FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
MIGLĖ PAŠKEVIČIŪTĖ
STATINŲ PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO KASOS VĖŽIO LĄSTELIŲ
KULTŪROSE ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Doc. dr. Vilma Petrikaitė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
STATINŲ PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO KASOS VĖŽIO LĄSTELIŲ KULTŪROSE ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. dr. Vilma Petrikaitė Data
Recenzentas Darbą atliko
Prof. Edgaras Stankevičius Magistrantė
Miglė Paškevičiūtė
Data Data
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Kasos vėžio gydymo problematika ... 10
1.2. Statinų savybės ... 11
1.3. Statinų veikimo mechanizmas ... 13
1.4. Statinų piešvėžinio aktyvumo tyrimai ... 15
1.5. Pasirinktų ląstelių linijų savybės... 20
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 21
2.1. Tyrimo objektas ... 21
2.2. Reagentai, priemonės ir aparatūra... 21
2.3. Tyrimo metodikos ... 23
2.3.1. Ląstelių kultūrų auginimas... 23
2.3.2. Poveikio ląstelių gyvybingumui nustatymas... 23
2.3.3. Poveikio ląstelių sferoidams tyrimas ... 24
2.3.4. Poveikio ląstelių kamieniškumui nustatymas ... 25
2.3.5. Vėžio ląstelių žūties būdo nustatymas ... 25
2.3.6. Statistinis duomenų apdorojimas ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1. Statinų poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui... 27
3.2. Statinų poveikis vėžio ląstelių sferoidams ... 28
3.3. Statinų poveikis vėžio ląstelių kamieniškumui ... 34
3.4. Statinų sukeliamas ląstelių žūties būdas ... 36
4. IŠVADOS... 40
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41
SANTRAUKA
M. Paškevičiūtės magistro baigiamasis darbas „Statinų priešvėžinio aktyvumo kasos vėžio ląstelių kultūrose įvertinimas“. Mokslinė vadovė – doc. dr. V. Petrikaitė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2017.
Darbo tikslas – įvertinti statinų priešvėžinį aktyvumą žmogaus kasos vėžio ląstelių kultūrose. Darbo uždaviniai:
1. Ištirti statinų poveikį žmogaus kasos vėžio ląstelių gyvybingumui.
2. Ištirti statinų aktyvumą žmogaus kasos vėžio ląstelių 3D kultūrose (sferoiduose). 3. Ištirti statinų poveikį žmogaus kasos vėžio ląstelių kamieniškumui.
4. Nustatyti statinų sukeliamą žmogaus kasos vėžio ląstelių žūties būdą.
Tyrimo metodai. Šiame darbe buvo tiriamas keturių statinų (lovastatino, mevastatino, pitavastatino ir simvastatino) poveikis žmogaus kasos vėžio ląstelių linijų (BxPC-3, MIA PaCa-2 ir PANC-1) 2D ir 3D kultūrose. Statinų poveikis žmogaus kasos vėžio ląstelių gyvybingumui nustatytas MTT metodu po 24, 48 ir 72 val. inkubacijos, apskaičiuojant EC50 vertes. Statinų aktyvumas kasos
vėžio ląstelių 3D kultūrose nustatytas įvertinant jų poveikį sferoidų dydžio kitimui. Koreliacija tarp junginių aktyvumo 2D ir 3D ląstelių kultūrose nustatyta apskaičiuojant Pearson‘o koeficientą bei jo statistinį patikimumą. Ląstelių žūties būdas nustatytas jas dažant fluorescenciniais dažais Hoechst 33342 ir propidžio jodidu. Statinų poveikis ląstelių kamieniškumui nustatytas įvertinant jų poveikį ląstelių kolonijų formavimui ir augimui.
Rezultatai. Pagal poveikį žmogaus kasos vėžio ląstelių gyvybingumui statinai išsidėstė tokia seka pitavastatinas > simvastatinas > lovastatinas > mevastatinas. Labiausiai visų trijų ląstelių linijų gyvybingumą slopino pitavastatinas (EC50 vertė po 72 val. BxPC-3, MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių
linijose atitinkamai lygi 1,4 ± 0,4 μM, 1,0 ± 0,2 μM and 1,0 ± 0,5 μM). Pitavastatinas taip pat aktyviausiai slopino sferoidų augimą. MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių linijose nustatytas didesnis slopinamasis poveikis nei BxPC-3. Panašios tendencijos nustatytos poveikio ląstelių kamieniškumui tyrimo metu. Pitavastatinas aktyviausiai slopino ląstelių gebėjimą formuoti kolonijas, tačiau tarp kitų statinų skirtumo nebuvo. Apoptozės/nekrozės tyrimo metu nustatyta, jog mažomis koncentracijomis statinai ląstelių žūtį sukelia daugiausiai per apoptotinius mechanizmus, o didelėmis koncentracijomis aktyvuojami nekrotiniai procesai.
Išvados. Statinai, ypač pitavastatinas, pasižymi priešvėžiniu aktyvumu kasos vėžio ląstelių linijose ir yra perspektyvūs tolimesniems tyrimams.
SUMMARY
M. Paškevičiūtė Master Thesis „Evaluation of anticancer activity of statins in pancreatic cancer cell cultures“. Scientific supervisor – Assoc. Prof. V. Petrikaitė. Department of Drug chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2017.
The aim of the research was to evaluate the anticancer activity of statins in human pancreatic cancer cell cultures.
Objectives:
1. To investigate the effects of statins on the proliferation of human pancreatic cancer cells. 2. To investigate the effects of statins in the human pancreatic cancer cell 3D cultures (spheroids). 3. To evaluate the effects of statins on the clonogenicity of human pancreatic cancer cells.
4. To identify the type of human pancreatic cancer cell death induced by statins.
Methods. In the present study we investigated the activity of four statins (lovastatin, mevastatin, pitavastatin and simvastatin) in 2D and 3D human pancreatic cancer cell (BxPC-3, MIA PaCa-2, PANC-1) cultures. The effect of statins on cell viability was tested using the MTT assay, and EC50 values were calculated after 24, 48 and 72 hours of incubation. The activity of statins in 3D
pancreatic cancer cell cultures was examined by measuring the size change of spheroids. The correlation between activity of statins in 2D and 3D cultures was assessed by calculating Pearson`s coefficient and its statistical reliability. The type of cell death was identified by cell double staining with Hoechst 33342 and propidium iodide. The activity of statins on the clonogenicity of pancreatic cancer cells was tested by evaluating the effect on the colony- forming ability of cancer cells.
Results. The rank order of the activity of tested statins on cell viability was as followed: pitavastatin > simvastatin > lovastatin > mevastatin. Among tested statins pitavastatin had the greatest effects on cell viability (EC50 values after 72 h on BxPC-3, MIA PaCa-2 and PANC-1 were 1.4 ±
0.4 μM, 1.0 ± 0.2 μM and 1.0 ± 0.5 μM, respectively). Pitavastatin also showed the strongest effect on tumor spheroid growth. Statins also suppressed colony formation of cancer cells, and pitavastatin demonstrated the greatest reduction in colony size and number. Statins exerted stronger inhibitory activity against MIA PaCa-2 and PANC-1 cell lines compared to the effect on BxPC-3. In apoptosis/necrosis assay we determined that at lower concentrations statins mostly induced cell death through apoptosis, whereas higher concentrations of compounds activated also necrotic processes.
Conclusions. Statins, especially pitavastatin, demonstrate an anticancer activity against pancreatic cancer cell lines BxPC-3, MIA PaCa-2 and PANC-1, and may be worthy of further studies.
PADĖKA
Dėkoju mokslinei vadovei doc. dr. Vilmai Petrikaitei už suteiktas darbo sąlygas ir pagalbą eksperimentų vykdymo bei magistro darbo rašymo metu. Taip pat dėkoju doc. Arvydui Ūsui, prof. Arvydui Skeberdžiui ir prof. Vilmantei Borutaitei už suteiktą pagalbą ir galimybę naudotis reikiama įranga.
SANTRUMPOS
ATCC Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American Type Culture Collection, ATCC)
Cmax didžiausia laisvo vaisto koncentracija kraujo plazmoje
DMEM Dulbecc‘o modifikuota Eagle mitybinė terpė (angl. Dulbecco's Modified Eagle Medium)
DMSO dimetilsulfoksidas
EC50 koncentracija, sukelianti 50 proc. laukiamo atsako
FBS fetalinis veršiukų serumas (angl. fetal bovine serum) FPP farnezilpirofosfatas
GGPP geranilgeranilpirofosfatas GTP guanozino 5-trifosfatas
HMG-KoA 3-hidroksi-3- metilgliutaril kofermentas A
IC50 koncentracija, sukelianti 50 proc. ląstelių biologinių ar biocheminių funkcijų
netekimą
logD pasiskirstymo koeficientas (angl. distribution coefficient); visų junginio formų (jonizuotų ir nejonizuotų) koncentracijų sumos santykio n-oktanolio ir vandens fazėse, logaritmas
ĮVADAS
Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, 2015 m. nuo vėžinių susirgimų mirė 8,8 mln. žmonių, ir tai buvo viena pagrindinių mirčių priežasčių [1]. Mirštamumas nuo vėžio nuolatos auga. Prognozuojama, jog per du artėjančius dešimtmečius naujų vėžio atvejų skaičius padidės 70 proc. [1].
