LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Artūras Blažaitis
OKSIDUOTŲ DIDELIO TANKIO LIPOPROTEINŲ IR FIBRINOGENO REIKŠMĖ TROMBOCITŲ AKTYVUMUI
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovė prof. dr. Aušra Mongirdienė
2
Turinys
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
PADĖKA ... 6
INTERESŲ KONFLIKTAS, ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 7
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Oksidantų susidarymo keliai ... 10
1.2. Oksidantų reikšmė vystantis trombozei ... 11
1.2.1. Oksidantų poveikis fibrinogenui ... 11
1.2.2. Nitrotirozinas ... 12
1.2.3. Baltymų nitrinimo mechanizmai... 12
1.2.4. DTL reikšmė trombocitų funkcijai ... 13
1.2.5. Oksiduotas DTL ... 14
1.3. Trombocitai ir arterinės trombozės vystymasis ... 15
1.4. Lėtiniu širdies nepakankamumu sergančių pacientų hemostazės pokyčiai ... 16
2. TYRIMO METODIKA ... 17
2.1. Pacientų atranka ... 17
2.2. Tiriamosios medžiagos surinkimas ir apdorojimas ... 19
2.2.1. Kraujo serumo mėginiai ... 19
2.2.2. Kraujo plazmos mėginiai ... 20
2.3. Duomenų apdorojimas ... 21
3. REZULTATAI ... 22
3.1. Tiriamųjų charakteristika ... 22
3.2. Rodmenų palyginimas tarp grupių ... 22
3
3.4. Tirtų rodmenų tarpusavio sąsajos ... 26
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 30
IŠVADOS ... 34
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 35
4
SANTRAUKA
Magistro darbo autorius. Artūras Blažaitis
Magistro darbo pavadinimas. Oksiduotų didelio tankio lipoproteinų ir fibrinogeno reikšmė trombocitų aktyvumui.
Tyrimo tikslas: įvertinti oksiduotų DTL ir fibrinogeno reikšmę trombocitų agregacijos intensyvumui. Tyrimo uždaviniai: 1. Ištirti fibrinogeno ir oksidacijos produktų: oksiduotų didelio tankio lipoproteinų, ditirozino ir nitrotirozino koncentracijas, sergančiųjų lėtiniu širdies nepakankamumu kraujyje. 2. Ištirti trombocitų agregacijos intensyvumą sergančiųjų lėtiniu širdies nepakankamumu kraujyje. 3. Nustatyti sąsajas tarp fibrinogeno, oksiduotų didelio tankio lipoproteinų, ditirozino ir nitrotirozino koncentracijų bei trombocitų agregacijos intensyvumo.
Tyrimo objektas. Tyrimui buvo atrinkta 60 ligonių, kurie buvo nuo 2017 m. kovo 31 d. iki 2018 m kovo 19 d. gydyti Lietuvos sveikatos mokslų univesiteto ligoninės Kardiologijos klinikoje dėl paūmėjusio lėtinio širdies nepakankamumo. Atlikta demografinių duomenų ir bendro kraujo tyrimo retrospektyvinė analizė. Taip pat ištirta pacientų lipidogramos, oksiduotų didelio tankio lipoproteinų ir nitrotirozino koncentracijos kraujo serume bei ditirozino, fibrinogeno koncentracijos ir trombocitų agregacijos intensyvumas kraujo plazmoje.
Tyrimo metodai. Lipidų koncentracijai nustatyti buvo naudojami standartiniai metodai su Synchron DxC 800 (Beckman Coulter) analizatoriumi. Oksiduoto didelio tankio lipoproteinų ir nitrotirozino koncentracijos buvo tiriamos imunofermentiniu ELISA metodu. Trombocitų agregacija buvo nustatoma trombocitais turtingoje plazmoje naudojant agregometrą (Chrono-Log, JAV) standartiniu Borno metodu. Netrombocitonėje plazmoje nustatoma fibrinogeno koncentracija Clauss metodu, naudojamas analizatorius STA Compact Max. Ditirozino koncentracija buvo tiriama spektrofluorimetru Perkin Elmer LS-55. Statistinei duomenų analizei naudotas Mann-Whitney U ir Spearman koreliacijos testai. Rezultatai ir išvados. Didžiausia ditirozino koncentracija rasta IV funkcinės klasės ligonių grupėje. Rasta tendencija: didėjant pacientų NYHA funkcinei klasei, tolygiai didėja oksiduotų didelio tankio lipoproteinų koncentracija. Fibrinogeno ir nitrotirozino koncentracijos tarp tiriamųjų grupių reikšmingai nesiskyrė. Trombocitų agregacija intensyviausia rasta NYHA III grupėje. Nitrotirozino koncentracija tiesiogiai koreliavo su oxDTL ir atvirkščiai – su DTL koncentracija. Ditirozino koncentracija koreliavo su VTT. Trombocitų agregacijos intensyvumas tiesiogiai koreliavo su trombocitų skaičiumi ir neigiamai – su ditirozino koncentracija.
5
SUMMARY
Author of Master Thesis. Artūras Blažaitis
Full title of Master Thesis. Significance of oxidative high density lipoproteins and fibrinogen in platelet activity.
The aim of study was to evaluate the effect of oxidized HDL and fibrinogen on platelet aggregation intensity.
Objectives. 1. Measure the concentrations of oxidized high density lipoproteins, fibrinogen, dityrosine and nitrotyrosine in patiens with chronic heart failure. 2. Measure the intensity of platelet aggregation in patients with chronic heart failure. 3. To establish correlations between the concentrations of oxidized high density lipoproteins, fibrinogen, dityrosine and nitrotyrosine and the intensity of platlet aggregation. Patients and methods. For the study, 60 patients were selected which were treated from March 31, 2017 to March 19, 2018 at the Cardiology Clinic of the Lithuanian University of Health Sciences due to the exacerbation of chronic heart failure. Retrospective analysis of total blood test and demography data was done. Concentration of lipids were measured using standard methods by Synchron DxC 800 (Beckman Coulter) analyzer. Oxidative high density lipoproteins and nitrotyrosine concentrations were measured using ELISA method. Platelet aggregation was detected in platelet-rich plasma using an aggregator (Chrono-Log, USA) by standard Born method. In platelet-poor plasma was measured fibrinogen concentration using the Clauss method by STA Compact Max analyzer. Concentration of dityrosine was measured using the Perkin Elmer LS-55 spectrofluorometer. Mann-Whitney U and Spearman’s correlation tests were used for statistical analysis.
Results and conclusions. The highest dityrosine concentration was found in the IVth function group. A trend has been found: the increase of NYHA functional class increases the oxidized high density lipoprotein concentracion. There were no significant correlation found between fibrinogen and nitrotyrosine concentrations. The most intensive platlet aggregation was found in NYHA IIIrd group. The concentration of nitrotyrosine was directly correlated with oxDTL, and negatively correlated with DTL concentration. Dityrosine directly correlated with MPV. There were direct correlation between platelet aggregation intensity with platelet count and negatively correleted with dityrosine concentration.
6
PADĖKA
Darbo autorius nuoširdžiai dėkoja medicinos studijų studentams Renatui Treiniui ir Evelinai Sabeckytei padedant atrinkti tiriamuosius pacientus. Medicinos biologo asistentui Viliui Skipskiui atliekant trombocitų agregacijos tyrimus. Laboratorinės medicinos klinikos dėstytojai Rasai Steponavičiūtei nagrinėjant tyrimų metodikas bei organizuojant tyrimų atlikimą. Bei darbo vadovei prof. dr. Aušrai Mongirdienei už puikų darbo organizavimą ir pagalbą rašant baigiamąjį darbą.
7
INTERESŲ KONFLIKTAS, ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Autoriui interesų konflikto nebuvo.
Etikos komiteto pavadinimas – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centras Leidimo numeris – BEC-LMB(M)-174
Leidimo išdavimo data – 2016-12-22 1 priedas.
8
SANTRUMPOS
ADP – adenozino difosfatas ADR – adrenalinas
ApoAI – apolipoproteinas AI
DKS – diastolinis kraujo spaudimas DTL – didelio tankio lipoproteinai FpA – fibrinopeptidas A
FpB – fibrinopeptidas B GP – glikoproteinas
KSIF – kairiojo skilvelio išmetimo frakcija LMTL – labai mažo tankio lipoproteinai LP – lipoproteinai
LŠN – lėtinis širdies nepakankamumas MPO – mieloperoksidazė
MTL – mažo tankio lipoproteinai
NYHA – Niujorko širdies asociacija (angl. New York Heart Association) oxDTL – oksiduoti didelio tankio lipoproteinai
p – statistinis reikšmingumas
R – Spearman koreliacijos koeficientas RDR – reaktyvios deguonies rūšys
SKS – sistolinis kraujo spaudimas TxA2 – tromboksanas A2
VTL – vidutinio tankio lipoproteinai VTT – vidutinis trombocitų tūris vWF – von Willebrand‘o faktorius
9
ĮVADAS
Pacientams, sergantiems lėtiniu širdies nepakankamumu (LŠN) 11 – 44 % pasitaiko trombozinės komplikacijos (1). Manoma, kad viena iš komplikacijų priežasčių gali būti didesnis susidarančių oksidantų kiekis kraujyje asmenims, kurie serga širdies ir kraujagyslių ligomis (2,3). Normaliomis sąlygomis oksidantų žmogaus organizme susidaro kaip normalaus metabolizmo metu, tačiau patofiziologinėmis sąlygomis jų kiekis padidėja (4). Oksidantai gali aktyvinti trombocitus. Viena iš grandžių – oksiduoto fibrinogeno susidarymas, kas lemia nitrotirozino ir ditirozino koncentracijos padidėjimą kraujyje (5,6). Fibrinogenas yra baltymas, per kurį trombocitai jungiasi tarpusavyje, todėl oksiduota jo forma galėtų lemti agregacijos intensyvumo pokyčius (7).
Kita iš grandžių – poveikis trombocitams per lipoproteinus. Didelio tankio lipoproteinai (DTL) slopina trombocitų aktyvumą per SR-B1 receptorių. Maža DTL koncentracija kraujyje siejama su didesne širdies ir kraujagyslių ligų rizika (8). Ne tik dėl reikšmės vystantis aterosklerozei randama ir daugiau DTL funkcijų: priešuždegiminė, antitrombozinė ir antioksidacinė (9). Yra manoma, kad pacientams, sergantiems širdies ir kraujagyslių ligomis, viena iš trombozinių komplikacijų priežasčių gali būti ta, kad oksiduota DTL forma nebegali jungtis prie SR-B1 receptorių ir dėl to negali slopinti trombocitų (10–12).
Atradus sąsajų tarp oksiduotų DTL ir fibrinogeno koncentracijos bei trombocitų agregacijos rodmenų, galima būtų pagrįsti DTL antitrombotinį poveikį. Tai galėtų keisti ir gydymo strategiją mažinant trombotinių komplikacijų riziką antioksidantais.
