Šaldytos mėsinių bulių spermos gyvybingumo analizė po atšildymo Assessment of post-thaw beef bull semen viability

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Paulius Zenavičius

Šaldytos mėsinių bulių spermos gyvybingumo analizė po

atšildymo

Assessment of post-thaw beef bull semen viability

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovė: prof. dr. Vita Riškevičienė

DARBAS ATLIKTAS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Šaldytos mėsinių bulių spermos gyvybingumo analizė po atšildymo“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Paulius Zenavičius

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Paulius Zenavičius

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)

2)

(vardas, pavardė) (parašai)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

TURINYS

1.1.1. Belgijos mėlynųjų veislės buliai ... 10

1.1.2. Limuzinų veislės buliai ... 10

1.1.3. Simentalų veislės buliai ... 11

1.2. Mėsinių bulių reprodukcija ... 11

1.3. Mėsinių bulių sperma ir jos kokybė ... 12

1.3.1. Bulių spermatozoidų sandara ir savybės ... 12

1.3.2. Mėsinių bulių spermos kokybė ... 13

1.3.3. Spermatozoidų koncentracija ... 14

1.3.4. Spermatozoidų judrumas ... 14

1.3.5. Veiksniai sukeliantys spermatozoidų plazminės membranos pažeidimus ... 15

1.3.6. Spermatozoidų plazminės membranos vientisumas ir gyvybingumas ... 17

2. MEDŽIAGOS IR METODAI ... 18

2.1. Bandymo schema ... 19

2.2. Spermos atšildymas ... 20

2.3. Spermatozoidų koncentracijos nustatymas ... 20

2.4. Subjektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas ... 20

2.5. Objektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas ant objektinio stiklelio kompiuterinės spermatozoidų analizės CASA metodu ... 21

2.6. Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas fluorescenciniu būdu ... 21

2.7. Statistiniai skaičiavimai ... 22

3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 23

3.1. Atšildytos mėsinių bulių spermos spermatozoidų koncentracijos vertinimas ... 23

3.2. Mėsinių bulių spermatozoidų judrumo ir judrumo parametrai juos vertinant objektyviu (CASA) ir subjektyviu (mikroskopu) metodais ... 24

3.4. Mėsinių bulių spermos spermatozoidų gyvybingumas (SYBR-14/PI) po atšildymo ir po 5 val. inkubacijos 37oC T vandens vonioje bei jo koreliaciniai ryšiai su spermatozoidų

koncentracija dozėje ... 28

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32

IŠVADOS ... 35

SANTRUMPOS

ROS – reaktyvūs deguonies junginiai PI – propidžio jodidas

DNR – deoksiribonukleorūgštis

SANTRAUKA

Šio darbo tikslas buvo nustatyti ir palyginti Belgijos mėlynųjų, limuzinų ir simentalų veislių mėsinių bulių šaldytos spermos judrumo ir gyvybingumo rodiklius po atšildymo ir 5 val. inkubacijos vandens vonioje bei įvertinti jų priklausomybę nuo spermatozoidų koncentracijos dozės mililitre.

Tyrimas atliktas 2015-2016 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Tyrimui pasirinkta Lietuvoje vienų paklausiausių mėsinių bulių veislių sperma. Šaldyta bulių sperma buvo gauta iš Lietuvos veislininkystės įmonių.

Visų mėsinių bulių sperma buvo tirta dviem etapais: po atšildymo ir po 5 val. inkubacijos 37°C vandens vonioje. Abiejų etapų metu buvo vertinamas spermatozoidų judrumas subjektyviu ir objektyviu (CASA) metodais, spermatozoidų gyvybingumas dažant SYBR-14/PI fluorescenciniais dažais. Spermatozoidų koncentracija nustatyta tik pirmojo etapo metu, po atšildymo, nes tyrimams naudota tos pačios serijos sperma. Vėliau buvo įvertinta spermatozoidų judrumo ir gyvybingumo tarpusavio koreliacija bei spermatozoidų judrumo ir gyvybingumo priklausomybė nuo spermatozoidų koncentracijos dozės mililitre. Nustatyta, kad didžiausia (100,67 x 106 doz/ml) spermatozoidų koncentracija buvo limuzinų, o mažiausia (88,33 x 106 doz/ml) simentalų veislės bulių spermos dozės ml, bet statistiškai patikimų spermatozoidų kiekio dozės mililitre skirtumų tarp atskirų bulių veislių nenustatyta. Po atšildymo didžiausias progresyviai judrių spermatozoidų procentas nustatytas simentalų veislės bulių spermoje, o po 5 val. inkubacijos - limuzinų veislės bulių spermoje, nors spermatozoidų judrumo rodikliai tarp atskirų mėsinių bulių veislių statistiškai patikimai nesiskyrė.

Nustatyta, kad kuo buvo didesnė spermatozoidų koncentracija dozės ml tuo spermatozoidų judrumas ir išgyvenimas buvo mažesni. Limuzinų veislės bulių spermos koncentracija doz/ml su judrumu ir išgyvenimu koreliavo neigiamai patikimai (r = - 0,11, p ≤ 0,025), o simentalų teigiamai patikimai (r = 0,42; p ≤ 0,001).

Po atšildymo gyvybingų spermatozoidų, turinčių sveikas ir nepažeistas plazmos membranas procentas visoms bulių veislėms vidutiniškai buvo 39,23 ± 3,35 proc., kuris per 5 inkubacijos val. sumažėjo 17,77 proc. (p < 0,005).

SUMMARY

The aim of this paper was to identify and compare the Belgian Blue, Limousine and Simmental beef cattle breeds frozen semen motility and viability rates after the thawing and after the 5 hours of incubation in a water bath, and assessing the dependency on the concentration of semen per milliliter dose.

The study was conducted in 2015-2016, at Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy’s Animal Reproduction Laboratory. The variety of most marketable Lithuania’s beef cattle breeds semen were selected for the study. Frozen bull semen samples were obtained from Lithuanian cattle breeding companies.

All of the selected beef cattle bull semen samples were evaluated in two stages: after the thawing and after the 5 hours of incubation at 37°C water bath. During both stages the sperm motility was evaluated by subjective and objective (CASA) methods, and the sperm viability was evaluated by sample staining with SYBR-14/PI fluorescent dyes. Spermatozoid concentration was estimated only during the first phase – after the thawing, because the same sperm series were used in the study. Subsequently sperm motility and vitality correlation, and sperm motility and viability of sperm concentration dependence of doses per milliliter were estimated. It was determined that the largest sperm concentration (100.67 x 106 dose/ml) was found in Limousines breed’s bull semen sample, while the lowest sperm concentration (88.33 x 106 _{dose/ml) had Simmental breed’s bull semen}

sample dose/ml, but the statistically significant amount of sperm per milliliter dosage differences between breeds were not determined. After the thawing, the highest percentage of progressively motile sperm percent was discovered in Simmental breed’s bull semen sample, and after 5 hour incubation period – Limousine breed’s bull semen sample, although the sperm mobility rates between different breeds of beef cattle showed no statistically significant difference.

It was discovered, the higher dose/ml sperm concentration, the lower was sperm motility and survival. Limousine breed’s bull semen concentration dose/ml correlation was negatively reliable with the motility and survival (r = - 0,11, p ≤ 0,025), and Simmental breed’s was positively reliable (r = 0,42; p ≤ 0,001).

After the thawing, the percentage of viable sperm with healthy and intact plasma membranes of all breeds on the average were 39,23 ± 3,35 percent, declining to 17,77 percent (p<0,005) after the 5 hours incubation period.

Limousin breed’s sperm concentration per dose correlated positively significantly with the viable, intact plasma membranes of sperm percent per dose – the bigger concentration, the bigger

amount of sperm with damaged membranes. Belgian Blue (r= - 0,68, p ≤ 0,005) and Simmental (r = - 0,96; p ≤ 0,01) breeds bull sperm concentration per dose, correlated negatively significantly

ĮVADAS

Galvijai yra vieni iš seniausių gyvūnų, kuriuos pavyko prisijaukinti žmogui. Archeologinė ir genetinė informacija leidžia teigti, kad pirmasis prisijaukintas galvijas buvo laukinis jautis (Bos

primigenius) prieš 10500 metų [1, 2]. Šie jaučiai davė pradžią atsirasti naujai veislei – Bos taurus,

kuri paplito po visą pasaulį ir jie vadinami moderniaisiais, šių laikų galvijais [2]. Šiuo metu visame pasaulyje priskaičiuojama daugiau nei 1000 galvijų veislių [3]. Veislinėms galvijų savybėms gerinti ir produktyvumui didinti greta selekcijos neatsiejama dalimi tapo sėklinimas šaldyta sperma.

Pirmieji karvių sėklinimai buvo atlikti 1930-aisiais metais viename iš Danijos kooperatyvų. Tuo metu buvo apsėklinta 1070 karvių, kurių rezultatai parodė, kad veršingumo procentas buvo šiek tiek didesnis, nei kergiant natūraliu būdu. Vėliau sėklinimo mastai didėjo ir šiai dienai sėklinimo būdu naudojant šaldytą spermą yra apvaisinama virš 90 proc. karvių [4, 5].

Vertinant apsivaisinimo rezultatus, sėklinimui naudojant kriokonservuotą bulių spermą, ir palyginus juos su natūraliai kergiant gautais apsivaisinimo rezultatais, paaiškėjo, kad sėklinant -apsivaisinimo rezultatai dažnai yra geresni, negu kergiant natūraliai. Dėl šių priežasčių kriokonservuota bulių sperma naudojama ne tik pieninių karvių, bet ir mėsinių karvių sėklinimui labai plačiu mastu [6].

Nepaisant to, kad bulių spermatozoidai yra labiau atsparūs kriokonservavimui, lyginant su kitomis gyvūnų rūšimis, kriokonservavimas turi neigiamos įtakos spermatozoidų kokybiniams rodikliams, nes netinkamai ruošiant spermą kriokonservavimui ar spermą šaldant bei atšildant, spermatozoidai gali būti pažeidžiami. Ypač užšaldymui ir atšildymui yra jautrios spermatozoidų membranos, kurios proceso metu gali būti pažeidžiamos tiek funkciškai, tiek struktūriškai. Dėl tos priežasties sumažėja spermatozoidų judrumas, mažėja spermatozoidų gyvybingumas. Todėl užšaldoma bulių sperma turi atitikti aukštus reikalavimus.

