LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Jolita Stankevičiūtė
Detoksikuojančio preparato panaudojimas karvių mikotoksikozių
profilaktikai
Use of detoxifying agent for the prevention from mycotoxicosis in cows
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: prof. dr. Bronius Bakutis
2 DARBASATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMASAPIEATLIKTODARBOSAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Detoksikuojančio preparato panaudojimas karvių mikotoksikozių profilaktikai.“:
1. yra atliktas mano pačios.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas: Jolita Stankevičiūtė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
Stasė Masilionienė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
Prof. dr. Bronius Bakutis
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
Prof. Mindaugas Malakauskas (aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo
(-os) vardas, pavardė)
(parašas)
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė)
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 1.1 Pašarų svarba ... 91.2 Didžiausią žalą karvėms darantys mikotoksinai ... 10
1.2.1 Deoksinivalenolis (DON) ...10 1.2.2 Aflatoksinai ...11 1.2.3 Zearalenonas (ZEA) ...12 1.2.4 T-2 toksinas ...13 1.2.5 Ochratoksinas A (OTA)...15 1.2.6 Fumonizinai (FUM) ...16 1.3 Detoksikacija ... 18 1.3.1 Biologiniai metodai ...18 1.3.2 Cheminiai metodai ...19 1.3.3 Fiziniai metodai ...20
2. TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGA ... 21
2.1 Tyrimo atlikimo vieta, trukmė, sąlygos ... 21
2.2 Tyrimo vietos aplinkos rodiklių vertinimas ... 22
2.2.1 Fizikinių aplinkos rodiklių vertinimas ...22
2.2.2 Cheminių aplinkos rodiklių vertinimas ...23
2.2.3 Biologinių aplinkos rodiklių vertinimo metodika ...23
2.3 Mikotoksinų koncentracijos pašaruose nustatymo metodika ... 23
2.4 Pieno mėginių vertinimas ... 23
2.5 Somatinių ląstelių skaičiaus ir klinikinių mastitų vertinimas ... 24
2.6 Prieskrandžių turinių paėmimas ir vertinimas ... 24
2.7 Kraujo mėginių paėmimas ir tyrimų atlikimas ... 24
2.8 Statistinis duomenų įvertinimas ... 25
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 26
3.1 Tvarto aplinkos rodikliai ... 26
3.1.1 Terminiai ir fizikiniai tvarto aplinkos rodikliai ...26
3.1.2 Cheminiai tvarto aplinkos rodikliai ...27
3.1.3 Biologiniai tvarto aplinkos rodikliai ...27
4
3.3 Kraujo biocheminiai tyrimai ... 28
3.4 Kraujo morfologiniai tyrimai ... 34
3.5 Pieno mėginių tyrimai ... 38
3.6 Somatinių ląstelių skaičiaus ir klinikinių mastitų pasireiškimas ... 41
3.7 Prieskrandžių turinių tyrimai ... 43
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 45
IŠVADOS ... 47
REKOMENDACIJOS ... 48
5 DETOKSIKUOJANČIO PREPARATO PANAUDOJIMAS KARVIŲ MIKOTOKSIKOZIŲ
PROFILAKTIKAI
Jolita Stankevičiūtė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Dideli mikotoksinų kiekiai karvėms sukelia mikotoksikozes ir tam tikrus sveikatos sutrikimus. Mikotoksinų detoksikavimui pašaruose atrasta įvairių metodų ir būdų. Atliktame tyrime panaudotas biologinis detoksikavimo metodas. 87-nios melžiamos karvės gavo mikotoksinus adsorbuojantį preparatą. Sudaryta kontrolinė ir bandomoji melžiamųjų karvių grupė preparato poveikiui įvertinti. Pašarai tirti pagal plonasluoksnės chromatografijos (PLCh) Romer Labs. Inc metodikas (Austrija). Biocheminiai kraujo tyrimai nustatyti naudojant automatinį biocheminį analizatorių „COBAS INTEGRA 400 plus“ (Šveicarija). Morfologiniai kraujo tyrimai nustatyti „Abacus junior vet“ analizatoriumi Stambiųjų gyvūnų klinikoje. Karvių prieskrandžių tyrimai atlikti paėmus prieskrandžio turinį. Vertintos prieskrandžio pH vertės ir apskaičiuoti prieskrandžio turinio infuzorijų skaičiaus pokyčiai. Pieno sudėties ir kokybės vertinimai atlikti gavus periodinius duomenis iš VĮ „Pieno tyrimai“ įmonės. Įvertinti tyrimo vietoje aplinkos rodikliai su specialiais prietaisais ir analizatoriais. 30-tą tyrimo dieną bandomojoje grupėje nustatyta, kad GGT vidurkis sumažėjęs 44,04 proc. (p<0,05), BILT-3 koncentracijos vidurkis sumažėjęs 12,5 proc. (p<0,01), LDH vidurkis sumažėjęs 29,09 proc. (p<0,05), WBC vidurkis sumažėjęs 34,60 proc. (p<0,01) nuo tyrimo pradžios. Bandomojoje grupėje 63-čią tyrimo dieną pieno urėjos vidurkis buvo sumažėjęs 21,11 proc. (p<0,05). Somatinių ląstelių skaičius sumažėjo piene 30-tą tyrimo dieną 13,12 proc. (p<0,01), o tyrimo pabaigoje sumažėjo 49,74 proc. (p<0,05) tiriamosiose grupėse. Klinikinių mastitų tiriamąjame ūkyje sumažėjo 66,70 proc. (p<0,05). Bandomosios karvių grupės 30-tą tyrimo dieną infuzorijų skaičiaus vidurkis prieskrandžių turinyje padidėjęs 2,56 proc. (p<0,05) nuo tyrimo pradžios.
Raktažodžiai: detoksikuojantis preparatas, karvės, mikotoksikozės, mikotoksinai, kraujas, pienas, mastitai, prieskrandžio turinys.
6 USE OF DETOXIFYING AGENT FOR THE PREVENTION FROM MYCOTOXICOSIS IN
COWS Jolita Stankevičiūtė
Master‘s Thesis
SUMMARY
High levels of mycotoxins in cows cause mycotoxicosis and certain health problems. Various methods and techniques have been discovered for detoxifying mycotoxins in feed. The research used a biological detoxication method. 87 dairy cows received mycotoxin adsorbent preparation. A control and experimental group of dairy cows was developed to evaluate the effect of the product. The feed was analyzed by thin layer chromatography (PLCh) Romer Labs. Inc. Methodologies (Austria). Biochemical blood tests were performed using an automated COBAS INTEGRA 400 plus biochemical analyzer (Switzerland). Morphological blood tests were performed with the Abacus junior vet analyzer at the Large Animal Clinic. The stomach contents of the cows were analyzed. Stomach pH values were evaluated and changes in the number of stomach contents infused were calculated. The composition and quality of milk were evaluated by receiving periodic data from the enterprise "Pieno Tyrimai". Environmental indicators with special instruments and analyzers were evaluated. On the day 30 th of the study the test group showed a 44.04 % reduction
in GGT (p<0.05), the concentration of BILT-3 decreased by 12.5 % (p<0.01), LDH decreased by 29.09 % (p<0.05), WBC decreased 34.60 % (p<0.01) from the start of the study. In the test group milk urea was reduced by 21.11 % on Day 63 th of the study (p<0.05). Somatic cell counts in milk
decreased by 13.12% on day 30 th of the study (p<0.01) and decreased by 49.74 % at the end of the
study (p<0.05) in the study groups. Clinical mastitis in the study farm decreased by 66.70 % (p<0.05). On the 30 th day of the test group the number of rumens infusions increased by 2.56 %
(p<0.05) from the beginning of the study.
Key words: Detoxifying agent, cows, mycotoxicoses, mycotoxins, blood, milk, mastitis, rumen contents.
7
SANTRUMPOS
DON - Deoksinivalenolis AF - Aflatoksinas ZEA - Zearalenonas OTA - Ochratoksinas A FUM - Fumonizinas ALP – Šarminė fosfatazėALT – Alaninino aminotransferazė AST – Aspartato aminotransferazė ALB - Albuminai
CREAJ - Kretininas
BILT-3 – Bendras Bilirubinas GLUC - Gliukozė TP – Bendrieji baltymai GGT – Gama gliutamiltransferazė LDH – Laktato dehidrogenazė UREA - Šlapalas WBC - Leukocitai LYM - Limfocitai MON - Monocitai NEU - Neutrofilai RBC - Eritrocitai HGB - Hemoglobinas HCT - Hematokritas PLT - Trombocitai
SC – Somatinių ląstelių skaičius PSO – Pasaulio sveikatos organizacija
8
ĮVADAS
Toksiškos medžiagos yra plačiai paplitusios aplinkoje. Mikotoksinai gali būti randami įvairiuose maisto produktuose ir gyvulių pašaruose (2). PSO organizacija teigia, jog 25 proc. pasaulio maisto yra užteršta mikotoksinais (3). Daugiausiai mikotoksinais užterši būna kukurūzai, kviečiai, silosai. Pagrindinės toksigeninės grybų rūšys priklauso Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp. Alternaria spp. gentims (4). Iki šiol aptikta daugiau kaip 300 skirtingų mikotoksinų (2).
Mikotoksinai maisto produktuose ir pašaruose turi neigiamos įtakos organoleptinėms savybėms, o dėl to blogėja maistinė vertė. Užterštų pašarų vartojimas daro neigiamą poveikį gyvūnų sveikatai. Nustatytas stipresnis poveikis monogastriniams gyvūnams. Atrajotojai dažniausiai laikomi atsparesni mikotoksinų poveikiui, tačiau įtakos turi toksinų rūšis, kiekiai ir jų tarpusavio sąveika (3).
Priklausomai nuo mikotoksinų pobūdžio, toksinai gali būti kancerogeniniai, mutageniniai, teratogeniniai, estrogeniniai ir kiti (5). Kai kurios atrajotojų ligos yra tiesiogiai susijusios su mikotoksinų įsisavinimu. Didžiausią reikšmę žemės ūkiui ir visuomenės sveikatai turi aflatoksinai, ochratoksinai, trichotecenai, fumonizinai, zearalenonas ir skalsių alkaloidai (6).
