LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

UGNĖ ČEPONYTĖ

NESTEROIDINIŲ VAISTŲ NUO UŽDEGIMO PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO KASOS VĖŽIO LĄSTELIŲ KULTŪROSE ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Dr. Vilma Petrikaitė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

Parašas Data

NESTEROIDINIŲ VAISTŲ NUO UŽDEGIMO PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO KASOS VĖŽIO LĄSTELIŲ KULTŪROSE ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Dr. Vilma Petrikaitė Parašas

Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė

Parašas Ugnė Čeponytė

Data Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1. NVNU pritaikymas chemoprevencijai ir vėžio terapijai ... 11

1.2. NVNU veikimo mechanizmai ... 14

1.3. NVNU poveikis vėžinių ląstelių kultūrose ... 17

1.4. Kasos vėžio ląstelių savybių apžvalga ... 22

2. TYRIMO METODIKA ... 24

2.1. Tyrimo objektas ... 24

2.2. Reagentai, priemonės ir aparatūra ... 24

2.3. Tyrimų metodikos... 25

2.3.1. Poveikio vėžinių ląstelių gyvybingumui nustatymas ... 25

2.3.2. Poveikio vėžio ląstelių sferoiduose tyrimas ... 26

2.3.3. Ląstelių žūties būdo nustatymas ... 26

2.3.4. Poveikio vėžio ląstelių kolonijų formavimuisi nustatymas ... 27

2.3.5. Statistinis duomenų apdorojimas ... 27

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28

3.1. NVNU poveikis kasos vėžio ląstelių gyvybingumui ... 28

3.2. Poveikis vėžio ląstelių sferoiduose ... 30

3.3. Vėžio ląstelių žūties būdo nustatymas ... 35

3.4. Poveikis vėžinių ląstelių kolonijų formavimuisi ... 38

4. IŠVADOS ... 41

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43

SANTRAUKA

U. Čeponytės magistro baigiamasis darbas: Nesteroidinių vaistų nuo uždegimo priešvėžinio aktyvumo kasos vėžio ląstelių kultūrose įvertinimas. Mokslinė vadovė: dr. V. Petrikaitė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2017.

Darbo tikslas: Įvertinti nesteroidinių vaistų nuo uždegimo (NVNU) priešvėžinį aktyvumą kasos vėžio ląstelių kultūrose.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti NVNU poveikį kasos vėžio ląstelių gyvybingumui. 2. Ištirti NVNU aktyvumą kasos vėžio ląstelių 3D modeliuose. 3. Nustatyti NVNU sukeliamą žuties būdą kasos vėžio ląstelėms. 4. Ištirti NVNU poveikį vėžinių ląstelių kamieniškumui.

Tyrimo metodai. NVNU poveikis žmogaus kasos vėžio ląstelių gyvybingumui nustatytas MTT metodu. Junginių aktyvumas vėžio ląstelių 3D kultūrose nustatytas, vertinant jų poveikį ląstelių sferoidų dydžio kitimui. Ląstelių žūties būdas nustatytas, ląsteles dažant Hoechst 33342 ir propidžio jodidu. Junginių poveikis ląstelių kamieniškumui nustatytas, vertinant jų poveikį ląstelių kolonijų formavimuisi. Koreliacija tarp priešvėžinio aktyvumo 2D ir 3D ląstelių kultūrose įvertinta apskaičiuojant Pearson‘o koeficientą r ir įvertinant jo statistinį patikimumą.

Rezultatai. Penki iš septynių tirtų NVNU mažino kasos vėžio ląstelių gyvybingumą. Fenamatai pasižymėjo didesniu antiproliferaciniu aktyvumu COX-2 ekspresuojančiai BxPC-3 nei COX-2 neekspresuojančiai MIA PaCa-2 ląstelių linijai. Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo meklofenamo rūgštis (EC50 = 16,0 ± 5,9 µM BxPC-3 ląstelėms, EC50 = 43,5 ± 1,8 µM MIA PaCa-2 ląstelėms). Didžiausiu BxPC-3 sferoidų augimą slopinančiu poveikiu pasižymėjo niflumo rūgštis, o celekoksibas labiausiai slopino MIA PaCa-2 sferoidų augimą. Fenamatai ir koksibai buvo aktyvesni 2D ląstelių kultūrose, o salicilatai – 3D ląstelių kultūrose. Fenamatai ir koksibai sukėlė nuo koncentracijos priklausomą kasos ląstelių apoptozę ir nekrozę. Koksibai labiau sukėlė apoptozę MIA Paca-2 nei BxPC-3 ląstelėms. NVNU slopino ir ląstelių kamieniškumą. Meklofenamo ir niflumo rūgštys bei parekoksibas didesnį poveikį turėjo BxPC-3, o celekoksibas – MIA PaCa-2 ląstelių kolonijų formavimuisi.

Išvada. Fenamatai, koksibai ir salicilatai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu žmogaus kasos vėžio ląstelių BxPC-3 ir MIA PaCa-2 kultūrose.

SUMMARY

U. Čeponytė Master Thesis: Evaluation of anticancer activity of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in pancreatic cancer cell cultures – Assoc. Prof. V. Petrikaitė. Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2017.

The aim: To evaluate the anticancer activity of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in pancreatic cancer cell lines.

Objectives:

1. To evaluate the effect of NSAIDs on the viability of human pancreatic cancer cell lines. 2. To test the effect of NSAIDs on human pancreatic cancer spheroid growth.

3. To identify the type of human pancreatic cancer cell death induced by NSAIDs.

4. To evaluate the effect of NSAIDs on colony forming of human pancreatic cancer cell lines. Methods. Cell growth inibition was tested using MTT assay. The activity of compounds in 3D cell cultures was evaluated by measuring the changes of cancer spheroid size. The type of pancreatic cancer cell death was identified by staining cells with Hoechst 33342 and propidium iodide. The effect of compounds on the formation of pancreatic cancer cell colonies was evaluated using clonogenic assay. The correlation between anticancer activity in 2D and 3D cell cultures was assesed by calculating Pearson`s coefficient r and its statistical reliability.

Results. Five out of seven tested NSAIDs reduced the viability of both cancer cell lines. Fenamates were more active against COX-2 expressing BxPC-3 than COX-2 non-expressing MIA PaCa-2 cell line. The most active compound in 2D cell cultures was meclofenamic acid ( EC50 was 16.0 ± 5.9 µM against BxPC-3, and 43.5 ± 1.8 µM against MIA PaCa-2). Niflumic acid possessed the highest effect on BxPC-3 cancer spheroid growth, while celecoxib had the highest effect on MIA PaCa-2 cancer spheroid growth. Fenamates and coxibs were more active in 2D cell cultures, salicylates – in 3D cell cultures. Fenamates and coxibs induced dose-dependent apoptosis and necrosis in pancreatic cancer cells. Coxibs induced apoptosis more in MIA PaCa-2 than in BxPC-3 cell line. NSAIDs also inhibited the cell colony formation. Meclofenamic acid, niflumic acid and parecoxib possessed higher activity on BxPC-3, and celecoxib – on MIA PaCa-2 cell colony formation.

Conclusion. Phenamates, coxibs and salicylates possess anticancer activity on human pancreatic cancer BxPC-3 and MIA PaCa-2 cell cultures.

PADĖKA

Dėkoju mokslinio darbo vadovei dr. V. Petrikaitei už suteiktą visapusišką pagalbą ir konsultacijas. Taip pat dėkoju prof. Arvydui Ūsui, prof. Arvydui Skeberdžiui ir prof. Vilmantei Borutaitei už suteiktą pagalbą ir galimybę naudotis reikiama įranga.

SANTRUMPOS

ATCC Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American type culture collection) CDK nuo ciklino priklausanti kinazė (angl. cyclin-dependent kinase)

cGMP ciklinio guanozino monofosfatas (angl. cyclic guanosine monophosphate)

COX ciklooksigenazė

DMEM Dulbecc'o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (angl. Dulbecco's Modified

Eagle Medium)

DMSO dimetilsulfoksidas

EC50 koncentracija, sukelianti 50 proc. biologinių arba biocheminių funkcijų praradimą (angl. effective concentration)

FBS fetalinis veršiukų serumas (angl. fetal bovine serum) MMP matrikso metaloproteinazė

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas

NF-κB branduolinis transkripcijos faktorius kappa B (angl. nuclear factor kappa B) NVNU nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo

PBS fosfatinis druskų tirpalas (angl. phosphate-buffered saline) PDE fosfodiesterazė (angl. phosphodiesterase)

PDK-1 nuo fosfoinozitido priklausoma kinazė 1 (angl. phosphoinositide-dependent kinase-1) PFA paraformaldehidas

PG prostaglandinas

PGH2 prostaglandinas H2

PI3K-Akt fosfatidilinozitolio 3-kinazė (angl. Phosphatidylinositol 3-kinase) PKB baltymų kinazė B (angl. protein kinase B)

PPAR peroksisomos proliferacijos aktyvintas receptorius (angl. peroxisome

proliferator-activated receptor)

ĮVADAS

Vėžys yra antra dažniausia žmonių mirties priežastis pasaulyje. 2015 m. nuo vėžinių susirgimų mirė 8,8 mln. žmonių. Vienos iš šešių mirčių priežastis yra vėžiniai susirgimai, o žmonių skaičius, mirštančių nuo vėžio, vis auga [1].

Nepaisant didelės pažangos kasos vėžio terapijoje, pacientų, sergančių šia liga, išgyvenamumas per pastaruosius kelis dešimtmečius nepagerėjo. Penkerių metų santykinio išgyvenamumo vidurkis yra tik apie 8 proc. Šis rodiklis yra žemas todėl, kad daugiau nei pusė kasos vėžio atvejų diagnozuojama vėlyvosiose stadijose. Žmonių, sergančių vėlyvosios stadijos kasos vėžiu, penkerių metų santykinio išgyvenamumo vidurkis yra tik apie 2 proc. Net ir pacientų, kuriems buvo diagnozuotas neišplitęs kasos vėžys, išgyvenamumas yra tik apie 15 proc [2–4]. Kasos vėžys yra labai atsparus chemoterapijai, dėl to jo gydymas dažniausiai būna nesėkmingas [4,5].

Infekcijos ir uždegimas yra susiję su vėžio vystymusi [6]. Vienas iš uždegimą slopinančių būdų – ciklooksigenazės (COX) slopinimas. Nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo (NVNU), slopindami COX, mažina ne tik uždegimą, bet slopina ir su vėžio formavimusi ir vystymusi susijusius procesus, tokius kaip DNR sintezė, ląstelių proliferacija, apoptozė, angiogenezė ir migracija [7].

