NEUROHISTOCHEMINIO TYRIMO PANAUDOJIMAS DIAGNOZUOJANT HIRŠPRUNGO LIGĄ

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS ANATOMIJOS INSTITUTAS

NEUROHISTOCHEMINIO TYRIMO PANAUDOJIMAS DIAGNOZUOJANT

HIRŠPRUNGO LIGĄ

Medicinos vientisųjų studijų Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Doc. dr. Vytautas Vaičekauskas Darbą paruošė: Rita Skaistė Kužmarskytė

2

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI...8

1. LITERATŪROS APŽVALGA...9

1.1. Virškinamojo trakto anatomija ir histologija...9

1.2. Virškinamojo trakto inervacija...9

1.3. Hiršprungo liga...11

1.4. Neurohistocheminių tyrimų panaudojimas diagnostikoje...12

2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODIKA...14

2.1. Tyrimo medžiaga...14

2.2. Tiriamosios medžiagos paėmimas ir paruošimas...14

2.3. Preparatų mikroskopavimas...14

2.4. Nervinių skaidulų kiekio įvertinimas...15

3. REZULTATAI...16

3.1. Preparatų mikroskopavimas...16

3.2. Nervinių skaidulų kiekio įvertinimas...17

4. REZULTATŲ APTARIMAS...23

5. IŠVADOS...25

3

SANTRAUKA

Rita Skaistė Kužmarskytė. Baigiamasis magistro darbas „Neurohistocheminio tyrimo panaudojimas diagnozuojant Hiršprungo ligą“.

Šio darbo tikslas yra įtariant vaikams Hiršprungo ligą, panaudojant neurohistocheminį tyrimą, ją patvirtinti.

Darbo uždaviniai: įvertinti padarytus preparatus mikroskopuojant ir nustatyti ar yra matomi nerviniai mazgai tiriamajame storosios žarnos segmente. Taip pat įvertinti ar yra matomos acetilcholinesterazės pozityvios nervinės skaidulos gleivinėje ir aptikus šias nervines skaidulas suskaičiuoti jų tankumą tiriamajame preparate.

Medžiaga ir metodai: tyrimui rektoskopinės biopsijos metu paimti tiriamosios medžiagos ėminiai iš 7 vaikų, kuriems įtariama Hiršprungo liga. Paimta medžiaga greitai užšaldyta panaudojant skystą azotą. Laboratorijoje kriostato pagalba atlikti 15 µm storio pjūviai. Toliau medžiaga buvo dažoma, panaudojant AchE dažymą pagal A. L. Badawi ir E. A. Schenk metodiką. Preparatai buvo mikroskopuojami, lyginami su kontroline medžiaga ir vertinami esami pokyčiai. Atrinkti 52 preparatai, kuriuose matomi skersiniai storosios žarnos pjūviai. Juose buvo skaičiuojamas aptiktų nervinių skaidulų tankumas.

Rezultatai: preparatuose nustatyta, kad paveiktame storosios žarnos segmente, pogleivinėje nėra nervinių mazgų. Taip pat stebimas didelis kiekis AchE teigiamų nervinių skaidulų, kurios siekia gleivinę. Tyrimo metu suskaičiuotas šių nervinių skaidulų tankumas, tam tikrame preparato plote.

Išvados: atlikus tyrimą buvo stebimi ligos diagnozei būdingi histologiniai pokyčiai, todėl galima teigti, jog neurohistocheminis tyrimas yra patikimas ir vertingas patvirtinant Hiršprungo ligą vaikams.

4

SUMMURY

Rita Skaiste Kuzmarskyte. Master’s thesis: “The usage of neurohistochemical test in diagnosing Hirschsprung’s disease”.

The aim of this thesis is to diagnose children, who are suspected to have Hirschsprung’s disease, using neurohistochemical test.

The objects of the thesis: to evaluate made preparations with microscope and to determine whether or not the ganglia is visible in the segment of the large intestine that is under observation. Also, to evaluate whether or not the positive nerve fibers of acetylcholinesterase are seen in mucosa, and to count the density of these found nerve fibers in the preparation under investigation.

Material and methods: the samples for the research were taken by the means of rectal biopsy from 7 children, who are suspected to have Hirschsprung’s disease. The taken material was quickly frozen with liquid nitrogen. With the help of cryostat 15 µm thick cuts were made in the laboratory. Next, the material was painted using AchE colouring, according to A. L. Badawi and E. A. Schenk methods. Preparations were observed with microscope, compared with control material and current changes were evaluated. 52 preparations were selected where cross-sectional cuts of the large intestine are visible. There the density of found nerve fibers was counted.

Results: it was determined in the preparations that there are no ganglia in the affected segment of the large intestine, in it’s submucosa. Also, a large amount of AchE positive nerve fibers are under observation, which reaches mucosa. During the research the density of these nerve fibers was counted in the certain area of the preparation.

Conclusions: histological changes specific to diagnosis of the disease were observed after the research, therefore, it is possible to state that the neurohistochemical test is reliable and valuable in diagnosing Hirschsprung’s disease for children.

5

PADĖKA

Dėkoju šio darbo vadovui doc. dr. Vytautui Vaičekauskui už visapusišką pagalbą ir bendradarbiavimą atliekant šį mokslinį darbą. Taip pat dėkoju prof. dr. Dainiui Haroldui Paužai už galimybę dirbti Anatomijos instituto Elektroninės mikroskopijos laboratorijoje.

INTERESŲ KONFLIKTAS

BIOETIKOS CENTRO LEIDIMAS

6

SANTRUPOS

ENS – enterinė nervų sistema HL – Hiršprungo liga

AchE – acetilcholinesterazė VT – virškinamasis traktas

RNR – raumeninis nervinis rezginys PNR – pogleivinis nervinis rezginys Ach – acetilcholinas

NADPH – nikotino adenino difosfato dehidrogenazė H&E – hematoksilinas ir eozinas

7

ĮVADAS

Chroninis vidurių užkietėjimas šiuo metu yra dažna problema, su kuria susiduria pediatrai savo kasdieninėje praktikoje. Tai sudaro apie 3 -10 % [1, 2] visų konsultacijų, o tarp gastroenterologų net 10 – 25 % [1, 3]. Chroninis vidurių užkietėjimas skiriamas į funkcinį ir organinį [4]. Funkcinis sudaro didžiąją dalį, kurie susiduria su šia problema [1] ir yra nustatomas, kai nėra jokių objektyvių patologinių požymių [2]. Organinis sudaro likusią dalį. To priežastimi yra grupė skirtingos kilmės būklių, kurios sutrikdo žarnyno funkciją. Tai taip pat apima retesnes, bet rimtas obstipacijos formas, kurios įvyksta dėl enterinės nervų sistemos (ENS) anomalijų ir bendrai vadinamos – žarnyno disganglionozės [5]. Šiai sutrikimų grupei priklauso ir Hiršprungo liga (HL).

