). Teigiama, jog abu inaktyvacijos tipai persipina tarpusavyje ir, esant adekvačiai kanalo aktyvacijai, kanalai inaktyvuojami tiek N, tiek C tipo inaktyvacijomis (27).

10.10

Kalcio kanalų struktūra bei veikimas.

Kalcis, skirtingai nuo kitų jonų, ląstelėje sukelia ne tik elektrinius membranos pokyčius, bet ir perduoda signalus, kurie keičia ląstelės metabolizmą. Esant ramybės potencialui, viduląstelinė kalcio koncentracija yra maždaug 100 nanomolių (nM) (31). Kalcio kanalai gali būti suskirstyti į 10 potipių, CaV1-CaV10, priklausomai nuo ląstelinės signalo transdukcijos. Pagal kanalų pralaidumo greitį, inaktyvacijos greitį ir trukmę, skatinančius bei slopinančius veiksnius, yra išskiriami keli kalcio jonų srovės būdai. Tai yra L (CaV1), N (CaV2.2), P/Q (CaV2.1), R (CaV2.3), T (CaV3) tipo srovės, atitinkamai taip gali būti klasifikuojami ir patys kalcio kanalai (32). L-tipo srovė yra rezultatas didelės aktyvavimo įtampos. L-tipo srovė turi didelį kanalo pralaidumą, lėtą, nuo įtampos priklausomą inaktyvaciją. Taip pat ši srovė stiprėja ciklinio aminomonofosfato, bei su juo susijusio baltymo forsforizacijos. L-tipo kalcio joninė srovė yra gerai ir specifiškai inhibuojama kalcio antagonistinių vaistų, tokių kaip dihidropiridinai, fenilalkilaminai ir benzotiazepinai. Šios srovės yra puikus taikinys reguliacijai per antrinių tarpininkų sukeltą baltymų fosforizaciją (33). N-tipo kalcio kanalai lokalizuojasi presinapsinėse membranose ir yra atsakingi už sinapsių genezę bei neutrotransmisiją. Šių kanalų aktyvumą reguliuoja substratas – nuo ciklino priklausoma kinazė 5 (Cdk5), kuri fosforilizuoja kanalus, taip padidindama kalcio srovę į ląstelę. Cdk5 palengvina neutrotransmiterio išsiskyrimą ir keičia presinapsinį plastiškumą, didindama pūslelių su neurotransmiteriu skaičių presinapsinėje membranoje (34). P/Q kalcio kanalai yra reguliuojami didelės įtampos, bei dalyvauja atsipalaiduojant neurotransmiterio pūslelėms. Ar kanalas yra P-, ar Q-tipo, sprendžiame pagal jautrumą Amerikos piltuvininko voro (Agelenopsis aperta) nuodams, tačiau šiuos abu kanalus koduoja tas pats genas CACNA1A, o jų skirtingumą nulemia genetinis splaisingas.

20 Todėl abu šie kanalai ir jų veikimo mechanizmai yra tyrinėjami kartu. Su šių kanalų patologijomis siejama migrena, ataksija bei Alzhaimerio liga (35). R-tipo kalcio kanalai šiuo metu yra vienas iš dažniausia tyrinėjamų molekulinio neuromokslo objektų. Teigiama, jog R-tipo kanalai dalyvauja formuojantis plaučiams, vidinei ausiai bei Kortijaus organui. Embriogenezės metu CaV2.3 kanalai reguliuoja semoforiną 3A, bei jo kontroliuojamą neuronų diferenciaciją. R- tipo kanalai dalyvauja presinapsinio ir postsinapsinio plastiškumo formavime, neurotransmiterio išskyrime. Papildomai, teigiama, jog už šių kanalų mechanizmų slypi skausmo formavimasis bei suvokimas, baimės suvokimas ir mielinogenezė. Kanalą koduoja genas CACNA1E, kurio polimorfizmas gali lemti skirtingą opioidų poveikį žmogaus organizme. Šio kanalo neblokuoja jokios kitus kanalus blokuojančios medžiagos, ir tik 1988 buvo atrasta, jog šį kanalą blokuoja toksinas SNX-482, išskirtas iš Kamerūno raudonojo babuinų tarantulos (Hysterocrates Gigas). Taip pat šie kanalai jautrūs Brazilijos šarvuotojo voro (Phoneutria nigriventer) toksinams ω-ctebitoksinui-Pn2a, ω-PnTx3-3, ω-PnTx3-3 ω-fonetoksinui IIA. Sunkieji metalai, tokie kaip nikelio jonai Ni2+, Zn2+, Cu2+ taip pat yra stiprūs kanalo blokatoriai, keičiantys kalcio jonų tėkmę (36). T-tipo kalcio kanalai, skirtinai nuo kitų, yra aktyvuojami žemos įtampos, o tai reiškia, jog užtenka nedidelės depoliarizacijos, kad jie būtų atidaromi. Taip pat T kanalai skiriasi ir tuo, jog jų pralaidumas yra mažesnis nei kitų kanalų tipų. Kadangi šiuos kanalus koduoja trys skirtingi genai, galima išskirti tris porūšius (CaV3.1, CaV3.2 ir CaV3.3), taip pat dėl genetinio splaisingo vystosi didelė molekulinė kanalų įvairovė, o tai atveria daug kelių tyrinėjimams. Dėl šio tipo kanalų žemo aktyvavimo slenksčio sukelto atsidarymo, vyksta depoliarizacijos sustiprinimas, kuris palengvina pačią depoliarizaciją ir impulsas gali sklisti lengviau. Kai kurios neurologinės patologijos, pavyzdžiui, epilepsija, autizmas, psichozės, generalizuoti traukuliai yra glaudžiai siejamos su T tipo kalcio joniniais kanalais. Atliktuose tyrimuose su pelėmis, išjungus CaV3.1 kanalus, pelėms nustojo reikštis absanso priepuoliai (37). Kadangi kalcio jonų kanalai yra plačiai paplitę organizme, natūralu, jog šių kanalų patologijos sukelia nemažą kiekį ligų, todėl jų tyrinėjimas ir veikimo mechanizmų išmanymas yra svarbus medicininio tobulėjimo aspektas.