Toksinai veikia įvairius organus ir audinius. Mikotoksinai, kuriuos gamina Fusarium spp gentys, gali sukelti didelius produktyvumo nuostolius, o aflatoksinai pripažįstami kaip labai stiprūs toksinai (7). Tinkamas rizikos valdymas priklauso nuo žinių apie šių medžiagų absorbciją, metabolizmą, toksinį poveikį, bei praktines priemones jų mažinimui (8).
Mikotoksinai pasižymi dideliu fiziniu ir cheminiu stabilumu, o pašaruose gali išlikti net po pašalinimo įprastiniais metodais (4). Dažniausiai naudojamas būdas apsaugoti gyvūnus nuo mikotoksikozės – absorbentų panaudojimas, kurie, kaip manoma, jungia mikotoksinus virškinimo trakte. Perspektyviausi pašarų detoksikavimo metodai – biologiniai (9).
Darbo tikslas: Įvertinti detoksikuojančio preparato panaudojimą karvių mikotoksikozių profilaktikai.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti tyrimo vietos aplinkos rodiklius ir pašarų mikotoksinų koncentracijas.
2. Įvertinti detoksikuojančio preparato poveikį kraujo biocheminiams ir morfologiniams rodikliams.
3. Įvertinti detoksikuojančio preparato poveikį pieno rodikliams.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Pašarų svarba
Mikotoksinai yra antriniai metabolitai, kuriuos gamina mikotoksiniai grybai, kurie daugiausiai priklauso Aspergillus, Penicillium ir Fusarium gentims (10). Pelėsių gamybos produktai gali išsivystyti įvairiuose augalų augimo etapuose: lauke, derliaus nuėmimo metu, transportuojant ar sandėliuojant. Mokslininkai grybelines rūšis produkuojančius mikotoksinus skirsto į dvi grupes: lauko ir sandėlio (11).
Veiksniai, turintys įtakos mikotoksinų gamybai, yra temperatūra, drėgmė, deguonis, substrato aeravimas, mikrobų sąveika, mechaniniai pažeidimai, užsikrėtimas vabzdžiais. Toksiškos grybelinės sporos yra visur dirvožemyje, ore ir vandenyje. Kai sąlygos yra palankios, pelėsiniai grybeliai gali sudygti ir gaminti toksinus (1). Jie gali išsivystyti temperatūroje nuo 10 iki 40 ℃, o vandens aktyvumas turi būti didesnis nei 0,7, pH optimalios vertės vystymuisi yra 4 – 8. Aspergillus spp. daugiausia auga karštame klimate, o dauguma Fusarium spp. ir Penicillium spp. švelnesnio klimato zonose (4). Miraglia M. ir kt. (2006) teigia, kad mikotoksinų atsiradimo būdai Europoje turėtų keistis dėl kylančios vidutinės temperatūros (10).
Mikotoksinai kelia pavojų pašarų tiekimo grandinei, darančiai įtaką ekonomikai ir tarptautinei prekybai. Buvo nustatyta, kad daugelis pašarų mėginių užteršti daugiau nei vienu mikotoksinu. Daugeliu atvejų koncentracijos buvo pakankamai žemos, kad būtų užtikrinta atitiktis Europos Sąjungos rekomendacinėms vertėms arba didžiausiam leistinam lygiui (11). Daugelyje pasaulio šalių pašarų užterštumo rodikliai siekia iki 100 proc., o vidutiniškai - 30 - 40 proc. (12).
Teigiama, kad yra daugiau kaip 300 chemiškai skirtingų mikotoksinų, kuriuos sudaro daugiau kaip 350 grybų rūšių. Gyvūnų sveikatos ir produktyvumo požiūriu svarbiausi Fusarium spp. toksinai yra DON ir ZEA (13).
Daugelyje šalių leistinas DON kiekis grūduose ir kituose pašaruose, maisto produktuose ribojamas įstatymais. Nepaisant šių pastangų, grūdų užterštumas ir toliau kelia grūdų auginimo grėsmę (24). Europoje DON randama daugiau nei 50 proc. tirtų mėginių. Ištyrus 18884 mėginius 2007 – 2012 m. iš ES valstybių narių ir Norvegijos DON nustatyta atitinkamai 44,6 proc., 43,5 proc., ir 75,2 proc. neapdorotų grūdų, maisto ir pašarų mėginiuose (26).
Taip pat susirūpinimą keliantys mikotoksinai yra šie: Aflatoksinas, kurį paprastai gamina Aspergilus spp., pelėsiai, T-2 toksinas ir fumonizinas, kuriuos gamina Fusarium formos, ochratoksinas, gaminamas iš Penicillium spp. mikotoksinių grybelių (15).
Aflatoksinai yra daugelyje tipiškų daug energijos naudojančių koncentratų. Jie randami javų grūduose, kukurūzų glitime, sojų pupelių produktuose, taip pat aliejinių augalų, tokių kaip saulėgrąžų, medvilnės sėklų, palmių branduolių ir kopros spaudinuose. Kukurūzuose randama
10 mikotoksinų - fumozino, zearalenono, o javų grūduose dažniau būna trichotecenų deoksinivalenolio ar ochratoksinų, skalsių alkaloidų. Melžiamų karvių raciono mikotoksinų šaltinis – koncervuotų pašarų, tokių kaip silosas, šienas ir šiaudai vartojimas (16).
Silose dažniausiai randama mikotoksinų, priklausančių Penicillium spp. Aspergillus spp. ir Fusarium spp. gentims. Be laukinių mikotoksinų, gijinių grybų dauginimasis vėliau veikiant orui tiekimo metu gali dar labiau padidinti siloso mikotoksinų kiekį (17).
Pašaruose esantys toksinai gali būti pernešami žmonėms per pieną ir mėsą (15). Gyvūnai, vartojantys mikotoksinais užterštus pašarus, gali gaminti pieną, kuriame yra nuodingų likučių ir biotransformacijos produktų (18).
1.2 Didžiausią žalą karvėms darantys mikotoksinai
1.2.1 Deoksinivalenolis (DON)
DON priskiriamas prie toksiškiausių mikotoksinų, kuriuos gamina Fusarium spp. grybų rūšys (19). Daugiausia DON gaminamas F. graminearium ir F. culmorum grybų rūšių (20). F. graminearium grybų rūšis yra endeminė kviečių ir kitų javų tarpe visame pasaulyje (21).
DON priklauso B tipo trichotecenams, kurie yra labiau fitotoksiniai. B tipo trichotecenai netirpūs vandenyje arba mažai tirpūs ir turi mažą molekulinę masę. Jie yra stalibūs esant skirtingoms aplinkos sąlygoms (2).
Trichotecenams būdingas citotoksinis, imunotoksinis ir kancerogeninis poveikis. DON slopina baltymų sintezę ląstelėse, taip trinka lastelių dalijimasis ir RNR ir DNR sintezė. Be to, DON sustiprina ląstelių apoptozę, daugiausiai paveikiami limfoidiniai ir kraujodaros audiniai (19).
Pieniniams galvijams DON poveikis siejamas su sumažėjusiu pašaro suvartojimu, sumažėjusia pieno gamyba, produkcijos sutrikimais, žarnyno uždegimais ir hemoragijomis bei nekroze (1).
Atrajotojai gali kelias savaites toleruoti iki 8,5 mg/ g DON nerodydami stipresnių sveikatos sutrikimų. Tačiau jei karvės kenčia nuo prieskrandžio acidozės, išsivysto prieskrandyje mikroorganizmų balanso sutrikimas, dėl to nepasišalina DON iš organizmo ir įvyksta nepilnas mikotoksino skilimas. Seeling J.M. ir kt. (2006) teigia, jog DON buvo susijęs su pakitusia prieskrandžio fermentacija ir sumažėjusiu baltymų srautu į dvylikapirštę žarną (22).
Whitlow L.W. ir kt. (1994) nustatė, kad vidutinė pieno gamyba koreliavo su pašarais, užkrėstais DON (500-900 ng/g). Dänicke S. ir kt. (2005) pranešė apie padidėjusią prieskrandžio amoniako koncentraciją ir sumažėjusių baltymų koncentraciją pieninėms karvėms, kurios buvo šertos DON užkrėstu pašaru (16).
Mokslininkų atliktame tyrime didelės gryno DON dozės nesudarė karvėms pastebimų sveikatos problemų, tačiau mažesnės DON dozės su kitais mikotoksinais koreliavo tarpusavyje.
11 Karvėms sumažėjo pieno gamyba, pranešta apie nervinius simptomus, viduriavimą ir kraujavimą iš žarnyno. Pašaruose DON buvimas paprastai susijęs su kitais mikotoksinais, kuriuos nelengva nustatyti (7).
Atrajotojai yra mažiausiai jautrios gyvūnų rūšys DON toksinui, kadangi jų prieskrandžio mikroflora geba detoksikuoti šį mikotoksiną (10). Pieniniai galvijai yra jautresni DON poveikiui lyginant su mėsiniais galvijais ir avimis. DON toksino poveikis pieninėms karvėms ir veršeliams vis dar nepatikslintas. Gauti prieštaringi rezultatai kelių tyrimu metu. Manoma, kad šie prieštaringi rezultatai galimi dėl prieskrandžių skirtingo aktyvumo paverčiant DON pirminę molekulę į mažiau toksiškus metabolitus (27).
1.2.2 Aflatoksinai
Aflatoksinai – metabolinės antrinės medžiagos, kurias produkuoja daugiausiai Aspergillus flavus, A. parasiticus ir A. nomius mikotoksinų grybų rūšys (28). Aflatoksinai (AF) chemiškai klasifikuojami į difurokumarolaktonus. Pašaruose gaminami keturi pagrindiniai AF tipai yra B1, B2, G1, G2. A. flavus produkuoja B1 ir B2 mikotoksinus, o A. parasiticus gamina visus keturis mikotoksinų tipus (23).
Aflatoksinai gaminami 12 - 40 C° temperatūroje, kai aplinkos drėgmė 3 - 18 proc. (1). A. parasiticus pelėsiai užteršia ir vystosi ant aliejinių augalų, tuo tarpu A. flavus dažniau vystosi grūduose. Daugiausia pasaulyje AF užteršiami javai ir jų produktai, žemės riešutai (29). AF 2008 m. įtraukti į (RASFF) Europos Sąjungos greitojo įspėjimo apie maisto produktus ir pašarus sistemą (28).