HL – įgimta malformacija, apibūdinama kaip ganglinių neuronų nebuvimu raumeniniame ir pogleivinės nerviniuose rezginiuose, distalinėje virškinimo trakto dalyje [5, 6], dar kitaip vadinama aganglionozė. Yra duomenų, kad HL sudaro 13 – 15% [7] visų atvejų, kai yra kreipiamasi pas pediatrijos gydytojus dėl obstipacijų. HL santykinai dažna priežastis sukelianti žarnyno obstrukciją naujagimiams. Tai apima 1 iš 5000 gyvų gimusiųjų [8, 9, 10]. Dauguma autorių pateikia duomenis, jog tarp berniukų ir mergaičių HL pasireiškia santykiu 4:1 [5, 7, 11]. Taigi HL būtina diagnozuoti laiku, nes dėl paveikto žarnos distalinio aganglionozinio segmento išsiplečia proksimalinė storosios žarnos dalis, kitaip dar šis reiškinys vadinamas megacolon [12]. Norint diagnozuoti HL yra labai svarbu suprasti vykstančius patofiziologinius procesus paveiktoje virškinimo trakto dalyje. Remiantis anamneze, klinikiniais požymiais ar atliktais radiologiniais tyrimais panaudojant bario kontrastinę klizmą, galime tik įtarti HL. Tačiau diagnozės patvirtinimui yra privaloma biopsija iš paveiktos žarnyno dalies ar net medžiaga paimta jau iš operacinės medžiagos [13, 14, 19]. Panaudojant neurohistocheminius tyrimus yra ištiriama biopsijos ar operacijos metu gauta medžiaga. Šiuo metu didžiausias dėmesys yra skiriamas neurohistocheminiams tyrimams, kurie jau tampa rutininiais tyrimais siekiant diagnozuoti HL [15, 16, 17]. Yra pateikiama duomenų, kad neurohistocheminiai tyrimai tampa‚ „auksiniu standartu“ diagnozuojant žarnyno disganglionozes [1, 18]. Šio darbo pagrindas yra panaudojant neurohistocheminį tyrimą patvirtinti HL.

8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: panaudojant neurohistocheminį tyrimo metodą patvirtinti Hiršprungo ligos diagnozę.

Darbo uždaviniai:

1. Mikroskopuojant nustatyti ar yra aptinkami nerviniai mazgai paimtoje tiriamojoje medžiagoje.

2. Mikroskopuojant įvertinti ar yra acetilcholinesterazei teigiamų nervinių skaidulų tiriamojoje medžiagoje.

9

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Virškinamojo trakto anatomija ir histologija.

Šiame darbe svarbiausia yra gerai suprasti virškinamojo trakto (VT) distalinės dalies anatomiją ir histologiją, nes būtent distalinėje VT dalyje įvyksta pokyčiai HL metu. Visas VT yra apie 8-10 metrų ilgio. Jis tęsiasi nuo burnos iki išangės ir yra skiriamas į viršutinį VT ir apatinį [20]. Viršutiniam VT priskiriama burna, stemplė, skrandis ir plonasis žarnynas. Apatiniam VT priskiriamas visas storasis žarnynas. Plonoji žarna dar skiriama į tris dalis: dvylikapirštę, tuščiąją ir klubinę. Bendras ilgis yra apie 4-5 metrai. Storąją žarną taip pat sudaro trys dalys: akloji žarna kartu su kirmėline atauga, gaubtinė žarna ir tiesioji žarna. Bendras ilgis yra apie 1,2-1,5 metro. Gaubtinė dar skirstoma į kylančiąją, skersinę, nusileidžiančiąją ir riestinę dalis. Tiesioji žarna pereina i analinį kanalą ir distalinis VT traktas užsibaigia išange [21, 22].

Žarnos sienelė yra sudaryta iš keturių dangalų. Žarnos spindis yra išklotas gleivine (mucosae), tai pirmas dangalas. Gleivinė sudaryta dar iš kelių struktūrų: 1) vienasluoksnio stulpinio epitelio; 2) savosios gleivinės plokštelės (lamina propria mucosae); 3) raumeninės gleivinės plokštelės (lamina muscularis mucosae). Epitelis čia sudarytas iš stulpinių ir taurinių ląstelių. Vietomis epitelis įlinksta į poepitelinį jungiamąjį audinį ir sudaro kriptas, kuriuose ypač daug taurinių ląstelių. Toliau yra išsidėstęs antrasis žarnos sienelės dangalas, tai pogleivinė (tela submucosa), kuri sudaryta iš jungiamojo audinio, praeinančių kraujagyslių ir pogleivinės (Meissner‘io) nervinio rezginio (plexus neuralis submucosus). Trečiasis – raumeninis dangalas (tunica muscularis), sudarytas iš dviejų neruožuotojų miocitų sluoksnių – vidinio žiedinio ir išorinio išilginio. Tarp jų yra žarnų raumeninio dangalo (Auerbach‘o) nervinis rezginys (plexus neuralis myentericus). Ketvirtasis sluoksnis yra išorinis žarnos sienelės sluoksnis ir vadinamas seroza [3, 12, 23].

1.2. Virškinamojo trakto inervacija.

VT gauna inervaciją iš centrinės nervų sistemos (CNS) ir ENS [24]. CNS ir ENS kartu veikia suderintai. ENS dar kitaip vadinama kaip vidinė žarnyno inervacijos

10 sistema, kadangi išsidėsto pačioje žarnos sienelėje, o iš CNS ateinantys aksonai priskiriami išoriniai žarnyno inervacijos sistemai, nes nėra išsidėsčiusi pačioje žarnos sienelėje [25, 26]. Iš CNS yra gaunamos simpatinės ir parasimpatinės nervinės skaidulos.

