LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Asta Bobin
Mikotoksinus detoksikuojančio preparato
panaudojimas mėsinių kiaulių sveikatingumui gerinti
Use of mycotoxin detoxifying agent for improving the
health of fattening piglets
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr. Bronius Bakutis
2 DARBASATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMASAPIEATLIKTODARBOSAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Mikotoksinus detoksikuojančio preparato panaudojimas mėsinių kiaulių sveikatingumui gerinti“:
1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė)
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Pašarų sanitarija ... 101.2. Aktualiausi kiaulėms mikotoksinai ... 11
1.2.1. Aflatoksinai (AF) ... 11 1.2.2. Deoksinivalenolis (DON) ... 13 1.2.3. Zearalenonas (ZEA) ... 16 1.2.4. T-2 toksinas ... 18 1.2.5. Ochratoksinas A (OTA)... 20 1.3. Detoksikacija ... 22 1.3.1. Fiziniai metodai ... 22 1.3.2. Cheminiai metodai ... 23 1.3.3. Biologiniai metodai ... 23
2. TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGOS ... 25
2.1. Tyrimo atlikimo vieta, laikas, sąlygos ... 25
2.2. Mikotoksinų koncentracijos pašaruose tyrimo metodika ... 26
2.3. Kraujo tyrimų metodika ... 27
2.4. Priesvorių ir pašarų sunaudojimo matavimo metodika ... 28
2.5. Statistinė analizė ... 28
3. TYRIMO REZULTATAI ... 29
3.1. Mikotoksinų koncentracija pašaruose ... 29
3.2. Kraujo biocheminiai tyrimai ... 29
3.3. Kraujo morfologiniai tyrimai ... 38
3.4. Patologiniai anatominiai pokyčiai... 43
3.5. Priesvoris ir pašarų sunaudojimas ... 44
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 46
IŠVADOS ... 48
REKOMENDACIJOS ... 49
LITERTŪROS SĄRAŠAS ... 50
4 MIKOTOSKSINUS DETOKSIJUOJANČIO PREPARATO PANAUDOJIMAS MĖSINIŲ
KIAULIŲ SVEIKATINGUMUI GERINTI
Asta Bobin
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Netgi mažos mikotoksinų koncentracijos pašaruose gali sukelti kiaulių, kurios yra jautriausios jų poveikiui, organizmo sutrikimus. Mikotoksinus detoksikuojančio preparato Alltech Mycosorb A+ veikimas pagrįstas ant Saccharomyces cerevisiae sienelių esančių specifinių angliavandenių adsorbcinėmis savybėmis. Tyrimo tikslas įvertinti šio preparato panaudojimą mėsinių kiaulių sveikatingumui gerinti. 132 nujunkyti paršeliai buvo šerti natūraliai kontaminuotais pašarais, mikotoksinų koncentracijos racione neviršijo ES rekomenduojamų normų. Į bandomosios grupės pašarus įterptas Alltech Mycosorb A+ preparatas. Pašarai tirti pagal Romer Labs. Inc (Austrija) metodikas, biocheminiai kraujo tyrimai pagal SDP 5.4.4.R.3: 2017, imunologiniai kraujo tyrimai atlikti IgA (pig) ELISA Kit, morfologiniai BC-2800Vet hematologiniu analizatoriumi, vertinti nujunkytų paršelių priesvoriai. 38-tą tyrimo parą bandomojoje grupėje nustatyta 13,24 proc. didesnė ALB koncentracija (P<0,05), o 100-ąją tyrimo parą 18,59 proc.didesnis GGT aktyvumas (P<0,05), kontrolinėje grupėje 9,86 proc. ir 17,68 proc. didesnis LDH (P<0,01) ir ALP (P<0,01) aktyvumas atitinkamai. Antrojoje bandymo dalyje reikšmingai mažėjo IgA kiekis (P<0,05). 38-tą tyrimo parą bandomojoje grupėje nustatytas 31,69 proc. didesnis PLT kiekis (P<0,05), tyrimo pabaigoje 3,71 proc. didesnė MCHC (P<0,01), o kontrolinėje grupėje 3,68 proc. didesnis MCV (P<0,05). Preparato poveikis priesvoriui ženklesnis iki 38-tos tyrimo paros, kuomet mikotoksinų koncentracijos pašaruose buvo didesnės (P>0,05).
5 USE OF MYCOTOXIN DETOXIFYING AGENT FOR IMPROVING THE HEALTH OF
FATTENING PIGLETS
Asta Bobin
Master‘s Thesis
SUMMARY
Even at low concentration, mycotoxins can cause disorders in pigs‘ organisms, which are the most susceptible to their effects. The effect of mycotoxin detoxifying agent Alltech Mycosorb A+ is based on the adsorption properties of specific carbohydrates present on the walls of Saccharomyces
cerevisiae. The aim of the study is to evaluate the use of this agent for improving the health of
fattening piglets. 132 weaned piglets were fed with naturally contaminated feed, in which the concentration of mycotoxins did not exceed the recommended EU standards. Alltech Mycosorb A+ was added to the feed which was utilized for the experimental group. Concentrations of mycotoxins were analysed according to approved Romer Labs. Inc (Austria) methodology, biochemical parameters of blood according to SDP 5.4.4.R.3: 2017 methodology, ELISA kit was used for measurement of IgA and BC-2800Vet hematology analyzer for hematological parameters of blood, average daily gain was evaluated. On the 38th day of the study, the test group was found to have 13,24 % higher ALB concentration (P<0,05), on the 100th study day 18,59 % higher activity of GGT (P<0,05), the control group was found to have 9,86 % and 17,68 % higher activity of LDH (P<0,01) and ALP (P<0,01) respectively.On the second part of the study, a significant decrease of IgA in the control group was observed (P<0,05). On the 38th day of the study, the test group was found to have 31,69 % higher PLT count (P<0,05), on the 100th study day 3,71 % higher MCHC (P<0,01) and the control group 3,68 % higher MCV (P<0,05). Higher impact of the used agent on average daily weight was noted in the first part of the study, when the concentration of mycotoxins in the feed was higher (P>0,05).
6
SANTRUMPOS
AF – aflatoksinas AFB1 – aflatoksinas B1 AFL – aflatoksikolis DON – deoksinivalenolis ZEA – zearalenonas OTA – ochratoksinas A FUM – fumonizinai aw – vandens aktyvumasCYP P450 – citochromas P450 fermentai DNR – deoksiribonukleorūgštis
RNR – ribonukleinorūgštis AFM1 – aflatoksinas M1 AFQ1 – aflatoksinas Q1
ROS – reaktyvios deguonies formos
MAPK – mitogeno aktyvintos proteino kinazės IL-2 – interleikinas 2 IL-4 – interleukinas 4 IL-5 – interleukinas 5 IL-6 – interleukinas 6 IL-8 –interleukinas 8 IL-10 –interleukinas 10 IL-1β – interleukinas 1β
TNF-α – naviko nekrozės faktorius α TNF-β – naviko nekrozės faktorius β
PRRSV – kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo virusas IgA – imunoglobulinas A
IgG – imunoglobulinas G IgM – imunoglobulinas M α- ZOL – α zearalenolas β-ZOL – β zearalenolas
7 TLR – toll tipo receptoriai
ALT – alanin amino transferazė AST – aspartat amino transferazė GGT – γ glutamil transferazė CREA – kreatininas
LDH – laktat dehidrogenazė ALP – šarminė fosfatazė TP – bendrieji baltymai
BIL-D – tiesioginis bilirubinas UREA – šlapalas GLU – gliukozė ALB – albumina WBC – leukocitai RBC – eritrocitai HGB – hemoglobinas HCT – hematokritas
MCV –vidutinis eritrocito tūris
MCH – vidutinis eritrocitų hemoglobinas
MCHC – vidutinė eritrocitų hemoglobino koncentracija RDW – eritrocitų apimties variacija
PLT – trombocitai
8
ĮVADAS
Grūdai sudaro ūkinių gyvūnų mitybos pagrindą ir yra svarbūs pašarų komponentai (1). Labiausiai mikotoksinais užteršti kviečiai, kukurūzai, miežiai, rugiai ir avižos (2). Mažesni gyvūnai pasižymi didesniu jautrumu mikotoksinų poveikiui, todėl paukščiai, kiaulės ir vandens stuburiniai yra imlesni mikotoksikozėms (3).
Pasauliniu mastu 30 - 100 proc. maisto ir pašarų mėginių yra kontaminuoti mikotoksinais (1). Dažnai mažomis koncentracijomis aptinkamos kelios mikotoksinų rūšys vienu metu, ypatingai gaminamos Aspergillus spp. ir Fusarium spp. genčių (3). Tokiais atvejais gali pasireikšti stiprus sinergistinis, antagonistinis arba papildomas poveikis (4). Tyrimais įrodyta, kad kontaminacija keliom mikotoksinų rūšim gali sukelti neigiamą poveikį kiaulių sveikatingumui, netgi kuomet toksinų koncentracijos neperžengia rekomenduojamų ribų (5). Europos Sąjungoje gyvūnų pašaruose ribojamas tik AFB1, todėl mikotoksinai ūkiniams gyvūnams dažnai sukelia sunkius susirgimus (3).
2011-2014 metais Lenkijoje tirtuose pašarų mėginiuose dažniausiai nustatyta DON ir ZEA. Mažagrūdžių javų mėginiuose atitinkamai 98 ir 97 proc. Virš 90 proc. visų tirtų mėginių nustatyta trichotecenai ir ZEA (6). Nors daugumoje mėginių mikotoksinų koncentracijos neviršijo ES rekomenduojamų normų, šeriant gyvūnus tokiais pašarais pasireiškė lėtinių mikotoksikozių simptomai (7). Be to ūkininkai pastebėjo neigiamą mikotoksinų įtaką gaunamai produkcijai, sumažėjusius gyvulių priesvorius ir patyrė ekonominius nuostolius. Dėl šių priežasčių pašarų užterštumas keliomis mikotoksinų rūšimis kelia didelį susirūpinimą (3).
2009 metais Europos Sąjunga patvirtino mikotoksinus detoksikuojančių preparatų panaudojimą mikotoksikozių prevencijai gyvūnų fermose (386/2009/EC). Šie priedai yra dedami į pašarus (pagrindinai kiaulių, paukščių ir galvijų), kad sumažintų mikotoksinų absorbciją iš virškinamojo trakto ir jų paskirstymą į taikininius organus (3).