Buvo atlikta daug klinikinių tyrimų, kuriuose nagrinėjamas NVNU priešvėžinis poveikis. Dauguma tyrimų buvo skirti išsiaiškinti galimą NVNU pritaikymą vėžio terapijoje. Mažiau buvo tirtos jų pritaikymo galimybės chemoprevencijai. Klinikinių tyrimų, kuriuose yra studijuojamas NVNU poveikis kasos vėžio augimui, nėra atlikta daug. Daugelyje tyrimų yra nagrinėjami jų sinergistiniai poveikiai kartu su priešvėžiniais vaistais. Pastebėta, kad kartu su priešvėžiniais vaistais pradėjus vartoti NVNU, padidėja žmonių, sergančių kasos vėžiu, išgyvenamumas [8].

Nutarėme nustatyti skirtingų NVNU poveikį kasos vėžio ląstelėms. Pasirinkti salicilatų, fenamatų ir koksibų grupėms priklausantys vaistiniai junginiai tarpusavyje skiriasi chemine struktūra, selektyvumu COX ir veikimo mechanizmais. Norint nustatyti NVNU priešvėžinį aktyvumą, yra svarbu įvertinti, ar jis yra susijęs su tiesioginiu šių junginių mechanizmu (COX-2 slopinimu), ar su netiesioginiais, kadangi ne visos kasos vėžio ląstelių linijos ekspresuoja COX-2 [9]. Dėl šių priežasčių nusprendėme plačiau išnagrinėti pasirinktų NVNU priešvėžinį aktyvumą COX-2 ekspresuojančiai BxPC-3 ir COX-2 neekspresuojančiai MIA PaCa-2 ląstelių linijai.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Įvertinti NVNU priešvėžinį aktyvumą kasos vėžio ląstelių kultūrose. Darbo uždaviniai:

1. Ištirti NVNU poveikį kasos vėžio ląstelių gyvybingumui. 2. Ištirti NVNU aktyvumą kasos vėžio ląstelių 3D modeliuose. 3. Nustatyti NVNU sukeliamą žuties būdą kasos vėžio ląstelėms. 4. Ištirti NVNU poveikį vėžinių ląstelių kamieniškumui.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. NVNU pritaikymas chemoprevencijai ir vėžio terapijai

NVNU priešvėžiniais tyrimais susidomėta jau praeitame amžiuje. ClinicalTrials.gov duomenimis, nuo 1992 iki 2017 m. buvo atlikta 216 klinikinių tyrimų, kuriuose tiriamas NVNU priešvėžinis efektyvumas. Šios vaistų klasės klinikiniai tyrimai suintensyvėjo 2000 m., daugiausiai jų pradėta 2003 m., tačiau nuo 2006 m. tyrimų skaičius gerokai sumažėjo (1 pav.).

1 pav. NVNU priešvėžinių klinikinių tyrimų skaičius pagal metus (pagal ClinicalTrials.gov)

Ankstyvuosiuose klinikiniuose tyrimuose, pradėtuose 1992-1993 m., buvo analizuojama aspirino įtaka polipų susidarymui. Nustatyta, kad pacientams, kurie 3 metus kasdien vartojo 81 mg aspirino, polipų pasireiškimo rizika sumažėja 19 proc., o tiems, kurie vartojo 4 mg – tik 4 proc. [10]. Daugiausiai užregistruota klinikinių tyrimų, kuriuose buvo nagrinėjamas celekoksibo priešvėžinis poveikis (168). Jis yra vienintelis NVNU, kurio adjuvantinę chemoterapiją žmonėms, sergantiems adenomatozine polipoze, 1999 gruodį patvirtino Maisto ir vaistų agentūra [11]. Šis nuosprendis priimtas po to, kai buvo įvertinti randomizuoto, dvigubai aklo, placebu kontroliuojamo klinikinio tyrimo rezultatai, kuriame tirtas celekoksibo poveikis polipų skaičiui žmonėse, sergančių adenomatozine polipoze. Pastebėta, kad pacientams, kurie vartojo 400 mg celekoksibo du kartus per dieną, po šešių mėnesių polipų skaičius sumažėjo 28 proc. [12].

Kaip matyti 2 paveiksle, didžioji dalis tyrimų (155) buvo skirti išsiaiškinti galimą celekoksibo pritaikymą vėžio terapijoje ir tik trylikoje tyrimų buvo analizuojamos galimybės šį vaistą pritaikyti

chemoprevencijai. O acetilsalicilo rūgšties, atvirkščiai, daugiau nei pusė tyrimų skirti aiškintis jo galimą pritaikymą vėžio profilaktikai.

2 pav. Celekoksibo ir acetilsalicilo rūgšties klinikiniai tyrimai pagal terapijos pobūdį (pagal ClinicalTrials.gov)

Kitų koksibų ir salicilatų pritaikymas vėžio terapijoje ar chemoprevencijai taip plačiai nėra nagrinėjamas, kaip celekoksibo ir acetilsalicilo rūgšties. Epidemiologinių tyrimų duomenimis, koksibų grupei priklausantis rofekoksibas mažina krūties ir plaučių, o valdekoksibas – plaučių vėžio riziką [13,14]. ClinicalTrials.gov duomenų bazėje užregistruotas tik vienas klinikinis tyrimas, kuriame buvo analizuojamas parekoksibo priešvėžinis aktyvumas. Tyrimų, kuriuose būtų vertinamas kitų salicilatų priešvėžinis efektyvumas, nėra užregistruota. Iš fenamatų grupės NVNU tik meklofenamo rūgštis yra tiriama viename klinikiniame tyrime, kuriame nagrinėjamas jos poveikis galvos smegenų metastazėms. Klinikiniuose tyrimuose plačiausiai nagrinėjamas NVNU poveikis žarnyno, plaučių ir krūtų vėžiui (3 pav.).

Ne visuose klinikiniuose tyrimuose yra stebimas tik vieno NVNU priešvėžinis aktyvumas. Taip pat yra nagrinėjamas NVNU aktyvumas, juos derinant kartu su priešvėžiniais vaistais. Pastebėta, jog padidėjusi COX-2 raiška yra susijusi su vėžinių ląstelių atsparumu chemoterapijai. Todėl kartu su priešvėžiniais vaistais vartojant NVNU yra padidinamas chemoterapijos efektyvumas [15].

Remiantis ClinicalTrials.gov duomenimis, daugumoje (67 proc.) klinikinių tyrimų yra studijuojamas celekoksibo aktyvumas, jį derinant kartu su priešvėžiniais vaistais. Viename iš tyrimų buvo nustatyta, kad celekoksibas kartu su gemcitabinu sinergistiškai veikia prieš kasos vėžį. 30 proc. šiuo deriniu gydytų pacientų liga stabilizavosi, o jų išgyvenamumas vidutiniškai buvo 9 mėnesiai [8].

3 pav. NVNU priešvėžinių klinikinių tyrimų skaičius pagal vėžio tipą (pagal ClinicalTrials.gov)

Verta paminėti, kad tyrimų, kuriuose studijuojamas NVNU pritaikymas kasos vėžio chemoterapijai ar chemoprevencijai, nėra atlikta daug. Bradley M.C. ir kt. atliko tyrimą, kurio metu buvo tiriamas NVNU poveikis kasos vėžio prevencijai. Į tyrimą buvo įtraukti 9095 žmonės, kurie kasdien vartojo skirtingas NVNU dozes. NVNU prevenciniam poveikiui didesnę įtaką turėjo vaisto vartojimo trukmė nei vartota dozė. Nustatyta, kad NVNU vartojimas 2–5 metus sumažina kasos vėžio riziką 20 proc., o ilgesnis nei 5 metų vartojimas – sumažina riziką net 30 proc. [16]. Priešingai, kitame epidemiologiniame tyrime buvo nustatyta, kad aspirino vartojimas padidina kasos vėžio riziką. Prospektyvinės kohortinės analizės metu buvo tirtos 88 378 moterys. Nustatyta, kad ilgas reguliarus aspirino vartojimas (>2 325 mg per savaitę) yra susijęs su padidėjusia kasos vėžio rizika. Moterims, kurios vartojo aspiriną daugiau nei 20 metų, rizika susirgti kasos vėžiu buvo 58 proc. didesnė, nei toms, kurios reguliariai šio vaisto nevartojo. Taip pat pastebėtas ryšys tarp dozės ir padidėjusios susirgimo rizikos. Kuo didesnė vartojama aspirino dozė, tuo didesnė susirgimo rizika. Pacientės, kurios reguliariai vartojo 14 ar daugiau tablečių per savaitę, rizika susirgti kasos vėžiu buvo 86 proc. didesnė [17].

Atlikti klinikiniai tyrimai parodo, kad celekoksibas ir acetilsalicilo rūgštis turi priešvėžinį aktyvumą. Daugiausiai tiriamas celekoksibo pritaikymas vėžio gydymui, o acetilsalicilo rūgšties – chemoprevencijai. Klinikinių tyrimų su fenamatais, kitais koksibais ir salicilatais atlikta nedaug. Taip pat, palyginus su kitų tipų vėžiais, yra mažai epidemiologinių duomenų apie NVNU priešvėžinį poveikį kasos vėžiui.

1.2. NVNU veikimo mechanizmai

Nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo (NVNU) – tai vieni iš labiausiai vartojamų vaistų pasaulyje, jie efektyviai mažina skausmą ir uždegimą. Ši junginių grupė yra heterogeninė, nes junginiai dažniausiai yra chemiškai nesusiję. Jų veikimas pagrįstas prostanoidų, biologiškai aktyvios mediatorių šeimos, sintezės slopinimu. NVNU vartojami gydyti osteoartrito, reumatoidinio artrito, podagros, galvos ir dantų skausmui [18,19]. Naujausiais duomenimis, uždegimas yra kritinis įvairių vėžio ląstelių susidarymo, proliferacijos ir išplitimo veiksnys. Todėl priešuždegiminių vaistų, ypač NVNU, tyrimai susilaukė didelio susidomėjimo [20].

Prostanoidų, tokių kaip prostaglandinų ir tromboksanų, biosintezė vyksta trimis etapais [21] (4 pav.). Pirmiausiai, riebalų rūgščių substratas, arachidono rūgštis, veikiant fosfolipazei A2, yra mobilizuojamas iš membranose esančių fosfolipidų. Tada COX paverčia arachidono rūgštį į prostaglandiną G2 (PGG2), kuris redukuojamas į nestabilų tarpinį endoperoksidą – prostaglandiną H2 (PGH2) Specifinės PG sintazės metabolizuoja PGH2 į penkis prostanoidus: PGE2, PGD2, PGF2α, PGI2 ir tromboksaną A2 (TxA2). Jie daro įtaką ląstelių angiogenezei, apoptozei, proliferacijai ir migracijai [21–24].