ENS formuojasi iš nervinės skiauterės ląstelių, kurios proliferuoja, migruoja ir kolonizuoja žarnos sienelę [27, 28]. ENS sudaryta iš 200 – 600 milijonų neuronų ir neuroglijos ląstelių, kurie sudaro tūkstančius smulkių nervinių mazgų [24, 29, 30]. Šie nerviniai mazgai sudaro du stambius nervinius rezginius išsidėstančius žarnos sienelėje [31, 32]. Tai raumeninis nervinis rezginys (RNR), kuris yra išsidėstęs tarp žarnos sienelės raumeninio dangalo išorinio išilginio ir vidinio žiedinio sluoksnių. Šis RNR dar kitaip vadinamas Auerbach‘o nerviniu rezginiu. RNR yra atsakingas už motorinę funkciją [26, 30]. Antrasis pagrindinis ENS rezginys yra pogleivinės nervinis rezginys (PNR), kuris ir yra randamas pogleivinėje tarp žarnos sienelės lygiųjų raumenų dangalo ir gleivinės. PNR taip pat dar yra vadinamas Meisner‘ io nerviniu rezginiu. PNR koordinuoja refleksus, tokius kaip sekrecija ir absorbcija [29, 30, 32]. RNR tęsiasi nuo stemplės iki analinio sfinkterio, o PNR tik nuo plonojo žarnyno [24].

Simpatinės nervinės skaidulos ateina iš priestuburinių simpatinių mazgų. Šios skaidulos yra adrenerginės. Jos nueina iki nervinių rezginių ir atitinkamai pasiekia įnervuojamą sritį. Nervinės skaidulos atėjusios iš apatinio pasaito rezginio siunčia adrenerginę inervaciją storajai žarnai, o iš dubeninio rezginio tiesiajai žarnai. Parasimpatinės skaidulos ateina iš klajoklio nervo branduolio ir nugaros smegenų kryžmeninių segmentų S2-4, kuriuose yra parasimpatiniai branduoliai. Iš branduolių

išeina ikimazginės cholinerginės skaidulos, kurios pasibaigia ant mazginių papilvės rezginio neuronų arba įnervuojamų organų sienos mazguose. Iš čia išėjusios skaidulos jau vadinamos užmazginėmis. Cholinerginės skaidulos atėjusios iš klajoklio nervo branduolio įnervuoja pilvo organus iki nusileidžiančiosios gaubtinės žarnos, o išėjusios iš kryžmeninių segmentų įnervuoja nusileidžiančią ir riestinę gaubtines žarnas [24, 26, 33, 34] .

11 1.3. Hiršprungo liga.

Pirmą kartą HL buvo aprašyta danų gydytojo Harold Hirschsprung 1887 metais Kopenhagoje [ 35, 36]. Nors Meier-Ruge savo darbe nurodo, jog ši liga pirmą kartą buvo paminėta Jacobi Abraham 1869 metais [37]. HL atsiranda dėl įgimtų neuromorfologinių pokyčių, kurie įvyksta embriogenezės metu distalinėje žarnos dalyje, vystantis ENS. Tuo metu neuroblastai iš nervinės skiauterės keliauja į žarnos sienelę, kur susidaro RNR ir PNR [1]. Embriogenezės metu svarbiausios yra 6 – 12 savaitės, nes tai šių dviejų nervinių rezginių vystymosi laikas. HL atveju yra sustabdoma nervinių ląstelių migracija į žarnos sienelę ir nesusidaro nerviniai rezginiai [ 1, 6, 37]. Todėl parasimpatinės skaidulos, kilusios iš S2-4 kryžmeninių segmentų, kurios normaliai

migruoja 5 – 7 savaitę, negali įsiterpti aganglionoziniame distalinės žarnos segmente [3,40]. Taigi HL apibūdinama, kaip įgimta malformacija, kai nėra nervinių ganglinių neuronų distalinėje žarnoje [ 35, 38, 39]. HL gali apimti skirtingo ilgio žarnos segmentą. Taigi pagal aganglinio segmento ilgį yra klasifikuojama į: klasikinę HL, kai agangliozinis segmentas apima tiesiąją ir riestinę žarnas. Tai sudaro 75 – 80% visų atvejų [5, 6, 9, 35, 37, 38]. Kita forma – totali HL. Ji apima storąją žarną iki plonosios žarnos pradžios. Ši forma nustatoma apie 3 – 8 % atvejų [5, 9, 37, 38]. Išskiriama dar viena retesnė forma – ultratrumpo segmento HL. Agangliozinė zona tęsiasi virš išangės maksimaliai tik 3 – 4 cm. Tai sudaro apie 5 - 10 % pacientų [6, 37]. Visos HL formos yra patvirtinamos atliekant neurohistocheminius tyrimus, radus histologinius pakitimus tiriamojoje medžiagoje. Prieš tai įvertinama paciento anamnezė, klinikiniai duomenys ir atlikti tyrimai. HL daugiau nei 90 % atvejų galima įtarti naujagimiams. Pirmasis, dažniausiai ir vienintelis simptomas būna uždelstas mekonijaus pasišalinimas per pirmas 24 h [1, 5]. Vaikams taip pat gali būti pilvo tempimas, pūtimas dėl koprostazės [17]. Morfologiškai stebima, jog agangliozinis segmentas yra stipriai susiaurėjęs ir proksimalia kryptimi, per tranzitorinę zoną, per eina į išsiplėtusį gangliozinį segmentą [41]. Taigi norint patvirtinti HL yra būtina ištirti paveiktos žarnos sienelę ir nustatyti būdingus histologinius pokyčius.

12 1.4. Neurohistocheminių tyrimų panaudojimas diagnostikoje.