Neigiamas mikotoksinų poveikis pasireiškia nuo hepatoceliulinės karcinomos, siejamos su lėtine ekspozicija AF iki žinduolių hiperestrogenizmo, stebimo dėl ZEA įtakos (8). DON konsumpcija, daugiausiai sveikatos problemų kelianti kiaulėms dėl didelio jų jautrumo, apibūdinama gastroenteritu ir imunotoksiškumu (9). OTA sukelia nefropatiją, o lėtinė ekspozicija FUM yra vienas iš rizikos veiksnių susirgti stemplės vėžiu ir nervinio vamzdelio defektų formavimuisi (8). Esant tokiam plačiam mikotoksinų poveikio spektrui gyvūnų sveikatai, lengvai suprantama, kodėl tiek daug dėmesio skiriama mikotoksinų detoksikacijos ir kontrolės klausimams (10).
Darbo tikslas:
Įvertinti Alltech Mycosorb A+ mikotoksinus detoksikuojančio preparato panaudojimą mėsinių kiaulių sveikatingumui gerinti.
9 1. Įvertinti pašarų, skirtų mėsinėms kiaulėms, mikotoksikozinį lygį X ūkyje.
2. Įvertinti mikotoksinus detoksikuojančio preparato įtaką nujunkytų paršelių kraujo biocheminiams bei morfologiniams rodikliams.
3. Įvertinti mikotoksinus detoksikuojančio preparato įtaką nujunkytų paršelių prieaugiui ir pašarų sunaudojimui.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Pašarų sanitarija
Mikotoksinai tai mažos molekulinės masės antriniai metabolitai, kurie net mažomis koncentracijomis turi neigiamą poveikį žmonių ir gyvūnų sveikatai. Jie dažniau aptinkami šilto ir drėgno klimato zonose, kuriose sąlygos yra palankesnės pelėsių augimui, tačiau taip pat vystosi ir vidutinio klimato juostose. Daugiau nei 300 pelėsinių grybų rūšių gamina mikotoksinus kaip atsaką į stresą, sukeltą aplinkos nepastovumo, maisto medžiagų trūkumo ar konkurencijos su kitais mikroorganizmais (11).
Kai kurie mikotoksigeniniai grybai, ypač Fusarium spp. gali gaminti daugiau nei vieną mikotoksinų rūšį (12). Be to, kai kurie mikotoksinai gaminami daugiau nei vienos mikroskopinių grybų rūšies (13). Dažniausiai daugiau nei keletas mikotoksinų aptinkama vienu metu, pvz.: AF, FUM, DON ir ZEA gali būti randami viename grūde (12).
Dažniausiai aptinkami mikotoksinai pašaruose yra gaminami trijų grybų genčių: Aspergillus
spp. Penicillium spp. ir Fusarium spp. (13). Būtent dėl pasėlių grybinės infekcijos ir apipelijusių
grūdų naudojimo pašarų gamyboje, mikotoksinai randami gyvūnų pašarų gamybos grandinėje. Grybai gali kontaminuoti augančius augalus prieš derliaus nuėmimą ir gaminti mikotoksinus laukuose, arba po derliaus nuėmimo ir javų sandėliavimo bei transportavimo metu. Palankios aplinkos sąlygos: aukšta temperatūra, didelis drėgmės kiekis, vabzdžių sukelti pažeidimai, sukelia stresą ir paskatina pelėsių augimą bei mikotoksinų gamybą prieš nuimant derlių (14).
Penicillium spp. ir Aspergillus spp. dažniausiai pakenkia sandėliavimo metu (15). Grybinė
infekcija gali prasidėti nuo labai mažo sporų kiekio, užteršiančio grūdus per transporto priemones, pervežant juos iš laukų į sandėlius, tvarkymo ir sandėliavimo įrenginius ir nuo sporų jau esančių sandėliuose (16). Grybų vystymąsis priklauso nuo maistinių medžiagų grūduose sudėties ir kiekio, drėgmės ir temperatūros bei biotinių veiksnių, t.y. konkurencijos su sandėliuojamų produktų kenkėjais (17). Daugelis grybų auga 10-40,5 ℃, esant 70 proc. santykiniam drėgniui ir pH 4-8 (18). Tačiau kai kurios gentys, kaip Aspergillus spp. ir Penicillium spp. yra aktyvios žemose temperatūrose (10 ir 20 ℃ atitinkamai) (19). Sandėlių grybai gali augti esant mažesniam vandens aktyvumui (aw =0.70-0.75) palyginus su laukų grybais, kurie vandens kiekiui yra reiklesni (aw>0.9) (20).
Grūduose aptinkamos penkios pagrindinės mikotoksinų rūšys: aflatoksinai, fumonizinai, deksinivalenolis, ochratoksinas ir zearalenonas. DON, ZEA ir FUM gali būti gaminami prieš derliaus nuėmimą, kuomet AF ir OTA dažniausiai randami sandėliavimo metu dėl netinkamo grūdų tvarkymo (21). Lėtinės mikotoksikozės simptomai pasireiškia net ir tuomet, kai pašaras kontaminuotas mažesniais nei ES didžiausiais leistinais mikotoksinų kiekiais (7).
11 Kritiniais veiksniais, sąlygojančiais grybinę infekciją po derliaus nuėmimo, laikomi pradinis grūdų drėgnis, derliaus nuėmimo savalaikiškumas, grūdų sandėliavimo trukmė prieš jų džiovinimą, grūdų ir pašalinių medžiagų kiekis, grūdų dulkių kiekis, sandėliavimo statinių tipas ir kokybė, grūdų temperatūra, oro santykinis drėgnis bei kondensacinis garų sluoksnis (18). Vabzdžiai, rausiantys tunelius grūdų lukštuose sudaro sąlygas oru ar dulkėmis plintančių patogeninių grybų infekcijoms, o pažeisdami branduolius, palengvina grybams pasiekti endospermą (22). Tokie pažeidimai gali tapti infekcijos vartais bei lemti branduolių išdžiūvimą iki palankaus drėgnio Aspergillus. flavus augimui ir AF gamybai (23).
Pagrindiniai veiksniai, įvertinant sandėliuojamų grūdų saugumą yra drėgmė ir temperatūra. Didelė grūdų drėgmė (16-30 proc.), palanki jų temperatūra (25-32 ºC) ir didelis oro santykinis drėgnis (80-100 proc.) skatina grybų augimą ir mikotoksinų biosintezę sandėliuojamuose grūduose. Santykinis drėgnis turi įtaką grūdų drėgmės kiekiui, lemiančiam vandens, reikalingo grybų augimui ir mikotoksinų gamybai, prieinamumą (18). Nustatyta, kad grūdų pažeidimas mažesnis kuomet sandėliuojamuose grūduose yra mažiau nei 120-140 g vandens/kg (19). Sezoninis drėgmės svyravimas ir jos migracija į skirtingas grūdų mases sąlygoja drėgmės susikaupimą tam tikrose vietose, kurios tampa puikia terpe vabzdžių ir grybų vystymuisi (24).
1.2. Aktualiausi kiaulėms mikotoksinai
1.2.1. Aflatoksinai (AF)Aflatoksinai (AF) plačiai pasaulyje paplitę antriniai grybų metabolitai, dažniausiai gaminami
Aspergillus flavus ir A. parasiticus pelėsių (25). Šie mikotoksinai aptinkami lietingu sezonu ir esant
aukštai aplinkos temperatūrai (30-45℃). Literatūroje rašoma, kad pašarų kontaminacija grybų toksinais didesnė besivystančiose šalyse, kur nėra užtikrintų pašarų sandėliavimo sąlygų (26).
AFB1 būdinga lipofilinė struktūra, todėl su pašaru patekęs į gastrointestinalinį traktą, jis pasyviai difunduoja pro žarnų epitelį. Taip pat žarnyno mikroflora skaido AFB1, didinant jo biologinį prieinamumą ir jis greitai patenka į kraujotaką (27). CYP P450 šeimos fermentai ir glutationo S-transferazės žarnų audiniuose ir kepenyse metabolizuoja mikotoksinus į daugiau ar mažiau toksiškus hidroksilintus metabolitus AFM1, AFQ1, AFL ir labai reaktyvų AFB1 ekso-8,9-epoksidą (28). Pastarasis dėl sąveikos su DNR ar kitomis ląstelių makromolekulėmis sukelia mutacijas ir vėžį (29) bei skatina reaktyvių deguonies formų (ROS) susidarymą, kurios, veikiant CYP P450, sukelia oksidacinį stresą (30). AFB1 ir jo metabolitai išskiriami su pienu, šlapimu ir kitais sekretais (28).
AF poveikio spektras in vivo neselektyvus ir platus, jis veikia teratogeniškai, mutageniškai, hepatotoksiškai, citotoksiškai ir imunotoksiškai (31). Atliktais tyrimais įrodyta, kad AFB1 tiek stimuliuoja, tiek slopina imuninę sistemą, gali pažeisti ir įgimtą, ir įgytą imunitetą (32), o slopindamas dendritinių ląstelių antigeno prezentavimo savybes turi įtaką ląsteliniam imunitetui (33).
12 AF sukelti pažeidimai priklauso nuo gyvūnų amžiaus, raciono, mikotoksinų koncentracijos pašaruose ir ekspozicijos laiko. Jų poveikis labiausiai išreikštas nujunkytiems paršeliams ir penimiems paršams. AF sukelti skrandžio pažeidimai ir imuninės sistemos sutrikimai yra siejami su padidėjusiu jautrumu infekcijoms. Literatūroje rašoma, kad net jei mikotoksinų koncentracijos pašaruose nežymios, jų poveikyje sulėtėja augimas, susilpnėja efektyvus pašaro panaudojimas, sukeliami kepenų ir inkstų pažeidimai reprodukcinių funkcijų sutrikimai, padidėja embrionų žuvimo, apsigimimų bei vėžinių susirgimų tikimybė (34). Per 4 savaites kristaliniu AFB1 (1807 µg/kg pašaro) kontaminuotais pašarais šertoms kiaulėms išsivystė kepenų fibrozė ir funkcijos nepakankamumas bei sumažėjo priesvoriai, tačiau mažesnės mikotoksino koncentracijos (385 µg arba 867 µg/kg pašaro) racione, kiaulėms aflatoksikozės simptomų nesukėlė (35).
AF poveikiui jautriausios kepenų ląstelės ir tarpląstelinė medžiaga, tyrimuose pastebėti makro- ir mikroskopiniai organo pakitimai (36). Skrodžiant AFB1 kontaminuotu pašaru (1807 µg/kg pašaro) šertų kiaulių gaišenas aprašytos marmurinės, geltonos spalvos, išblyškusios kepenys su išryškėjusiomis skiltimis, kuomet mažesnėmis mikotoksino koncentracijomis (385-867 µg/kg pašaro) užterštu pašaru šertų kiaulių kepenys buvo hiperemiškos ir homogeniškos. Histopatologinio tyrimo metu nustatyta hepatocitų edema, kepenų triadų fibrozė bei jungiamojo audinio išvešėjimas (35).