COX-1 yra nuolat ekspresuojamos daugelyje audinių, fiziologinėje ir patologinėje būklėse. Prostaglandinai, kurių gamybą reguliuoja COX-1, apsaugo skrandžio gleivinės ląsteles, reguliuoja inkstų kraujotaką ir trombocitų agregaciją [21,25]. COX-2 nėra aptinkamas daugumoje ląstelių ir audinių, tačiau jo ekspresija yra skatinama tokių dirgiklių, kaip prouždegiminių citokinų (IL- 1b, TNFα), lipopolisacharidų, mitogenų ir onkogenų (forbolio esterių), augimo faktorių (fibroblastų augimo faktoriaus, trombocitų kilmės augimo faktoriaus; epidermio augimo faktoriaus), hormonų (liuteinizuojančio hormono) ir vandens-elektrolitų hemostazės sutrikimų [21,24]. Taip pat PGE2, kurių gamybą reguliuoja COX-2, yra prouždegiminiai bioaktyvūs lipidai. Jie yra randami daugumoje vėžių, tokių kaip gaubtinės žarnos, skrandžio ir krūties [24]. Dėl to padidėjusi COX-2 ekspresija yra susijusi su vėžio vystymusi: ji skatina ląstelių dalijimąsi, slopina apoptozę, didina ląstelių adheziją ir pagerina metastazę. NVNU, slopindami COX-2, mažina šiuos ląstelių popkyčius ir taip lėtina vėžio vystymąsi [22].

COX slopiklių priešvėžinis aktyvumas gali pasireikšti ir per kitus, su COX nesusijusius, veikimo mechanizmus [22]. Vartojant dideles NVNU dozes, gali būti veikiami ir kiti, su COX nesusiję, ląstelėje vykstantys procesai [23,24]. Vienas iš šių procesų – ląstelių proliferacijos slopinimas. Perėjimai tarp skirtingų ląstelės ciklo fazių yra kontroliuojami įvairių ciklinų, nuo ciklinų priklausančių kinazių (CDK) ir CDK slopiklių. Sumažėjus ciklinų A, B ir D ir padidėjus ląstelių ciklo slopiklių p21WAF1

ir p27KIP1 ekspresijai, sustabdoma ląstelių ciklo G1 fazė (5 pav.). Vienas iš taikinių, kuris gali turėti įtakos šiam procesui, yra baltymų kinazė B (PKB/Akt) arba nuo fosfoinozitido priklausoma kinazė (PDK-1). Ląstelių cikle PKB yra kaip tarpininkas, nes jis fosforilina ir blokuoja CDK slopiklius p21WAF1 ir p27KIP1. Dėl to yra aktyvuojami ciklinų-CDK kompleksai ir įvyksta DNR replikacija ir proliferacija. Todėl slopinant PDK-1/Akt signalinį kelią, galima užblokuoti ir ląstelės ciklą [11,22,26].

5 pav. NVNU priešvėžinis veikimo mechanizmas per PDK-1/Akt signalinio kelio blokavimą [22]

Kitas svarbus procesas, lemiantis ląstelių žūtį, yra apoptozė. Tai užprogramuota ląstelės mirtis, kuri gali būti sukelta per ląstelės išorėje vykstančius metabolinius kelius, aktyvuojant mirties receptorius, arba per vidinius kelius, išlaisvinant citochromą c iš mitochondrijų [22]. Vienas iš NVNU molekulinių taikinių yra ciklinio guanozino monofosfato (cGMP) fosfodiesterazės (PDE) (6 pav.).

PDE yra didelė fermentų šeima, jos katalizuoja cAMP ir cGMP hidrolizę į biologiškai neaktyvius 5‘-nukleozidų monofosfatus. Slopinant tam tikrus cGMP redukuojančius izofermentus, yra padidinamas cGMP kiekis. Dėl to yra aktyvuojamas PKB, kuris stimuliuoja signalinius kelius, sukeliančius ląstelių apoptozę ir slopinančius proliferaciją ir angiogenezę [11,22,26,27].

6 pav. NVNU priešvėžinis veikimo mechanizmas per cGMP PDE slopinimą [11]

Apoptozė gali būti sukeliama ir per peroksisomos proliferacijos aktyvintus receptorius (PPAR). Jie reguliuoja ne tik apoptozę, bet ir ląstelių diferenciaciją ir proliferaciją. Yra trys šių receptorių izoformos – PPARα, γ ir δ. PPARα ir γ sumažėjimas siejamas su kai kurių vėžio formų karcinogeneze [25,28]. Tačiau padidėjusi PPARδ ekspresija yra siejama su ląstelių apoptozės slopinimu. Dėl to blokuojant PPARδ ekspresiją yra indukuojama apoptozė [11,24,28].

NVNU gali sukelti ląstelių apoptozę, slopindami ir branduolinio transkripcijos faktoriaus kappa B (NF-κB) signalinį kelią [22,29]. NF-κB neaktyvus, kuomet yra komplekse su baltymu IκB (7 pav.). Tačiau baltymo IκB kinazei β (IKKβ) fosforilinant IκB, NF-κB yra išlaisvinamas. Tada jis patenka į ląstelės branduolį ir jungiasi prie DNR, aktyvuodamas mRNR transkripciją, susijusią su apoptozės slopikliais, taip slopindamas apoptozę [11,29,30].

7 pav. NVNU priešvėžinis veikimo mechanizmas per NF-κB signalinio kelio slopinimą. Adaptuota pagal

[30]

Be proliferacijos ir apoptozės, kiti svarbūs procesai yra migracija, invazija ir angiogenezė. Šie procesai taip pat gali būti slopinami per COX-2 arba per kitus, nuo šio fermento nepriklausomus, veikimo mechanizmus. Nustatyta, kad esant labai didelei COX-2 ekspresijai vėžio ląstelėse, kurios supa stromą, yra aktyvuojamas kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF), kuris skatina naviko angiogenezę ir ląstelių migraciją [11,22]. Šio faktoriaus ekspresiją taip pat gali sukelti transkripcijos faktoriaus Sp1 nuolatinis aktyvavimas PANC-1 kasos vėžio ląstelėse [31].

Angiogenezę, migraciją ir invazyvumą gali paskatinti ir padidėjusi matrikso metaloproteinazės 2 (MMP 2) ekspresija. MMP 2 yra pagrindinis fermentas, dalyvaujantis IV tipo kolageno membranos suardyme. Šio proceso pasekoje vėžinės ląstelės lengviau įsiveržia į šalia esančius audinius ir metastazuoja [11,32]. NVNU, slopindami COX-2, faktoriaus Sp1 aktyvavimą ir mažindami MMP 2 kiekius, slopina ląstelių angiogenezę, invaziškumą ir migraciją.

Vertinti NVNU priešvėžinį aktyvumą vien tik pagal jų gebėjimą slopinti COX vėžinėse ląstelėse yra netikslu, kadangi NVNU pasižymi tuo, kad jų priešvėžinis aktyvumas gali pasireikšti veikiant ir kitus procesus.

1.3. NVNU poveikis vėžinių ląstelių kultūrose

NVNU priešvėžinis aktyvumas in vitro nustatytas daugelyje tyrimų (1 lentelė). Šie vaistai gali slopinti įvairių tipų vėžio ląstelių proliferaciją, migraciją, augimą, gali sukelti apoptozę, o jų poveikis

yra priklausomas nuo koncentracijos. Ląsteles veikiant didelėmis NVNU koncentracijomis, priešvėžinis poveikis gali pasireikšti ne tik per COX slopinimą, bet ir per kitus, ląstelėse vykstančius, procesus [23].

1 lentelė. NVNU priešvėžinis aktyvumas in vitro

Vėžio tipas Nesteroidinis vaistas nuo uždegimo Literatūros šaltinis Gaubtinės žarnos vėžys Acetilsalicilo rūgštis, celekoksibas, meklofenamo

rūgštis, parekoksibas, salicilo rūgštis

[34,35,37,44,50]

Prostatos vėžys Acetilsalicilo rūgštis, celekoksibas, mefenamo rūgštis, meklofenamo rūgštis

[20,38,53]

Krūties vėžys Acetilsalicilo rūgštis, celekoksibas, niflumo rūgštis [39,47,50,52] Kepenų vėžys Acetilsalicilo rūgštis, mefenamo rūgštis [42,54] Plaučių vėžys Acetilsalicilo rūgštis, celekoksibas, mefenamo rūgštis,

meklofenamo rūgštis, niflumo rūgštis

[40,45,46,48,50]

Gimdos kaklelio vėžys Mefenamo rūgštis, meklofenamo rūgštis [41]

Eritroleukemija Niflumo rūgštis [43]

Nosiaryklės karcinoma Niflumo rūgštis [49]

Šlapimo pūslės vėžys Mefenamo rūgštis, meklofenamo rūgštis [45,46] Kasos vėžys Acetilsalicilo rūgštis, celekoksibas. [55–60]

Koksibams priklausantys celekoksibas ir parekoksibas yra selektyvūs COX- 2 slopikliai (8 pav.). Jie efektyviai slopiną skausmą ir uždegimą. Celekoksibas turi priešvėžinį aktyvumą prieš daugelį vėžinių ląstelių [33], ypač – prieš gaubtinės žarnos vėžio ląsteles [34]. Parekoksibas yra aktyvesnis nei celekoksibas, tačiau jis yra naujesnis, jo veikimo mechanizmas yra ne visai suprantamas, ir kol kas nėra atlikta pakankamai jo tyrimų vėžinių ląstelių kultūrose. Daugiausia parekoksibas vartojamas vėžio sukelto skausmo malšinimui [35,36].

8 pav. Koksibų struktūrinės formulės

Nustatyta, kad COX-2 raiška labai padidėja žmogaus gaubtinės žarnos ląstelėse, formuojantis vėžiui, taip pat po radioterapijos ir chemoterapijos. Parekoksibas ir celekoksibas, sumažindami COX-2 raišką gaubtinės žarnos HT29 ląstelių linijoje, slopina ląstelių gyvybingumą [35,37].