Kasos vėžys yra viena agresyviausių ir didžiausiu mirtingumu pasižyminti vėžio rūšis. Jis dažniausiai diagnozuojamas vėlyvosiose stadijose, be to, dėl genetinių ypatybių pasižymi dideliu atsparumu antinavikiniams vaistams [2]. Tarptautinės vėžio tyrimų agentūros d uomenimis, 2012 m. pasaulyje nustatyta daugiau kaip 337 tūkst. naujų kasos vėžio atvejų. Prognozuojama, kad iki 2030 m. šis skaičius išaugs 1,5 karto [3].
JAV kasos vėžiui gydyti yra patvirtinta septyniolika vaistinių preparatų bei keturios jų kombinacijos [4], tuo tarpu Lietuvoje šiai ligai gydyti vartojami tik gemcitabinas ir 5-fluorouracilas, kurie, priklausomai nuo paciento būklės, gali būti derinami kartu su keletu kitų antinavikinių preparatų [5]. Vis dėlto didėjantis mirštamumas nuo šio vėžio bei trumpa išgyvenimo trukmė [1] leidžia manyti, jog jie nėra pakankamai efektyvūs, todėl ieškoma naujų gydymo metodų. Naujų vaistų kūrimas yra labai brangus ir ilgai trunkantis procesas. Dėl šių priežasčių pastaruoju metu intensyviai tiriami rinkoje jau esantys kitoms indikacijoms skirti vaistai, siekiant įvertinti jų priešvėžinį aktyvumą ir pritaikyti vėžio gydymui, prevencijai, ar padidinti jau patvirtintų vaistinių preparatų efektyvumą [6]. Tokiu būdu sutrumpėja vaisto vystymo trukmė, kadangi jo farmakokinetiniai profiliai bei saugumas jau būna žinomi, be to, sumažėja kaštai, reikalingi vaistui sukurti [7].
Statinai, kitaip vadinami 3- hidroksi-3-metilgliutaril kofermento A (HMG-KoA) reduktazės slopikliais, yra vartojami hipercholesterolemijai, dislipidemijai gydyti ir širdies bei kraujagyslių ligų prevencijai [8]. Jie slopina vieną iš mevalonato metabolinio kelio fermentų – HMG-KoA reduktazę – tokiu būdu mažina cholesterolio bei kitų sterolių ir izoprenoidų sintezę [9]. Per pastaruosius dešimtmečius atlikta daug tyrimų, įrodančių, jog statinai ne tik mažina cholesterolio kiekį kraujyje, bet ir pasižymi priešvėžiniu aktyvumu. Nustatyta, jog šiems junginiams būdingas antiproliferacinis poveikis, jie sukelia vėžinių ląstelių apoptozę, slopina jų migraciją ir invaziją [10–12].
Nepaisant to, kad statinų priešvėžinis aktyvumas prieš įvairias vėžio rūšis yra plačiai tiriamas, duomenų apie šių junginių poveikį kasos vėžiui ir šio vėžio ląstelių linijoms yra labai ribotai. Dėl to nusprendėme įvertinti pasirinktų skirtingų tipų statinų priešvėžinį aktyvumą trijose kasos vėžio ląstelių linijose. Šiam tikslui buvo nustatytas poveikis ląstelių gyvybingumui, sferoidų augimui, kamieniškumui, įvertintas sukeliamas ląstelių žūties būdas bei tokiu būdu atrinktas perspektyviausias junginys tolimesniems tyrimams kasos vėžio terapijai.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti statinų priešvėžinį aktyvumą žmogaus kasos vėžio ląstelių kultūrose. Darbo uždaviniai:
1. Ištirti statinų poveikį žmogaus kasos vėžio ląstelių gyvybingumui.
2. Ištirti statinų aktyvumą žmogaus kasos vėžio ląstelių 3D kultūrose (sferoiduose). 3. Išanalizuoti statinų poveikį žmogaus kasos vėžio ląstelių kamieniškumui.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Kasos vėžio gydymo problematika
Kasos vėžys yra aštuntoje vietoje pagal susirgimų nuo vėžio skaičių Europoje [13] ir dvyliktoje vietoje pasaulyje [14]. Kasmet Europoje nuo šios vėžio rūšies miršta daugiau kaip 10 tūkst. žmonių, ir prognozuojama, jog ateityje šis skaičius didės (1 pav.). Išgyvenamumas sergant kasos vėžiu yra mažiausias ir pagal mirštamumą užima ketvirtą vietą tarp visų vėžio rūšių [15]. Tik apie 5 proc. pacientų, kuriems diagnozuotas kasos vėžys, išgyvena ilgiau nei penkerius metus [16], tuo tarpu sergant metastazavusiu kasos vėžiu, vidutinė išgyvenimo trukmė yra 2,8 – 5,7 mėn. [17].
1 pav. Sergamumo ir mirštamumo nuo kasos vėžio Europos valstybėse prognozės [3]
Dažniausias kasos vėžio tipas yra kasos latakų adenokarcinoma. Bene vienintelis efektyvus šios ligos gydymo metodas yra chirurginis gydymas, tačiau jį taikyti galima mažiau nei 20 proc. atvejų [16]. Daugiau nei 80 proc. pacientų kasos vėžys diagnozuojamas vėlyvojoje ligos stadijoje, kuomet chirurginis gydymas jau nebetaikomas [18]. Sergant kasos latako adenokarcinoma, mikroskopinės metastazės formuojasi jau ankstyvoje ligos stadijoje, o tai riboja chirurginio bei spindulinio gydymo pritaikymo galimybę bei efektyvumą. Vis dėlto naviko rezekcija negarantuoja ilgos gyvenimo trukmės. Po operacijos pacientai vidutiniškai išgyvena 18 mėn., tuo tarpu ilgesnė nei penkerių metų išgyvenimo trukmė nustatyta tik maždaug 18 proc. pacientų [19].
Adjuvantiniam gydymui pirmo pasirinkimo vaistas yra pirimidino analogas gemcitabinas, taip pat, nors ir mažiau efektyvus, gali būti skiriamas 5-fluorouracilas kartu su folio rūgštimi. Jei naviko operuoti negalima, standartiškai skiriamas 6 mėn. gydymo kursas gemcitabinu [16]. Vis dėlto, dėl
didelio kasos vėžio ląstelių atsparumo šiam vaistui, gemcitabinas efektyvus ne daugiau kaip 25 proc. pacientų [20].
Pastaruoju metu bandoma atrasti kitų būdų kovoti su šia liga, tačiau dažniausiai jie nepasiteisina. Vienas iš pavyzdžių yra chemoterapija vaistų deriniu, vadinamu FOLFIRINOX. Šiame derinyje yra oksaliplatina, irinotekanas, 5- fluorouracilas bei folino rūgštis. Nors FOLFIRINOX, lyginant su gemcitabinu, išgyvenamumą prailgina labiau, tačiau pasižymi daug didesniu toksiškumu ir labai pablogina gyvenimo kokybę, dėl ko šio gydymo metodo atsisakoma [21].
Nepaisant atliekamų tyrimų gausos, kasos vėžio gydymas vis dar išlieka opi problema.
1.2. Statinų savybės
Pagal savo struktūrą statinai gali būti skirstomi į I ir II tipo statinus. I tipo statinai (mevastatinas, lovastatinas, simvastatinas, pravastatinas) yra gamtiniai, gauti iš Penicillium ar Aspergillus grybelių, tuo tarpu II tipo statinai (cerivastatinas, fluvastatinas, atorvastatinas, rozuvastatinas pravastatinas, pitavastatinas) yra sintetiniai [22].
Gamtiniai statinai nuo sintetinių skiriasi ne tik savo kilme, bet ir struktūra, giminingumu HMG-KoA reduktazei. Gamtinių statinų pagrindą sudaro naftaleno žiedas su prisijungusia esterine grupe, tuo tarpu sintetiniams statinams būdingas bazinio pobūdžio pe nkianaris ar šešianaris žiedas, su vienu ar dviem pakeistais azoto atomais bei prijungtomis p- fluorfenilo ir metiletilo grupėmis (2 pav.).
2 pav. I ir II tipo statinų struktūriniai ypatumai; kairėje – simvastatinas, dešinėje – atorvastatinas (adaptuota pagal Istvan [23])
Statinai su fermentu HMG-KoA reduktaze jungiasi ne tik per HMG-KoA liekaną: I tipo statinai taip pat formuoja jungtis per dekalino žiedą, o II tipo statinai jungiasi ir per fluorfenilo grupę.
Dėl savo struktūrinių ypatybių II tipo statinai formuoja daugiau jungčių su HMG-KoA reduktaze ir yra efektyvesni [23]
Statinų priešvėžiniam aktyvumui didelę įtaką turi jų lipofiliškumas. Šie junginiai skirstomi į lipofilinius ir hidrofilinius (1 lentelė). Lipofiliškiausi yra simvastatinas, lovastatinas (laktoninės formos) bei cerivastatinas, mažiau lipofiliški – fluvastatinas, atorvastatinas ir pitavastatinas, o rozuvastatinas bei pravastatinas priskiriami hidrofiliniams statinams [24–26].
1 lentelė.Statinų logD reikšmės, kai pH 7,0 [24–27]
* log D reikšmė, kai pH 7,4.
Lovastatinas ir simvastatinas yra vartojami kaip provaistai, egzistuojantys neaktyvių laktonų pavidalu. Organizme vykstant fermentinei hidrolizei, jie verčiami aktyviomis rūgštinėmis formomis [28]. Laktonai pasižymi didesniu lipofiliškumu nei rūgštinės molekulės [24].
