NQO1 609 GENO POLIMORFIZMŲ IR DEMOGRAFINIŲ, MITYBOS BEI GYVENIMO BŪDO YPATUMŲ SĄSAJŲ REIKŠMĖ, PROGNOZUOJANT GAUBTINĖS IR TIESIOSIOS ŽARNOS VĖŽIO IŠPLITIMĄ Į SRITINIUS LIMFMAZGIUS

(1)

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS ONKOLOGIJOS INSTITUTAS

MEDICINOS VIENTISŲJŲ STUDIJŲ PROGRAMOS STUDENTĖS INDRĖS ŠIMELIŪNAITĖS

MAGISTRINIS MOKSLINIS DARBAS

NQO1 609 GENO POLIMORFIZMŲ IR DEMOGRAFINIŲ,

MITYBOS BEI GYVENIMO BŪDO YPATUMŲ SĄSAJŲ REIKŠMĖ,

PROGNOZUOJANT GAUBTINĖS IR TIESIOSIOS ŽARNOS VĖŽIO

IŠPLITIMĄ Į SRITINIUS LIMFMAZGIUS

Darbo vadovas: gyd. dr. Viktoras Rudžianskas

Kaunas 2017

(2)

2

TURINYS

1. SANTRAUKA………...4

2. SUMMARY………...5

3. INTERESŲ KONFLIKTAS………..6

4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS………6

5. SANTRUMPOS……….………7

6. ĮVADAS……….8

7. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI………...9

8. LITERATŪROS APŽVALGA………10

8.1 Gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio paplitimas………10

8.2 Gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys, rizikos veiksniai……….10

8.2.1 Žuvies vartojimas………..10

8.2.2 Alkoholio vartojimas……….11

8.2.3 Nutukimas……….…………11

8.2.4 Fizinis aktyvumas………..…11

8.3 Genų mutacijos……….…………12

8.4 NQO1 609 genas ir jo funkcijos………...12

8.5 NQO1 609 polimorfizmai ir jų reikšmė vėžio vystymuisi………...13

9. TYRIMO METODIKA……….………….14 9.1 Tyrimo planavimas……….…..…14 9.2 Tyrimo objektas……….……...…14 9.3 Tiriamųjų atranka……….………14 9.4 Tyrimo metodika……….……….15 9.4.1 Apklausa……….……….…..15 9.4.2 Laboratorinis tyrimas………15

9.4.2.1 Kraujo ėminių rinkimas ………..15

9.4.2.2 DNR išskyrimas………...15

9.4.2.3 Geno NQO1 609 (rs1800566) polimorfizmo nustatymas………16

9.4.2.4 Elektroforezė………18

9.5 Duomenų analizės metodai………..19

10. REZULTATAI……….………20

(3)

3 10.2 Demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumų sąsajos su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose…….……….……….……….……….……….…….20 10.2.1 Demografinių ypatumų sąsajos…….……….……….……….……….…...20 10.2.2 Mitybos ypatumų sąsajos…….……….……….……….……….………....21 10.2.3 Gyvenimo būdo ypatumų sąsajos…….……….……….……….………....22 10.3 Geno NQO1 609 polimorfizmų sąsajos su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius……...23 10.4 Demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumų įtaka NQO1 609 atskirų polimorfizmų sąsajai su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose…….……….………...24 10.4.1 Demografinių ypatumų reikšmė…….……….……….……….……….…..24 10.4.2 Mitybos ypatumų reikšmė…….……….……….……….……….………...26 10.4.3 Gyvenimo būdo ypatumų reikšmė…….……….……….……….………...27 11. REZULTATŲ APTARIMAS…….……….……….……….……….……….……….……….…..30 12. IŠVADOS…….……….……….……….……….……….……….……….……….……….……..32 13. LITERATŪROS SĄRAŠAS…….……….……….……….……….……….……….……….…...33

(4)

4

1. SANTRAUKA

Indrė Šimeliūnaitė

„NQO1 609 geno polimorfizmų ir demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumų sąsajų reikšmė, prognozuojant gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio išplitimą į sritinius limfmazgius“

Darbo tikslas: įvertinti NQO1 609 geno polimorfizmų ir demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumų sąsajų reikšmę, prognozuojant gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio (GTŽV) išplitimą į sritinius limfmazgius.

Darbo uždaviniai: 1) išanalizuoti demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumų sąsajas su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose; 2) išanalizuoti geno NQO1 609 polimorfizmų sąsajas su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose; 3) įvertinti geno

NQO1 609 atskirų polimorfizmų ir demografinių, mitybos, gyvenimo būdo ypatumų derinio sąsajas su

GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose.

Metodai: į tyrimą įtrauktas 81 pacientas, sergantis GTŽV. Tiriamieji apklausti, naudojant klausimyną apie demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumus. Taip pat buvo renkami bei kaupiami pacientų veninio kraujo ėminiai. Geno NQO1 609 (rs1800566) polimorfizmai nustatyti, padauginant geną polimerazės grandinės reakcijos metodu. Geno variantai identifikuoti restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo tyrimo metodu. Duomenų analizė atlikta, naudojant IBM SPSS 23 programinį paketą.

Rezultatai: nustatyta, kad žuvį vartojantiems pacientams 5 kartus mažesnė tikimybė, kad bus diagnozuota į sritinius limfmazgius išplitusi liga (p=0,034). NQO1 609 geno polimorfizmai nustatyti: CC – 64 proc. tiriamųjų, CT – 33 proc., TT – 2,5 proc. Esant CC polimorfizmui 3,5 karto mažesnė rizika, kad bus diagnozuota išplitusi į sritinius limfmazgius liga (p=0,013). Ši prognostinė reikšmė praranda prasmę, organizmą veikiant epigenetiniams veiksniams: moteriškai lyčiai, vienišam gyvenimo būdui, retam žuvies vartojimui, dažnesniam (dažniau nei 1 kartą per mėnesį) alkoholio vartojimui, nutukimui ir sėsliam gyvenimo būdui.

Išvados: žuvį valgantiems pacientams dažniau nustatoma neišplitusi į sritinius limfmazgius GTŽV. Geno NQO1 609 polimorfizmai susiję su limfmazgių būkle, sergant GTŽV, tačiau prognostinė reikšmė priklauso nuo organizmą veikiančių epigenetinių veiksnių.

(5)

5

2. SUMMARY

Indre Simeliunaite

„Associations between NQO1 609 polymorphism and demographic, dietry, lifestyle habits – prognostic value of colorectal cancer with lymph nodes metastasis“

The aim: to evaluate the associations between NQO1 609 polymorphisms, demographic characteristics, dietary, lifestyle habits and the status of regional lymph nodes for patients with colorectal cancer (CRC).

Objectives: 1) to evaluate the associations between demographic characteristics, dietary habits, lifestyle habits and the status of regional lymph nodes for patients with CRC; 2) to evaluate the associations between NQO1 609 polymorphisms and the status of regional lymph nodes for patients with CRC; 3) to evaluate the associations between NQO1 609 polymorphisms and demographic characteristics, dietary habits, lifestyle habits and the status of regional lymph nodes for patients with CRC.

Methods: 81 patients with CRC diagnosis were included. A questionnaire was used to collect the following information: demographic characteristics, dietary habits, lifestyle habits. Interwied patients were asked to donate a venous blood sample. Genotyping of the NQO1 609 (rs1800566) polymorphisms was carried out using polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphysim technology. IBM SPSS 23 software was used to perform data analysis.

Results: it was established that patients who consumed fish had 5–fold decreased risk of CRC with lymph nodes metastasis diagnosis (p=0,034). The frequencies of the NQO1 609 polymorphisms were: CC – 64 proc., CT – 33 proc., TT – 2,5 proc. Individuals with CC polymorphism had a 3,5–fold lower risk of metastases of CRC into regional lymph nodes (p=0,013). This prognostic value was not important if patient was affected by epigenetic factors: female, marital status – single, rare consumption of fish, frequent consumption of alcohol (more than once per week), obesity, hypoactivity.

Conclusions: consumption of fish is associated with decreased risk of CRC with lymph nodes metastasis diagnosis. NQO1 609 polymorphisms are associated with the status of regional lymph nodes for patients with CRC. However, the prognostic value depends on epigenetic factors.

(6)

6

3. INTERESŲ KONFLIKTAS

Interesų konflikto nebuvo.

4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Gautas Etikos komiteto leidimas: 2014–12–12, Nr. BEC–MF–273.

Gautas Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas: 2014, Nr.P1–BE– 2–10/2014.