Taip pat nustatyta, kad celekoksibas slopina prostatos vėžio DU145 sferoidų augimą, tačiau pasižymi silpnu aktyvumu monosluoksnyje. Celekoksibo priešvėžinis aktyvumas sferoiduose pasireiškia per PGE2gamybos slopinimą. Tačiau, kitaip nei DU145 3D ląstelių kultūroje, 2D kultūroje nepasireiškia COX-2 raiška, dėl to nėra gaminami PGE2, ir vėžio ląstelių augimas nėra slopinamas [38]. Krūties vėžio MDA-MB-231 ląstelių gyvybingumą ir augimą slopinantis celekoksibo mechanizmas yra nesusijęs su COX-2 slopinimu. Jo priešvėžinis poveikis pasireiškia per urokinazės tipo plazminogeno aktyvatoriaus gamybos slopinimą, kadangi šis fermentas skatina ląstelių augimą ir migraciją [39]. Taip pat celekoksibas slopina plaučių vėžio H358, A549, H1792 ir H460 ląstelių linijų gyvybingumą (EC50 visose linijose yra apie 30 µM) ir sukelia apoptozę per mirties receptorių raiškos didinimą [40].

Meklofenamo, niflumo ir mefenamo rūgštys priklauso fenamato dariniams (9pav.). Mefenamo ir niflumo rūgštys yra selektyvūs COX-2 slopikliai, pasižymintys stipriomis antiproliferacinėmis savybėmis. Meklofenamo rūgšties priešvėžinis veikimo mechanizmas yra siejamas su aldo-keto reduktazių slopinimu, kurios reguliuoja androgeno, estrogeno ir progesterono koncentracijas ir katalizuoja ketosteroidų redukciją [20,41–43]

9 pav. Fenamato darinių struktūrinės formulės

Nors fenamatų cheminė struktūra tarpusavyje panaši, jų aktyvumas įvairiose vėžio ląstelių linijose yra skirtingas. Mokslininkų nustatyta, kad meklofenamo rūgštis slopina gaubtinės žarnos vėžio SW480 ląstelių linijos gyvybingumą ir sukelia apoptozę. Šiam priešvėžiniam poveikiui pasiekti reikia didelės vaisto koncentracijos (EC50 = 163 µM), kuri blokuoja cGMP PDE, ir todėl aktyvuoja PKG, slopina ląstelių proliferaciją ir sukelia apoptozę [44]. Mefenamo rūgšties priešvėžinis poveikis gali pasireikšti taip pat per kitus, nei COX-2 slopinimo, mechanizmus. Skatindamas kaspazės-3 veiklą, šis vaistinis junginys slopina kepenų vėžio Chang ir Huh-7 ląstelių linijų proliferaciją, sukelia jų apoptozę, tačiau tam reikia didelių (100 µM) mefenamo rūgšties koncentracijų. [42].

Lyginant meklofenamo ir mefenamo rūgščių priešvėžinį aktyvumą pastebėta, kad meklofenamo rūgštis dažnai pasižymi stipresniu priešvėžiniu poveikiu in vitro. Mokslininkai nustatė, kad 100 µM meklofenamo rūgštis slopina gimdos kaklelio VIPA, INBL, SiHa ir HeLa ląstelių gyvybingumą Mefenamo rūgštis turėjo antiproliferacinį aktyvumo tik SiHa ir HeLa ląstelių linijoms [41]. Taip pat nustatyta, kad mefenamo rūgštis slopina prostatos vėžio PC3 ir LNCaP ląstelių gyvybingumą 3,5–5 kartus silpniau nei meklofenamo rūgštis [20]. Beje, šie vaistiniai junginiai pasižymi panašiu aktyvumu šlapimo pūslės T-24 ir plaučių A549 vėžio ląstelių linijose: meklofenamo rūgštis tik 1,1–1,3 karto stipriau mažino šių ląstelių gyvybingumą, nei mefenamo rūgštis [45,46].

Niflumo rūgštis slopina krūties vėžio Hs578T ir MDA-231 ląstelių, kuriose pasireiškia COX-2 raiška, proliferaciją, tačiau neturi poveikio šio fermento neekspresuojančių MCF-7 ląstelių augimui [47]. Taip pat pastebėta, kad ir niflumo rūgšties priešvėžinis poveikis dažnai pasireiškia per kitus veikimo mechanizmus. Niflumo rūgštis didelėmis koncentracijomis (100–500 µM) blokuoja Cl- ir K+ kanalus, kurie yra aktyvuojami Ca2+, ir sukelia eritroleukemijos K532 ląstelių apoptozę [43]. Šio vaistinio junginio priešvėžinis aktyvumas plaučių vėžio A549, H460 ir H1299 ląstelių linijose taip pat

nepriklauso nuo COX-2 slopinimo. Niflumo rūgštis didelėmis koncentracijomis (100–300 µM) aktyvina kaspazės-3 veiklą, sukeldama ląstelių apoptozę, mažina jų gyvybingumą [48]. Nosiaryklės vėžio CNE-2Z ląstelių linijoje niflumo rūgšties priešvėžinis poveikis pasireiškia per kinazių ERK raiškos slopinimą. Vaistinis junginys mažina šių ląstelių gyvybingumą (EC50 = 83,7 µM), migraciją, invazyvumą, kamieniškumą, o didelėmis koncentracijomis (100–200 µM) – sukelia ląstelių apoptozę [49].

Salicilo ir acetilsalicilo rūgštys priskiriamos salicilatų grupei (10 pav.) ir yra yra neselektyvūs COX slopikliai. Šie junginiai tarpusavyje skiriasi tik acetilo grupe, dėl kurios yra slopinamas COX per serino liekaną. Abiejuose junginiuose esanti salicilato grupė nulemia priešuždegimines savybes dėl NF-κB slopinimo. Ilgalaikis jų vartojimas gali sumažinti gaubtinės žarnos, krūties, prostatos, plaučių ir odos vėžio rizikas [50,51].

10 pav. Salicilatų struktūrinės formulės

Nustatyta, kad 0,25–2,5 mM acetilsalicilo ir salicilo rūgščių koncentracijos slopina gaubtinės žarnos vėžio ląstelių HCT-116 augimo greitį, nekeisdamos jų gyvybingumo. Taip pat sumažina C-Myc baltymo kiekį gaubtinės žarnos SW480, HCT-116 ir plaučių karcinomos NCI-H226 ląstelių linijose. C-Myc yra transkripcijos veiksnys, kuris kontroliuoja beveik 15 proc. genų, susijusių su ląstelių proliferacija, metabolizmu, apoptoze, diferenciacija ir augimu, raišką. Daugumoje vėžinių ląstelių šio tranksripcijos veiksnio raiška yra pernelyg padidėjusi [50]. Nustatyta, kad 5 mM koncentracijos acetilsalicilo rūgštis sukelia krūties vėžio MCF-7 ląstelių apoptozę, mažindama antiapoptotinio baltymo Bcl-2 kiekį. Vaistas mažina didele Bcl-2 raiška pasižyminčių MCF-7 ląstelių gyvybingumą 60 proc., o MDA-MB231, kuriose šio baltymo raiška yra nedidelė – tik 20 proc. [52]. Nustatyta, kad 1 mM acetilsalicilo rūgšties slopina prostatos vėžio PC3 ląstelių kolonijų formavimąsi 36 proc., lyginant su kontroline grupe [53]. O tiriant acetilsalicilo rūgšties poveikį prostatos vėžio DU145 ir kepenų vėžio HepG2 ląstelių linijų sferoidų augimui, pastebėta, kad 1 mM koncentracijos vaistinis junginys slopina prostatos vėžio DU145 sferoidų augimą, tačiau neturi reikšmingo poveikio kepenų vėžio HepG2 sferoidų augimui, kaip ir šių ląstelių monosluoksniui [38,54].

NVNU priešvėžinio aktyvumo kasos vėžio ląstelėms tyrimų nėra daug atlikta. Nustatyta, kad celekoksibas ir acetilsalicilo rūgštis mažina kasos vėžio BxPC-3, MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių gyvybingumą [55–58]. Taip pat ištirta, kad šie junginiai sukelia BxPC-3 ir PANC-1 ląstelių apoptozę [57,59]. Tačiau, skirtingai nei acetilsalicilo rūgštis, celekoksibas nesukelia MIA PaCa-2 ląstelių apoptozės [58,59]. Nustatyta, kad acetilsalicilo rūgštis mažina BxPC-3 ir PANC-1 ląstelių migraciją ir reikšmingai slopina AsPC-1, BxPC-3 ir PANC-1 ląstelių kamieniškumą [57,60].

Aptarti tyrimai in vitro sąlygomis rodo, kad NVNU turi priešvėžinį aktyvumą. Daugelyje tyrimų buvo nustatytas tirtų NVNU poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui, proliferacijai, apoptozei, migracijai ir kamieniškumui 2D ląstelių kultūrose. Tik keletas vaistinių junginių tirti kasos ląstelių kultūrose, ypač mažai tyrimų atlikta vėžio sferoiduose. Todėl buvo nutarta detaliau ištirti ir palyginti pasirinktų trijų NVNU klasių (fenamatų, koksibų ir salicilatų) atstovų aktyvumą kasos vėžio 2D ir 3D ląstelių kultūrose.

1.4. Kasos vėžio ląstelių savybių apžvalga

Kasos vėžys – tai gana agresyvi liga, kuri vystosi nepasireiškiant beveik jokiems simptomams ir dažniausiai yra diagnozuojama esant tik vėlyvosioms jos stadijoms. Tai vienas iš labiausiai vaistams atsparių vėžių [61].

Kasos vėžio ląstelės pasireiškia skirtingais fenotipais ir genotipais, kurie nulemia skirtingas ląstelių savybes, tokias kaip adhezija, migracija, invazyvumas ir angiogenezinis potencialas. Vėžio ląstelių augimui ir metastazei yra labai svarbi jų adhezija. Įvairių ląstelių linijų adhezija skirtingiems ekstraląsteliniams matrikso baltymams yra nevienoda. Pavyzdžiui, BxPC-3 geriau prisiriša prie kolageno I nei MIA PaCa-2, o prie fibrinocetino – vienodai. Kitos svarbios ląstelių savybės vėžio išplitimui – migracija ir invazyvumas. Panc-1 ląstelės pasižymi geresniu judrumu ir migracija, nei BxPC-3. Jos migruoja kaip atskiros ląstelės, o BxPC-3 – kaip tvirtai sukibęs sluoksnis. Tyrimai parodė, kad BxPC-3 ląstelių linija yra agresyvesnė, in vivo formuoja didesnius navikus, nei PANC-1 ir MIA PaCa-2 ląstelių linijos [62].