Kaip nurodoma Lietuvoje šiuo metu galiojančiuose šviežios ir kriokonservuotos bulių spermos kokybės reikalavimuose šviežia, šaldymui atrinkta sperma turi būti ne mažesnio nei 70 proc. judrumo ir 0,8 × 109 ml koncentracijos [7], nes, kaip yra žinoma, po atšildymo vidutiniškai 30 proc. ar daugiau spermatozoidų žūsta.

Atšildytos spermos spermatozoidų judrumas negali būti mažesnis nei 40 proc., o progresyviai judančių spermatozoidų koncentracija dozėje ne mažesnė nei 15,0 x 106 .

Todėl prieš užšaldymą tiriami tokie spermatozoidų kokybės rodikliai kaip spermatozoidų judrumas, gyvybingumas, spermatozoidų morfologija, taip pat nustatoma spermatozoidų koncentracija, ejakuliato tūris. Kriokonservuoti leidžiama tik labai geros kokybės spermą.

Vienas iš populiariausių spermos kokybės parametrų, kuris naudojamas norint įvertinti spermos gyvybingumą ir tinkamumą sėklinimui po atšildymo yra spermatozoidų judrumo nustatymas.

Spermatozoidų gyvybingumas taip pat yra labai svarbus spermos kokybės rodiklis. Spermatozoidas laikomas gyvybingu jei jo plazminės membranos yra sveikos, neturinčios struktūrinių ar funkcinių pažeidimų, nes tik gyvybingi spermatozoidai su nepažeistomis plazminėmis membranomis gali pasiekti kiaušides ir prasiskverbti į kiaušialąstę [9].

Yra nustatyta, kad buliaus veislė taip pat gali turėti įtakos spermos kokybei ir tiesiogiai daryti įtaką bulių spermatozoidų judrumui [10, 11]. Shanani et al. [12] pastebėjo, kad buliaus veislė turi įtakos morfologinei spermos kokybei, tokiai kaip spermatozoidų galvutės forma ir spermatozoido viduriniosios dalies ilgis.

LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijos duomenimis, tiriant įvairiose šalyse pagamintą pieninių bulių spermos kokybę buvo nustatyta, kad dozėje esanti spermatozoidų koncentracija patikimai teigiamai koreliavo su spermos kokybe, tai yra kuo užšaldytoje spermoje buvo didesnis morfologiškai nenormalių spermatozoidų kiekis tuo spermatozoidų koncentracija tokioje dozėje buvo didesnė.

Tokių tyrimų, atliktų tiriant mėsinių bulių spermą, atlikta nebuvo. Nedaug rasta informacijos ir mokslinėje literatūroje, todėl tuo vadovaujantis buvo suformuotas šio darbo tikslas:

Nustatyti ir tarpusavyje palyginti mėsinių bulių (Belgijos mėlynųjų, limuzinų ir simentalų veislių) šaldytos spermos gyvybingumo rodiklius po atšildymo ir 5 val. inkubacijos vandens vonioje bei įvertinti jų priklausomybę nuo spermatozoidų koncentracijos dozės mililitre.

Šiam tikslui pasiekti buvo sprendžiami tokie darbo uždaviniai:

1. Nustatyti mėsinių bulių spermatozoidų koncentraciją x106 spermos dozės mililitre po atšildymo.

2. Įvertinti mėsinių bulių spermatozoidų judrumo parametrus po atšildymo ir po 5 val. inkubacijos 37°C T vandens vonioje.

3. Nustatyti koreliacinius ryšius tarp spermatozoidų koncentracijos x 106 _{dozės mililitre ir}

spermatozoidų judrumo.

4. Nustatyti mėsinių bulių spermatozoidų membranų vientisumo (gyvybingumo) (SYBR-14/PI) pokyčius po atšildymo ir 5 val. inkubacijos 37°C T vandens vonioje.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Mėsiniai buliai

Galvijų skiriamos trys pagrindinės rūšys: Bos taurus, Bos indicus, Bos primigenius. Pastaroji rūšis yra išnykusi.

Bos taurus yra pagrindinė šiuo metu auginama rūšis. Mėsiniai buliai daugiausiai yra

auginami norint gauti aukštos kokybės mėsą ir norimą jos kiekį. Nors mėsinių bulių veislių gyvūnai yra laukinės prigimties tačiau norint gauti kuo didesnį produkcijos kiekį neišvengiamai gyvūnai yra selekcionuojami ir veislei atrenkami tik turintys pačias geriausias mėsines savybes

Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro duomenimis, paskelbtais 2016 m. sausio 1 d., Lietuvoje daugiausiai auginama Limuzinų veislės (1886 buliai) ir Aubrakų veislės (1136 buliai) mėsinių bulių.

Belgijos mėlynųjų veislės mėsinių bulių Lietuvoje yra nedaug, tik 23 buliai, tačiau gautais neoficialiais vienos Lietuvos veislininkystės įmonės statistiniais duomenimis, per 2015 metus būtent Belgijos mėlynųjų veislės bulių šaldyos spermos yra parduodama daugiausiai, lyginant su kitomis mėsinių bulių veislėmis.

Simentalų veislės mėsinių bulių Lietuvoje yra 611 bulių. Remiantis šiais duomenimis tyrimui buvo pasirinktos Belgijos mėlynųjų, Limuzinų, Simentalų mėsinių bulių veislės.

1.1.1. Belgijos mėlynųjų veislės buliai

Ši veislė išvesta Belgijoje 19 amžiuje. Šios veislės bulių populiarumas išaugo 1960-siais metais, kai selekcijos dėka šiems buliams išsivystė dvigubo raumeningumo charakteristika. Išvedant šią veislę daug turėjo įtakos Šarolė mėsinių galvijų veislė.

Belgijos mėlynieji buliai yra vidutinio dydžio, sunkieji mėsiniai galvijai. Jie priskiriami prie turinčių dvigubą raumenų struktūrą bulių, kurie pasižymi masyviais raumenimis. Mentės, nugara, užpakalinė dalis yra labai raumeningos. Šie buliai yra palyginti smulkių kaulų su paslėptais klubais, stipriomis kojomis ir palyginti maža galva. Viena iš opiausių šios veislės galvijų veislininkystės problemų yra sunkus veršelių atsivedimas, kadangi jie atvedami didelio svorio, todėl atvedimas būna sunkus, dažnai reikia ir chirurginės intervencijos. Suaugusių Belgijos mėlynieji buliai sveria apie 1100-1300 kg. Jų aukštis ties ketera siekia apie 145-150cm [13].

1.1.2. Limuzinų veislės buliai

į kitas šalis Limuzinų veislės buliai pradėti eksportuoti 1960-aisiais. Ši veislė taip pat pasižymi dvigubu raumeningumu, kaip ir Belgijos Mėlynųjų veislės buliai. Šios veislės buliai sveria apie 1000-1100 kg, jie turi plačią kaktą, jų kaklas yra trumpas su plačiu snukiu. Bulių aukštis ties ketera apie 145 cm. Šie buliai pasižymi geru produktyvumo ir ekonominiu santykiu, taip pat jie pasižymi geru vaisingumu [13, 14].

1.1.3. Simentalų veislės buliai

Rašytinė informacija apie Simentalų veislės galvijus randami dar viduramžiais. Kilmės knygoje, leidžiamoje Berne Vakarų Šveicarijoje, jie buvo įrašyti nuo 1806 m. Yra minima, kad šių bulių veislei atsirasti įtakos turėjo Vokietijos ir Šveicarijos galvijų veislės. Veislės pavadinimas kilo iš pavadinimo Simme slėnio miesto, Šveicarijoje, kur ši veislė ir buvo išvesta. Ši veislė pasižymi geru raumeningumu, bulių aukštis ties ketera siekia apie 150-160 cm, suaugusieji buliai sveria apie 1100-1300 kg. Simentalai pasižymi ilgaamžiškumu, geru vaisingumu, trumpais intervalais tarp veršiavimųsi, greitu subrendimu ir yra mažai reiklūs laikymo sąlygoms [13, 14].

1.2. Mėsinių bulių reprodukcija

Mėsinių bulių reprodukcija ir lytinė branda yra susijusi su gonadotropinio hormono LH ir testosterono sekrecija bei sparčiu sėklidžių augimu ir spermatogeneze.

Mėsiniai buliai laikomi lytiškai subrendusiais, kai jų ejakuliate yra ne mažesnis nei 50 x 106 spermatozoidų kiekis, o jų judrumas yra didesnis nei 10 procentų [15, 16]. Bulių reprodukcijos raida skirstoma į tris periodus: pradinį, lytiškai nesubrendusį ir subrendusį. Pirmasis periodas, kuris įvardijamas, kaip pradinis tęsiasi iki 8-os amžiaus savaitės. Šiame periode mažai išskiriama gonadotropinių hormonų ir testosterono. Tačiau protarpiais pasitaiko išryškėjanti trumpalaikė suaktyvėjusi gonadotropinų sekrecija, kartu taip pat sustiprėja ir išskiriamo testosterono kiekis.

Sėklidės, augant buliui, iki 25 savaitės vystosi ir didėja palyginus lėtai, vėliau, lytiškai bręstant ir stiprėjant hormoninei reguliacijai sėklidžių vystymasis greitėja iki pat tol kol lytiškai subręsta, tai yra visą laikotarpį nuo 37 iki 50 amžiaus savaitės. Spermatogeninio epitelio ląstelių proliferacija ir diferencijacija intensyviausiai vyksta nuo 32 iki 40 amžiaus savaitės [17].

nuo veislės, nepaisant to, kad vis dėlto veislė yra svarbus aspektas sėklidžių vystymuisi [18]. Buliai pradeda produkuoti sėklinimui tinkamos kokybės spermą apie 12-tą amžiaus mėnesį, o sulaukę 16 mėnesių jau beveik visų veislių buliai išskiria tinkamos kokybės spermą [20].