(7)

7

5. SANTRUMPOS

bp – bazių pora C – citozinas d. – diena DNR – deoksiribonukleorūgštis g – gramai

GTŽV – gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys h – valanda

IL – interleukinas kcal. - kilokalorijos

KMI – kūno masės indeksas LDH – laktatdehidrogenazė

LSMUL KK – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė, Kauno klinikos MAPK – mitogeno aktyvuojama proteinkinazė

MMP – metalproteinazė

NCBI – biotechnologinių informacijų nacionalinis centras NF-κB – branduolio faktorius -κB

NQO1 –NAD(P)H kuinonų dehidrogenazė 1 OHK – Onkologijos ir hematologijos klinika OML – Onkologijos mokslo laboratorija PGR – polimerazės grandinė reakcija proc. – procentai

RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmai ROS – reaktyvios deguonies formos

SV – standartinis vienetas T – timinas

TNF–α – naviko nekrozinis faktorius – α

VEGF – kraujagyslių endotelio augimo faktorius VNP – vieno nukleotido pakaita

(8)

8

6. ĮVADAS

Gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys (GTŽV) yra viena dažniausiai diagnozuojamų onkologinių ligų pasaulyje ir Lietuvoje. GTŽV labiau paplitęs ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse ir vis dažniau nustatomas ekonomiškai besivystančiose šalyse [1].

Didžioji dalis GTŽV atvejų yra sporadiniai, t.y. nesusiję su paveldimais genetiniais pokyčiais. GTŽV kancerogenezei didelę įtaką daro epigenetiniai (išoriniai) veiksniai: alkoholio vartojimas, nutukimas, gausus riebaus ar mažai skaidulų turinčio maisto vartojimas ir daug kitų [2]. Šie epigenetiniai veiksniai keičia žmogaus ląstelių genetinę informaciją. Dėl to prasideda daugiastadijinis kancerogenezės procesas, kurio metu normalus audinys proliferuoja, vystosi adenoma ir galiausiai – karcinoma [3].

Tačiau organizmo atsakas į kancerogenines medžiagas nėra vienodas. Su tuo susijusios genų mutacijos, kurios atsiranda atsitiktinai, tačiau yra paveldimos. Dėl vieno nukleotido pakaitos (VNP) – polimorfizmo – gali pakisti koduojamo baltymo funkcija. Viena iš labiausiai nagrinėjamų mutacijų, susijusių su padidėjusia vėžio rizika, yra geno NQO1 609 (ang. NAD(P)H quinone dehydrogenase 1) mutacija [4]. Įvykus VNP mutacijai kinta fermento NQO1, dalyvaujančio oksidacijos reakcijose, aktyvumas. Esant CT ar TT polimorfizmams, fermento detoksikacinės savybės, onkosupresinių baltymų stabilumas organizme mažėja, o oksidacinis stresas didėja. Esant oksidaciniam stresui, skatinama ląstelių proliferacija, slopinami apoptozės mechanizmai, skatinamas navikinių ląstelių metastazavimas ir t.t. [5].

Pastaruoju metu vis didesnis mokslininkų dėmesys kreipiamas į epigenetinių veiksnių poveikį genetiškai skirtingiems individams ir jų reikšmę vėžio kancerogenezei. Tačiau tyrimai dažniausiai orientuojami į rizikos sirgti GTŽV nustatymą [6]. Trūksta tyrimų, nagrinėjančių geno NQO1 609 polimorfizmų ir epigenetinių veiksnių reikšmę, prognozuojant GTŽV invazyvumą, išplitimą į sritinius limfmazgius.

Šio darbo tikslas – išnagrinėti epigenetinių veiksnių ir skirtingų geno NQO1 609 polimorfizmų galimų sąsajų reikšmę, prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius. Tyrimo metu buvo ištirti geno NQO1 609 polimorfizmai pacientams, sergantiems GTŽV, nagrinėtos polimorfizmų sąsajos su ligos išplitimu į sritinius limfmazgius, atsižvelgiant į epigenetinių veiksnių poveikį.

(9)

9

7. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: įvertinti NQO1 609 geno polimorfizmų ir demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumų sąsajų reikšmę, prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius.

Darbo uždaviniai:

1. Išanalizuoti demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumų sąsajas su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose.

2. Išanalizuoti geno NQO1 609 polimorfizmų sąsajas su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose.

3. Įvertinti geno NQO1 609 atskirų polimorfizmų ir demografinių, mitybos, gyvenimo būdo ypatumų derinio sąsajas su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose.

(10)

10

8. LITERATŪROS APŽVALGA

8.1 Gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio paplitimas

Pasaulyje 2012 metais buvo nustatyta 14,1 milijonų naujų susirgimo vėžiu atvejų. Iš jų 9,6 proc. diagnozuotas GTŽV. Apie 55 proc. GTŽV atvejų nustatoma labiau išsivysčiusiose šalyse. Pasaulyje GTŽV yra trečia pagal dažnumą onkologinė liga vyrams ir antra moterims [1].

Lietuvoje 2012 metais buvo nustatyta 14520 naujų susirgimo vėžiu atvejų. Iš jų 10,7 proc. diagnozuotas GTŽV. Sergamumas GTŽV yra 47,3/10000 gyventojų, šiek tiek dažniau diagnozuojamas vyrams (vyrai: 50,2/100000; moterys: 44,8/100000). Lietuvoje GTŽV yra antra pagal dažnumą onkologinė liga vyrams ir penkta – moterims. Mirtingumas sergant GTŽV yra 30,2/100000, didesnis vyrams (vyrai: 33/100000; moterys: 27,8/100000) [7].

8.2 Gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys, rizikos veiksniai

Didžioji dalis GTŽV atvejų yra sporadiniai, t.y. nesusiję su paveldimais genetiniais pokyčiais. GTŽV kancerogenezei didelę įtaką daro epigenetiniai (išoriniai) veiksniai: alkoholio vartojimas, nutukimas, gausus riebaus ar mažai skaidulų turinčio maisto vartojimas ir daug kitų [2,6]. Šie epigenetiniai veiksniai keičia žmogaus ląstelių genetinę informaciją. Prasideda daugiastadijinis kancerogenezės procesas, kurio metu normalus audinys proliferuoja, vystosi adenoma ir galiausiai – karcinoma [3]. Šiame darbe didžiausias dėmesys skirtas tokiems GTŽV rizikos veiksniams, kaip negausus žuvies vartojimas, alkoholio vartojimas, nutukimas, mažas fizinis aktyvumas.

8.2.1 Žuvies vartojimas

Atliktos metaanalizės įrodė, kad žuvies vartojimas sumažina GTŽV riziką 12 proc. [8]. Žuvyje gausu omega-3 polinesočiųjų riebalų rūgščių kurios siejamos su sumažėjusia mutacijų rizika, ląstelių augimo slopinimu ir apoptozės sukėlimu. Omega-3 polinesočiosios riebalų rūgštys slopina uždegiminių medžiagų sintezę, pvz., prostaglandinų E2 ir leukotrienų, branduolio faktorius–κB (NF– κB) gamybą. Žuvyje taip pat gausu seleno, kuris atstato oksidacinio streso sukeltas deoksiribonukleorūgšties (DNR) pažaidas, skatina adenomų regresavimą ir lėtina jų augimą [9].

(11)

11 8.2.2 Alkoholio vartojimas

Metaanalizės tyrimai pateikia įrodymus, kad yra ryšys tarp alkoholio suvartojimo kiekio ir didėjančios GTŽV rizikos [2]. Tačiau tyrimuose varijuoja skirtingi etanolio kiekiai ir GTŽV rizikos dydis: 10 g/d. – 1,07 karto, 50 g/d. -1,38 karto, 100 g/d. – 1,82 karto [10,11]. Taip pat nustatytas stiprus ryšys tarp gausaus alkoholio vartojimo (≥50 g etanolio per dieną) ir mirtingumo nuo GTŽV padidėjimo [10].

Alkoholio kancerogeninis poveikis siejamas su įvairiais vietiniais, sisteminiais ir molekuliniais mechanizmais. Endotoksinė teorija teigia, kad etanolis didina žarnų pralaidumą, dėl kurio mikrofloros išskiriami endotoksinai patenka į kraują. Šie endotoksinai aktyvina Kupferio ląsteles, dėl ko suintensyvėja azoto oksido, superoksidų (reaktyvių deguonies formų (ROS)), citokinų, tokių kaip naviko nekrozinis faktoriu –α (TNF–α) gamyba. TNF–α aktyvuoja NF–κB, dėl ko didėja ląstelių proliferacija ir invazyvumas [12]. Etanolis taip pat sutrikdo folatų, svarbių DNR sintezei ir metilinimui, vitaminų A, B12, B6 ir kitų vitaminų absorbciją virškinimo trakte [2].