10.11

Medžiagos, keičiančios joninių kanalų veikimą neuronuose.

Tam tikros cheminės medžiagos gali keisti natrio judėjimą joniniais kanalais, taip keisdamos depoliarizaciją, bei elektrinio impulso sklidimą neuronais. Tetrodotoksinas yra natūraliai išskirtas toksinas iš žuvų – keturdančių pūsliažuvių. Jis veikia blokuodamas natrio kanalus ir mažindamas neurono

21 membranos gebėjimą sukurti veikimo potencialą. Natrio kanalai, kurie yra jautrūs tetrodotoksinui, yra vadinami TTX-S (tetradotoxin-sensitive) kanalais, o natrio kanalai, kurių tetrodotoksinas neveikia yra vadinami TTX-R (tetradotoxin-resistant) kanalais (38). Kadangi natrio kanalai neuronuose yra labai svarbūs skausmo susidarymui ir plitimui, tetrodotoksinas yra naudojamas blokuoti natrio kanalus, taip nutraukti neurono membranos gebėjimą depoliarizuotis ir mažinti skausmą, kuris yra tiek uždegiminės, tiek neuropatinės ar ūmios kilmės (39). Kalcio kanalus blokuojančių medžiagų yra labai daug. Kiekvienas kalcio kanalo potipis yra specifiškai jautrus tam tikroms medžiagoms. L-tipo kalcio kanalus blokuoja trijų tipo vaistai: dihidropiridininiai, tokie kaip nifedipinas, fenilalkilaminai, tokie kaip verapamilis bei benzotiazepinai – cis-diltiazemas. Jie visi jungiasi prie kanalo aktyvacijos vietos, esančios α1 subvienete. Tai leidžia grįžtamai sutrikdyti nuo įtampos priklausomą kanalo veikimo ciklą, kuris apima ramybės potencialo, veikimo potencialo ir inaktyvacijos fazes, todėl mažėja kalcio patekimas į ląstelę. Šiuo metu klinikinėje praktikoje L tipo kalcio kanalų blokatoriai plačiai naudojami kardiovaskulinėmis ligomis sergančių pacientų gydymui, nes šie preparatai efektyviai mažina kraujospūdį, nukrauna širdies krūvį, vartojami esant krūtinės anginos rizikai. Klinikinis šių kanalų blokatorių pritaikymas neurologinės kilmės patologijų gydyme kol kas nėra gerai išplėtotas, kanalų blokavimas neuronuose tėra naudojamas eksperimentiniuose lygmenyse, tačiau jau dabar yra duomenų, jog ateityje šių farmakologinių preparatų naudojimas neurologinių ligų gydymui gali tapti kliniškai reikšmingu (40). N-tipo kalcio kanalus blokuoja iš kūginių sraigių išskirti peptidai ω-konotoksinas-GVIA ir ω-konotoksinas-MVIIA. Šios medžiagos yra mokslinių tyrinėjimų centre. ω-konotoksinas-GVIA toksinas kanalus blokuoja negrįžtamai, o MVIIA – grįžtamai. N tipo kalcio kanalų didžiausia koncentracija CNS yra nugaros smegenų užpakaliniuose raguose esančiuose mazguose. Todėl šių kanalų blokavimas neretai yra susijęs su mechaninio, terminio, uždegiminio skausmo slopinimu, nes blokada sustabdo substancijos P bei su kalcitonino genu susijusio baltymo (CGRP) išsiskyrimą iš jutiminių neuronų. Moksliniai tyrimai su pelėmis parodė, jog intratekalinės MVIIA injekcijos uždegiminį ir neuropatinį skausmą malšina iki 10 kartų stipriau nei morfinas. Taip pat yra duomenų, jog MVIIA stabdo hiperalgezijos ir alodinijos vystymąsi (41). P/Q kanalų didžiausia koncentracija yra smegenėlėse, hipokampe bei galvos smegenų žievėje. Tai yra greitos sinapsinės kontrolės kanalai. Su jais susijusios tokios ligos kaip smegenėlių ataksija, hemipleginė migrena, galvos svaigimas (vertigo) ir epilepsija. Šių ligų kontrolė dabartinės medicinos galimybėmis yra sudėtinga ir ne visada yra veiksminga, todėl tolimesnis tyrinėjimas yra labai svarbus (42). P/Q kanalų selektyvus blokavimas vis dar tyrinėjamas. Daugelis toksinų nėra išskirtinai specifiniai P/Q kanalų tipui – neretai jie blokuoja N, P/Q bei T kanalus kartu, todėl nėra aiškių duomenų