Belgijos mėlynųjų mėsiniais buliais kergiamos karvės pasižymi prastesniu apsivaisinimu lyginant su apvaisinimu, kai karvės sėklinamos užšaldyta Belgijos mėlynųjų mėsinių bulių sperma. To priežastimi gali būti dažnai nustatomas didelis patologinių spermatozoidų kiekis šios veislės bulių spermoje, o sperma, prieš ją užšaldant, yra tiriama, atrenkama ir užšaldoma tik reikalavimus atitinkanti sperma [11].

Kraujomaiša gali neigiamai paveikti spermos kokybinius rodiklius. Tam išsiaiškinti buvo tirti Simentalų veislės buliai. Maximini et al. [21] aprašė, jog visi tirti šios veislės buliai buvo paveikti kraujomaišos, tačiau pagrindinis kraujomaišos koeficientas buvo labai mažas (1,2 ir 1,5 proc.) ir tik 1-2 proc. iš tirtų bulių turėjo didesnį nei 5 proc. kraujomaišos koeficientą. Dėl kraujomaišos buvo paveikti visi tirti spermos kokybės rodikliai (ejakuliato tūris, spermatozoidų koncentracija, judrumas, gyvybingumas)

1.3. Mėsinių bulių sperma ir jos kokybė

Spermatozoidas sudarytas iš galvutės, kaklelio ir uodegėlės. Bulių spermatozoidų galvutės sudarytos iš akrosomos ir branduolio, jų forma yra ovali ir plokščia. Akrosoma randama priekinėje spermatozoido galvutės dalyje, ji yra kepurėlės tipo vezikulė, gulinti tarp plazminės membranos ir perinuklearinio apvalkalo. Ji taip pat yra padengta dvigubo sluoksnio membrana. Akrosoma yra svarbi spermatozoido dalis, nes vykstant apvaisinimui jos fermentai tirpdo oocito membraną. Branduolyje randamas chromatinas, kurio sudedamoji dalis yra DNR. Taip pat branduolyje yra haploidinis chromosomų rinkinys.

1.3.2. Mėsinių bulių spermos kokybė

Svarbiausi bulių reprodukcijos aspektai yra galėjimas išskirti tinkamos kokybės ir pakankamą kiekį spermos, kurie leidžia užtikrinti gerą patelės apsivaisinimą ir palikuonių gavimą. Gavus labai geros kokybės spermą reiškia, kad bus galima pagaminti daugiau dozių iš vieno ejakuliato, sumažinti neapsivaisinusių karvių skaičių [24].

Morfometriniai normalaus buliaus spermatozoido matavimai yra tokie: galvutė turi būti 8-10 µm ilgio, 4-4,5 µm pločio, 1-1,5 µm storumo, uodegėlė 40-45 µm ilgio arba ji gali būti ir ilgesnė [18].

Bulių spermatozoidų kokybę taip pat apibūdina spermatozoidų judrumas, morfologinė kokybė ir gyvybingumas. Jei spermatozoidų judrumas yra didesnis nei 70 proc. ji vertinama, kaip labai gera, jeigu judrumas yra nuo 50 iki 69 proc. - gera, jei nuo 30 iki 49 proc. - patenkinama, o jei judrumas yra mažesnis nei 30 proc. – bloga [25, 26].

Kokybiškoje mėsinių bulių spermoje turi būti bent 70 proc. spermatozoidų be morfologinių pakitimų [27].

Tiriant Belgijos mėlynuosius ir Holšteinų veislės bulius nustatyta, kad Belgijos mėlynųjų veislės buliai gali turėti mažesnes sėklides, dėl hipoplazijos. Reliatyvus skaičius buvo pasirinktas kolageninių skaidulų, kurios randamos sėklidžių intersticiniame audinyje, jos su spermatozoidų judrumu sudarė vidutinio ryšio koreliaciją (r = - 0,47; p = 0,017). Tai parodo, kad kuo daugiau kolageninių skaidulų aptinkama sėklidėse, tuo mažesnis bus nustatomas spermatozoidų judrumas [11].

Belgijos mėlynieji buliai buvo suskirstyti į grupes pagal amžių. Tiriant spermatozoidų judrumą pastebėta, kad bulių amžius nedaro įtakos spermatozoidų gyvybingumui [10].

Nustatyta, kad Limuzinų ir Belgijos mėlynųjų veislės bulių spermatozoidų vidurinioji dalis yra ilgesnė, lyginant su kitomis veislėmis - Angusais, Šarole, Holšteinais. Nustatyta, kad Belgijos mėlynųjų ir Simentalų bulių spermatozoidų viduriniosios dalies ilgis yra apie 13,8 mikronų., tuo tarpu Angusų veislės bulių spermatozoidų viduriniosios dalies ilgis buvo mažiausias – 13,35. Yra teigiama, kad spermatozoido vidurinioji dalis gali koreliuoti su spermatozoido gyvybingumu, judrumu, tačiau tokių duomenų rasti nepavyko [12].

1.3.3. Spermatozoidų koncentracija

Spermatozoidų koncentacija spermoje yra svarbus rodiklis norint efektyviai sėklinti. Bulių vidutinis ejakuliato tūris siekia 5 – 8 ml, taip pat sveikų bulių ejakuliate aptinkama 5 – 15 milijardų spermatozoidų [22].

Kriokonservuojant spermą nurodoma, kad minimali koncentracija turi būti bent 10 - 15 x 106 spermatozoidų šiaudelyje ( 0,25 ml), norint apsėklinti pateles [30]. Literatūroje minima, kad 0,5 ml šiaudeliuose koncentracijos tendencijos šaldymui išlieka tos pačios, nurodoma spermatozoidų minimali koncentracija yra nuo 10 x 106 dozėje [31].

Spermatozoidų kiekis dozėje taip pat daro įtaką spermatozoidų gyvybingumui. Garner et al. [32] su kitais mokslininkais, kriokonservuojant spermą įvairiomis koncentracijomis, nustatė, kad kuo daugiau yra skiedžiama sperma, tuo spermatozoidų gyvybingumas nustatomas mažesnis.

Norint gauti pasirinktą koncenraciją dažnai pasirenkami komerciniai skiedikliai. Juose yra įvairių medžiagų, kurios gerina spermatozoidų kokybinius rodiklius, tačiau esant įvairių gamintojų skiedikliams, jų efektyvumas skiriasi [33, 34].

1.3.4. Spermatozoidų judrumas

Tai viena svarbiausių spermatozoido gyvybingumą ir vaisingumą parodančių savybių. Ši savybė padeda spermatozoidams pasiekti patelės kiaušinėlį ir apvaisinti jį. Patelės lytiniuose takuose spermatozoidai juda reotaksio būdu – spermatozoidų slinkimu prieš srovę [35].

Gyvi ir normalūs bulių spermatozoidai juda progresyviai. Dalis spermatozoidų juda, yra gyvi, bet jų judėjimas yra neprogresyvus arba gali iš viso nejudėti.

Progresyviai judantys spermatozoidai juda tiesia linija, neprogresyviai judrūs spermatozoidai juda trajektorija, kuri nėra tiesi, ji labiau primena spermatozoido judėjimą ratu dar vadinamą maniežiniu arba svyruojančiu judėjimu.

Nejudrūs spermatozoidai dažniausiai būna mažai gyvybingi, o dažniausiai iš viso negyvi ir pasiekti kiaušialąstės negali. Spermatozoido judrumą užtikrina uodegėlių mitochondrijose sukaupta energija adenozino trifosfatas (ATP) [22].

Nors šaldyta bulių sperma naudojama karvių sėklinimui labai plačiu mastu, tačiau sėklinimo rezultatai šaldytos spermos yra prastesni lyginant su sėklinimu šviežia sperma. Kriokonservuojant spermatozoidus viena iš opiausių problemų yra šalčio ir atšildymo metu padaroma žala spermatozoidams. Tai neigiamai veikia spermatozoidų funkcijas ir judrumą [36].

eiga, prieš užšaldant spermą, turi būti didesnis nei 70 proc., o po atšildymo judrių spermatozoidų, kurie juda tiesia eiga, turi likti ne mažiau nei 50 proc. [38].

Tiriant spermatozoidų judrumo įtaką apvaisinimui buvo pastebėta reikšminga įtaka, kuo didesnis judrių spermatozoidų kiekis, tuo didesni šansai apvaisinti kiaušialąstę [39]. Kiti tyrimai atlikti Jungtinėje Karalystėje su Herefordų veislės buliais, taip pat parodė stipriai reikšmingą koreliaciją tarp judrumo ir apvaisinimo [40].

Nustatyta, kad spermatozoidų judrumui įtakos turi atšildymo laikas. Kanadoje tirta bulių sperma buvo ištirta atšildžius ir po 2 valandų inkubacijos. Po inkubacijos tiriant spermatozoidų judrumą paaiškėjo, kad judrių spermatoizoidų procentas spermoje sumažėjo, taip pat sumažėjo ir jų judėjimo greitis (p < 0,01) lyginant su judrumu po atšildymo. Anzar et al. [41] atlikę tyrimus išsiaiškino, kad spermos kokybei įtakos turi ir šiaudelių tūris.

Užšaldyta sperma buvo užšaldyta dviejų tipų šiaudeliuose - 0,25 ml ir 0,5 ml tūrio. Atšildžius šiaudelius paaiškėjo, kad judrių spermatozoidų buvo daugiau 0,25 ml tūrio šiaudeliuose, nei 0,5 ml šiaudeliuose.

Atlikti tyrimai parodė, kad ejakuliatai, kurie turėjo didžiausią progresyviai judančių spermatozoidų kiekį buvo atsparesni kriokonservavimui ir parodė geriausią atšildytų spermatozoidų išgyvenimą [42].

