1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS
Karolis Lideikis
6 kursas, 17 grupėGlutamato transporterio EAAT2 rs4354668 genetinių variantų ryšys su
priklausomybių išsivystymo rizika
Baigiamasis magistro darbas Studijų programa - medicina
Darbo vadovas: Dr. Ramūnas Jokubka Konsultantė: Dokt. Miglė Kaminskaitė
2
TURINYS
1. SANTRAUKA ... 3
2. SUMMARY ... 4
3. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 5
4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5
5. SANTRUMPOS ... 6
6. SĄVOKOS ... 7
7. ĮVADAS ... 8
8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...10
9. LITERATŪROS APŽVALGA ...11
9.1 Glutamatas, jo metabolizmas, išskyrimas CNS, receptoriai bei nešikliai ...11
9.2 EAAT2, jo funkcija, struktūra ir lokalizacija...12
9.3 Alkoholio priklausomybė ir glutamatas ...13
9.4 Alkoholio priklausomybė ir glutamato transporteris EAAT2 ...14
9.5 Alkoholizmo gydymas ...15
10. METODOLOGIJA ...17
10.1 Tyrimo planavimas ...17
10.2 Tyrimo objektas ...17
10.3 Tiriamųjų atranka ir mėginių paėmimas ...17
10.4 DNR išskyrimas ...18
10.5 Genotipavimas ...19
10.6 Duomenų analizė ...20
11. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...21
11.1 EAAT2 geno VNP (rs4354668) genotipų ir alelių pasiskirstymas ...21
11.2 EAAT2 geno VNP (rs4354668) ryšys su alkoholio vartojimo rizika ...22
12. IŠVADOS ...24
13. LITERATŪROS SĄRAŠAS ...25
3
1. SANTRAUKA
Autorius: Karolis Lideikis
Darbo pavadinimas: Glutamato transporterio EAAT2 rs4354668 genetinių variantų ryšys su priklausomybių išsivystymo rizika.
Darbo tikslas: Ištirti glutamato transporterio EAAT2 rs4354668 įtaką rizikingam alkoholio vartojimui. Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti EAAT2 rs4354668 polimorfizmo genotipų dažnius rizikos ir kontrolinėje grupėse. 2. Nustatyti EAAT2 rs4354668 genotipų ryšį su alkoholio vartojimo rizika.
Metodika: LSMUL KK Neurochirurgijos skyriuje buvo renkami tiriamųjų seilių mėginiai (burnos gleivinės epitelio ląstelės) bei vykdomos apklausos apie alkoholio vartojimą. Iš laboratorijoje išskirtų DNR mėginių nustatytas EAAT2 geno VNP (rs4354668), tam taikytas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos (TL-PGR) metodas. Gavus duomenis, atlikti statistiniai skaičiavimai, naudojant IBM SPSS, R (3.4.3 versija) statistinį paketą, programą SNPassoc.
Tyrimo rezultatai: Tyrimo metu statistiškai reikšmingų duomenų nebuvo gauta, taigi ryšys tarp EAAT2 geno polimorfizmo (rs4354668) ir rizikingo alkoholio vartojimo nerastas.
Išvados: 1. EAAT2 geno rs4354668 vieno nukleotido polimorfizmo dažniausiai pasitaikęs genotipas tiek rizikos, tiek kontrolinėje grupėje buvo T/G. 2. Nėra ryšio tarp EAAT2 geno rs4354668 VNP genotipų ir rizikingo alkoholio vartojimo.
4
2. SUMMARY
Author: Karolis Lideikis
Title: Association between genetic variants of the glutamate transporter EAAT2 rs4354668 and risk of alcohol dependence development.
Purpose: To evaluate influence of the glutamate transporter EAAT2 rs4354668 on risky alcohol consumption.
Objectives: 1. To evaluate frequencies of the EAAT2 rs4354668 polymorphism genotypes in two groups (risk and control). 2. To evaluate connection between genotypes of the EAAT2 rs4354668 and risky alcohol consumption.
Methods: Information on the subjects (saliva samples and polls about alcohol consumption) was collected in Neurosurgery section of Hospital of Lithuanian University of Health Sciences Kauno Klinikos. The SNP (rs4354668) in the EAAT2 gene was determined from extracted DNA samples using Real-time PCR method. When the data was collected, statistical tests were performed using the IBM SPSS, R (3.4.3 version) statistical package, SNPassoc software.
Results: During the study, there was no statistically significant association between the SNP rs4354668 of the EAAT2 gene and risky alcohol consumption.
Conclusions: 1. T/G genotype was the most common in both groups (risk and control) of the SNP rs4354668 of the EAAT2 gene. 2. There is no association between genotypes of the SNP rs4354668 of the EAAT2 gene and risky alcohol usage.
5
3. INTERESŲ KONFLIKTAS
Autoriui interesų konflikto nebuvo.
4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Leidimą tyrimui atlikti išdavusio Etikos komiteto pavadinimas: LSMU Bioetikos centras Leidimo numeris: BEC-HF-186
6
5. SANTRUMPOS
EAAT2 – sužadinantysis amino rūgščių nešiklis 2 (angl. Excitatory amino acid transporter 2) CNS – centrinė nervų Sistema
VNP – vieno nukleotido polimorfizmas (angl. single nucleotide polymorphism, SNP) DNR – deoksiribonukleorūgštis
VGLUT - glutamato nešiklis per pūslelių membraną (angl. vesicular glutamate transporter) NMDA – N-metil-D-aspartato receptorius (angl. N-methyl-D-aspartate receptor)
AMPA – hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropijoninės rūgšties receptorius (angl. α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor)
GLT-1 – glutamato transporteris 1 kb – kilobazė
iRNR – informacinė ribonukleorūgštis (angl. mRNA) ATP - Adenozin 5' trifosfatas
NAc – pasvirasis branduolys (lot. Nucleus accumbens)
VTA - ventralinė smagenų padangtė (angl. ventral tegmental area)
TL-PGR – tikro laiko polimerazės grandininė reakcija (angl. real-time PCR)
7
6. SĄVOKOS
Ekscitotoksiškumas –ląstelės pažeidimas, kurį sukelia ekscitatoriniai (jaudinamieji) neurotransmiteriai. Ilgalaikė depresija –ilgalaikis ryšio tarp presinapsinio ir postsinapsinio neurono silpninimas.
Ilgalaikė potenciacija –ilgalaikis ryšio tarp presinapsinio ir postsinapsinio neurono stiprinimas.
Neurotransmisija - procesas, kai smegenyse esantys neuromediatoriai perduoda nervinį impulsą iš vieno neurono aksono galo (presinapsinis neuronas) kito neurono dendritui (postsinapsinis neuronas).
Sinapsinis plastiškumas –sinapsių gebėjimas keisti savo stiprumą. Sinapsė –juntis tarp dviejų neuronų, pritaikyta signalams perduoti.
Vieno nukleotido polimorfizmas –vieno nukleotido pasikeitimas, kuris atsiranda specifinėje genomo vietoje.