Yra daug publikacijų apie atliktus neurohistocheminius tyrimus [1, 2]. Vieni autoriai rašo, kad histocheminiai tyrimai buvo panaudoti nuo 1960 m [3] ir aptiktas AchE aktyvumas, kuris parodo cholinergines struktūras ir demonstruoja parasimpatinį aktyvumą, normaliai raumeniniame sluoksnyje. 1964 m Karnovsky ir Roots [15] publikavo savo AchE dažymo techniką. Nuo to laiko buvo atlikta daug šios technikos modifikacijų, siekiant geriau išryškinti reikiamas struktūras bei sutrumpinti dažymo laiką. Acetilcholinas (Ach) yra pagrindinis ENS neurotransmiteris reguliuojantis žarnyno judrumą ir kitas funkcijas [42, 43]. Tyrimo metu yra panaudojama AchE, o ne Ach. Kadangi Ach greitai suyra tik išskirtas į sinapsinį plyšį, o AchE aktyvumas įrodomas dar kelias valandas, todėl ir yra tinkamas diagnostikai [37]. AchE yra fermentas pasižymintis cholinerginius neuronus. Yra įrodyta, jog normaliai įnervuotoje gleivinėje [42] cholinerginės nervinės skaidulos nenusidažo taikant AchE dažymą [13, 35, 44]. 1972 m Meier- Ruge [13] apibūdino buvimą, cholinerginių AchE teigiamų nervinių skaidulų gleivinės savajame sluoksnyje, gleivinės raumeniniame sluoksnyje ir pogleivyje, tiriant aganglinį segmentą. Šis AchE teigiamų skaidulų buvimas yra kaip HL indikatorius. Jau prieš daug metų buvo pradėti formuoti histologiniai kriterijai HL nustatyti [45]. Panaudojant AchE dažymą HL diagnostikai, remiamasi šiais nustatytais histologiniais kriterijais [2, 13, 14, 30, 36, 41, 44] :1) ganglinių neuronų nebuvimas pogleivinėje; 2) tankus nervinių skaidulų tinklas, nusitęsiantis į gleivinę; 3) ryškiai padidėjęs AchE aktyvumas savojoje gleivinės plokštelėje ir raumeninėje gleivinės plokštelėje. Čia cholinerginės skaidulos nusidažo ruda spalva [2]. Normoje nervinių skaidulų diametras pogleivinėje yra mažiau 40mikrometrų. HL atveju randami didesnes nei 40mikrometrų nervinės skaidulos [10]. Taip pat AchE histocheminis tyrimas labai svarbus nustatant ultratrumpo segmento HL, nes tai vienintelis metodas galintis patvirtinti šią formą [5, 36, 37,46]. Pagrindinis skirtumas nuo klasikinės HL formos, tai jog AchE aktyvumas padidėja pogleivinėje ir raumeninėje gleivinės plokštelėje, bet ne savajoje gleivinės plokštelėje. Panaudojant neurohistochemiją, taikant AchE dažymą HL diagnozuoti, jautrumas yra nuo 90,47% iki 96% , o specifiškumas nuo 96,36% iki 100% [2, 39, 44, 47]. Atliekant AchE dažymą turi būti tinkamai paimta biopsinė medžiaga. Jei paimtas per mažas pogleivinės kiekis ar padarytos kitos technikos klaidos, mėginys yra netinkamas diagnostikai. Yra nustatyta, kad reikia imti biopsiją 2 – 3 cm virš dantytosios linijos [2, 6, 37, 39], kad būtų išvengta fiziologinės

13 hipogangliozinės zonos. Taip pat klaidingi rezultatai gali būti gaunami, jei tiriamasis yra per jauno amžiaus. Todėl rekomenduojama tirti ne jaunesnius nei 3 mėnesių vaikus, kadangi iki tol dar yra nesubrendę gangliniai neuronai ir juos galima supainioti su storomis nervinėmis skaidulomis, kurios matomos HL atveju [2, 19, 29, 37]. Dauguma autorių savo publikacijose nurodo, jog taikant du dažymo metodus yra žymiai geresnė diagnostika. Tam dažniausiai panaudojamas hematoksilino ir eozino (H&E) dažymas kartu su AchE dažymo būdai [1, 2, 10]. H&E dažymu geriau įvertinamas bendras histologinis vaizdas, o AchE dažymu geriau įvertinamos nervinės struktūros. Naudojant abu metodus diagnostikos jautrumas 99% [10] ir išvengiama klaidingai teigiamų rezultatų. Naudojant H&E dažymą reikia didesnės patirties vertinant preparatus ir tai užima daugiau laiko [1]. Buvo atlikta nemažai tyrimų panaudojant imunohistocheminius žymeklius. Publikuota, jog HL diagnostikai panaudojant Kalretininą, rezultatai buvo geri [19]. Tačiau taikant šį metodą negalima nustatyti ultratrumpos HL formos [1, 5, 19]. Imunohistochemija atliekama su Kalretininu yra kaip alternatyva AchE dažymui ir ateityje net gali tapti „auksiniu standartu“ HL diagnostikoje [5]. Buvo atlikti tyrimai panaudojant HL tyrimui nikotino adenino difosfato dehidrogenazę (NADPH). Normaliai yra stiprus aktyvumas pogleivinės mazguose ir daug NADPH teigiamų skaidulų raumeninėje gleivinės plokštelėje [16]. Nustatyta, kad HL atveju nėra NADPH teigiamų skaidulų, nėra pogleivinės mazgų ir silpnai dažosi hipertrofavusios nervinės skaidulos [2, 16]. Tai parodo, jog dažymas yra naudingas diagnozei.

Analizuojant atliktus tyrimus ir publikuotą medžiagą, galime pastebėti, jog neurohistocheminiai tyrimai žymiai pagerina HL diagnostiką ir tuo pačiu leidžia įvertinti kitus žarnos inervacijos defektus [36, 37].

14

2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI

2.1. Tyrimo medžiaga.

Tyrimui atlikti buvo paimtos 7 vaikų tiesiosios žarnos biopsinė medžiaga, kuriems buvo įtariama HL . Visi tiriamieji buvo berniukai. Jų amžius nuo 1 iki 2 metų. Šie vaikai buvo gydomi Kauno klinikose vaikų chirurgijos skyriuje. Kreipėsi dėl pasikartojančio vidurių užkietėjimo, pilvo tempimo. Atliktuose rentgenologiniuose tyrimuose buvo matomas proksimalinės storosios žarnos išsiplėtimas, kuris pereina į stipriai susiaurėjusį distalinį storosios žarnos segmentą. Kontrolinei grupei panaudojome biopsinę medžiagą paimtą iš visų 7 vaikų sveiko riestinės žarnos segmento. Kita medžiaga paimta iš išsiplėtusio ir stipriausiai susiaurėjusio tiesiosios žarnos segmentų. Preparatai paimti iš susiaurėjusio segmento buvo priskirti tiriamajai grupei.