Nustatyta, jog priešvėžinis aktyvumas būdingas lipofiliniams statinams, tuo tarpu hidrofiliniai rozuvastatinas ir pravastatinas vėžio ląsteles veikia silpnai arba neveikia išvis [29–32]. Šis reiškinys aiškinamas tuo, kad lipofiliniai statinai lengviau pereina ląstelių membranas, todėl geriau patenka į audinius [33]. Taip pat nustatyta, jog hidrofiliniai statinai yra hepatoselektyvesni. Tuo tarpu lipofiliniai labiau patenka ne į kepenis, o į kitus audinius [34].
Junginių aktyvumui taip pat svarbios jų farmakokinetinės savybės. Geriausiomis farmakokinetinės charakteristikomis iš visų statinų pasižymi pitavastatinas (2 lentelė). Jo biopasisavinimas yra vienas didžiausių, lyginant su kitais statinais, ir, vartojant terapinėmis dozėmis, pasiekiama didžiausia Cmax. Be to, pitavastatinas stipriau nei kiti slopina fermentą HMG-KoA
reduktazę.
Statinas Lipofilinis/hidrofilinis log D, kai pH = 7,0 Simvastatinas Lipofilinis 4,40 (laktonas)/1,88 (rūgštis) Lovastatinas Lipofilinis 3,91 (laktonas)/1,51 (rūgštis)
Mevastatinas Lipofilinis 3,78 (laktonas)
Cerivastatinas Lipofilinis 2,32 Fluvastatinas Lipofilinis 1,75 Atorvastatinas Lipofilinis 1,53 Pitavastatinas Lipofilinis 1,50 Rozuvastatinas Hidrofilinis -0,33* Pravastatinas Hidrofilinis -0,47
2 lentelė. Statinų farmakokinetinės savybės [35–50] Statinas Terapinė paros dozė (mg) Biopasisavinimas (proc.) Jungimasis su plazmos baltymais (proc.) Cmax (ng/ml) IC50 (nM) **
Simvastatinas 5–80 < 5 > 95 (laktonas ir β-hidroksirūgštis) Laktono 18,4; β-hidroksirūgšties
4,6 11 Lovastatinas 10–80 < 5 > 95(laktonas ir β-hidroksirūgštis) Laktono 7,0–16,3; β-hidroksirūgšties 7,4–7,8 –*** Fluvastatino natrio druska 20–80 29 98 183 28 Atorvastatino kalcio druska 10–80 14 ≥ 98 66,2 8 Pitavastatino kalcio druska 1–4 51 (vartojant tirpalo forma) > 99 120,98 6,8 Cerivastatino natrio druska* 0,2–0,8 60 > 99 12,7 10 Rozuvastatino kalcio druska 5–40 20 88 17,9–21,7 5 Pravastatino natrio druska 10–80 17 50 153,2 44,1 Mevastatinas* –*** –*** –*** –*** 23
*Šiuo metu nevartojami. **HMG-KoA reduktazei. ***Nėra duomenų.
Atsižvelgdami į minėtas statinų savybes, tyrimams pasirinkome tris labiausiai lipofilinius 1 tipo statinus – mevastatiną, lovastatiną bei simvastatiną. Be to, į tyrimus įtraukėme patį naujausią, didžiausiu biopasisavinimu bei stipriausiu HMG-KoA reduktazės slopinimu pasižymintį, tačiau mažiau lipofilinį, II tipo statiną – pitavastatiną, kad palygintume jį su lipofiliškesniais, I tipo statinais.
1.3. Statinų veikimo mechanizmas
Statinų molekulės sudarytos iš farmakoforo dihidroksiheptano rūgšties fragmento ir žiedų sistemos su skirtingais pakaitais (3 pav.) [51,52]. Žiedų sistemą gali sudaryti heksahidronaftalenas
(simvastatinas, lovastatinas, mevastatinas, pravastatinas), pirolas (atorvastatinas), indolas (fluvastatinas), pirimidinas (rozuvastatinas), piridinas (cerivastatinas), chinolinas (pitavastatinas) [51,52].
3 pav. HMG-KoA ir statinų struktūra [16]
Jie jungiasi prie HMG-KoA reduktazės per dihidroksiheptano rūgšties fragmentą, imituodami fermento substratą HMG-KoA. Tokiu būdu statinai slopina šio fermento veikimą, negrįžtamai slopindami HMG-KoA virtimą mevalono rūgštimi ir cholesterolio sintezę [51] (4 pav.).
Sumažėjus mevalonato kiekiui, taip pat sumažėja ir tolimesnių jo produktų, tokių kaip dolicholis, GGPP, FPP, svarbių ląstelės signaliniams keliams, potransliacinėms modifikacijoms, ląstelių augimui bei diferenciacijai [53]. GPP ir FPP yra izoprenoidai, kurie jungiasi prie viduląstelinių nuo GTP priklausomų baltymų Ras ir Rho, dalyvaujančių signalų, svarbių vėžio vystymuisi, ląstelių proliferacijai, diferenciacijai, apoptozei, perdavime [10,11]. Esant izoprenoidų trūkumui, Ras ir Rho baltymai tampa neaktyvūs, sutrinka signalų perdavimas, naviko vystymasis ir vėžys regresuoja [54].
1.4. Statinų piešvėžinio aktyvumo tyrimai
Siekiant įvertinti galimą statinų pritaikymą vėžio terapijoje, atlikta daug tyrimų in vitro ir in vivo. Jų metu nustatyta, jog šie junginiai aktyvūs įvairų tipų vėžio ląstelių linijose, taip pat gyvūnų modeliuose (3 lentelė).
Tyrimų duomenys rodo, jog statinai slopina vėžinių ląstelių proliferaciją [31,55,56], sukelia apoptozę, veikdami proapoptozinius baltymus, tokius kaip Bax [57], mažindami antiapoptozinių baltymų, pvz., Bcl-2, Bcl-xl kiekį [32], didindami apoptozinių proteazių kaspazių aktyvumą [58], pasižymi antimetastaziniu veikimu, slopindami matrikso metaloproteinazių ekspresiją bei kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus sintezę [59].
3 lentelė. Statinų priešvėžinis aktyvumas in vitro ir in vivo
Vėžio rūšis Statinas Nuoroda į literatūros
šaltinį Kiaušidžių vėžys Simvastatinas, atorvastatinas,
rozuvastatinas, lovastatinas, fluvastatinas [22, 26, 27] Krūties vėžys Fluvastatinas, lovastatinas, simvastatinas,
mevastatinas [25, 28–31]
Storosios žarnos
vėžys Lovastatinas, simvastatinas, mevastatinas [32–37] Priešinės liaukos
vėžys
Atorvastatinas, rozuvastatinas, mevastatinas,
simvastatinas [24, 38]
Kasos vėžys Lovastatinas [39]
Leukemija Lovastatinas, simvastatinas, atorvastatinas,
mevastatinas [40, 41]
Smegenų vėžys Lovastatinas, mevastatinas, fluvastatinas,
simvastatinas, atorvastatinas [42–52] Kepenų vė žys Fluvastatinas, simvastatinas, atorvastatinas,
lovastatinas [53]
Kasos vėžys Atorvastatinas, fluvastatinas, lovastatinas,
cerivastatinas, simvastatinas [27, 54, 55]
Taip pat tiriamas statinų aktyvumas, juos derinant kartu su antinavikiniais vaistais (4 lentelė). Nustatytas sinergizmas tarp doksorub icino ir lovastatino kiaušidžių vėžio ląstelių linijose [60] bei tarp gemcitabino ir fluvastatino, veikiant kasos vėžines ląsteles [61]. Be to, eksperimentų duomenys rodo, jog simvastatinas bei lovastatinas adityviai veikia kartu su doksorubicinu ar cisplatina prieš kiaušidžių vėžio ląsteles, padidina jų jautrumą vaistams [33]. Panašus poveikis nustatytas ir tarp atorvastatino su gemcitabinu ar 5-fluorouracilu kasos vėžio ląstelių linijose [62]. Vis dėlto, statinai kartu su priešvėžiniais vaistais gali veikti ir antagonistiškai: pastebėta, kad didelės simvastatino koncentracijos ir karboplatina arba paklitakselis turi antagonistinį poveikį kiaušidžių vėžio ląstelėms [29].
Statinų poveikis kasos vėžio ląstelėms dar nėra taip plačiai ištirtas kaip kitoms vėžio rūšims. Čekijos mokslininkai, atlikę tyrimus su Capan-2, MIA PaCa-2 bei BxPC-3 ląstelių linijomis nustatė, kad in vitro sąlygomis 2D ląstelių kultūrose ryškiausiu antiproliferaciniu poveikiu pasižymėjo cerivastatinas (IC50 2–22 µM), šiek tiek silpniau veikė simvastatinas (IC50 3–26 µM) bei lovastatinas
(IC50 3–33 µM), dar mažiau proliferaciją slopino fluvastatinas (IC50 5–29 µM) ir atorvastatinas (IC50 5–
37 µM), tuo tarpu rozuvastatinas ir pravastatinas buvo mažai efektyvūs (IC50 > 40 µM). Atliekant
tyrimus in vivo su pelėmis buvo stebimi navikų dydžių pokyčiai veikiant įvairiais statinais. Gauti rezultatai skyrėsi nuo rezultatų, gautų in vitro sąlygomis: didžiausiu aktyvumu pasižymėjo fluvastatinas, cerivastatinas bei rozuvastatinas [63]. Taip pat atlikta tyrimų, vertinant statinų įtaką ląstelių migracijai bei invazyvumui. Nustatyta, jog lovastatinas bei fluvastatinas reikšmingai slopina epidermio augimo faktoriaus (EGF) sukeliamą RhoA translokaciją iš citozolio į plazminę membraną, aktino siūlų funkciją ir PANC-1, AsPC-1 bei MIA PaCa-2 kasos vėžio ląstelių migraciją ir invazyvumą in vitro [64].