Užšaldyta bulių spermą buvo naudojama išgyvenamumui patelės reprodukcinėje sistemoje ištirti, bei tiriama jos galimybė apvaisinti patelę. Nustatyta, kad spermatozoidų užšaldymas neturėjo poveikio spermatozoidų išgyvenamumo laikui patelės reprodukcinėje sistemoje [43].

1.3.5. Veiksniai sukeliantys spermatozoidų plazminės membranos pažeidimus

Spermatozoido plazminė membrana yra svarbi, išorinė spermatozoido sandaros dalis, kuri atlieka svarbų vaidmenį patelės apvaisinime, taip pat padeda spermatozoidui išgyventi patelės lytiniuose takuose, bei pasirengti spermatozoidui apvaisinimui [44, 45]. Plazminė membrana dengia visą spermatozoidą ir jos vientisumas apsaugo spermatozoidą nuo išorinių veiksnių [46].

Plazminės membranos pažeidimas yra viena iš pagrindinių priežasčių lemiančių spermatozoido gyvybingumą ir buliaus vaisingumo [47].

spermatozoido ląstelėse esančias mitochondrijų membranas, spermatozoido uodegėlės funkcijas. [49]. Temperatūrinis šokas, patiriamas ne tik spermatozoidus užšaldant, bet ir juos atšildant [50]. Sumažinti kriokonservavimo metu daromus pažeidimus spermatozoidams naudojami krioprotektoriai, kaip pavyzdžiui glicerolis [51].

Spermatozoido plazminėje membranoje aptinkami lipidai (apie 70 proc. fosfolipidų, 25 proc. neutralių lipidų ir apie 5 proc. glikolipidų) ir angliavandeniiai. Jų kiekis kriokonservavimo metu didėja, dėl šios priežasties plazminė membrana gali tapti hidrofobiška užšaldymo metu ir padėti spermatozoidams išgyventi dėl šalčio daromos neigiamos įtakos [47].

Lipidų, esančių spermatozoido membranose, reagavimas su deguonimi ar vandenilio peroksidu iššaukia neigiamas pasekmes spermatozoidų gyvybingume. Šis procesas kitaip vadinamas oksidaciniu stresu. Spermatozoidai yra jautrūs oksidaciniam stresui, dėl didelio kiekio spermatozoidų plazminėse membranose esančių polinesočių riebalų rūgščių ir reliatyviai prastų antioksidacinių apsaugos priemonių. Spermatozoidų ląstelės keliaudamos į oocitą neišvengiamai kontaktuoja su radikalais, kurie gali paveikti lipidus. Patelės lytiniuose takuose sutinkami leukocitai sintetina reaktyvius deguonies junginius (ROS), kurie gali pažeisti spermatozoidų ląstelių plazmines membranas. Yra žinoma, kad patys spermatozoidai gamina ROS, siekiant padidinti spermatozoidų uodegėlių aktyvumą [45, 52].

Spermatozoidų kapacitacijai skatinti vyksta peroksidazės reakcijos. Jos metu išskiriami nedideli kiekiai vandenilio peroksido. Stiprėjant peroksidacijos procesams išsiskiria daugiau vandenilio peroksido ir tai sukelia plazminės membranos pažeidimus, dėl kurių sumažėja spermatozoidų judrumas, o tuo pačiu - buliaus vaisingumas. Judrumo sumažėjimas šiuo atveju priklauso ne tik nuo lipidų peroksidazės reakcijos plazminėje membranoje, tačiau prie to prisideda ir ATP energijos rezervo išeikvojimas mitochondrijose [52].

Sumažinus oksidacinį stresą spermatozoiduose – spermatozoidų plazminės membranos būtų mažiau pažeidžiamos ir spermatozoidų kokybiniai rodikliai pagėrėtų. Mokslininkas Sapanidou et al. [53], norėdamas sumažinti oksidacinį stresą, kaip antioksidantą naudojo krocetiną (crocetin), kuris yra pagrindinė sudedamoji dalis šafrano (Crocus sativus L.). Ši medžiaga pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu, kuri surenka reaktyvius deguonies junginius (ROS), taip pat sustiprina antioksidacinių fermentų, esančių spermatozoido ląstelėje, aktyvumą.

kartu su krocetinu teigiamai veikia bulių spermos kokybinius rodiklius, taip pat pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, kurių dėka plazminės membranos tampa atsparesnės.

1.3.6. Spermatozoidų plazminės membranos vientisumas ir gyvybingumas

Spermatozoidų plazminės membranos vientisumas, siejamas su spermatozoidų gyvybingumu, norint jį nustatyti, gali būti nustatomas spermatozoidus dažant dviejų vitalinių dažų kombinacija. Plazminės membranos vientisumo nustatymui yra naudojami fluorescenciniai dažai SYBR – 14 komplekse kartu su propidžio jodidu (PI) [54]. Tiriant spermatozoidų gyvybingumą šiuo metodu, spermatozoidai, su nepažeistomis membranomis nusidažo žaliai, gyvybingų spermatozoidų ląsteles paveikia SYBR – 14 dažai, kurie prisijungia prie spermatozoidų branduolio DNR. Tuo tarpu PI nudažo negyvybingus spermatozoidus raudona spalva, šios spermatozoidų ląstelės yra praradusios membranų vientisumą ir dažai prasiskverbia per spermatozoido ląstelę. Pamatyti spermatozoidų gyvybingumą nusidažiusiais dažais naudojamas mikroskopas su fluorescencine šviesa [55, 56].

Vertinant kriokonservavimo įtaką spermatozoidų membranos vientisumui ir judrumui nustatyta, kad atšildžius spermatozoidus, jų judrumas gali sumažėti didesniu procentu, nei gyvybingumas. Taip gali atsitikti todėl, kad spermatozoidai, kurių membranos yra pažeistos vis dar gali judėti, tačiau prasiskverbti per kiaušialąstės skaidrųjį dangalą ir apvaisinti kiaušialąstę tokiems spermatozoidams neįmanoma [57].

Atlikti tyrimai su Simentalų veislės buliais patvirtino, kad kriokonservavimas sumažina spermatozoidų judrumą pažeisdamas spermatozoidų plazmines membranas [58].

2. MEDŽIAGOS IR METODAI

Tyrimas atliktas 2015-2016 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje.

Buvo ištirta 3 mėsinių veislių (Belgijos mėlynųjų, Limuzinų, Simentalų) bulių 51permos mėginys.

Šaldytos bulių spermos šiaudeliai buvo įsigyjami iš Lietuvos veislininkystės įmonių. Sperma užšaldyta kriokonservuojant. Spermos mėginiai buvo transportuojami ir laikomi iki tyrimo Diuaro inde.

2.1. Bandymo schema

Simentalai Belgijos mėlynieji Limuzinai

Mėsinių veislių bulių šaldytos spermos mėginiai (n = 51) Tyrimai Po 5 val. inkubavimo 37°C T vandens vonioje Spermatozoidų koncentracija x 106 dozės mililitre

1. Subjektyvus spermatozoidų judrumo įvertinimas

2. Objektyvus spermatozoidų judrumo įvertinimas

3. Spermatozoidų gyvybingumas (PI/SYBR14)

2.2. Spermos atšildymas

Spermos mėginiai buvo atšildomi 37°C vandens vonioje, kurioje visada yra palaikoma pastovi temperatūra. Mėginiai buvo laikomi 15 sek. šiltame vandenyje, tada nusausinama popieriniu rankšluosčiu ir nukirpus šiaudelio galą sperma išleidžiama į Eppendorf tipo mėgintuvėlį.

Atšildyti spermos mėginiai buvo tiriamai šias būdais: 1. Spermatozoidų koncentracijos nustatymas dozėje.

2. Subjektyvus ir objektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas. 3. Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas fluorescenciniu metodu. Spermos tyrimai po 5 val. inkubacijos 37°C vandens vonioje: 1. Subjektyvus ir objektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas. 2. Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas fluorescenciniu metodu.

2.3. Spermatozoidų koncentracijos nustatymas

Spermatozoidų koncentracijai nustatyti buvo naudojama hemocitometrinė Biurker‘o skaičiavimo kamera. Kamera paruošiama klasikiniu būdu: nuriebalinama, pirštais pritvirtinamas dengiamasis stiklelis, po kuriuo įlašinamas tikslus, distiliuotu vandeniu, praskiestos spermos kiekis. Mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu padidinus 200 kartų. Spermatozoidai skaičiuojami 5 dideliuose laukuose (80 mažų kvadratėlių) įstrižai. Iš viso spermatozoidai suskaičiuojami 15 didelių laukų, ir gautus duomenis sudėjus ir padalinus išvedamas vidurkis. Skaičiuojamos visos spermatozoidų galvutės esančios kvadrato viduje ir ant kairės bei viršutinės didelio kvadrato linijų. Uodegėlės be galvučių neskaičiuojamos. Koncentracija nustatoma pagal ŠIĄ formulę: K = S × P × 5 × 10, kur: K – koncentracija; S – spermatozoidų skaičius 80 mažų kvadratėlių; P – praskiedimo laipsnis; 5 – koeficientas, (spermatozoidai suskaičiuoti 0,2 mm2 kameros plote); 10 – daugiklis, (kameros gylis 0,1 mm). norint apskaičiuoti Spermatozoidų koncentraciją 1,0 ml tūrio yra naudojamas daugiklis 1000. Kiekvienas mėginys skaičiuojamas 2 kartus kiekvieną kartą užpildant po 2 tinklelius ir išvedamas skaičiavimų vidurkis [33].

2.4. Subjektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas

uždengiama šiltu dengiamuoju stikleliu. Analizuojami 3 matymo laukai fazių kontrastiniu mikroskopu (Olympus BH2, Olympus Optical Co., Ltd., Japonija) padidinus100 kartų. Kiekviename matymo lauke nustatomas judančių spermatozoidų procentas ir išvedamas vidurkis [33].

