LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA VETERINARIJOS FAKULTETAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS FAKULTETAS

Marija Žemaitytė

Kiaulių kalpastatino geno polimorfizmo sąryšis su skirtingu raumenų fenotipu

Pig‘s calpastatine gene polymorphism linkage to a different muscle fenotip

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovė: prof. Dr. Ilona Miceikienė

2 PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis „Kiaulių kalpastatino geno polimorfizmo sąryšis su skirtingu raumenų fenotipu“.

Yra atliktas mano pačios:

1. Nebuvo naudotas kitame universitete, Lietuvoje ir užsienyje:

2. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

Marija Žemaitytė

Data pavardė (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS

TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Marija Žemaitytė

Data pavardė (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO

GYNIMO

Ilona Miceikienė

Data pavardė (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE

Data pavardė (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

(gynimo komisijos sekretorės (-riaus) parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(katedros vadovės vardas pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3 TURINYS SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 9

1.1. Genetiniai ir aplinkos veiksniai lemiantys kiaulių raumenų vystimąsi ... 9

1.1.1. Veislė ... 9

1.1.2. Lytis ... 10

1.1.3. Amžius ... 10

1.1.4. Šėrimas ... 11

1.1.5. Laikymas ... 11

1.1.6. Genai veikiantys raumenų vystimąsi... 12

2.TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI ... 20

2.1. Tyrimų medžiaga ... 20

2.2. Kiaulių fenotipinių požymių duomenų bazė ... 20

2.3. Kalpastatino geno tyrimo metodika ... 21

2.3.1. DNR ekstrakcija Chelex dervų pagalba ... 21

2.3.2. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas ... 22

2.3.3. Kiaulių CAST (kalpastatino) geno tyrimo metodika ... 22

3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 24

3.1. Kalpastatino geno polimorfizmo tyrimai ... 24

3.2. Kiaulių turinčių CAST/HinfI genotipą savybės. ... 26

3.3. Kiaulių turinčių CAST/MspI genotipą savybės. ... 28

3.4. Kiaulių turinčių CAST/RsaI genotipą savybės. ... 29

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32

IŠVADOS ... 32

4 SANTRAUKA

Kiaulių kalpastatino geno polimorfizmo sąryšis su skirtingu raumenų fenotipu Marija Žemaitytė

Šio tyrimo tikslas buvo ištirti kiaulių kalpastatino įtaką raumenų vystimuisi.

Tyrimo metodika. Tiriamasis darbas atliktas LSMU Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.

Penėjimosi ir mėsinių savybių duomenys gauti iš Valstybinės kiaulių kontrolinio penėjimo stoties Kauno skyriaus.

Tyrimui buvo atrinktos 47 naminės kiaulės. Jos priklausė Diurokų, Landrasų, Jorkšyrų, Pjetrėnų, Lietuvos Baltųjų, Didžiųjų baltųjų kiaulių veislėms. DNR buvo išskirta iš plaukų svogūnėlių. PGR produktai buvo karpomi restrikcijos karpymo fermentais HinfI, MspI ir RsaI.

Rezultatai ir išvados. Kalpastino geno polimorfizmo tyrimai atlikti skirtingose kiaulių veislėse parodė, kad atskirose veislėse randami skirtingi genotipų dažniai. Identifikavome trijose polimorfinėse vietose 6 alelius (A, B, C, D, E, F) ir 6 skirtingus genotipus (AB, BB, CD, DD, EE, EF). Mūsų gautais tyrimų rezultatais buvo nustatyta, kad CAST/MspI CD genotipo kiaulės turėjo didesnę nugaros raumenų plotą ir kumpio masę lyginant su kitų kalpastatino genotipų kiaulėmis, o CAST/HinfI BB genotipo kiaulės buvo liesiausios. Vertinant CAST geno įtaką penėjimosi savybėms nustatėme, kad per penėjimosi laikotarpį mažiausiai pašarų sunaudojo ir didžiausią priesvorį pasiekė kiaulės turinčios CAST/HinfI BB genotipą. Didžiojoje Baltojoje kiaulių veislėje CAST/HinfI lokuse BB genotipą, turėjo 50 proc. kiaulių, AA genotipas nerastas, CAST/MspI lokuse vyravo DD genotipas (atitinkamai 81,2 proc.) CC genotipas nerastas, EE genotipą turėjo 87,5 proc. kiaulių.

5 SUMMARY

Pig‘s calpastatine gene polymorphism linkage to a different muscle fenotip Marija Žemaitytė

Research methodology. The objective of this research was to investigate the influence of pigs' calpastatine gene to the muscle growth.

Research methodology: This research was performed at LUHS Biological Systems and Genetic Research Institute at K. Janušauskas Animals Genetics Laboratory.

Fattening and meat traits data was obtained from Kaunas Department of Public Pigs Control Fattening Station.

For this research 47 domestic pigs were selected. They belong to Duroc, Landrace, Yorkshire, Pietrain, Lithuanian whites, and Large white pigs breeds. DNA used for this research was extracted from plucked hair. PGR products were cut using restriction cropping ferments HinfI,

MspI and RsaI.

Results and conclutions. Results and conclusions. Calpastatine gene polymorphism research performed on different pig breeds has shown, that different genotype frequency is found in different breeds. Six alleles (A, B, C, D, E, F) and six different genotypes (AB, BB, CD, DD, EE, EF) were identificated in three polymorphic places. Using the received results, we have concluded, that CAST/MspI CD genotype pigs had larger back muscle area and ham mass, compared to other calpastatine genotype pigs, CAST/HinfI BB genotype pigs were the leanest. Estimating CAST gene's influence to fattening traits, we have come to conclusion, that during the fattening period, largest amount of forage and biggest overweight was achieved by pigs with CAST/HinfI BB genotype. In the breed of Large Whites CAST/HinfI locus, 50 percent of pigs had BB genotype, AA genotype was not found. DD genotype dominated in CAST/MspI locus (81,2 percent), AA genotype was not found. 87,5 percent of pigs had EE genotype.

6 SANTRUMPOS

CAST – kalpastatino baltymo genas GH – augimo hormonas

GHRH – augimo hormonus atpalaiduojantis hormonas HAL – halotano (streso) genas

IgF2 – insulino augimo faktorius LEP – leptino genas

MAS – markerių asistentų selekcija

MC4R - melanokortino 4 receptoriaus genas MYO – miostatino genas

MYOG – miogeninis genas Nn – heterozigotinė geno būsena

NN – homozigotinė dominantinė geno būsena nn – homozigotinė recesyvinė geno būsena PGR – polimerazinė grandininė reakcija PHS – piktybinės hipertermijos sindromas PIT – pituitrino genas

PPARGC1 – peroksisomas proliferuojantys aktyvatoriai receptorių gama koaktivatorius 1 PSE – blyškios, minkštos, vandeningos mėsos sindromas (pale, soft, exudative)

PSS – kiaulių streso sindromas QTL – kiekybinis požymių lokusas

RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas RYR1 – rianodino receptoriaus genas 1

7 ĮVADAS

Sparti DNR tyrimų metodikos plėtra pastaraisiais keliais dešimtmečiais suteikė galimybę atpažinti genus, kurie veikia genetinių produkcijos bruožų pakitimus, pastebimus naminių gyvulių veislėse. Šių genų atpažinimo dėka tikimasi pagerinti atranką, panaudojant genetinius markerius, ir norint išgauti kuo tikslesnes atitinkamų savybių fiziologines savybes. Dauguma produkcijos savybių yra poligeniškos ir pirmiausiai nustatant jų genetinį pagrindą reikialingas genas kandidatas, kuris turi įtakos tam tikrų savybių paieškoms.

Kiaulių produkcijos bruožai, tokie kaip augimas ir skerdenos charakteristika, turi didelę įtaką kiaulių veisimui bei atrankai. Kaip daugelis kitų ekonomiškai svarbių naminių gyvūlių savybių, šiuos lemia daugelio genų ir aplinkos veiksnių sąveika. Mėsos kokybės vertinimas yra nulemtas apskaičiuojant fenotipinius bruožus, tokius kaip tarpraumeninių riebalų sudėtis, pH – dydis, elektros laidumas, skysčių netekimas ir spalva. Tyrinėjant ryšius susijusius su genais kandidatais ir fenotipo paveikimu svarbiausia identifikuoti genus, kurie selekcijos programose naudojami kaip markeriai asistentai.

Prieš 7000 metų kiaulė buvo vienas iš pirmųjų domestikuotų gyvūnų, ir kiauliena populiariausia vartojama raudona mėsa pasaulyje. Apie 1990 metus siekiant geriau suprasti kiaulių genomą, buvo pristatytas tarptautinis PiGMaP genų žymėjimo projektas. Įpusėjus 1990 metams buvo publikuoti du jungčių žemėlapiai, iš kurių viename buvo daugiau nei 1200 mikrosatelitinių markerių (Archibald ir kt., 1995; Rohrer ir kt., 1996). Nuo to laiko, jungčių žemėlapių raida sulėtėjo, tačiau nauji genų markeriai, tokie kaip mikrosatelitai, AFLP (amplified fragment length polymorphism) ir SNP vis dar identifikuojami ir žymimi. Progresas molekulinėje genetikoje atvėrė galimybę genetiniam kiaulių tobulinimui tiesiogiai atrenkant genus ar chromosomų regionus, kuriuose yra genai veikiantys reikiamas savybes.