4 lentelė. Statinų tyrimai in vitro derinyje su antinavikiniais vaistais
Statinas Antinavikinis vaistas
Vėžio rūšis Poveikis
Šalti-nis Atorvastatinas Gemcitabinas Kasos vėžys ↑veikimas, ↑ ląstelių jautrumas [62] Atorvastatinas 5-fluorouracilas Kasos vėžys ↑veikimas, ↑ ląstelių jautrumas [62]
Fluvastatinas Gemcitabinas Kasos vėžys Sinergizmas [61]
Lovastatinas Cisplatina Kiaušidžių vėžys Adityvumas, ↑ląstelių jautrumas [33] Lovastatinas Doksorubicinas Kiaušidžių vėžys Sinergizmas [60] Simvastatinas Cisplatina Kiaušidžių vėžys Adityvumas, ↑ląstelių jautrumas [33] Simvastatinas Doksorubicinas Kiaušidžių vėžys Adityvumas, ↑ląstelių jautrumas [33] Simvastatinas Karboplatina Kiaušidžių vėžys Adityvumas/antagonizmas [29] Simvastatinas Paklitakselis Kiaušidžių vėžys Adityvumas/antagonizmas [29]
Siekiant įvertinti, ar šia savybe statinai pasižymi ir in vivo sąlygomis, atliktas tyrimas su pelėmis, kurioms buvo įšvirkšta AsPC-1 ląstelių į blužnį. 2 dienas prieš injekciją bei 42 dienas po jos pelėms buvo skiriama 0,6 mg/kg fluvastatino. Nors AsPC-1 ląstelių blužnyje reikšmingai nesumažėjo, fluvastatinu gydytose pelėse nustatyta mažiau metastazinių mazgelių kepenyse, o jų vidutinis dydis buvo mažesnis nei kontrolinėse pelėse [65]. Be to, nustatytas sinergistinis fluvastatino bei gemcitabino poveikis in vitro ir in vivo tyrimuose su pelėmis [66].
Per pastarąjį dešimtmetį atlikta keletas epidemiologinių tyrimų, įrodančių statinų poveikį kasos vėžio prevencijai. 2006-2011 m. San Franciske buvo tiriamas statinų poveikis kasos vėžio prevencijai (n = 1405). Nustatyta, jog statinų vartojimas 34 proc. sumažino kasos vėžio riziką, tačiau toks statistiškai reikšmingas poveikis nustatytas tik vyrų grupėje. Ryškiausias prevencinis poveikis pastebėtas tarp pacientų, kurie statintus vartojo 10 metų ir ilgiau [67]. Taip pat aprašyta epidemiologinių tyrimų, įrodančių teigiamą statinų poveikį kasos vėžiu sergančių pacientų išgyvenamumui. 2010 m. JAV atliktos retrospektyvinės kohortinės analizės metu buvo tirti 7813 senyvo amžiaus (≥ 65 m.) pacientai, kuriems buvo diagnozuota kasos latako adenokarcinoma. Rezultatai parodė, jog statinų vartojimas po vėžio diagnozės maždaug 21 proc. sumažino mirties riziką pacientams, kuriems buvo diagnozuota I arba II laipsnio kasos latako adenokarcinoma, chirurgiškai pašalinta kasa arba buvo nustatytas lėtinis pankreatitas, bei tiems, kurie nėra vartoję statinų iki vėžio diagnozės [68]. Vis dėlto statinų efektyvumas kasos vėžio prevencijai vertinamas prieštaringai. 2003-2008 m. Taivanyje atlikto atvejo-kontrolės tyrimo metu (n = 950) nenustatytas ryšys tarp statinų vartojimo ir kasos vėžio išsivystymo rizikos [69].
Per pastaruosius dešimtmečius buvo atliekami ir klinikiniai tyrimai, vertinant priešvėžinį statinų aktyvumą (5 pav.). Remiantis ClinicalTrials.gov duomenimis, pirmieji priešvėžinio statinų aktyvumo klinikiniai tyrimai pradėti vykdyti 2001 m. Iš pradžių šie tyrimai nebuvo atliekami labai aktyviai, tačiau nuo 2005 m. jų skaičius sparčiai išaugo. Iki 2015 m. užregistruoti 73 klinikiniai tyrimai. Didžioji jų dalis (62) buvo skirti analizuoti statinų pritaikymą vėžio gydymui, 11 – įvertinti profilaktinį poveikį.
5 pav. Priešvėžinio statinų aktyvumo klinikiniai tyrimai pagal vėžio rūšis (parengta pagal ClinicalTrials.gov duomenis).
Simvastatino klinikinių tyrimų yra daugiausiai, kiek mažiau – atorvastatino, pravastatino, lovastatino. Tuo tarpu ClinicalTrials.gov duomenų bazėje neužregistruotas nei vienas cerivastatino, mevastatino bei pitavastatino klinikinis tyrimas. Cerivastatinas šiuo metu yra išimtas iš rinkos ir terapijoje nevartojamas [70]. Mevastatinas niekuomet nebuvo taikomas klinikinėje praktikoje dėl jo stiprių nepageidaujamų poveikių [71]. Gali būti, kad dėl to cerivastatinas ir mevastatinas nenaudojami klinikiuose tyrimuose, vertinant galimą pritaikymą vėžio terapijoje. Pitavastatinas yra pats naujausias statinas, kuris į JAV rinką išleistas tik 2009 m. [72], todėl tikėtina, jog ateityje šio vaisto klinikinių tyrimų skaičius didės.
Iki šiol klinikiniuose tyrimuose plačiausiai nagrinėtas statinų pritaikymas krūties vėžio gydymui (5 pav.). Vis dėlto, šių tyrimų rezultatai yra kontraversiški, didžiosios dalies rezultatai statinų efektyvumą paneigia (5 lentelė).
Metai Tyrimo tipas Fazė Tiriamųjų skaičius Vėžio tipas Tirti junginiai Rezultatai Šalti-nis 2008– 2012 Dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas
II 114 IIIB/IV fazių kasos vėžys Simvastatinas (40 mg) + gemcitabinas
Nenustatytas skirtumas tarp kontrolinės ir
tiriamosios grupių. [73] 2010– 2013 Daugiacentris, dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas
III 269 IV fazės kolorektalinis vėžys
Simvastatinas (40 mg) + irinotekanas + kapecitabinas arba simvastatinas (40 mg) + irinotekanas + folino rūgštis + 5-fluorouracilas
Nenustatytas skirtumas tarp kontrolinės ir
tiriamosios grupių. [74] 2006– 2008 Randomizuotas, atviras II 106 IIIB/IV fazių nesmulkialąstelinis plaučių vėžys Simvastatinas (40 mg) + gemcitabinas
Nenustatytas skirtumas tarp kontrolinės ir tiriamosios grupių. Turintiems laukinio tipo EGFR geną nustatytas didesnis atsako dažnis ir ilgesnis išgyvenamumas be ligos progreso, nei tarp gydytųjų tik gefitinibu.
[75] 2007– 2011 Dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas II 80 Melanomos prevencija Lovastatinas (5 sav. 40 mg/d., vėliau 80 mg/d.)
Nenustatytas skirtumas tarp kontrolinės ir
tiriamosios grupių. [76] 2007– 2011 Randomizuotas, viengubai aklas paralelinių grupių II 40 Duktalinė karcinoma in situ ir I stadijos estrogenų receptorių neigiamas krūties vėžys
Fluvastatinas (20 arba 80 mg/d.)
Fluvastatinas slopino didelio piktybiškumo
laipsnio naviko proliferaciją ir skatino apoptozę [77]
2007– 2012 Randomizuotas, dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas
III 846 Smulkialąstelinis plaučių
vėžys
Pravastatinas (40 mg/d.)
Nenustatytas skirtumas tarp kontrolinės ir
tiriamosios grupių. [78] 2009– 2012 Dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas
III 244 IV fazės skrandžio vėžys
Simvastatinas (40 mg/d.) +
kpecitabinas
Nenustatytas skirtumas tarp kontrolinės ir
tiriamosios grupių. [79]
2009– 2012
Galimybių
lango II 50
II ir III fazių krūties
vėžys Atorvastatinas
Atorvastatinas padidino naviko supresoriaus p27 ir sumažino onkogeno ciklino D1 genų ekspresiją, galimai slopindamas naviko proliferaciją; vėžio žymenų ekspresija nepakito.
intensyviai tiriamas ir yra nemažai duomenų, įrodančių jų poveikį in vivo bei in vitro. Vis dėlto, kai kurių statinų, tokių kaip pitavastatinas, tyrimų iki šiol atlikta nedaug. Be to, lyginant su kitomis vėžio rūšimis, literatūroje pateikta mažiau duomenų apie statinų aktyvumą prieš kasos vėžį ir jo ląstelių linijas, todėl tyrimams pasirinktos būtent šio vėžio tipo ląstelių linijos.
1.5. Pasirinktų ląstelių linijų savybės
Eksperimentams pasirinktos trys skirtingos žmogaus kasos latako adenokarcinomos ląstelių linijos BxPC-3, MIA PaCa-2 bei PANC-1. Adenokarcinomos sudaro apie 95 proc. visų kasos vėžių ir didžioji jų dalis pradeda formuotis kasos latakuose [13]. Lyginant ląstelių linijas tarpusavyje, BxPC-3 ląstelės yra agresyvesnės, labiau linkusios formuoti auglius [81]. Be to, BxPC-3 ląstelės išsiskiria tuo, kad jose KRAS genas, koduojantis KRAS GTP rišantį baltymą, yra laukinio tipo, priešingai nei 90 proc. kasos adenokarcinomos atvejų. Tuo tarpu MIA PaCa-2 bei Panc-1 ląstelėse šis genas yra mutavęs, vadinasi KRAS baltymas yra nuolat aktyvioje būsenoje [81]. Dėl šios priežasties MIA PaCa-2 bei Panc-1 ląstelės geriau imituoja kasos auglius.