2.2. Tiriamosios medžiagos paėmimas ir paruošimas.

Tiriamoji medžiaga buvo paimta rektoskopinėmis biopsinėmis žnyplėmis apimant gleivinę ir pogleivinę. Atstumas nuo dantytosios linijos buvo 5 cm. ir 10 cm. Taip pat panaudojant žirklutes 2,5 cm atstumu nuo dantytosios linijos paimtas trečiasis mėginys. Biopsinės medžiagos ėminiai buvo greitai dedami į plastikinį indelį ir skubiai šaldomi įdedant jį į skystą azotą. Medžiaga buvo perduota į Anatomijos institutą. Laboratorijoje buvo padaromi biopsinės medžiagos pjūviai, panaudojant kriostato aparatą. Pjūviai atlikti 15 mikrometrų storio. Šie pjūviai toliau buvo naudojami AchE aktyvumui tirti panaudojant dažymą. AchE dažymui panaudojome A. L. Badawi ir E. A. Schenk metodiką (1967 m)[48]. Naudojamo tirpalo sudėtis: acetilthiocholinjodidas 12,5 mg; 0,06 N natrio acetatas, 15,8 ml; 0,1 N acto rūgštis, 0,5 ml; 0,1 M natrio citratas, 1,2 ml; 30 mM vario sulfatas, 2,5 ml; 5 mM raudonoji kraujo druska, 2,5 ml; distiliuotas vanduo, 2 ml. Medžiaga šiame tirpale laikyta 1 h 30 min. Preparatai padengti ir paruošti mikroskopavimui.

2.3. Preparatų mikroskopavimas.

Preparatų peržiūrai naudojome šviesinį „Zeiss“ mikroskopą. Pirmiausiai buvo mikroskopuojami kontrolinės medžiagos preparatai. Nustatėme ar juose yra matomi nerviniai mazgai ir nervinių skaidulų pluoštai, pasižymintis dideliu AchE aktyvumu.

15 Vėliau buvo peržiūrimi preparatai, kurie buvo padaryti iš siauriausios vietos segmento paimtos medžiagos. Juose taip pat vertinome ar yra matomos struktūros, kurių ieškome. Iš susiaurėjusio žarnos segmento vietos, paimtoje tiriamojoje medžiagoje, kur nebuvo nervinių mazgų atrinkome preparatus su skersiniais žarnos sienelės pjūviais. Taip iš viso buvo atrinkti 52 preparatai, kurie buvo naudojami nervinių skaidulų kiekiui įvertinti.

2.4. Nervinių skaidulų kiekio įvertinimas.

Tyrimui naudojome atrinktus 52 preparatus, kuriuose matomi skersiniai žarnos sienelės pjūviai. Iš 4 vaikų buvo paimta po 8 preparatus, iš 2 vaikų paimta po 7 preparatus ir iš 1 vaiko paimti 6 preparatai. Preparatai, kuriuose matomas išilginis pjūvis, skaidulų kiekiui vertinti, nebuvo naudojami. Mikroskopuojant preparatus 10x objektyvu, panaudojome Image – pro plus programą ir padarėme tiriamų preparatų nuotraukas. Padarytos nuotraukos buvo vertinamos naudojant „AxioVision“ (Zeiss, Vokietija) kompiuterinę programą. Šios programos pagalba skaičiavome matomų AchE teigiamų nervinių skaidulų kiekį. Ėmėme padarytos preparato nuotraukos bendrą plotą ir šiame apimtame plote skaičiavome esamų nervinių skaidulų kiekį. Skaičiavimui naudojome sudaryta formulę - nervai/visas plotas x 100. Gauti rezultatai buvo suvedami į lentelę panaudojant „Microsoft Excel 2007“ programą ir apskaičiuotas vidurkis.

16

3. REZULTATAI

3.1. Preparatų mikroskopavimas.

Mikroskopuojant kontrolinės medžiagos preparatus buvo aptikti nerviniai mazgai pogleivinėje (1pav., 2pav.). Taip pat tiriant nebuvo matyti AchE teigiamų nervinių skaidulų matomoje žarnos gleivinėje (3pav.). Taip įvertintas normalus storosios žarnos sienelės morfologinis vaizdas. Po to mikroskopavome preparatus, kurie buvo paimti iš išsiplėtusio žarnos segmento. Vaizdas gautas kaip ir kontrolinėje medžiagoje. Buvo rasti nerviniai mazgai pogleivinėje ir neaptikta AchE teigiamų nervinių skaidulų gleivinėje. Preparatuose paimtuose iš susiaurėjusio storosios žarnos segmento buvo stebimas kitoks vaizdas. Tiriamoje medžiagoje neaptikti nerviniai mazgai pogleivinėje (4pav.). Taip pat stebimas didelis kiekis AchE teigiamų nervinių skaidulų, kurios išsidėsčiusios raumeninėje gleivinės plokštelėje bei savojoje gleivinės plokštelėje (5pav., 6pav., 7pav.).

17 Preparate aiškiai matomas nervinis rezginys (pažymėtas rodykle), kuris sudarytas iš nervinių pluoštų ir neuronų. Taip atrodo nepažeistas, sveiko žmogaus ganglinio segmento pogleivinės dangalas.

2pav. Nervinis rezginys žmogaus sveikosios storosios žarnos pogleivinėje. Šiame preparate taip pat matomi nerviniai rezginiai (pažymėti rodyklėmis). Taip atrodo sveiko žmogaus ganglinio segmento pogleivinės dangalas.

18 3pav. Žmogaus sveikos storosios žarnos gleivinė skersiniame pjūvyje. Preparate matome, jog nėra aptinkamos AchE teigiamos nervinės skaidulos gleivinės sveikosios storosios žarnos segmente.

4pav. Žmogaus pažeistos storosios žarnos segmentas išilginiame pjūvyje. Šiame preparate matome aganglinį segmentą. Stebima, jog pogleivinėje nėra nervinių mazgų. Vietoj jų stebimas didelis kiekis išsidėsčiusių nervinių skaidulų, kurios nusidažiusios ruda spalva (pažymėta baltomis rodyklėmis). AchE teigiamų nervinių skaidulų matoma ir gleivinės sluoksniuose (pažymėta juodomis rodyklėmis).

19 5pav. Žmogaus pažeistos storosios žarnos gleivinė išilginiame pjūvyje. Šiame preparate matome, jog yra aptinkamos AchE teigiamos nervinės skaidulos agangliniame storosios žarnos segmente.

6pav. Žmogaus pažeistos storosios žarnos gleivinė skersiniame pjūvyje. Preparate matome, jog yra aptinkamos tankiai išsidėsčiusios AchE teigiamos nervinės skaidulos gleivinėje, vertinant aganglinį storosios žarnos segmentą. Šios skaidulos nusidažiusios ruda spalva (nurodyta rodyklėmis).

20 7 pav. Žmogaus pažeistos storosios žarnos gleivinė skersiniame pjūvyje. Preparate matomas AchE teigiamų skaidulų išsidėstymas agangliniame žarnos segmente, gleivinės sluoksniuose. Skaidulos nusidažiusios ruda spalva (nurodyta rodyklėmis).