Galvijų lėtinio apsinuodijimo AF metu būna sumažėjęs apetitas, sumažėja svoris ir pieno išeiga, galvijai sunaudoja mažiau pašaro, atsiranda kepenų pažeidimai (30).
Prieskrandyje aflatoksinai mažai suyra. Pašaruose esantys AF jungiasi su atrajotojų turiniu ir tik 2 – 5 proc. toksinų patenka į žarnyną. Aflatoksino B1 didelis kiekis (100 µg/ kg) galvijams toksiškas. Tačiau buvo atvejų, kai AF B1 koncentracija pašaruose 60 – 300 µg/kg nepaveikė atrajotojų sveikatos. Subrendę pieniniai galvijai yra mažiau jautrūs AF poveikiui nei veršeliai (23).
Pakistane 2015 m. buvo nustatytas aflatoksinų protrūkis skirtingo amžiaus pieninėms karvėms keliuose ūkiuose. Pranešta, kad karvėms į pašarus buvo įmaišyta naujas ingredientas – kukurūzai. Po 3 val. šėrimo pastebėti pirmieji karvių gaišimai, atsirado staigus viduriavimas (31).
AF B1 Tarptautinė vėžio tyrimų agentūra priskyrė 1 grupės kancerogenui. Qureshi M. A ir kt. (2015) teigė, kad AF B1 pereina kraujo smegenų barjerą sukeldami mitochondrijų DNR ir smegenų ląstelių struktūros ir funkcionavimo anomalijas (28).
2013 m. Europos šalys, įskaitant Rumuniją, Serbiją, Kroatiją, pranešė apie pieno užterštumą AF. Pieno pasterizavimas negali apsaugoti nuo užteršimo AF M1. Awasthi V. ir kt. (2012) pranešė, kad nei virimas, nei pasterizavimas nepadidino AF M1 lygio galvijų piene (28).
12 Toksiška ir kancerogeninė M1 AF forma, atsirandanti skylant B1 AF kepenyse, gali būti išskiriama į pieną. Dėl didelio pieno ir pieno produktų kiekio suvartojimo svarbu išlaikyti saugią aflatoksino M1 koncentraciją piene (29).
Nustatytos priimtinos aflatoksinų koncentracijos piene ir pašaruose. FDA nustatė, kad AF žaliame piene ir žindančiose karvėse turi būti ne didesnės koncentracijos kaip 0,5 ir 20 μg/ kg. Europos komisijos nustatyta AF M1 didžiausia leidžiama koncentracija yra 0,05 μg/ kg piene. Stroud J. (2006) atliko tyrimą, kurio metu karvės buvo šeriamos AF B1 mažesnėmis koncentracijomis, kaip 50 μg/ kg. Tyrimo metu nustatyta, kad pakanka šios AF koncentracijos, kad viršytų M1 kiekis piene FDA leistinas ribas (33). AF M1 kiekis piene paprastai sudaro 1 – 2 proc. išgerto AF B1. Didelio produktyvumo karvėse šis AF procentas gali siekti 6 proc. išgertame piene. Melžiamų avių AF M1 pernešimas į pieną yra mažesnis (34).
1.2.3 Zearalenonas (ZEA)
Zearalenonas yra Fusarium spp. mikotoksinių grybų gaminamas toksinas, kurio cheminė struktūra panaši į estrogeną (35). Pašaruose esančios ZEA įvairios formos yra I klasės metabolitai ir II klasės junginiai (36).
ZEA daugiausia gamina Fusarium graminearum, F. culmorum, F. semitectum, tačiau svarbiausias F. graminearum mikotoksinų gamyboje (23). ZEA ir DON yra labiausiai paplitę Fusarium spp. mikotoksinai, kurie daugiausiai aptinkami gyvūnų pašaruose (37). ZEA gali būti randamas kartu su DON, nes tos pačios rūšies grybeliai F. graminearum ir F. culmorum gali gaminti abu mikotoksinus (38).
Daugumoje pasaulio vietų ZEA aptinkamas šiene, silose, kukurūzuose ir kituose grūduose (1). Fusarium spp. grybeliai gali augti drėgnomis ir vėsiomis sąlygomis, bei įsiskverbti į pasėlius prieš derliaus nuėmimą ir po jo. Taip pat įtakos vystytis turi netinkamos pasėlių laikymo sąlygos. ZEA yra stabilus šilumai mikotoksinas, tačiau šarminėmis sąlygomis, esat 150 C°, gali būti suardomas (2).
Yra duomenų apie skirtingą ZEA biotransformaciją. Pavyzdžiui, galvijai daugiausia ZEA paverčia b – zearalenoliu, o kiaulės a – zearalenoliu (39). ZEA redukavimas į metabolitus daugiausia vyksta per kepenų veiklą, tačiau galvijams ir atrajotojams ZEA skaldo pirmuonys prieskrandyje (20). Buvo pranešta, kad galvijų hepatocitai ir granuliozinės ląstelės daugiausia gamina b-ZOL, kurie buvo rasti kaip vyraujantis metabolitas šlapime ir išmatose, kai karvės buvo šeriamos ZEA (38).
ZEA žinoma, kad sukelia estrogeninį poveikį, tokį kaip hiperestrogenizmas, kiaušidžių atrofijas ir pokyčius endometriume (39). Hiperestrogenizmo atvejai atrajotojams labai reti, nors ir ZEN jungiasi su estrogeno receptoriais. Taip yra todėl, kad a-zearalenolis pasižymi prasta absorbcija. Šis antrinis metabolitas dažnai naudojamas kaip augimą skatinanti priemonė galvijams
13 penėjimo metu, pasak Launay F.M. ir kt. (2004), bei Blokland M.H. ir kt. (2006). ZEA koncentracija neturėtų būti didesnė kaip 250 ppm atrajotojų racione (23).
ZEA – abortų, makšties ir tiesiosios žarnos prolapsų sukėlėjas (17). Atliktame tyrime karvių nevaisingumas, sumažėjęs pieno gaminimas buvo susijęs su ZEA. Telyčios buvo maitinamos su ZEA tris ciklus, kurių metu pastojimo procentas sumažėjo nuo 87 proc. iki 62 proc. (38).
Pagrindiniai ZEA padariniai reprodukcinės problemos ir lytinių organų pokyčiai, kurie panašūs į estradiolio (3). Hiperestrogenizmo pasekoje susidariusio dėl ZEA toksino atlikto mokslininkų tyrimo metu karvėms pasireiškė makšties ir tešmens patinimai, susidarė kiaušidžių cistos ir sutriko kiaušialąsčių vystymasis (41).
ZEA turi genotoksinį ir citotoksinį poveikį in vitro ar ex vivo ir yra potencialiai kancerogeniškas. Taip pat žinoma, kad šis mikotoksinas imunotoksiškas, tačiau jo funkcija uždegiminiame atsakyme dar nėra visiškai suprantama. ZEA veikia kaip uždegiminių citokinų gamybos aktyvatorius ir slopiklis (37).
ZEN ir jo metabolitai išsiskiria į galvijų pieną, tačiau jų kiekiai gana maži ir dažniausiai nesiekia išmatuojamo lygio. Huang K. ir kt. (2014) pastebėjo, kad ZEN aptinkamas ne tik žaliame piene, bet ir pieno milteliuose ir pasterizuotame piene (20). Vienai melžiamai karvei davus 7 d. ZEA 200 mg su pašarais, nustatyta, kad 0,7 proc. ZEA pateko į pieną. Atliktuose tyrimuose su mėsiniais galvijais, ZEA nei jų metabolitų nepavyko aptikti raumenyse, subproduktuose ir nugariniuose riebaluose (19).
Korosteleva S.N. ir kt. (2007) pastebėjo padidėjusį bendrą baltymų ir globulino kiekį eksperimentinėse karvėse, kurios buvo šeriamos ZEA užterštais pašarais. Taip pat yra duomenų, kad DON ir ZEA padidina žarnyno pralaidumą palengvindami antigenų tekėjimą iš žarnyno, dėl to kyla grėsmė uždegimams (41).
Monogastriniai gyvūnai labiau jautrūs ZEA poveikiui nei atrajotojai, tačiau buvo atvejų, kai ZEA toksinis poveikis pasireiškė panašiai veršeliams ir jaunoms telyčioms (40).
Karvių karštligės klinikiniai požymiai, atsirandantys dėl ZEA, yra labai reti ir jie atsiranda tik labai užterštų pašarų atvejais (39).
1.2.4 T-2 toksinas
T–2 toksinas yra A tipo trichotecenų mikotoksinas, kurį gamina skirtingos Fusarium spp. rūšys, tokios kaip F. sporotrichioides, F. poae, F. acuminatum ir kt. T-2 mikotoksiniai grybeliai vystosi ant įvairių javų grūdų, drėgnomis laikymo sąlygomis (42).
Šis toksinas daugiausia randamas kviečiuose, kukurūzuose, miežiuose, avižose ir rugiuose bei perdirbtuose grūduose (43). Buvo nustatyta, kad avižos ir jų produktai daugiausia užteršti T-2 ir HT-2 toksinų kiekiais (10).
14 Pranešta apie T–2 toksino ir susijusių mikotoksinų buvimą visame pasaulyje, jie vyrauja atogrąžų ir subtropikų regionuose. Palankus drėgmės kiekis šiems toksinams vystytis – nuo 12 iki 22 proc. Optimali temperatūra T–2 toksinui gamintis apie 15 C°. T–2 toksinas gali būti produkuojamas ir žiemos metu drėgnomis laikymo sąlygomis ar net lauke po sniego danga (44).
Iš trichotecenų T-2 toksinas – toksiškiausias. Nustatyta, kad jis slopina baltymų ir DNR sintezę bei silpnina imuninį atsaką gyvūnams (45). T-2 toksinas veikia aktyviai besidalijančias ląsteles: virškinamojo trakto, skydliaukės, eritroidines ląsteles ir kt. (12).
T-2 mikotoksinas išsiskiria iš kitų trichotecenų, kadangi sukelia sisteminį poveikį, bet kokiu sąlyčio būdu, tai yra per odą, per burną ar kvėpavimo takus. Mikotoksino perdavimas gali vykti tiesiogiai liečiant užterštus daiktus, paviršius, kurie nebuvo tinkamai nukenksminti (46).