Aflatoksikozė pasireiškia taip pat svorio netekimu, morfologiniais ir biocheminiais kraujo rodiklių pakitimais (25). Donmez N. ir kt. (2012) nustatė, kad AF poveikyje eritrocitų (RBC) kiekis, hemoglobino (HGB) koncentracija ir hematokritas (HCT) sumažėjo Merino veislių avinų kraujyje, HGB ir RBC sumažėjimas sąlygojo normocitinės normochroninės anemijos išsivystymą. Tokie pokyčiai pagrįsti sutrikdyta eritropoeze ir hemo biosinteze kaulų čiulpuose (37). Basmacioglu H. ir kt. (2005) taip pat pastebėjo minėtų rodiklių sumažėjimą per 21 parą kontamintuotu AF (2 mg AF/kg pašaro) pašaru šertų broilerių kraujyje (38).
Fu J.H. ir kt. (2013) AFB1 kontaminuotais pašarais (372.8 μg/kg pašaro) šertų nujunkytų paršelių kraujyje nustatė sumažėjusį neutrofilų (NEU), monocitų (MONO) ir leukocitų (LEU) kiekį (P<0.05) (39). Minėto Donmez N. ir kt. (2012) atlikto tyrimo duomenimis leukocitų kiekis sumažėjo taip pat Merino veislės avinų kraujyje (37), o Basmacioglu H. ir kt. (2005) nustatė limfocitų kiekio sumažėjimą broilerių kraujyje (38). Leukocitų kiekio sumažėjimas aiškinamas imuninės sistemos išsekimu, kuris siejamas su organizmo atsaku į toksinį AF (37). In vitro tyrimai atskleidė, kad nedidelės mikotoksino koncentracijos skatina limfocitų proliferaciją, o didesnės lemia nuo dozės-priklausomą jų kiekio mažėjimą (40). Fu J.H. ir kt. (2013) atliktame tyrime eozinofilų (EOS) ir bazofilų (BAS) kiekis reikšmingai nepasikeitė (39). Sun Y. ir kt. (2015) AF (20 µg/kg pašaro, P<0,05) poveikyje nustatė trombocitų (PLT) kiekio sumažėjimą nujunkytų paršelių kraujyje (41), o Basmacioglu H. ir kt. (2005) broilerių kraujyje (38).
13 AFB1 kontaminuotų pašarų (372.8 μg/kg pašaro) poveikis nujunkytų paršelių GGT, ALT, AST, ALP aktyvumui nepastebėtas (39). Anot Meissonier G.M. ir kt. (2007) ekspozicija 385 μg arba 867 μg AFB1/kg pašaro transaminazių, ALP, GGT aktyvumui įtakos neturėjo, tačiau didesnės AFB1 koncentracijos sukėlė reikšmingus biocheminius kraujo rodiklių pakitimus. Dėl sutrikusios kepenų funkcijos sumažėjo gliukozės (GLU), bendrųjų baltymų (TP) ir albuminų (ALB) koncentracija, siejama su padidėjusiu ALP ir GGT aktyvumu (42).
Sumažėjusią albuminų koncentraciją (P=0,55) dėl AF įtakos tyrimais patvirtino Sun ir kt. (2015) (41). Kai kurie mokslininkai, AFB1 kontaminuotais pašarais (372.8 μg/kg pašaro) šertų nujunkytų paršelių kraujyje TP, ALB, BUN, BLB kiekio pokyčių nepastebėjo (39).
Literatūroje rašoma, kad IgG ir IgM koncentracijos dėl AF poveikio nekinta, tačiau ilgiau kaip 2 savaites vidutinėmis (867 µg/kg pašaro) ir didelėmis (1807 µg/kg pašaro) AF koncentracijomis kontaminuotu pašaru šertų kiaulių serume pastebėtas IgA koncentracijos padidėjimas (35). Esant mažesnėms AFB1 koncentracijoms (372.8 μg/kg pašaro) poveikis IgG, IgA ir IgM nenustatytas (39). Nujunkytų paršelių, šertų su 385 ar 867 μg AFB1/kg pašaro, priesvoris buvo šiek tiek mažesnis, tačiau 1807 μg AFB1/kg kontaminuotu pašaru šertų nujunkytų paršelių priesvoris buvo reikšmingai mažesnis (sudarė 53 proc. kontrolinės grupės priesvorio) (42). Thieu N.Q. ir kt. (2008) tyrimais nustatė, kad per 41 dieną AF (200 μg/kg pašaro) kontaminuotais pašarais šertų nujunkytų paršelių vidutinis priesvoris ir vidutinis pašaro sunaudojimas patikimai sumažėjo (25).
1.2.2. Deoksinivalenolis (DON)
Deoksinivalenolis (DON) - Fusarium graminearum ir F. culmorum gaminamas antrinis metabolitas. Tai labiausiai paplitęs trichotecenas Europoje ir Šiaurės Amerikoje, dažniausiai aptinkamas kviečiuose, miežiuose, avižose ir kukurūzuose (43).Jis yra atsparus aukštai temperatūrai, kas sąlygoja didesnį maisto ir pašarų užterštumą šiuo mikotoksinu (44).
Kiaulė laikoma DON jautriausia rūšimi. 0.1-0.2 mg/kg DON kontaminuoti pašarai gali provokuoti vėmimą, o 0.5 mg/kg DON pašare sukelia vėmimą per 5-7 minutes (45). Būtent dėl savo emetinių savybių jis žinomas kaip vomitoksinas. Daug straipsnių nagrinėja toksinį DON poveikį smegenų funkcijai. Žinoma, kad DON taip pat sukelia reprodukcinius sutrikimus, veikia karcinogeniškai ir mutageniškai (46).
Trikdydamas proteinų sintezę DON turi įtaką ląsteliniam transportui, fermentų metabolizmui citoplazmoje ir prisijungimui prie aktyvaus jungimosi centro (47). In vivo ir in vitro tyrimais įrodyta, kad įgimta imuninė sistema yra pagrindinis DON taikinys, o mononukleariniai fagocitai ypatingai jautrūs jo poveikiui (48). DON jungiasi su eukariotinių ląstelių ribosomų subvienetais ir inicijuoja ribotoksinio streso atsaką, kuris skatina MAPK fosforilinimą. Aktyvuotas MAPKs stimuliuoja mRNR ekspresiją ir pro-uždegiminių citokinų IL-2, IL-4 ir IL-5 sekreciją (49). Mažos mikotoksino dozės moduliuoja imuninę sistemą, kuomet didelės sukelia imunosupresiją (50). Imunosupresinis
14 poveikis pasireiškia sumažėjusiu T ir B limfocitų aktyvumu, susilpnėjusia antikūnų gamyba, sutrikusia makrofagų ir neutrofilų funkcija (51). DON slopina viruso replikaciją kiaulių organizme, todėl mikotoksinas turi įtaką PRRSV modifikuotos gyvos vakcinos efektyvumui (52).
Moduliuodamas žarnų epitelio paraląstelines glaudžias proteinų tinklo jungtis DON pažeidžia epitelio pralaidumą. Klaudinai, transmembraniniai proteinai tai pagrindiniai tamprių jungčių komponentai jautrūs DON poveikiui. Aktyvindamas reguliacinius MAPKs ir jų tolimesnius signalinius kelius, mikotoksinas sumažina klaudinų ekspresiją žarnose, todėl redukuoja tamprių jungčių kiekį ir tuo pačiu pažeidžia žarnų barjerinę funkciją bei palengvina DON įsisavinimą (53). Mikotoksinas sutrikdo tam tikrų maisto medžiagų, gliukozės ar amino rūgščių absorbciją iš virškinimo trakto (54). Zielonka Ł. ir kt. (2015) atliktais tyrimais įrodė, kad netgi nedidelės mikotoksinų koncentracijos turi įtaką paršelių kraujo homeostazės pokyčiams (44).
Kiaulėms būdingi virškinimo sutrikimai, viduriavimas, minkštos, nesuformuotos išmatos, jautrumas infekcijoms ir sumažėjęs pašaro sunaudojimas. Apetito netekimas ir vėmimas pasireiškia dėl neurocheminio disbalanso smegenyse (55).
Po ūmios DON absorbcijos, augančių kiaulių dvylikapirštėje, tuščiojoje ir klubinėje žarnose nustatyti epitelio pokyčiai. Histologiniais tyrimais nustatyti židininiai dvylikapirštės, tuščiosios žarnos ir kepenų uždegimai, kraujagyslių ir jungiamojo audinio išvešėjimas ir limfocitų, plazmocitų, acidofilinių granuliocitų infiltracija žarnų gaurelių stromoje ir tarpuose tarp kriptų (56).
Zielonka Ł. ir kt. (2015) per 42 dienas kristaliniu DON (12 µg/kg KM) kontaminuotu pašaru šertų nujunkytų paršelių kraujyje nenustatė reikšmingų HCT, HGB skirtumų, tačiau pastebėjo padidėjusį RBC kiekį (44). Priešingai, Dąbrowski M. ir kt. (2017) nenustatė RBC kiekio skirtumų tarp tyrimo grupių, tačiau pašaras kontaminuotas buvo 1008 µg DON/kg (57). Zielonka Ł. ir kt. (2015) atliktame tyrime nustatyta, kad ekspozicija DON sąlygojo sumažėjusį MCHC ir MCV. Lygiagrečiai stebėtas MCH padidėjimas, kuris gali būti siejamas su nujunkytų paršelių brendimu (44). Modra H. ir kt. (2013) taip pat užfiksavo, kad natūraliai kontaminuoto pašaro (DON 2 mg/kg) naudojimas sumažino vidutinį eritrocitų tūrį (58).
Zielonka Ł. ir kt. (2015) atliktame tyrime kontrolinės grupės paršelių kraujyje leukocitų kiekis buvo didesnis negu DON kontaminuotais pašarais šertų paršelių beveik viso bandymo laikotarpiu, priešingai monocitų kiekiui, kuris buvo didesnis bandomosios grupės paršelių kraujyje. Neutrofilų mažėjimo, o eozinofilų didėjimo tendencija nustatyta abiejose grupėse nepriklausomai nuo to ar pašaras buvo kontaminuotas mikotoksinais. Tyrėjai statistiškai reikšmingų BAS skirtumų nenustatė, o EOS procentas tyrimo pabaigoje buvo didesnis bandomosios grupės paršelių kraujyje (44). Gauthier T. ir kt. (2013) aprašė neutrofilų jautrumą in vitro terpėje su 0,5-10 µM DON. Tyrimo metu nustatė susilpnėjusį ląstelių chemotaksį, fagocitį aktyvumą ir gebėjimą sekretuoti IL-8 (59). Dąbrowski M.