Darbo tikslas – įvertinti oksiduotų DTL ir fibrinogeno reikšmę trombocitų agregacijos intensyvumui.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti fibrinogeno ir oksidacijos produktų: oksiduotų didelio tankio lipoproteinų, ditirozino ir nitrotirozino koncentracijas, sergančiųjų lėtiniu širdies nepakankamumu kraujyje.
2. Ištirti trombocitų agregacijos intensyvumą sergančiųjų lėtiniu širdies nepakankamumu kraujyje.
3. Nustatyti sąsajas tarp fibrinogeno, oksiduotų didelio tankio lipoproteinų, ditirozino ir nitrotirozino koncentracijų bei trombocitų agregacijos intensyvumo.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Oksidantų susidarymo keliai
Oksidantai formuojasi kaip normalus aerobinio metabolizmo produktas, tačiau patofiziologinėmis sąlygomis šių medžiagų kiekis didėja (4). Reaktyvios deguonies rūšys (RDR) – labai reaktyvios molekulės, kurios žmogaus organizme susidaro dėl normalaus ląstelių metabolizmo ir aplinkos veiksnių. Šios molekulės gali pažeisti nukleino rūgštis ir baltymus, o todėl gali kisti jų funkcijos (13,14). RDR priskiriama - superoksido anijono radikalas (∙O2_), vandenilio peroksidas (H2O2) ir
hidroksilo radikalas (∙OH). Šios molekulės susidaro tarpiniuose etapuose kuomet yra redukuojamas deguonis. Deguonies radikalų gali susidaryti lipiduose kaip alkilo ar peroksilo radikalai. Taip pat, biologinėse sistemose randamas vienas iš dujinių radikalų – azoto oksidas. Azoto oksidas sąveikaudamas su superoksido anijono radikalu sudaro peroksinitritą. Ši molėkulė neturi laisvo radikalo, tačiau yra stiprus oksidantas (4).
Dauguma oksidantų yra endogeninės kilmės, kitaip tariant, juos gamina pačios organizmo ląstelės. Įprasto aerobinio kvėpavimo metu, mitochondrijos naudoja deguonį ir redukuoja jį iki vandens (1 pav.) (4,15).
1.1. pav. Normalaus metabolizmo oksidantų susidarymo reakcija. ∙O𝟐, H_ 2O2 ir ∙OH susidarymas vyksta nuosekliai jungiantis elektronams prie O2. Reakcijoje dalyvauja citochromo oksidazė, kuri ir prijungia elektronus, o energiją gamina mitochondrijos. Pritaikyta iš (15).
Leukocitai ir kitos fagocituojančios ląstelės kovoja su bakterijomis, parazitais ir virusais infekuotomis ląstelėmis naudodamos oksidantų mišinį, sudarytą iš NO, ∙O2, _ H2O2 ir HOCl. Šie
oksidantai apsaugo žmogaus organizmą nuo patogenų invazijos, tačiau gali iššaukti oksidacinius DNR pažeidimus ir sąlygoti mutacijas, kurios gali prisidėti prie kancerogeninio proceso (15). Hipochloritinė rūgštis (HOCl) svarbi imuninės sistemos veikloje. Šis oksidantas pagaminamas leukocito viduje, chloro jonus oksiduojant su vandenilio peroksidu, veikiant mieloperoksidazei, kuri katalizuoja šią reakciją. HOCl taip pat yra priskiriama RDR, nes yra O2 metabolito H2O2 produktas (16). Mažas šių medžiagų
11
1.2. Oksidantų reikšmė vystantis trombozei
Trombozė – tai susidaręs kraujo krešulys, kai to nereikia. Normoje krešuliai susidaro pažeidus kraujagyslę siekiant išvengti nukraujavimo. Trombų formavimąsi sąlygoja daugybė veiksnių: amžius, vaistų vartojimas, gretutinės ligos, gyvenimo būdas. Taip pat vienas iš veiksnių gali būti oksidantai, kurie gali keisti krešėjimo procese dalyvaujančių baltymų struktūrą ir funkciją. Trombocitai agreguoja kibdami vienas su kitu per fibrinogeno molekules, todėl fibrinogenas svarbus kraujo krešėjimo sistemoje. Jis taip pat gali būti paveiktas oksidantų (2,3).
1.2.1. Oksidantų poveikis fibrinogenui
Fibrinogenas gaminamas hepatocituose ir išskiriamas į kraują, kur šio baltymo gyvavimo puslaikis yra maždaug 3 dienos. Fibrinogenas yra 340 kDa baltymas, sudarytas iš dviejų porų trijų skirtingų grandinių, kurios vadinamos Aα, Bβ ir γ. Tai hemostazėje svarbiausias baltymas. Fibrinogeną taip pat gali oksiduoti oksidantai. Oksiduoto fibrinogeno struktūra ir funkcija gali keistis (7,17).
Fibrinogeno virtimas fibrinu pasireiškia fibrinogeno skilimu į fibrino monomerus ir fibrinopeptidus. Fibrino monomerai sukimba ir sudaro fibrino krešulį. XIIIa krešėjimo faktorius, kuris yra trombino suaktyvinta XIII faktoriaus forma, prisijungia prie fibrino. Fibrino jungtims susidaryti yra reikalingi ir kalcio jonai. Fibrinogeno oksidacijos metu susidaro ditirozino kryžminiai ryšiai ir, priklausomai nuo oksidanto dozės, padidėja karbonilų kiekis molekulėje. Oksiduojant fibrinogeno molekulę, oksiduojamos tam tikros aminorūgštys: histidinas, prolinas, argininas ir lizinas. Mokslininkai, tyrinėdami oksiduoto fibrinogeno savybes, šį baltymą oksiduoja įvairiais oksidantais. Fibrinogeną oksiduojant geležies askorbatu, pailgėja fibrinopeptido A (FpA) ir fibrinopeptido B (FpB) atpalaidavimo laikas, dėl šios priežasties yra uždelsiama fibrino polimerizacija ir tai pakeiča susidariusią fibrino struktūrą (18).
Fibrinogeno oksidacija hipochloritu (HOCl) sumažina fibrino polimerizacijos stiprumą. Yra nustatyta, kad veikiant fibrinogeną HOCl yra oksiduojamos trys metionino liekanos, Met476, Met367 ir Met78, kurios atitinkamai išsidėsčiusios Aα, Bβ ir γ grandinėse. Dažniausiai oksiduojamas Met476 ir būtent dėl šio metionino oksidacijos krešulio pluoštas tampa plonesnis, o tankis didesnis (19).
Nitrinto fibrinogeno koncentracija siejama su vainikinių arterijų ligomis, jo koncentracija didėja esant veninėms tromboembolijoms. Apskritai padidėjusi nitrinto fibrinogeno koncentracija siejama su arterijų ir venų trombozėmis (20). Nitrinimas vyksta per tirozino aminorūgštis, kurių yra fibrinogeno β grandinėje. Iš nitrinto fibrinogeno sudarytam krešuliui būdingi stori, susukti pluoštai,
12 didelės poros. Kai kuriose studijose teigiama, jog in vitro bandymuose, lyginant fibrinogeną su nitrintu fibrinogenu, nerandama jokių fibrinolizės greičio, ar susidariusių produktų skirtumų. Taip pat nepastebima jokios įtakos trombocitų agregacijai. Tačiau, tose pačiose studijose teigiama, kad nitrintas fibrinogenas pagreitina krešulio susidarymą (19).
1.2.2. Nitrotirozinas
Tai - aminorūgšties tirozino oksidacinė modifikacija, kurios metu prie tirozino molekulės hidroksifenilo žiedo yra prijungiama nitro grupė. Ateroskleroze sergančių pacientų kraujagyslių pažeidimų vietose ir kraujo plazmoje yra randami pakitę baltymai, kurių struktūroje aptinkamas nitrotirozinas. Nepaisant to, kad nitrinimo išeiga yra ganėtinai žema, epidemiologinės studijos rodo reiškmingą koreliaciją tarp nitrintų plazmos baltymų koncentracijos ir širdies ir kraujagyslių ligų. Nitrotirozino koncentracija gali būti tiriama, siekiant prognozuoti ligos vystymąsį ar sprendžiant gydymo klausimus aterosklerozės atveju (5,6,21,22).
1.2.3. Baltymų nitrinimo mechanizmai
Baltymų nitrinimas susideda iš dviejų etapų (1.2. pav.). Pirmame etape vienas vandenilio atomas atskeliamas nuo fenolio žiedo ir laikinai susiformuoja tirozilo radikalas (Tyr∙). Antrojo etapo metu, azoto dioksido radikalas (∙NO2) jungiasi prie tirozilo radikalo ir susiformuoja nitrotirozinas.
13 Pirmąjį oksidacijos etapą gali sukelti ne vienas, o keli oksidantai – hidroksilo radikalas (∙OH), azoto dioksido radikalas (∙NO2), karbonilo radikalas (∙CO
_
3), iš lipidų kilęs alkilas (LO∙) ir peroksilo radikalas (LOO∙) (22). Pirmieji trys oksidantai yra gauti produktai vykstant eilei reakcijų, kur reakcijos pradžią inicijuoja radikalai, atsiradę normalaus ląstelių metabolizmo būdu (23). Azoto oksido radikalas sąveikauja su superoksido anijono radikalu ir sudaro peroksinitritą.
∙ 𝑁𝑂 + ∙ 𝑂2− → 𝑂𝑁𝑂𝑂− (1)
Pastarasis jungiasi su vandeniliu ir išskiria hidroksilo ir azoto dioksido radikalus. 𝑂𝑁𝑂𝑂−+ 𝐻+ → ∙ 𝑂𝐻 + ∙ 𝑁𝑂
2 (2)
Taip pat, peroksinitritas gali jungtis su anglies dioksidu ir tokiu būdu susidaro azoto dioksido bei karbonilo radikalai.
𝑂𝑁𝑂𝑂−+ 𝐶𝑂2 → ∙ 𝑁𝑂2+ ∙ 𝐶𝑂3− (3)
Tuo tarpu, mieloperoksidazė gali inicijuoti abu etapus, nes išskiria didesnį kiekį ∙NO2 (5,21,22).
Kadangi šie oksidantai yra reikšmingi nitrotirozino susidarymui, tad tiriant nitrotirozino koncentraciją, galima atrasti sąsajų tarp oksidantų ir trombocitų agregacijos intensyvumo.