2.5. Objektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas ant objektinio

stiklelio kompiuterinės spermatozoidų analizės CASA metodu

Objektyvus spermatozoidų judrumo vertinimas atliekamas naudojant kompiuterinės spermatozoidų analizės metodus (CASA). CASA sistema yra standartizuota įranga, leidžianti ištirti spermos koncentraciją, judrumą, gyvybingumą ir morfologiją. Šią sistemą sudaro: optinis mikroskopas, vaizdo kamera ir kompiuteris su įrašyta SCA® programa. SCA® Motility and concentration programa yra kompiuterinė spermos analizės sistema, naudojama spermos koncentracijai ir judrumui analizuoti. Ši programa automatiškai identifikuoja ir pamatuoja spermatozoidų judėjimo parametrus mikroskopo regėjimo lauke naudojant 10x padidinimo objektyvą. Programa suskaičiuoja spermos koncentraciją ir ekrane parodo spermos judrumą procentais, ir sugrupuoja spermatozoidus į progresyviai judančius, neprogresyviai judančius ir nejudrius. Taip pat suskirsto spermatozoidus pagal judėjimo greitį į: greitai judančius, vidutiniškai judančius, lėtai judančius ir nejudančius.

Spermos mėginio paruošimas tyrimui atliekamas taip pat kaip ir subjektyvaus tyrimo metu. Mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu padidinus 100 kartų ir naudojant žalią filtrą. Analizuojama apie 500 spermatozoidų, tam turi būti peržiūrimi 2 – 3 regėjimo laukai. Sistema pateikia automatiškai išanalizuotus duomenis.

2.6. Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas fluorescenciniu būdu

Fluorescenciniu būdu, naudojant fluorescencinius dažus LIVE/DEAD® Sperm Viability Kit (Molecular Probes) yra nustatomas spermatozoido plazminės membranos vientisumas. Šio metodo esmė yra ta, kad fluorescenciniai dažai praeina per spermatozoido plazminę membraną ir nudažo spermatozoidą atitinkama spalva.

Tyrime naudojami 2 dažų rūšys:

1. SYBR® 14 dažai praeina pro nepažeistą spermatozoido plazminę membraną, susijungia su nukleininėmis rūgštimis ir nudažo spermatozoidą žalia spalva.

2. Propidžio jodidas (PI) praeina tik per pažeistą spermatozoido plazminę membraną ir nudažo spermatozoidą raudona spalva.

1. 25 µl spermos atskiedžiama 975 µl fosfatiniu buferiniu druskos tirpalu. 2. Paruošiamas 1:50 SYBR 14 dažų praskiedimas su dimetilsulfoksidu (DMSO). 3. 5 µl praskiestų SYBR 14 dažų įlašinama į 1 ml atskiestos spermos mėginį. 4. Inkubuojama 5 – 10 minučių 37°C temperatūroje.

5. Pridedama 5 µl PI į spermos ir SYBR 14 dažų mišinį. 6. Inkubuojama 37°C temperatūroje 5 - 10 minučių.

7. Mikroskopuojama fluorescenciniu mikroskopu padidinus 200 kartų. Suskaičiuojama 200 spermatozoidų, juos sugrupuojant į nusidažiusius žaliai - gyvi spermatozoidai, ir nusidažiusius raudonai - negyvi spermatozoidai. Apskaičiuojamas bendras gyvų spermatozoidų procentas.

2.7. Statistiniai skaičiavimai

3. TYRIMŲ REZULTATAI

3.1. Atšildytos mėsinių bulių spermos spermatozoidų koncentracijos

vertinimas

Įvertinus šaldytos mėsinių bulių spermatozoidų koncentraciją (x106) dozės mililitre po atšildymo nustatyta, kad spermatozoidų kiekis dozės mililitre visų tirtų bulių vidutiniškai buvo 96,49 ± 6,34 x 106 (24,12 ± 1,58 x 106 dozėje) (1 pav.).

Didžiausia spermatozoidų koncentracija buvo nustatyta limuzinų veislės bulių spermos šiaudeliuose ir sudarė 100,67 ± 15,52 x 106 spermatozoidų dozės mililitre (25,17 ± 3,88 x 106 dozėje), o mažiausia koncentracija - 88,33 ± 5,24 x 106 spermatozoidai dozės mililitre – nustatyta Simentalų veislės bulių spermos dozėse (22,1 ± 1,31 x 106 dozėje). Simentalų veislės bulių spermatozoidų koncentracija dozės mililitre buvo net 10,09 x 106 dozės mililitre mažesnė nei vidutinė visų tirtų bulių skaičiuojant kartu.

1 pav. Spermatozoidų koncentracijos x 106 dozės ml palyginimas tarp mėsinių bulių veislių.

Statistiškai patikimų spermatozoidų kiekio dozės mililitre ir atitinkamai dozėje skirtumų tarp atskirų bulių veislių nustatyta nebuvo.

2 pav. Spermatozoidų judrumo rodiklių po atšildymo palyginimas tarp bulių veislių, tyrimui

naudojant skirtingus metodus (objektyvų (CASA) ir subjektyvų (mikroskopu).

3.2. Mėsinių bulių spermatozoidų judrumo ir judrumo parametrai juos

vertinant objektyviu (CASA) ir subjektyviu (mikroskopu) metodais

Įvertinus spermatozoidų judrumo rodiklius po atšildymo objektyviu (CASA) ir subjektyviu (mikroskopu) metodais nustatyta, kad spermatozoidų judrumo rodikliai po atšildymo tarp atskirų bulių veislių statistiškai patikimai nesiskyrė. Tačiau Simentalų veislės bulių spermoje buvo nustatytas didžiausias (7,23 ± 4,69) procentas nejudrių spermatozoidų (2 pav.), tačiau šios bulių veislės spermoje taip pat buvo nustatytas ir didžiausias, vertinant tiek objektyviai (80,76 ± 0,97), tiek ir subjektyviai (77,77 ± 2,77), progresyviai judrių spermatozoidų procentas dozėje po atšildymo, lyginant su Belgijos mėlynųjų ir Limuzinų veislės buliais.

Mūsų ištirtų visų mėsinių bulių spermoje progresyviai judančių spermatozoidų procentas po atšildymo silpnai teigiamai patikimai koreliavo su spermatozoidų gyvybingumu (plazminių membranų vientisumas) (r = 0,1; p < 0,01).

Įvertinus mėsinių bulių spermatozoidų išgyvenimą (3 pav.) po 5 val. šiaudelio inkubacijos 37°C T vandens vonioje buvo nustatyta, kad Belgijos mėlynųjų veislės bulių spermatozoidų išgyvenimas buvo pats mažiausiais ir siekė tik 29,17 ± 10,48 proc., lyginant su Limuzinų ir Simentalų veislių bulių spermatozoidais (3 pav.). Spermatozoidų judrumas po 5 val. inkubacijos, lyginant jį su

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Belgų mėlynieji Limuzinai Simentalai

Judrumas, proc.

spermatozoidų judrumu spermą tik atšildžius Belgijos mėlynųjų bulių sumažėjo net 47,61 proc. (p < 0,025).

Po atšildymo buvęs geriausias (80,76 ± 0,97) Simentalų veislės bulių spermatozoidų judrumas per 5 inkubacijos valandas sumažėjo net 49,38 proc. (p < 0,005), bet, kadangi jis buvo pakankamai aukštas po atšildymo, judrių spermatozoidų kiekis jame nesumažėjo žemiau 30 procentų.

Pačiu geriausiu išgyvenamumu ir progresyviai judrių spermatozoidų kiekiu po 5 val. šiaudelio inkubacijos vandens vonioje, pasižymėjo limuzinų veislės bulių spermatozoidai (3 pav.). Judrių spermatozoidų procentas, lyginant su judrumu po atšildymo, limuzinų veislės bulių spermoje sumažėjo statistiškai nepatikimai tik 29,06 proc. (p > 0,05), nors jų judrumas po atšildymo buvo pats mažiausias lyginant su kitų veislių.

Nepaisant skirtingopradinio judrumo po atšildymo ir išgyvenimo inkubacijos metu, visų tirtų veislių bulių sperma, praėjus 5 val. inkubacijos laikui, atitiko rekomenduojamas bulių spermos kokybės normas.

Įvertinus spermatozoidų išgyvenimo koreliaciją su pradiniu spermatozoidų judrumu po atšildymo, koreliacijos rodikliai nei vienos veislės bulių nebuvo statistiškai patikimi.

3 pav. Spermatozoidų judrumo rodiklių po 5 val. inkubacijos 37°C T vandens vonioje palyginimas tarp bulių veislių, tyrimui naudojant skirtingus metodus (objektyvų (CASA) ir subjektyvų (mikroskopu).

Objektyviai vertinant spermatozoidų išgyvenimą po atšildymo bendrai visų tirtų mėsinių bulių veislių, inkubavus šiaudelį 5 val. 37°C T vandens vonioje, nustatyta, kad vidutiniškai judrių spermatozoidų procentas dozėje per 5 valandas inkubacijos sumažėjo net 41,35 proc. (p ≤ 0,001),

0 10 20 30 40 50 60

Judr. Subj Judr. Objekt. Neprogresyvūs (proc) Nejudrūs (proc) Judr um as , pr oc .

lyginant jį su bendru visų veislių judrumu, nustatytu po atšildymo (75,09 ± 3,17), bet išliko normos ribose.

Lyginant atšildytos mėsinių veislių bulių spermatozoidų judrumo parametrus juos tiriant skirtingais metodais (subjektyviu būdu ir objektyviai), buvo nustatyta, kad progresyviai judrių spermatozoidų procentas 3,31 proc. buvo didesnis tyrimą atlikus kompiuteriu (objektyviai), bet šis rezultatas nuo subjektyviu būdu nustatyto judrumo skyrėsi statistiškai nepatikimai (p > 0,05).

Tokia pati tendencija išliko ir vertinant spermatozoidų judrumą po 5 val. šiaudelio inkubavimo 37°C T vandens vonioje. Šiuo atveju judrių spermatozoidų procentas, matuojant kompiuteriu, buvo 2,15 proc. didesnis nei matuojant subjektyviai, šviesiniu mikroskopu (p > 0,05). Tuo remiantis toliau darbe bus analizuojamas ir lyginamas su kitais rodikliais tik CASA būdu nustatytas objektyvus spermatozoidų judrumas.