3.2. Nervinių skaidulų kiekio įvertinimas.

52 preparatuose, kuriuose matomas skersinis pjūvis buvo skaičiuojamas aptiktų cholinerginių nervinių skaidulų tankumas. Mikroskopuojant stebima, jog nervinės skaidulos buvo tankiai išsidėsčiusios gleivinėje. Panaudojant „Axiovision“ kompiuterinę programą gavome rezultatus. Bendras plotas visuose preparatuose nustatytas tas pats. Šiame plote ir buvo skaičiuojama kokią dalį ploto užima nervinės skaidulos. Gauti rezultatai suvesti į lentelę (1lent.) Stebima, jog nervinių skaidulų kiekis visuose preparatuose skiriasi nežymiai. Mažiausia gauta reikšmė yra 10901, o didžiausia - 15144 Vidurkis yra 13206. Buvo paskaičiuota kiek procentų bendro ploto sudaro nervinės skaidulos. Mažiausiai gauta 1,82 %, o didžiausias buvo 2,53 %. Vertinant kontrolinės medžiagos preparatus, nebuvo aptiktos nervinės skaidulos gleivinėje. Taigi šiuose preparatuose rezultatas prilyginamas 0. Todėl tarp šių preparatų negali būti atlikta statistinė analizė.

21 Preparatas Visas plotas Nervų suminis plotas

Procentas nuo bendro ploto 1 599491 14340 2,39 2 599491 13548 2,26 3 599491 14547 2,43 4 599491 15069 2,51 5 599491 15144 2,53 6 599491 14591 2,43 7 599491 14571 2,43 8 599491 13112 2,19 9 599491 13083 2,18 10 599491 11063 1,85 11 599491 13063 2,18 12 599491 12946 2,16 13 599491 12058 2,01 14 599491 15102 2,52 15 599491 11757 1,96 16 599491 10901 1,82 17 599491 11800 1,97 18 599491 10278 1,71 19 599491 12588 2,10 20 599491 12276 2,05 21 599491 14696 2,45 22 599491 15135 2,52 23 599491 12190 2,03 24 599491 12113 2,02 25 599491 11350 1,89 26 599491 13386 2,23 27 599491 12896 2,15 28 599491 14963 2,50 29 599491 12386 2,07 30 599491 12956 2,16 31 599491 13026 2,17 32 599491 13386 2,23 33 599491 11746 1,96 34 599491 14196 2,37 35 599491 15021 2,51 36 599491 12326 2,06 37 599491 11986 2,00 38 599491 13345 2,23 39 599491 12349 2,06 40 599491 12008 2,00 41 599491 14345 2,39 42 599491 15012 2,50 43 599491 11977 2,00 44 599491 15103 2,52 45 599491 12463 2,08 46 599491 14367 2,40

22 1 lent. Nervinių skaidulų užimamas plotas preparate.

Šioje lentelėje matome koks skaičius nervinių skaidulų yra pasiskirstęs tiriamajame preparato plote. Taip pat yra apskaičiuota kiek procentų bendro ploto sudaro nervinės skaidulos.

47 599491 13226 2,21 48 599491 12954 2,16 49 599491 13166 2,20 50 599491 14723 2,46 51 599491 12248 2,04 52 599491 13871 2,31

23

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Kadangi šiuo metu dažnai susiduriama su chroniniu vidurių užkietėjimu, kuris pasireiškia vaikams, yra būtina pirmiausiai įsitikinti ar tai nėra tik funkcinis sutrikimas [1]. Nes dauguma autorių nurodo, jog dažniausiai nėra aptinkami objektyvūs patologiniai pokyčiai ir tiesiog nustatomas tik kaip funkcinis sutrikimas [2, 4]. Todėl visais atvejais įtariant HL būtina pirmiausiai tinkamai įvertinti klinikinius simptomus, rentgenokontrastinių tyrimų rezultatus [5, 17]. Yra daug atliktų tyrimų ir savo tyrime matome, jog norint patvirtinti HL yra būtina atlikti diagnostinę biopsiją. Daugumoje darbų publikuojama, kad tai jau laikoma „auksiniu standartu“ ir jautrumas yra 93%, o specifiškumas 100 % diagnozuojant HL [2, 29]. Kai kurie autoriai aprašo, kad biopsinė procedūra, žarnyno motorikos sutrikimams nustatyti, kaip diagnostinė buvo patvirtinta jau 1965 m. [13]. Atliekant tyrimą taip pat panaudojome rektoskopinę biopsiją, prieš tai įvertinus tiriamųjų anamnezę, klinikinius požymius bei atliktus rentgenokontrastinius tyrimus. Norint įvertinti histologinius diagnostikos kriterijus, buvo panaudotas neurohistocheminis tyrimas. Šiame darbe panaudojome AchE aktyvumui tirti dažymo būdą pagal A. L. Badawi ir E. A. Schenk metodiką. Vertinant preparatus AchE teigiamos skaidulos buvo nusidažiusios ruda spalva. Dauguma autorių AchE aktyvumui įvertinti naudoja įvairias Karnovsky ir Roots metodikos modifikacijas, kur nervinės skaidulos nusidažo ruda spalva ir gali būti netgi iki juodos. [2, 4, 5, 37]. Gangliniame žarnos segmente, AchE teigiamos skaidulos gleivinės sluoksniuose nėra aptinkamos [35]. Tai taip pat įrodyta atlikus šį darbą. Mikroskopuojant tiriamąją medžiagą, kuri paimta kontrolei, žarnos gleivinės sluoksniuose neaptikome AchE teigiamų nervinių skaidulų. Remiantis atliktais tyrimais ir įvertinant savo darbe gautus rezultatus galime patvirtinti, jog taikyti histologiniai kriterijai HL diagnostikai pasitvirtino. Tiriant preparatus iš paveikto segmento, taip pat nustatyta, jog nėra nervinių mazgų pogleivinėje. Taip buvo nustatytas aganglinis segmentas [13, 14, 36]. Kitas diagnostinis kriterijus, tai nervinių skaidulų aptikimas šiame agangliniame segmente. AchE teigiamos nervinės skaidulos matomos tankiai išsidėsčiusios gleivinės sluoksniuose [ 30, 41, 44]. Taigi, remiantis kitų autorių nustatytais diagnostiniais kriterijais, galime teigti jog gauti rezultatai tyrimo metu atitinka šiuos kriterijus ir leidžia patvirtinti HL diagnozę. Tai rodo, kad neurohistocheminio tyrimo panaudojimas yra labai reikšmingas ir specifiškas metodas pritaikant jį šios ligos diagnostikoje [2, 39, 47]. Dauguma autorių savo darbuose, neurohistocheminio tyrimo panaudojimą, taikant AchE dažymo metodiką, aprašo kaip

24 „auksini standartą“ HL diagnostikai [1, 3, 4]. Neurohistocheminis tyrimas yra panaudojamas diferencijuojant žarnyno disgangliozes [5].