Egzistuoja du pagrindiniai genetinio tobulinimo būdai taikomi ūkinės paskirties gyvūliams. Pirmasis yra markerių ieškojimas, kurie yra tiesiogiai susije su kiekybiniais bruožais ir kiekybinio bruožo lokus (QTL) žymėjimu. Galimybė išanalizuoti kiekybinius genus tobulinama remiantis nuodugniais ryšiniais DNR markerių žemėlapiais. Panaudojant juos gali buti išskiriama individuali chromosoma tam tikrose veislėse (Andersson ir kt., 1994). Iš pradžų dauguma QTL eksperimentu buvo atliekama naudojant ryšių žemėlapius, kurie padėdavo nustatyti kiaulių pramonei svarbiausius bruožus. Ankstyviesiems QTL skenavimams buvo pasitelkiamos šeimos, tiesiogiai poruojant Europinius laukinius šernus su komercine veisle, arba poruojant Kinijos Meišano veislę su komercine.

8

Genų žymėjimas ir lyginamojo genomo tyrinėjimai kiaulėms buvo atliekami norint išanalizuoti QTL geno ekonominę svarbą ir atskirų chromosomų regionų įtaką kiaulių vystimuisi, riebalų nuosėdoms bei skerdienos bruožams (Bidanel ir Rotschild, 2002).

Net jeigu QTL labai lengva aptikti sukryžmintose veislėse, problema yra ta, jog skanuojant kryžmintų veislių genomą, rasti markeriai, kurie susiję su tam tikru bruožu šiose veislėse gali būti labai nutolę nuo įtakojančio geno. Tuo labiau, aptinkami tik genai, kurie skiriasi tarp veislių kurios yra naudojamos kryžminimui ir gali neparodyti pakitimų veislės viduje, kurie reikalingi veislinei selekcijai. Šie du faktoriai riboja tiesioginę kryžminimo tyrimo naudą veislinei selekcijai (Rothschild ir kt., 2007)

Remiantis žymėjimu ir identifikuotais polimorfizmais geno viduje, ryšys tarp geno kandidato genotipo ir fenotipo gali būti išmatuotas uždaroje kiaulių veisimo populiacijoje. Priešingai nei kryžmintų veislių genomo skenavimas, genas kandidatas nuorodo markerius, kurie yra artimi kauzaliniam genui ir kuris išsiskiria pačioje veislėse. Šie markeriai gali buti tiesiogiai naudojami vidinei veislių selekcijai. Nuosekliai ištirti mėsos kokybės genai buvo aptikti, genetiniai markeriai, kurie buvo identifikuoti juose, suteikė galimybę atlikti genetinius bandymus, ir tai leidžia veisėjams pašalinti alelius, kurie gadina mėsos kokybę.

Periodas, tarp šių genų atradimo metodų ir QTL, ypatingai geno kandidato tyrinėjimai, leido atrasti kelis genus ir markerius, kurie yra naudojami pramonėje. Pavyzdžiui ryanodino receptoriaus genas (HAL geno) nusakantis mėsos kokybę, augimo hormonas (GH) ir augimo hormoną skatinantis hormonas (GHRH) augimui, išsivystimo bei įvairių metabolinių reiškinių reguliavimas, melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) ir hipofizės specifinio transkripcijos faktoriaus (PIT1) atsakingo už liesos mėsos sudėtį bei nugaros riebalų storumą, PPARGC1 adipocitų diferenciacijai, kalpastatino (CAST) mėsos minkštumui bei miogenino raumenų augimui, diferenciacijai (Dekkers ir Rothschild, 2007).

Darbo tikslas: ištirti kiaulių kalpastatino geno įtaką raumenų vystimuisi. Darbo uždaviniai:

 Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie genetinius ir aplinkos veiksnius veikiančius kiaulių raumenų vystimąsi.

 Ištirti kiaulių kalpastatino geno polimorfizmą tiriamojoje kiaulių grupėje, nustatant geno alelių ir genotipų dažnius PGR – RFIP metodu.

 Nustatyti asociacijas tarp kiaulių kalpastatino geno polimorfizmų ir raumenų išsivystimo.

9 1.LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Genetiniai ir aplinkos veiksniai lemiantys kiaulių raumenų vystimąsi

1.1.1. Veislė

Be visaverčio šėrimo, tinkamų laikymo sąlygų, lyties, veislės, amžiaus didelę įtaką mėsos kokybei ir produktyvumui turi genetiniai veiksniai (Klimas ir kt., 2003). Pagrindinis faktorius, turintis įtakos mėsos produkcijos kiekiui ir kokybei yra veislė. Nustatyta, kad pagrindinai mėsos kokybės rodikliai yra paveldimi (Skimundris, 2000). Kiaulių genotipas yra pats svarbiausias mėsos kokybei ir yra įtraukiamas į daugelį selekcijos programų (Hviid, 2002). Šiuolaikinės selekcijos užduotis pasiekti, kad auginamos kiaulės kauptų kuo mažiau riebalų, o raumenų masė būtų kuo didesnė. Pastaruoju metu išaugęs poreikis liesai kiaulienai, todėl atliekama selekcija raumeningumui didinti. Kiaulių kryžminimui ir hibridizacijai naudojami specialių mėsinių veislių kuiliai. Daugiau neriebios kiaulienos gaunama atrenkant didesnio raumeningumo kiaules, jas kryžminant arba mažinant skerdžiamų kiaulių svorį. Siekiant gauti sparčiau augančius, didelę liesos mėsos išeiga pasižyminčius mišrūnus, skirtingi požymiai derinami kryžminant motinines ir tėvines veisles. Renkantis veislę svarbu nepamiršti, kad didėjant kiaulių raumeningumui didėja ir jų jautrumas stresams, jos darosi lepios ir labiau reiklios šėrimo bei aplinkos sąlygoms (Stimbirys ir kt., 2005).

Kai kuriose Vakarų šalyse dėmesys buvo atkreiptas į tai, kad vienpusiška selekcija didinant raumeningumą mažina kiaulių atsparumą ligoms ir blogina kitų skerdenos rodiklių kokybę, o selekcijos programose svarbu numatyti kiaulių sveikatingumo kėlimą, genetinio kintamumo išsaugojimą (Stimbirys ir kt., 2005). Taikant dviejų veislių mišrinimą siekiama heterozės efekto pasireiškimo – palikuonių augimo spartos, priesvorio, raumeningumo padidėjimo, pašarų sąnaudų, lašinių storio sumažėjimo lyginant su pradinėmis grynaveislėmis formomis. Gavus aukštos genetinės vertės derinį, sudaromos puikios sąlygos antrajam mišrinimo etapui – hibridizacijai.

Pirmos kartos kiaulaitės mišrinamos su tėvinių veislių kuiliais. Paršeliai hibridai būna gyvybingesni, sparčiau auga, pasižymi geresnėmis mėsinėmis savybėmis. Trijų veislių hibridai auginami tik mėsai. Teisingas kryžminimo organizavimas leidžia palikuonyse suderinti specialiai tam parinktų veislių savybes ir pasireikšti heterozės efektui. Heterozė būdinga ne kiekvienam veislių deriniui ir kryžminant pasireiškia ne kiekvieno ūkiškai naudingo požymio heterozė. Prieš pradedant vykdyti mišrinimą, reikia atsižvelgti į tai, kokios produktyvumo krypties kiaules norime

10 gauti, kokias atskiras savybes norime pagerinti. Taip pat labai svarbu vykdyti veislių atranką ar paranką pagal atskirus rodiklius, bei kontroliuoti mišrinimo laipsnį siekiant gauti teigiamų rezultatų tolimesnėse mišrinimo kartose (Kiaulių veislininkystė, 2009).

1.1.2. Lytis

Kiaulių mėsos produkciją, jos kokybę įtakoja gyvulio lytis (Brunscheid ir kt., 1998). Nekastruotų patinų mėsa kietesnės konsistencijos, mažiau tarpraumeninių riebalų, jų vietoje yra daug jungiamojo audinio, tamsi spalva, didelis kiekis ekstrahuojamų medžiagų. Lietuvoje auginamų grynaveislių kiaulių fenotipinio įvertinimo duomenimis, kuiliukų raumeningumas 1 – 3 proc. didesnis negu kiauliačių (Brunscheid ir kt., 1999). Kastratai riebesnis už kiaulaites (Skimundris, 2000). Nustatytas tiesioginis ryšys tarp lyties ir raumeninio bei riebalinio audinio išeigos. Pas kastratus raumeninio audinio yra daugiau negu pas kiaulaites, tačiau didėjant jų skerdienų masei, liesos mėsos kiekis mažėja, o lašinių ir riebalų didėja (1lent.) (Krauβlich, 1997 ).

Kiaulaičių raumeninis audinys sudarytas iš plonų skaidulų, šviesesnis nei kuiliukų ar kastratų. Lyginant su kastratais, kiaulaičių mėsoje yra daugiau proteinų (Branscheid ir kt., 1998). 1 lentelė. Kūno sudedamųjų dalių priklausomybė nuo lyties.

Rodikliai Kastratai Kiaulaitės Kuiliai

Raumeninis

audinys, proc. 51,6 53,2 56,8

Riebalai, proc. 38,4 36,4 32,4

Kaulai, proc. 9,9 10,3 10,7

1.1.3. Amžius

Gyvuliui augant, vyksta esminiai pakitimai jo organizme: didėja raumeninio audinio, poodinių ir tarpraumeninių riebalų kiekis (Skimundris, 2000). Gyvuliui senstant, jo organizme intensyviau pradeda kauptis riebalai. (Cameron, 1998). Mėsa tampa kietesnė, nes jungiamajame audinyje padidėja elastinių ir kolageninių skaidulų kiekis. Tokių gyvulių raumeninės skaidulos tampa plonesnės, sumažėja arba išnyksta riebalinis audinys, keičiasi baltymų kokybė, sudėtis (Branscheid ir kt., 1999). Senų gyvulių mėsoje yra mažiau visaverčių baltymų ir drėgmės (Skimundris, 2000).