8.2.3 Nutukimas

Antsvorį turintiems žmonėms (kūno masės indeksas (KMI) 25 – 29,9 kg/m2 ) rizika sirgti GTŽV didėja 1,13 karto, o nutukusiems (KMI>30 kg/m2) – 1,31 karto [13]. Metaanalizės nustatė, kad žmonių nutukimas (KMI >30 kg/m2) susijęs su padidėjusiu mirtingumu nuo GTŽV (p<0,01) [14].

Lyginant lieso ir nutukusio žmogaus riebalinį audinį nustatyta, kad jie skiriasi imunologinėmis ir endokrinologinėmis savybėmis. Didėjant riebalinio audinio kiekiui, mažėja priešuždegiminių medžiagų išskyrimas (pvz., adiponektino) ir didėja uždegiminių medžiagų išskyrimas: laktatdehidrogenazės (LDH), leptino, interleukino (IL)–2, IL–6, IL–8 ir TNF–α. [5, 15]. TNF–α skatina oksidacinio streso vystymąsi. Esant ROS hiperprodukcijai ir kaupimuisi organizme, vyksta riebalų rūgščių peroksidacija, o jos metu susidarę metabolitai pasižymi mutageniniu poveikiu [5]. Uždegiminė organizmo mikroaplinka sudaro sąlygas įvykti naujoms genetinėms mutacijoms ir audinio proliferacijos aktyvinimui, dėl ko aktyvėja polipų susidarymas ir kancerogenezė [15].

8.2.4 Fizinis aktyvumas

Metaanalizių duomenimis fizinis aktyvumas susijęs su sumažėjusia rizika sirgti GTŽV ir mirti nuo jos [6]. Fiziškai aktyvių žmonių rizika susirgti GTŽV sumažėja 20–30 proc. [16].

(12)

12 Pagrindinis fizinio aktyvumo antikancerogeninis mechanizmas siejamas su uždegiminių reakcijų mažinimu organizme, mažinant prostaglandinų sintezę [17]. Taip pat su fizinio aktyvumo įtaka virškinamojo trakto peristaltikai, dėl ko mutageniniai veiksniai trumpiau užsilaiko virškinamajame trakte [2].

8.3 Genų mutacijos

Pastaruoju metu mokslininkų dėmesys nukreiptas į genų mutacijas, dėl kurių žmogaus organizmas tampa jautresnis tam tikrų epigenetinių veiksnių (dietos ir gyvensenos ypatumų) poveikiui ir didina GTŽV riziką.

Geno mutacijos atsiranda atsitiktinai ir yra paveldimos. Šios mutacijos gali būti didžiosios (didelių geno fragmentų mutacijos) arba mažosios (taškinės): vieno nukleotido pakaita ar kelių nukleotidų įsiterpimas, ar iškritimas. Pagal tai, kaip VNP pakeičia aminorūgštį koduojantį kodoną (sudarytą iš trijų nukleotidų) jos skirstomos į: 1) misens mutacijas – pakinta aminorūgštis; 2) nonsens – nebekoduojama jokia aminorūgštis; 3) tylioji mutacija – aminorūgštis nepakinta. Atitinkamai, dėl

misens mutacijos baltymo funkcija pakinta, dėl nonsens – baltymas nebeatlieka savo funkcijos, dėl

tyliosios mutacijos baltymo funkcija nekinta [18].

Viena iš labiausiai nagrinėjamų mutacijų, turinčių įtakos vėžio vystymuisi – NQO1 609 geno polimorfizmai.

8.4 NQO1 609 genas ir jo funkcijos

NQO1 609 geno lokalizacija yra 16q22.1 chromosomoje. Jis priklauso NAD(P)H

dehidrogenazių šeimai [19]. Dehidrogenazės – oksidoreduktazių klasės fermentai dalyvaujantys antioksidacinėse reakcijose, katalizuojant protonų pernašą akceptoriui nuo substrato ir elektronų poros [5, 19].

NQO1 dalyvauja detoksikuojant kancerogenines medžiagas (patenkančias į organizmą rūkant tabaką, su maisto produktais). Fermentui redukuojant du elektronus susidaro hidrokuinonai, kurie susijungę su kitomis molekulėmis (pvz., gliukuronidais) lengviau ir greičiau pašalinami iš organizmo.

NQO1 taip pat dalyvauja šalinant laisvuosius radikalus, ROS, aktyvuojant endogeninius antioksidantus

ir stabilizuojant onkosupresinius baltymus, tokius kaip p53 ir p73α (1 pav.) [20,21,22,23]. Dėl šių funkcijų NQO1 yra laikomas onkoprotekciniu fermentu, mažinančiu vėžio riziką.

(13)

13 1 pav. NQO1 funkcijos, apsaugančios nuo vėžio vystymosi

8.5 NQO1 609 polimorfizmai ir jų reikšmė vėžio vystymuisi

NQO1 609 geno polimorfizmai siejami su įvairių organų vėžio vystymusi [24]: GTŽV [20],

plonųjų žarnų ir skrandžio [25], stemplės [26], krūties, kasos, gimdos kaklelio, plaučių, odos [23]. Geno NQO1 609 mutacija yra svarbus genetinis rizikos faktorius vėžio išsivystymuisi [4]. Įvykus VNP taškinei misens mutacijai NQO1 lokuse rs1800566 (C609T), citozinas (C) pakeičiamas timinu (T). Dėl pakitusio aminorūgštį koduojančio kodono aminorūgščių sekoje prolinas pakeičiamas serinu [20]. Struktūriniai pokyčiai funkcinėje fermento vietoje nulemia fermento NQO1 aktyvumo sumažėjimą žmonėms, turintiems genotipą CT ir TT [27].

Sumažėjus fermento NQO1 aktyvumui organizme didėja ROS ir kitų reaktyvių dalelių kiekis. ROS laikomas vienu svarbiausiu oksidacinio streso vystymosi mechanizmų. ROS paveikia signalinių baltymų molekulinius mechanizmus. Paveikus mitogeno aktyvuojamas proteinkinazes (ang. mitogen–

activated protein kinase (MAPK)), NF–κB, aktyvėja ląstelių proliferacija. NF–κB taip pat slopina

apoptozės mechanizmus ląstelėse. Veikiant metalproteinazes (ang. metalloproteinases (MMP)), skatinama ląstelių invazija į audinius ir metastazavimas. Angiogenezė skatinama per kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus išskyrimą (ang. vascular endothelial growth factor (VEGF)) [5]. Sumažėjus fermento aktyvumui taip pat mažėja onkosupresinių baltymų stabilumas.

(14)

14

9. TYRIMO METODIKA

9.1 Tyrimo planavimas

Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninėje, Kauno klinikose (LSMUL KK), Onkologijos institute: Onkologijos ir hematologijos klinikoje (OHK) ir Onkologijos mokslo laboratorijoje (OML).

I tyrimo planavimo etapas. Literatūros apžvalga. Literatūros paieška atlikta naudojantis duomenų bazėmis: „PubMed“, „ELSEVIER“, „Science Direct“ ir kitomis. Analizuoti 2007–2017m. publikuoti moksliniai straipsniai, apžvelgiantys mitybos, gyvensenos bei genetinių veiksnių įtaką GTŽV patogenezei. Atlikus literatūros analizę pastebėta, kad trūksta tyrimų, nagrinėjančių epigenetinių veiksnių ir genų polimorfizmų sąsajas su ligos išplitimu organizme. Įvertinus, kad tokių sąsajų nustatymas galėtų būti prognostinis GTŽV išplitimo rodiklis, o epigenetinių veiksnių korekcija galėtų turėti prevencinę reikšmę, nuspręsta atlikti tyrimą.

II tyrimo planavimo etapas. Klausimyno ruošimas [28].

III tyrimo planavimo etapas. Ruošimasis tyrimui laboratorijoje. Įvertinta, kad laboratorijoje yra visa reikalinga įranga polimerazės grandinės reakcijos metodui (PGR), restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo tyrimo (RFIP) metodui ir elektroforezei atlikti. Remiantis moksliniais straipsniais nustatyti norimų amplifikuoti fragmentų ilgiai. Parinktos restrikcijos endonukleazės polimorfizmų nustatymui. Užsakyti reikalingi reagentai.

IV tyrimo planavimo etapas. Pateikus dokumetus Etikos komitetui, gautas leidimas atlikti tyrimą.

9.2 Tyrimo objektas

GTŽV sergantys pacientai.

9.3 Tiriamųjų atranka

Tyrime dalyvauti siūlyta pacientams, gydytiems LSMUL KK OK dėl histologiškai patvirtinto GTŽV. Į tyrimą planuota įtraukti 100 pacientų. Įtraukimo kriterijai: 18 m. ir vyresni pacientai, sergantys GTŽV, gyvai supažindinti su tyrimu ir pasirašę informuoto asmens sutikimo dokumentą.

