AUKŠTO DAŽNIO ULTRAGARSO TYRIMO IR IMUNOHISTOCHEMINIŲ ŽYMENŲ REIKŠMĖ MELANOCITŲ KILMĖS ODOS NAVIKŲ DIAGNOSTIKAI

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

Gintarė Linkevičiūtė

AUKŠTO DAŽNIO ULTRAGARSO

TYRIMO IR IMUNOHISTOCHEMINIŲ

ŽYMENŲ REIKŠMĖ MELANOCITŲ

KILMĖS ODOS NAVIKŲ

DIAGNOSTIKAI

Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,

Disertacija rengta 2013–2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Odos ir venerinių ligų klinikoje.

Mokslinė vadovė

prof. dr. Skaidra Valiukevičienė (Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos medicinos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė

prof. dr. Elona Juozaitytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

Nariai:

prof. habil. dr. Vaiva Lesauskaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

prof. dr. Algidas Basevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

doc. dr. Rūta Gancevičienė (Vilniaus universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

prof. habil. dr. Jacek C. Szepietowski (Vroclovo medicinos universi-tetas (Lenkija), biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

Disertacija bus ginama viešame Medicinos mokslo krypties tarybos posėdy-je 2018 m. birželio 21 d. 13 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES

Gintarė Linkevičiūtė

THE SIGNIFICANCE OF HIGH

FREQUENCY ULTRASOUND AND

IMMUNOHISTOCHEMICAL

MARKERS FOR DIAGNOSIS OF

MELANOCYTIC SKIN TUMOURS

Doctoral Dissertation Biomedical Sciences,

The Dissertation has been prepared at the Department of Skin and Venereal Diseases of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2013–2018.

Scientific Supervisor:

Prof. Dr. Skaidra Valiukevičienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

The Dissertation is defended at the Medical Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences:

Chairperson

Prof. Dr. Elona Juozaitytė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Members:

Prof. Habil. Dr. Vaiva Lesauskaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B) Prof. Dr. Algidas Basevičius (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Assoc. Prof. Dr. Rūta Gancevičienė (Vilnius University, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Prof. Habil. Dr. Jacek C. Szepietowski (Wroclaw Medical University (Poland), Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Dissertation will be defended at the open session of the Medical Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences on the 21st _{of June,} 2018 at 1.00 PM in the auditorium 202 of the Lithuanian University of

TURINYS

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 9

1. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 11

1.1. Darbo tikslas ... 11

1.2. Uždaviniai ... 11

1.3. Darbo mokslinis naujumas ... 11

2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

2.1. Odos melanoma ir jos gylio vertinimo svarba ligos išplitimo prognozei ... 12

2.2. Melanocitų kilmės odos navikų gylio ir struktūros tyrimai aukšto dažnio ultragarsu ... 13

2.3. Patologijos tyrimo ir imunohistocheminių žymenų reikšmė melanocitų kilmės odos navikų diagnostikai ... 21

3. TYRIMO METODIKA ... 24

3.1. Pasirengimas tyrimui ... 24

3.2. Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo etapai ... 24

3.3. Tyrimo eiga ... 27

3.3.1. Melanocitų kilmės odos naviko klinikinių požymių įvertinimas ... 27

3.3.2. Ultragarsinis tyrimas ... 28

3.3.3. Melanocitų kilmės odos naviko išpjovimas ... 31

3.3.4. Histologinis ir imunohistocheminis tyrimai ... 31

3.4. Statistinis duomenų vertinimas ... 35

4. DARBO REZULTATAI ... 39

4.1. Aukšto dažnio ultragarsu (rankiniu bei automatiniu būdais) ir histologiniu tyrimu išmatuoto melanocitų kilmės odos naviko gylio sąsaja priklausomai nuo naviko morfologinių požymių .... 39 4.2. Melanocitų kilmės odos navikų ultragarso vaizdo ypatumai

5. DARBO REZULTATŲ APTARIMAS ... 62

IŠVADOS ... 68

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 70

PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA ... 76

SUMMARY ... 108 PRIEDAI ... 137 1 priedas ... 137 2 priedas ... 139 3 priedas ... 140 4 priedas ... 142 CURRICULUM VITAE ... 143 PADĖKA ... 144

SANTRUMPOS

AJCC – Amerikos jungtinis vėžio komitetas bendr. – bendraautoriai

GS – galimybių santykis

IH – imunohistocheminis (-iai) K1 – pirmasis 25 proc. kvartilis K3 – trečiasis 75 proc. kvartilis

Kauno klinikos – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) ligoninė Kauno klinikos

kt. – kita, kitas, kiti

KTU UI – Kauno technologijos universiteto prof. K. Baršausko Ultragarso mokslo institutas

LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas MA – melanocitų kilmės apgamas

MN – melanocitų kilmės odos navikas MRN – matavimo rezultatų nesutapimas N – tyrime dalyvavusių pacientų skaičius

n – tirtų melanocitų kilmės odos navikų skaičius

OM – odos melanoma

OVLK – LSMU MA Odos ir venerinių ligų klinika p – reikšmingumo lygmuo, statistinis patikimumas,

tikimybė

pBG – naviko gylis pagal Breslau, išmatuotas histologinio tyrimo metu

pBG (HE) – naviko gylis, išmatuotas hematoksilinu ir eozinu dažytuose histologiniuose preparatuose

pBG (S100) – naviko gylis, išmatuotas S100 žymeniu dažytuose histologiniuose preparatuose

pBG (derinys) – naviko gylis, išmatuotas trijų imunohistocheminių žymenų deriniu dažytuose histologiniuose

preparatuose

PI – pasikliautinieji intervalai proc. – procentas (-ai)

R² – determinacijos koeficientas

|r| – Spirmeno koreliacijos koeficientas SLB – sarginio limfmazgio biopsija

aT – naviko gylis, nustatytas automatiškai ultragarsinio tyrimo metu

UG – ultragarsas

z – z kriterijus

χ2 _{– chi kvadrato kriterijus}

Δ BG 1 – vidurkio skirtumas tarp pBG (HE) ir pBG (S100) Δ BG 2 – vidurkio skirtumas tarp pBG (HE) ir pBG (derinys)

ĮVADAS

Odos melanoma (OM) – piktybinis melanocitų kilmės navikas (MN), kuris sukelia didžiausią mirtingumą lyginant su kitais piktybiniais odos navikais pažengusioje ligos stadijoje [40]. Todėl OM ankstyvoji diagnosti– ka, naudojant neinvazines odos vaizdinimo technologijas, yra labai aktuali. Daugiau nei pusės OM pirmtakas yra gerybinis melanocitų kilmės pigmen-tinis apgamas (MA). Lietuvoje OM paplitimas nėra aukštas, todėl šiame tyrime kaip ir kituose tyrimuose [13, 38, 42, 71] analizuoti OM ir MA atvejai kartu.

Vienas iš svarbiausiųjų OM prognozės veiksnių yra naviko gylis pagal Breslau (pBG), nustatytas histologinio tyrimo metu hematoksilinu – eozinu (HE) dažytame preparate [29]. Odos melanomos pBG (HE) yra sarginio limfmazgio biopsijos (SLB) atlikimo ar neatlikimo kriterijus, nes mikrome-tastazių suradimas sarginiame limfmazgyje yra reikšmingas ligos išplitimui įvertinti [40]. Rekomenduojama atlikti SLB, kai OM yra ≥1 mm gylio.

Klinikinių tyrimų duomenimis, MN gylio parametrai išmatuoti aukšto dažnio 20–100 MHz ultragarsu (rT) ir histologinio tyrimo metu (pBG (HE)) turi patikimą tarpusavio sąsają [38, 42, 50, 67, 71]. Tačiau tiriant <1 mm gylio MN nustatytas silpnesnis rT ir pBG (HE) ryšys [62, 81, 92]. Daugu-moje tyrimų [38, 67, 92] buvo pastebėtas MN gylio pervertinimas matuojant jį aukšto dažnio ultragarsu (UG) lyginant su pBG(HE). Iki šiol nėra pilnai aiški šio rT ir pBG nesutapimo priežastis. Vieni tyrėjai rT ir pBG (HE) nesutapimą sieja su naviko aplinkos limfocitų infiltratu – tokiu atveju, tiriant UG, sunkiau surasti naviko apatinį kraštą. Kiti tyrėjai nustatė, kad už pBG (HE) didesnis rT dažnesnis tais atvejais, kai OM susiformavusios iš MA [20, 38, 59, 67, 92].

Kai kurie autoriai svarsto, kad odos priklausiniai, pvz., riebalų liaukos ar plaukų folikulai, taip pat galimai reikšmingi rT ir pBG matavimų nesutapimui, bet dar nėra moksliniais tyrimais pagrįsto bendro sutarimo tarp tyrėjų [20, 81]. Kitų autorių duomenimis, melanocitų dydis, forma ir pasi-skirstymas epidermyje ar dermoje, limfocitų infiltrato laipsnis ir lokalizacija bei melanofagų kiekis dermoje reikšmingai skiriasi priklausomai nuo MN rūšies ir displazijos laipsnio [11, 34, 48, 95]. Todėl šiame perspektyviniame tyrime siekta nustatyti rT ir pBG (HE) ryšio stiprumą bei šių parametrų nesutapimo sąsają su MN morfologiniais požymiais.

pirmą kartą MN gylis išmatuotas šio darbo autorės ir kitų sukurta automa-tine ultragarso B-tipo vaizdų analizės programa ir nustatyta rT ir automati-niu būdu (aT) atliktų matavimų sąsaja su pBG (HE).