11 1.1.4. Šėrimas

Šėrimas – pagrindinis veiksnys, skatinantis kiaulių augimą ir vystymąsi. Raciono energijos lygis, lizino kiekis ir baltymingumas turi įtakos raumeninio audinio augimui ir kiaulių skerdenų raumeningumui. Moksliškai pagrįsta, kad subalansuotas gyvulių šėrimas leidžia reguliuoti raumeninio ir riebalinio audinio vystymąsi. Naudojamas racionas turi būti subalansuotas pagal maistines ir neorganines medžiagas, nes genetiškai kiaulės yra linkusios kaupti riebalus. (Skimundris, 2000).

Kiaules reikia šerti subalansuotais visaverčiais pašarais, kurių jos suėda mažiau, sparčiau auga, sukaupia daugiau raumenų, dėl to pagerėja skerdenų vertė (Kulpys ir kt., 2007).

Kiaulėms augant reikalingas skirtingas maisto medžiagų kiekis, todėl norint pagreitint raumenų vystimąsi kiaules kiekvieno augimo periodo metu reikia šerti skirtingo maistingumo pašarais. Kiaulės raumeningumui pagrindas yra racionalus šėrimas. (Paulauskas, 2011).

Svarbiausias veiksnys, lemiantis optimalų pašarų pasisavinimą, mėsingumą, yra raciono baltymų aminorūgščių kiekis ir jų tarpusavio santykis (Juknevičius ir kt., 2009).

Svarbiausia, kad kiaulių pašaruose būtų reikiamas apykaitos energijos kiekis ir jos tinkamas santykis su baltymais, svarbus lizino įsisavinimas, bei kitų nepakeičiamų aminorūgščių. Kiaulėms augant keičiasi maisto medžiagų poreikiai, todėl penėjimosi eigoje būtina keisti kombinuotojų pašarų maistingumą. Taip pat, kad kiaulės nenutuktų ir padidėtų raumeningumas, atskirais periodais rekomenduojama mažinti pašaro kiekį. (Paulauskas, 2011).

1.1.5. Laikymas

Auginimo technologija turi atitikti kiaulių fiziologinius poreikius, kad jos kuo mažiau patirtų stresų, kurie neigiamai veikia kiaulių produktyvumą (Kiaulių veislininkystė, 2009). Blogos gyvulių laikymo sąlygos turi neigiamą poveikį gyvuliams, tokie gyvuliai prastai auga ir vystosi. Blogos gyvulių laikymo sąlygos turi neigiamą poveikį mėsos kokybei (Skimundris, 2000). Pakitus kiaulių laikymo ir šėrimo sąlygoms, kiaulės tampa neatsparios stresams (Juncher ir kt., 2001). Kiaulių augimo ir energijos poreikiai priklauso nuo aplinkos temperatūros. Energijos paklausa didėja šaltuoju laikotarpiu. Aplinkos temperatūra gali turėti įtakos griaučiams ir raumenų savybėms. Aplinkos temperatūra smarkiai gali pakeisti raumenų ir audinių savybes. Paveikus raumenis,

12 sumažėjus organizme baltymų sumažėja ir kiaulių produktyvumas. Šaltai laikomos kiaulės turi mažesnį pH raumenyse, nei kiaulės kurios laikomos šiltoje aplinkoje. (Lébret ir kt., 2002).

1.1.6. Genai veikiantys raumenų vystimąsi

Pastaraisiais metais molekulinės genetikos metodai kiaulių veislėms buvo naudojami kaip priedas prie tradicinių kiekybinių metodų. Naujausi molekuliniai genetiniai tyrimai įtakojo eksponentinį daugelio genų, lemiančių ūkio gyvūnų savybes, informacijos augimą (Chen ir kt., 2007).

Atsižvelgiant į fenotipą kiaulės atrenkamos selekcijai. Dėl mažo požymių paveldimumo genetinė pažanga vyksta labai lėtai. Molekuliniai metodai, naudojant tam tikrus genus ir kiekybinius požymių lokusus (QTL), gali būti taikomi siekiant pagreitinti genetinę pažangą. Kiekybinių požymių lokusai (ang. Quantitative trait loci – (QTL)) – tai vietos chromosomose, kuriose yra genai, sąlygojantys kiekybinius požymius. Dauguma ekonomiškai svarbių požymių yra sąlygojami daugelio genų. Šie genai vadinami kiekybiniais, nes kiekvieno geno įtaką galima išreikšti tam tikra verte. Kiekybinių genų vietos chromosomose vadinamos lokusais (kiekybinių požymių lokusai – QTL). Tarp jų yra genai, turintys didesnę įtaką požymiui (pagrindiniai genai) (Yue ir kt., 2003). 2 lentelė. Genai lemiantys raumenų vystimąsi.

Geno pavadinimas Geno apibūdinimas

Augimo hormonus atpalaiduojantis hormonas (GHRH)

Tiesiogiai dalyvauja augimo faktorių ekspresijos reguliavime. Reikšmingas riebalų storiui ir skerdenos kokybei skirtingose kiaulių veislėse (Pierzchala M. ir kt., 2003) ir su vidutiniu augimo, bei riebalų storiu (Franco M.M ir kt., 2005).

Halotano (streso) genas (HAL)

Randamas kiaulių 6 chromosomoje. Įtakoja raumenų susitraukimus, metabolizmą ir temperatūros pokyčius mėsoje, dėl ko pakinta glikogeno skilimo greitis. Greitas glikogeno virtimas pieno rūgštimi lemia staigų pH kritimą (iki 5,5) taip blogindamas mėsos kokybę (PSE mėsa) (Miceikienė ir kt., 2007).

13 Insulino augimo

faktorius (IgF2)

Į insuliną panašus augimo faktorius, atlieką svarbų vaidmenį augime, daro įtaką ląstelių dalijimuisi, diferenciacijai, po gimdymo raumenų augimui. Kiaulių kiekybinio lokuso (QTL) genas turintis įtakos raumeningumui (Andersson – Eklund ir kt., 1998).

Kalpastatino baltymo genas

(CAST)

Sistema svarbi normaliam skeleto raumenų augimui. Taip pat gali turėti įtakos skeleto ląstelių (skaidulų) skaičiui (Kurly ir kt., 2003).

Leptino genas (LEP)

Leptino baltymas išsiskiria riebaliniame audinyje, veikia kaip kūno svorio ir energijos sąnaudų reguliatorius (Campfield ir kt., 1995).

Melanokortino 4 receptoriaus genas

(MC4R)

Dalyvauja kiaulių medžiagų apykaitos, energijos balanso reguliavime. Lemia riebalų atsidėjimą, augimo greitį ir maisto medžiagų pasisavinimą. Be to, pastebėtas poveikis produktyvumo savybėms – raumeningumui (%), paros priesvoriui (g), ir nugaros lašinių storiui (mm) (Kim ir kt., 2000).

Miogeninis genas (MYOG)

Įtakoja raumenų diferencijaciją. Geno polimorfizmas gali būti susijęs su skirtingais raumeninio audinio miofibrilių ir mioblastų kiekiais (Miceikienė ir kt., 2007).

Miostatino genas

(MYO) Įtakoja raumeninių skaidulų formavimąsi (Miceikienė ir kt., 2007). Rianodino

receptoriaus genas 1 (RYR1)

Rastas skeleto raumenyse. Koduojantis baltymas veikdamas išlaisvina Ca jonus iš sarkoplazminio tinklo į citoplazmą, sukeldamas raumenų susitraukimą (Takeshima ir kt., 1989). Peroksisomas proliferuojantys aktyvatoriai receptorių gama koaktivatorius 1 (PPARGC1)

PPARGC1 yra transkripcijos koaktivatorius daugeliui branduolinių hormonų receptorių, įskaitant peroksisomos proliferacinio aktivatoriaus receptorių gamą, kuris parodo sudėtingus riebalų metabolizmo ir veikimo mechanizmus centriniuose reguliaturiuose, adipocitų diferencijacijoje (Rosen ir Spiegelman, 2000).

Pituitrino genas (PIT1)

Įtakoja paršelių gimimo svorį ir nugaros lašinių storį (Miceikienė ir kt., 2007).

14 Troponinas I tipo 2

genas (TNNI2) Įtakoja raumenų skaidulų sudėtį (Yang et al., 2010).

1.1.6.1. Augimo hormonų (GH) ir augimo hormonus atpalaiduojantis hormonas (GHRH) Genai tiesiogiai dalyvauja augimo faktorių ekspresijos reguliavime, gali būti kandidatais genų augimui ir kiaulių skerdenos kokybėj. GHRH yra endogeninis stimuliatorius somatotropino sekrecijoje. Tai palengvina pagumburio ir somatotropiną hipofizėje, stimuliuoja ląstelių proliferaciją, kurios reguliuoja produkcijos augimą ir sekreciją GH. GH yra peptidinis hormonas su 190 liekanų, kurios reguliuoja augimą, išsivystimą ir įvairias metabolines veiklas.

AluI polimorfizmas trečiame eksone GHRH geno. Rasta reikšmingų asociacijų su riebalų

storiu ir skerdenos atitikimu skirtinguose kiaulių veislėse (Pierzchala M. ir kt., 2003), bei su vidurkiu kasdieninio augimo ir riebalų storiu (Franco M.M ir kt., 2005). Aminorūgštys laikomos GH proteinų, tačiau taip pat turi daug pavienių polimorfinių nukleotidų, kurie yra svarbūs augimui liesumo klasėje ir pieno produkcijoje. GH Ddel polimorfizmas asocijuojasi su riebalų storiu (P = 0.0326) ir vidutiniu dienos augimu (P = 0.0127) (Franco ir kt.,2005). Skirtingi Ddel, Narl ir BsmNl polimorfizmai randami koduotoje GH sekoje, esantys skirtingose veislėse.