Ne visos kasos vėžio ląstelių linijos pasireiškia COX raiška, kadangi kai kuriose linijose yra epigenetinių COX-1 ir COX-2 nutildymo atvejų. Buvo nustatyta, kad COX-1 ekspresija nepasireiškia daugumoje kasos vėžio ląstelių linijų: MIA PaCa-2, AsPC1, panc215, A32-1, A38-5, HPDE ir panc3.5. COX-2 ekspresija nepasireiškia MIA PaCa-2, AsPC1, Panc-, HPNE, HPDE, A38-5 ir panc2.5. Tik nedaug kasos vėžio ląstelių linijų ekspresuoja ir COX-1, ir COX-2 (BxPC-3, Capan-1, Capan-2, CAF-19) [9,63]. Buvo ištirta, kad kasos vėžio ląstelės, kuriuose nėra ekspresuojami COX fermentai, gali naudoti stromos fibroblastus kaip prostaglandinų šaltinį [9].

Tyrimuose buvo pasirinktos kasos vėžio BxPC-3 ir MIA PaCa-2 ląstelių linijos, kurios skiriasi COX-2 raiška. Nutarėme įvertinti, ar NVNU priešvėžinis aktyvumas yra susijęs su tiesioginiu šių junginių mechanizmu (COX-2 slopinimu), ar ir su netiesioginiais.

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – septyni nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo.

Salicilatai: acetilsalicilo (Sigma–Aldrich, ≥ 99 proc.) ir salicilo rūgštys (Sigma–Aldrich, ≥ 99 proc.). Fenamatai: niflumo (Sigma–Aldrich, > 99 proc.), mefenamo (Sigma–Aldrich, ≥ 98 proc.) ir meklofenamo rūgštys (Sigma–Aldrich, ≥ 93 proc.).

Koksibai: celekoksibas (Cayman Chemical Company, ≥ 98 proc.) ir parekoksibas (Fluka Analytical, > 99 proc.).

2.2. Reagentai, priemonės ir aparatūra

Ląstelių linijos:

Žmogaus kasos vėžio ląstelių linijos BxPC-3 ir MIA PaCa-2, Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl.

American Type Culture Collection, ATCC)

Žalia fluorescencine žyme (GFP) pažymėtų žmogaus fibroblastų HF-GFP linija gauta iš FTMC Nanoinžinerijos skyriaus vedėjo Dr. Ramūno Valioko. Ši linija buvo pirkta iš ATCC.

Reagentai:

1 proc. antibiotikų tirpalas (10000 vienetų/ml penicilino ir 10 mg/ml streptomicino, Gibco) 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) (≥ 97 proc., Sigma-Aldrich) Dimetilsulfoksidas (DMSO) (≥ 99 proc., Sigma-Aldrich)

Dulbecc‘o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (DMEM Glutamax) (Gibco)

Etanolis 96 proc. (Stumbras)

Fetalinis veršiukų serumas (FBS) (Gibco) Fosfatinis druskų tirpalas (PBS), pH 7,4 (Gibco)

Hoechst 33342 (10 mg/ml vandeninis tirpalas) (Thermo Fisher Scientific) Kristalinis violetinis (≥ 90 proc., Sigma-Aldrich)

Ląstelių mitybinė terpė 106 su priedu Low Serum Growth Supplement (LSGS) (Gibco) Nanodalelės Nanoshuttle (Nano3D Biosciences)

Paraformaldehido 16 proc. vandeninis tirpalas (Thermo Scientific)

Propidžio jodidas (1 mg/ml vandeninis tirpalas) (Thermo Fisher Scientific) Tripsino tirpalas TrypLE Express (Gibco)

Aparatūra

Mikroplokštelių spektrofotometras Multiskan go (Thermo Scientific) Fluorescencinis mikroskopas IX73 (Olympus)

Centrifūga 5702 R (Eppendorf)

G:Box Chemi XRQ gelių vaizdavimo sistema (Syngene International Ltd) Neubauer kamera Blaubrand (Sigma–Aldrich)

2.3. Tyrimų metodikos

2.3.1. Poveikio vėžinių ląstelių gyvybingumui nustatymas

NVNU poveikis žmogaus vėžio ląstelių gyvybingumui nustatytas naudojant MTT testą. Žmogaus kasos vėžio ląstelių linijos BxPC-3 ir MIA PaCa-2 auginamos DMEM Glutamax mitybinėje terpėje, papildytoje 1 proc. antibiotikų mišinio ir 10 proc. FBS 10 cm skersmens lėkštelėse. Ląstelių kultūros inkubuojamos 37 ˚C temperatūroje 5 proc. CO2 aplinkoje. Ląstelės auginamos iki tol, kol jų monosluoksnis padengia 70–80 proc. lėkštelės dugno paviršiaus ploto.

Nuo lėkštelėje esančių ląstelių nusiurbiama terpė, praplaunama PBS, įpilama 1 ml tripsino tirpalo, inkubuojama 5–10 min. 37 ˚C temperatūroje. Tuomet į lėkštelę įpilama 7–9 ml mitybinės terpės, ląstelės suspenduojamos ir perkeliamos į 15 ml centrifūginį mėgintuvėlį. Centrifūguojama 4 min. 1000 aps./min greičiu. Nupilamas supernatantas, ląstelės suspenduojamos 2–5 ml šviežios mitybinės terpės, suskaičiuojamas jų skaičius Neubauer kameros pagalba.

Ląstelių suspensija praskiedžiama mitybine terpe taip, kad 100 μl suspensijos būtų 5000 ląstelių. Į 96 šulinėlių plokštelės kiekvieną šulinėlį pilama po 100 μl suspensijos, inkubuojama 24 val. 37 ˚C temperatūroje, 5 proc. CO2 aplinkoje.

Tiriamieji junginiai tirpinami DMSO ir skiedžiami mitybine terpe, gaminant serijinius dvigubus skiedimus nuo 500 μM iki 3,13 μM. Kaip neigiama kontrolė naudojama mitybinė terpė su 0,5 proc. DMSO, o kaip teigiama kontrolė – mitybinė terpė su 50 proc. DMSO. Ląstelės su junginiais yra inkubuojamos 37 ˚C temperatūroje, 5 proc. CO2 aplinkoje. Praėjus 24 val., 48 val. ir 72 val. į kiekvieną šulinėlį įpilama po 20 μl MTT reagento (5 mg/ml koncentracijos) ir inkubuojama 4 val. Tada skystis nupilamas, o susidarę kristalai tirpinami 100 μl DMSO. Spektrofotometriškai matuojamas optinis tankis 570 nm ir 630 nm bangos ilgiuose. Poveikis ląstelių gyvybingumui įvertintas, apskaičiuojant efektyviąją koncentraciją (EC50), kuri sumažino 50 proc. ląstelių metabolinį aktyvumą.

2.3.2. Poveikio vėžio ląstelių sferoiduose tyrimas

Vėžio ląstelių sferoidai formuojami 3D Bioprinting metodu iš BxPC-3 ir MIA PaCa-2 ląstelių ir fibroblastų HF-GFP. Fibroblastai padeda kasos vėžio ląstelėms suformuoti ir išlaikyti sferoidinę struktūrą (BxPC-3 ląstelių sferoidai greitai irsta, o MIA PaCa-2 sferoidai be fibroblastų nesusiformuoja). Fibroblastai HF-GFP yra auginami 106 mitybinėje terpėje su LSGS, 37 ˚C temperatūroje, 5 proc. CO2 turinčioje aplinkoje.

Kasos vėžio ląstelės ir fibroblastai 9–10 val. inkubuojami 6 šulinėlių plokštelėje su 10 μl nano-dalelių „Nanoshuttle“ 37 ˚C temperatūroje, 5 proc.CO2 atmosferoje. Tuomet paruošiamos ląstelių suspensijos mitybinėje terpėje ir išpilstomos į labai mažo prilipimo 96 šulinėlių plokšteles taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 2000 kasos vėžio ląstelių ir 2000 fibroblastų. Plokštelė uždedama ant specialios magnetinės plokštelės ir inkubuojama 37 ˚C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje. Po 48 val., susiformavus sferoidams, į šulinėlius pilami mitybinėje terpėje paruošti 5 μM ir 20 μM NVNU tirpalai. Kaip neigiama kontrolė naudojama mitybinė terpė su 0,5 proc. DMSO .

Sferoidai fotografuojami fazių kontrastiniu mikroskopu panaudojant 4× didinimo objektyvą kas 2 dienas. Sferoidų terpė su junginiais keičiama kas 4 dienas, kaip mitybinė terpė naudojamas DMEM Glutamax ir 106 terpės su LSGS mišinys (1:1). Junginių poveikis sferoidams vertinamas pagal sferoidų dydžio pokytį, apskaičiuojant jų skersmens kitimą ImageJ programa.

2.3.3. Ląstelių žūties būdo nustatymas

Ląstelių žūties būdas nustatomas panaudojant dažymą Hoechst 33342 ir propidžio jodidu. Ląstelių suspensijos paruošiamos 2.3.1 skirsnyje aprašytu būdu. Į 24 šulinėlių plokšteles ląstelės sėjamos po 500 μl taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 15000 ląstelių. Ląstelės inkubuojamos 24 val 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje. Po 24 val. terpė nusiurbiama ir į kiekvieną šulinėlį įpilama po 500 μl paruoštų junginių tirpalų šviežioje terpėje. Naudojamos NVNU koncentracijos, atitinkančios paskaičiuotos kiekvieno junginio 90 proc., 50 proc. ir 10 proc. EC50 vertės. Po 72 val. inkubavimo 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje, terpė nusiurbiama, praplaunama PBS ir įpilama po 500 μl šviežios terpės. Į kiekvieną šulinėlį įpilama po 3 μl fluorescencinio dažo Hoechst 33342 (1 mg/ml koncentracijos) ir 1 μl propidžio jodido (1 mg/ml koncentracijos). Ląstelės su dažais inkubuojamos 10 min.

Ląstelės fotografuojamos fluorescenciniu mikroskopu naudojant 20× didinimo objektyvą. Daromos 5 nuotraukos kiekvieno šulinėlio skirtinguose regionuose. Rankiniu būdu apskaičiuojamas apoptotinių ir nekrotinių ląstelių procentinis kiekis nuo bendro ląstelių skaičio. Nekrotinių ląstelių

branduoliai 750 nm bangos ilgyje fluorescuoja raudonai, o apoptotinių ląstelių branduoliai 450 nm bangos ilgyje švyti šviesiai mėlyna spalva, yra fragmentuoti ir kondensuoti.