1.2.4. DTL reikšmė trombocitų funkcijai
Lipoproteinai (LP) yra dalelės, susidedančios iš lipidų ir baltymų, kurie laikosi kartu nekovalentinių ryšių pagalba. Žinomos 5 pagrindinės LP rūšys: didelio tankio lipoproteinai (DTL), mažo tankio lipoproteinai (MTL), chilomikronai, labai mažo tankio lipoproteinai (LMTL) ir vidutinio tankio lipoproteinai (VTL). Lipidų koncentracijos pokyčiai kraujyje lemia daugybės ligų atsiradimą ir vystymąsį. Didelė MTL koncentracija kraujyje siejama su širdies ir kraujagyslių ligomis. Mažo tankio lipoproteinų dalelės kaupiasi arterijose ir laikui begant gali suformuoti aterosklerozines plokšteles. Aterosklerozė padidina isulto, širdies ar kraujagyslių ligų išsivystymo tikimybę. DTL šalina cholesterolį iš arterijų ir gražina jį į kepenis, todėl dėl šios ir kitų širdies apsauginių savybių neretai yra vadinamas ,,geruoju cholesteroliu“ (24–26).
Teigiama, jog DTL būdingas antioksidacinis, priešuždegiminis ir antitrombotinis poveikis (9). DTL antitrombotinis aktyvumas pasireiškia tiesiogiai veikiant trombocitus – juos slopinant (27). Slopinimas vyksta jungiantis DTL prie B klasės I tipo receptoriaus, kuris vadinamas (angl. Scavenger receptor class B type I (SR-BI)). Antritrombotinės ypatybės siejamos ir su krešėjimo kaskados slopinimu
14 bei krešulio fibrinolize. Be to, DTL skatina išskirti azoto oksidą ir prostacikliną, kurie stipriai slopina trombocitus (8).
SR-BI yra pagrindinis didelio tankio lipoproteinų receptorius, kurio yra ant įvairių ląstelių paviršiaus, įskaitant hepatocitus ir endotelio ląsteles. Šis receptorius yra transmembraninis baltymas ir priklauso CD36 super šeimai. Prie SR-BI receptoriaus gali jungtis labai įvairūs ligandai, įskaitant natyvinius ir oksiduotus lipoproteinus (28). Be to, SR-BI yra randama ir ant žmogaus trombocitų paviršiaus. Sumažėjęs šių receptorių kiekis siejamas su suintensyvėjusia trombocitų agregacija (27).
1.2.5. Oksiduotas DTL
Esančios kraujyje RDR oksiduoja ir DTL esančius darinius. Taip susidarę oksiduoti didelio tankio lipoproteinai (oxDTL) praranda savo savybes slopinti trombocitus. Nustatyta, kad DTL oksidavimui svarbus neutrofilų fermentas mieloperoksidazė, lemianti RDR susidarymą (25). ApoAI oksidacija vyksta per tirozino molekules jas nitrinant (NO2-Tyr) ir chlorinant (Cl-Tyr). Būtent šių
oksiduotų komponentų kiekis ženkliai padidėja pacientams, kurie serga koronarine širdies liga (11,12). Oksidacijos metu pakinta DTL sudėtis, dėl to prarandama DTL funkcija slopinti trombocitus (1.3. pav.). Šie pokyčiai siejami su padidėjusia aterosklerozės ir koronarinės širdies ligos rizika.
1.3. pav. DTL pokyčių oksidacijos metu schema. DTL vidiniai komponentai yra esterifikuotas cholesterolis (CE) ir nedidelis kiekis trigliceridų (TG). Išorinį DTL sluoksnį sudaro laisvasis cholesterolis (FC), ApoAI, paraoksonazė (PON1), fosfolipidai (PL) ir kiti įvairūs baltymai. Kuomet DTL praranda savo funkciją, padidėja TG kiekis, sumažėja PON1 kiekis, sumažėja ApoAI kiekis bei tampa oksiduota forma, į išorinį sluoksnį įterpiama MPO ir baltymas serumo amiloidas A (SAA) ir fosfolipidai tampa oksiduota forma (OxPL). Pritaikyta iš (10).
15
1.3. Trombocitai ir arterinės trombozės vystymasis
Pirminė trombocitų funkcija yra po sužalojimo užsandarinti pažeistą kraujagyslės sienelę ir stimuliuoti atstatomąsias endotelio savybes (29). Po endotelio pažeidimo iš Weibel-Palade kūnelių, kurie yra endotelyje, išskiriamas ir paleidžiamas į cirkuliaciją von Willebrand‘o faktorius (vWF), kuris subendotelyje prilimpa prie kolageno pažeistame plote. Trombocitai gali susijungti su imobilizuotu vWF per glikoproteino Ib-V-IX (GPIb-V-IX) kompleksą, kuris yra ant trombocito membranos. Ši vWF ir GPIb-V-IX sąveika yra trumpalaikė ir sukibimas yra nestabilus, tačiau sąveika inicijuoja trombocitų aktyvinimą. Tai lemia tolesnę papildomų receptorių sąveiką, tokių kaip integrinų αIIbβ3, α2β1, ir GPVI
su vWF ir kolagenu, atitinkamai šios sąveikos sąlygoja tvirtesnį trombocitų sukibimą. Aktyvuoti trombocitai išskiria savo granulių turinį, tame tarpe ir trombocitus aktyvuojančią medžiagą tromboksaną A2 (TxA2). Tolesnis trombocitų prikibimo stabilizavimas pažedimo vietoje užtikrinamas dėl kitų
trombocitų aktyvinimo. Aktyvuoti trombocitai sudaro paviršių jungtis kitiems trombocitams. Trombocitai jungiasi per fibrinogeną, kuris yra susijungęs su skirtingų trombocitų paviršiuje esančiais integrinais αIIbβ3. Tokiu būdu yra sukeliama trombocitų agregacija (1.4. pav.) (8).
1.4. pav. Trombocitų adhezijos ir agregacijos schematinis vaizdas po kraujagyslės pažeidimo. 1) Normaliomis sąlygomis, trombocitai cirkuliuoja ramybės būsenoje. 2) Po endotelio pažeidimo, plazmos vWF prisijungia prie kolageno pažeistame plote. Ši sąveika inicijuoja cirkuliuojančius trombocitus susijungti su GPIb-V-IX kompleksu ant trombocitų membranos. 3) Trumpalaikė sąveika sulėtina trombocitus ir jie pasklinda virš pažeistos kraujagyslės sienelės vietos. Sąveiką tarp trombocito ir kolageno sutvirtina integrinas α2β1. Kuomet GPVI susijungia su kolagenu, tai lemia tolimesnę trombocitų aktyvaciją. 4) Aktyvuoti trombocitai deformuojasi ir sukuria tokią formą, kad galėtų prisijungti kiti trombocitai. 5) Po aktyvacijos, trombocitai atpalaiduoja savo granulių turinį (pvz., ADF), toliau sintetina ir atpalaiduoja trombocitus aktyvuojančią medžiagą TxA2. 5) Integrinas αIIbβ3 savo aktyvioje formoje jungiasi su fibrinogenu ir ši sąveika sukuria tiltą tarp dviejų aktyvuotų trombocitų. Pritaikyta iš (8).
16
1.4. Lėtiniu širdies nepakankamumu sergančių pacientų hemostazės pokyčiai
Nustatyta, kad pacientų sergančių lėtiniu širdies nepakankamumu (LŠN), kraujo krešėjimo sistema yra aktyvesnė. Tai gali padidinti arterijų ir venų tromboembolijų atsiradimo tikimybę. Endotelio pažeidimas ar disfunkcija yra vienas iš ženklų LŠN atvejais. Tokiems pacientams yra nustatomas fibrinogeno, VIII faktoriaus - vWF komplekso ir D-dimerų koncentracijos padidėjimas. Fibrinogeno ir vWF padidėjimas siejamas su neigiama prognoze, pavyzdžiui prieširdžių virpėjimo sutrikimu, o tai yra pagrindinis rizikos veiksnys širdies nepakankamumo atveju. Taip pat šių kraujo krešėjimo žymenų padidėjimas yra susijęs su padidėjusia koronarinės širdies ligos rizika (1,30,31).
Pagal (32) autorius yra pateikiama 1.1 lentelė, kurioje nuorodyti hemostazės pokyčiai, kur pacientų sergančių LŠN rezultatai lyginami su sveikais asmenimis.
1.1 lentelė. Lėtiniu širdies nepakankamumu sergančių pacientų trombocitų aktyvumo rodmenų pokyčiai lyginant su sveikais asmenimis (pritaikyta iš (32)).
Trombocitų aktyvumo žymenys Stebimas pokytis
β-tromboglobulinas ↑ Osteonektinas ↑ vWF ↑ Trombocitų faktorius 4 ↑ P-selektinas ↑ Tromboksanas ↑ Trombocitų agregacija ↑
Kadangi trombocitai agreguodami kimba vieni su kitais per fibrinogeno molekules, oksidantų paveiktos šios molekulės galėtų lemti agregacijos intensyvumo pokyčius. Tiriant oxDTL ir fibrinogeno oksiduotas formas galima tikėtis atrasti sąsajų su DTL bei trombocitų agregacijos rodmenimis.
17
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Pacientų atranka
Tyrimui buvo atrinkti tik tie ligoniai, kurie buvo nuo 2017 m. kovo 31 d. iki 2018 m. kovo 19 d. gydyti LSMU ligoninės Kardiologijos klinikoje dėl paūmėjusio LŠN. Šie pacientai per paskutines dvi savaites nevartojo antiagregantų ir nebuvo kitų trombocitų agregacijos įtakojančių veiksnių. Lėtinio širdies nepakankamumo diagnozė nustatoma remiantis diagnostikos ir širdies nepakankamumo gydymo gairėmis, kurias yra patvirtinusi Europos kardiologų draugija (angl. The European Society of Cardiology). Buvo renkami II-IV funkcinės klasės pagal NYHA (angl. The New York Heart Association) klasifikaciją pacientai. Ši klasifikacija grupuoja pacientus nuo pirmos iki ketvirtos kategorijos ir yra paremta pacientų apribojimai fizinio aktyvumo metu (33):
I klasė – Nepasireiškia jokie simptomai ir jokie apribojimai įprasto fizinio aktyvumo metu. Pavyzdžiui, silpnas dusulys vaikštant, lipant laiptais ir pnš.
II klasė – Lengvi simptomai (lengvas dusulys ir/ar angina) ir nedideli apribojimai įprasto fizinio aktyvumo metu.
III klasė – Juntami ryškūs apribojimai fizinio aktyvumo metu, dusulys pasireiškia nuėjus 20-100 metrų. Patogu tik ramybės būsenoje.
IV klasė – Dideli apribojimai. Simptomai jaučiami net ramybės būsenoje. Dažniausiai lovoje gulintys pacientai.
Tyrime sutikę dalyvauti pacientai buvo 23 – 87 metų amžiaus. Kiekvienoje grupėje buvo po 20 pacientų (2.1 lentelė).
2.1 lentelė. Tirtos imties charakteristika.