(15)

15 Neįtraukimo kriterijai: pacientai, kuriems patvirtintas kitos lokalizacijos navikas, psichikos ligomis sergantys asmenys, kiti pažeidžiami asmenys, nepasirašę sutikimo dalyvauti tyrime.

9.4 Tyrimo metodika

9.4.1 Apklausa

Pacientams, sutikusiems dalyvauti tyrime, buvo pateikiamas paruoštas klausimynas. Klausimynas suskirstytas į potemes: 1) bendri duomenys; 2) sveikata; 3) mityba; 4) alkoholio vartojimas (suvartotas alkoholio kiekis vertintas standartiniais vienetais (SV): 1 SV sudaro 0,33 l alaus ar 100 ml vyno, ar 40 ml degtinės); 5) svoris, ūgis ir fizinis aktyvumas. Papildomi duomenys apie ligą surinkti iš medicininių dokumentų.

9.4.2 Laboratorinis tyrimas

9.4.2.1 Kraujo ėminių rinkimas

Pacientų veninio kraujo ėminiai buvo rinkti į 10 ml vakuuminius mėgintuvėlius su antikoaguliantais. Mėginiai kaupti ir laikyti –20°C temperatūroje OML.

9.4.2.2 DNR išskyrimas

Prieš atliekant DNR išskyrimą, užšaldyti žmonių veninio kraujo ėminiai buvo atšildyti kambario temperatūroje. DNR iš mėginių išskirta silikagelio kolonėlių metodu, naudojant išgryninimo rinkinį „Tissue MiniPrep“ („ZYMO RESEARCH“): 2xDigestion buferis, Proteinazė K, lizės buferis, praplovimo buferis, plovimo buferis, eliucijos buferis, kolonėlės su silikageliu ir surinkimo mėgintuvėliai. Tyrimas atliktas pagal LSMU OI OML naudojamą protokolą [29]. Darbo eiga:

I. Ląstelių lizavimas

1. Į sterilų mėgintuvėlį, skirtą centrifugavimui įpilama 100µl kraujo, 95µl 2xDigestion buferio tirpalo ir 5µl proteinazės K. Sumaišoma.

(16)

16 2. 20 min. inkubuojama 55◦C temperatūroje.

3. Į mišinį įpilama 700µl lizės buferio. Sumaišoma. II. DNR išvalymas

1. Mišinys pernešamas ant Zymo–SpinTM IIC DNR išvalymo kolonėlės, įstatytos į skysčių

surinkimo mėgintuvėlį.

2. Centrifuguojama 10 000xg 1 min. Skysčių surinkimo mėgintuvėlis pakeičiamas nauju.

3. Ant DNR išvalymo kolonėlės užpilama 200µl DNR praplovimo buferio (DNA Pre–Wash Buffer).

4. Centrifuguojama 10 000xg 1 min. Skystis iš skysčių surinkimo mėgintuvėlio išpilamas ir DNR išvalymo kolonėlė vėl įstatoma į skysčių surinkimo mėgintuvėlį.

5. Ant DNR išvalymo kolonėlės užpilama 400µl g–DNR plovimo buferio (g–DNA Wash Buffer).

6. Centrifuguojama 10 000xg 1 min.

7. Skysčių surinkimo mėgintuvėlis pakeičiamas nauju steriliu centrifugavimo mėgintuvėliu. 8. Ant DNR išvalymo kolonėlės užpilama 100µl DNR išskyrimo buferio (Elution Buffer).

Inkubuojama kambario temperatūroje 5 min. 9. Centrifuguojama 12 000xg 30s.

10. Skystis (t.y. DNR) iš centrifuginio mėgintuvėlio perkeliamas į naują sterilų centrifugavimo mėgintuvėlį.

11. Mėginiai laikomi –20◦C temperatūroje.

9.4.2.3 Geno NQO1 609 (rs1800566) polimorfizmo nustatymas

Išskirtos DNR mėginiai panaudoti PGR atlikimui, siekiant pagausinti DNR sekos (NQO1 609 C>T) fragmentą. Tyrimas atliktas pagal LSMU OI OML naudojamus protokolus [29]. PGR reakcijai naudotos medžiagos nurodytos 1 lentelėje (į kiekvieną mėgintuvėlį supilta: 23μl mišinio ir 2μl genominės DNR), PGR reikalingi pradmenys – 2 lentelėje [20], PGR programa geno pagausinimui – 3 lentelėje (gautas 195 bp produktas). Geno NQO1 609 C>T variantai identifikuoti RFIP metodu. RFIP naudotas fermentas – HinfI restrikcijos endonukleazė. Šis fermentas PGR metu gautą 195 bp produktą kerpa per T alelį į 119 ir 76 bp fragmentus, o C alelis lieka neperkirptas – 195 bp fragmentas. Kitos RFIP mišinio sudedamosios dalys nurodytos 4 lentelėje (į kiekvieną mėgintuvėlį įpilta: 5,5 μl mišinio ir 10 μl PGR produkto. Inkubuota 37°C temperatūroje 2-3 val.).

(17)

17 1 lentelė. PGR mišinio sudėtis

Medžiaga Medžiagos kiekis 1 mėginiui (μl)

H2O 18,15

10x DreamTaq polimerazės buferis 2,5

DMSO 1

dNTP (0,2 mM) 0,5

adipoF pradmuo (20 pmol) 0,3

adipoR pradmuo (20 pmol) 0,3

DreamTaq polimerazė (5u/µl) 0,25

2 lentelė. Pradmenys geno NQO1 609 C>T polimorfizmo nustatymui

Pradmuo Pradmens seka

Tiesioginis – NQO1-F 5‘-AAG CCC AGA CCA ACT TCT-3‘ Atvirkštinis – NQO1-R 5‘-GCG TTT CTT CCA TCC TTC-3‘

3 lentelė. PGR programa geno NQO1 609 C>T pagausinimui Temperatūra °C Laikas Ciklų skaičius

95 5 min - 95 0,5 min 35 ciklai 58 0,5 min 72 0,5 min 72 5 min -

4 lentelė. RFIP mišinio sudėtis NQO1 609 C>T polimorfizmo nustatymui Medžiaga Medžiagos kiekis 1 mėginiui (μl)

H2O 3,75

10x Buferis 1

(18)

18 9.4.2.4 Elektroforezė

DNR bei jos fragmentų atskyrimui pagal jų dydį ir krūvį naudotas gelių elektroforezės metodas. Tyrimas atliktas pagal LSMU OI OML naudojamą protokolą. DNR elektroforezės agarozės gelyje eiga:

1. Elektroforezės buferio (1xTBE buferiu) paruošimas: 50 ml10xTBE buferio atskiestas su 450 ml distiliuoto H2O.

2. 2% agarozės gelio paruošimas: į kolbą suberta 0,5 g agarozės miltelių ir užpilta 25 ml 1xTBE buferio. Mišinys sumaišytas ir kaitintas mikrobangų krosnelėje. Kai tirpalas tapo skaidrus – gelis ištrauktas ir atvėsintas.

3. Į atvėsusį gelį įpilta 2,5 μl etidžio bromido tirpalo, sumaišyta.

4. Paruoštas gelis supiltas į rėmelį su šukutėmis. Geliui sustingus ištrauktos šakutės. Rėmelis su geliu panardintas į elektroforezės vonelę, užpildytą 1xTBE buferiu.

5. Į kiekvieną šulinėlį įpilta 10 μl PGR mišinio sumaišyto su 2 μl DNR užnešimo dažo „6X DNA

loading dye”.

6. Elektroforezė vykdyta 30 min, esant 90V įtampai.

7. Elektroforezės metu gauti fragmentų ilgiai (T alelis perkirptas į 119 ir 76 bp fragmentus; esant C aleliui stebimas 195 bp fragmentas) įvertinti ultravioletinėje šviesoje, naudojant Cleaver

(19)

19 2 pav. NQO1 609 polimorfizmo nustatymo elektroforegramos

Pastaba: numeracija 1-81 – tiriamųjų numeriai. 1 takelis – DNR molekulinės masės žymuo „GeneRulerTM Ultra Low range“ („Thermo Fisher Scientific“). 195 bp – CC alelis, 119 ir 76

bp – TT alelis, 195 ir 119 ir 76 bp – CT alelis.

9.5 Duomenų analizės metodai

Duomenų analizei naudotas IBM SPSS 23 programinis paketas. Kiekybiniai požymiai aprašyti nurodant vidurkį (vid.), standartinį nuokrypį (SD), minimumą (min.) ir maksimumą (maks.). Lyginamosiose grupėse kokybinių požymių reikšmių pasiskirstymo homogeniškumas tikrintas taikant χ² nepriklausomumo kriterijų. Rezultatai aprašyti, pateikiant reikšmių dažnį ir procentinę išraišką. Kokybinių dydžių ryšiui nustatyti naudotas Pearson χ² testas. Ryšys ir skirtumas laikytas statistiškai reikšmingu, kai p<0,05.