2.3.4. Poveikio vėžio ląstelių kolonijų formavimuisi nustatymas

Kasos vėžio ląstelių BxPC-3 ir MIA PaCa-2 suspensijos paruošiamos 2.3.1 skirsnyje aprašytu būdu. Jos praskiedžiamos taip, kad 1 ml mitybinės terpės būtų po 100 ląstelių. Ląstelių suspensijos išpilstomos po 1 ml į 12 šulinėlių plokštelę. Tuomet supilami junginiai ir plokštelės su ląstelėmis inkubuojamos 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje. Naudojamos junginių koncentracijos, atitinkančios kiekvieno junginio 100 proc. ir 10 proc. EC50 vertės.BxPC-3 ląstelės inkubuojamos 12 dienų, MIA PaCa-2 – 14 dienų. Po inkubacijos terpė nuo ląstelių nusiurbiama, praplaunama PBS du kartus. Ląstelės fiksuojamos 4 proc. paraformaldehido (PFA) tirpale 10–15 min., praplaunama PBS du kartus. Ląstelės dažomos su 0,1 proc. kristalinio violetinio vandeniniu tirpalu 5–10 min., plaunamos dejonizuotu vandeniu 2-3 kartus.

Susidariusios kolonijos fotografuojamos G:Box (Syngene International Ltd) įranga, naudojant Genesys programą. Junginių poveikis ląstelių kamieniškumui įvertinamas analizuojant kiekviename šulinėlyje esančių kolonijų skaičių ir plotą procentinėmis dalimis GeneTools programa.

2.3.5. Statistinis duomenų apdorojimas

Duomenys apdoroti „MS Excel 2007“ paketu, įvertinant trijų nepriklausomų eksperimentinių matavimų vidurkius ir santykinius standartinius nuokrypius. Vidurkių palyginimui buvo naudojamas Stjudent‘o t testas, o skirtumai laikomi statistiškai patikimi, kai reikšmingumo lygmuo p < 0,05.

Koreliacija tarp tyrimų rezultatų 2D ir 3D ląstelių kultūrose buvo įvertinta apskaičiavus Pearson‘o koreliacijos koeficientą r, įvertinus ryšio stiprumą ir patikrinus koreliacijos koeficiento patikimumą. Koreliacija laikoma stipria, kai koreliacijos koeficientas yra nuo 0,7 iki 1 (arba nuo -1 iki -0,7), vidutinė, kai koreliacijos koeficientas yra nuo 0,5 iki 0,7 (arba nuo -0,7 iki -0,5), silpna, kuomet r yra nuo 0,2 ir 0,5 (arba nuo -0,5 iki -0,2).

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. NVNU poveikis kasos vėžio ląstelių gyvybingumui

NVNU turėjo skirtingą poveikį ląstelių gyvybingumui (11 pav.). Iš septynių junginių tik du (acetilsalicilo ir salicilo rūgštys) neveikė nei vienos tirtos kasos vėžio ląstelių linijos gyvybingumo. Ou Y. ir kt. nustatė, kad acetilsalicilo rūgštis slopina PANC-1 kasos vėžio ląstelių gyvybingumą tik didelėmis koncentracijomis (2–4 mM) [64]. Šiame tyrime buvo naudojamos daug mažesnės (15,63– 500 µM) acetilsalicilo ir salicilo rūgščių koncentracijos, ir tai galėtų paaiškinti, kodėl nebuvo nustatytas antiproliferacinis salicilatų aktyvumas.

11 pav. NVNU EC50 reikšmės MIA PaCa-2 ir BxPC-3 ląstelėms (* p < 0,05)

Junginiai didžiausią poveikį turėjo BxPC-3 ląstelių gyvybingumui. Tai galėtų būti paaiškinta, remiantis NVNU veikimo mechanizmu (COX slopinimu): MIA PaCa-2 neekspresuoja nei COX-1, nei COX-2 fermentų, o BxPC-3 ekspresuoja abu [9]. Iš visų junginių BxPC-3 ląstelių gyvybingumą aktyviausiai slopino meklofenamo rūgštis (EC50 = 16,0 ± 5,9 µM; p < 0,05). Kiti tirti fenamatų dariniams priklausantys vaistiniai junginiai (mefenamo ir niflumo rūgštys) turėjo mažesnį poveikį ląstelių metaboliniam aktyvumui. Nors struktūriškai fenamatai skiriasi tik pakaitais heterocikluose,

EC50 vertės buvo atitinkamai 6 ir 8 kartus didesnės nei meklofenamo rūgšties (EC50 = 119,8 ± 15,6 µM ir 91,1 ± 3,0 µM). Ši tendencija pastebėta ir Soriano-Hernández A.D. ir kt. atliktame tyrime [20]. Mokslininkai nustatė, kad prostatos vėžio PC3 ir LNCaP ląstelių linijų gyvybingumui sumažinti 50 proc. reikalingos 3,5–5 kartus didesnės mefenamo rūgšties koncentracijos nei meklofenamo rūgšties.

Celekoksibas taip pat pasižymėjo gana dideliu citotoksiniu poveikiu BxPC-3 ląstelėms (EC50 = 23,9 ± 2,8 µM). Tai pačiai koksibų grupei priklausančio parekoksibo EC50 vertė buvo 4 kartus

didesnė (EC50 = 102,0 ± 2,7 µM). Li L.Y. ir kt. ištyrė, parekoksibo poveikį glioblastomos U251 ir U343 ląstelių, kuriose pasireiškia didelė COX-2 ekspresija, gyvybingumui. Mokslininkai nustatė, kad tik didelės parekoksibo dozės (100–200 µM) sumažino šių glioblastomos ląstelių gyvybingumą 50 proc. [65]. Todėl tai galėtų reikšti, kad parekoksibas slopina vėžio ląstelių gyvybingumą tik didelėmis koncentracijomis.

Išskyrus parekoksibą, kiti junginiai mažiau slopino MIA PaCa-2 ląstelių gyvybingumą (niflumo rūgšties p > 0,05, kitų junginių p < 0,05, lyginant junginių aktyvumą tarp BxPC-3 ir MIA PaCa-2 ląstelių linijų). Šių ląstelių gyvybingumą labiausiai slopino meklofenamo rūgštis (EC50 = 43,5 ± 1,8 µM), kuri aktyviausiai slopino ir BxPC-3 ląstelių gyvybingumą. Tai galima paaiškinti tuo, kad meklofenamo rūgšties priešvėžinis poveikis galėjo pasireikšti ne per COX, bet per kitus veikimo mechanizmus. Kitaip nei meklofenamo rūgštis, celekoksibas yra selektyvus COX-2 slopiklis. Celekoksibo IC50 (COX-2) vertė yra 0,04 µM, o meklofenamo rūgšties 0,05 µM. Tačiau meklofenamo rūgštis taip pat aktyviai slopina ir COX-1 (IC50 0,04 µM) [66]. Todėl, kitaip nei meklofenamo rūgšties, celekoksibo priešvėžinis aktyvumas pagrinde pasireiškia per COX-2 slopinimą. Celekoksibo koncentracija, kuri sumažino MIA PaCa-2 ląstelių gyvybingumą 50 proc., buvo 76,1 ± 2,3 µM. Ši koncentracija apie 3 didesnė nei BxPC-3 ląstelių linijoje (p < 0,05). Beje, Chuang H.C. ir kt. atliktuose eksperimentuose COX-2 ekspresija taip pat turėjo reikšmės ląstelių jautrumui celekoksibui. EC50 BxPC-3 ląstelių kultūroje po 48 val. inkubacijos su šiuo junginiu buvo 60 µM, o MIA PaCa-2 – 80 µM [55].

Parekoksibas, kitaip nei visi kiti junginiai, turėjo didesnį aktyvumą prieš MIA PaCa-2 nei BxPC-3 ląstelių liniją (p < 0,05). Jo priešvėžiniai veikimo mechanizmai nėra tiksliai žinomi. Manoma, kad priešvėžinis poveikis pasireiškia ne tik per COX-2 slopinimą, bet ir per NF-κB signalinių kelių slopinimą [65].

Tiriant ląstelių išgyvenamumo priklausomybę nuo inkubacijos laiko su junginiu, nustatyta, kad ilgėjant inkubacijos laikui, ląstelių gyvybingumas mažėja (12 pav.). Vis dėlto, vaistinių junginių

EC50 verčių kitimas 72 val. intervale labai priklauso nuo tirto junginio ir nuo ląstelių linijos. Pvz., BxPC-3 ląsteles inkubuojant su meklofenamo rūgštimi, EC50 vertės kinta labiau (11 pav. A) nei MIA PaCa-2 ląsteles inkubuojant su šiuo vaistiniu junginiu tą patį laiką (11 pav. B) (p < 0,05). O mefenamo rūgšties EC50 vertės atvirksčiai, labiau kito vaistinį junginį inkubuojant su MIA PaCa-2, nei BxPC-3 ląstelėmis.

12 pav. Meklofenamo rūgšties EC50 vertės kitimas po 24, 48 ir 72 val. A – BxPC-3 ląstelių

išgyvenamumas, B – MIA PaCa-2 ląstelių išgyvenumas

NVNU IC50 vertės, reikalingos slopinti 50 proc. COX-1 yra apie 0,04–140 µM, o COX-2 apie 0,04–66 µM [66–68]. Mūsų naudotos koncentracijos buvo 3,13–500 µM, todėl COX galėjo būti slopinamos beveik visais atvejais. Skirtumai tarp EC50 verčių leidžia daryti prielaidą, kad skirtingi NVNU galėtų turėti skirtingą veikimo mechanizmą. Fallahi-Sichani M. ir kt. nustatė, kad vertinant vaistų priešvėžinį poveikį ar ląstelių jautrumą / atsparumą jiems, yra netikslu pasikliauti vien tik EC50 vertėmis. Kiti svarbūs parametrai yra dozės–atsako kreivė, plotas po kreive ir maksmimalus efektas. Šie parametrų vertės varijuoja atsižvelgiant į vaistą ar ląstelių liniją ir tarpusavyje nekoreliuoja. Dėl to siekiant vertinant vaistų priešvėžinį poveikį, reiktų lygintine tik mažinti EC50 vertes, bet ir kitus parametrus [69].

Apibendrinus rezultatus, galima pasakyti, kad fenamatai ir celekoksibas pasižymi didesniu antiproliferaciniu aktyvumu COX-2 ekspresuojančiai BxPC-3 nei COX-2 neekspresuojančiai MIA PaCa-2 ląstelių linijai. Šių vaistinių junginių gyvybingumą slopinančiam poveikiui yra svarbi COX-2 ekspresija ląstelėse.