1.1.6.2. Halotano (streso) genas (HAL)

Intensyvinant selekciją mėsingumo gerinimo kryptimi, padidėjo ir stresams jautrių kiaulių skaičius. Šį reiškinį sukelia kiaulių 6 – oje chromosomoje sutinkamas halotano genas (n). Kiaulių streso genas (HAL) koduoja ryanodino receptorius, kurie yra raumenų sarkoplazminio tinklo Ca2+ kanalai (Bastos ir kt., 2000). Jeigu šis genas homozigotinėje būklėje (nn), tokios kiaulės yra jautrios stresams (Le Roy ir kt., 2000).

Kiaulių streso sindromas (PSS) yra paveldima raumenų patologija, kurios metu skeleto raumenų susitraukimas, hipermetabolizmas ir kūno temperatūros padidėjimas yra sukelti inhaliacinės anestezijos ir aplinkos neigiamo poveikio (Graves, 1984). Sindromas dažniausiai pasitaiko mėsinių kiaulių veislėms (15 – 30 %) (Ribikauskienė ir kt., 2003). Jautrios stresui kiaulės yra raumeningesnės, tačiau jų mėsa, kuriai būdingos PSE savybės, yra blogos kokybės (Wood ir kt.,1994; Leanch ir kt., 1996; Le Roy ir kt.,2000). Stresams jautrios kiaulės sunkiau, negu jiems atsparios, išgyvena stresines situacijas, blogiau prisitaiko prie pakitusių aplinkos sąlygų, imlesnės įvairioms ligoms (Juknevičius, 1994), prastesnis jų kai kurių vidaus organų išsivystimas (Andersson,1993). Didinat raumenų masę kyla raumenų hipertrofijos, stresinio sindromo ir PSE kiaulienos atsiradimo pavojus (Appel, 1999). Dėl padidėjusio raumenų metabolizmo, stresui jautrių

15 paskerstų gyvulių audiniuose pakinta glikogeno skilimo greitis, per 1 val. Jis paverčiamas į pieno rūgštį, todėl pH nukrenta iki 5,5, raumenų temperatūra būna 41,5 – 43,0 °C. Tik ką paskerstų kiaulių raumenyse pH būna 6,8 – 7,0 ir 40,0 – 40,5 °C (Skimundris, 2000). Stresui atsparių kiaulių raumenyse pH 7,3 – 5,5 nukrenta per 10 – 24 val. Žemas pH kartu su aukšta kūno temperatūra stresui jautrių kiaulių raumenyse sukelia sarkoplazmos baltymų denatūraciją, pablogėja baltymų makrosruktūra ir tai pablogina mėsos kokybę (Appel, 1999).

1.1.6.3. Insulino augimo faktorius (IgF2)

Į insuliną panašus augimo faktorius, atlieka svarbų vaidmenį augime, daro įtaką ląstelių dalijimuisi, diferenciacijai, po gimdymo raumenų augimui. Kiaulių kiekybinio lokuso (QTL) genas turintis įtakos raumeningumui (Andersson – Eklund ir kt., 1998). Į insuliną panašus augimo faktorius panašios struktūros su insulinu ir asocijuojasi su augimu, DNR ir RNR, bei baltymų sinteze. IgF2 apima 67 amino rūgštis, sekretuojamas kepenų. Ypatingai svarbus prieš gimimą ir vystimosi laikotarpiu, sukelia somatotropinės ašies brendimą (Lee ir kt., 1991). Gyvūnų mityba įtakoja sekreciją įvairių su augimu susijusių hormonų įskaitant GH, IgF1 ir IgF2, tiroksino ir gliukokortikoidų (Atinmo ir kt., 1978; Farmer ir kt., 1992; Straus, 1994).

1.1.6.4. Kalpastatino baltymo genas (CAST)

Kalpastinas yra specifinis endogeninis inhibitorius kalpinui, kuris priklauso kalcio proteazėm, kurios po mirties atsakingos už mėsos minkštumą (Koohmaraie, 1992).

Ankščiau tyrinėjant rasti haplotipai su trim atskirais vieno nukleotido polimorfizmais (SNP) koduojančiais CAST regione ir vienijami su mėsos rūšiniais bruožais, kai gaminant prarandamas mėsos sultingumas (Ciobanu ir kt., 2004). Skeleto raumenų augimo greitis ir dydis priklauso nuo trijų svarbiausių faktorių: baltymų sintezės greičio, baltymų degeneracijos greičio, bei kiekio ir dydžio skeleto raumenų ląstelių. Naujausiais tyrimais įrodytas kalpastatino aktyvumas veikiantis mioblastų sintezę (Barnoy, 1997) ir ląstelių proliferaciją, skatinančią papildomą ląstelių augimą (Mellegren, 1997). Naminių gyvūlių raumeninių ląstelių skaičius veikia kalpino sistemos greitį, bei yra lydima mioblastų proliferacijos ir mioblastų moduliacijos. Tyrimais įrodytas kalpino sistemos svarbumas skeleto raumenų vystimuisi. Skeleto raumenų augimo greitis gali būti susijęs su baltymų sumažėjimu raumenyse ir asocijuotis su aktyvaus kalpino sistema, dėl sumažėjusios kalpastatino veiklos (Goll ir kt., 1998).

16 Po mirties vykstantys proteolitiniai procesai ir kalpino – kalpastatino veikla yra gerai žinoma. Ši sistema daro įtaką mėsos kokybei, minkštumui, gebėjimui sulaikyti vandenį (Kemp ir kt., 2010; Melody ir kt., 2004). Skeleto raumenyse, proteolitinė sistema susideda iš proteazių μ – calpino ir m – kalpino, skeleto raumenų specifinio kalpino 3, ir endogeninių inhibitorių μ – calpino ir m – kalpino (Goll ir kt., 2003). Kiaulių kalpastatinas (CAST) genas lokalizuojasi SSC2q2.1-2.4 (Ernst ir kt., 1998) ir atitinka genominę poziciją 107 Mb SSC2 pagal dabartinę anotaciją kiaulių genome Sscrofa 10.2.

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=retrieve&dopt=full_report&list_uids=39

7135)

1.1.6.5. Leptino genas (LEP)

Leptinas yra 16 kDa baltymas, 18 – toje chromosomoje q13 – q21 regione. Jį išskiria baltosios riebalų ląstelės (adipocitai), veikia kaip kūno svorio ir energijos sąnaudų reguliatorius. Veikdamas smegenyse perduoda signalą apie maisto medžiagų statusą organizme, įtakoja kūno svorį, metabolizmo procesus ir energijos balansą (Campfield ir kt., 1995). Vykstant fiziologiniams ir endokrininiams mechanizmams įtakojama audinių struktūra ir augimas, todėl aptinkami polimorfizmai yra potencialūs genetiniai markeriai, nusakantys augimo greitį ir pašaro suvartojimą (Peixoto ir kt., 2006). Kiaulės kurios yra nutukusios jų iRNR yra daug didesnis nei liesų (McNeel ir kt., 2000).

1.1.6.6. Melakortino 4 receptoriaus (MC4R)

Melakortino 4 receptorius yra reikšmingas žinduolių smegenų regione ir atlieka svarbų vaidmenį energijos homeostazėje. Polimorfizmas šiame gene gali būti susietas su augimu ir nutukimu. Kiaulių, nesinoniminiai polimorfizmai buvo atvaizduoti (Asp298Asn) ir pademonstruoti veikiant cAMP produkcijoje ir pakeisdami adenilino ciklazę. Tyrimai atskleidė reikšmingus mutacijų ryšius susijusius su kiaulių produkcija (Kim ir kt., 2000; Hernandez – Sanchez ir kt., 2003; Jokubka ir kt., 2006). Šie polimorfizmai lengvo genotipo PGR ir apriboja Taql endonukleazės seką (Jokubka ir kt., 2006).

1.1.6.7. Miogeninis genas (MYOG)

Miogeninis genas (MYOG) įtakoją raumenų diferiacijaciją, gali būti susijęs su skirtingais raumeninio audinio miofibrilių ir mioblastų kiekiais (Miceikienė ir kt., 2007). Randamas 9

17 chromosomoje ir turi kelis skirtingus alelius. Miofibrilių skaičius mėsiniams gyvuliams susijęs su augimo galia. MYOG yra vienintelis MyoD genas, kuris randamas visų skeleto raumenų ląstelių linijose. Genetinis kintamumas šiame lokuse gali būti susijęs su skirtingais mioblastų ir miofibrilių kiekiais. Norint nustatyti skirtingų MYOG alelelių alelių įtaką kiaulių raumenų vystimuisi ir augimui, reikia išskirti genominius MYOG fragmentus ir apibūdinti keturis haplotipus, esančius

MspI srityje. Atliekant PGR – RFIP testą galima nustatyti ryšius susijusius su augimo savybėmis

(Saumillion, 1997). Myf – 5 ir MyoD1 genas ekspresuojamas proliferuojančiose pirminėse ląstelėse mioblastuose. Myf – 6 genas ekspresuojamas pogimdyminiu periodu (Pas, 1999).

1.1.6.8. Miostatino genas (MYO)

Miostatino genas (MYO) įtakoja raumeninių skaidulų formavimąsi (Miceikienė ir kt., 2007). Daugiau raumeninių skaidulų turinčios kiaulės greičiau auga ir turi didesnę raumenų masę. Kiaulių miostatinas veikia mėsines ir penėjimosi savybes (Saumillion ir kt., 1997; Cieslak ir kt., 2003; Fausto ir kt., 2005). Randamas 15 chromosomoje, koduojanti kiaulių miostatino geno seka apima 1128 bp (McPherron, Lee, 1997). Genas sudarytas ir trijų egzonų ir atitinkamai 373, 374 ir 381 pb ilgių, o aktyvi baltymo forma apima 376 amino rūgštis. MYO priklauso augimo faktoriaus β – šeimai, ekspresuojamas skeleto raumenyse embrioniniu ir poembrioniniu laikotarpiu, o esant funkcijos praradimo mutacijai miostatinas gali gaminti papildomas raumenų skaidulas, formuojančias hiperplaziją (Guimaraes ir kt., 2007).