Po naviko išpjovimo patologinės medžiagos dažymas HE yra iki šiol auksinis standartas OM gylio pagal Breslau (pBG) nustatymui [3]. Tyrimų duomenimis, OM gylio pagal Breslau (pBG) matavimo tikslumo tarp skir-tingų tyrėjų sutapimas svyruoja nuo 68,8 proc. iki 84,8 proc., priklausomai nuo patologo patirties [73]. Todėl 15,5 proc. OM atvejų, kurių pBG<1 mm gali būti klaidingai priskirtos OM in situ ar invazinei jos formai, kai BG išmatuojamas ≥1 mm [32]. Dėl MN ir OM morfologinių formų įvairovės pasitaiko atvejų, kai patyrę dermatopatologai neišvengia klaidingai neigia-mų išvadų diagnozuojant OM ar atvirkščiai. Imunohistocheminiai (IH) tyri-mai suteikia papildomos informacijos apie melanocitų brandumą ir padeda tiksliau nustatyti melanocitų displaziją bei jų skvarbą į dermą [79]. IH žymenų spalvinės reakcijos išryškina atsiskyrusius nuo naviko pavienius melanocitus ar smulkius jų lizdus dermoje bei melanocitus, kurie dėstosi išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos [27, 45]. Skirtingai, šių morfo-loginių požymių vertinimas HE preparatuose ribotas. Neretai MN preparate dažytame HE melanocitus būna sunku atskirti nuo histiocitų, melanofagų, ypač kai yra ryškus limfocitų infiltratas aplink naviką [27, 45]. Tyrimų duo-menimis, atliekant IH reakcijas, pirminė OM panašiu dažnumu reaguoja su polikloniniais antikūnais prieš S100 baltymą ir monokloniniais antikūnais prieš Melan-A, HMB-45 bei tirozinazę [78]. Tačiau OM audinių dažymas vienu metu keliais monokloniniais antikūnais („kokteiliu“) rodo aukštesnį tyrimo specifiškumą, nei vienu S100 žymeniu, diferencijuojant OM rūšį [78]. Iki šiol atlikta gana mažai tyrimų [27, 31] apie IH žymenų reikšmę MN gylio ir struktūros vaizdinimui histologiniame preparate. Atsižvelgiant į tai šiame tyrime pirmą kartą ištirta kelių IH žymenų (S100 bei jų derinio – HMB-5, Melan-A ir tirozinazė) svarba įvertinti MN gylį ir struktūros ypatu-mus, lyginant su standartinio histologinio tyrimo požymiais.

Disertacinio darbo tema OM diagnostikos srityje yra aktuali mokslinia-me ir praktiniamokslinia-me darbe. Gauti tyrimo rezultatai pateikia moksliškai naujas išvadas apie aukšto dažnio ultragarso tyrimo ir informacinių technologijų (automatinės naviko gylio vertinimo programos) svarbą neinvazinei OM diagnostikai. Iki šio nėra atlikta tyrimų, ar kelių imunohistocheminių žyme-nų naudojimas gali pagerinti MN gylio ir morfologinių ypatumų vaizdinimą, lyginant su standartiniu HE dažymu ir vertinimu histologiniame preparate. Disertacinio darbo išvados yra aktualios kelių sričių specialistams,

vykdan-1. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI

1.1. Darbo tikslas

Įvertinti aukšto dažnio ultragarso tyrimo ir imunohistocheminių žymenų reikšmę melanocitų kilmės odos navikų (melanomos ir jos pirmtakų mela-nocitų kilmės apgamų) diagnostikai.

1.2. Uždaviniai

1. Įvertinti aukšto dažnio ultragarsu (rankiniu bei automatiniu būdais) ir histologiniu tyrimu išmatuoto melanocitų kilmės odos naviko gylio sąsają priklausomai nuo naviko morfologinių požymių.

2. Ištirti melanocitų kilmės odos navikų ultragarso vaizdo ypatumus (struktūra, kraštai, riba tarp naviko ir aplinkinių audinių) priklausomai nuo jų histologinės sandaros.

3. Nustatyti imunohistocheminių žymenų (S100 bei jų derinio, t. y. HMB-45, Melan-A ir tirozinazė) reikšmę melanocitų kilmės odos naviko gyliui ir sandaros ypatumams įvertinti, lyginant su požymiais histologiniame HE dažytame preparate.

1.3. Darbo mokslinis naujumas

Tai pirmasis disertacinis darbas Lietuvoje apie MN gylio ir struktūros vaizdinimą, panaudojant aukšto dažnio ultragarsą ir imunohistoheminius žymenis.

Mūsų žiniomis, iki šiol nėra atlikta tyrimų apie MN gylio automatinį vertinimą UG tyrimo metu, kuris pritaikytas klinikinėje praktikoje. Anks-čiau atliktų tyrimų duomenimis, MN gylis matuojamas B-tipo vaizduose rankiniu būdu pažymint naviko ribas interaktyviais UG sistemos žymekliais. Rankiniu būdu naviko ribų žymėjimui UG atlikti reikia tyrimą atliekančio specialisto patirties ir prailgėja paties tyrimo atlikimo laikas. Todėl darbo autorės ir bendraautorių buvo sukurta klinikinei praktikai tinkama UG vaiz-dinamo naviko ribų aptikimo ir gylio vertinimo automatinė programa [65] ir šiame darbe atliktas jos tikslumo tyrimas.

Šiame darbe iškėlėme ir tikrinome prielaidas, ar OM ir MA ultragarso vaizdo ir gylio ypatumai turi ryšį su jų morfologiniais požymiais, ar skiriasi

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Odos melanoma ir jos gylio vertinimo svarba ligos išplitimo prognozei

Odos melanoma (OM) – tai piktybinis, linkęs metastazuoti navikas, kuris formuojasi iš pakitusių melanocitų ir dažniausiai aptinkamas odoje [40]. Pagrindiniai rizikos veiksniai yra genetiniai (paveldimumas, šviesi oda) ir išoriniai (ultravioletinė spinduliuotė) [40, 98]. Sergamumo OM rodikliai tarp baltaodžių pasaulyje [33, 40] ir Lietuvoje [75] sparčiai auga. Europoje diagnozuojama <10–25/100 000 gyventojų naujų OM atvejų. Palyginus su Europos regionu, Lietuvos gyventojų iki 55 metų amžiaus sergamumas odos melanoma yra vidutinis (10,5 naujų atvejų iš 100 000 gyventojų), tačiau dažniau diagnozuojama vėlyvesnėse stadijose. 2012 metų duomenimis, I stadijos OM sudaro 41,1 proc. visų naujų ligos atvejų mūsų šalyje [75], todėl labai svarbi yra ankstyva jos diagnostika. Sergančiųjų OM 10 metų išgyvenamumas svyruoja nuo 75 iki 85 proc. jei diagnozuojamas ir pradedamas gydyti pirminis neišplitęs navikas, o jei aptinkama sritinių limf-mazgių metastazių – nuo 20 iki 40 proc. OM stadija nustatoma pagal Amerikos jungtinio vėžio komiteto (AJCC) TNM klasifikaciją. Remiantis 7–ojo leidimo AJCC klasifikacija, svarbiausieji OM prognozės veiksniai yra per patologijos tyrimą nustatytas pirminio naviko gylis pagal Breslau (pBG), jo išopėjimas ir mitozių skaičius [29]. Nuo 2018 m. įsigaliojo 8-ojo leidimo AJCC klasifikacija, pagal ją pT1 (pirminio naviko patologinė stadija) kategorija turi dvi subkategorijas, kurios pagal pBG suskirstytos atitinkamai pT1a – ≤0,8 mm ir pT1b – nuo 0,8 iki 1,0 mm [3].

Pirminės OM chirurginis gydymas turi būti radikalus ir jos operacijos planas priklauso nuo naviko gylio (pBG). Įprastai odos melanomos pBG vertinamas naviko histologiniame preparate, dažytame hematosklinu – eozi-nu. Kai histologinio tyrimo metu nustatomas OM gylis ≤2,0 mm, per operaciją sveikų audinių kraštai turi būti ne mažiau nei 1 cm nuo pirminio naviko ar jo rando, jei melanoma operuojama per du etapus, tai yra pirma, atliekama jos diagnostinė ekscizija, antrame etape – radikali operacija. Atitinkamai jei OM pBG >2,0 mm, sveikų audinių ribos per operaciją turi būti 2 cm nuo naviko ar jo rando kraštų, jei taip plačiai išoperuoti leidžia anatominė naviko sritis [40].

limf-Sarginis limfmazgis – tai vienas ar keli sritiniai limfmazgiai, kurie pirmieji per aferentines limfagysles surenka naviko limfą [52]. Jei OM pBG (HE) rodmuo yra gilesnis nei 1 mm, rekomenduojama atlikti SLB dėl mikrome-tastazių (pagal AJCC klasifikacijos 8-ąjį leidimą nuo 0,8 mm gylio).

Vidutiniškai 25–33 proc. OM vystosi iš jos pirmtakų melanocitų kilmės apgamų (MA) [22, 63]. MA – tai gerybinis odos navikas atsirandantis dėl melanocitų proliferacijos [22].MA ir OM vystymąsi sieja tokie patys rizikos veiksniai [70], todėl, iki šiol MA, kurie dažniau paplitę nei OM, daugelio mokslininkų naudojami kaip modelis OM klinikiniuose tyrimuose [22].

Displazinis MA yra nustatomas, remiantis histologinių požymių klasifi-kacija, kuri neretai kelia prieštaravimų dėl žemos patologinės displazijos lapsnio apibrėžties koreliacijos tarp skirtingų patologų [94]. Vis dar išlieka tarp tyrėjų galutinai neapibrėžta displazinio MA klinikinė diagnostika ir gydymo taktika, taip pat ir reikšmė OM išsvystymui [101]. Todėl šiame darbe nesiekta nustatyti displazinio MA klinikinės ir patologinės displazijos laipsnio, bet vadovautasi gydytojo patologo išvada apie MA displaziją, yra ji ar nėra (žr. 31 psl.).

2.2. Melanocitų kilmės odos navikų gylio ir struktūros tyrimai aukšto dažnio ultragarsu

Pirmą kartą ultragarso (UG) tyrimas (15 MHz) odos navikų tyrimui ir įsiskverbimo į odą gylio matavimui pasiūlytas naudoti 1979 m. [1]. Išski-riami UG tyrimo dermatologjoje privalumai – neinvazinis, greitai atlieka-mas, nebrangus tyriatlieka-mas, kuris suteikia informaciją apie tiriamą objektą realiu laiku [50].