22 apie šio konkretaus kanalo blokavimo pritaikomumą klinikinėje praktikoje. Didelė dalis kalcio kanalų blokatorių yra išskiriama iš vorų bei sraigių toksinų. Iš žinomų toksinų tik du yra specifiniai P/Q kanalams. Tai yra ω-agatoksinas IVA ir ω-agatoksinas IVB. Šios medžiagos kanalus veikia skirtingai nuo kitų. Jos gali inaktyvuoti tik tuos kanalus, kurie yra uždari. Taip yra dėl to, kad vietoje tiesioginės inaktyvacijos, šios medžiagos paprasčiausiai didina depoliarizacijos slenkstį, todėl kanalai lieka uždari net susidarant paprastam veikimo potencialui. Esant didesnei depoliarizacijos jėgai, toksinai yra atjungiami nuo kanalų ir šie atsidaro (35). Apie R-tipo kalcio kanalų blokavimą taip pat nėra žinoma daug. Šiuos kanalus blokuoja jau ankščiau minėtas toksinas SNX-482. Eksperimentų metu, pelės su blokuotais CaV2.3 kanalais turėjo sumažėjusį skausmo suvokimą (43). Nors SNX-482 efektas yra žinomas ir įrodytas, nėra aišku ar šis R-tipo blokavimas vyksta užblokuojant pirminį aferentinį neuroną, ar tai yra dėl tiesioginio efekto į neurotransmiterio išskyrimą per receptorių moduliavimą (44). T-tipo kalcio kanalai labai skiriasi nuo kitų pogrupių. Dėl jų lėtos aktyvacijos ir mažo pralaidumo yra manoma, jog šių kanalų blokavimas gali turėti ne tik gydomąjį poveikį tam tikrų neurologinės kilmės ligų atvejais, bet ir neuroprotekcinį poveikį nervų sistemai. Deja, tačiau šiuo metu nėra specifiškai T kanalus blokuojančių medžiagų, kurios būtų patvirtintos kaip veiksmingos gydant patologijas. Etosukcimidas ir trimetadionas yra efektyvūs T kalcio, bei natrio kanalų blokatoriai, kurie yra naudojami epilepsijos gydymui. Bandymų stadijose yra nemažai potencialiai veiksmingų preparatų, tokių kaip TTA-A2, KYS05047, kurie galimai ateityje bus naudojami specifiniam kalcio T kanalų blokavimui (45).

23

11. TYRIMO METODIKA

11.1 Trišakio mazgo neuronų paruošimas

Tiksliai matuojamo trylikos parų trukmės nėštumo, pirmą dieną matuojant pagal makšties kamščio atsiradimą, Sprague Dawley žiurkėms buvo atlikta gili anestezija 50mg/kg kūno svorio natrio pentobarbitalio intraperitonine injekcija. Anestezija efektyviai veikia ir embrioną. Embrionai buvo pašalinti ir patalpinti į šaltą, 4˚C Earle‘s subalansuotą druskų tirpalą su 20µg/ml gentamicino sulfatu bei 20mM HEPES buferine sistema, kurios pH 7.4. Trišakio nervo mazgai buvo išpreparuoti ir perkelti ant stiklinių plokštelių. Plokštelės iš anksto buvo padengtos terpe, sudaryta iš jaučio ragenos endotelio ląstelių. Trišakio nervo mazgai buvo perpjauti pusiau ir dvi mazgo pusės buvo perkeltos ant vienos plokštelės. Plokštelės su trišakio nervo mazgais buvo patalpintos į Petri lėkštelę, kurioje buvo paruošta terpė, sudaryta iš: Dulbecc‘o modifikuotos Eagle‘s Minimum Essential Medium terpės ir Ham‘s mitybinių medžiagų mišinio F12. Šie du elementai buvo sumaišyti santykiu 1:1. Taip pat terpėje buvo 1% jaučio vaisiaus serumo, 20µg/ml gentamicino sulfato ir 2% B27 kultūros papildo (GIBCO, Life Technologies). Terpė buvo papildyta 10ng/ml nervų augimo faktoriumi (NGF) (Alomone Labs, Jeruzalė, Izraelis). NGF skirti optimaliam ląstelių palaikymui ir neuritų augimo skatinimui. Išskirti trišakio nervo mazgai buvo laikomi inkubatoriuje, esant drėgnam orui, kuriame buvo 5% CO2. Temperatūra inkubatoriuje buvo 37˚C. Mazgai buvo laikomi iki 9 parų, kas dieną pakeičiant terpę lėkštelėse.

11.2 Elektrofiziologiniai matavimai

Ląstelių elektrinių savybių matavimo metu, plokštelės su trišakio nervo mazgais buvo išimti iš Petri lėkštelių, patalpinti į naujas lėkšteles, kurios buvo pritvirtintos prie invertuoto mikroskopo (šviesos šaltinis iš viršaus). Mikroskopas turėjo fazių kontrasto optiką bei epifluorescentinį apšvietimą. Matavimams buvo pasirinkti nuo centrinės mazgo dalies numigravę neuronai. Elektrodai buvo valdomi naudojant trijų koordinačių hidraulinį manipuliatorių. Registruojant Petri lėkštelė buvo perfuzuojama (3ml/min) deguonies prisotintu tirpalu, kurį sudarė: 124mM natrio chlorido (NaCl), 5mM kalio chlorido (KCl), 5mM Magnio chlorido (MgCl2), 10mM natrio sukcinato, 15mM dekstrozės, 15mM HEPES buferinės sistemos, 2mM kalcio chlorido (CaCl2). Terpės rūgštingumas buvo koreguojamas natrio hidroksidu (pH 7.4). Pipetės buvo tempiamos iš 1.5mm išorinio diametro borosilikato stiklo su vidiniu