Ląstelių linijos tarpusavyje skiriasi ne tik genotipais bei fenotipais, bet ir jautrumu gemcitabinui. Jautriausios šiam junginiui yra MIA PaCa-2, o atspariausios PANC-1 ląstelės. Nustatyta, jog BxPC-3, MIA PaCa-2 bei PANC-1 ląstelių linijoms gemcitabino EC50 koncentracijos svyruoja nuo
494 nM iki 23,9 µM (atitinkamai 830 nM, 494 nM ir 9,5 µM) [82].
Dar viena svarbi savybė priešvėžinio aktyvumo tyrimuose in vitro – 3D erdvinių struktūrų, kitaip vadinamų sferoidais, formavimas. Visos trys ląstelių linijos formuoja taisyklingus sferoidus, taikant kabančio lašo metodą su metilceliuliozės polimeru, tačiau BxPC-3 ląstelių sferinės struktūros perpus ar trečdaliu mažesnės nei kitų dviejų linijų, skiriasi savo fenotipu [83].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas: keturi HMG-KoA reduktazės slopikliai – mevastatinas (Alfa Aesar, ≥ 98 proc.), lovastatinas (Alfa Aesar, ≥ 97 proc.), simvastatinas (Abcam, > 99 proc.), pitavastatino kalcio druska (Abcam, > 98 proc.) (6 pav.).
6 pav. Šiame darbe tirtų statinų struktūrinės formulės
2.2. Reagentai, priemonės ir aparatūra
Tyrimuose naudotos žmogaus kasos adenokarcinomos ląstelių linijos:
BxPC-3 (ATCC);
MIA PaCa-2 (ATCC);
PANC-1 (ATCC).
Žalia fluorescencine žyme (GFP) pažymėtų žmogaus fibroblastų HF-GFP linija gauta iš FTMC Nanoinžinerijos skyriaus vedėjo Dr. Ramūno Valioko. Ši linija buvo pirkta iš ATCC.
Ląstelių kultivavimui bei tyrimams su jomis reikalingos priemonės (centrifūginiai mėgintuvėliai, vienkartinės pipetės, 6, 12, 24 ir 96 šulinėlių plokštelės, lėkštelės ląstelių auginimui, labai mažo prilipimo 96 šulinėlių plokštelės, antgaliai pipetėms ) įsigytos iš kompanijos Corning.
Ląstelių sferoidų gamybai 3D Bioprinting metodu naudotos magnetinės plokštelės ir nanodalelės NanoShuttleT M įsigytos iš kompanijos Nano3D Biosciences. Sferoidams suformuoti reikalingų agarozinių plokštelių gamybai naudota 256 šulinėlių forma 3D PetriDish® įsigyta iš kompanijos MicroTissues.
Reagentai:
1 proc. antibiotikų tirpalas (10 000 VV/ml penicilino ir 10 mg/mg streptomicino, Gibco);
3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (Sigma-Aldrich, ≥ 97 proc.);
Agarozė (molekulinės biologijos grynumo, Sigma-Aldrich);
Buferinis fosfatinis druskų tirpalas pH 7,4 (PBS, Gibco);
Dimetilsulfoksidas (DMSO, Sigma-Aldrich Co., ≥ 99,5 proc.);
Dulbecc‘o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė su didele gliukozės koncentacija (DMEM GlutaMAX, Gibco);
Fetalinis veršiukų serumas (FBS, Gibco);
Hoechst 33342 10 mg/ml vandeninis tirpalas (Thermo Scientific);
Kristalinis violetinis (Sigma-Aldrich, ≥ 90 proc.);
Ląstelių mitybinė terpė 106 su priedu Low Serum Growth Supplement (LSGS) (Gibco);
Paraformaldehido 16 proc. vandeninis tirpalas (Thermo Scientific);
Propidžio jodido 1 mg/ml vandeninis tirpalas (Thermo Scientific);
Roswell Park Memorial Institute 1640 ląstelių mitybinė terpė (RPMI 1640 GlutaMAX, Gibco);
Tripsino tirpalas TrypLE™ Express (Gibco). Aparatūra:
Centrifuga Eppendorf Centrifuge 5702 R (Eppendorf);
G:BOX Chemi XRQ gelių dokumentacijos sistema ląstelių kolonijoms fotografuoti (Syngene International Ltd);
Mikroplokštelių skaitytuvas MultiscanT M FC (Thermo ScientificT M);
Mikroskopas Olympus IX73, invertuotas fluorescencinis (Olympus);
2.3. Tyrimo metodikos
2.3.1.
Ląstelių kultūrų auginimas
Ląstelių atšildymas. Ląstelės atšildomos, jų suspeniją maišant su kambario temperatūros mitybine terpe, praturtinta 10 proc. FBS ir 1 proc. antibiotikų tirpalo (toliau vadinama mitybine terpe). Ląstelių suspensija pilama į 10 cm skersmens lėkštelę. BxPC-3 ląstelių linija kultivuojama RPMI 1640 GlutaMAX mitybinėje terpėje, MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių linijos – DMEM GlutaMAX, o HF-GFP ląstelių linija – ląstelių mitybinėje terpėje 106 su LSGS priedu. Atšildytos ląstelės inkubuojamos 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje. Po 24 val. terpė pakeičiama nauja mitybine terpe.
Ląstelių persėjimas. Ląstelės auginamos, kol jos padengia apie 70 proc. lėkštelės dugno ploto. Tuomet nuo ląstelių mitybinė terpė nusiurbiama, ląstelės praplaunamos PBS. Įpilamas 1 ml tripsino (TrypLE Express) tirpalo, inkubuojama 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje, kol
ląstelės atkimba nuo lėkštelės dugno (6-8 min.). Tripsinas inhibuojamas 9 ml mitybinės terpės, ląstelės suspenduojamos, visas lėkštelės turinys perkeliamas į 15 ml centrifuginį mėgintuvėlį. Centrifuguojama 4 min. kambario temperatūroje, 1000 aps./min. greičiu. Supernatantas nupilamas, ląstelės suspenduojamos 2-5 ml mitybinės terpės. Jei reikia, ląstelės skaičiuojamos panaudojant Neubauer kamerą. 0,5-1 ml suspensijos perkeliama į 10 cm skersmens lėkštelę, sumaišoma su 9-10 ml mitybinės terpės, auginama 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.
Ląstelių linijos, naudotos šiame darbe aprašytiems eksperimentams, buvo auginamos iki dvidešimto persėjimo po jų atšildymo.
2.3.2.
Poveikio ląstelių gyvybingumui nustatymas
Statinų poveikis ląstelių gyvybingumui buvo nustatomas MTT metodu trims žmogaus kasos vėžio ląstelių linijoms: BxPC-3, MIA PaCa-2 bei PANC-1. Į 96 šulinėlių plokšteles pilama po 100 µl paruoštos ląstelių suspensijos taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 5000 ląstelių. Plokštelė inkubuojama 24 val. 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje. Tuomet į šulinėlius su ląstelėmis
pilama po 100 µl skirtingos koncentracijos tiriamųjų junginių tirpalų mitybinėje terpėje. Kiekvienai junginio koncentracijai naudojama po tris šulinėlius. Kaip teigiama kontrolė naudojama mitybinė terpė be ląstelių, o kaip neigiama kontrolė – ląstelės, inkubuojamos mitybinėje terpėje su 0,5 proc. DMSO (tokia pati DMSO koncentracija buvo visuose šulinėliuose su tiriamaisiais junginiais). Ląstelės inkubuojamos 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.
Praėjus 24, 48 ir 72 val. į šulinėlius pilama po 10 µl 5 mg/ml sterilaus MTT tirpalo ir inkubuojama 4 val. tomis pačiomis sąlygomis. Vėliau skystis iš plokštelių išpilamas ir susiformavę
formazano kristalai tirpinami 50 μ l DMSO. Gyvybingų ląstelių kiekis vertinamas spektrofotometriškai, tirpalų absorbciją matuojant mikroplokštelių skaitytuvu 570 nm ir 630 nm bangos ilgiuose.
Išmatuotos absorbcijos vertės normalizuojamos nuo 0 iki 1, kur 0 atitinka neigiamą, o 1 – teigiamą kontrolę. Gauti duomenys analizuojami Microsoft Office Excel 2007 programa, nustatomos junginių koncentracijos, slopinančios 50 proc. ląstelių gyvybingumą (EC50).
2.3.3.
Poveikio ląstelių sferoidams tyrimas
Ląstelių sferoidams formuoti taikyti 3D Petri Dish® ir 3D Bioprinting metodai.
3D Petri Dish® metodas naudotas suformuoti PANC-1 ląstelių sferoidus. Taikant šį metodą,
iš 3 proc. agarozės tirpalo pagaminamos agarozinės plokštelės su 256 identiškais šulinėliais, kuriuose formuojami sferoidai. Plokštelėms pagaminti naudojama 3D Petri Dish® originali plastiko forma. Pagamintos agarozės plokštelės steriliomis sąlygomis sudedamos į 6 šulinėlių plokštelę. Į kiekvieną šulinėlį įpilama mitybinės terpės, joje plokštelės palaikomos apie 30-60 min.