Trichotecenų poveikis yra beveik visose gyvūnų organizmo sistemose. T-2 toksikozės susiję su baltymų sintezės slopinimu, kuriuos inicijuoja metaboliniai mechanizmai. Be citotoksinio aktyvumo T-2 toksinas turi imunosupresinį poveikį, dėl kurio sumažėja atsparumas infekciniams mikrobams. Kartu jie sukelia virškinamojo trakto sutrikimus, dermatologinius ir neurologinius požymius (47).
Jauniems atrajotojams, kurių prieskrandis nėra visiškai funkcionuojantis, gali būti didesnis jautrumas T-2 toksinui. Ekspozicija 0,3 mg T-2 toksino 1 kg kūno svorio per parą gali sukelti virškinamo trakto pažeidimus, pakitusius serumo baltymus bei hematologinius pokyčius. Suaugusių atrajotojų intoksikacija retesnė (39).
T-2 ir susijusių mikotoksinų toksiškumui įtakos gali turėti įvairūs veiksniai: toksino vartojimo būdas, ekspozicijos laikas, ekspozicijų laikas, dozė, gyvūno amžius, lytis ir bendra sveikatos būklė bei kitų mikotoksinų buvimas. Patekęs per burną, odą, ar įkvėpus T-2 toksinas gali sukelti stiprų poveikį įvairiems gyvūnams įskaitant ir karves, pažeisti jų organus ar audinius (49).
Nustatyta, kad T-2 toksinas turi vietinį dirginantį poveikį ir sukelia serozinį hemoraginį uždegimą, nekrozes ir opas virškinamajame trakte, vegetacinės nervų sistemos, kepenų, inkstų, širdies, smegenų ir vegetacinės nervų sistemos ganglijų distrofiją (46). Atlikto tyrimo metu 7 karvės mirė nuo didelių virškinamojo trakto pažeidimų ir sukelto kraujavimo, šis epizodas buvo susijęs su T-2 toksino intoksikacija (39).
Burnos ertmės pažeidimai karvėms dažniausiai silpnesni nei kitoms gyvūnų rūšims. Pastebima tik burnos gleivinės hiperemija ir edema. Atrajotojams labiau būdingi T-2 toksino požymiai – drebulys ir užpakalinių galūnių paralyžius. Veršeliams sumažėja imuninis atsakas dėl T-2 toksino poveikio. Įrodyta, kad veršeliai, paveikti T-T-2 toksinu, turi mažiau imunoglobulinų, komplemento baltymų, baltųjų kraujo kūnelių ir neutrofilų kraujo serume (46). Be to, T-2 toksinas trikdo antigenus pristatančių ląstelių brendimą, pakeisdamas limfocitų proliferacijos antikūnų lygį, dėl kurio padidėja jautrumas infekcinėms ligoms (39).
15 T-2 dažnai galima aptikti pašaruose su kitais mikotoksinais ar jų metabolitais, tai akivaizdžiai daro didelį poveikį besivystančioms ligoms, kurių kilmė toksiška. Sukeliamas sinergetinis ar papildomas toksinis poveikis gyvūnams. Tačiau manoma, kad T-2 greitai metabolizuojamas ir greita biotransformacija neleidžia toksinui kauptis gyvūnų audiniuose (19).
Dänicke S. ir kt. (2013) savo tyrimais atskleidė, kad gyvūnai, šerti pašarais su A ar B tipo trichotecenais, išskyrė mikotoksinus kartu su pienu ir kitais medžiagų apykaitos sekretais (20).
1.2.5 Ochratoksinas A (OTA)
OTA – mikotoksinas, kurį gamina keli Aspergillus spp. ir Penicilium spp. genties grybai, daugiausia P. verrucosum, A. ochraceous (50). Šios rūšys auga skirtingomis klimato sąlygomis. Aspergillus spp. aptinkama atogražų regionuose, tuo tarpu Penicilium spp. grybeliai labiau paplitę vidutinio klimato regionuose ir gali augti, kai temperatūra vos siekia 5 ℃. OTA daugiausia susidaro nuėmus derlių nepakankamai išdžiovintuose grūduose ir jų produktuose. Veiksniai, darantys įtaką OTA gamybai, yra aplinkos sąlygos, temperatūra, vandens aktyvumas, taip pat sėklų rūšis ir jų vientisumas. A. ochraceous geriau auga aliejinių augalų sėklose, o P. verrucosum auga kviečiuose ir kukurūzuose (51).
Ochratoksinas A - žinomas toksinas gyvūnams, dėl nefrotoksinio, imunotoksinio ir kancerogeninio poveikio. Manoma, kad OTA toksiškumas yra pakankamai rimtas, nes OTA yra tarp maždaug 20 stebimų mikotoksinų maiste (52). Atlikti mokslininkų tyrimai parodė, kad OTA yra hepatogeninis, neurotoksinis, teratogeninis įvairiems gyvūnams, šis toksinas labiausiai sutrikdo inkstų veiklą, o pagrindinis poveikis – kancerogeninis (53).
Atsižvelgiant į atrajotojų detoksikacijos potencialą ir paprastai žemą OTA pasireiškimo pašaruose indikaciją, nenuostabu, kad OTA tarša nėra atrajotojų pašarų mikotoksinų problema. Tačiau negalime atmesti tam tikro OTA užteršimo dietomis, atsižvelgiant į atrajotojams siūlomų pašarų įvairovę (54).
OTA nesikaupia atrajotojų organizme dėl greito detoksikacijos mechanizmo, kuris prasideda didžiajame prieskrandyje (52). Ochratoksikozės atrajotojams pasitaiko retai, nes prieskrandžio mikroorganizmai sugeba hidrolizuoti OTA amidinį ryšį, kad gautų OTA α (3). Dėl savo prieskrandžio mikroorganizmų atrajotojai gali toleruoti OTA iki 100 mg per dieną (19). Vertinant atrajotojų OTA riziką reikia atsižvelgti į du aspektus: OTA skilimą į mažiau toksišką Otα, bei metabolitų ir OTA išnykimo greitį iš gyvūno ir produkto (54). OTA fermentiniu būdu veikiant karboksipeptitazei A gali būti hidrolizuota iki mažiau toksiškos žarnyne veikiant bakterijoms atrajotojų tarpe (53).
Nustatyta, kad atrajotojų dieta turi įtakos OTA skaldymui veikiant prieskrandžio mikroflorai. Nuo esamos dietos priklauso infuzorijų skaičius, kuris atsakingas už OTA skilimą. Nustatytas maksimalus pirmuonių skaičius ir greitas OTA skilimas, kai atrajotojų pašarus sudarė 40 proc.
16 rupiųjų pašarų ir 60 proc. koncentratų. Atliktame tyrime įpylus krakmolo į atrajotojų racioną OTA pusinės eliminacijos laikas buvo 1,9 val., o pridėjus celiuliozės padidėjo iki 4,5 val. (54).
Kraujotakoje beveik visi OTA yra stipriai sujungti su serumo baltymais, daugiausia albuminu. OTA ir serumo albumino sąveika daro įtaką toksino pusinės eliminacijos periodui kraujyje ir iš esmės skiriasi pagal gyvūno rūšį. Sreemannarayana ir kt. pranešė, kad atrajotojų ir veršelių OTA pusinės eliminacijos laikas yra apie 77 valandos (55).
Atliktų tyrimų metu po OTA pasiskirstymo audiniuose, paaiškėjo, kad OTA didžiausia koncentracija lieka inkstuose, kiek mažiau kepenyse ir raumenyse (52). OTA sukėlė inkstų išsiplėtimą ir spalvos pasikeitimą, o vėliau šlapimo rūgšties kaupimąsi. Atliktuose tyrimuose nustatyta, kad OTA iš esmės veikia proksimalinius inkstų kanalėlius, slopindamas fermento fosfoenolpiruvato karboksilazę, tai keičia funkcinį inkstų gebėjimą metabolizuoti kalcį. Morfologiškai inkstuose pasireiškia proksimalinių kanalėlių atrofija ir sklerozė (50).
OTA aptiktas ne tik pašaruose, gyvūninės kilmės šaltiniuose, bet ir pieno produktuose. Didžiausią susirūpinimą dėl pieno užterštumo mikotoksinais daugiausia lemia AFB1 ir OTA. Nedideli OTA likučiai gali likti karvės piene, nebent vartojamos didelės dozės šio mikotoksino ir lieka didesni kiekiai OTA ir jo skilimo produktų (57). Kai kurie tyrimai parodė, kad atrajotojų piene buvo OTα, kai jiems buvo duodami OTA užteršti pašarai (23).
Galtier P. (1991) atliktame tyrime apskaičiavo, kad karvė šerta 1 g OTA užterštais pašarais, per dieną į pieną išskirtų 100 μg/ kg OTA, o tai atitinka 0,01 proc. santykinės pernašos (20).
1.2.6 Fumonizinai (FUM)
Fumonizinai – grupė mikotoksinų, kuriuos daugiausiai gamina Fusarium verticillioides, F. proliferatum grybelių rūšys. Šie mikotoksinai produkuojami ypač šilto klimato regionuose, tačiau aptinkami visame pasaulyje, daugiausiai kukurūzuose. Yra daug fumonizinų homologų, tačiau svarbiausia FUM grupė yra B serija, kuriai priklauso fumonizinas FB1, FB2 ir FB3 (39).
Mokslininkų teigimu (EMST 2005) fumonizimai įvertinti kaip nepageidaujamos medžiagos gyvūnų pašaruose. Atrajotojai laikomi mažiau jautresni FUM poveikiui, nei arkliai ar kiaulės. Nustatyta, kad tiek galvijai, tiek avys ir ožkos turi panašų jautrumą šiam mikotoksinui (59).
Waskiewicz A. ir kt. (2012) pranešė, kad visuose analizuotuose kukurūzų miltų mėginiuose buvo aptiktas FB1, o 70,7 proc. tirtų mėginių nustatytas FB2 (58). USFDA nustatė FUM koncentracijas gyvūnų pašaruose, kurių gali būti nuo 1 iki 50 ppm atsižvelgiant į gyvūnų rūšį. Europos Sąjungos komisija taip pat rekomendavo FUM B1, B2 orientacinius lygius pašarinėse žaliavose ir paruoštuose pašaruose (63).