Šiame darbe įvertinome 52 preparatus, kuriuose nustatytas aganglinis žarnos segmentas ir matomas skersinis pjūvis. Panaudojant kompiuterinę programą skaičiavome aptiktų AchE teigiamų nervinių skaidulų kiekį, tam tikrame preparato plote. Panašių tyrimų, kurie butų publikuojami kitų autorių darbuose neaptikome. Šis skaidulų tankumas buvo įvertintas klasikiniame HL variante. Kadangi kontroliniame preparate skaidulų nerasta, tai tankumą prilyginame 0. Gautus rezultatus bus galima palyginti atlikus tokius pačius skaičiavimus kituose HL variantuose.

25

5. IŠVADOS

1. Tiriamoje kontrolinėje medžiagoje mikroskopuojant aptikti nerviniai mazgai pogleivinėje. Vertinant preparatus, kurie paimti iš paveikto žarnos segmento, pogleivinėje nebuvo aptikta nervinių mazgų. Taip nustatytas distalinės storosios žarnos aganglinis segmentas, kuris leidžia diagnozuoti klasikinį HL variantą.

2. Tiriamojoje kontrolinėje medžiagoje mikroskopuojant neaptikta AchE teigiamų nervinių skaidulų gleivinės sluoksniuose. Vertinant distalinį storosios žarnos aganglinį segmentą, aptiktas didelis kiekis AchE teigiamų nervinių skaidulų raumeninėje gleivinės plokštelėje ir savajoje gleivinės plokštelėje. Tai dar vienas histologinis diagnostikos kriterijus klasikiniame HL diagnostikoje.

3. Įvertinant aptiktų nervinių skaidulų kiekį tam tikrame preparato plote, nustatyta, jog vidurkis yra 13206. Užimamas nervinių skaidulų plotas kinta nuo 1,82 % iki 2,52 %.

26

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Montedonico S, Patricio C, Munoz N, Yanez H, Ramirez R, Fadda B. Histochemical staining for intestinal dysganglionosis:over 30 years experirnce with more than 1,500 biopsies. Pediatr Surg Int 2011;27:479-486.

2. Montedonico S, Piotrowska A P, Rolle U, Puri P. Histochemical staining of rectal suction biopsies as the first investigation in patients with chronic constipation. Pediatr Surg Int 2008; 24:785-792.

3. Feichter S, Meier-Ruge W A, Bruder E. The histopathology of gastrointestinal motility disorders in children. Seminars in Pediatric Surgery 2009; 18:206-211. 4. Levitt MA, Pena A. Management of Severe pediatric constapation.2015Aug

medscape[Internet]. Available from: http://emedicine.medscape.com/article/937030-overview#a4

5. Schäppi MG, Staiano A, Milla PJ, Smith VV, Dias JA, Heuschkel R, Husby S, Mearin ML, Papadopoulou A, Ruemmele FM, Vandenplas Y, Koletzko S. A practical guide for the diagnosis of primary enteric nervous system disorders. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition vol57, 2013 Nov; 677-686.

6. Kapur Raj P, MD, PhD. Practical pathology and genetics of Hirschsprung‘s disease. Seminars in Pediatric Surgery 2009; 18:212-223.

7. Yadav A K, Mishra K, Mohta A, Agarwal S. Hirschsprung‘s disease: Is there a relationship between mast cells and nerve fibers? World Journal of Gastroenterology 2009; 15(12): 1493-1498.

8. Roberts R R, Bornstein J C, Bergner A J, Young H M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung‘s disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008; 294: G996-G1008.

9. Matsuda H, Hirato J, Kuroiwa M, Nakazato Y. Histopathological and imunohistochemical study of the enteric innervations among various types of aganglionoses including isolated and syndromic Hirschprung disease. Neuropathology 2006; 26:8-23.

10. Kapur RP. Can we stop looking?Immunohistochemistry and the diagnosis of Hirschsprung disease. Am J Clin Pathology 2006;126:9-12.

11. Endom EE, Wesson DE. Emergency complications of Hirschsprung disease. 2016 Nov Uptodate [Internet]. Available from: https://www.uptodate.com/contents/emergency-complications-of-hirschsprung-disease#H11

12. Wedel T, Roblick U, Gleiss J, Schiedeck T, Bruch HP, Kuhnel W, Krammer HJ. Organization of the enteric nervous system in the human colon demonstrated by wholemount immunohistochemistry with special reference to the submucous plexus. Ann Anat 1999;181:327-337.

13. Santos M M, Tannuri U, Cecilia M, Coelho M. Study of acetylcholinesterase activity in rectal suction biopsy for diagnosis of intestinal dysganglionoses: 17 – year experience of a single center. Pediatr Surg Int 2008; 24:715-719.

27 14. Kobayashi H, Li Z, Yamataka A, Lane GJ, Yokota H, Watanabe A, Miyano T.

Acetylcholinesterase distribution and refractory constipation – a new criterion for diagnosis and management. Pediatric Surgery Int 2002;18:349-353.

15. Kobayashi H, Miyahara K, Kusafuka J, Yamataka A, Lane G, Sueyoshi N, Miyano T, Puri P. A new rapid acetylcholinesterase staining kit for diagnosing Hirschsprung‘s disease. Pediatr Surg Int 2007; 23:505-508.

16. Rolle P, Puri P.Immunohistochemical studies. In: Holschneider AM, Puri P(Eds.) Hirschsprung‘s Disease and Allied Disorders, 3rd ed, Springer, Berlin, 2008;207-214.

17. Agrawal R K, Kakkar N, Vasishta R K, Kumari V, Samujh R, Rao K L N. Acetylcholinesterase histochemistry(AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of hirschsprung disease. Diagnostic Pathology 2015; 10:208-217.

18. Staines WA, Bettolli M, De Carli C, Swinton E, Sweeney B, Krantis A, Rubin S Z. Fast evaluation of intraoperative biopsies for ganglia in Hirschsprung‘s disease. Journal of Pediatric Surgery 2007; 42: 2067-2070.