8
7. ĮVADAS
Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis žalingas alkoholio vartojimas kasmet pasaulyje sukelia 3 milijonus mirčių. Yra 230 skirtingų ligų, su kuriomis siejamas alkoholio poveikis. Žala sveikatai ir gerovei padaroma ne tik vartotojui, bet ir aplink jį esantiems žmonėms. 2016 m. gryno alkoholio kiekis, tenkantis vienam žmogui (15 metų ir vyresniam) visame pasaulyje, buvo 6,4l (Lietuvoje - ≥ 12,5l) Neregistruotas alkoholio suvartojimas pasaulyje sudaro 26 % viso suvartojamo kiekio. Remiantis tų pačių metų duomenimis, 40 % alkoholio vartotojų pasaulyje priskiriami sunkiems epizodiniams vartotojams [1,2].
Daugiau nei pusė suaugusiųjų amerikiečių savo šeimos istorijoje turi alkoholizmo arba piktnaudžiavimo alkoholiu atvejų. 1 iš 4 amerikiečių per savo gyvenimą turėjo alkoholio vartojimo sutrikimą. Apskaičiuota, kad tai JAV ekonomikai kainuoja 225 milijardų dolerių kasmet. JAV ligų kontrolės ir prevencijos centro duomenimis alkoholio vartojimo sutrikimai užima 3 vietą tarp mirčių, kurioms galima užkirsti kelią. Ne visiems pabandžiusiems narkotinių medžiagų išsivysto priklausomybė. Nustatyta, kad paveldimumas turi didžiulę reikšmę alkoholizmo predispozicijai. Asmenys, šeimoje turintys alkoholizmo atvejų, turi nuo 3 iki 7 kartų didesnę riziką alkoholizmui išsivystyti [3–6].
Alkoholis yra psichotropinis centrinės nervų sistemos (CNS) depresantas, kuris sukelia įvairius elgesio pokyčius. Dėl alkoholio poveikio atsiranda psichomotorinė depresija, sunkumai kaupti informaciją, logiškai mąstyti, motorinės sistemos sutrikimai, be to, stimuliuojama atpildo sistema [7].
Amerikos psichiatrijos asociacija apibrėžė keletą diagnostinių kriterijų, kuriais remiantis galima nustatyti priklausomybę narkotinėms medžiagoms. Šie kriterijai yra: medžiagos vartojimo kontrolės praradimas, pasikartojantys nesėkmingi bandymai nutraukti ar sumažinti vartojimą, tebesitęsiantis medžiagos vartojimas net ir atsiradus neigiamoms pasekmėms, tolerancijos ar nutraukimo simptomų atsiradimas [8–10]. Troškimo ir atkryčių dažnis yra didelis, priklausomybės išsivystymo numatymas ir
atpažinimas daugeliu atvejų yra sudėtingas. Dėl to, vienas patraukliausių gydymo objektų yra narkotinės medžiagos nutraukimo simptomų palengvinimas [8].
Priklausomybę sukeliantis narkotinių medžiagų poveikis siejamas su mezolimbine dopamino atpildo sistema, tačiau keletą pastarųjų dešimtmečių didžiulio dėmesio šioje sferoje (įskaitant priklausomybę nuo alkoholio) susilaukė glutamatas [9]. Ilgalaikis alkoholio vartojimas sukelia hiperglutamaterginę būklę (padidėjęs ekstraląstelinio glutamato kiekis dėl glutamato receptorių ir transporterių pakitimų). Ši būklė siejama ne tik su alkoholio nutraukimu ir troškimu, tačiau ir su
9 neurotoksiniu efektu [11]. Kadangi glutamato transporterių pokyčiai yra ypatingai svarbūs alkoholio priklausomybės išsivystymui, o jų atsiradime dalyvauja ir genetinis komponentas [3,8,9], šio baigiamojo magistrinio darbo tikslas yra išsiaiškinti, koks yra ryšys tarp EAAT2 (glutamato nešiklis, atsakingas už maždaug 90% ekstraląstelinio glutamato pašalinimą) geno vieno nukleotido polimorfizmo (VNP) rs4354668 ir alkoholio priklausomybės išsivystymo. Tam buvo atliekami DNR (deoksiribonukleorūgštis) tyrimai, panaudojant tyrime dalyvavusių asmenų surinktus seilių mėginius, bei analizuojami tiriamųjų užpildytų anketų (padedančių įvertinti alkoholio prillausomybės riziką) duomenys.
10
8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas
Ištirti glutamato transporterio EAAT2 rs4354668 įtaką rizikingam alkoholio vartojimui.
Uždaviniai:
1. Nustatyti EAAT2 rs4354668 polimorfizmo genotipų dažnius rizikos ir kontrolinėje grupėse. 2. Nustatyti EAAT2 rs4354668 genotipų ryšį su alkoholio vartojimo rizika.
11
9. LITERATŪROS APŽVALGA
9.1 Glutamatas, jo metabolizmas, išskyrimas CNS, receptoriai bei nešikliai
Glutamatas yra pagrindinis ir labiausiai paplitęs sužadinantysis neurotransmiteris žinduolių CNS. Jis yra ypatingai svarbus normaliai smegenų veiklai, įskaitant kognityvines funkcijas, atmintį, mokymąsi, neuroplastiškumą [12,13]. Glutamatas taip pat yra Gama-amino sviesto rūgšties (angl. GABA) metabolinis pirmtakas [14]. Taigi, glutamatas sintetinamas iš alfa-ketoglutarato (kuris dalyvauja Krebso cikle), veikiant glutamato dehidrogenazei. Tuomet jis išskiriamas iš sinapsinių pūslelių į sinapsinį plyšį, glijos ląstelės pasisavina perteklinį glutamatą iš ekstraląstelinio skysčio ir ten jis verčiamas glutaminu, veikiant glutamino sintetazei. Tada glutaminas transportuojamas (glutamino transporterio pagalba) iš glijos ląstelių į presinapsinę neurono dalį, ten, veikiant glutaminazei, verčiamas į glutamatą. Tada glutamatas vėl transportuojamas į sinapsinę membraną ir pakuojmas į sinapsines pūsleles arba, veikiant glutamato dekarboksilazei, verčiamas į GABA [3,15,16].