Nustatyta, kad FB1 sutrikdo sfingolipidų metabolizmą daugelio tipų ląstelėse ir audiniuose, įskaitant hepatocitus, neuronus ir inkstų ląsteles. Fumonizinai stipriai sutrikdo sfinganino ir sfingozino acetilinimą slopindami keramido sintezę. Dėl šio fermento slopinimo padidėja
17 tarpląstelinio sfinganino koncentracija (62). Laisvosios sfingoidinės bazės šlapime ir kraujyje buvo patvirtinti kaip gyvūnų FUM biomarkeriai, kurie susiję su toksiškumu (61). Dėl FUM toksinų perdirbami riebalai (sudėtiniai sfingolipidai) ir kaupiasi sfingoidinės bazės ir jų metabolitai organizme (64).
FB1 toksiškas kepenims ir inkstams daugelio ūkinių gyvūnų rūšių oragnizme, kadangi sukelia ląstelių negrįžtantį irimą (63). Įrodyta, kad FB1 yra hepatotoksiškas visoms gyvūnų rūšims (19). Osweiler G.D. ir kt. (1993) atliktame tyrime veršeliai buvo šeriami FUM skirtingomis koncentracijomis. Kai FUM koncentracija siekė 31 ppm veršeliams pasireiškė lengvi kepenų pažeidimai, o tiriamojoje grupėje buvo padidėję kepenų fermentų kiekiai. Veršeliams, šertiems didesniais FUM kiekiais, nustatyta sutrikusi limfocitų blastogenezė (22).
FUM, manoma, veikia ir imunotoksiškai. Kitą susirūpinimą FUM kelia dėl mutageniškumo, kuris, manoma, yra netiesioginis. Kai FUM metabolizuojami į DNR reaguojančius junginius, pasireiškia mutageninis jų poveikis gyvūnams (64).
Atskirai ir kartu su kitais mikotoksinas FB1 poveikis reprodukcijai buvo ištirtas naudojant galvijų granuliocitų ląsteles, FB1 neparodė jokio poveikio granuliozinių lastelių proliferacijai ir neturėjo reikšmingos įtakos progesterono gamybai. Naudojant FB1 1 - 3 µm koncentraciją buvo slopinama galvijų estradiolio gamyba, taip įrodyta šio toksino žala reprodukcijai (39).
FUM labai minimaliai absorbuojami atrajotojų, tai iš dalies paaiškina šio toksino pralaidumą. Kai veršeliai buvo šeriami FB1 ir FB2 toksinais, didelė dalis viso suvartoto mikotoksino buvo ne metabolizuojami, o šalinami su išmatomis. Šių mikotoksinų pėdsakų buvo randama šlapime. Tyrimuose, tiriančiuose prieskrandžio metabolizmą, buvo nustatyta, kad FB1 yra pakankamai skaidomas mikroorganizmų, o skaidymas užtrunka apie 72 val. FUM neturėjo jokio poveikio mikroorganizmų efektyvumui (63).
Pieniniams galvijams, šertiems 100 ppm FUM dozėmis, pasireiškė pieno gamybos sumažėjimas, taip pat buvo suvartojama mažiau pašaro. Nustatyta, kad pieniniai galvijai jautresni FUM poveikiui nei mėsiniai galvijai dėl produkcijos sumažėjimo (22).
Kai kurie tyrimai rodo, kad piene nėra užteršimo FUM mikotoksinais, juos gavus su pašarais. Tačiau buvo pranešta mokslininkų, kad FB1 į pieną patenka 0,05 proc., kai galvijams į 1 kg pašaro įmaišoma 3 mg toksino. FUM dažnis pieno mėginiuose nebuvo išsamiai ištirtas. Gazzoti T. ir kt. (2009) sukūrė metodą, kaip nustatyti ir kiekybiškai įvertinti FB1 pieno mėginiuose. Iš 10 tirtų mėginių 8 buvo užteršti virš kiekybinės ribos (0,26 μg/ kg). Pieno mėginiuose FB1 ir FB2 yra stabilūs termiškai juos apdorojant ir pasterizuojant 62 ℃ temperatūroje apie 30 min. ir laikant 11 dienų 4 ℃temperatūroje (20).
18
1.3 Detoksikacija
Maisto ir pašarų užterštumas mikotoksinais yra svarbi problema visame pasaulyje. Mikroskopiniai grybeliai gali būti sunkiai pašalinami iš pašarų ir maisto produktų (65). Kuriamos vis naujos metodikos mikotoksinams detoksikuoti. Dauguma mikotoksinų pasižymi dideliu cheminiu stabilumu, todėl skaidymo, nukenksminimo metodai, suderinti su maisto kokybės ir saugos standartais turėtų būti atliekami kuo efektyviau ir saugiau. Paskutiniais dešimtmečiais buvo plačiai ištirtos mikotoksinų biologinės, fizinės ir cheminės skaidymo ir eliminavimo strategijos. Biologinis, cheminis ar fizinis apdorojimas galėtų veiksmingai sumažinti maisto ir pašarų užteršimą mikotoksinais (66).
1.3.1 Biologiniai metodai
Biologiniai metodai apima mikotoksinų skaidymą, transformaciją arba adsorbciją. Daugiausia dėmesio skiriama mikotoksinų transformacijai ir biologiniam skaidymui, kurį sukelia įvairūs mikroorganizmai (67).
Adsorbuojantys agentai - vieni iš ekspozicijos mažinimo strategijų, kai sumažinamas biologinis prieinamumas. Dažniausiai į kombinuotuosius pašarus įtraukiami įvairūs mikotoksinų adsorbentai, dėl kurių sumažėja mikotoksinų įsisavinimas, taip pat mikotoksinų pasiskirstymas kraujyje ir organuose. Adsorbuojančios medžiagos taip pat vadinamos rišamosiomis medžiagomis, rišikliais (68).
Ląstelių sienelėse yra angliavandenių, baltymų ir lipidų, kurie gali turėti skirtingus adsorbcijos centrus. Taigi, gali būti įvairių adsorbcijos mechanizmų. Buvo tikimasi sukurti probiotikus kaip mikotoksinus adsorbuojančius agentus (69). Stoev S.D. (2013) teigė, jog adsorbcijos agentai yra labai naudingi norint išvengti aflatoksikozės, tačiau mažiau naudingi išvengiant kitų mikotoksinų (70).
Kita mikotoksinų agentų rūšis – biotransformuojantys agentai. Mikotoksinai skaidomi į netoksiškus metabolitus naudojant bakterijas, grybelius ar įvairius fermentus (68). Buvo nustatyta, kad Bacillus velezensis padermė pavadinta A2 po trijų dienų inkubacijos 37 ℃ temperatūroje Luria-Bertani terpėje visiškai suskaidė ZEA (69).
Doyle M.P. ir kt. (1978) nustatė, kad micelinis A. parasiticus NRRL 2999 mišinys gali suskaidyti AF B1 ir AF G1. Jų skilimo greitis proporcingai padidėjo padidėjus pradinei AF koncentracijai arba grybienos dydžiui. Kai kurie baltojo puvinio grybeliai, pasižymintys dideliu laktazės aktyvumu, galėjo suardyti AFB1 toksinus. Grybelius, turinčius skilimo prieš ZEA poveikį, apžvelgė Zinedine ir kt. (2007). Kitame tyrime Phoma sp. ne tik užkirto kelią formuotis AF, bet ir degradavo prieš tai suformuotus AF (70).
Teigė Brackett R.E. ir kt. (1995), kad daugelis mikroorganizmų, įskaitant bakterijas, mieles, pelėsius, dumblius gali pašalinti ar skaidyti aflatoksinus iš maisto produktų ir pašarų. Buvo
19 pranešta, kad kai kurios pieno rūgšties bakterijų padermės veiksmingai pašalina AF B1 iš užterštos skystos terpės (71).
Saccharomyces cerevisiae buvo nuolat tobulinamas kaip maistinis priedas ir gamybos metu buvo pridėtas prie pašarų, kad veiktų kaip detoksikacijos agentas slopinantis ZEA toksiškumą. Bueno D.J. ir kt. (2007) padarė išvadą, kad gyvybingos ir negyvybingos S. cerevisiae kolonijos ląstelės turi tą patį gebėjimą surišti AF B1. Tyrimai parodė, kad S. cerevisiae kolonizacija virškinimo trakte ne tik pagerina gyvūnų produktyvumą, sveikatą, taip pat sumažina ZEA biologinį prieinamumą (69).
Wilson J.C. ir kt. (2008) pranešė apie tirtus augalų ir dirvožemio mėginius, kuriuose nustatyti mikroorganizmai, galintys skaidyti trichotecenus. Galiausiai nustatytos dvi mišrios kultūros, nuosekliai mažinančios DON lygį oksidacijos būdu iki 3-keto-DON. Ištirti 43 bakterijų izoliatai ir identifikuotas Bacilus shackletonii L7, galintis redukuoti aflatoksiną B1, B2 ir M1 (72).
Fuchs E. ir kt. (2002) pirmą gryną kultūrą, galinčią detoksikuoti DON ir kitus trichotecenus, išskyrė iš karvių prieskrandžio. Ši kultūra Eubacterium sp., kuri pavadinta BBSH 797, gali oksiduoti tiek A, tiek B tipo trichotecenus (73).
Fermentinė mikotoksinų detoksikacija sujungia cheminio ir biologinio apdorojimo ypatybes ir juos sinerguoja. Tai lemia aukštą efektyvumą ir specifinį veikimą. Pakankamai sukaupta struktūrinių ir katalizinių duomenų apie įvairius fermentus modifikuojančius mikotoksinus, tačiau iki šiol paskelbta tik keletas apžvalgų, leidžiančių juos susisteminti. Pavyzdžiui, ZEA skaidymas vyksta nuskėlus laktono žiedą zearalenono hidrolaze, kurį išskiria Clonostachys rosea sp. Vienas iš galimų OTA skaidymo būdų yra jo amido jungties hidrolizė ochratoksinazės Otaze iš Ascomgcota Aspergillus niger (74).
Antioksidantai – imunostimuliuojantys agentai. Tai medžiagos, kurios nesąveikauja tiesiogiai su mikotoksinais. Manoma, kad antioksidantai nėra tokie efektyvūs kaip adsorbentai ar biotransformuojantys agentai, tačiau gali būti veiksmingi mažinant mikotoksinų toksiškumą (68).