Rodmuo Funkcinė grupė Skirtumo patikimumo
palyginimas tarp grupių, p reikšmė NYHA II N = 20 NYHA III N = 20 NYHA IV N = 20 NYHA II ir NYHA III NYHA III ir NYHA IV NYHA II ir NYHA IV Lytis Vyrai = 13 Moterys = 7 Vyrai = 10 Moterys = 10 Vyrai = 11 Moterys = 9 0,262 0,500 0,374
Amžius, metais Med. = 63,5 Min. = 23 Max. = 87 Med. = 68 Min. = 38 Max. = 82 Med. = 69,5 Min. = 44 Max. = 87 0,308 0,275 0,112 SKS, mm Hg Med. = 130 Min. = 102 Max. = 169 Med. = 131 Min. = 100 Max. = 168 Med. = 133,5 Min. = 90 Max. = 176 0,454 0,487 0,428
18 DKS, mm Hg Med. = 80 Min. = 68 Max. = 109 Med. = 80 Min. = 60 Max. = 112 Med. = 80 Min. = 60 Max. = 94 0,095 0,278 0,229 Trombozių komplikacijos Buvo = 3 (15 %) Nebuvo = 17 (85 %) Buvo = 1 (5 %) Nebuvo = 19 (95 %) Buvo = 4 (20 %) Nebuvo = 16 (80 %) 0,322 0,187 0,500 TRM, x 109/l Med. = 225 Min. = 113 Max. = 499 Med. = 222,5 Min. = 126 Max. = 304 Med. = 202 Min. = 86 Max. = 713 0,492 0,193 0,107 VTT, fl Med. = 10,95 Min. = 7,70 Max. = 12,80 Med. = 10,85 Min. = 9,60 Max. = 12,60 Med. = 11,45 Min. = 10,20 Max. = 12,50 0,356 0,043 0,018 LEU, x 109/l Med. = 6,02 Min. = 4,30 Max. = 14,60 Med. = 80 Min. = 60 Max. = 112 Med. = 80 Min. = 60 Max. = 94 0,407 0,497 0,228 NE, x 109/l Med. = 3,79 Min. = 3,20 Max. = 5,17 Med. = 3,82 Min. = 2,35 Max. = 4,36 Med. = 3,75 Min. = 2,94 Max. = 4,90 0,237 0,159 0,439 LY, x 109/l Med. = 1,17 Min. = 0,60 Max. = 1,91 Med. = 1,41 Min. = 0,72 Max. = 2,60 Med. = 1,19 Min. = 0,63 Max. = 1,85 0,038 0,044 0,465 MO, x 109/l Med. = 0,64 Min. = 0,25 Max. = 0,82 Med. = 0,60 Min. = 0,35 Max. = 1,27 Med. = 0,69 Min. = 0,26 Max. = 1,08 0,434 0,241 0,102 KSIF, % Med. = 45 Min. = 23 Max. = 55 Med. = 40 Min. = 10 Max. = 55 Med. = 25,5 Min. = 10 Max. = 55 0,044 0,019 <0,001
AKFi vartojimas Vartojo = 13 (65 %) Nevartojo = 7 (35 %) Vartojo = 12 (60 %) Nevartojo = 8 (40 %) Vartojo = 11 (55%) Nevartojo = 9 (45 %) 0,500 0,264 0,170 Beta blokatorių vartojimas Vartojo = 12 (60 %) Nevartojo = 8 (40%) Vartojo = 10 (50 %) Nevartojo = 10 (50 %) Vartojo = 7 (35 %) Nevartojo = 13 (65 %) 0,376 0,262 0,102 Diuretikų vartojimas Vartojo = 4 (20 %) Nevartojo = 16 (80%) Vartojo = 9 (45 %) Nevartojo = 11 (55 %) Vartojo = 4 (20 %) Nevartojo = 16 (80 %) 0,088 0,088 0,653 Nitratų vartojimas Vartojo = 1 (5 %) Nevartojo = 19 (95%) Vartojo = 2 (10 %) Nevartojo = 18 (90 %) Vartojo = 1 (5 %) Nevartojo = 19 (95 %) 0,500 0,500 0,756 Heparino vartojimas Vartojo = 0 (0 %) Nevartojo = 20 (100 %) Vartojo = 0 (0 %) Nevartojo = 20 (100 %) Vartojo = 1 (5 %) Nevartojo = 19 (95 %) 1,000 0,500 0,500 Kalcio kanalų blokatorių vartojimas Vartojo = 1 (5 %) Nevartojo = 19 (95%) Vartojo = 1 (5 %) Nevartojo = 19 (95 %) Vartojo = 3 (15 %) Nevartojo = 17 (85 %) 0,756 0,302 0,302
19 CD skirtų vaistų vartojimas Vartojo = 0 (0 %) Nevartojo = 20 (100 %) Vartojo = 1 (5 %) Nevartojo = 19 (95 %) Vartojo = 0 (0 %) Nevartojo = 20 (100 %) 0,500 0,500 1,000 Digoksino vartojimas Vartojo = 0 (0 %) Nevartojo = 20 (100 %) Vartojo = 6 (30 %) Nevartojo = 14 (70 %) Vartojo = 3 (15 %) Nevartojo = 17 (85 %) 0,010 0,225 0,115 MMMH vartojimas Vartojo = 1 (5 %) Nevartojo = 19 (95 %) Vartojo = 3 (15 %) Nevartojo = 17 (85 %) Vartojo = 1 (5 %) Nevartojo = 19 (95 %) 0,302 0,302 0,756 Tiroksino vartojimas Vartojo = 0 (0 %) Nevartojo = 20 (100%) Vartojo = 3 (15 %) Nevartojo = 17 (85 %) Vartojo = 0 (0 %) Nevartojo = 20 (100%) 0,115 0,115 1,000 Insulino vartojimas Vartojo = 1 (5 %) Nevartojo = 19 (95 %) Vartojo = 0 (0 %) Nevartojo = 20 (100%) Vartojo = 2 (10 %) Nevartojo = 18 (90 %) 0,500 0,244 0,500 Varfarino vartojimas Vartojo = 3 (15 %) Nevartojo = 17 (85 %) Vartojo = 7 (35 %) Nevartojo = 13 (65 %) Vartojo = 3 (15 %) Nevartojo = 17 (85 %) 0,137 0,137 0,669
SKS – sistolinis kraujo spaudimas; DKS – diastolinis kraujo spaudimas; TRM – trombocitų skaičius; VTT – vidutinis trombocitų tūris; LEU – leukocitų skaičius; NE – neutrofilų skaičius; LY – limfocitų skaičius; MO – monocitų skaičius; AKFi – angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai; CD – cukrinis diabetas; MMMH – mažos molekulinės masės heparinas; KSIF – kairiojo skilvelio išmetimo frakcija; N – tiriamųjų skaičius; Med. – rezultatų mediana; Min. – mažiausias rezultatas imtyje; Max. – didžiausias rezultatas imtyje.
2.2. Tiriamosios medžiagos surinkimas ir apdorojimas
Pacientų kraujo ėminiai buvo imami ryte, kai prieš tai pacientai buvo nevalgę 8-12 valandų.
2.2.1. Kraujo serumo mėginiai
Ėminiai, skirti gauti kraujo serumui, buvo imami į vakuminius mėgintuvėlius (5 mL) su koaguliacijos aktivatoriais. Kraujui sukrešėjus po 15 min., mėginiai buvo centrifuguojami 20 min. prie 1000x g (3000 aps./min. greičiu) kambario temperatūroje. Lipidų koncentracijai nustatyti buvo naudojami standartiniai metodai su Synchron DxC 800 (Beckman Coulter) analizatoriumi.
20 Naudoti reagentai:
Bendrai cholesterolio koncentracijai - SYNCHRON SYSTEMS Cholesterol reagent REF 467825;
DTL koncentracijai - SYNCHRON SYSTEMS HDLD Cholesterol reagent REF650207;
MTL koncentracijai - SYNCHRON SYSTEMS direct LDLD Cholesterol reagent REF969706;
Triacilglicerolio koncentracijai - SYNCHRON SYSTEMS Triglycerides GPO REF445850.
Likusi serumo dalis buvo užšaldoma -80 ºC temperatūroje tolimesniems tyrimams. Surinkus pakankamai pacientų, tiriamosios medžiagos buvo atšildytos. Oksiduoto didelio tankio lipoproteinų ir nitrotirozino koncentracijos buvo tiriamos serume imunofermentiniu metodu naudojant atitinkamus reagentų rinkinius: Human oxidized high density lipoprotein (Ox-HDL0 ELISA Kit CSB-E16552h (Cusabio biotech Co, Kinija) ir Nitrotyrosin ELISA K7829 (immune diagnostic AG).
2.2.2. Kraujo plazmos mėginiai
Trombocitų agregacijos tyrimui, kraujo ėminiai buvo imami į 3,5 mL vakuminius mėgintuvėlius su 3,8 proc. natrio citratu. Tyrimui buvo reikalinga trombocitinė ir netrombocitinė plazmos. Norint paruošti trombocitais turtingą plazmą, mėgintuvėliai buvo centrifuguojami 15 min. prie 100x g (1000 aps./min. greičiu) kambario temperatūroje. Trombocitais neturtinga plazma paruošiama likusį kraują centrifuguojant 30 min. prie 1000x g (3000 aps./min. greičiu) kambario temperatūroje. Trombocitų agregacija buvo nustatoma trombocitais turtingoje plazmoje naudojant agregometrą (Chrono-Log, JAV) standartiniu Borno metodu (34). Naudoti reagentai: adenozino difosfatas - ADP (3,8 mmol/l; Chrono-Log P/N 384) ir adrenalinas - ADR (4,5 mmol/l). Netrombocitonėje plazmoje nustatoma fibrinogeno koncentracija Clauss metodu, naudojamas analizatorius STA Compact Max, naudojant reagentus STA Fibrinogen (Diagnostica Stago). Ditirozino koncentracija buvo tiriama spektrofluorimetru Perkin Elmer LS-55 (ex 310, em 410) ir išreikšta santykiniais fluorescencijos vienetais.
21
2.3. Duomenų apdorojimas
Duomenų analizė atlikta naudojant statistinės analizės programos IBM SPSS Statistics 21.0 versiją (IBM Corporation, JAV). Apskaičiuotos atskirų grupių kiekybinių dydžių medianos, mažiausios ir didžiausios vertės, kadangi tiriamųjų imtys sudarė mažiau negu 30 pacientų grupėje. Mann – Whitney U testas naudotas lyginti kiekybinius duomenis tarp grupių imčių. Siekiant nustatyti kiekybinių požymių tarpusavio ryšį naudotas Spearman koreliacijas koeficientas. Statistiškai reikšmingas skirtumas apibrėžtas, kai p < 0,05.
22
3. REZULTATAI
3.1. Tiriamųjų charakteristika
Iš viso tyrime dalyvavo 60 asmenų. Iš jų 34 (56,7 %) vyrai ir 26 (43,3 %) moterys. Visi tyrime dalyvavę asmenys sirgo lėtiniu širdies nepakankamumu. Buvo pasirinkti II, III ir IV pagal NYHA klasifikaciją funkcinių klasių ligoniai, kur kiekvienoje grupėje buvo po 20 pacientų. Kiekvienam iš jų buvo ištirta trombocitų agregacija, lipidograma, fibrinogeno, ditirozino, oxDTL bei nitrotirozino koncentracijos.