Žinduolių CNS veikia preciziška fiziologinė glutamato kontrolė, nes esant pernelyg didelei glutamato stimuliacijai, galimas ekscitotoksinis pažeidimas. Didžiausia glutamato koncentracija randama neuronų galuose esančiose sinapsinėse pūslelėse, į kurias jis supakuojamas (glutamato nešiklio per pūslelių membraną (angl. vesicular glutamate transporter (VGLUT)) dėka), ir iš kurių jis išskiriamas egzocitozės būdu. [14] Patekęs į sinapsinį plyšį glutamatas geba sužadinti nervines ląsteles, kadangi savo paviršiuje jos turi glutamato receptorius. Glutamato receptoriai yra išsidėstę ant presinapsinių, postsinapsinių bei ant glijos ląstelių. Šie receptoriai yra jonotropiniai (NMDA, AMPA, kainatiniai) bei metabotropiniai (skiriamos trys grupės, kurios apima mGlu1-mGlu8 receptorius) [3,17]. Glutamato veikimas priklauso nuo receptoriaus subvieneto bei jo vietos (sinapsė, perisinapsė ar ekstrasinapsė). Jei šis poveikis per stiprus, galima ląstelių žūtis, šis procesas vadinamas ekscitotoksiškumu. Kad taip neįvyktų, egzocitozės būdu išsiskyręs glutamatas yra surenkamas iš ekstraląstelinio tarpo, šį procesą atlieka glutamato nešikliai (EAAT), kurių daugiausia yra ant astrocitų [7,18,19]. Verta paminėti, kad anksčiau minėtų glutamato receptorių stimuliacija svarbi sinapsiniam plastiškumui (ilgalaikei potenciacijai - LTP ir ilgalaikei depresijai - LTD) [17,19].
12 9.2 EAAT2, jo funkcija, struktūra ir lokalizacija
Nuo natrio priklausomų glutamato nešiklių šeima (EAAT) pašalina glutamatą iš ekstraląstelinės aplinkos. EAAT2 glutamatą perneša prieš koncentracijos gradientą, kartu su glutamatu jie perneša tris natrio jonus ir vieną protoną, mainais į vieną kalio joną [8,20]. Šių nešiklių funkcija yra itin svarbi, kadangi sinapsinio glutamato perteklius gali sukelti neuronų ekscitotoksiškumą ir/ar žūtį [11,21].
Skiriami penki žinduolių EAAT potipiai (EAAT1-EAAT5). EAAT1 ir EAAT2 (jų atitikmenys graužikuose vadinami GLAST ir GLT-1) yra svarbiausi potipiai, atsakingi už ekstraląstelinio glutamato klirensą CNS, vykstant glutamato neurotransmisijai [9,17,21]. Daugiausia jų astrocituose. EAAT1 randamas smegenėlėse, o EAAT2 pasiskirstęs kur kas plačiau, tačiau didžiausia jo raiška priekinėse smegenyse (angl. forebrain) [8,14,20]. Priklausomybių tyrimuose daugiausia dėmesio susilaukia EAAT2, kadangi jis yra pagrindinis EAAT potipis, kurio raiška dryžuotajame kūne (pamato branduolių dalis, siejama su priklausomybėmis ir kitais psichikos sutrikimais) yra atsakinga už maždaug 90% ekstraląstelinio glutamato pašalinimą. Taigi, pakitimai EAAT2 raiškoje ženkliai keičia glutamato pernašą [8,9,22].
Struktūriškai EAAT sudaryti iš 8 transmembraninių segmentų. EAAT2/GLT1 koduojama sritis apima daugiau kaip 100 kilobazių (kb), susideda iš 11 egzonų bei koduoja neįprastai ilgą transkriptą (10-12 kb). Kita vertus, paties baltymo koduojama seka yra tik 1,7 kb, tai reiškia, jog EAAT2 informacinė ribonukleorūgštis (iRNR) turi didelę netransliuojamą sritį (UTR) – 9-10 kb. Tiek in vivo, tiek in vitro buvo identifikuoti skirtingi EAAT2 iRNR transkriptai, tai sudarao sąlygas susidaryti skirtingiems EAAT2 splaisingo variantams [8,22]. Glutamatas yra pagrindinis sužadinantysis neurotransmiteris žinduolių CNS. Jis yra ypatingai svarbus normaliai smegenų veiklai, įskaitant kognityvines funkcijas, atmintį, mokymąsi, neuroplastiškumą [9,13].
Tačiau galimas ir atvirkštinis transportas - EAAT taip pat gali ir išskirti glutamatą į ekstraląstelinį tarpą [9,20]. Normaliomis fiziologinėmis sąlygomis EAAT2 perneša glutamatą į astrocitus dėl Na-K ATP-azės. Esant sumažėjusiai Na-K ATP-azės veiklai, dėl energijos trūkumo (sumažėjusi Adenozin 5' trifosfato (ATP) sintezė), sutrikdomi Na ir K gradientai, dėl to įvyksta membranos depoliarizacija ir EAAT2 gali pernešti glutamatą išorėn [20].
13 9.3 Alkoholio priklausomybė ir glutamatas
Priklausomybė yra elgesio būsena, kuriai būdingas pakitęs atpildo suvokimas, sutrikęs emocinis atsakas ir prastas sprendimų pasirinkimas. Šioje vietoje labai svarbų vaidmenį atlieka žievės - dryžuotojo kūno - gumburo grandinė, įskaitant ir prelimbinę žievę, pasvirąjį branduolį (lot. Nucleus accumbens, NAc), ventralinę smegenų padangtę (angl. ventral tegmental area, VTA). Atliktuose vaizdiniuose smegenų tyrimuose nustatyta, kad atkrytis, siekiant gauti narkotinių medžiagų, yra susijęs su prefrontaline ir priekine juostine (angl. anterior cingulate cortex) smegenų žievėmis, kurių projekcijos siekia NAc. Atliktos studijos su gyvūnais rodo, kad sugrįžęs potraukis narkotinėms medžiagoms (po buvusio jų nutraukimo) atsiranda dėl glutamato transmisijos iš prefrontalinės žievės į NAc pusiausvyros sutrikimo. Tai siejama su padidėjusiu ekstraląstelinio glutamato kiekiu NAc [20,23]. Taigi, glutamatas atlieka svarbų vaidmenį priklausomybėje nuo narkotinių medžiagų, įskaitant alkoholį [9].
NAc svarbus neurobiologiniuose procesuose, kurie dalyvauja formuojantis atpildui, impulsyvumui ir priklausomybėms [23]. NAc gauna dopaminergines projekcijas iš VTA, glutamatergines projekcijas - iš žievinių, gumburinių sričių. Dopaminas tarpininkauja formuojantis priklausomybei, esant ūmiam narkotinių medžiagų piktnaudžiavimui [4,23]. Esant ilgalaikiam vartojimui, narkotinės medžiagos, įskaitant alkoholį, yra atsakingos už glutamato proveržį NAc sinapsėse. Pastarasis procesas, atliktuose tyrimuose su graužikais, siejamas su priklausomybe ir atkryčiu [23]. Ekstraląsteliniam glutamato padidėjimui NAc ir prefrontalinėje žievėje įtakos turi ir genetika. Žiurkės, turinčios polinkį alkoholiui, demosntruoja ryškesnį glutamato padidėjimą šiose srityse, negu žiurkės, kurios turi mažesnį polinkį alkoholiui. Glutamato neurotransmisijos pakitimai stebimi ir klinikinėse studijose, atliekamose su alkoholio priklausomybę turinčiais asmenimis. Pavyzdžiui, tiriant hipokampe esančio glutamato vaidmenį sunkios depresijos ir rizikingo alkoholio vartojimo metu, naudojant protonų magnetinio rezonanso spektroskopiją, buvo nustatyta, kad padidėjęs glutamato kiekis hipokampe tiesiogiai susijęs su abiejų būklių pasireiškimu [3].