3.3. Spermatozoidų koncentracijos įtaka spermatozoidų judrumui ir

išgyvenimui

Įvertinus limuzinų ir Belgijos mėlynųjų mėsinių bulių spermatozoidų judrumo po atšildymo priklausomybę nuo spermatozoidų koncentracijos dozėje, tarp šių rodiklių buvo nustatytas neigiamas, statistiškai nepatikimas koreliacinis ryšys (Limuzinai r = - 0,23 ir Belgijos mėlynieji r = - 0,39, p > 0,05). Tačiau po 5 valandų inkubacijos Limuzinų bulių spermatozoidų judrumas tapo aukščiausias (5 pav.), lyginant su kitomis veislėmis, nepaisant to, kad po atšildymo Limuzinų veislės bulių spermatozoidų judrumas buvo pats mažiausias iš visų tirtų veislių.

Vertinant Limuzinų spermatozoidų judrumo po 5 valandų inkubacijos priklausomybę nuo koncentracijos dozėje buvo nustatytas labai silpnas ir vėl neigiamas, tačiau patikimas koreliacinis ryšys (r = - 0,11, p ≤ 0,025) (5 pav.).

4 pav. Mėsinių bulių spermatozoidų judrumo po atšildymo priklausomybė nuo

spermatozoidų koncentracijos x 106 _doz./ml

5 pav. Mėsinių bulių spermatozoidų judrumo po 5 val. šiaudelio inkubacijos 37°C vandens vonioje priklausomybė nuo spermatozoidų koncentracijos x 106 _doz./ml.(b_{p ≤ 0,025;} d_{p ≤ 0,005)}

Įvertinus simentalų veislės bulių spermatozoidų koncentracijos dozėje įtaką (ji buvo mažiausia, lyginant su kitomis tirtomis bulių veislėmis) spermatozoidų judrumui po atšildymo buvo nustatytas teigiamas koreliacinis ryšys tarp spermatozoidų kiekio dozėje ir judrumo po atšildymo (r = 0,59; p > 0,05), kuris, vertinant tų pačių rodiklių tarpusavio priklausomybę po 5 val. šiaudelio inkubacijos 37°C vandens vonioje, nors ir susilpnėjo, bet išliko teigiamas, ir tapo statistiškai patikimas (r = 0,42; p ≤ 0,001). Šis tyrimas parodė, kad spermos šiaudeliuose, kuriuose yra didelė

0 20 40 60 80 100 120 140 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Belgų mėlynieji Limuzinai Simentalai

K onc ent ra ci ja , doz /m l Judr um as obj ekt ., pr oc .

Judrumas objektyvus Koncentracija

d b 0 20 40 60 80 100 120 140 0 10 20 30 40 50 60

Belgų mėlynieji Limuzinai Simentalai

K onc ent ra ci ja , doz /m l Judr um as obj ekt ., pr oc .

spermatozoidų koncentracija spermatozoidų judrumas yra mažesnis už tų spermatozoidų, kurie yra šiaudeliuose turinčiose mažesnę spermatozoidų koncentraciją dozėje.

3.4. Mėsinių bulių spermos spermatozoidų gyvybingumas (SYBR-14/PI)

po atšildymo ir po 5 val. inkubacijos 37

°

C T vandens vonioje bei jo

koreliaciniai ryšiai su spermatozoidų koncentracija dozėje

Vertinant mėsinių bulių spermos kokybinius rodiklius po atšildymo ir išgyvenimo 5 val. inkubuojant šiaudelį 37°C T vandens vonioje, buvo įvertintas ir spermatozoidų gyvybingumas, tyrimui panaudojant fluorescencinius SYBR-14/PI dažus. Šiuo tyrimu spermatozoidų gyvybingumas buvo vertinamas nustatant spermatozoidų plazminės membranos vientisumą ir jo pokyčius iš karto po spermos atšildymo ir po 5 val. šiaudelio inkubacijos 37°C T vandens vonioje.

Vertinant bendrai visų veislių bulių spermatozoidų membranų vientisumą nustatyta, kad po atšildymo spermatozoidų, turinčių sveikas ir nepažeistas plazmos membranas procentas vidutiniškai sudarė 39,23 ± 3,35 proc., kuris per 5 inkubacijos valandas sumažėjo 17,77 procentais (p < 0,005).

Šis tyrimas parodė, kad nors spermatozoidų judrumas per 5 val. vidutiniškai sumažėjo 25,34 proc., bet gyvų spermatozoidų procentas, lyginant jį su spermatozoidų turinčių nepažeistas membranas procentu po atšildymo, sumažėjo tik 8,42 proc. Tai rodo, kad spermatozoidai, nors ir mažiau judrūs, bet išlieka gyvybingi.

Atskirai vertinant kiekvienos bulių veislės spermatozoidų gyvybingumo rodiklius, nustatyta, kad Belgijos mėlynųjų mėsinių bulių veislės spermatozoidų membranų vientisumo pokyčiai po atšildymo ir jų spermatozoidų membranos buvo pažeistos mažiausiai, nes jų spermoje buvo rastas didžiausias (43,34 ± 6,18 proc.) žalia spalva nusidažiusių spermatozoidų procentas (6 pav.).

6 pav. Mėsinių bulių spermatozoidų gyvybingumo pokyčiai, tarp mėsinių bulių veislių, po

spermos atšildymo ir po 5 val. inkubacijos, (ap < 0,05)

7 pav. Spermatozoidai su pažeistomis (raudona spalva) ir nepažeistomis (žalia spalva)

membranomis, nudažyti SYBR – 14 ir propidžio jodido (PI) dažais. (Nuotr. autoriaus)

Tačiau per 5 inkubacijos val. 37°C vandens vonioje spermatozoidų su nepažeistomis membranomis Belgijos mėlynųjų veislės bulių spermoje sumažėjo daugiausiai, tai yra žalia spalva

0 10 20 30 40 50 60

Atšildžius Po 5val Atšildžius Po 5val Atšildžius Po 5val

Belgų mėlynieji Limuzinai Simentalai

nusidažiusių spermatozoidų buvo 24,18 proc. mažiau (p ≤ 0,05) lyginant su kitomis dviem bulių veislėmis (6 pav.).

Įvertinus Belgijos mėlynųjų veislės bulių spermatozoidų membranų pažeidimo koreliacinius ryšius su spermatozoidų koncentracija dozėje, nustatyta patikima neigiama koreliacija tarp šių rodiklių tiek po spermos atšildymo (r = - 0,68, p ≤ 0,005) (8 pav.), tiek po 5 val. inkubacijos (r = - 0,55, p ≤ 0,001) (9 pav.) rodanti, kad kuo spermos dozėje yra didesnis spermatozoidų kiekis, tuo inkubacijos metu šiaudelyje lieka mažesnis gyvybingų su nepažeistomis plazminėmis membranomis spermatozoidų procentas.

Po atšildymo mažiausiai - 36,79 ± 4,38 proc. spermatozoidų su vientisa plazmine membrana buvo nustatyta Limuzinų veislės bulių spermoje. Tačiau, kaip matyti 6 paveiksle, šios veislės bulių gyvybingų spermatozoidų procentas po inkubacijos 5 val. 37°C vandens vonioje nors ir sumažėjo statistiškai patikimai (p ≤ 0,05), bet išliko 0,69 proc. didesnis nei Belgijos mėlynųjų bulių spermoje., bet 6,81 proc. mažesnis nei Simentalų.

Vertinant kokią įtaką šios veislės bulių spermatozoidų gyvybingumui turi spermatozoidų koncentracija dozėje nustatyta patikima teigiama koreliacija tiek po spermos atšildymo (r = 0,98, p ≤ 0,01) (8 pav.), tiek po 5 val. inkubacijos (r = 0,37, p ≤ 0,005) (9 pav.), rodanti, kad esant didelei spermatozoidų koncentracijai dozėje, atitinkamai joje nustatomas ir didesnis negyvybingų spermatozoidų kiekis.

Pats didžiausias (26,66 ± 5,16 proc.) gyvų - su vientisa plazmine membrana spermatozoidų procentas po inkubacijos 5 val. 37°C vandens vonioje nustatytas Simentalų mėsinių bulių spermoje, nors gyvų, su nepažeistomis membranomis spermatozoidų procentas po atšildymo jų spermoje buvo panašus kaip ir limuzinų veislės bulių - 37,00 ± 8,59 proc.

8 pav. Mėsinių bulių spermatozoidų gyvybingumo po atšildymo. priklausomybė nuo spermatozoidų

koncentracijos x 106 _{doz/ml. (}b_{p ≤ 0,025;} c_{p ≤ 0,01;} d_{p ≤ 0,005)}

9 pav. Mėsinių veislių bulių spermatozoidų gyvybingumo po 5 val. šiaudelio inkubacijos vandens

vonioje priklausomybė nuo spermatozoidų koncentracijos x106 _{doz/ml,. (}d_{p ≤ 0,005;} e_{p ≤ 0,001)}

d c b 0 20 40 60 80 100 120 140 0 10 20 30 40 50 60

Belgų mėlynieji Limuzinai Simentalai

K onc ent ra ci ja x 10 6 doz /m l G yvybi ngum as , pr oc . Gyvybingumas Koncentracija e d d 0 20 40 60 80 100 120 140 0 5 10 15 20 25 30 35

Belgų mėlynieji Limuzinai Simentalai

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Palyginti nedaug randama informacijos temomis susijusiomis su užšaldytos-atšildytos mėsinių bulių spermos kokybės vertinimu tarpusavyje lyginant daugiau nei dvi veisles. Daugiausiai atliekamų tyrimų yra tarp dviejų bulių veislių [60].