Paruošiama PANC-1 ląstelių suspensija DMEM GlutaMAX mitybinėje terpėje ir skiedžiama taip, kad supylus po 100 μl suspensijos į kiekvieną plokštelę, į kiekvieną jos šulinėlį patektų atitinkamai po 4000, 2000, 1000, 500 bei 250 ląstelių. Iš agarozinių plokštelių nusiurbiama mitybinė terpė, supilama po 100 µl paruoštų skirtingų koncentracijų ląstelių suspensijų. 6 šulinėlių plokštelė su agarozinėmis formelėmis ir ląstelių suspensijomis inkubuojama 37 C, 5 proc. CO2 atmosferoje.
Plokštelės su ląstelių kultūromis fotografuojamos mikroskopu kas 24 val., naudojant 4× didinimo objektyvą.
3D Bioprinting metodas buvo naudojamas suformuoti sferoidus iš BxPC-3, MIA PaCa-2 bei
PANC-1 ląstelių. Šios ląstelių linijos nesuformavo sferoidų, dėl to jos maišomos su žmogaus fibroblastais santykiu 1:1 (toks santykis nustatytas eksperimentiškai). 6 šulinėlių plokštelės šulinėliuose atskirai inkubuojamos kasos vėžio ląstelės ir žmogaus fibroblastai (apie 250 000 ląstelių viename šulinėlyje). Po 10-12 val. nuo inkubavimo pradžios į kiekvieną šulinėlį įpilama po 10 µl nanodalelių NanoShuttle ir ląstelės inkubuojamos dar 8-10 val.
Ląstelės tripsinizuojamos, gaminamos suspensijos DMEM Glutamax ir mitybinės terpės 106 mišinyje (1:1). Suspensijos sumaišomos lygiais santykiais ir išpilstomos į 96 šulinėlių labai mažo prilipimo plokšteles po 100 μl taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 2000 kasos vėžio ląstelių ir 2000 fibroblastų. Paruošta plokštelė dedama ant magnetinės plokštelės ir inkubuojama 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.
Sferoidai iš BxPC-3 ir PANC-1 ląstelių susiformavo per 48 val., o sferoidai iš MIA PaCa-2 ląstelių – per 72 val. Tuomet sferoidai kiekviename šulinėlyje fotografuojami fazių kontrastiniu
mikroskopu, naudojant 4× padidinimo objektyvą. Mitybinė terpė pakeičiama nauja terpe su skirtingomis statinų koncetracijomis (5, 10 ir 20 μM). Kaip neigiama kontrolė naudojama terpė su 0,5 proc. DMSO (tokia DMSO koncentracija buvo visuose šulinėliuose). Sferoidai fotografuojami kas 2 dienas, terpė keičiama kas 4 dienas.
Statinų poveikis 3D kultūroms vertinamas pagal sferoidų skersmens pokytį, analizė atliekama naudojantis ImageJ programa (Nacionalinis sveikatos institutas, angl. National Institutes of Health).
2.3.4.
Poveikio ląstelių kamieniškumui nustatymas
Statinų poveikis kamieniškumui tiriamas, įvertinant ląstelių gebėjimą suformuoti kolonijas. Į 12 šulinėlių plokšteles pilama po 1 ml paruoštos ląstelių (BxPC-3, MIA PaCa-2 arba PANC-1) suspensijos taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 100 ląstelių. Į šulinėlius supilami statinų tirpalai taip, kad galutinės junginių koncentracijos šulinėliuose atitiktų 10 ir 90 proc. MTT tyrimo metu nustatytų EC50 reikšmių. DMSO kocentracija visuose šulinėliuose, įskaitant neigiamą kontrolę (t.y.
ląstelės, nepaveiktos statinais), buvo 0,2 proc. Ląstelės inkubuojamos 12 dienų 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.
Po 12 dienų šulinėliai 2 kartus plaunami PBS tirpalu, ląstelės fiksuojamos 4 proc. paraformaldehido tirpalu kambario temperatūroje 15 min. Praplaunama PBS tirpalu, 15 min. inkubuojama su 0,1 proc. kristalinio violetinio vandeniniu tirpalu. Tuomet kelis kartus plaunama steriliu dejonizuotu vandeniu ir džiovinama.
Plokštelės fotografuojamos G:BOX gelių dokumentacijos sistema, naudojant Genesys programą. Ląstelių kolonijų skaičius šulinėlyje ir procentinis plotas apskaičiuoti GeneTools programa. Kontrolė prilyginta 100 proc., pagal ją procentaliai perskaičiuoti kitų grupių rezultatai.
2.3.5.
Vėžio ląstelių žūties būdo nustatymas
Kasos vėžio ląstelių linijos BxPC-3, MIA PaCa-2 ir PANC-1 sėjamos į 24 šulinėlių plokšteles po 0,5 ml taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų 15000 ląstelių. Plokštelės su ląstelėmis 24 val. inkubuojamos 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.
Tuomet į šulinėlius supilami statinų tirpalai DMSO taip, kad kiekviename šulinėlyje DMSO koncentracija būtų 0,5 proc., o galutinės statinų koncentracijos būtų lygios 10, 50 ir 90 proc. MTT tyrimo metu jų nustatytų EC50 reikšmių. Kiekvienai junginio koncentracijai naudojama po tris
šulinėlius. Plokštelės su ląstelėmis 72 val. inkubuojamos 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2
Po trijų parų iš šulinėlių atsargiai nusiurbiama terpė, ląstelės plaunamos PBS ir pilama po 500 μl naujos terpės. Į kiekvieną šulinėlį pilama po 3 μl 10 mg/ml Hoechst 33342 vandeninio tirpalo ir 1 μl 1 mg/ml propidžio jodido vandeninio tirpalo. Po 10 min. ląstelės fotografuojamos fluorescenciniu mikroskopu, naudojant 10× didinimo objektyvą. Padaroma po penkias skirtingose kiekvieno šulinėlio vietose augančių ląstelių nuotraukas.
Nuotraukose rankiniu būdu apskaičiuojama procentinė apoptotinių ir nekrotinių ląstelių dalis nuo bendro ląstelių skaičiaus. Gyvybingos ląstelės yra mėlynos spalvos, apoptotinės ląstelės traukiasi, jų branduoliai švyti melsvai, tuo tarpu nekrotinės ląstelės nusidažo raudona spalva.
2.3.6.
Statistinis duomenų apdorojimas
Gauti duomenys apdoroti Microsoft Office Excel 2007 programa, apskaičiuojant trijų nepriklausomų eksperimentų metu gautų rezultatų vidurkius ir santykinius nuokrypius. Patikimumui vertinti taikytas Student‘o t kriterijus, skirtumai laikyti statistiškai patikimais, kai reikšmingumo lygmuo p < 0,05.
Koreliacija tarp rezultatų 2D ir 3D kultūrose įvertinta apskaičiuojant Pearson`o koreliacijos koeficientą r, įvertinus ryšio stiprumą bei koreliacijos koeficiento patikimumą. Koreliacija laikoma stipria, kuomet r yra 0,7 – 1 arba -1 – (-0,7); vidutine, kai r yra 0,5 – 0,7 arba -0,7 – (-0,5); silpna, kai r yra 0,2 – 0,5 arba -0,5 – (-0,2).
3. REZULTATAI IR JŲ AP TARIMAS
3.1. Statinų poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui
Statinai tarpusavyje pasižymėjo skirtingu antiproliferaciniu aktyvumu (7 pav.). Jie visas tris ląstelių linijas veikė panašiai, EC50 vertės skyrėsi tik tarp BxPC-3 ir MIA PaCa-2 ląstelių, paveiktų
simvastatinu, bet ir šis poveikis nebuvo statistiškai reikšmingas (p > 0,05). Po 72 val. labiausiai ląstelių gyvybingumą slopino pitavastatinas (EC50 BxPC-3, MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių linijose
atitinkamai lygi 1,4 ± 0,4; 1,0 ± 0,2 ir 1,0 ± 0,4 μM) (7 pav.). Pagal aktyvumą junginiai išsidėstė tokia seka: pitavastatinas > simvastatinas > lovastatinas > mevastatinas. Nustatytos lovastatino bei simvastatino EC50 vertės po 72 val. inkubacijos šiek tiek mažesnės nei aprašytos literatūroje, kur
lovastatino EC50 prieš MIA PaCa-2 bei BxPC-3 ląstelių linijas atitinkamai lygios 3 ir 7 µM, o
simvastatino – 5 ir 6 µM [63], tačiau šis skirtumas nėra didelis ir gali atsirasti dėl nevienodų kultivavimo sąlygų bei taikytos skirtingos metodikos ląstelių gyvybingumo nustatymui.
7 pav. Statinų EC50 verčių palyginimas tarp skirtingų ląstelių linijų po 72 val.
Gautus rezultatus galima paaiškinti mokslininkų Istvan ir Igel nustatyta statinų geba slopinti fermentą HMG-KoA reduktazę: didžiausiu slopinamuoju aktyvumu pasižymi pitavastatinas, šiek tiek mažesniu simvastatinas, lovastatinas, o silpniausiai veikia mevastatinas [84,85]. Mokslininkas Istvan taip pat nustatė, jog II tipo statinai, kuriems priskiriamas pitavastatinas, su HMG-KoA reduktaze formuoja daugiau jungčių, o tai sustiprina jų inhibicinį poveikį, lyginant su I tipo statinais, kuriems priskiriami likusieji tirti junginiai – mevastatinas, lovastatinas ir simvastatinas [23]. Pastarųjų statinų struktūros yra labai panašios, skiriasi tik metilo grupių prie naftaleno žiedo ir butano rūgšties liekanos skaičiumi (6 pav.). Mevastatino struktūroje yra tik viena metilo grupė, prisijungusi prie butano rūgšties
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Mevastatinas Lovastatinas Simvastatinas Pitavastatinas
EC
50
liekanos, dėl ko šis statinas yra mažiausiai lipofiliškas. Prie lovastatino dekalino žiedo yra papildoma metilo grupė, lyginant su mevastatinu, todėl lovastatinas yra lipofiliškesnis. Tuo tarpu simvastatinas pasižymi didžiausiu lipofiliškumu, nes jo struktūroje esančioje šoninėje grandinėje prijungta dar viena metilo grupė. Kuo lipofiliškesni statinai, tuo lengviau jie gali pereiti ląstelių membraną [86], ir dėl to jie galėjo turėti didesnį antiproliferacinį aktyvumą.