Ūmiai vartojamas alkoholis slopina glutamaterginę transmisiją blokuodamas NMDA receptorius bei stiprina GABA-erginį aktyvumą [9,17,21]. Taigi, ankstyvose alkoholio piktnaudžiavimo stadijose veikia teigiamas stiprinimas (angl. Positive reinforcment), kuris skatina tolimesnį alkoholio vartojimą, dėl sukuriamo malonaus ir euforinio efekto [5]. Lėtinis alkoholio vartojimas siejamas su GABA–erginio aktyvumo slopinimu, glutamaterginio aktyvumo skatinimu (tai sukeliama per NMDA receptorių aktyvinimą), siekiant sugrąžinti glutamato homeostazę [9,17,21]. Manoma, kad šie procesai veikia kaip kompensacinis mechanizmas. To pasekoje, didėja ir dopaminerginis aktyvumas VTA, NAc, prefrontalinėje žievėje. Visa tai sukelia aversinę būseną, kuri numalšinama tik pavartojus alkoholio, ši būsena būna stipriai išreikšta nutraukus vartojimą [5,10]. Alkoholio nutraukimas (po ilgo vartojimo) padidina ekstraląstelinio
14 glutamato kiekį dryžuotajame kūne, migdoliniame kūne bei padidina NMDA receptorių jautrumą NAc, dėl šių procesų išryškėja nemalonūs simptomai (pvz.: traukuliai), siekiant jų išvengti/nutraukti vystosi alkoholio troškimas ir galimi atkryčiai [5,21].
Nepaisant daugelio neurotransmiterių dalyvavimo, vystantis priklausomybei nuo alkoholio, glutamaterginė sistema atlieka kritinį vaidmenį. Alkoholio vartojimas paveikia ekstraląstelinio glutamato kiekį ir įvairių jo transporterių raišką [21].
9.4 Alkoholio priklausomybė ir glutamato transporteris EAAT2
Glutamato transporteris 1 (GLT-1, taip pat žinomas kaip EAAT2) yra atsakingas už didžiąją dalį glutamato pašalinimo iš ekstraląstelinio tarpo tose smegenų dalyse, kurios siejamos su priklausomybės formavimusi, taigi šis transporteris ypač svarbus glutamato homeostazei [17,24]. Alkoholio priklausomybė yra susijusi su ryškiu glutamato transporterių raiškos sumažėjimu [21]. Lėtinis alkoholio vartojimas sukelia ryškų GLT-1 raiškos sumažėjimą NAc ir prefrontalinėje žievėje žiurkėms, kurios turi polinkį vartoti alkoholį. Be to, atlikti tyrimai parodė, kad mirusių žmonių alkoholikų smegenyse stebimas ryškus EAAT2 sumažėjimas, lyginant su mirusiais nealkoholikais [3,5,23,25]. Alkoholio sukeltas glutamato pašalinimo iš sinapsinio plyšio sumažėjimas sustiprina glutamaterginę transmisiją. Be to, sumažėjusi GLT-1 raiška leidžia glutamatui pasiekti užsinapsines sritis. Šis išsiliejimas gali suaktyvinti mGlur5 ir užsinapsinius NMDA receptorius ir taip sukelti padidėjusį alkoholio troškimą. GLT-1 raiškos sumažėjimas NAc srityje ir įvairių klasių narkotinių medžiagų vartojimas sukelia glutamaterginę disfunkciją ir glutamato kiekio padidėjimą NAc [23].
Literatūros duomenimis, pokyčiai glutamato receptoriuose, transporteriuose yra ypatingai svarbūs alkoholio priklausomybės išsivystymui, šių pokyčių atsiradime dalyvauja ir genetinis komponentas [3]. Vieno nukleotido polimorfizmai (angl. single nucleotide polymorphisms, SNPs) siejami su priklausomybėmis. Atliktų tyrimų metu, vokiečių alkoholikų, turinčių antisocialinį asmenybės sutrikimą, populiacijoje, buvo rastas padidėjęs EAAT2 geno alelio dažnis su VNP 5-ame egzone (G603A). Tačiau jis nebuvo rastas tarp alkoholikų, neturinčių antisocialinio asmenybės sutrikimo. Nors tirtoje populiacijoje nebuvo galima šio EAAT2 VNP sieti su alkoholizmu per se, bet buvo galima tai padaryti su rizikingo elgesio tendencija, kuri dažnai stebima asmenims, sergantiems alkoholizmu. Papildomai atlikto tyrimo metu buvo nustatyta sąsaja tarp G603A alelio ir alkoholinės cirozės [8,9]. Taip pat literatūroje aprašomas kitas SLC1A2 geno funkcinis VNP (rs4354668), esantis geno 11 chromosomos trumpajame petyje, p13 lokuse [26]. Jo G
15 alelis yra siejamas su sumažėjusiu glutamato transporterio EAAT2 aktyvumu ir psichinėmis ligomis, tačiau jis nebuvo tirtas dėl ryšio su alkoholio priklausomybe [27]. Tarp europiečių šio VNP T alelis paplitęs 59 proc., o G – 41 proc [28].
Daugybė tyrimų su pelėmis patvirtina EAAT2 dalyvavimą tiek ūmaus, tiek lėtinio alkoholio vartojimo sukeltuose procesuose, taip pat ir simptomuose, atsirandančiuose nutraukus alkoholio vartojimą. Padidėjusi EAAT2 raiška/funkcija palengvina alkoholio nutraukimo simptomus ir sumažina alkoholio vartojimą, dėl to dar labiau išryškėja EAAT2 svarba, sinapsinio glutamato perdavimo reguliacijoje [8].
9.5 Alkoholizmo gydymas
Siekiant palengvinti alkoholio priklausomybę GLT – 1 (EAAT2) yra laikomas molekuliniu taikiniu, nes jis yra pagrindinis ekstraląstelinio glutamato pasisavinimo reguliatorius smegenyse. Sukaupti duomenys rodo, kad priklausomybę sukeliančių medžiagų sukeltas elgesys graužikamas ir žmogui gali būti slopinamas, sugrąžinus glutamato homeostazę, atstatant EAAT2 funkciją ir raišką [5,20,21,23].