24 stiklo siūleliu dviem etapais, naudojant Narishige PP-83 elektrodų tempiklį. Pipetės buvo pripildytos tirpalo, kurį sudarė 130mM kalio gliukonato, 10mM HEPES buferinės sistemos, 10mM etazino rūgšties (EGTA), 1mM magnio chlorido (MgCl2), 1mM kalcio chlorido (CaCl2), 2mM adenozintrifosfato (ATP). Tirpalo pH buvo 7.2, koreguojamas kalio hidroksidu (KOH). Elektrodų galiukų varža buvo 6-8MΩ. Visi matavimai buvo atliekami kambario temperatūroje (20-22˚C). Visos ląstelės elektrinių srovių įrašai buvo daromi naudojant Axoclamp-2A stiprintuvą (Axon Instruments). Elektrinis sandūros potencialas, susidaręs tarp pipetėje esančio skysčio ir Petri lėkštelėje esančio skysčio buvo apie 10mV. Pagal tai buvo koreguoti visi išmatuoti membraniniai potencialai. Kad matavimas būtų laikomas tinkamu, turėjo būti laikomasi šių kriterijų: ne mažiau nei 10 minučių matavimo trukmė, stabilus membranos ramybės potencialas, labiau neigiamas nei -40mV, veikimo potencialo amplitudė ne mažesnė nei 70mV, įėjimo varža ne mažesnė nei 100MΩ. Natrio kanalų blokatorius tetrodotoksinas (Sigma, St. Louis, MO) buvo laikomas citrato buferinėje sistemoje (pH 4.3), -20˚C temperatūroje. Tetrodotoksinas buvo skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos prieš kiekvieną matavimą. Matavimo metu TTX buvo išpurškiamas šalia ląstelės per pipetę, naudojant Picospritzer padavimo sistemą. Neuronuose vykstančių procesų morfologijos stebėjimuose buvo naudojamas 5% Lucifer Yellow CH(dinatrio druska, Sigma, St. Louis, MO). Buvo tirti 15 trišakio nervo mazgo neuronų. Šio tyrimo metu elektrofiziologinių matavimų rezultatai nebuvo naudojami duomenų analizei, o tik leido patvirtinti neuronų gyvybingumą. Šio dažo panaudojimas leido fotografuoti neuronus ir analizuoti neuritų šakojimosi ypatumus.

11.3 Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija

(RT-PCR)

Žiurkių embrionai buvo išimti tryliktą nėštumo dieną. Trišakio nervo mazgai buvo išpreparuoti ir patalpinti į RNAlater reagentą (Ambition, Austin, TX). Prieš izuoliuojant RNA, į RNAlater reagentą buvo pridėtas fosfato buferis (PBS) tam, kad RNAlater būtų mažesnio tankio. Buferio su RNAlater santykis buvo 1:1. Trišakio nervo mazgai terpėje buvo patalpinti į centrifugavimo įrenginį ir buvo centrifuguojami 2000 x g vieną minutę. RNA buvo izoliuota pagal RNeasy mini protokolą (Qiagen, Valencia, CA), kurio metu reikėjo deoksiribonukleazės-1 (DNazės-1) tam, kad butų minimalizuotas genominės DNR užterštumas. Pirmoji komplementarios DNR grandinė buvo susintetinta naudojant Superscript pirmos grandinės sistemą, skirtą RT-PCR metodui (Invitrogen, Carlsbad, CA). Superscript sistema naudojo oligo(dT)12-18 gruntą (gruntas – trumpa viengrandė nukleino rūgštis, naudojama DNR sintezei inicijuoti).

25 Genetiniai gruntai, naudojami žiurkių natrio joninių kanalų α subvienetų genų Scn1a, Scn2a, Scn3a, Scn10a, Scn11a tranksripcijos amplifikacijai buvo pirmą kartą aprašyti Masamichi Gotoh su kolegomis (46). Priekinio galo genetinis gruntas, GTCCT TCATT AACAA CCCAA ACCT, bei galutinės dalies genetinis gruntas, CTGCT CAATG TAGAT GTCCT CAA, buvo naudojami 421 nukleotidų ilgio, iš Scn8a geno gauto PGR produkto amplifikacijai. Taip pat, 224 nukleotidų ilgio Scn9a geno produktas buvo amplifikuotas naudojant priekinį, CTATA TTTCA AACCG TACCC TTGC, bei galutinį, CTGAG TCACT GCTAA GCTCT TCTG, genetinius gruntus. Nebuvo nei vieno galutinio PGR kontrolės produkto, kurį sudarytų tik vanduo, ar produktas neturėtų šablono. Visų PGR produktų kilmė buvo patvirtina naudojant DNR sekoskaitą.

26

11.4 Duomenų analizė

Duomenys buvo analizuojami naudojant pCLAMP programinę įrangą (Axon Instruments). Įėjimo varža buvo vertinama, naudojant 400ms trukmės, hiperpoliarizuojančius, 25pA srovės šuoliukus. Membranos laiko konstanta buvo išmatuota pritaikant pirmos eilės eksponentinę funkciją registruojamo atsako kintančiai daliai. Membranos talpa buvo apskaičiuota membranos laiko konstantą dalinant iš įėjimo varžos. Vertinant veikimo potencialo savybes, buvo naudojamas trumpų (3 milisekundžių) 300pA srovės šuoliukų protokolas. Buvo vertinamos šios veikimo potencialo savybės: amplitudė, trukmė pusės amplitudės lygyje, veikimo potencialo repoliarizacijos trukmė, priekinio ir galinio frontų didžiausi statumai. Sujaudinimo slenkstis buvo išmatuotas paduodant vis didėjančio stiprio (kas 25pA ) srovės 400ms trukmės depoliarizuojančius šuoliukus. Hiperpoliarizacijos po veikimo potencialo amplitudė buvo matuojama nuo ramybės potencialo iki žemiausio kreivės taško. Hiperpoliarizacijos trukme buvo laikomas laiko tarpas reikalingas sugrįžti iki ramybės potencialo nuo žemiausio hiperpoliarizacijos taško. Vidutiniu neurono kūno dydžiu buvo laikomas ilgiausios ir trumpiausios išmatuotų ašių vidurkis. Matavimai buvo atliekami mikrometru. Duomenys pateikiami su ± standartiniu nuokrypiu (SD). Elektrofiziologinių matavimų skirtumai tarp trylikos ir šešiolikos parų embrionų trišakio mazgo neuronų buvo vertinami naudojant Mann-Whitney U testą. Skirtumai laikomi reikšmingais kai p≤0.05, konkrečios p reikšmės taip pat pateikiamos rezultatuose.