1.1.6.9.Rianodino receptoriaus genas 1 (RYR1)

Rianodino receptoriaus genas 1 (RYR1) tarpininkauja Ca (2+) išsiskyrime iš sarkoplazminio tinklo į citoplazmą, vaidina svarbų vaidmenį sukeliant raumenų susitraukimą po depoliarizacijos T-kanalėliuose. Reikalingas normaliam embriono skeleto raumenų ir skaidulų vystimuisi. (Takeshima ir kt., 1989). Kiaulėms rianodino receptoriaus geno 1 mutacija sukelia kiaulių piktybinės hipertermijos sindromą (PHS). PHS yra farmakogenetinė liga susijusi su kalcio reguliacija raumenyse ir mirtimi ar PSE. Gyvūnams PHS gali sukelti halothano anasteziją, kuri iššaukia defektus homozigotiniame nešiotojame (nn). Kadangi kiaulių jautrumas halothanui kontroliuojamas recesyviniu genu (HAL), tai eksponuojamas nepilnas pralaidumas, heterozigotinių gyvūnų (Nn) neparodo fenotipinių pakitimų PHS (Webb ir Jordan, 1978).

18 1.1.6.10 Peroksisomos proliferuojantys – aktyvatoriai receptorių gama koaktivatoriaus – 1

(PPARGC1)

Riebalų susikaupimas įvairiuose kiaulės kūno vietose yra ekonomiškai svarbus veiksnys kiaulienos pramonėje. Turi būti mažai nugaros riebalų, bet turi turėti tarpraumeninių riebalų, kurie padėtų pagerinti jutiminius mėsos bruožus. Atliekant naujausius tyrimus susitelkta į genų kandidatų identifikavimą ir bandoma numatyti mėsos kokybę, bei raumeninio audinio augimą.

Peroksisomos proliferatorių aktyvatoriai receptorių gama koaktivatorius – 1 (PPARGC1) yra transkripcijos koaktivatorius daugeliui branduolinių hormonų receptorių įskaitant peroksisomos proliferacinio aktivatoriaus receptorių gamą, kuris parodo sudėtingus riebalų metabolizmo ir veikimus centriniuose reguliaturiuose, bei adipocitų diferenciacijoje (Rosen ir Spiegelman, 2000).

PPARGC1 yra genas kandidatas kiaulienos liesumui ir riebumui, dėl įtakos kūno sudėčiai ir riebalų pasiskirstymui. Pilnas ir nuoseklus kiaulių PPARGC1 genas, įskaitant ir pavienius polimorfinius nukleotidus, buvo neseniai nustatytas eksone 8. T/A nukleotidų pozicijų pakeitimas 1378 rezultatas amirorūgščių pakeitimo (Cys –> Ser) pozicija 430 aminorūgščių sekoje.

Skirtingi aleliai skirstomi tarp Kinietiškų ir Vakarietiškų kiaulių veislių (Kunej ir kt.,2005). T (Cys) aleliai dalyvavo visose 13 analizuojamų kiaulių veislių. Taigi, A (Ser) alelis dalyvavo tik Vakarietiškų kiaulių veislėse, ir tik vieną kartą Kinietiškųjų (Taoyuan) veislėje.

1.1.6.11. Hipofizės – specifinis transkripcijos faktorius (PIT1)

Hipofizės transkripcijos faktorius (PIT1) yra teigiamas augimo hormonų reguliavimo faktorius, prolaktino, ir skydliaukę stimuliuojantis beta hormonas (TSH – β). Randamas kiaulių 13 chromosomoje. Genas koduojantis PIT1 buvo pasirinktas kaip genas kandidatas kiaulių augimo ir skredenos būdingiems bruožams.

Tyrimai parodė, kad PIT1 genas asocijuojasi su gimimo svorio pakitimais (Yu ir kt.,1996) ir nujunkymo svoriu, vidutiniu dienos augimu ir kiaulių lašinių storiu (Yu ir kt.,1995; Stančekova ir kt., 1999).

1.1.6.12. Troponinas I tipo 2 genas (TNNI2)

Troponino I tipo 2 genas (TNNI2) koduoja skeleto raumenų baltymus. Priklauso troponino I genų šeimai ir yra troponino komplekso komponentas, įkaitant troponino T, troponino C ir

19 troponino I subvienetus. Troponino – tropomiozino kompleksas vadinamas „atpalaiduojančiu baltymu“. Nustatyta, kad troponinas labai tvirtai prijungia Ca+ jonus, o laisvi Ca+ jonai sužadina raumens susitraukimą. Troponinas lemia aktino ir miozino siūlų jautrumą kalcio jonams. Nustatyta, kad įtakoja raumenų skaidulų sudėtį (Yang ir kt., 2010) ir gali vaidinti svarbų vaidmenį reguliuojant lygiųjų raumenų funkciją. Be to, raumenų audiniuose, šis baltymas yra nustatytas, ragenos epitelio, kremzlių, kur jis yra iš angiogenezės inhibitorius, slopina naviko augimą.

20 2.TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI

2.1. Tyrimų medžiaga

DNR buvo išskirta iš plaukų svogūnėlių, imant mėginius į vienkartinius plastikinius maišelius, juos markiruojant bei užpildant mėginių paėmimo lydraščius.

Tiriamasis darbas atliktas LSMU Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.

Penėjimosi ir mėsinių savybių duomenys gauti iš Valstybinės kiaulių kontrolinio penėjimo stoties Kauno skyriaus.

Tyrimui buvo atrinktos 47 naminės kiaulės. Jos priklausė Diurokų, Landrasų, Jorkšyrų, Pjetrėnų, Lietuvos Baltųjų, Didžiųjų baltųjų kiaulių veislėms.

3 lentelė. Tyrimui naudotos gyvūnų veislės ir mėginių skaičius.

Gyvulio veislė Mėginių skaičius

Lietuvos baltosios 11 Didžiosios baltosios 16 Jorkšyrai 5 Mišrūnai DB × L 8 Mišrūnai DB × J 6 Mišrūnai DB × P 1

2.2. Kiaulių fenotipinių požymių duomenų bazė

Penėjimosi ir mėsinių savybių apibūdinimai:

Penėjimosi savybės – amžius esant 100 kg masės, d.; priesvoris per parą, g.; suvartota pašarų

per penėjimosi laikotarpį; pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio.

Brendimo greitis – amžius dienomis, kai gyvuliai pasiekia 100 kg masę. Šis rodiklis

apibūdina augimo spartą nuo paršelio gimimo iki 100 kg masės.

Vidutinis paros priaugimas – parodo gyvulio penėjimosi intensyvumą. Penėti pradedama

nuo 30 kg paršelio masės iki pasiekiama 100 kg masė, vidutinis paros priaugimas apskaičiuojamas: masės priaugimą nuo 30 kg iki 100 kg dalijant iš penėjimo dienų skaičiaus (100 kg – 30 kg =70 kg: 98 d. = 714 g).

21 Apskaičiuojamas sunaudotų pašarinių vienetų kiekį dalijant iš bendro masės priaugimo penėjimo metu.

Mėsinės savybės – šiltos skerdienos masė, kg; skerdienos puselės ilgis, cm; bekono puselės

ilgis, cm; nugaros raumens plotas, cm²; kumpio masė, kg; lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, mm; lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm; lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm; lašinių storis ties paskutiniu juosmens slanksteliu; lašinių storis taške Fat1, mm; lašinių storis taške Fat2, mm; raumeninis storis taške Fat2, mm; raumeningumas, %.

Skerdenos puselės ilgis centimetrais, matuojamas nuo pirmojo kaklo slankstelio priekinio

krašto iki dubens kaulų suaugimo priekinio krašto (95 - 100 cm).

Bekono puselės ilgis centimetrais, matuojamas nuo pirmojo krutinės slankstelio priekinio

krašto iki dubens kau1ų suaugimo priekinio krašto (77 - 83 cm).

Nugaros raumens plotas, cm²- matuojamas pjūvyje ties pirmu ir antru juosmens

slanksteliais.

Užpakalinio skerdenos puselės trečdalio (kumpio) masė, vertinama perpjovus skerdenos

puselę ties priešpaskutiniu ir paskutiniu juosmens slanksteliu.

Nugaros lašinių storis milimetrais, matuojamas slankmačiu: keteros srityje, ties 6-7

šonkauliu, juosmens srityje (už paskutinio šonkaulio) ir trijuose kryžiaus srities taškuose - prieš strėnų paviršinį raumenį, virš raumens ir už raumens.

Raumeningumas % - raumeningumas apskaičiuojamas mėsos plotą padauginus iš 100 ir

padalijus iš lašinių ploto. Juo procentas didesnis, tuo skerdena mėsingesnė.

2.3. Kalpastatino geno tyrimo metodika

2.3.1. DNR ekstrakcija Chelex dervų pagalba

Nukerpami 4 – 5 plaukų svogūnėliai ir patalpinami į mėgintuvėlius. Paruošiamas lizavimo mišinys (DTT -7,5 µl, Chelex- 200µl, Proteinaze K (20mg/ml)- 10.7µl). Mėgintuvėlio turinys užpilamas lizavimo mišiniu (vienam pavyzdžiui imama 218,2µl paruošto mišinio). Mėgintuvėliai 30 s. maišomi maišyklės „Vortex" pagalba. Centrifuguojami l0 s 13500 aps./min. greičiu. Pavyzdžiai 30 min. inkubuojami 56°C temperatūroje. Po inkubacijos mėginiai (po 10µm) pakaitinami 94°C temperatūroje (inaktyvuojami - amplifikatoriuje) bei paliekami nakčiai.