(20)

20

10. REZULTATAI

10.1 Tiriamųjų charakteristika

Tiriamųjų grupę sudarė 81 žmogus: vyrų 50 (61,7 proc.), moterų 31 (38,3 proc.). Tiriamųjų amžiaus vid. 62,5 (10,6) m., min. – 34 m., maks. – 84 m. Gaubtinės žarnos vėžiu sirgo 43 (53,1 proc.) pacientai, tiesiosios žarnos vėžiu – 38 (46,91 proc.).

10.2 Demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumų sąsajos su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose

10.2.1 Demografinių ypatumų sąsajos

Pacientų su neišplitusia į sritinius limfmazgius liga grupėje daugiau buvo vyrų (56,6 proc.) nei moterų (43,4 proc.) (5 lentelė). N1-2 grupėje taip pat daugiau buvo vyrų. Tačiau šis ryšys nėra statistiškai reikšmingas.

5 lentelė. Metastazių sritiniuose limfmazgiuose dažnio pasiskirstymas, atsižvelgiant į lytį Lytis Metastazės sritiniuose limfmazgiuose Vyras Moteris p N0 (n=53, 100 proc.) 30 (56,6) 23 (43,4) 0,337* N1-2 (n=25, 100 proc.) 17 (68) 8 (32) *χ² nepriklausomumo kriterijus

Pastaba: n – pacientų skaičius; N0 – neišplitusi į sritinius limfmazgius liga; N1-2 – išplitusi į sritinius limfmazgius liga

Vertinant šeiminės padėties sąsajas su ligos išplitimu pastebėta, kad N0 grupėje daugiau buvo ne vienišų (67 proc.) nei vienišų (6 lentelė). Tačiau šis ryšys nėra statistiškai reikšmingas.

(21)

21 6 lentelė. Metastazių sritiniuose limfmazgiuose dažnio pasiskirstymas, atsižvelgiant į šeiminę padėtį

Šeiminė padėtis Metastazės sritiniuose limfmazgiuose Ne vienišas n (proc.) Vienišas n (proc.) p N0 (n=52, 100 proc.) 35 (67,3) 17 (32,7) 0,435* N1-2 (n=25, 100 proc.) 19 (76) 6 (24) *χ² nepriklausomumo kriterijus

10.2.2 Mitybos ypatumų sąsajos

Metastazių sritiniuose limfmazgiuose dažnio pasiskirstymas, atsižvelgiant į žuvies vartojimą, pateiktas 7 lentelėje.

7 lentelė. Metastazių sritiniuose limfmazgiuose dažnio pasiskirstymas, atsižvelgiant į žuvies vartojimą Žuvies vartojimas Metastazės sritiniuose limfmazgiuose Nevartoja n (proc.) Vartoja n (proc.) p N0 (n=48, 100 proc.) 3 (6,2) 45 (93,8) 0,023* N1-2 (n=24, 100 proc.) 6 (25) 18 (75) *χ² nepriklausomumo kriterijus

Žuvį vartojo 88 proc. pacientų. Neišplitęs į sritinius limfmazgius GTŽV statistiškai reikšmingai dažniau nustatytas vartojantiems žuvį (94 proc.), nei nevartojantiems (6 proc.).

Logistinė regresinė analizė parodė, kad nevartojantiems žuvies pacientams yra 5 kartus didesnė tikimybė, kad bus nustatyta į sritinius limfmazgius išplitusi liga (8 lentelė).

8 lentelė. Į sritinius limfmazgius išplitusio GTŽV prognozavimas, atsižvelgiant į žuvies nevartojimą

Metastazės sritiniuose limfmazgiuose

β GS 95 proc. PI p

N1-2 1,609 5 1,13–22,18 0,034**

(22)

22 10.2.3 Gyvenimo būdo ypatumų sąsajos

77 proc., tiriamųjų nurodė, kad vartoja alkoholį, neatsižvelgiant į alkoholio vartojimo dažnumą. Tačiau alkoholio vartojimo reikšmė GTŽV metastazavimui į sritinius limfmazgius nenustatyta (p=0,664) (9 lentelė).

9 lentelė. Metastazių sritiniuose limfmazgiuose dažnio pasiskirstymas, atsižvelgiant į alkoholio vartojimą Alkoholio vartojimas Metastazės sritiniuose limfmazgiuose Nevartoja n (proc.) Vartoja n (proc.) p N0 (n=49, 100 proc.) 12 (24,5) 37 (75,5) 0,664* N1-2 (n=25, 100 proc.) 5 (20) 20 (80) *χ² nepriklausomumo kriterijus

61 proc., tiriamųjų KMI ≤30 (kg/m2), tačiau KMI reikšmė GTŽV metastazavimui į sritinius limfmazgius nenustatyta (p=0,897) (10 lentelė).

10 lentelė. Metastazių sritiniuose limfmazgiuose dažnio pasiskirstymas, atsižvelgiant į kūno masės indeksą KMI (kg/m2₎ Metastazės sritiniuose limfmazgiuose ≤30 n (proc.) >30 n (proc.) p N0 (n=47, 100 proc.) 32 (68,1) 15 (31,9) 0,897* N1-2 (n=30, 100 proc.) 20 (66,7) 10 (33,3) *χ² nepriklausomumo kriterijus

Pastaba: n – pacientų skaičius; N0 – neišplitusi į sritinius limfmazgius liga; N1-2 – išplitusi į sritinius limfmazgius liga; KMI – kūno masės indeksas.

78 proc., tiriamųjų nurodė, kad per parą sėdi mažiau nei 7 h. Tačiau sėdėjimo trukmės reikšmė GTŽV metastazavimui į sritinius limfmazgius nenustatyta (p=0, 164) (11 lentelė).

Pastaba: β – logistinės regresijos koeficientas; GS-galimybių santykis; PI – pasikliautinas intervalas; N0 – neišplitusi į sritinius limfmazgius liga.

(23)

23 11 lentelė. Metastazių sritiniuose limfmazgiuose dažnio pasiskirstymas, atsižvelgiant į laiką

praleistą sėdint

Laikas praleistas sėdint (h) Metastazės sritiniuose limfmazgiuose < 7 n (proc.) ≥7 n (proc.) p N0 (n=50, 100 proc.) 35 (83,3) 7 (16,7) 0,164* N1-2 (n=14, 100 proc.) 15 (86,2) 7 (31,8) *χ² nepriklausomumo kriterijus

10.3 Geno NQO1 609 polimorfizmų sąsajos su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius

Laboratorinio tyrimo metu ištirti NQO1 609 geno polimorfizmai ir nustatyti genotipai: CC nustatytas 52 (64,2 proc.) tiriamiesiems, CT – 27 (33,3 proc.), TT – 2 (2,5 proc.). Remiantis literatūros duomenimis, kad T alelis siejamas su sumažėjusiu fermento aktyvumu, CT ir TT genotipo turėtojai sujungti į vieną CT/TT grupę, kurioje buvo 29 (35,8 proc.) tiriamųjų.

Geno NQO1 609 polimorfizmų dažnio pasiskirstymas, atsižvelgiant į metastazių buvimą sritiniuose limfmazgiuose pateiktas 12 lentelėje.

12 lentelė. Geno NQO1 609 polimorfizmų dažnio pasiskirstymas, atsižvelgiant į metastazių buvimą sritiniuose limfmazgiuose Geno NQO1 609 polimorfizmai Metastazės sritiniuose limfmazgiuose CC n (proc.) CT/TT n (proc.) p N0 (n= 53, 100 proc.) 39 (73,6) 14 (26,4) 0,01* N1-2 (n=25, 100 proc.) 11 (44,0) 14 (56,0) *χ² nepriklausomumo kriterijus

N0 grupėje statistiškai reikšmingai dažniau nustatytas CC polimorfizmas (73,6 proc.), o N1-2 grupėje –CT/TT polimorfizmai (56 proc.) (p=0,01).

Panaudojus logistinės regresijos prognozavimo modelį nustatyta, kad N0 yra 3,5 karto labiau tikėtina nei N1-2, esant CC polimorfizmui (13 lentelė). Tikėtina, kad 78 proc. pacientų, turinčių CC

(24)

24 polimorfizmą bus nustatyta N0, o 22 proc. – N1-2. Turintiems CT/TT polimorfizmus ligos išplitimo į sritinius limfmazgius tikimybė yra tolygi (50 proc.).

10.4 Demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumų įtaka NQO1 609 atskirų polimorfizmų sąsajai su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose

Siekiant įvertinti ar demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumai turi įtakos NQO1

609 atskirų polimorfizmų sąsajai su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose, atlikta

pogrupių analizė.