1.3.2 Cheminiai metodai
Mikotoksinams detoksikuoti buvo išbandyta įvairių cheminių medžiagų įskaitant rūgštis, bazes, oksiduojančius reagentus, reduktorius, chlorinančius agentus ir įvairius reagentus (8).
Aflatoksinai gali būti detoksikuojami stiprių bazių ar rūgščių vandeniniais tirpalais. Stiprios rūgštys katalizuoja vandens pridėjimą prie aflatoksino B1 ir gaunamas aflatoksino B1 hidroksianalogas. Pons ir kt. mokslininkų tyrimų apžvalgose nustatyta, kad norit konvertuoti 95 proc. aflatoksino B1 vandeniniame tirpale, kurio pH 3, reikia mėginį laikyti apie 6 valandas 100C° temperatūroje (75). Aiko V. ir kt. (2016) aflatoksinus apdorojo praskiestomis rūgštimis, citrinos rūgštimis, pieno rūgštimis, o sąlygos buvo imituojančios virimo procesą (75).
20 T-2 toksinas gali būti oksiduojamas, bei apdorotas NaOCl 0,25 proc. apie 4 val. NaOCl pripažintas trichotecenų dezaktyvavimo agentas. Mokslininkų tyrimuose nustatyta, kad bentonitas surišo T-2 mikotoksiną, aflatoksinus ir ZEA (46).
Mikotoksinų cheminis apdorojimas dažnai neatitinka FAO rekomenduojamų kriterijų, nes kai kurios cheminės medžiagos gamina toksiškus metabolitus ir mažina pašarų maistinę vertę (66). Detoksikacijos cheminiu būdu sėkmė priklauso nuo pašaro ar maisto rūšies (76).
Keletas oksidatorių sunaikina AF, tačiau nevisi oksidatoriai tinkami pašarams ar maisto produktams. Vandenilio peroksidas yra oksidatorius, kuris gali skaidyti aflatoksiną, bet ir yra tinkamas naudojimui tam tikruose maisto perdirbimo procesuose (75).
Ozono panaudojimas yra vienas iš perspektyviausių maisto ir pašarų apsaugos priemonių, kuris sumažina mikroskopinių grybelių augimą ir mažina jų kaupimąsi. Daugiausiai naudojamas dujinis ozonas ir ištirpintas vandeniniame vandenyje (77).
1.3.3 Fiziniai metodai
Yra keletas fizinių metodų, kuriais pašarai ir žemės ūkio produktai gali būti apdirbami nuo mikotoksinų poveikio. Tai apima plovimo procedūras, pažeistų grūdų ar užterštų augalų dalies pašalinimą, radiacijos ar ultragarso panaudojimą, ekstrahavimą organiniais tirpikliais (78).
Mechaninis atskyrimas, spalvų rūšiavimas, smulkių dalelių arba atrankos pašalinimas iš smulkių grūdų sumažino mikotoksinų kiekį (82).
Aflatoksinai iš pašarų gali būti pašalinami juos paveikiant karščiu, radiacija. AF turi aukštą skilimo temperatūrą, kuri prasideda nuo 237 ℃. Terminis apdorojimas kukurūzų produktuose sunaikino didelę dalį AF ir OTA (50 - 70 proc.) (79). Šiluminis apdorojimas tam tikrais laiko ir temperatūros deriniais yra vienas svarbiausių fizinių procedūrų, kuriais siekiama sumažinti mikotoksinų kiekį (80).
Mikotoksinų kiekį grūduose gali sumažinti plovimas su vandeniu ir natrio karbonato tirpalu. Kviečių šveitimas sumažina OTA koncentracija daugiau kaip 50 proc., o kietus kviečius sumalant gaunant baltuosius miltus – maždaug 65 proc. (81).
Gauti geri detoksikavimo rezultatai, kai buvo naudojamas pertraukiamas ultragarsinis javų apdorojimas vandeninėje terpėje, papildytoje alkoholiu ir šarmais, esant 12 – 50 ℃ (80).
Refai M.K. ir kt. (1996) atliktuose tyrimuose gama švitinimas buvo sėkmingai naudojamas kontroliuoti OTA kiekį pašaruose (82). Pastebėta, kad švitinimas (5 – 10 M rad.) sumažino AF kiekį, tačiau visiškai sunaikinti mikotoksinų ir mutageniškumo negalėjo (83).
Šiuo metu pažangiausiai perdirbami pašarai ar maisto produktai su šalto atmosferos slėgio plazma, karštu oru ir infraraudonaisiais spinduliais bei neutralizuojami elektrolizuotu vandeniu (72). Šalto atmosferos slėgio plazma yra ne tik efektyvi mikotoksinų naikinime, bet ir ekonomiška, ekologiškai neutrali ir daro nedidelį poveikį apdorotų maisto produktų kokybei (84).
21
2. TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGA
2.1 Tyrimo atlikimo vieta, trukmė, sąlygos
Tyrimas atliktas tvartiniu laikotarpiu melžiamų karvių X ūkyje. Tyrimo trukmė - 63 dienos: nuo 2018 m. Spalio 10 d. iki 2018 m. Gruodžio 10 d. Ūkyje laikomos Vokietijos juodmargės, Lietuvos juodmargės, Holšteinai ir kitų veislių karvės (tyrime dalyvavo išvardintos karvių veislės). Melžiamos karvės buvo laikomos pririštos, įprastomis laikymo sąlygomis. Adsorbuojantį preparatą „TMXL 1000“ tyrimo metu gavo 87-ios karvės. Tyrimui sudaryta kontrolinių ir bandomųjų melžiamų karvių grupės panašios laktacijos (3-4 laktacijos) ir panašaus produktyvumo. Tyrime dalyvavo 10 karvių : 5-ios kontrolinės ir 5-ios bandomosios.
Bandomųjų karvių racionas buvo toks, kaip ir kontrolinės grupės, tik papildytas mikotoksinus adsorbuojančiu preparatu „TMXL 1000“. Preparatą sudarė mielės (Saccharomyces cerevisiae), miežiai, žirniai, džiovinta Aspergillus oryzae kultūra miežių miltuose, Kluyveromyces marxianus fermentacijos džiovintas ekstraktas ir kiti komponentai. Vitaminai, pro-vitaminai ir chemiškai išskirtos panašaus poveikio medžiagos: cholino chloridas. Analitinės sudedamosios dalys: magnis 2,5 proc., natris 1 proc., kalcis 0,5 proc., lizinas 0,5 proc., metioninas 0,5 proc. Preparato veikimas pagrįstas angliavandenių formavimu aplink ląstelės sieneles, kurie geba adsorbuoti mikotoksinus. Papildai skirti pašarų užterštumui mikotoksinais mažinti. Buvo skiriama preparato 40 g/ d. vienam gyvuliui.
Kraujas biocheminiams tyrimams buvo paimtas prieš tyrimą, vėliau po mėnesio laiko nuo tyrimo pradžios ir tyrimo pabaigoje. Kraujas morfologiniams kraujo tyrimams buvo paimtas prieš tyrimą ir po 30-ties dienų. Prieš tyrimą gauti duomenys apie karvių pieno kiekį ir sudėtį, vėliau po 30-ties dienų ir po 63-jų dienų. Šie duomenys analizuoti ir vertinti tarp kontrolinės ir bandomosios karvių grupių. Analizuoti somatinių ląstelių skaičiaus pokyčiai, klinikinių mastitų pasireiškimas prieš tyrimą ir tyrimo metu visoje melžiamų karvių bandoje. Taip pat analizuoti prieskrandžių turinių infuzorijų kiekio, bei pH pokyčiai tarp tiriamųjų grupių prieš tyrimą ir tyrimo metu.
Bandymas atliktas, laikantis 1997 11 06 „Lietuvos respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo“ Nr. 8 – 500 ir poįstatyminių aktų – LR Valstybinės ir veterinarinės tarnybos įsakymų: Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams (1999 01 18, Nr. 4 – 16).
22 1 pav. Tyrimo schema
2.2 Tyrimo vietos aplinkos rodiklių vertinimas
2.2.1 Fizikinių aplinkos rodiklių vertinimas
Fermoje buvo matuojami terminiai aplinkos rodikliai: temperatūra, santykinis oro drėgnumas, rasos taško temperatūra, oro judėjimas. Visi šie rodikliai buvo matuojami viduryje patalpos ir karvės stovėjimo vietoje 1,5 m, 1,0 m, bei 0,2 m aukštyje. Terminiai aplinkos rodikliai matuoti su daugiafunkciniu TSI prietaisu.
Buvo vertinami fiziniai aplinkos rodikliai: natūralus ir dirbtinis apšviestumas, bei triukšmas įvairiose karvių laikymo vietose tiriamoje fermoje. Nustatyti triukšmo šaltiniai. Apšviestumui nustatyti buvo naudojamas matavimo prietaisas - liuksmetras.
23 2.2.2 Cheminių aplinkos rodiklių vertinimas
Tiriamoje fermoje matuoti buvo šie cheminiai aplinkos rodikliai: anglies dvideginis, amoniakas ir sieros vandenilis. Matavimai atlikti viduryje patalpos 1,0 m aukštyje. Nustatytos galimos šių dujų susidarymo priežastys. Naudoti matavimo prietaisai: Dräger dujų matavimo prietaisas.
2.2.3 Biologinių aplinkos rodiklių vertinimo metodika
Tiriamoje fermoje buvo matuojamas bendras mikroorganizmų užterštumas. Matavimai atlikti 1,0 m aukštyje dviejuose taškuose: vienodai nutolus karvių laikymo patalpose nuo centro. Tyrimui buvo naudojamos petri lėkštelės su mėsos peptono agaru. Lėkštelės buvo laikomos 5 min. atidengtos, o praėjus pasėjimo laikui buvo uždengiamos bei transportuojamos į laboratoriją tolimesniems tyrimo etapams. Laboratorijoje lėkštelės buvo inkubuojamos termostate 30 ℃ temperatūroje ir vertintas bendras mikroorganizmų skaičius po 24 val. inkubavimo.