Atlikti tyrimai su ceftriaksonu (3 kartos cefalosporinas), nepaisant jo antibakterinio veikimo, parodė, kad šis antibiotikas padidina GLT – 1 (EAAT2) raišką ir funkciją smegenyse (NAc, prefrontalinėje žievėje, migdoliniame kūne, hipokampe) [3,5,8,20,23,24]. Tai daro šį vaistą patraukliu kandidatu priklausomybės gydymui, kadangi daugybė priklausomybę sukelenčių medžiagų sumažina anksčiau minėto baltymo raišką. Nustatyta, kad daugkartinis ceftriaksono skyrimas žiurkėms (linkusioms vartoti etanolį) ne tik sumažina alkoholio suvartojimą, bet ir palengvina jo nutraukimo simptomus [5,8,23,25,29]. Taip pat gydymas ceftriaksonu sumažina neuronų žūtį, šis neuroprotekcinis poveikis taip pat susijęs su vaisto sukeliamu GLT – 1 (EAAT2) raiškos padidinimu [24]. Dar reikia ištirti ceftriaksono poveikį kitoms smegenų sritims (nedalyvaujančioms formuojantis atpildui) ir išsiaiškinti ar šis vaistas gali sukelti neigiamą efektą smegenų neurochemijai [21].
Topiramatas – vaistas vartojamas kaip antikonvulsantas, taip pat vis dažniau vartojamas migrenai gydyti, kartais išrašomas esant bipoliniam sindromui ir potrauminiam stresui. Kaip ir daugelis kitų antikonvulsantų, topiramatas pasižymi keliais veikimo mechanizmais, įskaitant natrio ir kalcio kanalų slopinimu, GABAa receptorių aktyvinimu, be to pastebėta, kad jis blokuoja AMPA receptorius. Pastaraisiais metais vis daugiau kalbama, kad topiramatas gali būti naujas preparatas, skirtas priklausomybėms gydyti. Keletas atliktų klinikinių tyrimų pademonstravo topiramato gebėjimą paveikti glutamaterginę neurotransmisiją, slopinant glutamato receptorius (AMPA ir kainatinius), ir tokiu būdu
16 sumažinti alkoholio vartojimą bei troškimą [5,9]. Viename iš atliktų tyrimų nustatyta, kad topiramatas sumažina etanolio vartojimą žiurkėms, kurios turėjo polinkį alkoholiui, tačiau sumažėjimas nebuvo stebėtas žiurkėms, neturinčioms tokio polinkio [12,30]. Kitame tyrime, atliktame su žmonėmis, turinčiais alkoholio priklausomybę ir vieno nukleotido polimorfizmą (rs2832407) GRIK1 gene, koduojančiame kainatinį receptorių, buvo nustatytas skirtingas reagavimas į gydymą topiramatu. Asmenims, esantiems rs2832407*C alelio homozigotais, topiramatas sumažino alkoholio vartojimą, tačiau toks efektas nebuvo stebėtas rs2832407*A alelio turėtojams [30,31]. Šie duomenys rodo, kad topiramato alkoholio vartojimą mažinantis poveikis priklauso nuo genetinio faktoriaus, bet ne nuo vartojimo sunkumo laipsnio [12,30,31].
Tiek gyvūnų, tiek žmonių tyrimai parodė, kad N-acetilcisteinas geba grąžinti glutamato homeostazę (didindamas EAAT2 raišką) NAc srityje ir taip sumažinti alkoholio troškimą ir atkryčio riziką. Be to, N-acetilcisteinas didina ir cistino-glutamato keitiklio (angl. xCT) raišką, kuris irgi dalyvauja glutamato transmisijoje. Taip pat šis vaistas demonstruoja daug žadantį poveikį gydant patologinį lošimą, obsesinį-kompulsinį sutrikimą, šizofreniją ir bipolinį sindromą [23,32].
JAV maisto ir vaistų administracija (angl. Food and Drug Administration) patvirtinto Naltreksoną (ilgo veikimo injekuojamą formą), kaip vaistą, skirtą alkoholio ir opioidų priklausomybei gydyti [19]. Sintetinis GABA agonistas, Akamprosatas, kuris veikia kaip neselektyvus NMDA ir metabotropinių glutamato receptorių antagonistas, slopina perteklinį glutamato aktyvumą, taip sumažindamas alkoholio vartojimą. Šis preparatas taip pat buvo patvirtintas JAV maisto ir vaistų administracijos, kaip priemonė alkoholio atkryčiams išvengti [5,21].
17
10. METODOLOGIJA
10.1 Tyrimo planavimas
Planuojant baigiamąjį magistrinį darbą, buvo nuspręsta jį suskirstyti į keletą etapų. Pirmiausia, įvairiose LSMU bibliotekos prenumeruojamose duomenų bazėse rinkti informaciją, norint išsiaiškinti problemos aktualumą bei suprasti, kokia yra glutamato reikšmė priklausomybių vystymuisi. Tuomet rinkti tiriamųjų seilių mėginius bei apklausos duomenis, užsakyti reagentus tolimesniam laboratoriniam darbui. Išanalizavus turimą informaciją, gavus visas reikiamas priemones, darbą tęsti laboratorijoje. Surinktų mėginių DNR išskirti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Virškinimo sistemos tyrimo instituto Klinikinės ir molekulinės gastroenterologijos laboratorijoje. Iš išskirtų DNR mėginių nustatyti EAAT2 geno VNP (rs4354668), tam taikyti TL-PGR metodą. Gavus duomenis, atlikti statistinius skaičiavimus ir aprašyti gautus rezultatus.
10.2 Tyrimo objektas
Tiriamųjų asmenų (vyrų ir moterų, amžius nuo 18 metų) EAAT2 geno VNP (rs4354668). Šis genas buvo pasirinktas, nes yra susijęs su glutamatergine sistema, kuri siejama su priklausomybėmis nuo įvairių narkotinių medžiagų. VNP (rs4354668) yra funkcinis geno polimorfizmas ir jo G alelis siejamas su sumažėjusiu glutamato transporterio EAAT2 aktyvumu smegenyse.
10.3 Tiriamųjų atranka ir mėginių paėmimas
Tiriamieji buvo LSMUL KK Neurochirurgijos skyriuje stacionarizuoti pilnamečiai pacientai, kurie sutiko dalyvauti tyrime (buvo informuoti apie tyrimą ir pasirašė tiriamojo asmens informavimo ir sutikimo formas (Priedas Nr. 1 ir Priedas Nr. 2). Iš pacientų buvo imami seilių (burnos gleivinės epitelio ląstelės) mėginiai DNR tyrimams. Prieš imant mėginius, tiriamųjų buvo prašyta praskalauti burną vandeniu, kad neliktų maisto likučių ant burnos gleivinės. Mėginiams paimti naudoti sterilūs vatos pagaliukai. Paimta tiriamoji medžiaga nuo vatos pagaliukų perkelta į mėgintuvėlius su skysčiu (PBS, 200µl). Jie žymėti kiekvienam tiriamajam priskirtu kodu ir saugoti rakinamose patalpose esančiuose šaldikliuose (-20⁰C). Po
18 mėginių paėmimo, tiriamųjų buvo prašoma užpildyti anketą apie alkoholio vartojimą (AUDIT). Anketos žymėtos tuo pačiu kodu, kaip ir mėgintuvėliai, bei saugotos rakinamose patalpose. Tiriamieji buvo suskirstyti į dvi grupes (kontrolinę ir rizikos) pagal AUDIT anketų rezultatus.