3.2. Rodmenų palyginimas tarp grupių
Lyginant tarp NYHA grupių pacientų trombocitų agregacijos tyrimus matoma tendencija, kad didėjant funkcinei klasei iš II į III, trombocitų agregacija skatinta tiek su ADP, tiek su ADR didėja. Dar labiau sunkėjant pacientų būklei (iš III į IV grupę), sumažėja. Statistiškai reikšmingas trombocitų agregacijos skirtumas rastas tik tarp NYHA III ir IV grupių (p = 0,039). III grupės pacientų trombocitų agregacija, skatinta su ADP ir ADR buvo intensyviausia (3.1. lentelė).
3.1. lentelė. Trombocitų agregacijos rezultatai ir jų palyginimas tarp grupių.
Tirtas rodmuo
Rezultatas Skirtumo patikimumo palyginimas tarp grupių, p reikšmė
NYHA II NYHA III NYHA IV NYHA II ir NYHA III NYHA III ir NYHA IV NYHA II ir NYHA IV Trombocitų agregacija, skatinta su ADP, % Med. = 75 Min. = 52 Max. = 90 Med. = 78 Min. = 61 Max. = 92 Med. = 71,5 Min. = 51 Max. = 91 0,294 0,039 0,140 Trombocitų agregacija, skatinta su ADR, % Med. = 80,5 Min. = 60 Max. = 100 Med. = 87 Min. = 58 Max. = 102 Med. = 83,5 Min. = 51 Max. = 99 0,094 0,182 0,465
ADP – adenozino difosfatas; ADR – adrenalinas; p – statistinis reikšmingumas; Med. – rezultatų mediana; Min. – mažiausias rezultatas imtyje; Max. – didžiausias rezultatas imtyje.
Analizuojant pacientų lipidogramos tyrimų rezultatus yra matoma tendencija, jog bendro cholesterolio koncentracija, esant sunkiausiai pacientų būklei, yra didžiausia. DTL ir MTL koncentracija tarp ligonių grupių nesiskiria. Rasta, kad trigliceridų (TG) koncentracija II funkcinės klasės ligonių grupėje yra didžiausia (p = 0,011). Sunkėjant pacientų būklei, koncentracija mažėja (3.2. lentelė).
23
3.2. lentelė. Lipidogramos rezultatai ir jų palyginimas tarp grupių.
Tirtas rodmuo
Rezultatas Skirtumo patikimumo palyginimas tarp grupių, p reikšmė
NYHA II NYHA III NYHA IV NYHA II ir NYHA III NYHA III ir NYHA IV NYHA II ir NYHA IV Bendras cholesterolis, mmol/l Med. = 4,43 Min. = 3,04 Max. = 6,06 Med. = 4,42 Min. = 2,57 Max. = 8,59 Med. = 4,91 Min. = 2,81 Max. = 8,34 0,410 0,420 0,497 MTL, mmol/l Med. = 2,85 Min. = 1,71 Max. = 4,19 Med. = 2,94 Min. = 1,63 Max. = 5,41 Med. = 2,94 Min. = 1,52 Max. = 5,84 0,465 0,444 0,497 DTL, mmol/l Med. = 1,04 Min. = 0,72 Max. = 2,31 Med. = 1,09 Min. = 0,44 Max. = 1,88 Med. = 1,15 Min. = 0,67 Max. = 2,01 0,434 0,149 0,143 Trigliceridai, mmol/l Med. = 1,46 Min. = 0,66 Max. = 2,19 Med. = 1,34 Min. = 0,24 Max. = 4,35 Med. = 1,00 Min. = 0,59 Max. = 2,29 0,382 0,112 0,011
MTL – mažo tankio lipoproteinai; DTL – didelio tankio lipoproteinai; p – statistinis reikšmingumas; Med. – rezultatų mediana; Min. – mažiausias rezultatas imtyje; Max. – didžiausias rezultatas imtyje.
Tiriant fibrinogeno ir nitrotirozino koncentracijas ir lyginant jas tarp skirtingų funkcinių klasių pacientų, nerandama jokiu reikšmingų skirtumų. Tačiau pažymėtina, kad skaitinės fibrinogeno ir nitrotirozino vertės didžiausios III funkcinės klasės ligonių grupėje, kaip kad ir trombocitų agregacijos rodmenys. Matoma tendencija, kad didėjant NYHA funkcinei klasei, didėja oxDTL ir ditirozino koncentracija. Ditirozino koncentracijos skirtumas tarp II ir IV grupių yra statistiškai reikšmingas (p = 0,048) (3.3. lentelė).
3.3. lentelė. Fibrinogeno, ditirozino, oxDTL ir nitrotirozino rezultatai ir jų palyginimas tarp grupių.
Tirtas rodmuo
Rezultatas Skirtumo patikimumo palyginimas tarp grupių, p reikšmė
NYHA II NYHA III NYHA IV NYHA II ir NYHA III NYHA III ir NYHA IV NYHA II ir NYHA IV Fibrino-genas, g/l Med. = 4,09 Min. = 2,35 Max. = 7,69 Med. = 4,20 Min. = 2,01 Max. = 6,73 Med. = 4,08 Min. = 2,59 Max. = 6,06 0,356 0,487 0,342 Ditirozi-nas Med. = 7,48 Min. = 3,37 Max. = 9,85 Med. = 8,13 Min. = 4,87 Max. = 13,96 Med. = 8,44 Min. = 6,13 Max. = 11,04 0,096 0,410 0,048 oxDTL, x 102 pg/ml Med. = 2,779 Min. = 0,373 Max. = 8,814 Med. = 3,181 Min. = 0,496 Max. = 14,61 Med. = 3,465 Min. = 0,712 Max= 18,134 0,320 0,389 0,265 Nitroti-rozinas x 102 nM Med. = 3,665 Min. = 1,117 Max= 11,021 Med. = 4,142 Min. = 2,093 Max= 28,322 Med. = 3,928 Min. = 1,743 Max= 93,577 0,241 0,209 0,460
oxDTL – oksiduoti didelio tankio lipoproteinai; p – statistinis reikšmingumas; Med. – rezultatų mediana; Min. – mažiausias rezultatas imtyje; Max. – didžiausias rezultatas imtyje.
24
3.3. Tirtų rodmenų sąsajos su vaistais
Kadangi LŠN sergantys pacientai vartoja įvairius vaistus, ieškojome, ar vartoti vaistai gali turėti tam tikros įtakos tyrimų rezultatams. Rasta, kad vartoti vaistai mūsų tirtos imties trombocitų agregacijos rodmenims reikšmės neturėjo (3.4. lentelė).
Rasta, jog beta blokatorių vartojimas tiesiogiai silpnai koreliuoja su MTL (R = 0,256, p = 0,048). Trigliceridų koncentracija tiesiogiai vidutiniškai stipriai koreliuoja su kalcio kanalų blokatorių vartojimu ir silpnai tiesiogiai koreliuoja yra su varfarino vartojimu (atitinkamai R = 0,324, p = 0,012; R = 0,265, p = 0,041) (3.5. lentelė). Stebima, jog diuretikų vartojimas tiesiogiai silpnai koreliuoja su oxDTL koncentracija (R = 0,289, p = 0,025) bei vidutinė tiesioginė koreliacija stebima tarp nitratų vartojimo ir fibrinogeno koncentracijos (R = 0,351, p = 0,006) (3.6. lentelė). Šios tiesioginės koreliacijos rodo, jog išvardintų vaistų vartojimas nežymiai, tačiau didina MTL, trigliceridų, oxDTL ir fibrinogeno rodmenų koncentracijas.
3.4. lentelė. Trombocitų agregacijos rezultatų koreliacija su pacientų vartojamais vaistais.
Vartojamas vaistas Koreliacija tarp rodmenų
Trombocitų agregacija, skatinta su ADP, %
N = 60
Trombocitų agregacija, skatinta su ADR, % N = 60 R p R p AKFi 0,069 0,600 -0,176 0,179 Beta blokatoriai -0,093 0,482 -0,114 0,387 Diuretikai 0,112 0,393 -0,061 0,644 Nitratai 0,041 0,758 0,176 0,179 Heparinas 0,169 0,196 0,026 0,842 KKB 0,047 0,721 -0,040 0,761 CD vaistai 0,120 0,360 -0,094 0,474 Digoksinas 0,067 0,609 0,100 0,448 MMMH 0,047 0,721 0,066 0,615 Tiroksinas 0,104 0,430 0,155 0,238 Insulinas -0,203 0,119 0,084 0,523 Varfarinas 0,022 0,866 -0,009 0,943
ADP – adenozino difosfatas; ADR – adrenalinas; AKFi – angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai; KKB – kalcio kanalų blokatoriai; CD – cukrinis diabetas; MMMH – mažos molekulinės masės heparinas; N – tiriamųjų skaičius; R – Spearman koreliacijos koeficientas; p – statistinis reikšmingumas.
25
3.5. lentelė. Lipidogramos rodmenų koreliacija su pacientų vartojamais vaistais.
Vartojamas vaistas
Koreliacija tarp rodmenų Bendras cholesterolis, mmol/l N = 60 MTL, mmol/l N = 60 DTL, mmol/l N = 60 Trigliceridai, mmol/l N = 60 R p R p R p R p AKFi 0,157 0,230 0,122 0,352 0,129 0,325 0,142 0,280 Beta blokatoriai 0,221 0,089 0,256 0,048 0,120 0,359 0,094 0,473 Diuretikai -0,159 0,225 -0,079 0,548 -0,164 0,209 -0,125 0,341 Nitratai 0,100 0,446 0,122 0,355 0,151 0,251 0,085 0,519 Heparinas -0,019 0,887 -0,109 0,407 -0,034 0,797 0,207 0,113 KKB 0,120 0,361 -0,002 0,989 0,111 0,397 0,324 0,012 CD vaistai -0,086 0,511 -0,071 0,588 -0,098 0,457 0,038 0,776 Digoksinas -0,055 0,675 -0,058 0,660 0,086 0,512 -0,097 0,461 MMMH 0,071 0,588 0,021 0,874 0,148 0,259 -0,030 0,822 Tiroksinas 0,038 0,776 0,002 0,987 0,117 0,373 0,119 0,364 Insulinas -0,170 0,194 -0,113 0,392 -0,210 0,108 -0,026 0,841 Varfarinas 0,167 0,202 0,203 0,119 -0,072 0,582 0,265 0,041 MTL – mažo tankio lipoproteinai; DTL – didelio tankio lipoproteinai; AKFi – angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai; KKB – kalcio kanalų blokatoriai; CD – cukrinis diabetas; MMMH – mažos molekulinės masės heparinas; N – tiriamųjų skaičius; R – Spearman koreliacijos koeficientas; p – statistinis reikšmingumas.