Odos vaizdą tiriant UG nulemia kolageno skaidulų savybės, keratinas ir vandens kiekis. Odos kolageno kiekis, jo tipas lemia dermos (tikrosios odos) echogeniškumą. Echogeniškumas (angl. echogenicity) yra audinio gebėjimas atspindėti UG signalą kitų audinių atžvilgiu [2, 49]. Jei audinių struktūros yra skirtingo echogeniškumo, skirtingai jos atvaizduojamos ir UG vaizde. Audiniai, kurie gerai atspindi UG bangas vadinami „hiperechogeniniais“, jie yra šviesesnės spalvos lyginant su aplinkiniais UG tyrimo vaizde. Priešingai, silpniau atspindintys UG bangas, mažesnio echogeniškumo audiniai vadinami „hipoechogeniniais“ ir dažniausiai būna tamsesni (žr. 28–29 psl.) [2, 49]. Tiriant odą UG, ypač gerai atspindi storas keratinas (echogeniškumas didėja), o vanduo dermoje prastai atspindi UG bangas (echogeniškumas mažėja). Ultragarso sklindimo greitis odoje vidutiniškai siekia 1580 m/s [50, 58].

Tyrimų duomenimis, aukšto dažnio (20–100 MHz) UG keitikliai turi 16–80 μm skiriamąją gebą ir įsiskverbia į odą apytiksliai nuo 1 iki 6 mm. Didinant ultragarso dažnį gerėja vaizdo raiška ir geba atskirti struktūras, tačiau didelis UG dažnis sumažina ultragarso bangos skvarbą [50, 103]. Odos audinių vaizdinimas ir skvarbos gylis priklausomai nuo ultragarso dažnio pateiktas 2.2.1 lentelėje.

2.2.1 lentelė. Odos audinių vaizdinimas ir skvarbos gylis priklausomai nuo ultragarso dažnio [50]

Dažnis, MHz Apytikslis skvarbos gylis, cm Vaizdinimas

7,5 >4 Poodis, limfmazgiai

13,5–15 3,0–0,3 Epidermis, dermis

20 0,6–0,7 Epidermis, dermis

50–100 0,3–0,015 Epidermis

Komercinėse aukšto dažnio UG sistemose naudojamas vieno elemento fokusuotas keitiklis, kuris mechaniškai judėdamas užregistruoja dvimatį (2D) odos pjūvio vaizdą (B-tipo) [50, 58].Sveikos odos aukšto dažnio UG vaizde matoma aiškių ribų hiperechogeninė juosta, kuri yra tarp keitiklio ir odos paviršiaus, vadinama epidermio „įėjimu“ (angl. entry echo). Po juo – tikroji oda, kuri atvaizduojama kaip hiperechogeninis sluoksnis su smulkiais hipoechogeniniais ploteliais, kurie atsiranda dėl plaukų folikulų, krauja– gyslių ir riebalinių liaukų. Giliau stebimas poodis – hipoechogeninė zona su hiperechogeniniais jungiamojo audinio intarpais, skiriančiais riebalinio audinio skilteles. Dar giliau, priklausomai nuo UG dažnio gali būti matoma paviršinė raumeninį audinį dengianti fascija, kuri atrodo kaip aiški hiper– echogeninė linija (2.2.1 pav.) [2, 68].

2.2.1 pav. Sveikos odos B-tipo vaizdas nuskenuotas aukšto dažnio 22 MHz ultragarsu (vaizdas užregistruotas šio darbo autoriaus)

Ankstesni klinikiniai tyrimai parodė, kad 14 MHz UG tyrimas, lyginant su patologijos tyrimo metu įvertintu pBG (HE), tiksliau nustato gilesnių nei 2 mm OM įsiskverbimą į odą nei plonesnių OM. Todėl šis rodmuo gali būti patikimas atrankinis kriterijus OM operacinio gydymo planavimui [51, 60].

Šio darbo autoriaus ir bendraautorių literatūros apžvalgos [50] bei naujesnių klinikinių tyrimų duomenimis, MN gylio parametrai išmatuoti aukšto dažnio 20–100 MHz UG (rT) ir histologinio tyrimo metu (pBG (HE)) turi patikimą tarpusavio sąsają (2.2.2 lentelė). Tačiau silpnesnis rT ir pBG (HE) ryšys nustatytas tiriant <1 mm MN [62, 81, 92]. Vertinant plonus (<1 mm) MN, UG tyrimo metu išmatuotas gylis 15 proc. buvo didesnis lyginant su pBG(HE), ir atvirkščiai – storų (>1 mm) MN gylis – 7 proc. mažesnis nei histologinio tyrimo metu įvertintas pBG (HE) [50]. Daugumo-je tyrimų buvo pastebėtas MN gylio pervertinimas matuojant jį aukšto dažnio UG lyginant su pBG (HE). Nėra pilnai aiški šio rT ir pBG nesuta-pimo priežastis. Galimai tai sietina su limfocitų infiltratu ar tarp OM ir greta jos esančio MA skiriamųjų ribų vertinimo netikslumais UG tyrimo metu [20, 38, 59, 67, 92]. Patologijos tyrimo metu odos naviko audiniai fiksuo-jami 10 proc. formalino tirpale bei parafine, todėl audiniai gali susitraukti ir atsiranda raginio sluoksnio pažaida – galimai reikšmingi veiksniai rT ir pBG matavimų nesutapimui [38]. Dar vienas svarbus veiksnys, galintis paaiškinti skirtumus tarp rT ir pBG(HE) matavimų neatitikimo, tai natūralus odos susitraukimas po ekscizijos [38, 82]. Kai kurie autoriai svarsto, kad odos priklausiniai, pvz., riebalų liaukos ar plaukų folikulai, taip pat galimai reikšmingi rT ir pBG matavimų nesutapimui, bet dar nėra moksliniais tyrimais pagrįsto bendro sutarimo tarp tyrėjų [20, 81].

Kai kurios OM yra per plonos (0,1 mm), kad būtų galima jų rT išmatuoti 20 MHz UG [13, 35]. Gambichler ir bendraautoriai teigia, kad 100 MHz dažnio UG keitiklis, kurio skvarbos gylis siekia iki 1,5 mm, turi didesnę vaizdo skiriamąją gebą lyginant su 20 MHz. Tyrėjai nustatė, kad rT ir pBG(HE) parametrai sutampa tiksliau, kai 100 MHz UG tiriama mažo įsiskverbimo į odą OM, nei 20 MHz UG [38]. Guitera ir bendraautorių atlik-to tyrimo duomenimis, 75 MHz dažnio keitikliu OM in situ rT ir pBG(HE) parametrų koreliacija silpnesnė lyginant su invazine OM [42]. Manoma, kad stipriausias ryšys tarp UG ir histologinio tyrimo metu įvertinto MN gylio nustatomas, kai matuojamas gilesnis kaip 0,75 mm navikas [92].

Literatūros duomenimis, UG sistemos matavimų paklaidos, įskaitant hidrofonų (prietaisų akustinėms bangoms priimti vandenyje) kalibravimą ir erdvinį vidurkinimą, taip pat gali sąlygoti neatitikimą tarp rT ir pBG rezultatų [76].

2.2.2 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų gylio, išmatuoto 20–100 MHz ultragarsu ir histologinio tyrimo metu, koreliacija, remiantis klinikinių tyrimų apžvalga

Autorius,

tyrimo metai Ultra-garso dažnis (MHz) Tirtų melanocitų kilmės odos navikų tipas ir skaičius Koreliacijos koeficientas (r) ar sutapimas pagal Bland-Altman* Tyrėjų skaičius rT pBG(HE) Serrone ir kt., 2002 [92] 20 Melanoma (n=139) r=0,95 – – Pellacani ir kt., 2003 [81] 20 Melanoma (n=40) r=0,89 – – Bessound ir kt,

2003 [13] 20 Melanocitų kilmės odos navikai

(n=130)

r=0,96 – –

Gambichler ir

kt., 2007 [38] 20 and 100 Melanoma (n=13), melanocitų kilmės

apgamai (n=37)

r>0,99 (toks pat su abiem dažniais), 20 MHz ultragarsu nustatytos didesnės sutapimo ribos nei 100 MHz*

Vienas –

Guitera ir kt.,

2008 [42] 75 Melanoma (n=52), melanocitų kilmės

apgamai (n=36)

r=0,91 Du –

2.2.2 lentelės tęsinys Autorius,

tyrimo metai Ultra-garso dažnis (MHz) Tirtų melanocitų kilmės odos navikų tipas ir skaičius Koreliacijos koeficientas (r) ar sutapimas pagal Bland-Altman* Tyrėjų skaičius rT pBG(HE) Hayashi ir kt.,

2009 [43] 30 Melanoma (n=68) r=0,89 – Skirtingi patologai,

skaičius nenuro-dytas Crisan ir kt.,

2013 [20] 20 Bazalinių ląstelių karcinoma (n=18);

melanoma (n=28)

Tiesinė regresija ir

koreliacija 98,4 proc. – –

Meyer ir kt.,

2014 [71] 25 Melanoma (n=67), melanocitų kilmės

apgamai (n=54) Labai geras* (-0,01 mm; 95 proc. PI: nuo -0,157 iki 0,137 mm) Du – Botar-Jid ir

kt., 2016 [17] 40 Melanoma (n=42) Labai geras* (-0.05 mm; 95 proc. PI:

nuo -0,24 iki 0,13 mm)

Vienas –

Varkentin ir

kt., 2016 [99] 100 Melanocitų kilmės odos navikai

(n=32)

Labai geras* (-0,07 mm; sutapimo ribos nuo -0,43 iki 0,29 mm)

– –

rT – naviko gylis nustatytas rankiniu būdu ultragarsinio tyrimo metu; pBG(HE) – naviko gylis išmatuotas histologinio tyrimo metu hematoksilinu ir eozinu dažytuose preparatuose; (–) – nenurodyta; r – koreliacijos koeficientas; n – atvejų skaičius.

Anksčiau atliktų tyrimų duomenimis, MN gylis matuojamas B-tipo vaizduose rankiniu būdu pažymint naviko ribas interaktyviais UG sistemos žymekliais. Rankiniu būdu naviko ribų žymėjimui UG atlikti reikia tyrimą at-liekančio specialisto patirties ir prailgėja paties tyrimo atlikimo laikas. Šio darbo autorė kartu su bendraautoriais 2016 m. sukūrė ir pritaikė patikimą automatinį algoritmą, paremtą 22 MHz UGultragarsinių radiodažninių signa-lų analize eksperimentinėje aplinkoje, kurio jautrumas – 90 proc., o specifiš-kumas – 73 proc. matuojant plonų (<1 mm) MN gylį, lyginant su pBG. Ta-čiau šis automatinis algoritmas kol kas dar nepritaikytas klinikinėje prak-tikoje.