10.4.1 Demografinių ypatumų reikšmė

Lyties ir geno NQO1 609 polimorfizmų sąsajos su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius pateiktos 14 lentelėje.

Tiriamųjų didžiąją dalį sudarė vyrai (vyrų – 60 proc., moterų – 40 proc.). Vyrų grupėje neišplitusi į sritinius limfmazgius liga buvo dažniau nustatyta pacientams, kurie turėjo CC polimorfizmą (80 proc.), lyginant su moterų grupe, kurioje CC polimorfizmas buvo nustatytas rečiau (65 proc.). Moterims, turinčioms CC polimorfizmą tolygiai buvo nustatytas tiek išplitęs, tiek neišplitęs į sritinius limfmazgius GTŽV. Taigi, NQO1 609 polimorfizmų reikšmė, prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius, yra statistiškai reikšminga tik vyrams (p=0,002). 80 proc. vyrų, kuriems buvo nustatytas N0, turėjo CC polimorfizmą. 65 proc. vyrų, kuriems buvo nustatytas N1-2, turėjo CT/TT polimorfizmą.

13 lentelė. Į sritinius limfmazgius neišplitusio GTŽV prognozavimas, atsižvelgiant į geno NQO1 609 CC polimorfizmą

Metastazės sritiniuose limfmazgiuose

β GS 95 proc. PI p

N0 1,2 3,54 1,31–9,62 0,013**

** Dvinarės logistinės regresijos modelis

Pastaba: β – logistinės regresijos koeficientas; GS-galimybių santykis; PI – pasikliautinas intervalas; N0 – neišplitusi į sritinius limfmazgius liga.

(25)

25 14 lentelė. Lyties įtaka NQO1 609 polimorfizmų sąsajai su ligos išplitimu į sritinius limfmazgius

Geno NQO1 609 polimorfizmas Veiksnys Metastazės sritiniuose

limfmazgiuose CC (proc.) CT/TT n (proc.) p Lytis Vyras N0 (n=30, 100 proc.) 24 (80) 6 (20) 0,002* N1-2 (n=17, 100 proc.) 6 (35,3) 11 (64,7) Moteris N0 (n=23, 100 proc.) 15 (65,2) 8 (34,8) 0,890* N1-2 (n=8, 100 proc.) 5 (62,5) 3 (37,5) *χ² nepriklausomumo kriterijus

Šeiminės padėties ir geno NQO1 609 polimorfizmų sąsajos su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius pateiktos 15 lentelėje.

15 lentelė. Šeiminės padėties įtaka NQO1 609 polimorfizmų sąsajai su ligos išplitimu į sritinius limfmazgius

limfmazgiuose CC (proc.) CT/TT n (proc.) p Šeiminė padėtis Ne vienišas N0 (n=35, 100 proc.) 25 (71,4) 10 (28,6) 0,035* N1-2 (n=19, 100 proc.) 8 (42,1) 11 (57,9) Vienišas N0 (n=17, 100 proc.) 13 (76,5) 4 (23,5) 0,226* N1-2 (n=6, 100 proc.) 3 (50) 3 (50) *χ² nepriklausomumo kriterijus

Tiriamųjų didžiąją dalį sudarė ne vieniši asmenys (ne vienišų – 70 proc., vienišų – 30 proc.). Ne vienišų pacientų grupėje neišplitusi į sritinius limfmazgius liga buvo rečiau nustatyta pacientams, kurie turėjo CC polimorfizmą (71 proc.), lyginant su vienišų grupe, kurioje CC polimorfizmas nustatytas dažniau (77 proc.). NQO1 609 polimorfizmų reikšmė, prognozuojant GTŽV išplitimą į

(26)

26 sritinius limfmazgius yra statistiškai reikšminga tik ne vienišiems pacientams (p=0,035). 71 proc. ne vienišų pacientų, kuriems buvo nustatytas N0, turėjo CC polimorfizmą. 58 proc. pacientų, kuriems buvo nustatytas N1-2, turėjo CT/TT polimorfizmą.

Panaudojus logistinės regresijos prognozavimo modelį nustatyta, kad 74 proc. ne vienišų vyrų, turinčių CC polimorfizmą, bus nustatytas N0. 55 proc. ne vienišų vyrų, turinčių CT/TT polimorfizmą, bus nustatytas N1-2.

10.4.2 Mitybos ypatumų reikšmė

Žuvies valgymo ypatumų ir geno NQO1 609 polimorfizmų sąsajos su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius pateiktos 16 lentelėje.

16 lentelė. Žuvies valgymo ypatumų įtaka NQO1 609 polimorfizmų sąsajai su ligos išplitimu į sritinius limfmazgius

limfmazgiuose CC n (proc.) CT/TT n (proc.) p

Žuvies valgymas (dienų skaičius per savaitę)

Niekada N0 (n=3, 100 proc.) 2 (66,7) 1 (33,3) 1* N1-2 (n=6, 100 proc.) 3 (50) 3 (50) 1-2 N0 (n=37, 100 proc.) 29 (78,4) 8 (21,6) 0,015* N1-2 (n=14, 100 proc.) 6 (42,9) 8 (57,1) 3-5 N0 (n=7, 100 proc.) 5 (71,4) 2 (28,6) 0,576* N1-2 (n=4, 100 proc.) 2 (50) 2 (50) 6-7 N0 (n=1, 100 proc.) 1 (100) *χ² nepriklausomumo kriterijus

Žuvį vartojančių 1-2 k./sav. grupėje išplitusi į sritinius limfmazgius liga buvo rečiau nustatyta pacientams, kurie turėjo CC polimorfizmą (43 proc.), lyginant su žuvies nevartojančių grupe, kurie turėjo CT/TT polimorfizmą (50 proc.). Tačiau NQO1 609 polimorfizmų reikšmė prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius yra statistiškai reikšminga tik tada, kai žuvis vartojamas 1-2d. per

(27)

27 savaitę (p=0,015). Tokiu dažniu žuvį vartojo 70 proc. tiriamųjų. Esant šiam veiksniui 78 proc. pacientų, kuriems buvo nustatytas N0, turėjo CC polimorfizmą. 57 proc. pacientų, kuriems buvo nustatytas N1-2, turėjo CT/TT polimorfizmą.

10.4.3 Gyvenimo būdo ypatumų reikšmė

Alkoholio (6 SV ar daugiau) vartojimo ir geno NQO1 609 polimorfizmų sąsajos su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius pateiktos 17 lentelėje.

Alkoholį vartojančių <1k./mėn. grupėje išplitusi į sritinius limfmazgius liga buvo rečiau nustatyta pacientams, kurie turėjo CC polimorfizmą (30 proc.), lyginant su alkoholį vartojančių 1k./mėn. grupe, kurie turėjo CT/TT polimorfizmą (57 proc.). Tačiau NQO1 609 polimorfizmų reikšmė prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius yra statistiškai reikšminga tik tada, kai alkoholis vartojamas rečiau nei kartą per mėnesį (p=0,018). Tokiu dažniu alkoholį vartojo 41 proc. tiriamųjų. Esant šiam veiksniui 75 proc. pacientų, kuriems buvo nustatytas N0, turėjo CC polimorfizmą. 70 proc. pacientų, kuriems buvo nustatytas N1-2, turėjo CT/TT polimorfizmą.

17 lentelė. Alkoholio vartojimo ypatumų įtaka NQO1 609 polimorfizmų sąsajai su ligos išplitimu į sritinius limfmazgius

6 SV ir daugiau alkoholio vartojimas

Niekada N0 (n=12, 100 proc.) 8 (66,7) 4 (33,3) 1* N1-2 (n=5, 100 proc.) 3 (60) 2 (40) < 1 k./mėn N0 (n=20, 100 proc.) 15 (75) 5 (25) 0,018* N1/N2 (n=10, 100 proc.) 3 (30) 7 (70) 1 k./mėn. N0 (n=12, 100 proc.) 10 (83,3) 2 (16,7) 0,129* N1-2 (n=7, 100 proc.) 3 (42,9) 4 (57,1) 1 k./sav. N0 (n=5, 100 proc.) 3 (60) 2 (40) 1* N1-2 (n=2, 100 proc.) 2 (100) *χ² nepriklausomumo kriterijus

Pastaba: n – pacientų skaičius; N0 – neišplitusi į sritinius limfmazgius liga; N1-2 – išplitusi į sritinius limfmazgius liga; SV – standartiniai vienetai

(28)

28 KMI ir geno NQO1 609 polimorfizmų sąsajos su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius pateiktos 18 lentelėje.