15 ir kt. (2017) atlikę kraujo morfologinę analizę, reikšmingų WBC kiekio skirtumų tarp grupių nenustatė (57).
Zielonka Ł. ir kt. (2015) atliktame tyrime, dėl DON kontaminuoto pašaro naudojimo stebėjo didesnį PLT kiekį beveik viso tyrimo metu palyginus su kontroline grupe (44). Taip pat Prelusky ir kt. tyrimu įrodė, kad 3 mg DON/kg pašaro gali padidinti PLT kiekį (60).
Zielonka Ł. ir kt. (2015) atliktame tyrime bandomosios grupės paršelių kraujyje nustatė ALT aktyvumo mažėjimo tendenciją, tačiau rodiklio vertės buvo patikimai didesnės negu kontrolinės grupės viso tyrimo metu (44). Taip pat kristaliniu DON (6 mg/kg ar 12 mg/kg pašaro) kontaminuotais pašarais šertų nujunkytų paršelių kraujo serume ALT aktyvumas (P<0.01) buvo didesnis negu kontrolinės grupės (61). Kito fermento, AST aktyvumas netgi kuomet buvo didžiausias, buvo mažesnis nei kontrolinėje grupėje, tai rodo patologinį procesą kepenyse, tačiau taip pat kepenų funkcijos pagerėjimą palyginus su kontroline grupe (62). Tokie prieštaravimai aiškinami balansu tarp katabolizmo ir anabolizmo (44).
DON kontaminuotais pašarais šertų paršelių kraujyje stebėta žymesnė gliukozės mažėjimo tendencija (44). Gliukozės sumažėjimas aiškinamas mikotoksinų virsmu glikozilo dariniais, kurie sintetinami plonojoje žarnoje sąveikoje su gliukoze. Taip pat 51 proc. viso DON yra absorbuojamas plonojoje žarnoje, o šis procesas reikalauja didelių energijos sąnaudų (63). Kituose tyrimuose (DON 3-12 mg/kg) statistiškai reikšmingų gliukozės koncentracijos skirtumų tarp grupių nenustatyta (61).
Wu L. ir kt. (2015) atliktame tyrime, 3-12 DON mg/kg kontaminutu pašaru šertų paršelių kraujyje statistiškai reikšmingų kreatinino koncentracijos skirtumų tarp grupių nenustatyta, tačiau 6 mg/kg ir 12 mg DON/kg kontaminuotu pašaru šertų paršelių kraujyje pastebėtos didesnės BUN koncentracijos (P<0.05) negu kontrolinėje grupėje (61). Anot Zielonka Ł. ir kt. (2015) bendrųjų baltymų koncentracija didėjo tiek kontrolinėje, tiek bandomojoje grupėje (44).
Accensi F. ir kt. (2006) atliktame tyrime, 840 µg DON/kg kontaminuotas pašaras paršelių kraujyje morfologinių kraujo pakitimų nesukėlė, bet padidino IgA koncentraciją kraujo serume (64). Taip pat kitais tyrimais patvirtinta, kad DON turi įtaką serumo IgA koncentracijos didėjimui (65). Stanek C. ir kt. (2012) DON (3,1 mg DON/kg pašaro) poveikio nujunkytų paršelių biocheminiams kraujo rodikliams nenustatė (66).
Atliktuose tyrimuose pastebėta, kad ekspozicija DON padidina bendrųjų baltymų koncentraciją, tačiau tai neturi teigiamos įtakos paršelių priesvoriui (67). DON kontaminuoto pašaro naudojimas sąlygoja reikšmingai sumažėjusį pašaro sunaudojimą, todėl sumažėja ir paršelių priesvoris (61). Taip pat Danicke S. ir kt. (2013) nustatė patikimai sumažėjusį pašaro sunaudojimą priklausomai nuo DON koncentracijos (68). Mokslinių tyrimų duomenimis, 6 savaites trukusi ekspozicija DON (1008 µg DON/kg pašaro) priesvoriui įtakos neturėjo (57). Kiti šaltiniai teigia, kad nepriklausomai nuo ekspozicijos laiko stebimas sumažėjęs pašaro sunaudojimas ir sulėtėjęs augimas.
16 Netgi mažais DON kiekiais (1 mg/kg) kontaminuotas pašaras siejamas su sumažėjusiu pašaro sunaudojimu ir apetito stoka, tačiau laikoma, kad daugiau nei 2-5 mg DON/kg iš tikrųjų sumažina kiaulių priesvorius ir pašaro sunaudojimą (69).
1.2.3. Zearalenonas (ZEA)
Zearalenononas (ZEA), gaminamas pagrindinai Fusarium graminearum ir F. culmorum mikotoksigeninių grybų, estrogeninių savybių turintis junginys. Fusarium spp. grybai infekuoja javus žydėjimo metu, tačiau ZEA gaminamas ir esant blogoms grūdų sandėliavimo sąlygoms. Toksinas aptinkamas vidutinio ir šilto klimato zonose, ypatingai kukurūzų kultūrose, tačiau Fusarium spp. sporos yra plačiai paplitusios, todėl miežiai, avižos, kviečiai, ryžiai, sorgai ir sojos pupelės taip pat pažeidžiami (70).
Plonosios žarnos yra pirmas fizinis barjeras per os patekusioms dalelėms, todėl jos yra veikiamos didžiausių ZEA koncentracijų, o mikotoksino absorbcija turi įtaką jų sveikatingumui ir funkcijai (54). ZEA metabolizuojamas žarnų ląstelėse, jis hidroksilinamas į α-ZOL ir β-ZOL. ZEA paskatina IL-8 ir IL-10 sintezę, kuomet α- ir β-ZOL sumažina minėtų citokinų ekspresiją. Jo metabolitai sujungiami su gliukuronine ar sulfonine rūgštimi ir išskiriami su šlapimu (71). Įrodyta, kad Fusarium spp. grybų toksinai turi įtaką sekrecinių mucinų moduliavimui bei reikšmingų individo gleivinių imunitetui, į muciną panašių glikoproteinų sekrecijai (72).
Šis mikotoksinas pasižymi genotoksiniu ir citotoksiniu poveikiu in vitro. ZEA sukelia ROS kaupimąsi mitochondrijose bei skatina lipidų peroksidaciją, netiesiogiai sukeldamas DNR oksidacinius pažeidimus (73). Dėl suintensyvėjusios lipidų peroksidacijos pažeidžiama ląstelių membranų funkcija ir sumažinamas jų pralaidumas. Todėl sukeliami fermentų ir su ląstelės membrana susijungusių receptorių aktyvumo pokyčiai (74).
Didesnės nei 60 µM toksino koncentracijos gali sukelti steroidogenezės ir ovuliacijos procesams svarbių folikulų granuliocitinių ląstelių apoptozę ir nekrozę (75). Kiaulės yra ypatingai jautrios ZEA toksikozei, kuri pasireiškia vulvos patinimu, paraudimu ar netgi prolapsu, mikotoksinas sukelia kiaušidžių folikulų pažeidimus bei abortus (76). Veikiamos didelių ZEA koncentracijų (5-250 mg/kg pašaro ar 200-1000 µg/kg KM per dieną) kiaulės suserga lytinių takų lėtiniu uždegimu (77). Mažos ZEA koncentracijos imituoja hormono estrogeno poveikį, sukeldamos priešlaikinį pieno liaukų ir lytinių organų subrendimą. Didesnės ZEA koncentracijos trikdo apvaisinimą, ovuliaciją, embriono implantavimą, vaisiaus vystymąsi ir turi neigiamą poveikį naujagimių gyvybingumui (78).
ZEA susilpnina jungiančių proteinų ekspresiją žarnose, pažeisdamas jų gaurelių struktūrą (79). Žarnų audinių pažeidimai pasireiškia kriptų deformacija ir gleivinės erozija, o lamina propria ir pogleivinėje susiformuoja transmuraliai plintantys uždegiminių ląstelių židiniai (80). Didesnės nei 2,0 mg ZEA/kg koncentracijos skatina blužnies baltosios pulpos atrofiją ir raudonosios pulpos edemą (81).
17 Gajęcka M. ir kt. (2016) atliktame tyrime, ZEA (40 µg/kg KM) kontaminuotu pašaru šertų paršų kraujyje nenustatyti reikšmingi RBC kiekio, MCH ir MCHC skirtumai tarp grupių (82). Yang L. ir kt. (2016) nustatė koreliaciją tarp ZEA koncentracijos ir MCH - didėjant mikotoksino kiekiui MCH mažėja tiesiškai (P<0.05) (83). Kitų šaltinių duomenimis, netgi mažos ZEA koncentracijos pašaruose sukelia eriptozę, nes mikotoksinas skatindamas Ca2+ išlaisvinimą citozolyje, sukelia ląstelės membranos hiperpoliarizaciją ir osmotinį potencialą turinčių Cl- ir KCl praradimą, o tai sąlygoja eritrocitų tūrio sumažėjimą. Pažeisti eritrocitai greitai pašalinami iš kraujo apytakos, tačiau esant suaktyvėjusiai eriptozei išryškėja anemija (84).
Nujunkytų paršelių kraujyje, šertų pašarais, kuriuose ZEA koncentracija 2,0 mg ar daugiau/kg pašaro, nustatytas mažesnis HCT palyginus su kontroline grupe. Taip pat pastebėta, kad didėjant ZEA koncentracijai pašaruose, HCT mažėjo tiesiškai (P<0.05). Tokia pati koreliacija nustatyta ir tarp leukocitų, limfocitų ir mikotoksino koncentracijos (P<0.05). Tame pačiame tyrime bandomojoje grupėje leukocitų ir limfocitų kiekis paršelių kraujyje buvo mažesnis negu kontrolinės grupės (83). Gajęcka M. ir kt. (2016) atliktame tyrime nustatyta leukocitų mažėjimo tendencija, tačiau WBC kiekio pakitimai stebėti pirmoje tyrimo dalyje (82). Tokie pastebėjimai netiesiogiai rodo pirminį vietinį (pvz. gastrointestinalinio trakto) (85) ir antrinį sisteminį imuniteto stimuliavimą (84). Literatūroje rašoma, kad mažos ZEA koncentracijos stimuliuoja vietinę imuninę sistemą, Przybylska-Gornowicz B. ir kt. (2015) atliktuose tyrimuose nustatė limfocitų pagausėjimą žarnų gaurelių epitelyje ir plazmocitų infiltratus lamina propria. (56). Gajęcka M. ir kt. (2016) tyrimų duomenimis ZEA skatina eozinofilų proliferaciją, todėl yra alergizuojančiu agentu (82). Atliktuose tyrimuose nustatyta, kad ZEA kontaminuotų (1,1 mg ar daugiau ZEA/kg pašaro) pašarų šėrimas sumažino trombocitų kiekį nujunkytų paršelių kraujyje (83).