Nustatėme, kad vidutinė koncentracija visų tirtų bulių veislių (Belgijos mėlynųjų, Limuzinų, Simentalų) buvo 96,49 ± 6,34 x106 doz/ml. (24,12 ± 1,58 x 106 dozėje). Mokslinėje literatūroje teigiama, kad tokios koncentracijos pilnai užtenka apvaisinimui, taip pat nurodoma, kad minimali spermatozoidų koncentracija šiaudelyje turi būti ne mažesnė nei 10 - 15 x 106 spermatozoidų dozėje [30]. Foote et al. [31] nustatė, kad 0,5 ml tūrio šiaudeliuose kriokonservuojamos spermos minimali

spermatozoidų koncentracija dozėje reikalinga apvaisinimui taip pat yra nuo 10 x 106 spermatozoidų

dozėje.

Mažiausia mūsų nustatyta spermatozoidų koncentracija buvo Simentalų veislės bulių (88,33 ± 5,24 doz/ml.). Panašią, tik nežymiai mažesnę - 82,33 ± 1,73 × 106 doz/ml - spermatozoidų

koncentraciją simentalų veislės bulių spermos šiaudeliuose nustatė ir mokslininkas Samardzija et al. [61] analizuodamas šios veislės bulių spermą.

Mes savo tyrimais nustatėme, kad Belgijos mėlynųjų veislės bulių spermatozoidų judrumas po atšildymo buvo didesnis (76,78 ± 2,50 proc.), lyginant su šios veislės spermatozoidų judrumu nustatytu kitų mokslininkų: 53,8 ± 14,8 proc. [12], ir 62,73 ± 13,56 proc. [62].

Tokia pati tendencija nustatyta ir nustatant spermatozoidų judrumą subjektyviu būdu. Mūsų tirtuose Belgijos mėlynųjų bulių spermos mėginiuose spermatozoidų judrumas, tiriant subjektyviai, buvo 72,5 ± 4,79 proc., o literatūroje nurodoma, kad spermatozoidų judrumas, tiriant subjektyviu metodu buvo 56,5 ± 18,8 proc. [12].

Judrumą nustačius subjektyviu ir objektyviu būdu paaiškėjo, kad kompiuteriniu atlikus tyrimą gautas 4,28 proc. didesnis spermatozoidų judrumas Belgijos mėlynųjų bulių veislėje. Taip pat pastebėjome panašų skirtumą mokslininko Shanani et al. [12] atliktais tyrimais tarp Belgijos mėlynųjų bulių spermatozoidų judrumo nustatymo tarp minėtų metodų.

Mūsų gautais duomenimis, lyginant Belgijos mėlynųjų su limuzinų bulių veislių atšildytą spermą, didesnis progresyviai judrių spermatozoidų procentas buvo nustatytas Belgijos mėlynųjų bulių spermoje. Literatūros duomenimis, geresnis spermatozoidų judrumas inkubavus spermą 1 val. buvo nustatytas limuzinų veislės bulių spermoje [60].

Simentalų veislės mėsinių bulių progresyvus spermatozoidų judrumas, tiriant objektyviu būdu, mūsų atveju buvo 80,76 ± 0,97 proc., ir buvo geriausias lyginant su Limuzinų ir Belgijos mėlynųjų bulių veislėmis. Kiti tyrėjai nustatė, kad Simentalų veislės bulių tik 33,97 ± 4,51 procentai spermatozoidų judėjo progresyviai [63].

Įvertinus Simentalų veislės bulių spermatozoidų membranų vientisumo pažeidimus, nustatėme, kad po atšildymo bendras visoms veislėms spermatozoidų gyvybingumas mūsų tirtuose mėginiuose buvo 37,00 ± 8,59 proc., tačiau Karaji et al. [63] nustatė, jog jo su kolegomis gauti rezultatai vertinant mėsinių bulių spermatozoidų gyvybingumą siekė net 61,62 ± 3,13 proc.

Vertindami spermatozoidų gyvybingumą nustatant membranų vientisumą fluorescenciniais dažais, Belgijos mėlynųjų ir limuzinų mėsinių bulių veislėms nustatėme, kad po atšildymo spermatozoidų su nepažeistomis plazminių membranų struktūromis Belgijos mėlynųjų veislės bulių gyvybingumas buvo 43,34 ± 6,18 proc., tuo tarpu Limuzinų veislės bulių spermatozoidai pasižymėjo 36,79 ± 4,38 proc. gyvybingumu. Šie rezultatai skyrėsi nuo literatūroje aptiktų duomenų. Ntemka et al. [56] atliktais tyrimais Belgijos mėlynųjų mėsinių bulių veislės spermatozoidų gyvybingumas buvo net 67,7 ± 1,6 proc., o Limuzinų kiek mažesnis 63,9 ± 2,5 proc., bet vėlgi beveik du kartus didesnis nei buvo nustatytas mūsų.

Mūsų ištirtų visų mėsinių bulių spermos progresyviai judrių spermatozoidų koreliacija su gyvybingumu nustatyta silpno ryšio (r = 0,1, p < 0,01). Giaretta et al. [64] tiriant bulius taip pat nustatė silpną koreliacinį ryšį tarp progresyviai judrių spermatozoidų ir gyvybingumo (r = 0,17, p > 0,05).

Tiriant Limuzinų ir Belgijos mėlynųjų veislės bulių koncentracijos priklausomybę nuo judrumo nustatyta, kad šių veislių buliai turėję didesnę koncentraciją, nei Simentalų veislės buliai sudarė neigiamą koreliacinį ryšį atšildžius, o Limuzinų veislės buliai ir po 5 val. inkubacijos. Tai rodo, kad kuo didesnė nustatyta spermatozoidų koncentracija, tuo blogiau spermatozoidai judėjo.

Skirtingai nei limuzinų ir Belgijos mėlynųjų veislės bulių, Simentalų dozėse spermatozoidų koncentracijos koreliacija su judrumu buvo teigiama patikima (r = 0,59; p > 0,05). Singh et al. [65] taip pat nustatė teigiamą patikimą koreliaciją tarp spermatozoidų koncentracijos ir judrumo (r = 0,463, p < 0,01). Šiek tiek silpnesnė, tačiau taip pat teigiama judrumo ir koncentracijos tarpusavio koreliacija (r = 0,23, p < 0,001) buvo nustatyta jauniems buliams [66].

Tai patvirtina faktą, kad kuo spermos kokybiniai rodikliai iki užšaldymo yra mažesni, tuo daugiau spermatozoidų dedama į dozę.

IŠVADOS

1. Didžiausia spermatozoidų koncentracija nustatyta Limuzinų, o mažiausia Simentalų veislės bulių spermos dozės ml. Statistiškai patikimų spermatozoidų kiekio dozės mililitre skirtumų tarp atskirų bulių veislių nenustatyta.

2. Po atšildymo didžiausias progresyviai judrių spermatozoidų procentas nustatytas Simentalų veislės bulių spermoje, o po 5 val. inkubacijos - Limuzinų veislės bulių spermoje. Spermatozoidų judrumo rodikliai tarp atskirų mėsinių bulių veislių statistiškai patikimai nesiskyrė.

3. Nustatyta, kad kuo buvo didesnė spermatozoidų koncentracija dozės ml tuo spermatozoidų judrumas ir išgyvenimas buvo mažesnis. Limuzinų veislės bulių spermos koncentracija doz/ml buvo didžiausia, o judrumas ir išgyvenimas mažiausi (r = - 0,11, p ≤ 0,025), o Simentalų (r = 0,42; p ≤ 0,001) atvirkščiai: mažiausia koncentracija, bet geriausias judrumas bei išgyvenimas.

4. Nustatyta, kad po atšildymo gyvybingų spermatozoidų, turinčių sveikas ir nepažeistas plazmos membranas procentas vidutiniškai visoms bulių veislėms buvo 39,23 ± 3,35 proc., kuris per 5 inkubacijos val. sumažėjo 17,77 proc. (p < 0,005). Geriausiu gyvybingumu po atšildymo pasižymėjo Belgijos mėlynųjų bulių spermatozoidai, o geriausiu išgyvenimu – Simentalų.

5. Nustatyta, kad Limuzinų veislės bulių spermatozoidų koncentracija dozėje, patikimai teigiamai koreliavo su gyvybingų, nepažeistomis plazminėmis membranomis spermatozoidų procentu dozėje (didesnė koncentracija, daugiau spermatozoidų su pažeistomis membranomis).

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Bollongino R, Burger J, Powell A, Mashkour M, Vigne JD, Thomas MG. Modern taurine cattle descended from small number of near-eastern founders. Mol Biol Evol. 2012;29:2101-2104 2. Beja-Pereira A, Caramelli D, Lalueza-Fox C, Vernesi C, Ferrand N, Casoli A, et al. The origin of

European cattle: evidence from modern and ancient DNA. Proc Natl Acad Sci. 2006;103:8113-8118.

3. Buchanan DS. Breeds of Dairy Cattle (Major Bos taurus Breeds). Ref. Mod. In food Sci. 2015. 4. Ombelet W, Van Robays J. Artificial insemination history: hurdles and milestones. Facts Views

Vis Obgyn. 2015;7:137-143.

5. Foote RH. The history of artificial insemination: Selected notes and notables. Journal of Animal Science. 2002;80:1-0.

6. Slowinska M, Karol H, Ciereszko A. Comet assay of fresh and cryopreserved bull spermatozoa. Cryobiology. 2008;56:100-102.

7. Bulių sperma. Bendrieji reikalavimai. LST 1467:2006.

8. Menon AG, Barkema HW, Wilde R, Kastelic JP, Thundathil JC. Associations between sperm abnormalities, breed, age, and scrotal circumference in beef bulls. Can J Vet Res. 2011;75:241-247.

9. Bailey JL, Bilodeau JF, Cormier N. Semen cryopreservation in domestic animals: a damaging and capacitating phenomenon. J Androl. 2000;21:1-7.

10. Hoflack G, Opsomer G, Rijsselaere T, Van Soom A, Maes D, de Kruif A et al. Comparison of computer-assisted sperm motility analysis parameters in semen from Belgian blue and Holstein-Friesian bulls. Reprod Domest Anim. 2007;42:153-161.

11. Hoflack G, Van den Broeck W, Maes D, Van Damme K, Opsomer G, Duchateau L et al. Testicular dysfunction is responsible for low sperm quality in Belgian Blue bulls. Theriogenology. 2008;69:323-332.