Pacientų su mažesniu nei 30 kg/m2_{KMI grupėje išplitusi į sritinius limfmazgius liga buvo} rečiau nustatyta pacientams, kurie turėjo CC polimorfizmą (33 proc.), lyginant su pacientų turinčių didesnį nei 30 kg/m2_{KMI grupe, kurie turėjo CT/TT polimorfizmą (40 proc.). Tačiau NQO1 609} polimorfizmų reikšmė prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius yra statistiškai reikšminga tik tada, kai KMI mažesnis nei 30 kg/m2_{(p=0,012). Mažesnį nei 30 kg/m}2_{KMI turėjo 61} proc. pacientų. Esant šiam veiksniui 72 proc. pacientų, kuriems buvo nustatytas N0, turėjo CC polimorfizmą. 67 proc. pacientų, kuriems buvo nustatytas N1-2, turėjo CT/TT polimorfizmą.

Panaudojus logistinės regresijos prognozavimo modelį nustatėme, kad jei paciento KMI ≤30 kg/m2 ir jis turi genotipą CC, tai yra 79 proc. tikimybė jog bus nustatytas N0. Jei žmogaus genotipas CT/TT – tikimybė, kad bus nustatytas N1-2 yra 48 proc.

18 lentelė. Kūno masės indekso įtaka NQO1 609 polimorfizmų sąsajai su ligos išplitimu į sritinius limfmazgius

limfmazgiuose CC n (proc.) CT/TT n (proc.) p KMI (kg/m2) ≤30 N0 (n=32, 100 proc.) 23 (71,9) 9 (28,1) 0,012* N1-2 (n=15, 100 proc.) 5 (33,3) 10 (66,7) >30 N0 (n=20, 100 proc.) 15 (75) 5 (25) 0,398* N1-2 (n=10, 100 proc.) 6 (60) 4 (40) *χ² nepriklausomumo kriterijus

Pastaba: n – pacientų skaičius; N0 – neišplitusi į sritinius limfmazgius liga; N1-2 – išplitusi į sritinius limfmazgius liga; KMI – kūno masės indeksas.

Laiko praleisto sėdint ir geno NQO1 609 polimorfizmų sąsajos su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius pateiktos 19 lentelėje.

Pacientų per parą sėdinčių mažiau nei 7 val. grupėje išplitusi į sritinius limfmazgius liga buvo rečiau nustatyta pacientams, kurie turėjo CC polimorfizmą (47 proc.), lyginant su ilgiau nei 7 val. sėdinčių pacientų grupe, kurie turėjo CT/TT polimorfizmą (57 proc.). Tačiau NQO1 609 polimorfizmų reikšmė prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius yra statistiškai reikšminga tik tada, kai pacientai per parą sėdi mažiau nei 7 val. (p=0,034). Kad per parą sėdi trumpiau nei 7 val., nurodė 77

(29)

29 proc. pacientų. Esant šiam veiksniui 77 proc. pacientų, kuriems buvo nustatytas N0, turėjo CC polimorfizmą. 53 proc. pacientų, kuriems buvo nustatytas N1-2, turėjo CT/TT polimorfizmą.

19 lentelė. Laiko praleisto sėdint įtaka NQO1 609 polimorfizmų sąsajai su ligos išplitimu į sritinius limfmazgius

Laikas per dieną, praleistas sėdint (h)

<7 N0 (n=35, 100 proc.) 27 (77,1) 8 (22,9) 0,034* N1-2 (n=15, 100 proc.) 7 (46,7) 8 (53,3)

≥7 N0 (n=7, 100 proc.) 4 (57,1) 3 (42,9) 1*

N1-2 (n=7, 100 proc.) 3 (42,9) 4 (57,1) *χ² nepriklausomumo kriterijus

(30)

30

11. REZULTATŲ APTARIMAS

Šio tyrimo metu buvo analizuota geno NQO1 609 polimorfizmų įtaka, prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius, atsižvelgiant į demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumus. Tyrimu tikrinta mokslinė hipotezė ar geno NQO1 609 polimorfizmai susiję su prognoziniu veiksniu – sritinių limfmazgių pažeidimu, jei taip – ar šiam ryšiui gali turėti įtakos demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumai.

Nagrinėjant mitybos įtaką, prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius, nustatyta, jog žuvies nevartojantiems pacientams 5 kartus didesnė tikimybė, kad bus nustatytas N1-2 (p=0,034). Tyrimų, nagrinėjančių žuvies valgymo įtaką metastazavimui į sritinius limfmazgius, neaptikome, todėl mechanizmas neaiškus. Tačiau moksliškai įrodyta, kad žuvyje esančios omega–3 polinesočiosios riebalų rūgštys skatina ląstelių apoptozę ir slopina NF–κB gamybą, kuris siejamas su ląstelių invazyvumu [8,9]. Demografinių bei gyvenimo būdo ypatumų reikšmingų sąsajų su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius nenustatyta.

Fermentas NQO1 pripažintas svarbiu priešvėžiniu fermentu. NQO1 apsaugo ląsteles nuo oksidacinio streso, stabilizuoja onkosupresinius baltymus, tokius kaip p53 ir p73α [21]. Geno NQO1

609 mutacija yra genetinis rizikos faktorius vėžio išsivystymui [24]. Įvykus VNP mutacijai pakinta

fermento funkcinės srities vieta. Tai nulemia fermento NQO1 aktyvumo sumažėjimą žmonėms, turintiems genotipą CT ir TT [21]. Anot tyrimų, T alelio turėtojams rizika sirgti GTŽV padidėja 2,13 karto (p<0,001) [20].

Literatūros duomenimis NQO1 609 polimorfizmų dažnis skiriasi, priklausomai nuo rasės, lyties ir kitų veiksnių. Sergantiems GTŽV CC polimorfizmas nustatomas 24–64 proc., CT – 32–53 proc., TT – 3,4–23 proc. pacientų. Atliktuose atvejo – kontrolės tyrimuose pastebėta, kad sveikiems pacientams dažniau nustatomas CC polimorfizmas – 40–70 proc. (siejamas su mažesne rizika sirgti vėžiu), o kiti polimorfizmai nustatomi rečiau, lyginant su sergančiais: CT – 26–45 proc., TT – 3,3–15 proc. žmonių [20;30]. Mūsų tyrimo metu GTŽV sergantiems pacientams polimorfizmų dažniai buvo: CC – 64,2 proc., CT – 33,3 proc., TT – 2,5 proc. Atsižvelgiant į literatūros duomenis, 36 proc. mūsų tirtų pacientų turėjo padidėjusią riziką sirgti GTŽV, o 64 proc. – mažesnę. Tai, jog didžioji dalis turėjo su mažesne rizika siejamą genotipą, bet vis tiek sirgo GTŽV, leidžia daryti prielaidą, kad gyvenimo būdo keitimas didžiajai daliai pacientų galėtų turėti ženklią prevencinę naudą.

Remiantis įrodymais, kad T alelis siejamas su didesne rizika sirgti GTŽV, o C – su mažesne, kėlėme hipotezę ar NQO1 609 polimorfizmai susiję su ligos išplitimu sritiniuose limfmazgiuose. Nepavyko aptikti mokslinių tyrimų, nagrinėjančių NQO1 609 polimorfizmų reikšmę, prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius. Šio tyrimo metu nustatėme, kad CC polimorfizmas

(31)

31 reikšmingai dažniau susijęs su neišplitusia į sritinius limfmazgius liga (73,6 proc.), o CT/TT polimorfizmas – su išplitusia į sritinius limfmazgius liga (56 proc.) (p=0,01). Turintiems CC polimorfizmą 3,5 karto dažniau nustatyta N0, lyginant su N1-2 (p=0,013). Tai reiškia, kad CC polimorfizmas susijęs ne tik su mažesne rizika sirgti GTŽV, bet ir su mažesne tikimybe, kad jau sergant GTŽV, bus nustatyta išplitusi į sritinius limfmazgius liga.

Vertindami NQO1 609 polimorfizmų sąsajas su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius nustatėme, kad šios sąsajos išlieka reikšmingos tik esant tam tikriems demografiniams, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumams.

Nagrinėjant demografinių ypatumų įtaką nustatėme, kad NQO1 609 polimorfizmai reikšmingi prognozuojant įšplitimą į sritinius limfmazgius tik vyrams (p=0,002), lyginant su moterimis ir tiems, kurie nurodė, jog gyvena ar gyveno su partneriu (p=0,035), lyginant su visą gyvenimą buvusiais vienišais. Nustatėme, kad 74 proc. ne vienišų vyrų, turinčių CC polimorfizmą, tikėtinas N0. 55 proc. ne vienišų vyrų, turinčių CT/TT polimorfizmą, tikėtinas N1-2.

Nagrinėjant mitybos ypatumus nustatėme, kad CC polimorfizmas susjięs su neišplitusia į sritinius limfmazgius liga tiems pacientams, kurie nurodė, jog žuvį valgo1–2 dienas per savaitę (p=0,015). Kitokius mitybos įpročius turintiems pacientams NQO1 polimorfizmai neturėjo statistiškai reikšmingos diagnostinės prasmės.