Lenkų mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu prieš nujunkytų paršelių šėrimą suduodavo skirtingų ZEA koncentracijų (5 µg/kg KM; 10 µg/kg KM; 15 µg/kg KM) gelines kapsules ir nustatė ALT aktyvumo sumažėjimą, kuris didėjo augant ZEA koncentracijai (86). Gajęcka M. ir kt. (2015) taip pat pastebėjo ALT aktyvumo mažėjimo tendenciją, tačiau kaip ir prieš tai minėto tyrimo metu, fermento aktyvumas bandomojoje grupėje išliko didesnis negu kontrolinėje grupėje (82). Ekspozicijos pradžioje mikotoksinai eliminuojami žarnų epitelio lygmenyje, todėl ALT aktyvumui būdinga mažėjimo tendencija, vis dėlto fermento aktyvumas didesnis bandomosios grupės nujunkytų paršelių kraujo serume. Taip pat nustatytas kito fermento – AST tolygiai didėjantis aktyvumas, kuris priešingai ALT aktyvumui, bandomosios grupės nujunkytų paršelių kraujo serume išliko mažesnis negu kontrolinės grupės beveik viso bandymo laikotarpiu (86). Tolygus ALT ir AST verčių mažėjimas rodo uždegiminio proceso silpnėjimą kepenyse ir eksperimentinės grupės tiriamųjų kepenų funkcijos laipsnišką atstatymą palyginus su kontroline grupe (87).
18 Literatūroje rašoma, kad ZEA mažina gliukozės kiekį kraujyje (86). ZEA, kaip ir DON konvertuojamas į glikozilo darinius. Plonojoje žarnoje, ypač kaudalinėje dvylikapirštės dalyje ir tuščiojoje žarnoje asimiliuojama 80-90 proc. ZEA, šio proceso metu sunaudojama daug energijos, tai paaiškina kontaminuotais ZEA pašarais šertų nujunkytų paršelių kraujo gliukozės sumažėjimą (82).
ZEA (40 µg/kg KM) kontaminuotais pašarais šertų nujunkytų paršelių kraujyje nustatytos didesnės palyginus su kontroline grupe TP koncentracijos bei rodiklio didėjimo tendencija (82). Tai aiškinama stimuliuojančiu ZEA ir jo metabolitų, į augimo promotorių panašiu poveikiu. Dėl to padidėja kūno masės prieaugis, susilpnėja uždegiminiai procesai kepenyse (stebimas ALT aktyvumo sumažėjimas) bei padidėja bendrųjų baltymų kiekis kraujo serume (88).
Minėtame Rykaczewska A. ir kt. (2018) tyrime su gelinėmis kapsulėmis, bandomojoje grupėje nustatytos labai mažos BUN koncentracijos, kurios nesiekė fiziologinių normos ribų (86). Kitų mokslininkų teigimu mikotoksinas padidina BUN koncentraciją, tačiau tyrimuose buvo naudoti dideli ZEA kiekiai (0.3, 48.5, 97.6 ir 146.0 mg/kg KM) (89). Gajęcka M. ir kt. (2016) atliktame tyrime abiejose grupėse BUN ir UREA koncentracijos buvo panašios (82), o minėtame Rykaczewska A. ir kt. (2018) tyrime UREA koncentracijos buvo didesnės bandomosiose grupėse. Tai reiškia, kad naudojami pašarai buvo turtingi baltymais ir inkstų funkcija nesutrikusi (86). Kitais tyrimais nustatyta, kad per 18 dienų 41-316 µg ZEA /kg kontaminuoto pašaro naudojimas nujunkytų paršelių šėrimui neturėjo įtakos organizmo metabolizmo rodikliams (90).
Kontaminuotais 2,0 mg ar daugiau ZEA/kg pašarais šertų nujunkytų paršelių kraujo serume nustatytas IgG titro sumažėjimas, tačiau mikotoksino įtaka IgA ir IgM koncentracijoms nepastebėta (83).
Anot Marin D.E. ir kt. (2013) ZEA neturi įtakos kūno masės priesvoriui ar pašaro sunaudojimui (90). Nesubrendusiuose audiniuose bei sveikame virškinimo trakte vyrauja aktyvios ląstelės, kurios metabolizuoja baltymus (91). Kai metaboliniai procesai suintensyvėja, endogeninės ar egzogeninės, estrogeninių savybių turinčios medžiagos stimuliuoja ląstelių proliferaciją, o su pašaru į paršelių organizmą patekęs ZEA tiesioginiu būdu sąveikauja su žarnų gleivine (85). Būtent todėl bandomosios grupės paršelių augimo tempas žymiai didesnis negu kontrolinės (86).
1.2.4. T-2 toksinas
T-2 miktoksinas gaminamas Fusarium spp. grybų, aptinkamas visame pasaulyje, tačiau vyrauja tropiniuose ir subtropiniuose regionuose (92).Šis trichotecenas labiausiai pažeidžia kepenis, žarnyną ir limfinius organus (93).
T-2 toksinas sukelia įvairių ląstelių apoptozę in vitro (94). Apoptozę inicijuoja ląstelių biomolekulių oksidaciniai pažeidimai (30). T-2 toksinas trikdo metabolizmui kertinių enzimų (pvz.: sukcinato dehidrogenazės) veiklą, nuosekliai pažeisdamas ląstelės energetiką, slopindamas sukcinato, malato ir piruvato molekulių oksidaciją ir proteinų sintezę mitochondrijose (95).
19 Mikotoksinas neigiamai veikia organizmą proteinų lygmenyje, trikdo RNR ir DNR sintezės procesus (96). Šis slopinimas labiausiai išreikštas aktyviai proliferuojančiose odos, virškinimo trakto, kaulų čiulpų ir skydliaukės ląstelėse. Stiprų proteinų ir DNR sintezės slopinimą lemia T-2 toksino tiolo grupė (95). Trichotecenų veikimo mechanizmas pagrįstas toksino sąveika su subląstelinėmis struktūromis, dėl kurios pakinta mitochondrijų šiurkštaus endoplazminio tinklo ir kitų membranų morfologija (94). Pagrindinis T-2 toksino taikinys yra ribosomų 60S subvienetas, T-2 toksinas jungiasi ir inaktyvuoja peptidil-transferazę transkripcijos vietoje (97).
Hemotoksinis T-2 toksino poveikis pasireiškia imuninės sistemos pažeidimu (98). T-2 toksinas gali ir stimuliuoti, ir slopinti imunines funkcijas (99). Mažos toksino koncentracijos sukelia pro-uždegiminių genų ekspresiją mRNR ir proteinų lygmenyje, kuomet didelės - skatina leukocitų apoptozę (97). Tyrimais įrodyta, kad lėtinė ekspozicija mažoms T-2 toksino koncentracijoms turi įtaką T ląstelių atminčiai bei neigiamą poveikį humoraliniam B limfocitų ir antriniam imuniniam atsakui kiaulių organizme (96). Skatindamas aktino reorganizaciją ir ląstelės membranos raukšlėjimąsi T-2 toksinas sustiprina makrofagų fagocitinę funkciją (94). Mažos T-2 toksino koncentracijos moduliuoja TLR aktyvavimą, trikdydamos patogenų atpažinimą ir tuo pačiu uždegiminio atsako prieš bakterijas ir virusus inicijavimą (100).
T-2 toksinis poveikis kiaulėms pasireiškia alimentinės toksinės aleukijos forma, kurios simptomai - vėmimas, diarėja, leukopenija, hemoragijos, gali ištikti šokas ir mirtis. T-2 toksinui būdingas serozinis-hemoraginis nekrotinis-opinis virškinimo trakto uždegimas, audinių nekrozė knyslės, lūpų ir liežuvio srityje, skrandžio gleivinės edema ir gleivėtos apnašos, galvos srities patinimas, ypatingai apie gerklas ir akių vokus, rečiau parezė ir paralyžius (101).
Ūmi toksikozė apibūdinama kepenų serozos, žarnų, skrandžio ir stemplės daugybinėmis hemoragijomis, kraujingu eksudatu žarnose ir pilvo ertmėje (102). Ekspozicija T-2 toksinui sukelia skrandžio liaukų žiočių ir kaklelio ląstelių nekrozę, žarnose nustatyta pogleivinės edema ir kriptų epitelinių ląstelių nekrozė, labiausiai pažeista gaubtinė žarna. Žarnų kriptų, lamina propria limfoidinėse ląstelėse ir klubinės žarnos Pejerio ląstelių sankaupose nustatyti apoptotiniai kūneliai, būtent todėl galima manyti, kad pagrindinis T-2 mikotoksino veikimo mechanizmas sukeliantis žarnų pažeidimus yra apoptozė (103). T-2 toksinu kontaminuotų pašarų naudojimas paršų racione slopina kiaušidžių veiklą, sukelia jų histologinę degeneraciją ir atrofiją (102).
T-2 toksinas sąlygoja leukopeniją ir ląstelių išeikvojimą limfoidiniuose organuose, taip pat slopina eritropoezę kaulų čiulpuose ir blužnyje bei mažindamas limfocitų proliferacinį atsaką ir trikdydamas dendritinių ląstelių vystymąsi slopina antikūnų gamybą (96).
Dėl pašarų kontaminuotų T-2 toksinu naudojimo šėrimui sumažėja raudonųjų kraujo kūnelių kiekis (104). Kitame tyrime, per dvi savaites kontaminuotu 2 mg T-2 toksinu/kg pašaru šertų triušių kraujyje nustatytas didesnis eritrocitų kiekis negu kontrolinėje grupėje (105). Literatūroje rašoma,
20 kad 2-3 mg/kg pašaro T-2 toksinu kontaminuoto pašaro naudojimas mažina MCV (104), tačiau minėtame tyrime su triušiais nustatytas MCV padidėjimas palyginus su kontroline grupe (105). Parenterinis T-2 toksino administravimas jūrų kiaulytėms sąlygojo padidėjusį, o ilgainiui sumažėjusį hematokritą (106). Kitais tyrimais taip pat nustatyta, kad 10 mg T-2 toksino /kg KM pelių kraujyje sumažino HCT ir HGB koncentraciją (107).
Pašarų kontaminuotų T-2 toksinu šėrimas patikimai sumažino T limfocitų kiekį (104). Taip pat kitų šaltinių duomenimis T-2 toksinas sukelia leukopeniją (98). Pavienė T-2 toksino (0.6- 4.8 mg/kg) intraveninė injekcija kiaulėms sukėlė leukocitozę, o ilgainiui leukopeniją, tačiau parenterinis T-2 toksino administravimas jūrų kiaulytėms sąlygojo tik leukocitozę. Taip pat beždžionėms po pavienės T-2 toksino (LD20) injekcijos užfiksuota trumpalaikė leukocitozė (106). Per 28 dienas kontaminuotu 1324 ar 2102 µg T-2/kg pašaru šertiems nujunkytiems paršeliams limfoidinių organų ląstelių išeikvojimas nenustatytas, tai koreliuoja su nepakitusiomis leukocitų vertėmis (93).