UG tyrimas suteikia papildomos informacijos tikslinant odos naviko klinikinę diagnozę ir padeda atskirti kai kurių odos navikų rūšis – gerybinį

tikslumas padidėja nuo 73 iki 97 proc., naudojant UG kaip papildomą diagnostinį metodą [103].

Tačiau tyrimų, susijusių su UG galimybe atskirti OM nuo MA ir kitų odos navikų atlikta tik keletas [24, 30, 44, 87]. Naudodami seborėjinės keratozės, MA ir OM B-tipo UG vaizdus, Harland ir bendraautoriai nustatė, kad UG tyrimo specifiškumas diferencijuoti OM nuo MA yra 30 proc., kai tyrimo jautrumas – 100 proc. [44]. Samimi ir bendraautoriai diferencijavo mėlynąjį apgamą nuo melanomos metastazių odoje ir nustatė, kad UG tyrimo jautrumas yra 70,8 proc., specifiškumas – 94 proc [87]. Šis metodas taip pat naudingas atskiriant hemangiomas nuo OM [24].

Nustatyta, jog tiriant ultragarsu MN vaizdas būna simetriškas ir aiškių ribų, hipoechogeniškos struktūros, kurioje matyti dauginiai smulkūs hiperechogeniš-ki šešėliai [44]. Shiperechogeniš-kirtingai, tiriant ultragarsu OM vaizdas yra homogeniškas ir turi stipriau išreikštą hipoechogenišką struktūrą, lyginant su MN [44].

K. Andrekutės ir bendraautorių tyrimo duomenimis, aukšto dažnio UG bangų sklidimas per MN gali priklausyti nuo melanocitų displazijos laipsnio bei kitų odos morfologinių požymių [4]. Kitų autorių duomenimis, melano-citų dydis, forma ir pasiskirstymas epidermyje ar dermoje, limfomelano-citų infiltra-to apie naviką pobūdis bei melanofagų kiekis dermoje reikšmingai skiriasi priklausomai nuo MN rūšies ir displazijos laipsnio [11, 34, 48, 95].

Atsižvelgiant į tai šiame darbe iškėlėme ir tikrinome prielaidą, ar OM ir MA ultragarso gylio ir vaizdo ypatumai turi ryšį su jų morfologiniais požy-miais. Mūsų žiniomis, iki šiol nėra atlikta tyrimų apie MN gylio automatinį vertinimą UG tyrimo metu. Todėl darbo autorės ir bendraautorių buvo sukurta klinikinei praktikai tinkama UG vaizdinamo naviko ribų aptikimo ir gylio vertinimo automatinė programa paremta UG B-tipo vaizdo (logoritmuotos signalo gaubtinės) analize [65] ir šiame darbe atliktas jos tikslumo tyrimas.

MN struktūros pokyčių in vivo vaizdininimui yra naudojamos ir kitos technologijos, ne tik aukšto dažnio ultragarasas. Apibendrintai jų vaizdi-nimo rezultatus, kurie turi teigiamą prognostinę reikšmę OM diagnostikai, lyginat su patologijos tyrimo rezultatais, galima suskirstyti į kelias kate-gorijas: 1) tyrimo metodai, kurie vaizdina MN gylį ir vertiklaus dviejų ar trijų dimensijų vaizdo struktūrą (aukšto dažnio ultragarasas, koherentinė to-mografija); 2) MN anatominių struktūrų ir jų skvarbą charakterizuojantys vaizdiniai tyrimai (spektrofotometrinė intrakutaninė analizė (sin. SIAskopija) ir konfokalinė lazerinė mikroskopija); 3) MN anatominių struktūrų vaizdinė charkteristika (dermatoskopija). Šių tyrimų metodų apžvalga, jautrumas ir specifiškumas bei trūkumai pateikti 2.2.3 lentelėje.

tel ė. O dos v ai zdi ni m o in v iv o ty ri m o m et odų, re m iant is T . Al lis on ir be ndr aaut or ių [ 76 ] apž val ga, ta ši o dar bo au tor iaus od as im o , m. ) V ei ki mo mech an iz ma s Ja ut ru ma s / Sp eci fiš ku ma s O M di ag no st ika i* Pr ival um ai Tr ūkum ai , k ito s pa st abo s pi ja ] Pa vi rš ini ų odo s s tru kt ūr ų opt ini s pa di di ni m as 77 pr oc . / 9 9 pro c. Pa di di na k lin ik in io ty rim o tik slu m ą ir su m až in a ne re ik al in gų bi op sij ų ir ek sc iz ijų sk ai či ų Ri bo ta g ile sn ių o do s sluo ks ni ų apž iūr a, pr ik lau -so nu o de rm at olog o pa tir tie s, ne le id ži a įv er tin ti od os na vi ko gy lio (199 7) Sk irt in go b an go s i lg io o pt in ia i šv ie so s š al tin ia i, sk le id ži a ra udo -ną , m ėl yn ą, ž al ią a r i nfra ra ud o-nų jų spi nd ul ių spe kt ro švi es ą, ku -rią su ge ria (i ki 2 m m g yl io ) o do s au di ni ų ch rom of or ai (m el anina s, he m ogl obi na s i r kol age na s) 82, 7 pr oc . (7 0, 3– 90 ,6 p ro c. ) / 80, 1 pr oc . (7 5, 1– 84 ,2 p ro c. ) Pa di di na k lin ik in io ty rim o tik slu -m ą ir su m aži na ne rei kal in gų biop sij ų ir ek sc iz ijų sk ai či ų, le i-dž ia įv er tin ti m el an in o at sid ėj im ą ep id erm yj e ir de rm oj e (p ag al ta i ga lim a pr og no zuot i da rini o gy lį) Ri bo ta g ile sn ių o do s sluo ks ni ų apž iūr a, pr i-kl aus o n uo de rm at ol ogo pa tir tie s ė la ze -sk pi ja ] V ai zd o ko nt ras tas at sir an da dėl sk irt in go s l ąs te lių ir o rg an el ių str uk tū ros ir ge bos a tspi ndė ti šv ie są , ne s j ų švi es os ba ngo s l ū-ži o ro di kl is di de sni s ne i va nde ns 97 ,3 p ro c. / 83 p ro c. Sum až ina ne re ika ling ų ge ry bi ni ų m el anoc itų ki lm ės a pga m ų eks ci -zi jų sk ai či ų, k ur ie d er m at osk op iš-ka i ga li būt i pa na šūs į m el anom ą Ri bo ta s s kv ar bo s g ylis (ap ie 2 00 µ m ), p rik la us o nu o ty rė jo p at irt ie s, ty ri-m as il ga i t ru nk a, re ik ia pa gi lin tų o do s h ist ol ogi -nė s s an da ros ž ini ų ir pa tir tie s

te lė s t ęsi ny s od as oj im o , m. ) V ei ki mo mech an iz ma s Ja ut ru ma s / Sp eci fiš ku m as O M di ag no st ika i* Pr ival um ai Tr ūkum ai , ki to s pa st abo s ren -ra fij a 3 9, 46 , A ud in ia i s ug er ia ir a tsp in di in fra -ra udo no sios švie so s s pindu lius , ta ip ga una m as od os ske rs pj ūv io vai zd as 74 p roc . / 9 2 pr oc . (tači au od os m el a-nom os ty rim o du o-m enų nė ra pa ka n-kam ai ) D ėl d id el ės v ai zd o rai šk os ir sk va rbos gy lio iki 1 m m na ud o-ja m as m or fo log in ių odo s s truk tū -rų v ai zd in im ui , p lo nų (< 1 m m ) od os na vi kų gy lio m at avim ui Ri bo ta s s kv ar bo s g yl is, ne tik sli ai m at uo ja ≥ 1 m m gyli o od os na vi kus , pr i-kl au so n uo ty rė jo p at irt ie s, rib ot a pr ie ig a ir ilg as ty rim o la ik as sij ų (19 93 ) Sum uoja nt da ugi ni us B -ti po ul tra ga rs o va iz dus , s uku ria m as va iz da s l ygi ag re či oje o do s pa vi r-šiui pl okš tum oje N enur odo m a N epr ik la us o nu o ty rė jo p at irt ie s, ne s k ei tik lis d om in an či oj e vi et oj e la ik om as st ab ili ai , p er 6 s nu sk e-nuo jam as p lo tas si ek ia 4×4 c m Ri bot a pr ie iga , ne pa ka n-ka m ai duom enų api e di a-gn os tik os spe ci fiš kum ą, ilg a ty rim o tru km ė pa tol ogi jo s t yr im o re zu lta ta is

Pagrindinis neinvazinis tyrimas naudojamas melanocitų kilmės odos navikų (MN) klinikinei diferencinei diagnostikai yra dermatoskopija, kuri padidina OM diagnostikos tikslumą 10–27 proc., lyginant su klinikiniu ištyrimu (tikslumas 60 proc.), kuris labai priklauso nuo tyrėjo patirties [6, 100]. Klaidingai teigiama OM ar displazinio MA dermatoskopinė diagnozė padidina nereikalingų ekscizijų skaičių, tačiau klaidingai neigiama diag-nozė, daug pavojingensė [80].

Todėl ne mažiau svarbi kitų MN vaizdinimo metodų (UG tyrimas, ko-herentinė kompiuterinė tomografija, konfokalinė lazerinė mikroskopija) skvarbos į odą (gylio) tikslumo vertinimo tyrimai bei kelių generuojamų optinių ir fizinių vaizdų, gaunamų šiomis medicinos technologijomis pro-graminio vertinimo junginys.