12. Shahani SK, Revell SG, Argo CG, Murray RD. Mid-piece length of spermatozoa in different cattle breeds and its relationship to fertility. Pak J Biol Sci. 2010;13:802-808.

13. Šileika A, Japertienė R, Juozaitienė V, Šlyžius E, Muzikevičius A, Anskienė L. Lietuvoje Veisiamos ir Auginamos Ūkinių Gyvūnų Veislės. Kaunas, Lietuva: LSMU; 2013.

15. Lunstra DD, Ford JJ, Echternkamp SE. Puberty in beef bulls: hormone concentrations, growth, testicular development, sperm production and sexual aggressiveness in bulls of different breeds. J Anim Sci. 1978;46:1054-1062.

16. Wolf FR, Almquist JO, Hale EB. Prepuberal behavior and puberal characteristics of beef bulls on high nutrient allowance. Journal of animal science. 1965;24:761-5.

17. Rawlings N, Evans AC, Chandolia RK, Bagu ET. Sexual maturation in the bull. Reprod Domest Anim. 2008;43:295-301.

18. Chenoweth PJ, Lorton S, editors. Animal Andrology: Theories and Applications. Cabi. 2014:1:144-151.

19. Barth A. Pubertal development of Bos taurus beef bulls. Le Medecin Veterinaire du Québec. 2004;38:54-55

20. Arteaga A, Baracaldo M, Barth AD. The proportion of beef bulls in western Canada with mature spermiograms at 11 to 15 months of age. Can Vet J. 2001;42:783-787.

21. Maximini L, Fuerst-Waltl B, Gredler B, Baumung R. Inbreeding depression on semen quality in Austrian dual-purpose simmental bulls. Reprod Domest Anim. 2011;46:102-4.

22. Hafez ES, Hafez B. Reproduction in Farm Animals 7th Ed. 2000.

23. Schatten H, Constantinescu GM. Comparative reproductive biology. Blackwell; 2007.

24. Gredler B, Fuerst C, Fuerst-Waltl B, Schwarzenbacher H, Solkner J. Genetic parameters for semen production traits in Austrian dual-purpose Simmental bulls. Reprod Domest Anim. 2007;42:326-328.

25. Hopkins F, Spitzer J. A The new Society for Theriogenology breeding soundness evaluation system. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 1997;13:283-293.

26. Kennedy SP, Spitzer JC, Hopkins FM, Higdon HL, Bridges WC. Breeding soundness evaluations of 3648 yearling beef bulls using the 1993 Society for Theriogenology guidelines. Theriogenology. 2002;58:947-61.

27. Thundathil JC, Dance AL, Kastelic JP. Fertility management of bulls to improve beef cattle productivity. Theriogenology. 2016;86:397-405.

28. Koivisto MB, Costa MT, Perri SH, Vicente WR. The effect of season on semen characteristics and freezability in Bos indicus and Bos taurus bulls in the southeastern region of Brazil. Reprod Domest Anim. 2009;44:587-592.

29. Koivisto M, Costa M, Perri S, Vicente W. Effects of season, age, and breed on semen characteristics in different Bos taurus breeds in a 31-year retrospective study. 2013;79:847-52. 30. Holt WV. Basic aspects of frozen storage of semen. Anim Reprod Sci. 2000;62:3-22.

32. Garner DL, Thomas CA, Allen CH. Effect of semen dilution on bovine sperm viability as determined by dual-DNA staining and flow cytometry. J Androl. 1997;18:324-331.

33. Vera-Munoz O, Amirat-Briand L, Diaz T, Vasquez L, Schmidt E, Desherces S, et al. Effect of semen dilution to low-sperm number per dose on motility and functionality of cryopreserved bovine spermatozoa using low-density lipoproteins (LDL) extender: comparison to Triladyl and Bioxcell. Theriogenology. 2009;71:895-900.

34. Abdussamad AM, Detterer J, Gauly M, Holtz W. Comparison of various semen extenders and addition of prostaglandin F2alpha on pregnancy rate in cows. Animal 2016;10:655-659.

35. Ishimoto K, Gaffney EA. Fluid flow and sperm guidance: a simulation study of hydrodynamic sperm rheotaxis. J R Soc Interface. 2015;12:1098

36. Chen X, Wang Y, Zhu H, Hao H, Zhao X, Qin T, et al. Comparative transcript profiling of gene expression of fresh and frozen-thawed bull sperm. Theriogenology. 2015;83:504-511.

37. Vishwanath R, Shannon P. Storage of bovine semen in liquid and frozen state. Anim Reprod Sci. 2000;62:23-53.

38. Januškauskas A. Žemės Ūkio Gyvūnų Reprodukcija ir Sėklinimas. Kaunas: Vetinfo; 2010;6-33. 39. Kjaestad H, Ropstad E, Berg KA. Evaluation of spermatological parameters used to predict the

fertility of frozen bull semen. Acta Vet Scand. 1993;34:299-303.

40. Wood PD, Foulkes JA, Shaw RC, Melrose DR. Semen assessment, fertility and the selection of Hereford bulls for use in AI. J Reprod Fertil. 1986;76:783-795.

41. Anzar M, Kroetsch T, Boswall L. Cryopreservation of bull semen shipped overnight and its effect on post-thaw sperm motility, plasma membrane integrity, mitochondrial membrane potential and normal acrosomes. Anim Reprod Sci. 2011;126:23-31.

42. Muino R, Tamargo C, Hidalgo CO, Pena AI. Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: effects of cryopreservation and between-bull variation. Anim Reprod Sci. 2008;109:27-39.

43. P. Shannon RV. The effect of optimal and suboptimal concentrations of sperm on the fertility of fresh and frozen bovine semen and a theoretical model to explain the fertility differences. Anim Reprod Sci. 1995;39:1-10.

44. Lenzi A, Picardo M, Gandini L, Dondero F. Lipids of the sperm plasma membrane: from polyunsaturated fatty acids considered as markers of sperm function to possible scavenger therapy. Hum Reprod Update. 1996;2:246-256.

45. Flesch FM, Gadella BM. Dynamics of the mammalian sperm plasma membrane in the process of fertilization. Biochim Biophys Acta. 2000;1469:197-235.

47. Chakrabarty J, Banerjee D, Pal D, De J, Ghosh A, Majumder GC. Shedding off specific lipid constituents from sperm cell membrane during cryopreservation. Cryobiology. 2007;54:27-35. 48. Watson PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim Reprod Sci

2000;60-61:481-492.

49. Meyers SA. Spermatozoal response to osmotic stress. Anim Reprod Sci. 2005;89:57-64.

50. Watson PF. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reprod Fertil Dev. 1995;7:871-891.

51. Tasdemir U, Buyukleblebici S, Tuncer PB, Coskun E, Ozgurtas T, Aydin FN, et al. Effects of various cryoprotectants on bull sperm quality, DNA integrity and oxidative stress parameters. Cryobiology. 2013;66:38-42.

52. Aurich C. Factors affecting the plasma membrane function of cooled-stored stallion spermatozoa. Anim Reprod Sci. 2005;89:65-75.

53. Sapanidou V, Taitzoglou I, Tsakmakidis I, Kourtzelis I, Fletouris D, Theodoridis A, et al. Protective effect of crocetin on bovine spermatozoa against oxidative stress during in vitro fertilization. Andrology. 2016;4:1138-49.

54. Januskauskas A, Rodriguez-Martinez H. Assessment of sperm viability by measurement of ATP, membrane integrity and motility in frozen/thawed bull semen. Acta Vet Scand. 1995;36:571-574. 55. Garner DL, Johnson LA, Yue ST, Roth BL, Haugland RP. Dual DNA staining assessment of

bovine sperm viability using SYBR-14 and propidium iodide. J Androl. 1994;15:620-629. 56. Garner DL, Johnson LA. Viability assessment of mammalian sperm using SYBR-14 and

propidium iodide. Biol Reprod. 1995;53:276-284.

57. Salamon S, Maxwell W. Frozen storage of ram semen II. Causes of low fertility after cervical insemination and methods of improvement. 1994. Anim. Reprod. Sci. 1995;38:1–36.

58. Celeghini EC, de Arruda RP, de Andrade AF, Nascimento J, Raphael CF, Rodrigues PH. Effects that bovine sperm cryopreservation using two different extenders has on sperm membranes and chromatin. Anim Reprod Sci. 2008;104:119-131.

59. Muino R, Fernandez M, Pena AI. Post-thaw survival and longevity of bull spermatozoa frozen with an egg yolk-based or two egg yolk-free extenders after an equilibration period of 18 h. Reprod Domest Anim. 2007;42:305-311.

60. Ntemka A, Tsousis G, Brozos C, Kiossis E, Boscos CM, Tsakmakidis IA. Breed differences of bull frozen-thawed semen. Reprod Domest Anim. 2016;51:945-952.

62. Hoflack G, Opsomer G, Van Soom A, Maes D, de Kruif A, Duchateau L. Comparison of sperm quality of Belgian Blue and Holstein Friesian bulls. Theriogenology. 2006;66:1834-1846. 63. Olfati Karaji R, Daghigh Kia H, Ashrafi I. Effects of in combination antioxidant supplementation

on microscopic and oxidative parameters of freeze-thaw bull sperm. Cell Tissue Bank. 2014;15:461-470.

64. Giaretta E, Munerato M, Yeste M, Galeati G, Spinaci M, Tamanini C, et al. Implementing an open-access CASA software for the assessment of stallion sperm motility: Relationship with other sperm quality parameters. Anim Reprod Sci. 2017;176:11-19.

65. Singh AK, Brar PS, Cheema RS. Relationships among frozen-thawed semen fertility, physical parameters, certain routine sperm characteristics and testosterone in breeding Murrah buffalo (Bubalus bubalis) bulls. World. 2014;7:644-51.

66. Sylla L, Stradaioli G, Borgami S, Monaci M. Breeding soundness examination of Chianina, Marchigiana, and Romagnola yearling bulls in performance tests over a 10-year period. Theriogenology. 2007;67:1351-8.