3.6. lentelė. Fibrinogeno, ditirozino, oxDTL ir nitrotirozino rezultatų koreliacija su pacientų vartojamais vaistais.
Vartojamas vaistas
Koreliacija tarp rodmenų Fibrinogenas, g/l N = 60 Ditirozinas N = 60 oxDTL, x 102 pg/ml N = 60 Nitrotirozinas x 102 nM N = 60 R p R p R p R p AKFi -0,077 0,560 -0,025 0,848 0,037 0,780 -0,056 0,669 Beta blokatoriai -0,065 0,624 -0,078 0,554 0,115 0,383 -0,222 0,088 Diuretikai -0,254 0,050 -0,206 0,114 0,289 0,025 -0,163 0,212 Nitratai 0,351 0,006 0,185 0,157 -0,046 0,725 -0,029 0,826 Heparinas 0,117 0,375 -0,049 0,711 0,117 0,375 0,143 0,276 KKB 0,075 0,570 0,040 0,761 -0,075 0,570 -0,120 0,361 CD vaistai 0,165 0,207 0,041 0,754 -0,101 0,440 -0,147 0,264 Digoksinas 0,061 0,645 -0,071 0,588 0,015 0,910 0,182 0,164 MMMH -0,050 0,702 -0,082 0,534 0,113 0,389 0,005 0,968 Tiroksinas -0,051 0,700 0,108 0,411 -0,223 0,087 -0,095 0,471 Insulinas 0,035 0,789 0,068 0,603 0,015 0,907 -0,135 0,305 Varfarinas 0,002 0,986 -0,076 0,564 -0,006 0,965 -0,030 0,818 oxDTL – oksiduoti didelio tankio lipoproteinai; AKFi – angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai; KKB – kalcio kanalų blokatoriai; CD – cukrinis diabetas; MMMH – mažos molekulinės masės heparinas; N – tiriamųjų skaičius; R – Spearman koreliacijos koeficientas; p – statistinis reikšmingumas.
26
3.4. Tirtų rodmenų tarpusavio sąsajos
Rasta atvirkštinė silpna koreliacija tarp trombocitų agregacijos, skatintos su ADR ir diastoliniu kraujo spaudimu (R = -0,294, p = 0,022) bei su trombocitų skaičiumi (R = 0,303, p = 0,019). Matoma priešinga, silpna koreliacija tarp trombocitų agregacijos, skatintos su ADP ir ditirozino koncentracijos (R = -0,296, p = 0,022) (3.7. lentelė).
3.7. lentelė. Trombocitų agregacijos rodmenų koreliacija su tirtųjų lytimi, amžiumi, AKS, KSIF ir laboratoriniais tyrimais.
Rodmuo Koreliacija tarp rodmenų
Trombocitų agregacija, skatinta su ADP, %
N = 60
Trombocitų agregacija, skatinta su ADR, % N = 60 R p R p Lytis -0,106 0,420 -0,036 0,785 Amžius, metai -0,060 0,651 -0,053 0,687 SKS, mm Hg 0,077 0,558 -0,085 0,518 DKS, mm Hg -0,037 0,781 -0,294 0,022 Trombozių komplikacijos 0,037 0,780 0,146 0,266 KSIF, % -0,052 0,694 0,063 0,633 TRM, x 109/l 0,303 0,019 0,009 0,944 VTT, fl -0,219 0,093 -0,159 0,225 LEU, x 109/l -0,044 0,740 -0,087 0,507 NE, x 109/l 0,019 0,883 0,039 0,769 LY, x 109/l -0,108 0,410 -0,046 0,728 MO, x 109/l -0,148 0,259 -0,083 0,527
Bendras cholesterolis, mmol/l -0,038 0,775 0,039 0,769
MTL, mmol/l -0,030 0,817 0,145 0,269 DTL, mmol/l 0,064 0,628 -0,070 0,595 Trigliceridai, mmol/l -0,124 0,345 -0,025 0,850 Fibrinogenas, g/l -0,072 0,585 0,092 0,486 oxDTL, x 102 pg/ml -0,030 0,817 0,024 0,855 Nitrotirozinas, x 102 nM -0,055 0,676 -0,042 0,751 Ditirozinas -0,296 0,022 0,039 0,765
ADP – adenozito difosfatas; ADR – adrenalinas; AKS – arterinis kraujo spaudimas; KSIF – kairiojo skilvelio išmetimo frakcija; SKS – sistolinis kraujo spaudimas; DKS – diastolinis kraujo spaudimas; TRM – trombocitų skaičius; VTT – vidutinis trombocitų tūris; LEU – leukocitų skaičius; NE – neutrofilų skaičius; LY – limfocitų skaičius; MO – monocitų skaičius; MTL – mažo tankio lipoproteinai; DTL – didelio tankio lipoproteinai; oxDTL – oksiduoti didelio tankio lipoproteinai; N – tiriamųjų skaičius; R –
Spearman koreliacijos koeficientas; p – statistinis reikšmingumas.
Lipidogramos tyrimų rezultatai statistiškai reikšmingai skiriasi tarp LŠN sergančių pacientų lyčių (3.8. ir 3.9. lentelės). Nors didesnė rizika sirgti širdies ir kraujagyslių ligomis būdinga vyrams, tačiau šio darbo rezultatai rodo, jog visų lipidogramos komponentų koncentracijų medianos yra didesnės
27 moterų tarpe (3.9. lentelė). Statistiškai reikšmingai tarp vyrų ir moterų nesiskyrė tik TG koncentracijos, nors skaitinė vertė irgi matoma didesnė moterų grupėje (p = 0,078).
3.8. lentelė. Lipidogramos rodmenų koreliacijia su tirtųjų lytimi, amžiumi, AKS, KSIF ir laboratoriniais tyrimais.
Rodmuo Koreliacija tarp rodmenų
Bendras cholesterolis, mmol/l N = 60 MTL, mmol/l N = 60 DTL, mmol/l N = 60 Trigliceridai, mmol/l N = 60 R p R p R p R p Lytis 0,371 0,004 0,271 0,036 0,390 0,002 0,229 0,078 Amžius, metai 0,092 0,486 -0,055 0,674 0,283 0,029 0,080 0,545 SKS, mm Hg 0,255 0,049 0,145 0,269 0,268 0,038 0,025 0,849 DKS, mm Hg 0,231 0,076 0,150 0,254 0,167 0,202 0,133 0,310 Trombozių komplikacijos 0,041 0,755 0,093 0,478 0,040 0,764 -0,263 0,069 KSIF, % 0,284 0,028 0,211 0,105 0,168 0,200 0,290 0,025 TRM, x 109/l 0,263 0,042 0,219 0,093 0,141 0,281 0,298 0,021 VTT, fl 0,216 0,097 0,131 0,320 0,202 0,122 0,068 0,608 LEU, x 109/l 0,078 0,553 0,170 0,194 -0,002 0,985 -0,089 0,498 NE, x 109/l 0,104 0,427 0,105 0,424 0,025 0,850 -0,027 0,839 LY, x 109/l -0,031 0,815 -0,017 0,897 -0,043 0,743 0,175 0,181 MO, x 109/l -0,309 0,016 -0,325 0,011 -0,097 0,462 -0,250 0,054 Fibrinogenas, g/l -0,019 0,883 0,007 0,957 0,057 0,663 0,071 0,590 oxDTL, x 102 pg/ml -0,038 0,772 -0,37 0,779 0,045 0,734 -0,205 0,117 Nitrotirozinas, x 102 nM -0,199 0,128 -0,161 0,219 -0,285 0,027 -0,083 0,528 Ditirozinas -0,011 0,935 0,043 0,742 -0,111 0,397 0,047 0,722 AKS – arterinis kraujo spaudimas; KSIF – kairiojo skilvelio išmetimo frakcija; MTL – mažo tankio lipoproteinai; DTL – didelio tankio lipoproteinai; SKS – sistolinis kraujo spaudimas; DKS – diastolinis kraujo spaudimas; TRM – trombocitų skaičius; VTT – vidutinis trombocitų tūris; LEU – leukocitų skaičius; NE – neutrofilų skaičius; LY – limfocitų skaičius; MO – monocitų skaičius; oxDTL – oksiduoti didelio tankio lipoproteinai; N – tiriamųjų skaičius; R – Spearman koreliacijos koeficientas; p – statistinis reikšmingumas.
Šiame darbe gaunama silpna tiesioginė koreliacija tarp bendro cholesterolio koncentracijos ir trombocitų skaičiaus (R = 0,263, p = 0,042) ir tarp trigliceridų koncentracijos su trombocitų skaičiumi (R = 0,298, p = 0,021). Statistiškai reikšminga vidutinė neigiama koreliacija stebima tarp bendro cholesterolio koncentracijos ir monocitų skaičiaus (R = -0,309, p = 0,016) ir tarp MTL koncentracijos ir monocitų skaičiaus (R = -0,325, p = 0,011). Vertinant DTL koncentracijos sąsają su nitrotirozino koncentracija LŠN sergančių pacientų serume, stebima priešinga silpna koreliacija tarp šių rodmenų (R = -0,285, p = 0,027) (3.8. lentelė).
28 Rasta, kad bendro cholesterolio koncentracija silpnai tiesiogiai koreliuoja su sistolinio kraujo spaudimu (SKS) (R = 0,255, p = 0,049) ir silpnai tiesiogiai koreliuoja su kairiojo skilvelio išmetimo frakcija (KSIF) (R = 0,284, p = 0,028). Taip pat gaunama tiesioginė silpna koreliacija tarp DTL ir SKS (R = 0,268, p = 0,038) ir tiesioginė silpna koreliacija tarp trigliceridų koncentracijos ir KSIF (R = 0,290, p = 0,025). Šios sąsajos rodo, jog didėjant įvardintų lipidų koncentracijoms, nežymiai didėja atitinkami kraujo spaudimo rodikliai tiriamojoje imtyje (3.8. lentelė).
3.9. lentelė. Lipidogramos rodmenys tarp LŠN sergančių pacientų lyčių.
Rodmuo Vyrai N = 34 Moterys N = 26 p reikšmė Bendras cholesterolis, mmol/l Med. = 4,17 Min. = 2,57 Max. = 8,34 Med. = 5,28 Min. = 2,88 Max. = 8,59 0,004 MTL, mmol/l Med. = 2,75 Min. = 1,63 Max. = 5,84 Med. = 3,30 Min. = 1,52 Max. = 5,46 0,036 DTL, mmol/l Med. = 1,02 Min. = 0,44 Max. = 2,31 Med. = 1,22 Min. = 0,87 Max. = 1,88 0,002 Trigliceridai, mmol/l Med. = 1,14
Min. = 0,24 Max. = 2,29 Med. = 1,50 Min. = 0,59 Max. = 4,35 0,078
MTL – mažo tankio lipoproteinai; DTL – didelio tankio lipoproteinai; Med. – rezultatų mediana; Min. – mažiausias rezultatas imtyje; Max. – didžiausias rezultatas imtyje; N – tiriamųjų skaičius, p – statistinis reikšmingumas.