2.3. Patologijos tyrimo ir imunohistocheminių žymenų reikšmė melanocitų kilmės odos navikų diagnostikai

Odos melanomos gylis pagal Breslau yra svarbus patologijos tyrimo parametras, kuris nulemia ligos išplitimo prognozę [40]. Šio parametro vertinimą hematoksilinu ir eozinu (HE) dažytame histologiniame preparate įdiegė A. Breslau – 1970 m. [18]. Breslau rodiklis – tai didžiausias OM storis, išmatuotas statmenai odos paviršiui nuo epidermio raginio ir grū-dėtojo sluoksnių ribos iki giliausio naviko išplitimo taško tikrojoje odoje ar poodyje [18]. HE dažymo metodas yra iki šiol auksinis OM išplitimo standartas [3].

Tyrimų duomenimis, OM gylio pagal Breslau (BG) matavimo tikslumo tarp skirtingų tyrėjų sutapimas svyruoja nuo 68,8 proc. iki 84,8 proc., priklausomai nuo patologo patirties [73]. Todėl 15,5 proc. OM atvejų, kurių pBG<1 mm gali būti klaidingai priskirtos OM in situ ar invazinei jos formai, kai BG išmatuojamas ≥1 mm [32].

Dėl didelės MN ir OM morfologinių formų įvairovės pasitaiko atvejų, kai patyrę dermatopatologai neišvengia klaidingai neigiamų išvadų diagno-zuojant OM ar atvirkščiai. Imunohistocheminiai (IH) tyrimai suteikia pa-pildomos informacijos apie melanocitų brandumą ir padeda tiksliau nu-statyti melanocitų displaziją ir jų skvarbą į dermą [79]. IH žymenų spalvinės reakcijos išryškina atsiskyrusius nuo naviko pavienius melanocitus ar smulkius jų lizdus dermoje bei melanocitus, kurie dėstosi išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos [27, 45]. Skirtingai, šių morfologinių požymių

atliekant IH reakcijas, pirminė OM panašiu dažnumu reaguoja su poli-kloniniais antikūnais prieš S100 baltymą ir monopoli-kloniniais antikūnais prieš Melan-A, HMB-45 bei tirozinazę [78]. Tačiau OM audinių dažymas vienu metu keliais monokloniniais antikūnais („kokteiliu“) rodo aukštesnį tyrimo specifiškumą, nei vienu S100 žymeniu, diferencijuojant OM rūšį [78] bei sarginių limfmazgių mikrometastazes [93]. Nustatyta, jog polikloniniu S100 žymeniu dažosi ne tik melanocitai, bet ir nervų dangalų, lygiųjų raumenų, Langerhanso ląstelės, todėl šio žymens IH reakcijos specifiškumas yra mažesnis (75–87 proc.) nei jautrumas (98–100 proc.) [79]. Pavienių mono-kloninių IH žymenų naudojimas yra ribotas diferencijuojant gerybinius ir piktybinius MN. Pagrindiniai melanocitų kilmės odos navikų diagnostikai naudojami imunohistocheminiai žymenys pateikiami 2.3.1 lentelėje.

Beltraminelli ir bendraautoriai nustatė, jog Melan-A žymeniu klaidingai teigiamai nusidažo lichenoidinio (juostos tipo) limfocitų infiltrato ląstelės ir tai apsunkina OM in situ diagnostiką lėtinio saulės poveikio srityse [10]. Kitų autorių duomenimis, Melan-A žymuo reikšmingai pervertina melano-citų tankumą epidermyje, lyginant OM in situ ir saulės šlako histologinį preparatą, nudažytą hematoksilinu ir eozinu (HE) [55].

Drabeni ir bendraautoriai rado reikšmingą pBG matavimo skirtumą ≥0,2 mm gylio OM (n=99) preparatuose tarp dviejų dažymo metodų HE ir IH žymeniu Melan-A, atsižvelgiant į tai, kad IH žymenimis pavyko išryš-kinti pavienių ar mažų melanocitų telkinius dermos speneliniame sluoksnyje [27]. Eng ir bendraautoriai nustatė IH žymens S100 vertę desmoplastinių OM (n=21) ir sveikų audinių atskyrimui bei pBG vertinimui, lyginant su HE dažytu histologiniu preparatu [31].

2.3.1 lentelė. Imunohistocheminiai žymenys dažniausiai naudojami melano-citų kilmės odos navikų diagnostikai [79]

Žymuo Diagnostinė vertė Kita informacija

S100 Jautrumas: 93–100 proc.;

specifiškumas: 75–87 proc. Imunohistocheminė reakcija: branduolinė, citoplazminė, membraninė.

Teigiamas beveik visais melanomų, įskai-tant ir desmoplastinių, atvejais. Nervų dan-galų, lygiųjų raumenų, Langerhans’o ląste-lės taip pat teigiamos šiam žymeniui, todėl turi būti naudojamas kartu su kitais melano-citų kilmės odos navikų žymenimis

HMB-45 Jautrumas: 70–90 proc;

specifiškumas: 77–100 proc. Imunohistocheminė reakcija: citoplazminė. Tik 10 proc. desmoplastinių melanomų

tei-giamos šiam žymeniui. Skaidrių ląstelių kar-cinoma, perivaskulinių epitelioidinių ląstelių navikai; melanocitinės švanomos, meningi-nės melanocitomos; kai kurie kiaušidžių steroidiniai navikai bei inkstų navikai su t(6;11)(p29;q12) mutacija taip pat ekspresuo-ja šį žymenį. Gali būti naudoekspresuo-jamas diferenci-nei melanocitų kilmės apgamų nuo melano-mos diagnostikai

Melan-A

(MART-1) Jautrumas: 85–97 proc. pirminės melanomos,

57–92 proc. metastatinės melanomos atvejais; specifiškumas: 95–100 proc.

Imunohistocheminė reakcija: citoplazminė. Perivaskulinių epitelioidinių ląstelių navikai ir kai kurios skaidrių ląstelių karcinomos, A103 klonas (Melan-A) taip pat dažo ant-inksčių žievės ir lytinių organų steroidinius navikus

Tirozinazė Jautrumas: 80–90 proc.;

specifiškumas: 97–100 proc. Imunohistocheminė reakcija: citoplazminė. Tik apie 6 proc. desmoplastinių melanomų,

beveik visos skaidrių ląstelių karcinomos ir pigmentinės neurofibromos, apie 20 proc. angiolipomų teigiamos šiam žymeniui.

Šiame darbe iškėlėme prielaidą patikrinti, ar skiriasi pBG matavimo rezultatai MN histologiniuose preparatuose, dažytuose standartiniu dažymu HE bei skirtingais IH dažymo metodais – žymeniu S100 ir kelių žymenų deriniu (HMB-45, Melan-A ir tirozinaze). Mūsų žiniomis, apie tai iki šiol nėra paskelbta tyrimo duomenų.

3. TYRIMO METODIKA

3.1. Pasirengimas tyrimui

Klinikinis tyrimas vykdytas bendradarbiaujant LSMU MA Odos ir ve-nerinių ligų, Patologinės anatomijos, Plastinės ir rekonstrukcinės chirurgijos klinikoms bei Kauno technologijos universiteto prof. K. Baršausko Ultra-garso mokslo institutui. Tyrimui atlikti gautas Kauno regioninio biomedi-cininių tyrimų etikos komiteto leidimas (2014–11–04, Nr. P2-BE-2-25/2009) ir Valstybinės duomenų apsaugos inspekcijos leidimas dėl asmens duomenų tvarkymo veiksmų (2015–07–15, Nr. 2R–4137 (2.6–1.)) (1 ir 2 priedai). Tyrimą iš dalies finansavo LSMU Mokslo fondas vykdant LSMU ir KTU jungtinį projektą SkinTech.

3.2. Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo etapai

Norint įgyvendinti pirmąjį ir antrąjį tyrimo uždavinius, tiriamųjų imčiai apskaičiuoti taikyta formulė esant pasirinktai tyrimo jėgai β = 0,8 ir pasi-kliovimo lygmeniui α = 0,05. Tiriamųjų imtis apskaičiuota pasikliautinuoju tikimybės intervalu [88]. Generalinės aibės pasikliautinasis vidurkio inter-valas yra toks:

. n s t x m n s t x− < < +

Tenkina vidurkio įvertinimo tikslumas ∆ – 0,05, t. y. . ∆ + < < ∆ − m x x Šiuo atveju taikyta formulė:

2 2 2 ∆ = z s n ,

kur n – atvejų skaičius atrankinėje grupėje; z – koeficientas, surandamas iš Stjudento pasiskirstymo lentelių pagal pasirinktą patikimumą 95 proc. (p = 0,05), z = 1,96; s – imties vidutinis kvadratinis nuokrypis; Δ (delta) – leistinas netikslumas, t. y. skirtumas tarp atrankinės grupės ir generalinės aibės vidurkio, laisvai pasirenkamas rodiklis.

Tiriamųjų imtis pirmajam uždaviniui įgyvendinti apskaičiuota remiantis G. Pellacini ir kitų autorių tyrimo rezultatais [81]. Tyrėjai nustatė, jog odos melanomos (n = 88) gylio, išmatuoto histologiniu tyrimu, vidurkis yra 1,14 ± 1,4 mm (± – standartinė paklaida). Didžiausia galima matavimo paklaida pasirinkta 0,1 mm. Apskaičiuota, jog, norint palyginti UG ir histologiniu tyrimu nustatytus MN gylio matavimo rezultatus (0,1 mm sutapimo tikslumu), reikia ištirti ne mažiau kaip 75 MN atvejus.

Kadangi literatūros šaltinių apie MN gylio matavimą skirtingais IHC dažymo metodais nėra (tokių publikacijų [27, 31] rasta tik apie OM), tiriamųjų imtis nustatyta remiantis bandomojo tyrimo, kurį atliko darbo autorė, duomenimis. Apskaičiuota, jog MN (n = 30) gylio, išmatuoto imu-nohistocheminių žymenų deriniu dažytuose histologiniuose preparatuose, vidurkis yra 1,00 ± 0,87 mm (± – standartinė paklaida). Didžiausia galima matavimo paklaida pasirinkta 0,2 mm remiantis M. Drabeni ir bendraautorių tyrimo rezultatais [27]. Nustatyta, jog, norint palyginti MN gylį, išmatuotą skirtingais histologiniais dažymo metodais, reikia ištirti ne mažiau kaip 72 atvejus.