22 2.3.2. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas

Genominės DNR kiekis ir grynumas buvo nustatomas spektrofotometrinio metodo pagalba (DNA/RNA Reader, Pharmacia). Tam tikslui paruošiamas l00 μl skiestos DNR tirpalas: imama l0 μl koncentruotos DNR ir skiedžiama 90μl distiliuotu vandeniu. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo optinį tankį (OD) prie 260nm bangos ilgio. Kai OD = 1, tai l ml tirpalo yra 50ug dvigrandės DNR. DNR kokybė įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280 nm bangos ilgių. Švarumą rodo santykis OD260/OD280. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1.8 – 2.0. Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Baltymų koncentracija neturi viršyti 0.5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų daugiau, atlikamas pakartotinis genominės DNR valymas.

2.3.3. Kiaulių CAST (kalpastatino) geno tyrimo metodika Polimerazės grandinės reakcija – PGR – RFLP(Choi ir kt. 2006).

CAST geno pradmenys:

 Pirminis pradmuo 5’-GCG-TGC-TCA-TAA-AGA-AAA-AGC-3’

 Atvirkštinis pradmuo 5’-TGC-AGA-TAC-ACC-AGT-AAC-AG-3’

PGR buvo atlikta naudojant 50 ng DNR ir 50 l reakcijos mišinio. PGR reakcija vykdoma amplifikatoriuje (AppliedBiosystem; GeneAmp PCR System 2700) tokiu režimu:

94 OC, 5 min (pirminė denatūracija) 35 ciklai: 94 OC, 1min. (denatūracija),

60 O_{C 1 min. (oligonukleotidų prisijungimas),} 72°C 1,5 min. (DNR grandinėlės sintezė). 72 O_{C, Sintezės užbaigimui 10 min.}

4 lentelė. PGR komponentai kiaulių CAST geno tyrimui Eil.

Nr. PGR komponentai Vienai reakcijai atlikti

1 Buferis 1xPCR

2 MgCl2 (mM) 1,5

3 dNTP miksas 200 μM

4 Pirminis pradmuo 0,3 μM

23 PGR produkto karpymas fermentais:

PGR produktai buvo karpomi restrikcijos karpymo fermentais HinfI, MspI ir RsaI. Elektroforezė agarozės gelyje:

Karpytas PGR produktas elektroforezės būdu frakcionuojamas 2% agarozės gelyje. Gelis dažomas etidžio bromidu (0,5 μl). 15−20 min. ir analizuojamas UV šviesoje (bangos ilgis 300 nm) „MiniBisPro“ videodokumentavimo prietaisu (Herolab).

5 lentelė. Kiaulių CAST/HinfI aleliai ir genotipai.

Bp A B AA genotipas AB genotipas BB genotipas 790 — — — 500 — — —

6 lentelė. Kiaulių CAST/RsaI aleliai ir genotipai.

Bp E F EE genotipas EF genotipas FF genotipas 360 — — — 250 — — —

7 lentelė. Kiaulių CAST/MspI aleliai ir genotipai.

Bp C D CC genotipas CD genotipas DD genotipas 760 — — — 370 — — —

24 3. TYRIMŲ REZULTATAI

3.1 Kalpastatino geno polimorfizmo tyrimai 8 lentelė. Kalpastatino geno alelių dažniai tirtoje kiaulių grupėje.

CAST/HinfI genotipai CAST/MspI genotipai CAST/RsaI genotipai A alelio dažnis B alelio dažnis C alelio dažnis D alelio dažnis E alelio dažnis F alelio dažnis 0,255 0,745 0,106 0,893 0,883 0,117

Tirtoje kiaulių grupėje identifikuoti 6 kalpastatino geno aleliai. CAST/HinfI A alelio dažnis 0,255 žemesnis už B alelio dažnį 0,745. CAST/MspI C alelio dažnis žemesnis 0,106 už D alelio dažnį, kuris buvo 0,893. CAST/RsaI E alelio dažnis buvo didesnis 0,882 už F alelio dažnį 0,117.

9 lentelė. Kalpastatino geno genotipų dažniai tirtoje kiaulių grupėje.

CAST/HinfI genotipai CAST/MspI genotipai CAST/RsaIgenotipai AB genotipo dažnis BB genotipo dažnis CD genotipo dažnis DD genotipo dažnis EE genotipo dažnis EF genotipo dažnis 0,489 0,511 0,213 0,787 0,766 0,234

Tirtoje kiaulių grupėje identifikuoti 6 kalpastatino genotipai. Iš kurių dižiausią pasireiškimą turėjo CAST/MspI DD genotipo 0,787, o mažiausią pasireiškimą turėjo taip pat CAST/MspI genotipo CD genotipas. Šis skirtumas buvo statistiškai patikimas (p<0,05).

10 lentelė. Kalpastatino geno alelių dažniai tirtoje kiaulių grupėje pagal veisles.

Kalpastatinas LB DB J DBxL DBxJ DBxP CAST/HinfI genotipai A 0,364 0,25 0,1 0,437 0 0 B 0,636 0,75 0,9 0,563 1 1 CAST/MspI genotipai C 0,227 0,094 0,1 0,063 0,083 0,5

25

D 0,773 0,906 0,9 0,937 0,917 0,5

CAST/RsaIgenotipai

E 0,864 0,938 0,8 0,813 0,917 1

F 0,136 0,062 0,2 0,187 0,083 0

Pagal kalpastatino geno alelių dažnių pasireiškimą veislėse, CAST/HinfI genotipo dažniausiai pasireiškė kalpastatino geno alelis B atitikantis 1, visiškai nepasireiškė kalpastatino geno alelis A atitinkantis 0. CAST/MspI genotipo didžiausias pasireiškimas buvo kalpastatino geno alelio D, kuris atitiko 0,937, o nepasireiškė kalpastatino geno alelis C – 0. CAST/RsaI genotipo kalpastatino geno alelis E (0,917) atitinkantis DB × J, visiškai nepasireiškė kalpastatino geno alelis F (0), atitinkantis DB × P.

11 lentelė. Kalpastino geno genotipų dažniai tirtoje kiaulių grupėje pagal veisles.

Kalpastatinas LB DB J DBxL DBxJ DBxP CAST/HinfI genotipai AB 0,727 0,5 0,2 0,875 0 0 BB 0,273 0,5 0,8 0,125 1 1 CAST/MspI genotipai CD 0,455 0,188 0,2 0,125 0,167 1 DD 0,545 0,812 0,8 0,875 0,833 0 CAST/RsaI genotipai EE 0,727 0,875 0,6 0,625 0,833 1 EF 0,273 0,125 0,4 0,375 0,167 0

Pagal kalpastatino geno genotipų dažnių pasireiškimą kiaulių veislėse, visiškai nepasireiškė CAST/HinfI AB genotipo DB× J ir DB × P, dažniausiai pasireiškė taip pat AB genotipo DB × L, atitinkamai 0,875. CAST/MspI genotipo nepasireiškė kalpastatino geno alelis DD genotipo kiaulių DB × P, o dažniausiai pasireiškė kalpastatino geno alelis DD atitinkantis 0,875 kiaulių DB × L.

26 CAST/RsaI genotipo dažniausias pasireiškimas kiaulių EE genotipo DB × J (0,833), o visiškai nepasireiškė EF genotipo DB × P.

3.2 Kiaulių turinčių CAST/HinfI genotipą savybės.

12 lentelė. CAST/HinfI geno įtaka kiaulių mėsinėms savybėms.

Genotipas n Šiltos skerdenos masė, kg Skerdenos puselės ilgis, cm Bekono puselės ilgis, cm Nugaros raumens plotas, cm² Kumpio masė, kg AB 24 75,3± 0,024 99,2± 0,322 78,2± 0,316 39,4± 0,698 11,8± 0,051 BB 23 75,2± 0,181 98,6± 0,356 77,7± 0,356 41,9± 0,713 11,9± 0,059

Iš 5 – toje lentelėje pateiktų duomenų matome, kad šiltos skerdenos masės skirtumas tarp CAST/HinfI AB ir BB genotipo yra nežymus. AB individų jis buvo didesnis 0,1 kg (p<0,05). Skerdenų puselės ilgis ir bekono puselės ilgis atitinkamai 0,6 cm ir 0,5 cm buvo trumpesnės BB genotipo kiaulių. Nugaros raumenų plotas didesnis buvo kiaulių BB genotipo, jis buvo 2,5 cm² (p<0,05) didesnis, nei AB genotipo kiaulių. Kumpio masė nežymiai didesnė buvo kiaulių su BB genotipu, nei AB. Ji buvo didesnė 0,1 kg (p<0,05).

13 lentelė. CAST/HinfI geno įtaka kiaulių mėsinėms savybėms.

Genotipas n Lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, Mm Lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm Lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm Lašinių storis taške Fat2, mm Raumens storis taške Fat2, Mm Raumenin gumas, % AB 24 18,6± 0,795 17,2± 0,825 17,7± 0,7 15,9± 0,8 15,9± 0,7 54,1± 0,7

27 BB 23 18,0± 0,435 15,9± 0,382 16,8± 0,389 14,2± 0,478 14,4± 0,425 55,6± 0,485

Mažesnį lašinių storį turėjo BB genotipo kiaulės, nei AB genotipo. Storis atitinkamai mažesnis 0,6 mm ties 6 – 7 šonkauliu, 1,3 mm ties 10 šonkauliu, 0,9 mm už paskutinio šonkaulio, Fat2 taške 1,7 mm. Didesnis raumeningumas kiaulių turinčių AB genotipą 1,5 % didesnis, nei BB genotipo.

14 lentelė. CAST/HinfI geno įtaka kiaulių penėjimosi savybėms.