27

12. REZULTATAI

12.1 Neuronų morfologija

Trišakio nervo mazgo neuronų (n=48) kūno dydis buvo 24,6±3,6 µm. Buvo pastebėtas statistiškai reikšmingas (p<0,001) ląstelių augimas, matuojant ląsteles skirtingomis kultivavimo dienomis. 15 trišakio nervo mazgo neuronų, pripildytų Lucifer Yellow dažu per registravimo pipetę, turėjo paprastą neuritų konfigūraciją. 2 iš 15 neuronų buvo vienpoliai (unipoliniai), 8 iš 15 buvo dvipoliai (bipoliniai), bei 5 iš 15 buvo pseudounipoliniai. Neuronų nuotraukos ir grafikas, atspindintis E13 ir E16 neuronų dydžių skirtumą pateikiamas 1 pav.

1 pav. Trišakio mazgo neuronų morfologija.

V idut ini s s o m os di am et ras , µm

28

12.2 Elektrofiziologinės neuronų savybės

Tam, kad galėtume įvertinti bei palyginti tryliktos paros neuronų savybes, buvo tiriami 48 trišakio mazgo neuronai, kurie buvo kultivuojami nuo 5 iki 8 dienų. Kruskal-Wallis testo rezultatai, parodantys, jog skirtingu laiku nuo kultivavimo pradžios atlikti tų pačių parametrų matavimai gali būti lyginami tarpusavyje, pateikti 1 lentelėje. Kultivuojant trylikos parų trišakio mazgo neuronus 5-8 dienas, statistiškai reikšmingai nesikeitė: membranos ramybės potencialas, įėjimo varža, laiko konstanta, veikimo potencialo amplitudė, laikas, per kurį pasiekiama pusė amplitudės, priekinio ir galinio frontų didžiausi statumai, sujaudinimo slenkstis, matuojamas milivoltais (mV), hiperpoliarizacijos po veikimo potencialo trukmė (veikimo potencialo registravimo vaizdas pateikiamas 2 pav.). Tačiau membranos talpa, hiperpoliarizacijos amplitudė, sujaudinimo slenkstis, matuojamas pikoamperais (pA), statistiškai reikšmingai padidėjo. Veikimo potencialo repoliarizacijos trukmė, matuojant kelias dienas, mažėjo. Taip pat buvo pastebėti reikšmingi pokyčiai, neuronus veikiant 100-250 pA stiprio hiperpoliarizuojančia srove (3 pav.). Didėjant kultivavimo laikui, atsake vis labiau atsispindėjo nuo laiko priklausomi įlinkiai, kurie atspindi į neuronų vidų nukreiptą reaktyvuojančią srovę. Tokios srovės nebuvo pastebėta iki 6 kultivavimo dienomis. Tai buvo stebima visuose trišakio mazgo neuronuose jau 8-tą kultivavimo dieną. Trišakio mazgo neuronų membranos ramybės potencialas buvo -59,2 ± 3,6 mV, įėjimo varža buvo 407,6 ± 189,8 MΩ. Membranos laiko konstanta buvo 21,9 ± 14,3 milisekundžių (ms). Membranos elektrinė talpa penktąją kultivavimo dieną buvo 34,4 ±5,4 pF, o aštuntą kultivavimo dieną buvo 60,6 ± 12,2 pF (χ2_{= 15,31, p= 0,002). Tai , matomai, susiję su neurono kūno augimu. Trišakio mazgo neuronuose} pasiekus sujaudinimo slenkstį, kildavo pavieniai veikimo potencialai. Visi stebėti neuronai veikimo potencialo repoliarizacijos fazėje turėjo išlinkimą (2 pav.). Vidutinė veikimo potencialo amplitudė buvo 100,2 ± 4,4 mV. Vidutinis laikas, per kurį pasiekiama pusė amplitudės buvo 1,86 ± 0,24 ms. Maksimali galinio fronto statumo reikšmė buvo -53,5 ± 8,6 V/s, o priekinio fronto - 155,6 ± 23,0 V/s. Veikimo potencialo repoliarizacijos trukmė sumažėjo: penktą kultivavimo parą buvo 2,22 ± 0,29 ms, o aštuntą dieną 1,89 ± 0,15 (χ2_{= 11,79, p= 0,008). Hiperpoliarizacijos amplitudė po veikimo potencialo padidėjo} nuo -8,1 ± 1,5 mV penktą dieną, iki -10,5 ± 1,0 mV aštuntą dieną (χ2= 18,90, p< 0,001). Hiperpoliarizacijos trukmė nesikeitė ir buvo 46,8 ± 17,1 ms. Taip pat devyniolika trišakio mazgo neuronų buvo paveikti natrio kanalų blokatoriumi tetrodotoksinu (TTX). Neuronai buvo paveikti skirtingomis TTX koncentracijomis (0,3-10µM). Visos TTX koncentracijos tyrimo metu padidino veikimo potencialo susidarymo slenkstį, tačiau, net didelės (10µM) TTX dozės nesustabdė veikimo potencialo susidarymo neuronuose.

29 2 pav. E13 trišakio nervo mazgo neurono veikimo potencialas.