10.4 DNR išskyrimas
DNR išskyrimui naudotas „Thermo Fisher Scientific“ GeneJET Genomic DNA Purification Kit rinkinys.
a) Burnos epitelio ląstelių membranų suardymas
Į mėgintuvėlį su burnos epitelinėmis ląstelėmis ir PBS buferiniu tirpalu įpilama 20 µl proteinazės K ir 200 µl lizavimo tirpalo. Tada mėginys sumaišomas su vortex maišyklę, siekiant gauti homogeniškas tirpalas, ir 10 min inkubuojamas 55˚C temperatūroje, tam, kad prasidėtų baltymų ardymas.
b) DNR surišimas
Po inkubacijos įpilama 200 µl etanolio (96-100%), jis maišomas apie 5 s su vortex maišykle ir trumpai centrifuguojamas, kad ant dangtelio esantys lašeliai pasišalintų. Gautas mišinys perkeliamas į „GeneJET Genomic DNR Purification" kolonėlę ir centrifuguojamas kambario temperatūroje 1 minutę 10000 aps./min greičiu. DNR lieka kolonėlėje, nes etanolis ją suriša ir ji negali pereiti pro kolonėlę. Apatinė mėgintuvėlio dalis su filtratu išmetama, o kolonėlė perkeliama į švarų surinkimo mėgintuvėlį.
c) DNR valymas (plovimas) ir eliuavimas
Į naują mėgintuvėlį, pilama 500 µl pirmojo plovimo buferio (paruošto su etanoliu) ir centrifuguojama kambario temperatūroje 1 minutę 10000 aps/min greičiu. Surenkamoji mėgintuvėlio dalis su filtratu išmetama, o kolonėlė perkeliama į švarų surinkimo mėgintuvėlį. Tada pilama 500 µl antrojo plovimo buferio (taip pat paruošto su etanoliu) ir centrifuguojama kambario temperatūroje 3 minutes maksimaliu greičiu. Surenkamoji mėgintuvėlio dalis su filtratu išmetama, o kolonėlė perkeliama į sterilų 1,5 ml mėgintuvėlį. Pilama 25-200 µl rinkinyje esančio eliuavimo buferio, priklausomai nuo norimos gauti DNR koncentracijos, ir 1 minutę inkubuojama kambario temperatūroje, po to 1 minutę centrifuguojama kambario temperatūroje maksimaliu greičiu. Mėgintuvėlyje yra išgryninta genominė DNR, o kolonėlę galima išmesti. Kol bus atliekami tolimesni tyrimai, išgrynintą DNR reikia saugoti -20˚C temperatūroje.
19 10.5 Genotipavimas
Genotipuoti 200 tiriamųjų mėginiai. Buvo naudotos 96 šulinėlių plokštelės bei pradmenys ir molekuliniai žymenys, sukurti ir užsakyti iš „Termo Fisher Scientific“ kompanijos. Reakcijai vykdyti į kiekvieną šulinėlį buvo pilama 2 µl išgrynintos DNR ir 8 µl mišinio. 1 lentelėje pavaizduotos TL-PGR reakcijai naudotos sudedamosios mišinio dalys. Į kiekvienos 96 šulinėlių plokštelės paskutinius du šulinėlius buvo pilama tik 2 µl sterilaus vandens be nukleazių, jie buvo naudoti kaip neigiama kontrolė. Ant plokštelių klijuota optinė plėvelė (MicroAmp® Optical Adhesive Film), tada lėtai centrifuguota, kad surinkti visus lašelius bei eliminuoti oro burbuliukus. Tada plokštelė įdėta į TL-PGR „7500 Fast Real-time PCR System“ aparatą. Nustatytos PGR reakcijos sąlygos, pagal kurias atliktas VNP genotipavimas, aprašytos 2 lentelėje. Kompiuterinėje „7500 Software v2.0.5“ programoje suvesti duomenys VNP nustatymui ir programa paleista. Programai baigus darbą, vykdyta rezultatų analizė.
1 lentelė. Mišinio, naudoto VNP nustatyti TL-PGR metodu, sudėtis vienam mėginiui
Komponentas Tūris vienam mėginiui (µl)
TaqMan Universal PCR Master Mix (2X) 5
Genotipavimo rinkinys (20X) 0,5
Vanduo be nukleazių 2,5
DNR 2
Viso 10
2 lentelė. TL-PGR reakcijai vykdyti irrs4354668 genotipams nustatyti naudotos sąlygos
Parametrai
Inkubacija Polimerazės aktyvacija
PGR (50 ciklų)
Laikyti Laikyti Denatūracija Hibridizacija/
Elongacija
Temperatūra 50oC 95oC 95oC 60oC
20 10.6 Duomenų analizė
Genotipų ir alelių dažniai buvo apskaičiuoti pagal genotipų skaičių, chi-kvadrato testas naudotas apskaičiuojant Hardy-Weinberg pusiausvyrą rinktoje imtyje. Geno, genotipų ir alelių su rizikingo alkoholio vartojimu ryšiui įvertinti naudota vienos krypties ANOVA analizė, IBM SPSS, R (3.4.3 versija) statistiniu paketu, programa SNPassoc [33] ir SNPstats [34]. Siekiant įvertinti geno VNP reikšmę rizikingam alkoholio vartojimui buvo remtasi alelių pasiskirstymo skirtumais tarp kontrolinės ir rizikos grupių. Nustatyti ryšį tarp VNP ir alkoholio vartojimo atlikta regresinė analizė, skaičiuoti genetiniai modeliai (kodominantinis, dominantinis, recesyvinis viršdominantinis ir įvertintas log-adityvinis alelio efektas) normalizuoti pagal lytį, apskaičiuotas galimybių santykis (GS) su 95% pasikliautinumo intervalu (PI). Statistiškai reikšmingiskirtumai vertinti, kai p<0,05.
21
11. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Tiriamieji buvo suskirstyti į dvi grupes (kontrolinę ir rizikos) pagal AUDIT anketų rezultatus. Tiriamieji, AUDIT anketoje surinkę 0-7 balus, priskirti kontrolės grupei, o surinkę 8-40 balų – rizikos grupei. Iš viso buvo suinkta 200 tiriamųjų (122 vyrai (61proc.) ir 78 moterys (39 proc.)), kontrolės grupei priskirta 120 asmenų (53 vyrai (44 proc.) ir 67 moterys (56 proc.)), o rizikos grupei – 80 (69 vyrai (86 proc.) ir 11 moterų (14 proc.). Šie grupių duomenys ir kiekvienos grupės AUDIT balų vidurkis pateikiami 3 lentelėje.