19. Guinard-Samuel V, Bonnard A, De lagausie P, Chomette P P, Alberti C, El Ghoneimi A, Peuchmaur M, Berrebi-Binczak D. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnoze Hirschsprung disease. Modern Pathology 2009; 22:1379-1384.

20. Kapoor KV. Lower GI track anatomy. 2015 Nov;[Internet]. Available from: http://emedicine.medscape.com/article/1899008-overview

21. Česnys G, Tutkuvienė J, Barkus A, Gedrimas L.V, Jankauskas R, Rizgelienė R, Žukienė J. Žmogaus anatomija 1. Vilniaus universiteto leidykla; 2008.

22. Drake, Richard L. Gray‘s anatomy for students. Philadelphis: Churchill Livingstone/Elsevier;2010.

23. Rao JN, Wang JY, Rafael S. Intestinal architecture and development. Morgan and Claypool life sciences 2010; [Internet]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK54098/

24. Furness JB, Callaghan BP, Rivera LR, Cho HJ. The enteric nervous system and gastrointestinal innervation: integrtated local and central control.Microbial endocrinology [Internet], 2014June9;pp39-71.

25. Uesaka T, Young HM, Pachnis V, Enomoto H. Development of the intrinsic and extrinsic innervation of the gut. Dev Biol.[Internet]. 2016Sep 15;417(2):158-67. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27112528

26. Phillips RJ, Powley TL. Innervation of the gastrointestinal tract:patterns of aging. Autonomic neurosciense 2007 Oct;136(1-2):1-19.

27. Barlow-Anacker AJ, Erickson CS, Epstein ML, Gosain A. Immunostaining to visualize murine enteric nervous system development. J Vis Exp [Internet]. Apr29;(98):e52716. Available from:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25993536 28. Heanue TA, Pachnis V. Enteric nervous system development and hirschsprung‘s disease: advances in genetic and stem cell studies. Ant Rev Neurosci [ Internet].

2007Jun;8(6):466-79. Available from:

28 29. Nagy N, Goldstein AM. Enteric nervous system development: A crest cell‘s journey

from neural tube to colon. Semin Cell Dey Biol [Internet]. 2017Jan10; (17)S1084-9521.Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28087321

30. Sasselli V, Pachnis V, Burns AJ. The enteric nervous system. Developmental Biology 2012Jun; 64-73.

31. Benskey MJ, Manfredsson FP. Gene therapy of the peripheral nervous system: The Enteric Nervous System. Methods Mol Biol.[Internet]. 2016;1382:263-74. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26611593

32. Corbille AG, Coron E, Neunlist M, Derkinderen P, Lebouvier T. Apraisal of the dopaminergic and noradrenergic innervation of the submucosal plexus in PD. JParkinsons Dis.[Internet]. 2014;4(4):571-6. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25055959

33. Simren M, Abrahamsson H. Gastrointestinal motility and neurogastroenterology. Scandinavian Journal of Gastroenterology 2015, vol50; 685-697.

34. Stropus R, Vaičekauskas V, Tutkuvienė J, Paužienė N, Pauža DH, Dabužinskienė A, Gedrimas V, Aželis V, Schumacher GH. Žmogaus anatomija 2. Kaunas:KMU leidykla;2007.

35. Karim S, Hession C, Marconi S, L Gang D, Otis C. The identification of ganglion cells in Hirschsprung disease by the immunohistochemical detection of ret incoprotein. Am journal Clinical Pathology 2007; 126:49-54.

36. Meier – Ruge W, Kaüfeler R E, Brönnimann P. Classification of inborn malformation of distal gut innervation. Virchorws Archiv a Pathol Anat. 1992; 420:171-177.

37. Bruder E, Terracciano L M, Passarge E, Meier-Ruge W A. Enzymhistochemie des klassischen und des ultrakurzen Morbus Hirschsprung. Pathologe 2007;28:105-112.

38. Donnell A M, Puri P. Deficiency of purinergic P2Y receptors in aganglionic intestine in Hirschsprung‘s disease. Pediatr Surg Int 2008; 24:77-80.

39. Moore SW. Advances in understanding functional variotions in the Hirschsprung disease spectrum(variant Hirschsprung disease). Pediatric Surg Int [Internet]. 2017

Mar; 3393):285-298. Available from:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27988850

40. Miyahara K, Kato Y, Koga H, Lane G, Inoue T, Akazawa C, Yamataka A. Abnormal enteric innervation identified without histopathologic staining in aganglionic colorectum from a mouse model of Hirschsprung‘s disease. Journal of Pediatric Surgery 2010; 45:2403-2407.

41. Kubota M, Suita S, Kamimura T, Ito Y, Szurszewski JH. Electrophysiological properties of the aganglionic segment in Hirschsprung‘s disease. Surgery 2002;131:S288-93.

42. Porter AJ, Wattchow DA, Brookes SJH, Schemann M, Costa M. Choline Acetyltransferase Immunoreactivity in the human small and large intestine. Gastroenterology1996;111:401-408.

43. Kusafuka J, Kobayashi H, Miyahara K, Lane G J, Sueyoshi N, Yamataka A. Does Abnormal Expression of Acetylcholine Receptors in Hirschsprung‘s Disease Induce

29 Acetylcholine Esterase Positive Nerve Fibres? Asian Journal of Surgery 2007Oct.255-260

44. Moore SW, Johnson G. Acetylcholinesterase in Hirschsprung‘s disease. Pediatr Surg Int2005;21:255-263.

45. Chow CW, Chan WC, Yue PCK. Histochemical criteria for the diagnosis of Hirschsprung‘s disease in rectal suction biopsies by acetylcholinesterase activity. Journal of Pediatric Surgery 1977Oct;675-680.

46. Meier – Ruge W, Bruder E. histopathological Diagnosis and differential diagnosis of Hirschsprung‘s disease. In: Holschneider AM, Puri P(Eds.) Hirschsprung‘s Disease and Allied Disorders, 3rd ed, Springer, Berlin, 2008; 185-195

47. Budianto IR, Obata S, Kinoshita Y, Yoshimaru K, Yanagi Y, Miyata J, Nagata K, Ieiri S, Taguchi T. Reevaluation of acetylcholinesterase staining for the diagnosis of Hirschsprung disiease and allied disorders. J Peadiatr Gastroenterology nutrition 2015 may; 60(5):606-12.

48. El – Badawi A, Shenk EA. Histochemical methods for separate, consecutive and simultaneous demonstration of acetylcholinesterase and norepinephrine in cryostat sections. J Histochem Cytochem 1967;15(10):580-2.