3 pav. E13 trišakio nervo mazgo neurono atsakas į dirginimą depoliarizuojančiais ir hiperpoliarizuojančiais srovės impulsais. Apatinis įrašas demonstruoja į neuronų vidų nukreiptos reaktyvuojančios srovės atsiradimą (išlinkimas hiperpoliarizaciniame atsake).

30 1 lentelė. Kruskal-Wallis testo rezultatai, leidžiantys vertinti E13 trišakio mazgo savybes 5-8

kultivavimo dienomis.

Trišakio mazgo neurono savybės Matavimų reikšmės

Vidutinis neurono kūno diametras, μm _χ2_{=24.88 p<0.001}

Ramybės potencialas, mV _χ2_{=5.27 p=0.153}

Įėjimovarža, MΩ _χ2_{=7.71 p=0.053}

Laiko konstanta, ms χ2_{=4.11 p=0.250}

Membranos elektrinė talpa, pF χ2_{=15.31 p=0.002}

Veikimo potencialo amplitudė, mV χ2_{=0.72 p=0.867}

Veikimo potencialo pusinė trukmė, ms χ2_{=2.75 p=0.433}

Veikimo potencialo galinio fronto statumo maksimalios reikšmės, V/s χ2_{=2.74 p=0.434}

Veikimo potencialo kreivės priekinio fronto statumo maksimalios reikšmės, V/s

χ2_{=1.92 p=0.588}

Veikimo potencialo repoliarizacijos trukmė, ms χ2_{=11.51 p=0.009}

Sujaudinimo slenkstis, mV χ2_{=1.25 p=0.740}

Sujaudinimo slenkstis, pA χ2_{=11.79 p=0.008}

Hiperpoliarizacijos po veikimo potencialo amplitudė, mV χ2_{=18.90 p<0.001}

31

12.3 Tryliktos (E13) ir šešioliktos (E16) paros embrionų trišakio nervo

mazgo elektrofiziologinių savybių palyginimas

Tam, kad galėtume vertinti trišakio mazgo neuronų embrioninį vystymąsi, buvo ištirtos bei palygintos E13 ir E16 embrionų elektrofiziologinės savybės. Jos patektos 2 lentelėje. Neurono kūno dydis išaugo nuo 24,6 ± 3,6 µm E13 dieną iki 29,4 ± 3,3 µm E16 dieną (z=-7,2, p<0,001). Membranos ramybės potencialo reikšmės (z=-0,5, p=0,597), bei įėjimo varža (z=-0,3, p=0,735) statistiškai reikšmingai nesiskyrė tarp E13 ir E16. Membranos laiko konstanta ilgėjo nuo 21,9 ± 14,3 ms iki 27,1 ± 13,5 ms tarp E13 ir E16 dienų (z=-2,8, p=0,006). Membranos elektrinė talpa padidėjo tarp E13 (51,7 ± 16,4 pF) ir E16 (68,7 ± 19,3 pF) dienų (z=-5,3, p<0,001). Tiek E13, tiek E16 veikimo potencialų forma buvo panaši. Taip pat abiejų grupių neuronai turėjo išlinkimą repoliarizacijos fazėje. Be minėtų panašumų, buvo pastebėtų ir skirtumų tarp E13 ir E16 neuronų veikimo potencialo charakteristikų. Veikimo potencialo amplitudė pakilo nuo 100,2 ± 4,4 mV iki 105,2 ± 6,9 mV (z=-5,7, p<0,001). Veikimo potencialo kilimo ir kritimo frontai tapo labiau pasvirę: dešinėje pusėje nuo -53,5 ± 8,6 V/s iki -40,5 ± 8,0 V/s 8,2, p<0,001), o kairėje pusėje nuo 155,6 ± 23,0 V/s iki 127,6 ± 34,2 V/s (z=-5,8, p<0,001). Dėl labiau pasvirusių frontų, prailgėjo ir veikimo potencialo repoliarizacijos trukmė. E13 jis buvo 2,13 ± 0,31 ms, o E16 jis buvo 3,19 ± 0,71 ms (z=-8,8, p<0,001). Taip pat prailgėjo ir pusinės amplitudės pasiekimo trukmė nuo 1,86 ± 0,24 ms iki 3,08 ± 0,73 ms (z=-5,7, p<0,001). Slenkstinis potencialas didėjo, vystantis embrionams – tryliktą embriogenezės parą jis buvo -33,8 ± 2,0 mV, o šešioliktą - -35,8 ± 4,6 mV (z=-3,9, p<0,001). Tačiau, srovė, kurios reikia veikimo potencialams neuronuose sukelti, statistiškai reikšmingai nesikeitė (z=-1,3, p=0,199). Vystymosi metu, hiperpoliarizacijos po veikimo potencialo amplitudė padidėjo nuo -9,5 ± 1,7 mV iki 132,2 ± 91,2 mV (z=-3,7, p<0,001) ir tapo žymiai ilgesnė – nuo 46,8 ± 17,1 ms iki 132,2 ± 91,2 ms (z=-6,7, p<0,001). Taip pat, tiek E13, tiek E16 trišakio mazgo neuronai turėjo TTX atsparius veikimo potencialus. Statistiškai reikšmingai pakitusių savybių grafiniai duomenys pateikiami 4 pav. Statistiškai reikšmingai nepakitusių savybių grafiniai duomenys pateikiami 5 pav.

32 4 pav. Statistiškai reikšmingai nepakitusių charakteristikų grafiniai duomenys.