T-2 toksinas sukelia trombocitopeniją. Žmonėms nustatytos progresuojančios kraujo koaguliacijos problemos, sumažėjęs rezistentiškumas infekcijoms, dėl to T-2 toksikozei būdingos masyvios hemoragijos ir septicemija (98). Parenterinis T-2 toksino administravimas jūrų kiaulytėms sąlygojo trombocitų agregacijos nusilpimą ir PLT kiekio sumažėjimą. Pailgėjęs protrombino laikas ir sumažėjęs koaguliacijos faktorių kiekis užfiksuotas beždžionėms po pavienės T-2 toksino (LD20) injekcijos (106).
Per 28 dienas kontaminuotu 1324 ar 2102 µg T-2/kg pašaru šertų nujunkytų paršelių kraujo serume GLU, TP koncentracijos bei ALT, AST, ALP aktyvumo pokyčių nenustatyta. Nepakitęs transaminazių ir ALP aktyvumas atspindėjo gerą kepenų histologinę būklę (93).
2102 µg T-2/kg kontaminuoto pašaro naudojimas nujunkytų paršelių racione IgG ir IgM koncentracijoms kraujo serume įtakos neturėjo, tačiau per 7 dienas stebėta padidėjusi IgA koncentracija (p<0,05) (93). Literatūroje rašoma, kad T-2 toksinas slopina antikūnų gamybą (109).
Dėl lėtinės intoksikacijos mažomis T-2 toksino koncentracijomis, stebimas sulėtėjęs augimas, sumažėjęs priesvoris ir pašarų sunaudojimas (97). Meissonnier G.M. ir kt. (2008) atliktame tyrime (2102 µg T-2/kg pašaro), nujunkytų paršelių priesvoris buvo sumažėjęs, jis siekė 87 proc. kontrolinės grupės paršelių priesvorio, tai buvo vienintelis šio tyrimo metu užfiksuotas klinikinis simptomas, mažesnės mikotoksinų koncentracijos priesvoriui įtakos neturėjo (93).
1.2.5. Ochratoksinas A (OTA)
Ochratoksinas A (OTA) tai antrinis metabolitas gaminamas vienuolikos Aspergillus spp. ir dešimties Penicillium spp. grybų rūšių, šiuo metu manoma, kad pagrindiniais OTA gamintojais yra
Penicillium verrucosum, dažniausiai aptinkamas vidutinio klimato zonoje bei Aspergillus ochraceus
21 Patekęs per os OTA greitai absorbuojamas ir išskiriamas per inkstus. Kiaulių organizme žarnose absorbuojama 66 proc., triušių 56 proc., o broilerių 40 proc. viso suvartoto OTA (110). Šis mikotoksinas gali būti suskaidytas enzimų ir žarnyno mikrofloros (111). Ilgalaikė lėtinė ekspozicija mikotoksinui turi didesnę įtaką sveikatingumui nei pavienės didelės OTA koncentracijos (112). Tyrimai įrodo, kad 30 dienų trunkanti nujunkytų paršelių ekspozicija mažoms OTA koncentracijoms, sąlygojo toksino susikaupimą inkstuose ir žarnyne, koncentracija dvylikapirštėje žarnoje buvo didesnė negu inkstuose (113).
Mokslinėje literatūroje rašoma, kad OTA sukeldamas oksidacinį stresą limfocituose pažeidžia imuninės sistemos funkciją, paveikia ir ląstelinį, ir humoralinį imunitetą (114). Lengva ochratoksikozė sukelia latėntinę sisteminę uždegiminę reakciją (115).
Ochratoksikozės metaboliniai sutrikimai siejami su mitochondriniu kvėpavimu dėl fosforo transporterių disfunkcijos mitochondrijų membranose bei ATP-azės aktyvumo sutrikimo vidinėse organelės membranose (116). Sukeliamas taip pat konkurencinis sukcinato dehidrogenazės ir citochromo C oksidazės bei Krebso ciklo fermentų aktyvumo slopinimas ir ATP produkcijos sumažėjimas. Patogeninis poveikis pasireiškia ir sudarančių ląstelių membranas, neprisotintų riebalų rūgščių peroksidacija. Ląstelės membraninių struktūrų pažeidimas ir padidėjęs pralaidumas sukelia kalcio homeostazės sutrikimus, todėl padidėja laisvo kalcio citoplazmoje, aktyvuojami fermentai ir pažeidžiamos ląstelės bei audiniai. Apsinuodijimas mikotoksinu skatina laisvųjų radikalų susidarymą, pastarieji pažeidžia plazmines membranas, DNR, RNR ir mitochondrijas (117).
OTA siejamas su kiaulių ir paukščių nefropatijomis bei laikomas viena pagridinių etiologinių lėtinių ir ūminių inkstų ligų priežastimi (118). Vidutinės OTA koncentracijos pašare sukeliančios mikotoksikozinę nefropatiją tai 200 µg/kg (108). Nefrotokisinis poveikis siejamas su atsakingo už organinių anijonų transportą mechanizmo, esančio inkstų proksimalinių kanalėlių epitelinių ląstelių šepetiniame paviršiuje pažeidimu, kuris pasireiškia poliurija ir biocheminių bei morfologinių kraujo rodiklių pakitimais (119). Stebima gliukozurija, proteinurija bei enzimurija, gliukozurija ir proteinurija sukeliama dėl sutrikusios reabsorbcijos proksimaliniuose inkstų kanalėliuose (120).
Mikotoksinų sukelta nefropatija makroskopiškai apibūdinama pilkai-baltais židiniais inkstų paviršiuje (121), o mikroskopiškai degeneraciniais proksimalinių kanalėlių epitelinių ląstelių pakitimais ir intersticinio audinio fibroze (108).
Anot Bernardini C. ir kt. (2014) dėl OTA(18±34 ng/g) kontaminuotų pašarų naudojimo reikšmingai sumažėjo serumo baltymų koncentracija, tačiau kiti kraujo rodikliai nepakito (115). Kiti šaltiniai taip pat nurodo kraujo serumo bendrųjų baltymų ir albuminų sumažėjimą (121). Literatūroje rašoma, kad hepatotoksiniai OTA pažeidimai pasireiškia sumažėjusia globulinų (122), bendrųjų baltymų ir albuminų koncentracija bei sumažėjusiu GGT ir cholinesterazės aktyvumu kraujo serume (123). Baltymų sumažėjimas gali būti susijęs su susilpnėjusia kepenų funkcija sintetinti proteinus,
22 nors AST ir ALT aktyvumas nepakito (115). Kiti šaltiniai rašo apie AST, ALT aktyvumo, AST ir ALT santykio bei ALP aktyvumo padidėjimą dėl mikotoksino poveikio (121).
Stoev S.D. ir kt. (2012) atliktame tyrime, 0,5 ppm OTA kontaminuotais pašarais šertų nujunkytų paršelių kraujyje nustatytas gliukozės sumažėjimas (122). Mokslinėje literatūroje rašoma, kad mikotoksinas gali lėtinti gliukozės ir insulino metabolizmą, sukeliant glikogeno kaupimąsi kepenyse (116).
OTA (0,8 mg/kg OTA) kontaminuotais pašarais šertų nujunkytų paršelių kraujyje nustatytas BUN koncentracijos (P<0,05) padidėjimas (121). Kituose šaltiniuose rašoma, kad intoksikacija mažomis OTA koncentracijomis (0,050 mg/kg) neturi įtakos BUN ir UREA kiekiui kraujo serume (110). Anot Stoev S.D. ir kt. (2012) OTA sukelia CREA koncentracijos padidėjimą (121).
OTA slopina kiaulių augimą. Literatūroje rašoma, kad OTA (181±34 ng/g) kontaminuotų pašarų naudojimas kiaulių priesvoriui įtakos neturi, nors OTA kiekis kraujo plazmoje, kepenyse ir inkstuose statistiškai reikšmingai (P<0,001) padidėjo (115). Anot kitų autorių, 4,0 mg OTA/kg arba 0,8 mg OTA/kg kontaminuotais pašarais šertų nujunkytų paršelių kūno masė, priesvoris ir pašarų sunaudojimas mažesnis (P<0,05) negu kontrolinės grupės (122).
1.3. Detoksikacija
Mikotoksinus bandyta eliminuoti įvairiais fiziniais, cheminiais ir biologiniais metodais. Dauguma mikotoksinų atsparūs aukštai temperatūrai ir sudaro toksinius skilimo produktus. Nors žinoma daug detoksikacijos metodų, tačiau praktikoje naudojami tik keli (124).
1.3.1. Fiziniai metodai
Grūdų džiovinimo, švitinimo UV spinduliais ar plovimo siekis sumažinti mikotoksinų koncentraciją žaliavoje po derliaus nuėmimo (125). Literatūroje rašoma, kad kavos pupelių džiovinimas (100-180 °F 6-48 val.) suredukuoja vandens kiekį <20 proc. masės, dėl to slopinamas grybų augimas ir netiesiogiai mažinama mikotoksinų koncentracija. Džiovinant galima palaikyti AF, OT, FUM ir DON koncentracijas žemesnes nei 20 ppb, 5 ppb, 5 ppm ir 5 ppm atitinkamai (126).
Švitinimo vidutinėmis ir ilgosiomis A ir B ultravioletinėmis bangomis veiksmingumas įrodytas detoksikuojant AF kietuose maisto produktuose (127). AFB1 suskaidomas panaudojant UV spindulius, tačiau metodo efektyvumas priklauso nuo švitinimo sąlygų (128). UV spinduliai veiksmingai nukenksmina taip pat OTA užterštą paukščių pašarą, švitinimas 60 min. gali sumažinti OTA lygį (500 µg/kg) iki leistinos 100 µg/kg ribos, tuo tarpu naudojant saulės spinduliuotę detoksikacijos laikas pailgėja iki 8 val. (129).
Kitas fizinis separacijos metodas, pagrįstas savitojo svorio skirtumu tarp mikotoksinais kontaminuotų ir nekontaminuotų grūdų yra plovimas, kuomet dalis grūdų su didesniu mikotoksinų
23 kiekiu pašalinama. Aprašyta optimizuota plovimo technika, kuri pašalino daugiau nei 80 proc. AF, netenkant mažiau nei 15 proc. kontaminuotų kukurūzų (125).