Genotipas n Amžius esant 100 kg masės, d. Priesvoris per parą, g Suvartota pašarų per penėjimosi laikotarpį, kg Pašarų sanaudos 1 kg priesvorio AB 24 177,1± 2,848 745,8± 21,717 180,4± 1,512 2,74± 0,033 BB 23 171,9± 2,369 780,0± 18,183 174,6± 1,544 2,67± 0,034

BB genotipo kiaulės 5,2 d. greičiau pasiekė 100 kg masę, nei AB genotipo kiaulės (p<0,05). Didesnis priesvoris per parą taip pat buvo didesnis BB genotipo kiaulių 34,2 g, nei AB genotipo.

Per penėjimosi laikotarpį pašarų daugiau suvartojo AB genotipo kiaulės 5,8 kg daugiau už BB genotipo kiaules. Pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio AB genotipo kiaulių buvo didesnis 0,07 kg už BB genotipo (p<0,05). Statistiškai lyginant pašarų sąnaudas gauti statistiškai patikimi rodikliai.

28 3.3. Kiaulių turinčių CAST/MspI genotipą savybės.

15 lentelė. CAST/MspI geno įtaka kiaulių mėsinėms savybėms.

Genotipas n Šiltos skerdenos masė, kg Skerdenos puselės ilgis, Cm Bekono puselės ilgis, cm Nugaros raumens plotas, cm² Kumpio masė, kg CD 11 75,3± 0,198 98,7± 0,422 77,3± 0,422 43,3± 0,422 11,8± 0,056 DD 36 75,3± 0,123 98,9± 0,261 78,1± 0,284 40,9± 1,68 11,8± 0,048

Iš 8 – toje lentelėje pateiktų duomenų matome, kad šiltos skerdenos masė tarp CAST/MspI CD ir DD genotipo kiaulių yra vienoda (p<0,05). Skerdenų puselės ilgis ir bekono puselės ilgis atitinkamai 0,2 cm ir 0,8 cm buvo trumpesnės CD genotipo kiaulių. Nugaros raumenų plotas didesnis buvo kiaulių CD genotipo, jis buvo 2,4 cm² (p<0,05) didesnis, nei DD genotipo kiaulių. Kumpio masė abiejų genotipų CC ir DD buvo vienoda (p<0,05).

16 lentelė. CAST/MspI geno įtaka kiaulių mėsinėms savybėms.

Genotipas n Lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, Mm Lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm Lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm Lašinių storis taške Fat2, mm Raumens storis taške Fat2, Mm Raumenin gumas, % CD 11 20,6± 0,754 19,3± 0,892 20,0± 0,744 14,2± 0,455 17,9± 0,680 51,6± 0,796 DD 36 17,0± 0,467 16,2± 0,467 16,4± 0,422 17,9± 0,998 14,3± 0,457 55,8± 0,420

29 Mažesnį lašinių storį turėjo DD genotipo kiaulės, nei CD genotipo. Storis atitinkamai mažesnis 0,287 mm ties 6 – 7 šonkauliu, 0,425 mm ties 10 šonkauliu, 0,322 mm už paskutinio šonkaulio. Fat2 taške lašinių storis CD genotipo didesnis 0,543 mm, nei DD genotipo kiaulių. Raumens storis taške Fat2 didesnis CD genotipo kiaulių, 0,376 mm didesnis, nei genotipo kiaulių. Didesnis raumeningumas kiaulių turinčių DD genotipą 4,2 % didesnis, nei CD genotipo.

17 lentelė. CAST/MspI geno įtaka kiaulių penėjimosi savybėms.

Genotipas n Amžius esant 100 kg masės, d. Priesvoris per parą, g Suvartota pašarų per penėjimosi laikotarpį, kg Pašarų sanaudos 1 kg priesvorio CD 11 174,3± 4,538 783,0± 29,907 176,0± 2,424 2,94± 0,041 DD 36 174,7± 2,064 756,3± 16,353 178,0± 1,235 2,73± 0,023

DD genotipo kiaulės 0,4 d. greičiau pasiekė 100 kg masę, nei CD genotipo kiaulės (p<0,05). Didesnis priesvoris per parą taip pat buvo didesnis CD genotipo kiaulių 26,7 g, nei DD genotipo.

Per penėjimosi laikotarpį pašarų daugiau suvartojo DD genotipo kiaulės 2 kg daugiau už CD genotipo kiaules. Pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio CD genotipo kiaulių buvo didesnis 0,21 kg už DD genotipo (p<0,05).

3.4. Kiaulių turinčių CAST/RsaI genotipą savybės.

18 lentelė. CAST/RsaI geno įtaka kiaulių mėsinėms savybėms.

Genotipas n Šiltos skerdenos masė, kg Skerdenos puselės ilgis, Cm Bekono puselės ilgis, cm Nugaros raumens plotas, cm² Kumpio masė, kg

30 EE 35 75,3± 0,023 99,0± 0,267 78,1± 0,274 40,7± 0,564 b\ 11,8± 0,045 EF 12 75,1± 0,048 98,7± 0,410 77,7± 0,481 40,4± 1,603 11,9± 0,079

Iš 11 – toje lentelėje pateiktų duomenų matome, kad šiltos skerdenos masės skirtumas tarp CAST/RsaI EE ir EF genotipo yra nežymus. EE individų jis buvo didesnis 0,2 kg (p<0,05). Skerdenų puselės ilgis ir bekono puselės ilgis atitinkamai 0,3 cm ir 0,4 cm buvo trumpesnės EF genotipo kiaulių. Nugaros raumenų plotas didesnis buvo kiaulių EE genotipo, jis buvo 0,3 cm² (p<0,05) didesnis, nei EF genotipo kiaulių. Kumpio masė nežymiai didesnė buvo kiaulių su EF genotipu, nei EE. Ji buvo didesnė 0,1 kg (p<0,05).

19 lentelė. CAST/RsaI geno įtaka kiaulių mėsinėms savybėms.

Genotipas n Lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, Mm Lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm Lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm Lašinių storis taške Fat2, mm Raumens storis taške Fat2, Mm Raumenin gumas, % EE 35 17,6± 0,413 16,1± 0,411 16,8± 0,404 14,6± 0,474 14,8± 0,422 55,1± 0,449 EF 12 18,8± 1,185 17,5± 1,258 18,1± 1,105 15,9± 1,161 16,0± 1,090 54,3± 1,124

Mažesnį lašinių storį turėjo EE genotipo kiaulės, nei EF genotipo. Storis atitinkamai mažesnis 1,2 mm ties 6 – 7 šonkauliu, 1,4 mm ties 10 šonkauliu, 1,3 mm už paskutinio šonkaulio, Fat2 taške 1,3 mm. Raumens storis taške Fat2 didesnis EF genotipo kiaulių, 1,2 mm didesnis, nei EE genotipo kiaulių. Didesnis raumeningumas kiaulių turinčių EE genotipą 0,8 % didesnis, nei EF genotipo.

31 20 lentelė. CAST/RsaI geno įtaka kiaulių penėjimosi savybėms.

Genotipas n Amžius esant 100 kg masės, d. Priesvoris per parą, g Suvartota pašarų per penėjimosi laikotarpį, kg Pašarų sanaudos 1 kg priesvorio EE 35 173,1± 2,053 774,0± 16,910 177,2± 1,321 2,70± 0,022 EF 12 177,8± 4,107 738,0± 26,484 178,1± 2,046 2,73± 0,048

EE genotipo kiaulės 4,7 d. greičiau pasiekė 100 kg masę, nei EF genotipo kiaulės (p<0,05). Didesnis priesvoris per parą taip pat buvo didesnis EE genotipo kiaulių 36 g, nei EF genotipo.

Per penėjimosi laikotarpį pašarų daugiau suvartojo EF genotipo kiaulės 0,9 kg daugiau už EE genotipo kiaules. Pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio EF genotipo kiaulių buvo didesnis 0,03 kg už EE genotipo (p<0,05). Statistiškai lyginant pašarų sąnaudas gauti statistiškai patikimi rodikliai.

32 4. REZULTATŲ APTARIMAS

Skeleto raumenų augimo tempas bei dydis priklauso nuo trijų pagrindinių faktorių: raumenų baltymų sintezės greičio, raumenų baltymų degradacijos greičio ir nuo skeleto raumenų ląstelių skaičiaus bei dydžio. Naujausi tyrimai parodė, kad kalpino veikla yra reikalinga mioblastų sintezei ir ląstelių proliferacijai, taip pat ir ląstelių augimui. Kalpino sistema gali taip pat paveikti naminių gyvūnų skeleto raumenų ląstelių skaičių keičiant mioblastų proliferacijos tempą ir moduliuojant mioblastų sintezę. Daug tyrimų parodė, kad kalpino sistema yra taip pat svarbi normaliam skeleto raumenų augimui. Padidėjęs skeleto raumenų augimo tempas gali būti nulemtas sumažėjusio raumenų baltymų degradacijos greičio ir tai yra susiję su sumažėjusia kalpino sistemos veikla dėl to, kad labai padidėjęs kalpastatino aktyvumas. Šie pastebėjimai rodo, kad genai koduojantys kalpinus ir kalpastatiną gali būti laikomi kaip genai kandidatai nulemiantys liesą kiaulių skerdeną.