Pitavastatinas antiproliferaciniu aktyvumu išsiskyrė ir kitų autorių atliktų tyrimų metu. Mokslininkas Jiang nustatė, jog pitavastatinas buvo vienas iš aktyviausių statinų, slopinusių krūties vėžio bei glioblastomos ląstelių proliferaciją (EC50 po 72 val. skirtingose ląstelių linijose svyravo nuo
0,1 iki 7,3 μM), už jį stipresniu antiproliferaciniu veikimu pasižymėjo tik cerivastatinas [87].
Taip pat nustatyta, kad statinų gyvybingumo nuo koncentracijos priklausomybės kreivių profilis primena antimetabolitų veikimą [88]. Jie iš karto nenužudo visų ląstelių net didelėmis koncentracijomis, ryškus citotoksinis poveikis pastebimas tik po 48 ar 72 val. (8 pav.).
8 pav. Pitavastatino poveikis BxPC-3 (A) ir MIA PaCa-2 (B) ląstelių gyvybingumui skirtingais laiko tarpais
Apibendrinus gautus rezultatus, galima teigti, jog statinai mažina kasos vėžio ląstelių linijų gyvybingumą. II tipo statinas pitavastatinas pasižymėjo didesniu aktyvumu nei I tipo statinai.
3.2. Statinų poveikis vėžio ląstelių sferoidams
3D ląstelių kultūros geriau imituoja in vivo sąlygas nei monosluoksniu auginamos ląstelės [89], todėl tyrimai ląstelių sferoiduose leidžia geriau prognozuoti junginio poveikį gyvame organizme. Siekiant įvertinti, ar statinai priešvėžiniu aktyvumu pasižymi ne tik 2D ląstelių kultūrose, jais buvo veikiami kasos vėžio ląstelių sferoidai.
Iš pradžių sferoidai buvo formuojami 3D Bioprinting metodu, tačiau MIA PaCa-2 bei PANC-1 ląstelių linijos šiuo būdu sferoidų neformavo (9A pav.). Dėl to buvo pasirinktas 3D Petri Dish® metodas, tačiau ir šis būdas nedavė teigiamų rezultatų (9B pav.).
9 pav. A. 3D Petri Dish® metodu nesusiformavę PANC-1 sferoidai; B. 3D Bioprinting metodu nesusiformavę MIA PaCa-2 sferoidai
Literatūros duomenimis, ir kitiems mokslininkams nepavyko suformuoti 3D kultūrų vien iš gaubtinės žarnos adenokarcinomos ląstelių, tačiau pridėjus fibroblastų gauti kompaktiški apvalūs sferoidai [90]. Be to, gyvuose organizmuose naviką sudaro ne vien vėžinės ląstelės. Fibroblastai yra kasos bei kitų organų navikų stromos sudedamoji dalis, kuri svarbi auglio formavimuisi bei vystymuisi, padeda palaikyti jo struktūrą, išskiria įvairius augimo faktorius bei ekstraląstelinio matrikso komponentus [91]. Be to, didelę kasos naviko dalį sudaro stroma su fibroblastais ir tuo šis vėžys išsiskiria iš kitų vėžio rūšių [92].
Dėl minėtų priežasčių buvo nutarta sferoidus formuoti iš kasos vėžio ląstelių ir žmogaus fibroblastų santykiu 1:1, taikant 3D Bioprinting metodą. Šiuo būdu BxPC-3 ląstelės po 2 dienų suformavo nedidelius, apvalius, kompaktiškus sferoidus (10 pav.), tuo tarpu MIA PaCa-2 ir PANC-1 sferoidai formavosi kiek sunkiau (PANC-1 sferoidai susiformavo po 2, o MIA PaCa-2 – po 3 dienų), buvo daug didesni, nelygiais kraštais. Gautų sferoidų skersmuo buvo mažesnis nei 500 µM, kuomet sferoido centre pradeda formuotis nekrotinė zona [93].
10 pav. A. BxPC-3 sferoidų dydžio kitimas, kai statinų koncentracija 20 µM; B. BxPC-3 sferoidų dydžio skirtumai po 18 dienų inkubacijos skirtingomis statinų koncentracijomis
Kaip ir 2D kultūrose, didžiausiu aktyvumu visų trijų linijų sferoiduose pasižymėjo pitavastatinas (p < 0,05), silpniau veikė simvastatinas, o lovastatinas ir mevastatinas buvo mažiausiai aktyvūs. BxPC-3 sferoidų irimą sukėlė visi keturi 20 µM koncentracijos statinai bei 5 μM koncentracijos pitavastatinas ir simvastatinas. Šiais junginiais paveikti sferoidai pradėjo irti po 2 dienų, pats sparčiausias irimas pastebėtas 2-rą – 6-tą dienomis. 1 µM visų statinų ir 5 μM mevastatino bei lovastatino tirpalais paveikti sferoidai iki pat tyrimo pabaigos dydžiu reikšmingai nesiskyrė nuo kontrolės (p > 0,05). Tuo tarpu 20 µM pitavastatinu veikiamų sferoidų dydis 12-tą ekperimento dieną stabilizavosi, buvo 1,4 karto mažesni lyginant su kontrole (11 pav).
11 pav. A. BxPC-3 sferoidų dydžio kitimas inkubuojant su 20 µM koncentracijos statinais
MIA PaCa-2 sferoidai, priešingai BxPC-3 3D kultūroms, palaipsniui didėjo (12 pav.), tačiau jų augimą nuo pat eksperimento pradžios reikšmingai slopino visi keturi 20 µM koncentracijos statinai bei 5 ir 1 μM koncentracijos pitavastatinas ir simvastatinas (p < 0,05) (13 pav.).
12 pav. A. MIA PaCa-2 sferoidų dydžio kitimas, kai statinų koncentracija 20 µM; B. MIA PaCa-2 sferoidų dydžio skirtumai po 6 dienų inkubacijos skirtingomis statinų koncentracijomis
6-tą dieną pastebėtas sferoidų, paveiktų 5 bei 20 µM pitavastatinu bei 20 µM mevastatinu, lovastatinu bei simvastatinu, irimas. 8-tą tyrimo dieną sferoidai, paveikti 5 ir 20 µM pitavastatino bei 20 µM simvastatino tirpalais, visiškai suiro.
13 pav. MIA PaCa-2 sferoidų dydžio kitimas inkubuojant su 20 µM koncentracijos statinais
Panašūs rezultatai gauti ir su PANC-1 sferoidais. Jie taip pat pamažu didėjo, bet 4-tą eksperimento dieną nustatytas 3D kultūrų, paveiktų 5 bei 20 µM pitavastatino tirpalais, mažėjimas, o per aštuonias ekperimeto dienas šiais junginiais pave ikti sferoidai atitinkamai sumažėjo 1,3 bei 1,6 karto (14 pav.).
14 pav. A. PANC-1 sferoidų dydžio kitimas, kai statinų koncentracija 20 µM; B. PANC-1 sferoidų dydžio skirtumai po 6 dienų inkubacijos skirtingomis statinų koncentracijomis
Lyginant su kontrole nuo pat pirmosios dienos sferoidų augimą slopino 1, 5 ir 20 µM koncentracijos pitavastatinas, 5 ir 20 µM koncentracijos simvastatinas bei 20 μM koncentracijos lovastatinas ir mevastatinas (15 pav.). 8-tą dieną pradėjo irti visi sferoidai, įskaitant kontrolę.
15 pav. PANC-1 sferoidų dydžio kitimas inkubuojant su 20 µM koncentracijos statinais
Palyginus tyrimo sferoiduose ir MTT testo rezultatus, galima pastebėti, jog statinai ląstelių 2D kultūras veikė aktyviau nei 3D kultūras. Mokslininkas Longati nustatė, jog tam tikri vaistai, kaip gemcitabinas, mikrovamzdelių inhibitoriai ar alicinas, sferoiduose pasižymėjo daug silpnesniu antiproliferaciniu aktyvumu lyginant su 2D kultūromis [94]. Viena iš priežasčių gali būti ribota junginio skvarba į sferoidus [95], dėl ko labiau veikiamos arčiau sferoidų kraštų esančios ląstelės, tuo tarpu monosluoksnyje augančios ląstelės junginiu yra veikiamos vienodai. Analizuodamas kasos vėžio ląstelių Capan-2 sferoidus, mokslininkas Laurent nustatė, jog 10 μM koncentracijos lovastatinas pasižymi ląstelės ciklo slopinimu G1 fazėje, tačiau šis poveikis pastebėtas tik išoriniuose 300-350 µM skersmens sferoidų sluoksniuose [96].