2.3 Mikotoksinų koncentracijos pašaruose nustatymo metodika
Prieš tyrimo pradžią 2018 Spalio 5 d. pašarai buvo ištirti mikotoksinų atžvilgiu. Pašarai pristatyti į LSMU VA Gyvūnų gerovės laboratoriją. Pašaruose nustatyti šie mikotoksinai: aflatoksinas B1, zearalenonas, bei DON (deoksinivalenolis). Aflatoksino B1 ir zearalenono koncentracijos nustatytos pagal aflatoksino B1 ir zearalenono kiekybines plonasluoksnės chromatografijos (PLCh) Romer Labs. Inc metodikas (Austrija). Deoksinivalenolio koncentracija nustatyta pagal trichotecenų A ir B tipo kiekybines plonasluoksnės chromatografijos (PLCh) Romer Labs. Inc (Austrija) metodikas su dvigubu mėginio valymu. Tiriamieji mėginiai buvo užpilti 84/16 acetonitrilo/vandens mišiniu ir perfiltruoti per popierinį filtrą. Gautas ekstraktas valytas valymo kolonėlėse ir perkeltas į mėgintuvėlį, vėliau išgarintas panaudojant Romer® Evap sistemą. Ekstrakto nuosėdos ištirpintos atitinkamose judančios fazės tirpikliuose. Užneštas standartas ir tiriamasis mėginys PSCh autospoteriu ant chromatografinės plokštelės 60 ºC temperatūroje. Rezultatai buvo išryškinami plokšteles pamerkus į organinių tirpiklių mišinio voneles. Papildomai DON plokštelė apipurškta 15 proc. aliuminio chloridu metanolyje. Toksinų koncentracijos įvertintos UV fone pagal spalvų švytėjimą ir intensyvumą.
2.4 Pieno mėginių vertinimas
X ūkis atliko periodinius kokybės ir pieno sudėties tyrimus VĮ „Pieno tyrimai“ įmonėje. Gauti duomenys iš ūkio buvo analizuojami ir vertinami. Kontrolinės (5 karvės) ir bandomosios (5 karvės) karvių grupių vertinti šie pieno rodikliai: pieno kiekio, pieno riebumo, baltymingumo, pieno laktozės ir urėjos.
24
2.5 Somatinių ląstelių skaičiaus ir klinikinių mastitų vertinimas
Somatinės ląstelės piene buvo vertinamos iš gautų duomenų VĮ „Pieno tyrimai“ įmonės. Ūkis atlieka periodinius pieno kokybės tyrimus. Analizuoti ir vertinti duomenys apie melžiamų karvių somatinių ląstelių skaičiaus pokyčius bendrai visų melžiamųjų karvių tarpe (97-ioms karvėms) prieš tyrimą ir tyrimo metu. Klinikiniai mastitai buvo identifikuojami ir registruojami ūkyje. Gauti duomenys vertinti ir analizuoti iš ūkio apie klinikinių mastitų pasireiškimą bendrai visoms melžiamoms karvėms prieš tyrimą ir tyrimo metu.
2.6 Prieskrandžių turinių paėmimas ir vertinimas
Karvių prieskrandžių turiniai buvo paimti tris kartus: tyrimo pradžioje, po mėnesio laiko nuo tyrimo pradžios ir tyrimo pabaigoje (po 63 d.). Prieskrandžių turiniai imti į specialius konteinerius, naudojant specialius zondus. Konteineriai buvo sunumeruoti eiliškai pagal kontrolines ir bandomąsias karves, užtikrintas mėginių atsekamumas. Prieskrandžių turiniai paimti iš 3 kontrolinių ir 3 bandomųjų karvių. Viso tyrimo metu išliko tos pačios kontrolinės ir bandomosios karvės prieskrandžių turinių tyrimams. Iš karvių prieskrandžių turinių buvo vertinamos pH vertės ir infuzorijų skaičiaus dinamika. Prieskrandžių turinio pH vertės apskaičiuotos su pH-metru „Orion-7110“. Infuzorijų skaičius buvo nustatinėjamas praskiedus prieskrandžių turinius spec. skiedikliu. Keli skiesto mėginio lašai užlašinti ant Goriajevo kameros ir uždengti dengiamuoju stikleliu. Toliau atlikti infuzorijų skaičiaus skaičiavimai mikroskopuojant mėginius, išvestas 3-jų skaičiavimų aritmetinis vidurkis.
2.7 Kraujo mėginių paėmimas ir tyrimų atlikimas
Kraujo mėginiai biocheminiams kraujo tyrimams buvo imami tris kartus: tyrimo pradžioje 2018 m. spalio 10 dieną, po 30 d. ir tyrimo pabaigoje (po 63 d.). Morfologiniai kraujo tyrimai buvo imami tyrimo pradžioje ir po 30 dienų. Biocheminiams ir morfologiniams kraujo tyrimams pirmą kartą buvo paimta 10 mėginių (5 bandomosios karvių grupės ir 5 kontrolinės), antrą kartą vėl 10 kraujo mėginių. Tyrimo pabaigoje trečią kartą paimta 10 kraujo mėginių biocheminiams kraujo tyrimams. Viso tyrimo metu išliko tos pačios kontrolinės ir bandomosios karvės. Kraujas imtas iš karvių V. Jugularis į sterilius mėgintuvėlius su antikoaguliantais, su koncervuojančiu tirpalu (EDTA) morfologiniams kraujo tyrimams. Biocheminiams kraujo tyrimams paimti buvo naudojami sterilūs mėgintuvėliai be antikoaguliantų. Mėgintuvėliai sunumeruoti pagal karvių eiliškumą išskirinat kontrolinę ir bandomąją karvių grupes. Kraujas buvo imamas naudojantis vacuntainer sistema, kurią sudaro mėgintuvėlio įvirtinimas, adatos laikiklis ir prisukama adata. Kiekvienai karvei kraujui paimti buvo naudojama nauja adata ir kiekvieną kartą buvo dezinfekuojama kraujo ėmimo vieta (su vata ir spiritu). Biocheminiai rodikliai ištirti Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute Vilniuje, Radiologinių tyrimų skyriuje, naudojant automatinį biocheminį
25 analizatorių „COBAS INTEGRA400 plus“ (Tegimenta Ltd. Roche, Šveicarija). Tirti ALP, ALT, AST, ALB, CREAJ, BILT3, GLUC, TP, GGT, LDH, UREA. Rodikliai analizuoti absorbcinės fotometrijos matavimo principu. Morfologiniai kraujo rodikliai tirti LSMU VA stambiųjų gyvūnų klinikinių tyrimų laboratorijoje analizatoriumi “Abacus junior vet„. Tirti šie morfologiniai kraujo rodikliai: WBC, LYM, MON, NEU, RBC, HGB, HCT, PLT.
2.8 Statistinis duomenų įvertinimas
Tyrimo rezultatai apskaičiuoti „SPSS Statistics 17.0“ statistiniu duomenų paketu ir „Microsoft Excel 2013“ programa. Skaičiuoti aritmetiniai vidurkiai, vidurkių paklaidos, santykinis standartinis nuokrypis. Duomenys buvo laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05. Patikimumas tarp grupių nustatytas naudojant T-testą.
26
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1 Tvarto aplinkos rodikliai
3.1.1 Terminiai ir fizikiniai tvarto aplinkos rodikliai
Terminiai aplinkos rodikliai pateikti 1 lentelėje. Matuojant skirtingame aukštyje karvių laikymo patalpų temperatūrą patalpų viduryje nustatyta, kad 1,5 m aukštyje temperatūra didesnė – 10,5℃, 1,0 m aukštyje temperatūra didesnė 10,4 ℃, o 0,2 m aukštyje temperatūra didesnė 10,3℃ už normos ribas. Karvių stovėjimo vietoje temperatūra didesnė 10,2 ℃ 1,5 m aukštyje, o 1,0 m ir 0,2 m aukštyje temperatūra didesnė 10,1℃ už normos ribas. Santykinis oro drėgnis atitiko normos ribas viduryje patalpos, bei karvių stovėjimo vietoje. Rasos taško temperatūra normos ribose visame tvarte. Oro judėjimas tvarto viduryje ir karvių stovėjimo vietose skirtingame (1,0 ir 0,2 m) aukštyje neatitiko normos ribų. Tai rodo, kad ventiliacija tvarte buvo nepakankama tyrimo pradžioje.
1 lentelė. Terminiai tvarto aplinkos rodikliai
Terminiai aplinkos rodikliai Aukštis, m -
1,5 1,0 0,2 Vidurkis Normos Temperatūra (℃), viduryje patalpos 22,5 22,4 22,3 22,4 8-12 Temperatūra (℃), karvės stovėjimo vietoje 22,2 22,1 22,1 22,1 8-12 Santykinis oro drėgnis (%), viduryje patalpos 49,6 49,7 49,7 49,67 50-70 Santykinis oro drėgnis (%), karvės stovėjimo
vietoje 49,8 50,0 49,8 49,87 50-70
Rasos taško temperatūra (℃), viduryje patalpos -20 -20 -20 -20 -20 Rasos taško temperatūra (℃), karvės stovėjimo
vietoje -20 -20 -20 -20 -20
Oro judėjimas (m/s), viduryje patalpos 0,1 0,08 0,08 0,09 0,1-0,3 Oro judėjimas (m/s), karvės stovėjimo vietoje 0,1 0,09 0,08 0,09 0,1-0,3
Fizikiniai tvarto aplinkos veiksniai pateikti 2 lentelėje. Natūralus apšviestumas, dirbtinis apšviestumas neatitiko normos ribų (stovėjimo vietoje, laikymo patalpoje). Triukšmas neviršijo normos ribų tiriamajame tvarte. Natūralus apšviestumas į karvių laikymo patalpas patenka per langus, kurių 31 vnt., ilgis 1,67 metrai, durys, kurių yra 4 vnt. 7,08 m ilgio. Nustatyti triukšmo šaltiniai karvių laikymo patalpose: skreperio keliami garsai, gyvuliai, traktorius.