3.2. Poveikis vėžio ląstelių sferoiduose

Dauguma priešvėžinio aktyvumo eksperimentų yra atliekami vėžinių ląstelių monosluoksnyje. Vis dėlto, ląstelių 2D modeliai pilnai neatspindi vėžio mikroaplinkos. 3D ląstelių modeliuose tiksliau atsiskleidžia biologinės ir fizikocheminės mikroaplinkos funkcijos. Juose yra labiau atkartojamos in vivo vėžinių ląstelių tarpusavio sąveikos, maisto medžiagų ir vaistų paskirstymas naviko stromoje. Šie veiksniai daro labai didelę įtaką ląstelių reakcijai į vaistus [70]. Vaistų poveikis 2D ir 3D ląstelių kultūrose gali skirtis, todėl svarbu įvertinti jų aktyvumą abiejuose modeliuose.

Kasos vėžio ląstelės įprastinėmis sąlygomis nėra linkusios formuoti sferoidinių struktūrų. MIA PaCa-2 ląstelės nepasižymi agregacija, dėl to jų sferoidų formavimui pritaikomos specifinės sąlygos [71]. BxPC-3 suformuoja kompaktiškus sferoidus su aiškiu kontūru, tačiau ląstelės laikui bėgant yra linkusios atsiskirti nuo sferoido, ir jie suyra [70,72]. Todėl siekiant pagerinti ląstelių agregaciją ir 3D kultūrų stabilumą, sferoidai buvo formuojami kartu su fibroblastais. Fibroblastai yra stromoje vyraujančios ląstelės, kurios atsakingos už ekstraląstelinio matrikso sintezę, remodeliavimą ir pašalinimą, taip pat augimo faktorių ir citokinų gamybą [73]. Modeliuojant 3D ląstelių kultūras kartu su fibroblastais, yra tiksliau atkuriama vėžio mikroaplinka.

Kasos vėžio sferoidai buvo inkubuojami su 5 µM ir 20 µM NVNU – tokios tirtų vaistinių junginių koncentracijos yra panašios į fiziologines koncentracijas, aptinkamas kraujo plazmoje. Fenamatų ir koksibų koncetracijos kraujo plazmoje yra apie 1–10 µM [74–78], o salicilatų – 1–5 mM [79]. NVNU šiomis koncentracijomis slopino sferoidų augimą, lyginant su kontrole. BxPC-3 sferoidų augimą labiausiai slopino niflumo rūgštis (13 ir 15 pav.). Po 20 dienų inkubacijos su 20 µM šio junginio sferoidų skersmuo buvo 9 proc. mažesnis nei kontrolinės grupės sferoidų (p < 0,05) (13 pav.). Musrap N. ir kt. nustatė, kad niflumo rūgštis reikšmingai nesumažina gimdos vėžio OV-90, TOV-112D ir ES-2 sferoidų gyvybingumo. Tačiau prieš sferoidų formavimą paveikus vėžio ląsteles niflumo rūgštimi, yra sumažinama ląstelių agregacija ir ląstelės nesuformuoja sferoidų, nes šis junginys slopina chloridų kanalus aktyvuojamus kalcio. [80]. Šiame eksperimente niflumo rūgšties poveikis sferoidų augimams buvo didesnis po ilgesnės inkubacijos (14 dienų) nei eksperimento pradžioje, ir jis taip pat galėtų būti siejamas su ląstelių agregaciją mažinančių poveikiu.

Koksibų grupės junginiai sferoidų augimą veikė priešingai nei kiti. Nors jie labiau slopino BxPC-3 ląstelių gyvybingumą, su 20 µM parekoksibu inkubuotų sferoidų skersmuo per 20 dienų beveik nesiskyrė nuo kontrolės (14 pav.). Sferoidai, inkubuoti su 20 µM celekoksibo 20 dienų, padidėjo, lyginant su kontrole (p < 0,05). Junginių citotoksinis poveikis gali pasireikšti ne tik sferoidų mažėjimu, bet ir ląstelių agregacijos mažinimu ir adhezijos slopinimu, dėl ko jų skersmuo padidėja [80].

14 pav. BxPC-3 sferoidų skersmuo po 20 dienų inkubacijos su junginiais (* p < 0,05, lyginant su kontrole)

15 pav. BxPC-3 sferoido skersmens kitimas, po inkubacijos su 20 µM aktyviausiais junginiais (* p < 0,05, lyginant su kontrole)

2D modelyje niflumo rūgštis pasižymėjo silpnu BxPC-3 ląstelių gyvybingumą slopinančiu aktyvumu. Acetilsalicilo ir salicilo rūgštis neveikė ląstelių gyvybingumo, bet buvo vieni iš aktyvesnių

junginių, slopinančių sferoidų augimą (p < 0,05). Priešingai, meklofenamo rūgštis labiausiai slopino ląstelių gyvybingumą, bet sferoidų augimą veikė silpnai (p > 0,05). Šie skirtumai galėjo atsirasti dėl skirtingų junginių veikimo mechanizmų tarp 2D ir 3D ląstelių modelių.

16 pav. MIA PaCa-2 sferoidai po 11 dienų inkubacijos su 20 µM junginiais

Parekoksibo, mefenamo ir meklofenamo rūgščių poveikis MIA PaCa-2 ląstelių sferoidų augimui buvo panašus, kaip ir BxPC-3 atveju. Niflumo, acetilsalicilo ir salicilo rūgštys aktyviau slopino BxPC-3, nei MIA PaCa-2 sferoidų augimą, o celekoksibas atvirkščiai – labiau veikė MIA PaCa-2 nei BxPC-3 (16 pav.). Po 11 dienų inkubacijos su 20 µM celekoksibo, sferoidų skersmuo buvo 16 proc. mažesnis, nei kontrolinės grupės (p < 0,05) (17 pav.).

17 pav. MIA PaCa-2 sferoido skersmens kitimas, po inkubacijos su 20 µM ir 5 µM koncentracijos celekoksibu (* p < 0,05, lyginant su kontrole)

Niflumo rūgštis, kuri aktyviausiai slopino BxPC-3 sferoidų augimą, beveik neturėjo įtakos MIA PaCa-2 sferoidų augimui (p > 0,05). Su niflumo rūgštimi inkubuotų sferoidų skersmuo po 11 dienų inkubacijos sumažėjo tik 3 proc. (18 pav.). Kitų junginių poveikis buvo dar mažesnis.

18 pav. MIA PaCa-2 sferoido skersmuo po 20 dienų inkubacijos su junginiais (* p < 0,05)

Cui J. ir kt. ištyrė, kad celekoksibo poveikis žmogaus kepenų vėžio Hep G2 sferoidams buvo žymiai mažesnis nei ląstelių monosluoksniui. Celekoksibo EC50 vertė 3D kultūroje buvo 60,6 ± 15,9 µM, tuo tarpu 2D kultūroje – 31,0 ± 12,4 µM [81]. 3D modeliuose yra tiksliau nei 2D sistemose imituojamas ląstelių atsparumas vaistams, kuris pasireiškia solidiniuose navikuose in vivo. Dėl to junginiai dažnai mažiau slopina sferoidų, nei ląstelių, augančių monosluoksnyje, augimą [82]. Junginių skvarba ir pernašos barjerai taip pat yra svarbūs veiksniai efektyvumui. Junginiai sunkiau patenka arba išvis nepatenka į gilesnius sferoidų sluoksnius, jų koncentracija tose zonose gali būti mažesnės. Dėl to gyvybingos vėžinės ląstelės toliau dauginasi, neveikiamos tiriamų junginių, arba veikiamos tik maža jų koncentracija [71,83].

Lyginant junginių aktyvumą 2D ir 3D kultūrose, nustatytas vidutinis koreliacijos ryšys BxPC-3 ląstelių kultūroje r = –0,62 (p > 0,05). Tačiau koreliacija tarp 2D ir BxPC-3D MIA PaCa-2 ląstelių kultūrų nenustayta, r = 0,14 (p > 0,05). Salicilatai buvo aktyvesni 3D ląstelių kultūrose, o fenamatai ir koksibai aktyvesni 2D ląstelių kultūrose. Niflumo rūgštis aktyviausiai slopino BxPC-3 sferoidų augimą, o celekoksibas – MIA PaCa-2.

3.3. Vėžio ląstelių žūties būdo nustatymas

Svarbus junginių priešvėžinio poveikio rodiklis yra ne tik ląstelių išgyvenamumas, bet ir jų žūties būdas. Todėl norint įvertinti priešvėžinį poveikį, reiktų įvertinti ir kokiu būdu ląstelės labiau miršta – apoptozės ar nekrozės.

Apoptozė – tai užprogramuota ląstelės mirtis. Ląstelėse vykstant apoptozei, jose pasireiškia tipiški morfologiniai pokyčiai: plazminės membranos susitraukimas, chromatino kondensacija, branduolio fragmentacija ir apoptotinių kūnelių formavimasis. Nekrozė yra priešingas apoptozei ląstelės žūties būdas. Jai yra būdinga greitas ląstelės brinkimas, kurio pasekoje plyšta plazminė membrana, organelės, ir išsilieja ląstelės turinys. Tokiu atveju yra sukeliamas uždegimas [84]. Ląstelių žūties būdų – apoptozės ir nekrozės – iliustracijos pavyzdys pateiktas 19 pav.

Visi tirti penki NVNU sukėlė ląstelių apoptozę ir nekrozę. Acetilsalicilo ir salicilo rūgštys neveikė kasos vėžio ląstelių gyvybingumo, todėl jų poveikis ląstelių žūties būdui nebuvo nustatomas.

NVNU labiau sukėlė kasos vėžio ląstelių apoptozę nei nekrozę, šis poveikis buvo priklausomas nuo koncentracijos. Tačiau tirti junginiai apoptozę ir nekrozę sukėlė nedideliam ląstelių skaičiui, nes tam reikalingos didelės junginių koncentracijos (koncentracijos turėtų siekti milimolius) [85].

19 pav. BxPC- 3 ir MIA PaCa-2 ląstelės po inkubacijos su meklofenamo rūgštimi (1 – gyvos ląstelės, 2 – apoptotinės ląstelės, 3 ­ nekrotinės ląstelės)

15 µM meklofenamo rūgšties (90 proc. EC50) sukėlė apoptozę didžiausiam skaičiui BxPC-3 ląstelių (7,4 proc.) (20 pav.). Šis vaistinis junginys taip pat aktyviausiai slopino ir ląstelių gyvybingumą. Kiti fenamato dariniai, niflumo ir mefenamo rūgštys, silpniausiai slopino ląstelių

gyvybingumą, tačiau sukėlė apoptozę panašiam ląstelių skaičiui (6,5 proc.) (p > 0,05). Koksibų poveikis BxPC-3 ląstelių apoptozei buvo silpnesnis nei fenamatų (p < 0,05). Luo S. ir kt. ištyrė, kad nosiaryklės karcinomos CNE-2Z ląsteles paveikus 50 µM koncentracijos niflumo rūgštimi apoptozės būdu žuvo apie 7 proc., 100 µM – 9 proc. ir 200 µM – 17 proc. ląstelių [49].