Į tyrimą įtraukti Kauno klinikų Odos ir venerinių ligų klinikos pacien-tai, kuriems po gydytojo dermatologo apžiūros ir dermatoskopinio tyrimo suplanuota atlikti vieno ar daugiau MN eksciziją.

Įtraukimo į tyrimą kriterijai:

1. Vyresni nei 18 metų vyrai ir moterys.

2. Rašytinis tiriamojo sutikimas dalyvauti tyrime.

3. Oda aplink MN nepažeista, anksčiau netaikytas kitas gydymas. 4. MN susiformavęs tose odos srityse, kur atliekant UG tyrimą

galimas tiesioginis sąlytis su ultragarso keitikliu, t. y. ne plaukuoto-joje galvos dalyje, nago plokštelėje ar kitoje vietoje, kai tiesioginis sąlytis neįmanomas.

5. MN paviršius plokščias ir neišopėjęs. 6. MN skersmuo mažesnis nei 2 cm.

Neįtraukimo į tyrimą kriterijai:

1. Tiriamasis dėl kalbinių ar psichologinių kliūčių nesupranta Infor-muotojo asmens sutikime pateikiamos informacijos ar atsisako pasirašyti sutikimą dalyvauti tyrime.

Pacientai išsamiai supažindinti su tyrimo eiga naudojant Asmens infor-mavimo formą (3 ir 4 priedai). Tiriamojo asmens duomenys koduoti ketur-ženkliu skaitmeniniu kodu.

Perspektyviojo tyrimo pradžia – 2014-09-01, pabaiga – 2015-09-01. Ty-rimo imtis ir etapai pateikti 3.2.1 paveiksle.

Į tyrimą įtraukti 136 pacientai, kuriems UG ištirti ir po to išoperuoti 165 MN. Iš jų, remiantis histologinio tyrimo išvada, patvirtintos MA (n = 128) ir OM (n = 37) diagnozės. Po histologinių preparatų peržiūros MN, kurių dermoje nebuvo melanocitų ir jų vaizdas netilpo į mikroskopo skaitmeninės kameros regėjimo lauką, padidintą 4 kartus (pBG (HE) > 3,5 mm), neįtrauk-ti į galuneįtrauk-tinį tyrimo rezultatų verneįtrauk-tinimą (n = 30; 28 MA ir 2 OM). Į tolesnius tyrimo etapus įtraukta 20 OM atvejų, ištirtų retrospektyviai pagal tą patį klinikinio tyrimo protokolą, vykdant 2009–2013 m. EUROSTARS projektą „Odos vėžio diagnostika informacinėmis bei komunikacijų technologi-jomis“ (SkinMonitor: Nr. E!4846).

Taigi, analizuojant statistinį ryšį tarp UG ir histologiniu tyrimu išmatuoto MN gylio rezultatų, ištirti 155 MN (3.2.1 pav.).

Lyginant rT ir aT parametrų sąsają, ištirti 145 MN, nes 10 atvejų aT rodiklis neišmatuotas dėl UG artefaktų.

Siekiant nustatyti imunohistocheminių (IH) tyrimų papildomą naudą ma-tuojant naviko gylį, lyginant su histologiniu tyrimu, ištirti MN atvejai, kurie nuosekliai atrinkti iš bendros tyrimo imties (20 OM ir 87 MA). Toks atvejų skaičius buvo pakankamas remiantis imties tūrio skaičiavimu (žr. 24 psl.).

Vykdant bendrą LSMU ir KTU Mokslo fondo finansuotą projektą „SkinTech“, 52 atvejų MN ultragarso vaizdai ir pBG histologinio vertinimo duomenys išanalizuoti KTU UI sukurta automatine radiodažninių signalų analizės programa, rezultatai paskelbti Journal of Ultrasound in Medicine žurnale (citavimo indeksas – 1,547) (žr. 76 psl.)

3.2.1 pav. Tyrimo imtis ir etapai ⃰ OM (n = 20) atvejai įtraukti retrospektyviai.

3.3. Tyrimo eiga

3.3.1. Melanocitų kilmės odos naviko klinikinių požymių įvertinimas

Pagal klinikinio tyrimo protokolą įvertinti šie MN požymiai: spalva, ribos, dydis (mm) pagal ilgiausią X ir Y ašis. Nustatyta MN anatominė sritis pagal t-SNOMED nomenklatūrą (angl. topography – Standardised Nomen-clature of Medicine) [86] bei klinikinė diagnozė pagal Tarptautinį ligų klasifikatorių (TLK-10-AM). MN vaizdas papildomai ištirtas skaitmeniniu dermatoskopu FotoFinder (padidinančiu vaizdą 20 kartų). Skaitmeniniai dermatoskopiniai MN vaizdai archyvuoti DICOM (angl. Digital Imaging and Communications in Medicine) formatu PACS (angl. Picture Archiving and Communication System) serveryje [36, 37]. Vieno tiriamojo apžiūra

3.3.2. Ultragarsinis tyrimas

Rankiniu ir automatiniu būdu atliktas MN tyrimas. MN ištirtas ultragar-su DUB-USB (Taberna Pro Medicum, Vokietija) aukšto dažnio (22 MHz) fokusuoto mechaninio skenavimo keitikliu su vandens talpykla, kuri skirta vienodam atstumui iki tiriamo odos paviršiaus garantuoti. UG duomenų registravimo metu keitiklis laikytas statmenai MN paviršiui, vaizdo langas parinktas rankiniu būdu. Aukšto dažnio UG signalų registravimo tiriant MN schema pateikta 3.3.2.1 paveiksle.

3.3.2.1 pav. Aukšto dažnio ultragarso duomenų surinkimo sistema [5, 83] Tiriant MN, kad būtų nustatytas didžiausias vertikalus gylis nuo naviko viršutinės ribos iki giliausio hipoechogeninio taško, užregistruoti mažiausiai du dvimačiai B-tipo vaizdai (3.3.2.2 pav. A). MN gylis (0,01 mm tikslumu)

UG rankiniu būdu (rT) išmatuotas vieno tyrėjo (darbo autorės) naudojant UG gamintojo programos interaktyvius žymeklius (3.3.2.2 pav. A). Papildo-mai įvertinti UG vaizdo ypatuPapildo-mai: MN struktūra (homogeninė, nehomo-geninė), kraštai (taisyklingi, netaisyklingi), riba tarp MN ir aplinkinių audinių (aiški, neaiški, iš dalies aiški) [2]. Tirtų UG vaizdo ypatumų charak-teristikos pateiktos 3.3.2.3 paveiksle.

Užregistruoti UG vaizdai išsaugoti d4w formatu kietajame kompiuterio diske ir Meddream programoje („Softneta“, Lietuva) DICOM formatu PACS serveryje. Naviko UG vaizdo matmenų erdvinė analizė atlikta specializuota LSMU ir KTU mokslininkų sukurta programine įranga, skirta automatiniam odos naviko gyliui ultragarsiniuose B-tipo vaizduose matuoti.

Ši programa sukurta vykdant LSMU ir KTU UI projektus „SkinTech“ (2014 m.) bei „SkinTechSoft“ (2015 m.), finansuotus LSMU Mokslo fondo. Naudojant šią programą darbo autorė automatiniu būdu išmatavo MN gylį (aT) skaitmenizuotuose UG vaizduose (3.3.2.2 pav. B) ir palygino jį su rT bei pBG (HE) matavimo rezultatais. Programa integruota į darbinį kompiu-terį, jos veikimo algoritmas aprašytas 3.3.2.1 lentelėje. Vieno paciento ultragarsinis tyrimas truko nuo 15 iki 30 minučių.

3.3.2.2 pav. Odos melanomos gylis, išmatuotas 22 MHz ultragarsu B-tipo vaizduose rankiniu būdu (A) ir naudojant automatinę programą (B)

3.3.2.3 pav. Melanocitų kilmės odos naviko ultragarso vaizdo ypatumų charakteristikos: struktūra – (A) homogeninė, (B) nehomogeninė;

kraštai – (A) taisyklingi, (B, C) netaisyklingi; riba tarp MN ir aplinkinių audinių – (A) aiški, (B) neaiški, (C) iš dalies aiški

3.3.2.1 lentelė. Pagrindiniai B-tipo ultragarso vaizdo apdorojimo automati-niu segmentavimo algoritmu etapai* [65]

Etapas Aprašymas

1. Vaizdo paruošimas Vaizdo triukšmo mažinimas, vaizdo glotninimas panaudojant

amplitudės slenkstį ir erdvinį slenkančio vidurkio lango filtrą (branduolio dydis – 3×3)

2. Odos paviršiaus

aptikimas Dvimačio MN vaizdo skenavimas adaptyviu binarizavimo algoritmu eilutė po eilutės [89], viršutinės MN ribos

aptikimas ir kontūro linijos apskaičiavimas [26] 3. MN viršutinio krašto

aptikimas

4. MN apatinio (pagrindo)

krašto aptikimas Vaizdo išplėtimas, sutraukimas, glotninimas panaudojant amplitudės slenkstį ir erdvinį slenkančio vidurkio lango filtrą

(branduolio dydis – 3×3) [41] 5. MN formos vertinimas

pagal aptiktus kraštus Kartotinis MN ribų atkūrimas, apibrėžimas ir segmentacija

6. MN pjūvio ploto bei

gylio matavimas Pjūvio ploto apskaičiavimas standartiniu daugiakampio ploto apskaičiavimo algoritmu. Didžiausio atstumo tarp kontūro

taškų aptikimas X ašyje. Maksimalus atkarpos ilgis laikomas didžiausiu MN gyliu

3.3.3. Melanocitų kilmės odos naviko išpjovimas

Laikantis LSMU ligoninės darbo instrukcijų, tiriamiesiems MA ekscizija atlikta OVLK, o OM operacinis gydymas – LSMU MA Plastinės ir rekonstrukcinės chirurgijos klinikoje. Atvejų skaičius pateiktas 3.2.1 pa-veiksle (žr. 27 psl.).