2 lentelė. Fizikiniai tvarto aplinkos rodikliai
Fizikiniai aplinkos rodikliai Vidurkis Normos
Natūralus apšviestumas, (lx) viduryje karvių laikymo patalpos
27 Natūralus apšviestumas, (lx) karvės stovėjimo
vietoje 22,4 50-75
Dirbtinis apšviestumas, (lx) viduryje karvių
laikymo patalpos 27,57 50-75
Dirbtinis apšviestumas, (lx) karvės stovėjimo
vietoje 37,6 50-75
Triukšmas, (dB) viduryje karvių laikymo
patalpos 51,17 70
Triukšmas, (dB) viduryje karvės stovėjimo
vietoje 50,47 70
3.1.2 Cheminiai tvarto aplinkos rodikliai
Cheminiai aplinkos rodikliai pateikti 3 lentelėje. Matuojant dujas 1,0 m aukštyje karvių laikymo patalpose nustatyta, kad anglies dvideginis, amoniakas, sieros vandenilis neviršijo normos ribų. Sieros vandenilio nebuvo aptikta.
3 lentelė. Cheminiai tvarto aplinkos rodikliai
Cheminiai aplinkos rodikliai Viduryje patalpos, aukštis 1,0 m
Normos
Anglies dvideginis, proc. 0,2 0,15 - 0,25
Amoniakas, mg/ m3 6 5-20
Sieros vandenilis, mg/ m3 Neaptikta 10
3.1.3 Biologiniai tvarto aplinkos rodikliai
Bendras mikroorganizmų skaičiaus rodiklis tiriamajame ūkyje pateiktas 4 lentelėje. Bendras mikroorganizmų skaičius 1,0 m aukštyje ženkliai viršijo normos ribas.
4 lentelė. Biologiniai tvarto aplinkos rodikliai Bendras mikroorganizmų skaičius 1,0 m
aukštyje, ksv/ m3 Normos
2000000 700000
3.2 Mikotoksinų koncentracija pašaruose
Nustatyta mikotoksinų koncentracija pašarų mišinyje, kuri pateikta 5 lentelėje. AFL B1 neviršijo leistinų normų. Rastas ženklus ZEA kiekis pašarų mišinyje. DON - žemiau įprastinio leistino kiekio.
5 lentelė. Mikotoksinų koncentracija pašarų mišinyje
Aflatoksinas B1 Zearalenonas Deoksinivalenolis
28
3.3 Kraujo biocheminiai tyrimai
ALP vidurkių dinamika pateikta 2 paveiksle. Kontrolinėje grupėje ALP vidurkis padidėjo 30-tą tyrimo dieną 12,5 proc. (p>0,05), o tyrimo pabaigoje ALP vidurkis padidėjo 22,75 proc. (p>0,05) nuo tyrimo pradžios. Bandomojoje grupėje ALP aktyvumo vidurkis sumažėjo po pirmo tyrimo mėnesio 31,72 proc. (p>0,05), o tyrimo pabaigoje ALP vidurkis sumažėjo 25,75 proc. (p>0,05) nuo tyrimo pradžios. Viso tyrimo metu ALP aktyvumo vidurkiai buvo didesni kontrolinėje grupėje palyginus su bandomąja. Bandomųjų karvių grupėje ALP vidurkis 30-tą tyrimo dieną buvo žemiau normos ribų, o tyrimo pabaigoje ALP vidurkis buvo normos ribose. Nustatytas statistiškai patikimas skirtumas tarp tiriamųjų grupių po pirmojo tyrimo mėnesio. Kontrolinėje grupėje ALP vidurkis buvo didesnis 39,31 proc. (p<0,01). Pastebėta kontrolinės grupės ALP vidurkių didėjimo tendencija.
2 pav. Šarminės fosfatazės (ALP) pokyčių dinamika tyrimo metu
ALT vidurkių dinamika pateikta 3 paveiksle. Kontrolinėje grupėje ALT vidurkis 30-tą tyrimo dieną sumažėjo 1,70 proc. (p>0,05), o tyrimo pabaigoje ALT vidurkis padidėjo 5,35 proc. (p>0,05) nuo tyrimo pradžios. Bandomojoje grupėje ALT vidurkis sumažėjo 20,35 proc. (p<0,01) po pirmojo tyrimo mėnesio, o tyrimo pabaigoje ALT vidurkiai sumažėjo 18,39 proc. (p<0,001) nuo tyrimo pradžios. Viso tyrimo metu ALT aktyvumo vidurkis buvo didesnis kontrolinėje grupėje. ALT aktyvumo vidurkiai abiejose grupėse viso tyrimo metu buvo normos ribose. Lyginant abi grupes tarpusavyje nustatyta statistiškai patikimų ALT vidurkių skirtumų 30-tą tyrimo dieną, ALT vidurkis kontrolinėje karvių grupėje didesnis 18,97 proc. (p<0,05), o 63-čią tyrimo dieną ALT vidurkis buvo didesnis 22,55 proc. (p<0,05).
**
29 3 pav. Alanin amino transferazės (ALT) pokyčių dinamika tyrimo metu
AST vidurkių dinamika pateikta 4 paveiksle. Kontrolinėje grupėje AST vidurkis padidėjo 30-tą tyrimo dieną 4,77 proc. (p>0,05), o tyrimo pabaigoje AST vidurkis padidėjo 16,55 proc. (p>0,05) nuo tyrimo pradžios. Bandomojoje grupėje AST vidurkis sumažėjo 30-tą tyrimo dieną 3,04 proc. (p>0,05), o tyrimo pabaigoje AST aktyvumo vidurkis sumažėjo 20,48 proc. (p>0,05) nuo tyrimo pradžios. Viso tyrimo metu AST vidurkis didesnis buvo kontrolinėje grupėje. AST vidurkiai kontrolinėje ir bandomojoje grupėje buvo normos ribose. Lyginant abi grupes tarpusavyje statistiškai patikimų AST dinamikos skirtumo reikšmių nenustatyta. Pastebėta kontrolinės grupės AST vidurkio didėjimo tendencija.
4 pav. Aspartat amino transferazės (AST) vidurkių dinamika tyrimo metu
ALB koncentracijos dinamika pateikta 5 paveiksle. Kontrolinėje grupėje ALB koncentracijos vidurkis padidėjo po pirmo tyrimo mėnesio 3,80 proc. (p>0,05), o 63-čią tyrimo dieną ALB koncentracijos vidurkis padidėjo 1,37 proc. (p>0,05). Tarp tiriamųjų grupių patikimų ALB
* *
*** **
30 koncentracijos vidurkių skirtumų nenustatyta. Bandomojoje grupėje ALB koncentracijos vidurkis padidėjo po pirmo tyrimo mėnesio 7,14 proc. (p>0,05), o tyrimo pabaigoje ALB koncentracijos vidurkis padidėjo 5,03 proc. (p>0,05) nuo tyrimo pradžios. ALB koncentracijos vidurkis viso tyrimo metu buvo didesnis bandomojoje grupėje. Abiejų grupių ALB koncentracijos vidurkiai buvo normos ribose.
5 pav. Albuminų (ALB) koncentracijos dinamika tyrimo metu
Bendro bilirubino koncentracijos dinamika pateikta 6 paveiksle. Kontrolinėje grupėje BILT-3 koncentracijos vidurkis sumažėjo 30-tą tyrimo dieną 2,27 proc. (p>0,05), o tyrimo pabaigoje sumažėjo 37,5 proc. (p<0,01) nuo tyrimo pradžios. Bandomojoje grupėje BILT-3 koncentracijos vidurkis po pirmo tyrimo mėnesio sumažėjo 12,5 proc. (p<0,01), o tyrimo pabaigoje sumažėjo 45,45 proc. (p<0,01) nuo tyrimo pradžios. Bendro bilirubino koncentracija buvo didesnė kontrolinėje grupėje viso tyrimo metu. BILT-3 koncentracija buvo normos ribose abiejose tiriamose grupėse viso tyrimo metu. Pastebėta abiejų tiriamų grupių bendro bilirubino koncentracijos vidurkių mažėjimo tendencija. Statistiškai patikimų BILT-3 koncentracijos vidurkių skirtumų tarp tiriamųjų grupių nenustatyta.
Gama gliutamiltransferazės vidurkių dinamika pateikta 7 paveiksle. Kontrolinėje grupėje GGT vidurkis po mėnesio laiko nuo tyrimo pradžios sumažėjo 24,22 proc. (p>0,05), o tyrimo pabaigoje GGT vidurkis sumažėjo 14,09 proc. (p>0,05) nuo tyrimo pradžios. Bandomojoje grupėje GGT vidurkis 30-tą tyrimo dieną sumažėjo 44,04 proc. (p<0,05) o 63-čią tyrimo dieną GGT vidurkis sumažėjo 44,25 proc. (p<0,05) nuo tyrimo pradžios. GGT vidurkis viso tyrimo metu buvo didesnis kontrolinėje grupėje. Kontrolinėje ir bandomojoje grupėje GGT vidurkiai viso tyrimo metu buvo normos ribose. Statistiškai patikimų GGT vidurkio skirtumų tarp kontrolinės ir bandomosios grupės nenustatyta.
31 6 pav. Bendro bilirubino (BILT-3) koncentracijos dinamika tyrimo metu
7 pav. Gama gliutamiltransferzės (GGT) vidurkių dinamika tyrimo metu
Laktato dehidrogenazės vidurkių dinamika pateikta 8 paveiksle. Kontrolinėje grupėje LDH vidurkio aktyvumas sumažėjo 16,03 proc. 30-tą tyrimo dieną (p>0,05), o tyrimo pabaigoje kontrolinėje grupėje LDH vidurkio aktyvumas padidėjo nuo 30-tos tyrimo dienos 9,8 proc. (p>0,05). Bandomojoje grupėje LDH aktyvumo vidurkis sumažėjo 29,09 proc. (p<0,05) 30-tą tyrimo dieną, o tyrimo pabaigoje LDH aktyvumas sumažėjo 30,62 proc. (p<0,05) nuo tyrimo pradžios. Statistiškai patikimas LDH vidurkių skirtumas tarp grupių nustatymas paskutinį tyrimo mėnesį, kontrolinėje grupėje LDH vidurkis buvo didesnis 24,80 proc. (p<0,05). LDH aktyvumo vidurkis viso tyrimo metu buvo didesnis kontrolinėje grupėje. Kontrolinės ir bandomosios grupės LDH vidurkiai viršijo normos ribas visą tyrimo laikotarpį, tačiau kontrolinės grupės LDH vidurkis buvo aukštesnis. Pastebėta bandomosios grupės LDH vidurkio mažėjimo tendencija.
* * *P<0,05 **P<0,01 ***P<0,001 *P<0,05 **P<0,01 ***P<0,001 ** ** **