20 pav. Junginių poveikis BxPC- 3 ląstelių apoptozei (* p < 0,05)

BxPC-3 ląstelių nekrozę fenamatai ir koksibai sukėlė panašiam ląstelių skaičiui (21 pav.) (p > 0,05). Ląsteles paveikus didžiausiomis junginių koncentracijomis (90 proc. nustatytos kiekvieno junginio EC50) nekrozės būdu žuvo apie 3,9–4,7 proc. ląstelių.

MIA PaCa-2 apoptotinių ląstelių kiekio priklausomybė nuo junginio koncentracijos nustatyta visų junginių atveju, išskyrus parekoksibo. Stipriausią MIA PaCa-2 ląstelių apoptozę sukeliantį poveikį turėjo fenamatai (22 pav.), jie sukėlė apoptozę ir didžiausiam BxPC-3 ląstelių skaičiui. Ląsteles paveikus didžiausia meklofenamo rūgšties koncentracija (40 µM), apoptozės būdu žuvo 9,4 proc. ląstelių.

22 pav. Junginių poveikis MIA PaCa-2 ląstelių apoptozei (* p < 0,05)

Koksibai labiau sukėlė apoptozę MIA Paca-2 nei BxPC-3 ląstelėms (p < 0,05). Ląsteles paveikus didžiausia celekoksibo koncentracija, žuvo 7,2 proc., o parekoksibo – 6,2 proc. MIA Paca-2 ląstelių. El-Rayes B.F. ir kt. nustatė, kad paveikus BxPC-3 ląstelių liniją su 1 µM celekoksibu po 48 val. apoptozė buvo sukelta nedideliam ląstelių skaičiui, o paveikus MIA PaCa-2 ląsteles – apoptozė nebuvo sukelta [59]. Ding N. ir kt. taip pat ištyrė, kad paveikus kasos vėžio PANC-1 ląsteles su 1 µM celekoksibu buvo sukelta apoptozė 4 proc., o 10 µM – 12 proc. ląstelių. Šis poveikis buvo nuo koncentracijos priklausomas [56].

Tirti NVNU sukėlė nekrozę panašiam MIA PaCa-2, kaip ir BxPC-3, ląstelių skaičiui (23 pav.) (p > 0,05). MIA PaCa-2 ląstelių nekrozę didžiausiam skaičiui sukėlė celekoksibas ir meklofenamo rūgštis. Ląsteles paveikus didžiausiomis jų koncentracijomis (90 proc. EC50), nekrozės būdu žuvo atitinkamai , 7 proc. ir 5,4 proc. ląstelių (p >0,05). Niflumo ir mefenamo rūgščių bei parekoksibo sukelta MIA PaCa-2 ląstelių nekrozė buvo panaši (p > 0,05). Šių junginių didžiausiomis koncentracijomis paveikus MIA PaCa-2 ląsteles nekrozės būdu žuvo apie 3,3 proc. ląstelių.

23 pav. Junginių poveikis MIA PaCa-2 ląstelių nekrozei (* p < 0,05)

Rezultatai parodė, kad visi penki tirti NVNU sukėlė kasos vėžio ląstelių apoptozę ir nekrozę. Junginiai turėjo didesnį poveikį ląstelių apoptozei, nei nekrozei. Fenamatai ir koksibai sukėlė nuo koncentracijos priklausomą ląstelių apoptozę ir nekrozę. Koksibai labiau sukėlė apoptozę MIA Paca-2 nei BxPC-3 ląstelėms. Fenamatai labiau sukėlė apoptozę BxPC-3 ląstelių linijoje, nei koksibai.

3.4. Poveikis vėžinių ląstelių kolonijų formavimuisi

Vėžio kamieninės ląstelės sudaro tik nedidelę vėžinio audinio dalį. Tačiau jos gali nulemti vėžio atsparumą chemoterapijai. Taip pat jos prisideda prie vėžio išsivystymo, augimo ir metastazės. Dauguma vaistų neveikia kasos vėžio kamieninių ląstelių, dėl to tai gali būti viena iš pagrindinių nesėkmingo gydymo priežasčių [86].

Tirtų NVNU poveikis kolonijų formavimuisi buvo skirtingas (24 pav.). BxPC-3 ląstelių linijos vienai kolonijai tenkantis plotas, po inkubacijos su fenamatais yra 1,3 - 2,4 karto mažesnis nei MIA PaCa-2, o po inkubacijos su parekoksibu – 3,5 karto. Tai parodo, kad COX-2 raiška yra svarbi ląstelių kamieniškumui. Kadangi tiriamų salicilatų naudotos koncentracijos nepaveikė ląstelių gyvybingumo, jie šiame tyrime nebuvo naudojami. Zhang Y. ir kt. nustatė acetilsalicilo rūgšties poveikį kasos vėžio PANC-1 ir AsPC-1 ląstelių kamieniškumui. Po 14 dienų inkubacijos su šiuo junginiu, kolonijų plotas apėmė 80 proc. (PANC-1) ir 60 proc. (AsPC-1). Tačiau šiame tyrime buvo naudotos didelės acetilsalicilo rūgšties koncentracijos (1–5 mM) [60].

24 pav. BxPC-3 ir MIA PaCa-2 kolonijos, po inkubacijos su aktyviausių junginių didžiausiomis koncentracijomis (EC50)

Labiausiai BxPC-3 kolonijų formavimąsi slopino koksibai (25 pav.). Celekoksibu paveiktų kolonijų plotas buvo 11 kartų, o parekoksibu – 6 kartus mažesnis nei kontrolinės grupės (p < 0,05). Singh B. ir kt. nustatė, kad celekoksibas taip pat aktyviai slopino didele COX-2 raiska pasižyminčių krūties vėžio SUM-149 ir BSC60 ląstelių kamieniškumą [87]. Iš fenamatų tik mefenamo rūgštis silpniau, nei niflumo ir meklofenamo rūgštys, veikė ląstelių kamieniškumą (p < 0,05). Niflumo ir meklofenamo rūgštimis paveiktų kolonijų plotas atitinkamai buvo 3 kartus ir – 2,5 karto mažesnis, nei kontrolinės grupės (p < 0,05). Tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo tarp šių junginių nenustatyta (p > 0,05).

25 pav. Junginių poveikis BxPC-3 kolonijų plotui (* p < 0,05)

MIA PaCa-2 ląstelės silpniau, nei BxPC-3, reagavo į junginių, išskyrus celekoksibo ir mefenamo rūgšties, poveikį kolonijų formavimuisi (26 pav.) (p < 0,05, išskyrus mefenamo rūgštį,

kurios p > 0,05). Tačiau tendencija matoma ta pati, celekoksibas buvo aktyviausias junginys (p < 0,05). Jo mažiausios koncentracijos poveikis panašus į parekoksibo ir niflumo rūgšties didžiausių koncentracijų poveikius (p > 0,05). Fenamatai silpniau veikė kolonijų formavimąsi nei parekoksibas, tačiau jų poveikiai tarpusavyje per daug nesiskyrė (p > 0,05). Affram K. ir kt. ištyrė gemcitabino poveikį įvairioms kasos vėžio ląstelių linijų kolonijoms. Jie nustatė, kad šis junginys taip pat labiau veikia BxPC-3, nei MIA PaCa-2 kolonijų augimą [88].

26 pav. Junginių poveikis MIA PaCa-2 kolonijų plotui (* p < 0,05)

Iš rezultatų matyti, kad tirti fenamatai ir koksibai slopino kasos vėžio ląstelių kamieniškumą. Parekoksibas, meklofenamo ir niflumo rūgštys turėjo didesnį poveikį BxPC-3, o celekoksibas – MIA PaCa-2 ląstelių kolonijų formavimuisi. Nors celekoksibas yra selektyvus COX-2 slopiklis, jo veikimo mechanizmas MIA PaCa-2 ląstelių linijoje gali būti nesusijęs su COX-2. Beje, Xu X.T. ir kt. nustatė, kad 30 µM koncentracijos celekoksibas slopino gaubtinės žarnos vėžio HCT116 ląstelių kamieniškumą. Jo veikimo mechanizmas šioje ląstelių linijoje taip pat buvo nuo COX-2 nepriklausantis [89]. Dėl to galima teigti, kad ne tik COX-2 turi svarbų vaidmenį vėžio kamieninių ląstelių normaliam funkcionavimui.

4. IŠVADOS

1. Tirti fenamatams ir koksibams priklausantys nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo mažina kasos vėžio ląstelių gyvybingumą. Fenamatai pasižymi didesniu antiproliferaciniu aktyvumu COX-2 ekspresuojančiai BxPC-3 nei COX-2 neekspresuojančiai MIA PaCa-2 ląstelių linijai (p < 0,05). 2. Salicilatai yra aktyvesni 3D ląstelių kultūrose, o fenamatai ir koksibai aktyvesni monosluoksniu

augančiose ląstelių kultūrose (p < 0,05). Niflumo rūgštis aktyviausiai slopina BxPC-3 sferoidų augimą, o celekoksibas – MIA PaCa-2.

3. Fenamatai ir koksibai sukelia nuo koncentracijos priklausomą kasos ląstelių apoptozę ir nekrozę. Koksibai labiau sukelia apoptozę MIA Paca-2 nei BxPC-3 ląstelėms (p < 0,05). Fenamatai labiau sukelia apoptozę BxPC-3 ląstelių linijoje nei koksibai (p < 0,05).

4. Tirti fenamatai ir koksibai slopina kasos vėžio ląstelių kamieniškumą. Meklofenamo ir niflumo rūgštys bei parekoksibas didesnį poveikį turi BxPC-3, o celekoksibas – MIA PaCa-2 ląstelių kolonijų formavimuisi (p < 0,05).

5.

DARBO REZULTATŲ PRISTATYMAS

Darbo rezultatai buvo pristatyti tarptautinėje konferencijoje „BaltPharmForum“, vykusioje Jūrmaloje 2017 balandžio 28-30 d. pristatytas stendinis pranešimas: „Anticancer activity of NSAIDs in pancreatic cell 2D and 3D models“.