3 Lentelė. Tiriamųjų duomenys skirtingose grupėse
Grupė/Lytis Vyrai Moterys Viso AUDIT balų
vidurkis Kontrolės 53 (44 proc.) 67 (56 proc.) 120 (60 proc.) 2,91
Rizikos 69 (86 proc.) 11 (14 proc.) 80 (40 proc.) 16,61 Iš viso 122 (61 proc.) 78 (39 proc.) 200 (100 proc.) 8,39
11.1 EAAT2 geno VNP (rs4354668) genotipų ir alelių pasiskirstymas
4 lentelėje pateikiamas skirtingose grupėse (rizikos ir kontrolės) apskaičiuotas EAAT2 geno VNP (rs4354668) genotipų ir alelių pasiskirstymas. Pagal Hardžio-Veinbergo lygtį nustatyta, kad tiek visa tirta populiacija, tiek rizikos ir kontrolės grupės atskirai atitinka Hardžio-Veinbergo pusiausvyros (HVP) dėsnį (p>0,05). Gauti rezultatai rodo, kad dažniausias genotipas visose grupėse buvo heterozigotinis T/G, T alelio dažnis visose grupėse yra 53 proc., o G alelio – 47 proc. Šie rs4354668 polimorfizmo rezultatai beveik nesiskiria nuo europiečių populiacijos rezultatų [28].
22 4 lentelė. EAAT2 geno VNP (rs4354668) genotipų ir alelių pasiskirstymas visoje tirtoje
populiacijoje, rizikos, kontrolės grupėse
Genotipas Alelis P reikšmė
Grupė T/T T/G G/G T G
Kontrolės 33 (28%) 61 (51%) 26 (22%) 127 (53%) 113 (47%) 1 Rizikos 19 (24%) 47 (59%) 14 (18%) 85 (53%) 75 (47%) 0,18
Visi 52 (26%) 108 (54%) 40 (20%) 212 (53%) 188 (47%) 0,26
11.2 EAAT2 geno VNP (rs4354668) ryšys su alkoholio vartojimo rizika
EAAT2 geno VNP (rs4354668) ryšio su alkoholio priklausomybės išsivystymu nustatymui buvo atlikta vienos krypties ANOVA analizė. Ryšio tarp EAAT2 geno polimorfizmo (rs4354668) ir rizikingo alkoholio vartojimo nebuvo rasta (F reikšmė – 0,671, p reikšmė – 0,512).
Po to buvo atlikta dvinarė logistinė regresija ir EAAT2 geno polimorfizmui (rs4354668) pritaikyti skirtingi modeliai (kodominavimo, dominavimo, recesyvinis ir viršdominantinis). Nė vienas iš genetinių modelių nėra susijęs su rizika alkoholio priklausomybei išsivystyti, nes tiriant šį VPN statistiškai patikimų duomenų nebuvo gauta (p reikšmė > 0,05) (5 lentelė)
5 lentelė. EAAT2 geno rs4354668polimorfizmo dvinarė logistinė regresija priklausomai nuo lyties. AUDIT – balų vidurkis ir standartinė paklaida, GS – galimybių santykis, PI – pasikliautinasis
intervalas, p – reikšmingumo lygmuo
Modelis Genotipas AUDIT GS (95% PI) P
reikšmė Kodominantinis T/T 7,52 (1,04) 0,00 0,47 T/G 9,05 (0,88) 1,43 (-1,25-4,10) G/G 7,75 (1,43) 0,03 (-3,30-3,37) Dominantinis T/T 7,52 (1,04) 0,00 0,42 T/G-G/G 8,7 (0,75) 1,05 (-1,50-3,60) Recesyvinis T/T-T/G 8,55 (0,68) 0.00 0,52 G/G 7,75 (1,43) -0,93(-3,73-1,87) Viršdominantinis T/T-G/G 7,62 (0,85) 0,00 0,22 T/G 9,05 (0,88) 1,41 (-0,83-3,65) log-adityvinis - - 0,12 (-1,54-1,78) 0,89
23 Nors ir nėra atlikta tyrimų, kurie EAAT2 geno rs4354668 polimorfizmą bandytų tiesiogiai susieti su rizikingu alkoholio vartojimu. Reynolds ir kiti [27] nustatė, kad būtent šio VNP G alelis yra siejamas su mažesniu glutamato transporterio EAAT2 aktyvumu.Sumažėjęs EAAT2 aktyvumas arba mažesnė šio geno raiška CNS yra siejama su įvairių priklausomybių išsivystymu, tarp jų ir alkoholio [3,5,21,23,25]. Tačiau šio tyrimo metu koreliacija tarp rs4354668 ir rizikingo alkoholio vartojimo nebuvo nustatyta.
24
12. IŠVADOS
1. Dažniausiai pasitaikęs EAAT2 geno rs4354668 vieno nukleotido polimorfizmo genotipas tiek rizikos, tiek kontrolinėje grupėje buvo T/G (kontrolės – 51 proc., rizikos – 59 proc., visoje imtyje – 54 proc.)
2. Ryšio tarp EAAT2 geno rs4354668 VNP genotipų ir rizikingo alkoholio vartojimo nėra. Taikant vienos krypties ANOVA analizę bei atliekant dvinarę logistinę regresiją negauta statistiškai reikšmingų rezultatų (p>0,05).
25
13. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. WHO | Global information system on alcohol and health [Internet]. WHO. World Health Organization; 2018 [cited 2019 Apr 3]. Available from: https://www.who.int/gho/alcohol/en/ 2. WHO | Heavy episodic drinking among drinkers [Internet]. WHO. World Health Organization;
2018 [cited 2019 Apr 3]. Available from:
https://www.who.int/gho/alcohol/consumption_patterns/heavy_episodic_drinkers/en/ 3. Bell RL, Hauser SR, McClintick J, Rahman S, Edenberg HJ, Szumlinski KK, et al.
Ethanol-Associated Changes in Glutamate Reward Neurocircuitry: A Minireview of Clinical and Preclinical Genetic Findings. Prog Mol Biol Transl Sci [Internet]. NIH Public Access; 2016 [cited 2018 Dec 4];137:41–85. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26809998
4. Casey KF, Benkelfat C, Cherkasova M V, Baker GB, Dagher A, Leyton M. Reduced dopamine response to amphetamine in subjects at ultra-high risk for addiction. Biol Psychiatry [Internet]. 2014 Jul 1 [cited 2018 Dec 1];76(1):23–30. Available from:
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0006322313008238
5. Rao PSS, Bell RL, Engleman EA, Sari Y. Targeting glutamate uptake to treat alcohol use disorders. Front Neurosci [Internet]. Frontiers Media SA; 2015 [cited 2018 Nov 10];9:144. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25954150
6. Cloninger CR, Sigvardsson S, Bohman M. Alcohol Health and Research World Volume 20 Number 1 1996 [Internet]. 1996 [cited 2018 Dec 1]. Available from:
https://pubs.niaaa.nih.gov/publications/ahrw20-1/18–23.pdf
7. Costardi JVV, Nampo RAT, Silva GL, Ribeiro MAF, Stella HJ, Stella MB, et al. A review on alcohol: from the central action mechanism to chemical dependency. Rev Assoc Med Bras [Internet]. 2015;61(4):381–7. Available from:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0104-42302015000400381&lng=en&tlng=en
8. Ayers-Ringler JR, Jia Y-F, Qiu Y-Y, Choi D-S. Role of astrocytic glutamate transporter in alcohol use disorder. World J psychiatry [Internet]. Baishideng Publishing Group Inc; 2016 Mar 22 [cited 2018 Nov 10];6(1):31–42. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27014596 9. Gass JT, Olive MF. Glutamatergic substrates of drug addiction and alcoholism. Biochem
26 Pharmacol [Internet]. NIH Public Access; 2008 Jan 1 [cited 2018 Nov 10];75(1):218–65. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17706608
10. Barker JM, Taylor JR. Habitual alcohol seeking: modeling the transition from casual drinking to addiction. Neurosci Biobehav Rev [Internet]. NIH Public Access; 2014 Nov [cited 2018 Nov 24];47:281–94. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25193245
11. Ozsoy S, Asdemir A, Karaaslan O, Akalin H, Ozkul Y, Esel E. Expression of Glutamate Transporters in Alcohol Withdrawal. Pharmacopsychiatry. 2015;49(1):14–7.