3.3.4. Histologinis ir imunohistocheminis tyrimai

MN histologinis ir IH tyrimai atlikti LSMU MA Patologinės anatomijos klinikoje, laikantis šių tyrimų atlikimo procedūros aprašo. MN mėginys padalytas į 2 dalis statmenai ilgajai naviko ašiai ir įlietas į parafino bloką. Iš parafine įlieto MN storiausios dalies mikrotomu atpjautas 3 µm storio prie-paratas nudažytas hematoksilinu-eozinu (HE). Iš likusios dalies atpjauti 3 papildomi 3 µm storio preparatai, kurie perkelti ant objektinių stiklelių SuperFrost Plus („Thermo Fisher Scientific“, JAV), skirtų IH reakcijoms atlikti su dviem skirtingais melanocito raiškos specifiniais žymenimis: poli-kloniniu triušio antikūnu S100 (CONFIRM anti-S100 (Polyclonal, Roche, JAV) ir trijų IH žymenų deriniu (Melanoma Triple Cocktail, Roche, JAV), sudarytu iš antimelanosominių (HMB-45), anti-MART-1/Melan-A (A103) ir antitirozinazės (T311) pelių monokloninių antikūnų. IH žymenų baltymų raiškos analizei naudotas Ventana BenchMark Ultra dažymo automatas („Ventana Medical Systems“, JAV). Antigenų epitopai atkurti Ventanos ląstelių kondicionavimo tirpalu CC1 (pH 8,5) 95 °C temperatūroje nustatytu laiku (S100 – 36 min., žymenų derinys – 60 min.). Vėliau, naudojant Ventana Ultraview DAB detekcijos sistemą, MN preparatai inkubuoti su monokloniniais antikūnais (S100: 36 °C temperatūroje – 20 min., tirpalo skiedimo santykis – 1:200; žymenų derinys: 37 °C temperatūroje – 28 min.).

Patyręs patologas (J. M.) nustatė MA, displazinio MA ar OM diagnozę remdamasis morfologiniais požymiais [97].

MN gylis pagal Breslau (pBG) išmatuotas nuo epidermio raginio ir grūdėtojo sluoksnių ribos iki giliausiai dermą ar poodį infiltruojančių naviko ląstelių (3.3.4.1 pav. A), preparate, dažytame HE, – pBG (HE), žymeniu S100 – pBG (S100) ir trijų IH žymenų deriniu – pBG (derinys) [64]. Šiems matavimas atlikti naudotas Olympus BX43 (Japonija) mikroskopas su 10 kartų didinančiu okuliaru. Mažiausia okuliare įmontuoto mikrometro padala – 0,01 mm. Nepriklausomas patyręs patologas (G. S.) Olympus BX51 (Japonija) mikroskopu (0,1 mm tikslumu, mikrometras integruotas mikrosk-opo stalelyje) papildomai išmatavo BG (HE) 15 proc. atsitiktinai atrinktų

5 mln. pikselių 2560×1920) BG (HE), BG (S100) ir BG (derinys) išma-tuotas antrojo tyrėjo (G. L.). Matavimai atlikti QCapture Pro 7 programa padidinus 10 kartų. Kai visas MN gylis mikroskopo kameros regėjimo lauke netilpo, vaizdas didintas 4 kartus (3.3.4.1 pav. B).

3.3.4.1 pav. Odos melanomos gylis pagal Breslau,

išmatuotas HE preparate patyrusio patologo (raudona rodyklė) (A) ir automatine QCapture Pro 7 programa (mėlyna rodyklė) (B) L1 – žymeklis (mikrometrais) jungia 2 taškus nuo raginio sluoksnio apačios iki giliausio naviko krašto. Vaizdas padidintas 4 k., nes navikas gilus ir netelpa

į mikroskopo kameros regėjimo lauką.

Bendru dviejų tyrėjų (J. M. ir G. L.) sutarimu, HE dažytame preparate vertinta:

• Limfocitų infiltrato laipsnis: a) nėra ar nedidelis, kai matyti pavie-niai limfocitai, išsidėstę perivaskuliariai dermoje (3.3.4.2 pav. A), b) didelis – vienas prie kito išsidėstę limfocitai naviko stromoje ar aplink naviką bent viename mikroskopo regėjimo lauke, c) vidutinis, kai jų kiekio negalima priskirti nei a, nei b kategorijoms (3.3.4.2 pav. B, C).

• Melanofagų kiekis dermoje: a) nėra ar pavieniai (3.3.4.2 pav. A), b) gausus – glaudžiai juostos forma išsidėstę naviko stromoje arba naviko apatiniame krašte (3.3.4.2 pav. B) bent viename mikroskopo regėjimo lauke c) vidutinis – kai negalima priskirti nei a, nei b kategorijoms (3.3.4.2 pav. C).

• Vyraujančio limfocitų infiltrato lokalizacija MN – stroma (3.3.4.2 pav. B) ar aplink naviką (3.3.4.2 pav. C).

3.3.4.2 pav. Melanocitų kilmės odos naviko morfologinių požymių vertinimas histologiniame preparate: A) HE ×10, mišrus displazinis melanocitų kilmės apgamas: limfocitų infiltratas – nėra ar nedidelis, melanofagai – nėra ar pavieniai; B) HE ×10, mišrus melanocitų kilmės apgamas: limfocitų infiltratas – vidutinis, lokalizuotas naviko stromoje, gausu melanofagų; C) HE ×10, mišrus melanocitų kilmės apgamas:

limfocitų infiltratas – didelis, lokalizuotas aplink naviką, vidutinis kiekis melanofagų dermoje

Raudonas kvadratas – limfocitų infiltratas, mėlynas kvadratas – melanofagai.

• Melanocitų išsidėstymo dermoje pobūdis: a) atskiros ląstelės – atskiri melanocitai, supami dermos, b) lizdai – atskira melanocitų grupelė, supama dermos, c) susiliejantys lizdai – susiliejančios melanocitų grupelės, supamos dermos, d) difuzinis – melanocitai išsidėstę labai glaudžiai, neįmanoma atskirti, tai atskiros ląstelės ar lizdai (3.3.4.3 pav. A–D).

HE ir IH žymenimis dažytame MN preparate nustatyti išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos išsidėstę (3.3.5.4 pav. A–C) arba nuo naviko atsiskyrę melanocitai (3.3.4.4 pav. D–F).

3.3.4.4 pav. Melanomos (A–C, ×4) ir mišraus melanocitų kilmės apgamo (D–F, ×10) gylio pagal Breslau vertinimas milimetrais (raudona rodyklė)

histologinio preparato skaitmenizuotuose vaizduose: dažymas HE (A, D), dažymas žymeniu S100 (B, E) ir kelių žymenų deriniu (C, F) išryškino išilgai

3.4. Statistinis duomenų vertinimas

Gauti tyrimo duomenys sukaupti skaitmeninėje duomenų bazėje naudo-jant Microsoft Excel 2003 programą. Duomenų aprašomąją statistiką atliko šio darbo autorė, padedama LSMU Informacinių technologijų centro inži-nierės programuotojos Eglės Šepetauskienės. Statistinis duomenų apdoroji-mas atliktas SPSS programine įranga, versija 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, JAV) ir MedCalc programine įranga (MedCalc Software, Mariakerke, Bel-gija).

Statistinės analizės uždaviniai ir metodai. Požymių aprašymas

• Kiekybiniai požymiai, kurių reikšmių skirstinys populiacijoje buvo normalusis (Gauso), aprašyti pateikiant jų reikšmių vidurkį bei standartinį nuokrypį.

• Kiekybiniai požymiai, kurie neturėjo normaliojo skirstinio pagal Kolmogorovo-Smirnovo kriterijų, aprašyti pateikiant jų reikšmių medianą ir pirmą (K1) bei trečią (K3) kvartilius. Mediana yra didė-jimo tvarka surikiuotų duomenų vidurys, kuris daug mažiau nei aritmetinis vidurkis priklauso nuo skirstinio asimetrijos. Tarp pirmo ir trečio kvartilių yra 50 proc. skaitinių duomenų reikšmių.

• Kokybiniams nominaliesiems ir ranginiams požymiams aprašyti naudotos proporcijos (proc.)

Grupuotų požymių palyginimas

• Hipotezėms apie vidurkių skirtumus lyginamosiose nepriklausomo-se grupėnepriklausomo-se (dviejų lyginamų grupių atveju) taikytas parametrinis hipotezių tikrinimo Stjudento t kriterijus [88].

• Skirtumas tarp dviejų nepriklausomų grupių (kiekybiniai nenorma-lieji požymiai) nustatytas pagal Manno-Vitnio kriterijų [88].

• Kokybinių požymių kelių grupių sąsajoms nustatyti taikytas susiju-sių požymių lentelių metodas ir skaičiuotas chi kvadrato (χ²) krite-rijus [88]. Dviejų proporcijų palyginimui naudotas z kriterijus [88]. Tiesinio ryšio vertinimas

3.4.1 lentelė. Koreliacijos koeficiento reikšmių vertinimas Koeficiento |r| reikšmė Interpretacija

0,9 |r|1 Labai stipri tiesinė koreliacija

0,7 |r|<0,9 Stipri tiesinė koreliacija

0,5 |r|<0,7 Vidutinė tiesinė koreliacija

0,3 |r|<0,5 Silpna tiesinė koreliacija

0 |r|<0,3 Labai silpna koreliacija arba jokios

|r| – Spirmeno koreliacijos koeficientas.

Dviejų tyrimo metodų duomenų sutapimo vertinimas

Dviem skirtingiems tyrimo metodams, naudojamiems klinikinėje praktikoje, palyginti taikyta Blando-Altmano grafinė analizė [14]. Matavimų rezultatų sutapimui įvertinti apskaičiuotos skirtumų vidurkio 95 proc. PI ribos: d±1,96 SN. Sutapimo ribų tikslumui įvertinti apskaičiuoti 95 proc. PI sutapimų riboms: apatinei (d–1,96 SN)±1,96 SN (3/n)½ _{ir viršutinei} (d+1,96 SN)±1,96 SN (3/n)½_{, kur d – vidurkių skirtumas, n – matavimų} porų skaičius (imties didumas).