Rasta vidutinio stiprumo tiesioginė koreliacija tarp vidutinio trombocitų tūrio (VTT) rodmenų ir ditirozino koncentracijos (R = 0,366, p = 0,004) (3.1 pav.). Neigiama vidutinė koreliacija stebima tarp oxDTL ir fibrinogeno koncentracijos (R = -0,344, p = 0,007) ir silpna tiesioginė koreliacija tarp oxDTL ir nitrotirozino koncentracijos (R = 0,278, p = 0,031) (3.10. lentelė).
3.1 pav. Ditirozino koncentracijos priklausomybė nuo vidutinio trombocitų tūrio. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 7 8 9 10 11 12 13 14 Ditiro zin o k o n ce n tra cija VTT, fl
29
3.10. lentelė. Fibrinogeno, ditirozino, oxDTL ir nitrotirozino koreliacija su tirtųjų lytimi, amžiumi, AKS, KSIF ir laboratoriniais tyrimais.
Rodmuo
Koreliacija tarp rodmenų Fibrinogenas, g/l N = 60 Ditirozinas N = 60 oxDTL, x 102 pg/ml N = 60 Nitrotirozinas x 102 nM N = 60 R p R p R p R p Lytis -0,129 0,325 0,039 0,768 -0,029 0,825 -0,216 0,098 Amžius, metai 0,167 0,203 0,142 0,278 0,108 0,411 -0,090 0,493 SKS, mm Hg 0,027 0,840 -0,051 0,698 -0,073 0,579 -0,238 0,068 DKS, mm Hg 0,197 0,131 -0,162 0,217 -0,167 0,201 -0,132 0,313 Trombozių komplikacijos -0,007 0,957 0,059 0,652 -0,226 0,082 -0,051 0,699 KSIF, % -0,042 0,752 -0,055 0,674 -0,100 0,446 -0,185 0,157 TRM, x 109/l 0,155 0,238 -0,070 0,594 -0,107 0,418 -0,117 0,374 VTT, fl 0,118 0,371 0,366 0,004 -0,180 0,169 0,140 0,286 LEU, x 109/l 0,121 0,358 0,119 0,365 -0,007 0,959 0,116 0,376 NE, x 109/l 0,194 0,137 0,095 0,472 -0,220 0,092 0,077 0,561 LY, x 109/l -0,091 0,488 -0,108 0,410 0,028 0,833 -0,121 0,356 MO, x 109/l 0,161 0,219 0,119 0,366 0,143 0,275 0,138 0,294 oxDTL, x 102 pg/ml -0,344 0,007 -0,203 0,120 1,000 - 0,278 0,031 Nitrotirozinas x 102 nM -0,042 0,749 0,066 0,614 0,278 0,031 1,000 - Ditirozinas 0,101 0,444 1,000 - -0,203 0,120 0,066 0,614
AKS – arterinis kraujo spaudimas; KSIF – kairiojo skilvelio išmetimo frakcija; oxDTL – oksiduoti didelio tankio lipoproteinai; SKS – sistolinis kraujo spaudimas; DKS – diastolinis kraujo spaudimas; TRM – trombocitų skaičius; VTT – vidutinis trombocitų tūris; LEU – leukocitų skaičius; NE – neutrofilų skaičius; LY – limfocitų skaičius; MO – monocitų skaičius; N – tiriamųjų skaičius; R – Spearman koreliacijos koeficientas; p – statistinis reikšmingumas.
30
4. REZULTATŲ APTARIMAS
LŠN sergančių pacientų trombocitų agregacija randama intensyvesnė, negu sveikų asmenų (3,32). Sunkėjant LŠN sergančių pacientų būklei, didėja trombozių komplikacijų rizika, o ši siejama su vis intensyvesne trombocitų agregacija (1). Šiame darbe lyginama trombocitų agregacija tarp NYHA grupių: III grupės trombocitų agregacijos rodmenys, skatinti su ADP ir skatinti su ADR, buvo aukštesni, negu II grupės pacientų. Tačiau šis pokytis nebuvo statistiškai reikšmingas (atitinkamai p = 0,294, p = 0,094). NYHA IV grupės pacientų trombocitų agregacijos, skatintos su ADP, rodmenys buvo statistiškai reikšmingai mažesni negu NYHA III grupės pacientų (p = 0,039).
Garcia ir kiti autoriai tyrinėdami ateroskleroze sergančių pacientų rodmenis rado stiprią koreliaciją tarp trombocitų agregacijos, skatintos su ADP, intensyvumo ir trombocitų skaičiaus kraujyje bei fibrinogeno koncentracijos (35). Šiame darbe analizuojant LŠN sergančių pacientų trombocitų agregacijos tyrimus buvo rasta tiesioginė vidutinio stiprumo koreliacija, tarp trombocitų agregacijos, skatintos su ADP, intensyvumo su trombocitų skaičiumi (R = 0,303, p = 0,019), o koreliacija su fibrinogeno koncentracija nėra statistiškai reikšminga (p = 0,585).
Toliau analizuojant tyrimų rezultatus tarp skirtingų funkcinių klasių pacientų buvo rastas trigliceridų koncentracijos mažėjimas, didėjant NYHA funkcinei klasei. Statistiškai reiškmingas skirtumas (p = 0,011) rastas tarp II ir IV grupių, kur IV grupės pacientų trigliceridų koncentracija buvo mažiausia. Kozdag ir kiti mokslininkai gavo tokį patį rezultatą, taip pat lygindami pacientų rodmenis tarp NYHA II ir IV grupių. Jų teigimu, sunkėjant pacientų būklei ir mažėjant trigliceridų koncentracijai, didėja mirties rizika (36).
Širdies ir kraujagyslių ligos, išsivystančios dėl aterosklerozės, moterims pasireiškia 7 – 10 metų vėliau negu vyrams (37). Koronarinę širdies ligą, aterosklerozę lemia padidėjusios bendro cholesterolio, MTL ir trigliceridų koncentracijos (38). Nors didesnė rizika sirgti širdies ir kraujagyslių ligomis yra vyrams, tačiau analizuojant LŠN sergančių pacientų rodmenis buvo rasta, jog lipidogramos rezultatų koncentracijos buvo didesnės moterų tarpe lyginant su vyrais. Bendro cholesterolio, MTL ir DTL koncentracijų skirtumai buvo statistiškai reikšmingi (atitinkamai p = 0,004, p = 0,036, p = 0,002), o trigliceridų koncentracijos padidėjimas nebuvo statistiškai reikšmingas (p = 0,078).
Khan su kolegomis tyrinėdami ateroskleroze sergančių pacientų rodmenis rado silpnas tiesiogines koreliacijas tarp pacientų lipidų, išskyrus DTL, koncentracijų su sistoliniu ir diastoliniu kraujospūdžiu. Dėl šios priežasties jie teigia, kad padidėjus kraujospūdžiui, lipidų metabolizme pasireiškia nedideli sutrikimai (39). LŠN sergančių pacientų imtyje buvo rasta silpna tiesioginė koreliacija tarp bendro cholesterolio koncentracijos ir sistolinio kraujo spaudimo (SKS) (R = 0,255, p = 0,049). Tarp SKS ir MTL ar trigliceridų koncentracijų statistiškai reikšmingos koreliacijos nebuvo.
31 Wang ir bendraautorių atliktame tyrime buvo nustatyta, kad lipidų koncentracijos, išskyrus DTL, tiesiogiai koreliuoja su trombocitų skaičiumi ir padidėjusiu trombocitų tūriu. Taip pat jie teigia, jog hiperlipidemija, arba kitaip vadinama hipercholesterolemija, yra siejama su padidėjusiu trombocitų aktyvumu. Trombocitai dalyvauja uždegiminiuose procesuose ir aterosklerozės vystymesi (40). Mūsų atliktame tyrime buvo gauta tiesioginė silpna koreliacija tarp bendro cholesterolio koncentracijos ir trombocitų skaičiaus kraujyje (R = 0,263, p = 0,042) bei trigliceridų koncentracija silpnai koreliuoja su trombocitų skaičiumi (R = 0,298, p = 0,021). Šie rezultatai rodo, kad LŠN sergančių pacientų kraujyje didėjant įvardintų lipidų koncentracijoms, didėja trombocitų skaičius. Negana to, jog gaunamas padidintas trombocitų skaičius, pastarieji yra aktyvuojami lipidų, išskyrus DTL, pagalba. Aktyvinti trombocitai intensyviau jungiasi tarpusavy, kartu prisijungdami leukocitus taip sudarydami aterosklerotines plokšteles (40).
Moksliniuose darbuose dažniausiai vertinamas monocitų ir DTL santykis. Jis laikomas uždegiminiu žymeniu širdies ir kraujagyslių ligų atvejais (41–43). Šiame darbe statistiškai reikšmingos koreliacijos tarp DTL ir monocitų skaičiaus nebuvo rasta (p = 0,462). Mūsų tiriamojoje imtyje buvo rasta neigiama vidutinio stiprumo koreliacija tarp bendro cholesterolio koncentracijos ir monocitų skaičiaus (R = -0,309, p = 0,016) bei neigiama vidutinio stiprumo koreliacija tarp MTL koncentracijos ir monocitų skaičiaus (R = -0,325, p = 0,011). Kokia tiksli koreliacija tarp monocitų skaičiaus ir kitų lipidų koncentracijos nėra visiškai aiški, nes Caklili ir kiti autoriai teigia, kad tarp MTL koncentracijos ir monocitų skaičiaus yra neigiama koreliacija (44), o Oda su kolegomis tvirtina, jog koreliacija tarp šių rodmenų yra teigiama (45). Mūsų atliktame tyrime rasta neigiama vidutinio stiprumo koreliacija tarp bendro cholesterolio ir MTL koncentracijų bei monocitų skaičiumi leidžia manyti, kad gali būti sąsajų tarp lipidų apykaitos ir monocitų veiklos.
Kresanov ir kiti mokslininkai yra nustatę oxDTL tiesioginę koreliacija su visais lipidogramos komponentais, tiriant pacientus su aterosklerozės rizika (46). Tie patys autoriai randa ir priešingą oxDTL koreliaciją su pacientų amžiumi. Analizuojant LŠN sergančius pacientus nebuvo rasta jokių sąsajų tarp oxDTL ir lipidogramos ar pacientų amžiaus.