12. Breslin FJ, Johnson BA, Lynch WJ. Effect of topiramate treatment on ethanol consumption in rats. Psychopharmacology (Berl) [Internet]. NIH Public Access; 2010 Jan [cited 2018 Dec
2];207(4):529–34. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19823810
13. Kortagere S, Mortensen O V, Xia J, Lester W, Fang Y, Srikanth Y, et al. Identification of Novel Allosteric Modulators of Glutamate Transporter EAAT2. ACS Chem Neurosci [Internet]. 2018 Mar 21 [cited 2018 Nov 27];9(3):522–34. Available from:
http://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschemneuro.7b00308
14. Niciu MJ, Kelmendi B, Sanacora G. Overview of Glutamatergic Neurotransmission in the Nervous System. Vol. 100, Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 2012. p. 656–64.
15. Yelamanchi SD, Jayaram S, Thomas JK, Gundimeda S, Khan AA, Singhal A, et al. A pathway map of glutamate metabolism. J Cell Commun Signal [Internet]. Springer; 2016 Mar [cited 2019 Feb 9];10(1):69–75. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26635200
16. Hackett JT, Ueda T. Glutamate Release. Neurochem Res [Internet]. Springer US; 2015 Dec 27 [cited 2018 Nov 22];40(12):2443–60. Available from: http://link.springer.com/10.1007/s11064-015-1622-1
17. Roberts-Wolfe DJ, Kalivas PW. Glutamate transporter GLT-1 as a therapeutic target for substance use disorders. Vol. 14, CNS & neurological disorders drug targets. 2015. p. 745–56.
18. Zhou Y, Danbolt NC. Glutamate as a neurotransmitter in the healthy brain. J Neural Transm [Internet]. Springer; 2014 Aug [cited 2018 Nov 23];121(8):799–817. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24578174
19. Sudakin D. Naltrexone: Not Just for Opioids Anymore. J Med Toxicol [Internet]. Springer; 2016 Mar [cited 2018 Nov 25];12(1):71–5. Available from:
27 20. Takahashi K, Foster JB, Lin CLG. Glutamate transporter EAAT2: Regulation, function, and
potential as a therapeutic target for neurological and psychiatric disease. Cell Mol Life Sci. Springer Basel; 2015;72(18):3489–506.
21. Rao PSS, Sari Y. Glutamate Transporter 1: Target for the Treatment of Alcohol Dependence. Vol. 19, Current medicinal chemistry. 2012. p. 5148–56.
22. Grewer C, Gameiro A, Rauen T. SLC1 glutamate transporters. Pflugers Arch [Internet]. NIH Public Access; 2014 Jan [cited 2018 Nov 10];466(1):3–24. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24240778
23. Scofield MD, Kalivas PW. Astrocytic Dysfunction and Addiction: Consequences of Impaired Glutamate Homeostasis. Vol. 20, The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 2014. p. 610–22.
24. Sari Y. Potential therapeutic role of glutamate transporter 1 for the treatment of alcohol
dependence. OA alcohol [Internet]. NIH Public Access; 2013 [cited 2018 Nov 25];1(1):6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24409344
25. Reissner KJ, Kalivas PW. Using glutamate homeostasis as a target for treating addictive disorders. Behav Pharmacol [Internet]. NIH Public Access; 2010 Sep [cited 2018 Nov 25];21(5–6):514–22. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20634691
26. Chromosome 11: 35,419,379-35,419,479 - Region in detail - Homo sapiens - Ensembl genome browser 96 [Internet][cited 2019 May 6]. Available from:
https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Location/View?db=core;r=11:35419379-35419479;source=dbSNP;v=rs4354668;vdb=variation;vf=331411613;time=1557149877 27. Reynolds GP, McGowan OO, Dalton CF. Pharmacogenomics in psychiatry: The relevance of
receptor and transporter polymorphisms. Br J Clin Pharmacol. 2014;77(4):654–72. 28. rs4354668 (SNP) - Population genetics - Homo sapiens - Ensembl genome browser 96
[Internet][cited 2019 May 6]. Available from:
https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Population?db=core;r=11:35418929-35419929;v=rs4354668;vdb=variation;vf=331411613
29. Sari Y. Role of glutamate transporter 1 in the attenuation of alcohol intake. Front Neurosci [Internet]. Frontiers Media SA; 2014 [cited 2018 Nov 22];8:200. Available from:
28 30. Kranzler HR, Armeli S, Wetherill R, Feinn R, Tennen H, Gelernter J, et al. Self-efficacy mediates
the effects of topiramate and GRIK1 genotype on drinking. Addict Biol [Internet]. NIH Public Access; 2016 Mar [cited 2018 Nov 10];21(2):450–9. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25496338
31. Kranzler HR, Armeli S, Feinn R, Tennen H, Gelernter J, Covault J. GRIK1 genotype moderates topiramate’s effects on daily drinking level, expectations of alcohol’s positive effects and desire to drink. Int J Neuropsychopharmacol [Internet]. NIH Public Access; 2014 Oct [cited 2018 Nov 10];17(10):1549–56. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24786948
32. Spencer S, Scofield M, Kalivas PW. The good and bad news about glutamate in drug addiction. J Psychopharmacol [Internet]. NIH Public Access; 2016 [cited 2018 Nov 23];30(11):1095–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27353027
33. González JR, Armengol L, Solé X, Guinó E, Mercader JM, Estivill X, et al. SNPassoc: An R package to perform whole genome association studies. Bioinformatics. 2007;23(5):644–5.
34. Solé X, Guinó E, Valls J, Iniesta R, Moreno V. SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics [Internet]. 2006;22(15):1928–9. Available from:
29
14. PRIEDAI
30
Priedas Nr.2 Tiriamojo asmens sutikimo forma