UG tyrimo tikslumo nustatymas matuojant melanocitų kilmės odos naviko gylį rankiniu būdu ir automatine programa

Šiame tyrimo etape tirti MN sugrupuoti į plonus (gylis <1 mm) ir storus (gylis ≥1 mm), nes tokia naviko gylio skiriamoji riba reikšminga OM prognozei ir operacinio gydymo taktikai (žr. 9 psl.).

UG tyrimo jautrumas, specifiškumas, teigiama ir neigiama prognozinė vertė bei tikslumas matuojant plonų ir storų MN gylį pBG (naviko gylis išmatuotas pagal Breslau histologinio tyrimo metu) atžvilgiu nustatyti pagal toliau pateiktas skaičiuotes:

Jautrumas (angl. sensitivity) – tikimybė, kad, esant <1 mm gylio MN,

histologiniu ir UG tyrimais nustatytas naviko gylis sutaps. Jautrumas apskaičiuotas pagal formulę:

c a

a

+ ,

kur a – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų <1 mm gylio MN skaičius, a + c – histologiniu tyrimu nustatytų <1 mm gylio MN skaičius [8].

Specifiškumas (angl. specificity) – tikimybė, kad, esant ≥1 mm gylio

MN, histologiniu ir UG tyrimais nustatytas gylis sutaps. Specifiškumas apskaičiuotas pagal formulę:

b d

d

+ ,

kur d – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius, d+b – histologiniu tyrimu nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius [8].

Teigiama prognozinė vertė (angl. positive predictive value) – tikimybė,

kad matuojant UG tikrai bus nustatytas <1 mm gylio MN. Ji apskaičiuota pagal formulę:

b a

a

+ ,

kur a – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų <1 mm gylio MN skaičius, a+b – visų tik UG tyrimu nustatytų <1 mm gylio MN skaičius [8].

Neigiama prognozinė vertė (angl. negative predictive value) – tikimybė,

kad matuojant UG bus nustatytas ≥1 mm gylio MN. Šis rodiklis apskai-čiuotas pagal formulę:

d c

d

+ ,

kur d – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius, c+d – visų tik UG tyrimu nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius) [8].

Tikslumas (angl. accuracy) – rodiklis, apibūdinantis diagnostikos metodo

tikslumą ir rodantis teisingai identifikuotų atvejų santykį su visais tiriamais atvejais. Tyrimo tikslumas apskaičiuotas pagal formulę:

d c b a d a + + + + ,

kur a – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų <1 mm gylio MN skaičius, b – histologiniu tyrimu nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius, c – histologiniu tyrimu nustatytų <1 mm gylio MN skaičius, d – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius [8].

Dviejų tyrėjų matavimo rezultatų sutapimo vertinimas

Dviejų tyrėjų vertintų parametrų tarpklasinės koreliacijos koeficientas (angl. intra-class correlation coefficient (ICC)) apskaičiuotas pagal kieky-binių matavimų sutapimą. Šio koeficiento reikšmės gali kisti nuo -1 iki 1. Kuo ICC arčiau 1, tuo dviejų tyrėjų matavimo rezultatų sutapimas didesnis [55].

Reikšmės prognozavimas pagal kitų kintamųjų reikšmes

Daugiamatės logistinės regresinės analizės duomenimis, taikant statisti-nio modelio atrankos pažingsnę (angl. stepwise) metodiką [19], nustatytas ryšys tarp MN ultragarso vaizdo ypatumų ir jų morfologinių požymių. Taip pat apskaičiuotas pBG (HE) ir pBG, matuoto IH dažymo metodais, rezultatų nesutapimo (MRN) galimybių santykis (GS), kai skirtumas tarp šių para-metrų buvo ≥0,1 mm. Tas pats modelis taikytas ir nustatant ryšio stiprumą tarp MN gylio, išmatuoto UG ir histologiniu tyrimais, rezultatų nesutapimo (nepakankamai įvertintas ir pervertintas UG gylis sutapusio su pBG (HE) atžvilgiu) priklausomai nuo morfologinių požymių.

Logistinės regresijos lygties koeficientai tikrinti pagal nuliškumo hipo-tezes. Atskirų požymių reikšmingumas nustatytas pagal GS dydį, exp(B) = GS ir jo pasikliautinuosius intervalus. Taikant determinacijos koeficientą R² ir modelio atitikimo kriterijų, atrinkti optimalūs požymių deriniai, kurie teisingai apibrėžė tiriamą dažnumą. Logistinė regresinė analizė modeliuota taip, kad koeficientas B būtų teigiamas, o modelio atitikimo kriterijaus reikšmingumas būtų p<0,05.

Analizės rezultatų pateikimas

Statistinės duomenų analizės rezultatai pateikiami lentelėmis ir grafikais. Išvadoms apie statistinių hipotezių tikrinimo rezultatus pateikti naudo-tos p reikšmės: ryšys laikytas statistiškai reikšmingu, kai p<0,05 [88].

4. DARBO REZULTATAI

4.1. Aukšto dažnio ultragarsu (rankiniu bei automatiniu būdais) ir histologiniu tyrimu išmatuoto melanocitų kilmės odos naviko gylio

sąsaja priklausomai nuo naviko morfologinių požymių

Įgyvendinant šį uždavinį, ištirti 155 MN, kurie buvo išoperuoti 94 mote-rims (69 proc.) ir 42 vyrams (31 proc.). OM ir MN diagnozių dažnumas pagal tiriamųjų lytį nesiskyrė (χ² = 0,23; p = 0,63). Tiriamųjų amžius svyravo nuo 18 iki 87 metų, amžiaus vidurkis – 47,46 ± 17,2. Vyrų ir moterų amžius nesiskyrė (p = 0,68). Daugiausiai (56 proc.) išoperuotų MN buvo susiformavę liemens odoje. Tirtų MN lokalizacijos, UG vertinto gylio bei morfologinių požymių charakteristika pateikta 4.1.1 lentelėje.

4.1.1 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų lokalizacijos, ultragarsu išma-tuoto gylio ir vaizdo ypatumų bei morfologinių tipų, nustatytų histologiniu tyrimu, apibūdinimas

Požymiai N Proc.

MN lokalizacija Liemuo 87 56

Viršutinės galūnės 27 17

Apatinės galūnės 38 25

MN klasifikavimas pagal gylį,

išmatuotą UG Ploni (<1 mm) _{Stori (≥1 mm)} 118 ₃₇ 76 ₂₄

MN gylio nustatymas UG

programiniu būdu* Išmatuotas _{Neišmatuotas} 145 ₁₀ 93 ₇

MN struktūra ultragarso

tyrimo metu Homogeninė _{Nehomogeninė} 84 ₇₁ 54 ₄₆

Riba tarp MN ir aplinkinių audinių ultragarso tyrimo metu

Aiški 80 52

Neaiški 6 4

Iš dalies aiški 69 44

MN kraštai ultragarso tyrimo

4.1.1 lentelės tęsinys

Požymiai N Proc.

MN morfologiniai tipai Paviršiumi plintanti OM 33 60

Mazginė OM 1 2

Lentigo maligna melanoma 8 15

Pailgųjų ląstelių OM 3 5

Akralinė lentiginozinė OM 6 11

Piktybinė OM,

neklasifikuota 4 7

Mišrus melanocitų kilmės

apgamas, nedisplazinis 55 55

Mišrus melanocitų kilmės

apgamas, displazinis 45 45

Iš viso 155 100

*Odos navikų automatinė UG gylio vertinimo programa sukurta KTU ir LSMU mokslininkų grupės vykdytuose jungtinės veiklos projektuose (žr. 29 psl.). OM – odos melanoma; MN – melanocitų kilmės odos navikas

Į galutinę MN gylio, nustatyto ultragarsu rankiniu (rT) ir automatiniu (aT) būdais, lyginamąją analizę įtraukti 145 iš 155 MN tyrimų rezultatai. Dešimt atvejų (7 proc.), t. y. vienos OM ir devynių melanocitų kilmės apgamų (MA), gylis automatine programa neišmatuotas dėl vaizdinimo artefaktų, tokių kaip UG vaizdo triukšmas ir nepakankamas ryškumas.

Apskaičiavus dviejų dermatologų nustatytų rT rezultatų sutapimą, tarpklasinės koreliacijos koeficientas buvo 0,98 (95 proc. PI nuo 0,96 iki 0,99). Rankiniu (rT) būdu ultragarsu išmatuotas OM gylis svyravo nuo 0,41 iki 2,83 mm, o automatiniu būdu (aT) – nuo 0,29 iki 3,72 mm. MA gylis, išmatuotas rankiniu būdu, svyravo nuo 0,13 iki 1,86 mm, aT – nuo 0,18 iki 2,55 mm. Odos melanomos rT mediana buvo 0,96 mm (K1–K3: 0,65–1,52), o aT – 0,98 mm (K1–K3: 0,62–1,65). Melanocitų kilmės apgamų rT ir aT mediana – atitinkamai 0,51 mm (K1–K3: 0,37–0,67) ir 0,50 mm (K1–K3: 0,36–0,74). Tarp rT ir aT rezultatų, gautų ištyrus OM ir MA gylį, nustatytas stiprus ryšys, atitinkamai r = 0,84 ir r = 0,87 (4.1.2 lentelė).

Remiantis Blando-Altmano analizės metodu (4.1.1, 4.1.2 pav.), rT ir aT reikšmių vidurkis, vertinant OM gylį, skyrėsi 0,08 mm (95 proc. PI nuo -0,01 mm iki 0,18 mm ), MA atvejais – vidurkio skirtumas -0,03 mm (95 proc. PI nuo 0 iki 0,07 mm).

4.1.1 pav. Odos melanomos (n = 54) gylio, vertinto ultragarsu rankiniu (rT) ir automatiniu būdais (aT), skirtumas Blando-Altmano analizės duomenimis

aT – naviko gylis, nustatytas ultragarsu automatiniu būdu; rT – naviko gylis, nustatytas

ultragarsu rankiniu būdu; SN – standartinis nuokrypis. Mėlyna linija rodo aT ir rT rodmenų skirtumo vidurkį (jis yra 0,08 mm), žalia linija – šio skirtumo 95 proc. pasikliautinojo intervalo (PI) ribas, raudona linija – aT ir rT vidurkio 95 proc. sutapimo ribas.