Sferoiduose pagal aktyvumą statinai išsidėstė tokia pačia seka kaip ir monosluoksniu auginamose ląstelėse. Palyginus aktyvumą skirtingų ląstelių linijų 2D ir 3D kultūrose MIA PaCa-2 linijoje nustatytas stiprus (r = 0,94), o BxPC-3 bei PANC-1 vidutinis (atitinkamai r = 0,67 ir r = 0,63) koreliacijos ryšys (pavyzdžiui, aktyviausias junginys 2D kultūrose pitavastatinas labiausiai slopino ir sferoidų augimą). Tačiau šis ryšys statistiškai nepatikimas (p > 0,05).
Eksperimento metu nustatėme, kad statinai slopina sferoidų augimą bei skatina jų irimą. Junginių aktyvumas pasižymėjo ta pačia tendencija kaip ir MTT tyrime: aktyviausiai sferoidų augimą veikė pitavastatinas, silpniau simvastatinas, lovastatinas, o mažiausiu aktyvumu pasižymėjo
mevastatinas. Taip pat gauti rezultatai rodo, jog poveikiui 3D kultūrose pasiekti reikalingos didesnės junginių koncentracijos nei ląstelių monosluoksnyje.
3.3. Statinų poveikis vėžio ląstelių kamieniškumui
Siekiant įvertinti, ar statinai turi poveikį kasos vėžio ląstelių kamieniškumui, atliktas kolonijų formavimo tyrimas, kurio metu nustatyta, jog statinai tam tikromis koncentracijomis reikšmingai mažina besiformuojančių kolonijų skaičių bei plotą. Kaip ir antiproliferacinio aktyvumo bei poveikio ląstelių sferoidams tyrimuose, didžiausiu aktyvumu pasižymėjo pitavastatinas. Jis visose trijose ląstelių linijose labiausiai mažino susidariusių kolonijų skaičių bei plotą (p < 0,05). Tuo tarpu statistiškai reikšmingo skirtumo tarp mevastatino, lovastatino ir simvastatino nenustatyta (p > 0,05).
Tyrimo rezultatai tarp skirtingų kasos vėžio ląstelių linijų skyrė si. Statinai MIA PaCa-2 bei PANC-1 ląstelių linijas veikė panašiai (p > 0,05), tuo tarpu aktyvumas prieš BxPC-3 ląsteles buvo daug silpnesnis (p < 0,05) (13 pav.). BxPC-3 ląstelių kolonijų skaičių reikšmingai sumažino tik 90 proc. EC50 (1,3 µM) pitavastatinas, lyginant su kontrole (p < 0,05). Tuo tarpu kolonijų dydžio kitimui
daugiausia įtakos turėjo 90 proc. EC50 pitavastatinas, simvastatinas (1,1 µM) ir mevastatinas (3,5 µM),
bendrą kolonijų plotą atitinkamai sumažinę 2,3; 1,3 ir 1,3 karto (16 pav.).
16 pav. Ląstelių kolonijų skaičius po 12 dienų inkubacijos su skirtingais statinais; * pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių kolonijų skaičiaus, p < 0,05. Tyrimuose naudotos statinų koncentracijos, atitinkančios 90 proc. jų nustatytos EC50 vertės
MIA PaCa-2 kolonijų formavimąsi labiausiai slopino pitavastatinas, kurios 90 proc. EC50
(0,9 µM) paveiktos ląstelės formavo 16,3 karto mažiau kolonijų ir jų p lotas sumažėjo nuo 13,2 iki 0,2 proc. bendro šulinėlio ploto (17 pav.). Mažesnis kolonijų skaičius bei plotas lyginant su kontrole
nustatyti ir šulinėliuose su 10 proc. EC50 (0,1 µM) pitavastatinu bei su 90 proc. EC50 simvastatinu
(1,8 µM), lovastatinu (2,7 µM) bei mevastatinu (3,8 µM).
17 pav. Procentinis kolonijų plotas po 12 dienų inkubacijos su skirtingais statinais; * pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių kolonijų procentinio ploto, p < 0,05. Tyrimuose naudotos statinų koncentracijos, atitinkančios 90 proc. jų nustatytos EC50
vertės
Panašūs rezultatai gauti ir su PANC-1 ląstelių linija, tik šiuo atveju 90 proc. EC50 (0,9 µM)
pitavastatinas visiškai nužudė ląsteles (18 pav.). Be to, mažesnis kolonijų skaičius nustatytas ne tik 90 proc. EC50 (1,3 µM), bet ir 10 proc. EC50 (0,1 µM) simvastatinu paveiktose ląstelėse.
Mūsų žinomis, statinų poveikis kasos vėžio kolonijų formavimui iki šiol nebuvo tirtas, tačiau literatūroje galima rasti nemažai duomenų, įrodančių, jog statinai pasižymi kitų tipų vėžio ląstelių kamieniškumo slopinimu. Autorius Brown, tirdamas rozuvastatino, mevastatino, atorvastatino, simvastatino bei pravastatino poveikį prostatos vėžio ląstelių kamieniškumui nustatė, jog pravastatinas koncentracijomis iki 100 μM neturėjo jokios įtakos kamieniškui, tuo tarpu 1 µM koncentracijos simvastatinas labiausiai sumažino besiformuojančių kolonijų skaičių ir dydį [31]. Kiti mokslininkai ištyrė, jog pitavastatinas 0,5 ir 1 μM koncentracijomis slopina kepenų vėžio ląstelių linijų Huh-7 ir SMMC7721 kolonijų formavimąsi. [97] Reikšmingas kolonijų skaičiaus ir jų dydžio sumažėjimas pastebėtas paveikus ir šlapimo pūslės vėžio ląstelių linijas 5637, EJ ir T24 1 bei 5 μM koncentracijos simvastatinu [98] bei paveikus krūties vėžio linijas MDA-MB-231 ir MCF-7 0,1 μM koncentracijos simvastatinu [99].
Mūsų tyrimo rezultatai patvirtino literatūroje pateiktus duomenis, jog statinai slopina vėžio ląstelių gebėjimą formuoti kolonijas. Nustatėme, jog labiausiai kasos vėžio ląstelių kolonijų skaičių bei plotą mažino pitavastatinas. Tuo tarpu, priešingai nei poveikio ląstelių gyvybingumui tyrimo metu, statistiškai reikšmingo skirtumo tarp kitų statinų aktyvumo nenustatėme. Be to, gauti duomenys parodė, jog statinų aktyvumas vėžio ląstelių linijose skyrėsi: MIA PaCa-2 bei PANC-1 ląstelės formavo mažiau kolonijų ir jų plotas buvo mažesnis, lyginant su BxPC-3.
3.4. Statinų sukeliamas ląstelių žūties būdas
Nustačius, kad statinai slopina ląstelių gyvybingumą, taip pat buvo vertinama, kokiu būdu – apoptozės ar nekrozės – yra sukeliama ląstelių žūtis. Tyrimo rezultatai parodė, jog mažomis koncentracijomis (10 proc. EC50) statinai nesukėlė nei ląstelių apoptozės, nei nekrozės (p > 0,05), tuo
tarpu ląsteles paveikus didesnėmis statinų koncentracijomis (50 ir 90 proc. EC50) visose trijose linijose
nustatytas didesnis apoptotinių ląstelių kiekis lyginant su kontrole (p < 0,05) (19 pav.). Nekrozę 90 proc. EC50 koncentracijomis BxPC-3 ląstelių linijoje sukėlė visi keturi statinai, o MIA PaCa-2 bei
19 pav. Skirtingų koncentracijų statinų sukeliama PANC-1 ląstelių žūtis (A – gyvybingos ląstelės, B – apoptotinės ląstelės, C – nekrotinės ląstelės)
Palyginus statinų poveikį tarpusavyje nustatyta, jog BxPC-3 ląstelių linijoje 90 proc. EC50
koncentracijomis aktyviausiai apoptozę sukėlė pitavastatinas (p < 0,05), silniau veikė simvastatinas (p < 0,05), o mažiausiu aktyvumu pasižymėjo lovastatinas bei mevastatinas (p < 0,05) (20 pav. A). Tos pačios tendencijos pastebėtos ir PANC-1 ląstelių linijoje (p < 0,05) (21A pav.). Nekrotinių ląstelių skaičius visais keturiais statinais paveiktose BxPC-3 ląstelėse nesiskyrė (p > 0,05) (20 pav. B).
20 pav. A. Apoptotinių BxPC-3 ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingais statinais; B. Nekrotinių BxPC-3 ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingais statinais; * pažymėti
PANC-1 linijoje 90 proc. EC50 koncentracijomis intensyviau nekrozę sukėlė pitavastatinas
bei simvastatinas nei kiti du statinai (p < 0,05) (21 pav. B).
21 pav. A. Apoptotinių PANC-1 ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingais statinais; B. Nekrotinių PANC-1 ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingais statinais;
* pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05
Tuo tarpu lovastatinu, mevastatinu ir simvastatinu peveiktoje MIA PaCa-2 linijoje apoptotinių ląstelių skaičius buvo vienodas (p > 0,05), reikšmingai daugiau apoptotinių ląstelių nustatyta tik 90 proc. EC50 koncentracijos pitavastatinu paveiktoje linijoje (p < 0,05) (22 pav. A). Nekrotinių
ląstelių skaičius visais keturiais statinais paveiktoje MIA PaCa-2 linijoje reikšmingai nesiskyrė (p > 0,05) (22 pav. B).
22 pav. A. Apoptotinių MIA PaCa-2 ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingais statinais; B. Nekrotinių MIA PaCa-2 ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingais statinais;
* pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05.
Taip pat nustatyta, jog lovastatinas, simvastatinas ir pitavastatinas aktyviau apoptozę ir nekrozę sukėlė MIA PaCa-2 ir PANC-1 ląstelių linijose nei BxPC-3 (p < 0,05). Tuo tarpu mevastatinu