R amybės potenc iala s, m V La iko kons tanta , ms Ve iki mo pot enc ialo a mpl it udė , mV Ve iki mo pot enc ialo pusi nė trukmė , ms P ada vim o va rž a, MΩ Ve iki mo pot enc ialo sl en ksti s, mV Ve iki mo pot enc ialo kr eiv ės de šinės da li es maksim ali re ikšm ė, V/s Ve iki mo pot enc ialo kr eiv ės de šinės da li es maksim ali re ikšm ė, V/s Hipe rpolia riz ac ij os po ve iki mo potenc ialo trukmė , ms

33 5 pav. Statistiškai reikšmingai pakitusių charakteristikų grafiniai duomenys.

S ujaudinim o sl enkst is, p A Me mbra nos e lektrin ė tal pa , pF H ip erpo liari zacijo s, po v eiki m o p o te n cial o a m p litud ė, m V

34 2 lentelė. E13 ir E16 neuronų elektrinių savybių palyginimas.

Trišakio mazgo neurono savybės E13 E16 Mann-Whitney U testo

rezultatai

Vidutinis neurono kūno diametras, μm 24.6 ± 3.6 29.4 ± 3.3 z=-7.2 p<0.001 Ramybės potencialas, mV -59.2 ± 2.5 -59.4 ± 5.0 z=-0.5 p=0.597 Iėjimo varža, MΩ 407.6 ± 189.8 391.5 ± 171.6 z=-0.3 p=0.735 Laiko konstanta, ms 21.9 ± 14.3 27.1 ± 13.5 z=-2.8 p=0.006 Membranos elektrinė talpa, pF 51.7 ± 16.4 68.7 ± 19.3 z=-5.3 p<0.001 Veikimo potencialo amplitudė, mV 100.2 ± 4.4 105.2 ± 6.9 z=-5.7 p<0.001 Veikimo potencialo pusinė trukmė, ms 1.86 ± 0.24 3.08 ± 0.73 z=-9.9 p<0.001 Veikimo potencialo galinio fronto

statumo maksimalios reikšmės, V/s

-53.5 ± 8.6 -40.5 ± 8.0 z=-8.2 p<0.001

Veikimo potencialo kreivės priekinio fronto statumo maksimalios reikšmės, V/s

155.6 ± 23.0 127.6 ± 34.2 z=-5.8 p<0.001

Veikimo potencialo repoliarizacijos trukmė, ms 2.13 ± 0.31 3.19 ± 0.71 z=-8.8 p<0.001 Sujaudinimo slenkstis, mV -33.8 ± 2.0 -35.8 ± 4.6 z=-3.9 p<0.001 Sujaudinimo slenkstis, pA 136.4 ± 41.6 126.6 ± 42.0 z=-1.3 p=0.199 Hiperpoliarizacijos po veikimo potencialo amplitudė, mV -9.5 ± 1.7 -11.0 ± 2.2 z=-3.7 p<0.001 Hiperpoliarizacijos po veikimo potencialo trukmė, ms 46.8 ±17.1 132.2 ± 91.2 z=-6.7 p<0.001

35

12.4 Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijų

rezultatai

RNA buvo izoliuota iš trišakio mazgo neuronų, kurie buvo išpreparuoti tryliktą bei šešioliktą kontroliuojamo nėštumo parą. Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija buvo atlikta naudojant septynių natrio kanalų genų gruntą. Scn1a (Nav1.1), Scn2a (Nav1.2), bei Scn3a (Nav1.3)genų ekspresija buvo intensyvi tiek E13, tiek E16 (6 pav.) Taip pat buvo matomi Scn8a (Nav1.6) geno transkripcijos produktai. Periferinei nervų sistemos neuronams specifiškas kanalo Scn9a (Nav1.7) genas (TTX jautrus) ir Scn10a (Nav1.8) genas (TTX rezistentiškas) turėjo intensyvią ekspresiją tiriamuoju laikotarpiu (6 pav.) Buvo pastebėtas įdomus atvejis, dėl TTX atsparaus kanalo Scn11a (Nav1.9), kurio ekspresija buvo vėlesnė, lyginant su kitais kanalais. Šis genas, koduojantis Nav1.9 kanalą, buvo pastebėtas tik nuo E16 paros. 6 pav. pateikiama E13 ir E16 trišakio mazgo neuronų RT-PCR vaizdiniai rezultatai.

6 pav. RT-PCR vaizdiniai duomenys. 1- Scn1a/Nav1.1;