Biocheminis kelias raumenų vystymuisi ir fiziologijai gali būti šaltiniu genams kandidatams veikiantiems produkcinius požymius kiaulėse. Kalpino – kalpastatino proteolitinė sistema vaidina svarbų vaidmenį skeleto raumenų vystymuisi po gimimo (Goll ir kt., 1992), įskaitant mioblastų sintezę ir ląstelių proliferaciją bei augimą (Balcerzak ir kt., 1995,1998; Barnoy et al., 1997). Buvo ištirta, kad kalpastatino pilna reguliacija yra svarbi mioblastų sintezės ankstyvosiose stadijose (Balcerzak ir kt., 1998). Todėl (naujagymiuose) paršeliuose, buvo rasta kad sumažėjusi ekspresija kalpino ir kalpastatino mRNR koreliavo su didele baltymo akumuliacija raumenų vystymosi metu (Li ir kt., 2009). Be to, kalpino – kalpastatino sistemos vaidmuo po skrodimo proteolitiniuose procesuose taip pat yra gerai žinoma, o taip pat įtakoja mėsos kokybines savybes tokias kaip švelnumas ir sugebėjimas sulaikyti vandenį (Kemp ir kt., 2010, Melody ir kt., 2004). Skeleto raumenyse, ši proteolitinė sistema susideda iš proteazių µ-kalpino ir m–kalpino, skeleto raumenims specifinio kalpino 3 ir endogeninio µ-kalpino ir m-kalpino, kalpastatino inhibitoriaus (Goll ir kt., 2003). Kiaulių kalpastatino (CAST) genas yra randamas SSC2q2.1-2.4 (Ernst ir kt., 1998) kuris atitinka 107 Mb SSC2 remiantis dabartine kiaulių genomo anotacija SScrofa10.2

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=retrieve&dopt=full_report&list_uids=39

7135). Dėl savo svarbumo raumenų vystymęsi ir poskerdiminių mechanizmų, kalpastatino (CAST)

genas plačiai tyrinėjamas kaip perspektyvus genas kandidatas kiaulienos savybėms. Buvo aprašytos asociacijos tarp CAST SNP ir/ar haplotipų susijusių su švelnumu, pH, spalva ir kitom ūkinėmis savybėmis (Ciobanu ir kt., 2004; Gandolfi ir kt., 2011; Krzęcio ir kt., 2008; Lindholm – Perry ir kt.,

33 2009; Meyers ir Beever, 2008; Nonneman ir kt., 2011; Škrlep ir kt., 2010). Dalis iš šių mokslininkų taip pat tyrinėjo CAST polimorfizmo poveikį požymiams susijusiais su džiovinto kumpio produkcija ir karkaso požymiais (Krzęcio ir kt., 2008; Škrlep ir kt., 2010). Buvo rasta, kad SNP (VNP) esantis 6 introne daro įtaką skerdenai (nugarinės ir kumpio svoriui) ir nugaros riebalų storiui (Kręcio ir kt., 2008). Be to, CAST mutacija Lys249Arg (Ciobanu ir kt., 2004) parodė poveikį žalio kumpio svoriui Slovėnų komerciniams kiaulių krosams (Škrlep ir kt., 2010).

Kalpastatino gene (CAST) polimorfizmams identifikuoti naudojamas intronas, kuriame yra

HinfI, MspI ir RsaI, fermentų kirpimo vietos (Ernst ir kt., 1998). Polimorfizmų identifikavimui mes

ir naudojome analogišką metodiką. Identifikavome trijose polimorfinėse vietose 6 alelius (A, B, C, D, E, F) ir 6 skirtingus genotipus (AB, BB, CD, DD, EE, EF). Mokslininkų tyrimų rezultatai įrodo, kad kiaulių 2 chromosoma asocijuojasi su mėsos kokybe ypač riebumu. (Kuryl ir kt., 2003; Ciobanu ir kt., 2004; Malek ir kt.,2001). Vykdydami 2 kiaulių chromosomos tyrimus mokslininkai įrodė, kad būtent CAST genas, esantis 2 chromosomoje veikia mėsos kokybę. (Krzęcio ir kt., 2004). Autoriai teigia, kad vykdant koreliaciją kiaulių selekcijoje galima geresnė skerdenos ir mėsos kokybė. Tolimesniuose tyrimose, tų pačių kryžminamų kiaulių, kurios turėjo kalpastatino (CAST) geną, polimorfizmams buvo rastos ir kitos polimorfinės vietos Hinf l ir Hpy l88I, buvo nustatyti reikšmingi ryšiai tarp kalpastatino geno (CAST/Hinf I) ir mėsos kokybės bruožų (Rybarczyk ir kt., 2010). Tyrinėjant CAST Hinfl, Rsal ir Mspl genotipų poveikį skerdenos požymiams skirtingoms kiaulių veislėms buvo nustatyta, kad CAST/Rsal ir CAST/Mspl genotipai turėjo poveikį keletui kiaulių mėsos ir riebalų atsidėjimo požymių. Mūsų gautais tyrimų rezultatais buvo nustatyta, kad CAST/MspI CD genotipo kiaulės turėjo didesnę nugaros raumenų plotą ir kumpio masę lyginant su kitų kalpastatino genotipų kiaulėmis, o CAST/HinfI BB genotipo kiaulės buvo liesiausios. Vertinant CAST geno įtaką penėjimosi savybėms nustatėme, kad per penėjimosi laikotarpį mažiausiai pašarų sunaudojo ir didžiausią priesvorį pasiekė kiaulės turinčios CAST/HinfI BB genotipą.

Analizuojant mėsos kokybės požymius poveiktus CAST/Mspl genotipo buvo pastebėta, kad gyvūnai su BB genotipu, šiame lokuse buvo charakterizuojami kaip su pačiomis geriausiomis vertybėmis iš visų analizuotų savybių (Kręcio ir kt., 2005). Mokslininkai atrado, kad CAST/HinfI lokusas veikia raumeningumą, mėsos kokybę, elektros laidumą, Kuryl ir kt. (2004), nustatyta, kad tarp CAST/HinfI, CAST/MspI, CAST/RsaI lokusų CAST/HinfI pogrupio mėsos kokybė buvo aukščiausios vertės Grajewska ir kt. (1984), rasta, kad CAST/MspI lokuso kiaulės turėjo didesnį kumpio svorį Koćwin – Podsiadła ir kt. (2003), ir Kurył ir kt. (2004), CAST/RsaI gyvūnų BB genotipo kietesnė. CAST/MspI gyvūnai AA genotipo stangresnė ir eleastingesnė mėsa, nei AB ir BB genotipo Walstra ir Merkus (1996).

34 Kalpastatino geno polimorfizmo tyrimai atlikti skirtingose kiaulių veislėse parodė, kad atskirose veislėse randami skirtingi genotipų dažniai. Mūsų gauti kalpastino geno polimorfizmo tyrimų rezultatai koreliuoja su kitų mokslininkų tyrimų duomenimis: Didžiojoje Baltojoje kiaulių veislėje CAST/HinfI lokuse BB genotipą, turėjo 50 proc. kiaulių, AA genotipas nerastas, CAST/MspI lokuse vyravo DD genotipas (atitinkamai 81,2 proc.) CC genotipas nerastas, EE genotipą turėjo 87,5 proc. kiaulių. Kiti mokslininkai rado, kad Landrasų veislėje ir Didžiojoje Baltojoje kiaulių veislėse CAST/HinfI lokuse vyravo BB genotipas, kurį turėjo atitinkamai 86,7 proc. ir 85 proc. kiaulių, AA genotipas nerastas, CAST/MspI lokuse abiejose veislėse vyravo DD genotipas (atitinkamai 79,3 proc. ir 75 proc.) CC genotipas nerastas, Landrasų veislėje CAST/RsaI lokuse 100 proc. rado tik EE genotipo kaules, o Didžiojoje Baltojoje EE genotipą turėjo 80 proc. kiaulių (Rohrer. G.A. ir kt., 2009). Mūsų gauti kalpastino geno polimorfizmo tyrimų rezultatai koreliuoja su anksčiau minėtais tyrimų duomenimis: Didžiojoje Baltojoje kiaulių veislėje CAST/HinfI lokuse BB genotipą, turėjo 50 proc. kiaulių, AA genotipas nerastas, CAST/MspI lokuse vyravo DD genotipas (atitinkamai 81,2 proc.) CC genotipas nerastas, EE genotipą turėjo 87,5 proc. kiaulių. Kiaulių genomo sudėtingumo supratimas žemės ūkio tikslams išlieka svarbus iššūkis, tikintis kuo daugiau sąsajų su ūkiniais požymiais atradimo. Per praėjusį dešimtmetį, molekulinės technikos panaudojimas leido identifikuoti daug genų bei požymių taip pat sudaryti genolapius ir atlikti daug genų testų norint pagerinti kiaulienos produkciją,. Puikūs pavyzdžiai yra rianodino receptoriaus genas (halotano genas) atsakingas už mėsos kokybę, estrogenų receptoriaus genas atsakingas už vados dydį ir kiekybinių požymių lokusų genetiniai markeriai atsakingi už augimą, riebumą, vados dydį. Augimo dažnis, pašarų įsisavinimas ir liesos mėsos kiekis yra svarbūs požymiai kiaulininkystėje. Genų, įtakojančių šių požymių identifikaciją, gali padėti atrasti žymenis, naudingus selekcijai ir gali būti ekonomiškai naudingi kiaulių veisimui.

35 IŠVADOS

1. Atlikus kalpastatino geno tyrimus tarp Lietuvoje veisiamų kiaulių buvo identifikuoti šeši geno aleliai trijose polimorfinėse geno vietose CAST/HinfI, CAST/MspI, CAST/HinfI .

2. Visose tirtose veislėse vyravo CAST/HinfI B alelis ir AB genotipas, CAST/MspI D alelis ir DD genotipas, CAST/HinfI E alelis ir EE genotipas.

3. Atlikus kalpastatino geno tyrimus nustatyta, kad didžiausią įtaką raumenų vystimuisi turėjo CAST/HinfI B alelis.

4. Tiriant kalpastino geno įtaką mėsinėms savybėms buvo nustatyta, kad CAST/MspI CD genotipo kiaulės turėjo statistiškai reikšmingai didesnę nugaros raumenų plotą ir kumpio masę lyginant su kitų kalpastino genotipų kiaulėmis, o CAST/HinfI BB genotipo kiaulės buvo liesiausios.

5. Vertinant CAST geno įtaką penėjimosi savybėms nustatyta, kad per penėjimosi laikotarpį mažiausiai pašarų sunaudojo ir didžiausią priesvorį pasiekė kiaulės turinčios CAST/HinfI BB genotipą.