Gyvenimo ypatumų analizė parodė, kad CC polimorfizmas susjięs su neišplitusia į sritinius limfmazgius liga tiems pacientams, kurie alkoholį (6 SV ar daugiau) vartoja rečiau nei kartą per mėnesį (p=0,018), vidutiniškai sėdi mažiau nei 7 valandas per parą (p=0,034), o KMI mažiau nei 30 kg/m2 (p=0,012). Nustatėme, kad jei paciento KMI ≤30 kg/m2 ir jis turi genotipą CC, tai yra 79 proc. tikimybė, jog bus nustatytas N0. Jei žmogaus genotipas CT/TT – tikimybė, kad bus nustatytas N1-2 yra 48 proc.

Taigi, tyrimas parodė, kad pagal NQO1 609 polimorfizmus galima prognozuoti ligos išplitimą į sritinius limfmazgius (CC polimorfizmas – N0, CT/TT – N1-2), tačiau prognostinė reikšmė priklauso nuo epigenetinių veiksnių. Moteriška lytis, vienišas gyvenimo būdas, retas žuvies vartojimas, dažnesnis alkoholio vartojimas, nutukimas ir sėslus gyvenimo būdas keičia genetiškai nulemtą teigiamą CC polimorfizmo reikšmę, prognozuojant neišplitusią į sritinius limfmazgius ligą. Reikalingi detalesni tyrimai, siekiant išsiaiškinti, kodėl ir kaip NQO1 609 polimorfizmų sąsajos su GTŽV išplitimu į sritinius limfmazgius išnyksta priklausomai nuo epigenetinių veiksnių.

(32)

32

12. IŠVADOS

1. Išnagrinėjus demografinių, mitybos bei gyvenimo būdo ypatumų sąsajas su limfmazgiu būkle nustatytas reikšmingas ryšys tik su žuvies vartojimu: nevartojant žuvies penkis kartus didesnė tikimybė nustatyti į sritinius limfmazgius išplitusį GTŽV.

2. Geno NQO1 609 polimorfizmai susiję su GTŽV metastazių nustatymu sritiniuose limfmazgiuose: esant CC polimorfizmui 3,5 karto mažesnė tikimybė nustatyti išplitusį į sritinius limfmazgius GTŽV.

3. Epigenetiniai veiksniai turi neigiamą reikšme prognozuojant GTŽV išplitimą į sritinius limfmazgius.

(33)

33

13. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Fact Sheets by Cancer [Internet]. Globocan.iarc.fr. 2017 [cited 25 March 2017]. Available from: http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx .

2. Sierra MS, Forman D (2016). Etiology of colorectal cancer (C18-20) in Central and South America. In: Cancer in Central and South America. Lyon: International Agency for Research on Cancer. [cited 25 March 2017]. Available from: http://www-dep.iarc.fr/CSU_resources.htm, accessed .

3. Valuckas K P, Didžiapetrienė J, Uleckienė S ir kt. Storosios žarnos vėžys: situacija ir ateities perspektyvos. Medicinos teorija ir praktika. 2009; 15(2): 100-105.

4. Lajin B, Alachkar A. The NQO1 polymorphism C609T (Pro187Ser) and cancer susceptibility: a

comprehensive meta-analysis. British Journal of Cancer. 2013; 109(5):1325-1337.

5. Andres A, Majno P, Terraz S, et al. Management of patients with colorectal liver metastasis in eleven questions and answers. Expert Review of Anticancer Therapy. 2016;16(12):1277-1290.

6. Brown JC, Winters-Stone K, Lee A, Schmitz KH. Cancer, Physical Activity, and

Exercise. Comprehensive Physiology. 2012;2(4):2775-2809.

7. Online Analysis [Internet]. Globocan.iarc.fr. 2017 [cited 25 March 2017]. Available from: http://globocan.iarc.fr/Pages/online.aspx

8. Xu M, Fang Y-J, Chen Y-M, et al. Higher freshwater fish and sea fish intake is inversely associated with colorectal cancer risk among Chinese population: a case-control study. Scientific Reports. 2015;5:12976.

9. Engeset D, Braaten T, Teucher B, et al. Fish consumption and mortality in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition cohort. European Journal of Epidemiology. 2015;30(1):57-70.

10. Cai S, Li Y, Ding Y, et. al. Alcohol drinking and the risk of colorectal cancer death. European Journal of Cancer Prevention. 2014;23(6):532-539.

11. Fedirko V, Tramacere I, Bagnardi V, et al. Alcohol drinking and colorectal cancer risk: an overall and dose-response meta-analysis of published studies. Annals of Oncology. 2011;22(9):1958-1972.

12. Koken T, Gursoy F, Kahraman A. Long-term Alcohol Consumption Increases Pro-Matrix Metalloproteinase-9 Levels via Oxidative Stress. Journal of Medical Toxicology. 2010;6(2):126-130.

13. Murphy N, Cross AJ, Abubakar M, et al. A Nested Case–Control Study of Metabolically Defined Body Size Phenotypes and Risk of Colorectal Cancer in the European Prospective

(34)

34 Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC). Beck AH, ed. PLoS Medicine. 2016;13(4):e1001988.

14. Lee J, Meyerhardt JA, Giovannucci E, Jeon JY. Association between Body Mass Index and Prognosis of Colorectal Cancer: A Meta-Analysis of Prospective Cohort Studies. Gao L, ed. PLoS ONE. 2015;10(3):e0120706.

15. Tandon K, Imam M, Ismail BES, Castro F. Body mass index and colon cancer screening: The road ahead. World Journal of Gastroenterology : WJG. 2015;21(5):1371-1376.

16. Chan AT, Giovannucci EL. Primary Prevention of Colorectal Cancer. Gastroenterology. 2010;138(6):2029-2043.e10.

17. Yamauchi M, Lochhead P, Imamura Y, et al. Physical Activity, Tumor PTGS2 Expression, and Survival in Patients with Colorectal Cancer. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 2013;22(6):1142-1152.

18. Kučinskas V. Genetikos ir genomikos pagrindai. Vadovėlis. Vilniaus universitetas. Vilnius: Vilniaus universiteto leidykla, 2013. 115-128.

19. NQO1 NAD(P)H quinone dehydrogenase 1 [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI [Internet].

Ncbi.nlm.nih.gov. 2017 [cited 22 March 2017]. Available from:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1728.

20. Peng X, Jiang Y, Shi X, Hu Z. NQO1 609C>T polymorphism interaction with tobacco smoking and alcohol drinking increases colorectal cancer risk in a Chinese population. Gene. 2013;521(1):105-110.

21. Medina-Carmona E, Neira JL, Salido E, et al. Site-to-site interdomain communication may

mediate different loss-of-function mechanisms in a cancer-associated NQO1

polymorphism. Scientific Reports. 2017;7:44532.

22. Agúndez JAG, García-Martín E, Martínez C, et al. NQO1 gene rs1800566 variant is not associated with risk for multiple sclerosis. BMC Neurology. 2014;14:87.

23. Oh E-T, Park HJ. Implications of NQO1 in cancer therapy. BMB Reports. 2015;48(11):609-617. 24. Lajin B, Alachkar A. The NQO1 polymorphism C609T (Pro187Ser) and cancer susceptibility: a

comprehensive meta-analysis. British Journal of Cancer. 2013;109(5):1325-1337.

25. Liu H, Zhou S, Ma L, et al. Genetic association of NQO1 609C>T polymorphism with risk of gastrointestinal cancer: evidence from case-control studies. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2015;8(4):6046-6052.

26. Yanling H, Yuhong Z, Wenwu H, Lei X, Mingwu C. NQO1 C609T polymorphism and esophageal cancer risk: a HuGE review and meta-analysis. BMC Medical Genetics. 2013;14:31.

(35)

35 27. Medina-Carmona E, Neira JL, Salido E, et al. Site-to-site interdomain communication may

mediate different loss-of-function mechanisms in a cancer-associated NQO1

polymorphism. Scientific Reports. 2017;7:44532.

28. Grabauskas V, Klumbienė J, Petkevičienė J irk t. Suaugusių Lietuvos žmonių gyvensenos tyrimas, 2012. Kaunas: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Medicinos akademija. 2013. 29. Ambrasienė D. Molekulinės biologijos praktikumas. Kaunas: Vytauto Didžiojo universitetas.

2008.

30. Tijhuis MJ, Visker MH, Aarts JM, et all.. NQO1 and NFE2L2 polymorphisms, fruit and vegetable intake and smoking and the risk of colorectal adenomas in an endoscopy-based population. Int. J. Cancer. 2008;122(8):842–1848.