1.3.2. Cheminiai metodai
Cheminei detoksikacijai naudojami šarmai, rūgštys, oksiduojantys agentai, aldehidai, bisulfito dujos, jie pažeidžia mikotoksinų struktūrą ir bioprieinamumą (130). Naudojami oksiduojantys agentai, tokie kaip ozonas ir vandenilio peroksidas. Patulinas, ZEA ir AFB1, AFB2, AFG1 ir AFG2 veiksmingai suskaidomi ozono (131). Kiti tyrimai taip pat įrodė, kad ozonas sėkmingai suardo DON, ZEA ir AF bei sumažina bendrą grybų kiekį (132). Rašoma, kad OTA gali būti suskaidytas keletos organinių rūgščių (133), o grūdų amonizacija ne tik sumažina mikotoksinų (AF, FUM, OTA) kiekį iki neaptinkamų koncentracijų, bet taip pat slopina mikotoksigeninių grybų augimą (134). Taip pat potencijuotas glicerolis veikia detoksikuojančiai, jis gaunamas maišant glicerolį ir kalcio hidroksidą (130).
1.3.3. Biologiniai metodai
Adsorbentų, pagamintų iš mikroorganizmų, pagrindinai mielių, pienarūgščių bakterijų ir
Aspergilli konidijų ląstelių sienelių komponentų (135), detoksikacijos mechanizmas pagrįstas ne
mikotoksinų katabolizmu gyvuose mikroorganizmuose, bet fizine adsorbcija, kurią palengvina inaktyvuotų ląstelių sienelės. Vandenilinėmis jungtimis, joninėmis ir hidrofobinėmis sąveikomis mikotoksinai jungiasi su sienelių polisacharidais, proteinais ir lipidais (136).
Ištirta sąveika tarp pienarūgščių bakterijų padermių ir tokių mikotoksinų kaip AF, ZEA, OTA, patulinas. Bacillus licheniformis NRRL B-50504 ir B-50506 bei B. subtilis NRRL B50505 ir B-50507 sumažino DON kiekį pašare 46-100 proc. po 48 val. poveikio 37℃ temp., taip apribojant žalingą DON poveikį kiaulėms (137). Brevibacterium rūšys skaido OTA hidrolizuodamos jo amido jungtį (138).
Lactobacillus, Bifisobacterium ir Lactococcus padermės adsorbuoja AFB1. Tirtos padermės
turėjo skirtingas adsorbcines gebas nuo 5.6 iki 59.7 proc. (139). Lactobacillus taip pat veiksminga prieš ZEA ir jo darinį α-ZOL. Inaktyvuotų bakterijų panaudojimas minėtų toksinų pašalinimui įrodo, kad detoksikacijos mechanizmas pagrįstas adsorbcija, o ne metaboliniais procesais, todėl nukenksminimas priklauso nuo bakterijų paviršiaus ypatumų (140). Vyno pienarūgštės bakterijos adsorbuoja OTA 8-28 proc. veiksmingumu (141). Niderkorn V. ir kt. (2009) ištyrė in vitro sąveika tarp pienarūgščių bakterijų ir fumonizinų, įvertintas 29 pienarūgščių bakterijų padermių veiksmingumas šalinant FB1 ir FB2. Nustatyta, kad daugelis padermių surišo abu toksinus, o sąveiką tarp pienarūgščių bakterijų ir fumonizinų įgaliojo ląstelių sienos peptidoglikano struktūra (142).
Drėgnų grūdų žlaugtų, džiovintų grūdų žlaugtų bei džiovintų grūdų žlaugtų ir sunkos mielių biomasė taip pat veiksmingai nukenksmina įvairius mikotoksinus (143).
24
Pichia anomala gaminamas 2-feniletanolis slopina Aspergillus flavus AFB1 sintezę, minėtas junginys pažeidžia patogeninių grybų genų ekspresiją, todėl stabdomas jų augimas (144).
Saccharomyces cerevisiaeis laikomas labiausiai efektyviu mikroorganizmu adsorbuojančiu AFB1 (145). S. cerevisiae naudojamas ZEA pašalinimui, adsorbcijos vieta siejama su polisacharidais mielių ląstelių sienelėse, ypatingai šarmuose ekstrahuojamais β-D-gliukanais (146). Kitos mielių rūšys
Candida spp., Kloeckera spp., Pichia spp., Schizosaccharomyces spp ir Rhodotorula spp. taip pat
adsorbuoja OTA ir patuliną (147). Literatūroje rašoma, kad inaktyvuotų mielių panaudojimas mikotoksinų adsorbcijai visada veiksmingesnis nei aktyvių ląstelių (148).
Pelėsiniai grybai kaip Aspergillus spp., Rhizopus spp. ir Penicillium spp. taip pat turi mikotoksinus detoksikuojančių savybių. Clonostachysrosea spp. gamina zearalenono laktonohidrolazę, inhibuodamas kitų grybų augimuą ZEA užterštose terpėse, todėl naudojama javų užterštumo kontrolės programose (149).
Idealu, kai mikotoksinų adsorbentai geba adsorbuoti daugelį mikotoksinų arba veiksmingai rišti specifinius mikotoksinus, turi didelę adsorbcinę gebą bei nedaro įtakos mineralų, vitaminų, amino rūgščių absorbicjai, o struktūra primena pašaro komponentus, todėl yra gerai organizmo toleruojami (150).
25
2. TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGOS
2.1. Tyrimo atlikimo vieta, laikas, sąlygos
Tyrimas atliktas X mėsinių kiaulių ūkyje. Bandymo trukmė 100 parų –nuo 2017.06.30 iki 2017.10.07. Tyrimui naudoti nujunkyti 4 savaičių amžiaus Lenkijos baltosios nulėpausės ir Lenkijos didžiosios baltosios veislių paršeliai, kurių pradinis svoris 9.56±0.17 kg. Paršeliai suskirstyti į dvi grupes – bandomąją ir kontrolinę. Bandomojoje grupėje buvo 65 paršeliai, kontrolinėje – 67 paršeliai. Jie laikyti uždaruose garduose su vandens prieiga ad libitum. Tyrimas truko nuo paršelių nujunkymo 4 savaičių amžiaus iki II penėjimo laikotarpio pradžios, kai penimos kiaulės pasiekė 4 mėnesių amžių. Kiaulių laikymo patalpų mikroklimato reikalavimai atitiko rekomenduojamas normas. Kontrolinės grupės pašarų sudėtis pateikta 1 lentelėje. Bandomosios grupės nujunkytų paršelių racionas buvo toks kaip kontrolinės, tik papildytas Alltech Mycosorb A+ preparatu (2 kg/t pašaro). Jo pagrindą sudaro
Saccharomyces cerevisiae mielių padermė, auginama sąlygose, kurios užtikrina tam tikrų
angliavandenių formavimąsi ant ląstelių sienelių. Sudėtyje randama ir heterotrofinių dumblių, kurie taip pat gamina angliavandenius, galinčius adsorbuoti mikotoksinus.
Atlikti pašarų užterštumo mikotoksinais tyrimai, paršelių kraujo biocheminiai, imunologiniai, morfologiniai tyrimai, atlikti gaišenų skrodimai, vertintas priesvoris ir pašarų sunaudojimas.Tyrimo schema pristatyta 1 paveiksle.
1 lentelė. Kontrolinės grupės pašarų sudėtis skirtingomis tyrimo savaitėmis
Pašaro komponentas
Pašaro komponento kiekis procentais
1-2 sav. 3-4 sav 5-6 sav. 7-14 sav.
Miežiai 37,5 35,0 24,5 50,0 Kviečiai 37,5 34,5 50,0 - Kvietrugiai - - - 31,0 Soja - 20,0 20,0 15,0 Pašarinis aliejus - - 1,0 1,0 Prekren Forte 25,0 - - - Suggi - 10,0 - - Ferkelgold Forte - - 4,0 - Aminogold - - - 3,0 SanoCid - 0,5 0,5 -
26 1 pav. Tyrimo schema
Tyrimai atlikti laikantis RP galiojančių teisės aktų:
Ustawa z dnia 21 stycznia 2005 roku o doświadczeniach na zwierzętach. Dz.U. Nr 05.33.289. Ustawa z dnia 15 stycznia 2015 roku o ochronie zwierząt do celów naukowych lub edukacyjnych. Dz. U. 2015 poz. 266.
Ustawa z dnia 21 sierpnia 1997 roku o ochronie zwierząt. Dz.U. 1997 Nr 111 poz. 724.
Ustawa z dnia 21 grudnia 1990 roku o zawodzie lekarza weterynarii i izbach lekarsko-weterynaryjnych. Dz.U. Nr. 02.187.1567.
2.2. Mikotoksinų koncentracijos pašaruose tyrimo metodika
Kiekvieną kartą keičiant racioną pašaras buvo ištirtas AFB1, DON, ZEA, T-2 ir OTA atžvilgiu. Mikotoksinų koncentracijos tiriamuosiuose mėginiuose buvo nustatytos taikant plonasluoksnės chromatografijos metodą pagal Romer Labs. Inc (Austrija) metodikas.
Tiriamieji mėginiai užpilami 84/16 acetonitrilo/vandens mišiniu, kuris perfiltruojamas per popierinį filtrą. Gautas ekstraktas valomas valymo kolonėlėse. OTA ekstraktas prieš tai rūgštinamas 1 proc. acto rūgštimi. Išvalytas ekstraktas perkeliama į mėgintuvėlį ir išgarinama panaudojant Romer® Evap sistemą. Ekstrakto nuosėdos ištirpinamos atitinkamose judančios fazės tirpikliuose. PSCh autospoteriu užnešamas standartas ir tiriamasis mėginys ant chromatografinės plokštelės 60ºC temperatūroje. Siekiant išryškinti rezultatus plokštelės įmerkiamos į organinių tirpiklių mišinio
27 voneles. Papildomai DON plokštelė apipurškiama 15 proc. aliuminio chloridu metanolyje, o T-2 –10 proc. sieros rūgšties metanolyje. Plokštelės išdžiovinamos ore. Toksinų koncentracijos įvertinamos UV fone. AFB1 švyti mėlynai,kai Rf ≈ 0,45; DON mėlynai, kai Rf ≈ 0,5; ZEA žaliai kai Rf ≈ 0,9; T-2 mėlynai kai Rf≈0,5; OTA mėlynai-žaliai, kai Rf≈ 0,6. Aptikimo riba: AFB1 – 1 ppb; DON, ZEA, T-2, OTA – 10 ppb.