36

13. REZULTATŲ APTARIMAS

Šio tyrimo metu įvertintos tryliktos paros žiurkių embrionų trišakio mazgo neuronų elektrofiziologinės savybės, bei šios savybės yra lyginamos su šešioliktos paros žiurkių embrionų neuronų savybėmis, kurios pateikiamos jau ankščiau (47). Taip pat kaip ir tyrime su E16 neuronais, E13 neuronai buvo tiriami eksplantuojant trišakį mazgą ir perkeliant jį į kultivavimo terpę. E13 trišakio mazgo neuronai, praturtinti optimaliu neurotrofiniu faktoriumi (NGF), kultivuojant išvystė plačius neuronų ataugų tinklus, bei migravo nuo mazgo centro į periferiją, suteikdami galimybė tirti jų elektrines savybes, naudojant visos ląstelės elektrinių savybių registravimo techniką. Vertinimui buvo naudojami E13 neuronai po 5-8 kultivavimo dienų, kurių metu buvo palaikomos stabilios neuronų savybės bei sąlygos. Tačiau šiuo periodu padidėjo ląstelių kūno dydžiai. Tikėtina, jog dėl to pakito ir membranos elektrinė talpa, nes membranos elektrinė talpa priklauso nuo membranos paviršiaus ploto. Veikimo potencialo repoliarizacijos trukmė taip pat mažėjo ilgėjant kultivavimo trukmei, tačiau tai neturėjo poveikio veikimo potencialo formai, frontų statumui ar pačiai veikimo potencialo trukmei. Taip pat reikėjo stipresnės elektros srovės, kad butų pasiektas sujaudinimo slenkstis. Šis rodmuo reikšmingai išaugo 5-8 kultivavimo dienomis, o tai galėtų reikšti papildomą joninių kanalų formavimąsi neuronuose, panašesnį į šešioliktos paros neuronų. Viena konkreti savybė, atsispindėjusi E13 pavieniuose neuronuose tik nuo šeštos kultivavimo dienos, o visuose – devintą kultivavimo parą, tačiau E16 užfiksuota visuose neuronuose buvo hiperpoliarizacijos metu atsirandantis išlinkimas ląstelės atsake dėl vidinės reaktyvuojančios srovės. Šis reiškinys galėtų liudyti, jog būtent šiuo embriogenezės metu formuojasi tam tikri joniniai kanalai, kurie ir yra atsakingi už minėtos srovės tekėjimą. Tačiau kyla klausimas, ar šis procesas, vykstantis neuronus kultivuojant, yra toks pat in vivo sąlygomis. Lyginant šiuos duomenis su E16 tyrimų rezultatais, kuomet visi neuronai turėjo depoliarizuojantį išlinkimą trečią kultivavimo parą, galime teigti, jog šie kanalai nėra susiformavę žiurkių embrionuose iki tryliktos nėštumo paros. Lyginant E13 ir E16 neuronų elektrofiziologinių tyrimų duomenis, tampa aišku, jog šiame embriogenezės periode vyksta reikšmingi fiziologiniai pokyčiai neuronuose. Daugiausiai šie pokyčiai atsispindi stebint veikimo potencialo formą. Šiuo periodu veikimo potencialo amplitudė padidėjo, veikimo potencialas prailgėjo, hiperpoliarizacija po veikimo potencialo reikšmingai pailgėjo. Tai siejama su naujų joninių kanalų formavimusi laike tarp E13 ir E16. Pasyvios membranos savybės keitėsi mažiau arba nesikeitė išvis. Lyginant aktyviųjų bei pasyviųjų membranų savybių pokyčius tarp E13 ir E16, galime teigti, jog neuronuose vyksta reikšmingi virsmai, susiję su ląstelių elektriniu jautrumu. Kaip ir minėta ankščiau,

37 smarkiai kinta veikimo potencialo forma, trukmė, ir tai susiję su naujų kanalų formavimusi šiuo periodu. Tai patvirtino RT-PCR tyrimo rezultatai. Išanalizavus juos, pastebėta, jog E13 neuronai neturi susiformavusių TTX atsparių kanalų NaV1.9, o E16 neuronuose, šio kanalo genas jau buvo aptiktas. Kitas TTX atsparių natrio jonų kanalo NaV1.8 genas buvo rastas tiek E13, tiek E16 trišakio mazgo neuronuose. Šiuos genetinius tyrimus pagrindžia su natrio kanalų blokatoriumi tetrodoksinu atlikti tyrimai. Trišakio mazgo neuronai generavo TTX atsparius veikimo potencialus tiek E13, tiek E16 neuronuose. Būtent dėl to, jog RT-PCR tyrimuose nebuvo rasti NaV1.9 genai, o TTX atsparūs veikimo potencialai jau egzistavo, galime daryti prielaidą, jog būtent NaV1.8 natrio kanalai yra svarbiausi ląstelių elektriniam sujaudinimui E13 trišakio mazgo neuronuose. Takeshi Suwabe su kolegomis tyrė tos pačios rūšies žiurkių E14 užpakalinio tractus solitarii branduolio neuronus bei jų savybes darbe „Pre- and postnatal differences in membrane, action potential, and ion channel properties of rostral nucleus of the solitary tract neurons“ (48). Neuronų kūno dydis, dendritų šakojimasis, kūno ataugų ilgis didėjo laikui bėgant, o neuronų membranos ramybės potencialas, įėjimo varža, laiko konstanta mažėjo. Šiame tyrime tarp E13 ir E16 neuronų nei įėjimo varža, nei ramybės potencialas statistiškai reikšmingai nesiskyrė, o laiko konstanta – atvirkščiai – statistiškai reikšmingai padidėjo. Membranos elektrinė talpa didėjo abiejų struktūrų neuronuose, dėl to, jog šis biofizikinis parametras nėra specifiškas anatominei vietai, o priklauso nuo membranos paviršiaus ploto. Skirtumai tarp šių dviejų tyrimų galėjo atsirasti dėl to, jog buvo tirtos skirtingose anatominėse srityse esančių neuronų savybės. Taip pat Suwabe (48) tyrimo metu duomenys buvo lyginami tarp prenatalinio (E14) laikotarpio ir postnatalinio (20 parų po gimimo) laikotarpio, o šio tyrimo metu duomenys buvo tik prenatalinio periodo. Naudodami 1 µM TTX, Suwabe nustatė, jog TTX- jautrūs natrio joniniai kanalai jau yra susiformavę E14 nucleus tracti solitarii neuronuose. Abiejų tyrimų metu, bręstant neuronams, didėjo veikimo potencialo amplitudė, tačiau skirtingai keitėsi veikimo potencialai. Nucleus tracti solitarri neuronų veikimo potencialai tapo siauresni, o frontai - statesni, kai tuo metu trišakio mazgo neuronų veikimo potencialo formos tapo platesnės bei šiek tiek plokštesnės. Tikriausiai tai galima būtų sieti su skirtingoms funkcijoms pritaikytų neuronų diferenciacijos ypatumais.