Rasta, jog sunkėjant LŠN pacientų būklei, didėjo jų ditirozino koncentracija. Statistiškai reikšmingas rezultatas (p = 0,048) gautas lyginant II ir IV grupes, kur IV grupės ditirozino koncentracija buvo didžiausia. Nors statistiškai nereikšmingai, tačiau buvo pastebėta ir oxDTL koncentracijų didėjimas sunkėjant ligonių būklei. Be to, oxDTL silpnai tiesiogiai koreliavo su nitrotirozino koncentracija (R = 0,278, p = 0,031). Tsutsui ir kitų mokslininkų teigimu pacientams, sergantiems širdies nepakankamumu, organizme atsiranda padidintas kiekis oksidantų ir tai sukelia oksidacinį stresą (47). Gauti šio darbo rezultatai rodo, jog oksidantų daugėja, sunkėjant LŠN sergančių pacientų būklei. Dėl to didėja ditirozino ir oxDTL koncentracijos. Tie patys autoriai teigia, kad didėjant oksidantų kiekiui,
32 didėja nitrotirozino koncentracija pacientų serume. Nors reikšmingų nitrotirozino koncentracijų skirtumų tarp skirtingų funkcinių klasių ligonių grupių neradome, bet ditirozino koncentracija buvo rasta statistiškai patikimai didžiausia NYHA IV funkcinės klasės ligonių plazmoje. Tai patvirtina hipotezę, kad sunkesnės būklės ligonių organizme yra ženkliai didesnis oksidacinis stresas.
Tyrinėdami ateroskleroze sergančius pacientus Bencsik ir kiti autoriai teigia radę neigiamą vidutinio stiprumo koreliaciją tarp DTL ir nitrotirozino koncentracijų. Taip pat, jie pateikia tiesiogines koreliacijas tarp nitrotirozino ir kitų serumo lipidų koncentracijų (6). Mūsų atliktame tyrime buvo gauta neigiama silpna koreliacija tarp DTL ir nitrotirozino koncentracijų (R = -0,285, p = 0,027), o statistiškai reikšmingų koreliacijų tarp nitrotirozino ir kitų lipidų koncentracijų nebuvo rasta. Kadangi nitrotirozinas yra uždegimo ir oksidacinio streso produktas, todėl gauta priešinga koreliacija tarp DTL koncentracijos ir nitrotirozino koncentracijos, galbūt galėtų pagrįsti DTL priešuždegiminį poveikį.
Pacientams, sergantiems širdies nepakankamumu, rastas padidėjęs vidutinis trombocitų tūris (VTT) gali rodyti padidėjusią trombocitų aktyvaciją arba padidėjusių didelių, hiperagregacinių trombocitų skaičių (48). Savo darbe mes taip pat radome, kad sunkėjant ligonių būklei, VTT didėja. Nors nėra aprašyta, kad VTT koreliuotų su ditirozino koncentracija, tačiau šiame darbe gauta vidutinė tiesioginė koreliacija tarp šių rodmenų (R = 0,366, p = 0,004). Gavus tokį rezultatą, galima daryti prielaidą, jog padidėjusi ditirozino koncentracija gali sietis su aktyvesniais trombocitais.
Literatūros šaltiniuose teigiama, jog LŠN sergančių pacientų kraujyje fibrinogeno koncentracija yra didesnė (32). Fibrinogeno koncentracijos padidėjimas yra vienas iš rizikos veiksnių širdies ir kraujagyslių ligų atveju (31). Kotbi su kolegomis įrodė, kad fibrinogeno koncentracija tiesiogiai stipriai koreliuoja su koronarinės širdies ligos sunkumu (49). Analizuojant mūsų tiriamųjų imtį, neradome reikšmingų fibrinogeno koncentracijos skirtumų tarp skirtingų funkcinių klasių pacientų.
Thomson su kolegomis įrodė, kad ateroskleroze sergančių pacientų kraujyje tiesiogiai koreliuoja fibrinogeno ir nitrotirozino koncentracijos (22). Tiriant mūsų pacientų imtį tarp šių rodmenų nebuvo statistiškai reikšmingos koreliacijos neradome (p = 0,749).
Martinez ir kiti mokslininkai teigia, jog in vitro sąlygomis, padidėjus ditirozino koncentracijai, padidėja trombocitų agregacijos intensyvumas, skatintas su ADP (19). Tiriant LŠN sergančių pacientų rodmenis, rasta neigiama silpna koreliacija tarp ditirozino koncentracijos ir trombocitų agregacijos, skatintos su ADP, intensyvumo (R = -0,296, p = 0,022). Fiziologiškai, azoto oksidas organizme gaminamas dėl kraujgyslių praplėtimo, tačiau jis taip pat tiesiogiai slopina trombocitų agregaciją bei trombocitų sukibimą su kraujagyslių endoteliu (50). Dėl šios priežasties, mūsų ligonių imtyje, galima daryti prielaidą, jog dalis oksidantų buvo azoto oksidas, kuris veikdamas baltymus, galėjo didinti ditirozino koncentraciją, tačiau tuo pačiu galėjo slopinti trombocitų agregaciją. Be to, kai kurie autoriai randa, kad oksidantai netgi slopina trombocitus. Galima tikėtis, kad trombocitų aktyvinimas arba
33 slopinimas turėtų priklausyti nuo susidariusiu organizme oksidantų koncentracijos. Tačiau mūsų gauti rezultatai tarsi prieštarauja vieni kitiems: oksidacinį stresą rodančių rodmenų – nitrotirozino, ditirozino, oxDTL didesnės skaitinės vertės sunkesnės būklės ligonių kraujyje. Trombocitų agregacija intensyviausia NYHA III funkcinės klasės ligoniams, o koreliacija tarp ditirozino ir trombocitų agregacijos randama neigiama. Gali būti, kad koreliacijai turėjo reikšmės tai, kad IV funkcinės klasės ligonių ji buvo mažesnė, negu III funkcinės klasės ligonių. Kas lėmė tokį trombocitų agregacijos sumažėjimą IV funkcinės klasės ligonių grupėje, lieka neaišku.
Tirinėjant LŠN sergančių pacientų vaistų vartojimo poveikį tyrimų rezultatams, pastebėta, kad vaistų vartojimas trombocitų agregacijos rodmenims įtakos neturėjo. Šio tyrimo duomenimis beta blokatoriai galėjo šiek tiek padidinti MTL koncentracijos rodmenis, kalcio kanalų blokatorių ir varfarino vartojimas galėjo padidinti trigliceridų koncentraciją, diuretikai galėjo lemti oxDTL koncentracijos padidėjimą bei nitratų vartojimas galėjo padidinti fibrinogeno koncentraciją. Gavus tokius rezultatus galima daryti prielaidą, jog MTL, trigliceridų, oxDTL ir fibrinogeno koncentracijos galėjo būti šiek tiek padidintos dėl pacientų vartojamų vaistų.
Apibendrinant pasakytina, jog sunkesnės būklės ligonių kraujyje rastas didesnis VTT, limfocitų skaičius, gali būti intensyvesnės trombocitų agregacijos priežastimi.
Didžiausia ditirozino ir oxDTL koncentracijos sunkiausios būklės ligonių kraujyje, oxDTL ir nitrotirozino koreliacija bei didesnis nitrotirozino ir ditirozino koncentracijos prastesnės būklės ligonių kraujyje tendencija patvirtina sunkesnės būklės ligonių kraujyje esant didesnį oksidacinį stresą. oxDTL ir nitrotirozino ligonių kraujyje radimas patvirtina hipotezę, kad oksidantai ne tik nitrina baltymus, bet oksiduoja lipoproteinus.
Neigiama koreliacija tarp DTL ir nitrotirozino koncentracijų papildo žinias apie DTL svarbą ne tik lipidų apykaitoje, bet ir slopinant trombozių vystymąsi.
34
IŠVADOS
1. Didžiausia ditirozino koncentracija rasta IV funkcinės klasės ligonių grupėje. Rasta tendencija: didėjant pacientų NYHA funkcinei klasei, tolygiai didėja oksiduotų didelio tankio lipoproteinų koncentracija. Fibrinogeno ir nitrotirozino koncentracijos tarp tiriamųjų grupių reikšmingai nesiskyrė.
2. Trombocitų agregacija intensyviausia rasta NYHA III grupėje.
3. Nitrotirozino koncentracija tiesiogiai koreliavo su oxDTL ir atvirkščiai – su DTL koncentracija. Ditirozino koncentracija koreliavo su VTT. Trombocitų agregacijos intensyvumas tiesiogiai koreliavo su trombocitų skaičiumi ir neigiamai – su ditirozino koncentracija.
35
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Wannamethee SG, Whincup PH, Papacosta O, Lennon L, Lowe GD. Associations between blood coagulation markers, NT-proBNP and risk of incident heart failure in older men: The British Regional Heart Study. Int J Cardiol. 2017;230:567–71.
2. Palta S, Saroa R, Palta A. Overview of the coagulation system. Indian J Anaesth. 2014;58(5):515–23.
3. Jaffer IH, Fredenburgh JC, Hirsh J, Weitz JI. Medical device-induced thrombosis: What causes it and how can we prevent it? J Thromb Haemost. 2015;13(S1):S72–81.
4. Sies H. Oxidative stress: Oxidants and antioxidants. Exp Physiol. 1997;82(2):291–5. 5. Radi R. Protein Tyrosine Nitration: Biochemical Mechanisms and Structural Basis of its
Functional Effects. Acc Chem Res. 2014;46(2):550–9.
6. Bencsik P, Sasi V, Kiss K, Kupai K, Kolossváry M, Maurovich-Horvat P, et al. Serum lipids and cardiac function correlate with nitrotyrosine and MMP activity in coronary artery disease patients. Eur J Clin Invest. 2015;45(7):692–701.
7. Rosenfeld MA, Bychkova A V., Shchegolikhin AN, Leonova VB, Kostanova EA, Biryukova MI, et al. Fibrin self-assembly is adapted to oxidation. Free Radic Biol Med. 2016;95:55–64. 8. Van Der Stoep M, Korporaal SJA, Van Eck M. High-density lipoprotein as a modulator of
platelet and coagulation responses. Cardiovasc Res. 2014;103(3):362–71.
9. Riwanto M, Landmesser U. High density lipoproteins and endothelial functions: mechanistic insights and alterations in cardiovascular disease. J Lipid Res. 2013;54(12):3227–43.
10. Zhang B, Kawachi E, Miura S, Uehara Y, Matsunaga A, Kuroki M, et al. Therapeutic Approaches to the Regulation of Metabolism of High-Density Lipoprotein. Circ J. 2013;77(11):2651–63.
11. Zhou B, Zu L, Chen Y, Zheng X, Wang Y, Pan B, et al. Myeloperoxidase-oxidized high density lipoprotein impairs atherosclerotic plaque stability by inhibiting smooth muscle cell migration. Lipids Health Dis. 2017;16(1):1–11.
12. Sasidharan Soumyarani V, Jayakumari N. Oxidized HDL Induces Cytotoxic Effects: Implications for Atherogenic Mechanism. Vol. 28, Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 2014. 481-489 p.