2.3. Kraujo tyrimų metodika
Kraujo mėginiai biocheminias tyrimams buvo imami tris kartus: tyrimo pradžioje, po 38 parų ir tyrimo pabaigoje, o imunologiniams ir morfologiniams tyrimams du kartus – po 38 parų ir tyrimo pabaigoje. Pirmą kartą paimta 10 mėginių, antrą ir trečią kartą po 15 mėginių biocheminiams ir morfologiniams kraujo tyrimams ir po 10 mėginių imunoglobulinų tyrimams iš abiejų grupių. Kraujas imtas iš paršelių v. jugularis. Tyrimo pradžioje naudota vacutainer sistema bei mėgintuvėliai su krešėjimą skatinančia geline terpe. Antrą ir trečią kartą kraujas imtas vienkartinėmis injekcinėmis adatomis ir perpiltas į vacutainer mėgintuvėlius su krešėjimą skatinančia geline terpe biocheminiams ir imunologiniams tyrimams bei su antikoaguliantu EDTA morfologiniams tyrimams. Mėginiai buvo transportuoti šaldytuve į NMRVI Vilniuje. Kraujo biocheminiai tyrimai atlikti pagal SDP 5.4.4.R.3: 2017 tyrimo metodiką. Serumo mėginiai supilami į kiuvetes arba 5, 5.5, 7, 7.5 ar 10 ml pirminius mėgintuvėlius ir laikomi +20 ℃ temperatūroje tamsoje iki tyrimo pradžios. Laboratorinė analizė atlikta naudojus COBAS INTEGRA 400 plius selekcinį analizatorių. Matuotos serumo ALT, AST, GGT, LDH, ALP, TP, BIL-D, CREA, UREA, GLU, ALB vertės. Rodikliai analizuoti absorbcinės fotometrijos matavimo principu.
Mėginiai imunologiniams kraujo tyrimams buvo transportuoti šaldytuve į LSMU VA Maisto saugos ir kokybės katedros Mikotoksikologijos laboratoriją. Tyrimai atlikti IgA (pig) ELISA Kit, mėginiai užšaldyti ir laikyti -20℃ temperatūroje iki tyrimų atlikimo. Serumas tirtas dvigubo antikūnų sumuštinio ELISA metodu. Metodo principas: IgA esantis mėginiuose reaguoja su anti-IgA antikūnais adsorbuotais polistireninių mikrotitro duobučių pavišiuje. Pašalinus neprisijungusius proteinus, pridedami anti-IgA antikūnai konjuguoti su krienų peroksidaze. Šie fermentu pažymėti antikūnai sudaro kompleksus su ankščiau prisijungusiais IgA. Atliekamas antras plovimas ir pridedant chromogeninio substrato 3,3‘,5,5‘ – tetrametilbenzidino (TMB) įvertinamas fermento prisijungimas. Prisijungusio fermento kiekis tiesiogiai proporcingas IgA koncentracijai tirtame serume. IgA koncentracija interpoliuojama pagal standartinę kreivę. Nustatoma kiekvieno šulinio turinio adsorbcija (450 nm). Plokštelių skaitytuvas kalibruojamas pagal gamyklos instruktažą.
Mėginiai morfologiniams tyrimams buvo transportuoti šaldytuve į veterinarinę laboratoriją „Wetalek“ Suvalkuose. Tyrimai atlikti BC-2800Vet hematologiniu analizatoriumi. Aparatas ląsteles skaičiuoja kompleksinės grandinės varžos, o hemoglobiną laisvo cianido principu.
28
2.4. Priesvorių ir pašarų sunaudojimo matavimo metodika
Kiekvienas paršelis buvo svertas tyrimo pradžioje, po 38 parų ir tyrimo pabaigoje. Sverta elektroninėmis svarstyklėmis ACS DY 618 L.
Tyrimo metu stebėtas pašarų sunaudojimas. Bandomąjai ir kontrolinei grupei pašarai buvo ruošiami atskirai. Bandomosios grupės gardų šėrimo įranga buvo atjungta nuo bendros šėrimo linijos. Kiekvieną kartą ruošiant pašarus skaičiuotas suvartotas žaliavų kiekis.
2.5. Statistinė analizė
Tyrimo duomenys apdoroti „SPSS Statistics 17.0“ statistiniu duomenų paketu ir „Microsoft Excel 2013“ programa. Apskaičiuoti duomenų aritmetiniai vidurkiai, vidurkių paklaidos, santykinis standartinis nuokrypis. Patikimumas (P) tarp grupių nustatytas naudojant T-testą. Skirtumai laikyti statistiškai reikšmingi, kai P<0,05.
29
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Mikotoksinų koncentracija pašaruose
Mikotoksinų koncentracijos pateiktos 2 lentelėje. Didžiausios mikotoksinų koncentracijos ištirtos pašaro mėginyje Nr. 1, mažiausios koncentracijos mėginyje Nr. 3. OTA ir T-2 toksinas mėginiuose buvo žemiau aptikimo ribos.
2 lentelė. Mikotoksinų koncentracijos pašaruose
Mėginys
Mikotoksinų koncentracija, µg/kg
AFB1 ZEA DON T-2 OTA
Nr. 1 3 150 100 <10¹ <1¹
Nr. 2 <1¹ 70 <10¹ <10¹ <1¹
Nr. 3 5 <10¹ <10¹ <10¹ <1¹
Nr. 4 6,7 <10¹ 50 <10¹ <1¹
¹Mikotoksinų koncentracijos nustatytos žemiau aptikimo ribos
3.2. Kraujo biocheminiai tyrimai
Bandomosios ir kontrolinės grupių nujunkytų paršelių biocheminių kraujo tyrimų rezultatai ir tirtų rodiklių normos pagal „BAYR MED LT 2000” pateiktos 1-3 prieduose.
ALT aktyvumo dinamika tyrimo eigoje pristatyta 2 paveiksle. Kontrolinėje grupėje ALT aktyvumo vidurkis tyrimo pabaigoje padidėjo 31,12 proc. palyginus su tyrimo 38-ta para (P<0,01), tyrimo pabaigoje rodiklis viršijo rekomenduojamas normos. ALT aktyvumo vidurkiai buvo didesni kontrolinėje grupėje palyginus su bandomąja viso tyrimo laikotarpiu. Bandomojoje grupėje ir tarp grupių patikimų ALT aktyvumo skirtumų tyrimo metu nenustatyta.
AST aktyvumo dinamika tyrimo eigoje pristatyta 3 paveiksle. Kontrolinėje grupėje AST koncentracijos vidurkis tyrimo pabaigoje sumažėjo 27,14 proc. palyginus su 38-ta tyrimo para (P<0,05). Bandomojoje grupėje AST aktyvumo vidurkis tyrimo pabaigoje sumažėjo 25,95 proc. palyginus su tyrimo pradžia (P<0,05). Abiejose grupėse rodiklis neviršijo normos ribų viso tyrimo metu. Pastebėta AST aktyvumo mažėjimo tendencija tiek kontrolinėje, tiek bandomojoje grupėje. Tarp grupių patikimų AST aktyvumo skirtumų tyrimo metu nenustatyta.
30
2 pav. Alanin amino transferazės (ALT) aktyvumo dinamika tyrimo eigoje
3 pav. Aspartat amino transferazės (AST) aktyvumo dinamika tyrimo eigoje
GGT aktyvumo dinamika tyrimo eigoje pristatyta 4 paveiksle. Kontrolinėje grupėje GGT aktyvumo vidurkis 38-tą tyrimo parą padidėjo 32,33 proc. (P<0,05), o tyrimo pabaigoje 35,47 proc. (P<0,001) palyginus su tyrimo pradžia. Fermento aktyvumas neviršijo rekomenduojamų normos ribų. Bandomojoje grupėje GGT aktyvumo vidurkis tyrimo pabaigoje padidėjo 33,68 proc. palyginus su 38-ta tyrimo para (P<0,05) ir 60,08 proc. palyginus su tyrimo pradžia (P<0,01). Tyrimo pabaigoje GGT aktyvumas viršijo rekomenduojamas normas. Pastebėta GGT aktyvumo didėjimo tendencija
31 tiek kontrolinėje, tiek bandomojoje grupėje. Tyrimo pabaigoje bandomosios grupės nujunkytų paršelių GGT aktyvumo vidurkis buvo 18,59 proc. didesnis nei kontrolinės grupės tiriamųjų (P<0,05).
4 pav. γ glutamil transferazės (GGT) aktyvumo dinamika tyrimo eigoje
CREA koncentracijos dinamika tyrimo eigoje pristatyta 5 paveiksle. Kontrolinėje grupėje CREA koncentracijos vidurkis tyrimo pabaigoje padidėjo 20,77 proc. palyginus su 38-ta tyrimo para (P<0,05). CREA koncentracijos vidurkiai buvo didesni kontrolinėje grupėje palyginus su bandomąja viso tyrimo trukmės laikotarpiu. Bandomojoje grupėje CREA koncentracijos vidurkis 38-tą tyrimo parą sumažėjo 15,67 proc. palyginus su tyrimo pradžia (P<0,05) ir tyrimo pabaigoje padidėjo 25,23 proc. palyginus su tyrimo 38-ta para (P<0,001). Abiejų grupių rodiklio vertės neviršijo fiziologinių normos ribų. Tarp grupių patikimų CREA koncentracijos skirtumų tyrimo metu nenustatyta.
32
5 pav. Kreatinino (CREA) koncentracijos dinamika tyrimo eigoje
LDH aktyvumo dinamika tyrimo eigoje pristatyta 6 paveiksle. Kontrolinėje grupėje nujunkytų paršelių LDH aktyvumo vidurkis 38-tą tyrimo parą sumažėjo 20,71 proc. (P<0,01), o 100-ąją parą 35,64 proc. (P<0,001) palyginus su tyrimo pradžia, taip pat tyrimo pabaigoje sumažėjo 18,84 proc. palyginus su 38-ta tyrimo para (P<0,001). LDH aktyvumo vidurkiai buvo didesni kontrolinėje grupėje palyginus su bandomąja. Bandomojoje grupėje LDH aktyvumo vidurkis 38-tą tyrimo parą sumažėjo 25,87 proc. palyginus su tyrimo pradžia (P<0,001), o 100-ąją parą – 20,97 proc. palyginus su 38-ta tyrimo para (P<0,001) ir 47,42 proc. palyginus su tyrimo pradžia (P<0,001). Abiejose grupėse fermento aktyvumas viršijo rekomenduojamas normos ribas viso tyrimo metu. Pastebėta LDH aktyvumo mažėjimo tendencija tiek kontrolinėje, tiek bandomojoje grupėje.
Tyrimo pabaigoje kontrolinės grupės LDH aktyvumo vidurkis buvo 9,86 proc. didesnis negu bandomosios grupės (P<0,01). Kuomet mikotoksinų koncentracija buvo didesnė (iki 38-tos tyrimo paros) LDH aktyvumo vidurkis buvo mažesnis bandomojoje grupėje nei kontrolinėje.
