Magistro baigiamasis darbas

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

ARMINAS URBONAVIČIUS

In silico pagrįsta 1,3,4-tiadiazolų sintezė, taikant Balz-Shieman reakciją

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Hiliaras Rodovičius

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis, ____________ Data 2017 __ __

In silico pagrįsta 1,3,4-tiadiazolų sintezė, taikant Balz-Shieman reakciją

Darbo vadovas

Prof. dr. Hiliaras Rodovičius, ___________ Data 2017 __ __

Recenzentas Darbą atliko Magistrantas

_______________________ Arminas Urbonavičius, ____________ Data 2017 __ __ Data 2017 __ __

Turinys

6.1 Fluorintų heterociklų sintezė ... 11

6.2 Diazonio druskos stabilumas ... 13

6.3 Biomedicininis fluorintų heterociklių junginių panaudojimas ... 13

6.4 1,3,4-tiadiazolų sintezė ... 14

6.4.1 1,3,4-tiadiazolo ţiedo gavimas iš acilhidrazinų... 16

6.4.2 1,3,4-tiadiazolo ţiedo gavimas iš diacilhidrazinų ... 17

6.4.3 1,3,4-tiadiazolo ţiedo gavimas iš tiohidrazinų ... 18

6.4.4 1,3,4-tiadiazolo ţiedo gavimas iš oksadiazolų ... 21

7 Tyrimo metodika ir metodai ... 23

7.1 Naudotos medţiagos ... 23

7.2 In silico tyrimas ... 23

7.3 Junginių sintezės metodikos. ... 23

7.3.1 5-metoksi-1,3,4-tiadiazol-2-amino sintezė. ... 23 7.3.2 Aril-1,3,4-tiadiazolų sintezė ... 24 7.3.3 5-amino-1,3,4-tiadiazol-2-tiolio sintezė ... 25 7.3.4 1-amino-1,3,4-tiadiazolo sintezė ... 25 7.3.5 Balz-Shieman reakcija ... 26 7.3.6 Reakcijų optimizavimas ... 27

7.4 Analizės metodai ... 27

7.4.1 FT–IR spektroskopija ... 27

7.4.2 Plonasluoksnė chromatografija ... 28

7.4.3 UV spektrofotometrija ... 28

7.4.4 ESC – tandeminės MS/MS spektrometrija ... 28

8 Rezultatai ir jų aptarimas ... 31

8.1 CYP metabolinio stabilumo in silico tyrimas ... 31

8.2 1,3,4-tiadiazolų reakcijų optimizavimas ... 32

8.3 Junginių analizė ... 33

8.3.1 ESC-MS analizė ... 33

8.3.2 FT-IR analizė ... 35

8.4 Balz-Shieman reakcijos optimizavimas ... 36

9 Išvados ... 40

10 Praktikinės rekomendacijos ... 41

11 Literatūros sąrašas ... 42

1. Santrauka

Magistro darbą „In silico pagrįsta 1,3,4-tiadiazolų sintezė taikant Balz-Shieman reakciją“ atliko Arminas Urbonavičius. Mokslinio darbo vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra – Kaunas.

Tyrimo tikslas: susintetinti 1,3,4-tiadiazolo darinius, optimizuoti reakcijų sąlygas, įvesti fluoro

atomą pritaikant Balz-Shieman reakciją.

Tyrimo uždaviniai:

1. Sintezuoti 1,3,4-tiadiazolo darinius;

2. Nustatyti sintezuotų junginių tapatybę, fiziko-chemines savybes; 3. Pritaikyti Balz-Shieman reakciją radikalinei (SR) substitucijai;

4. Optimizuoti reakcijos sąlygas.

Tyrimo metodai: panaudojant klasikinės chemijos metodus (Eva Akerblom ir Kurt Skagius, Rao

ir Srinivasan, C. Ainsvort) buvo gauti 1,3,4-tiadiazolo dariniai. Šie junginiai buvo naudojami tolimesnėje sintezėje, siekiant pakeisti aminogrupę, esančią antroje padėtyje, į fluoro atomą, panaudojant

Baltz-Shieman reakciją. Sintetintų junginių struktūra įrodyta infraraudonosios (IR), ultravioletinės (UV)

spinduliuotės ir masių spektrometrijos metodais. Lydymosi temperatūra nustatyta Koflerio prietaisu. Grynumas nustatytas efektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrija (ESC-MS) metodu.

Tyrimo rezultatai: sintetintų junginių grynumas 80-96%. Iš keturių sintezuotų 1,3,4-tiadiazolo

junginių, modifikuoti pavyko tris, gaunat Šifo bazę.

Tyrimo išvados:

1. Susintetinti keturi 1,3,4-tiadiazolo dariniai, panaudojant skirtingas Eva Akerblom ir Kurt Skagius, Rao ir Srinivasan, Pedro Ortega-Luoni, ir C. Ainsvort metodikas.

2. Atliktas reakcijų optimizavimas, reakcija vyko greičiau ir išeiga buvo didesnė, kai oksidatorius yra bevandenis geleţies (III) chloridas, o ekstrahentas etilacetatas.

3. Junginių struktūros patvirtintos FT – IR ir MS spektrinės analizės metodais, o priemaišų analizė – ESC–MS metodu. Gautų junginių grynumas: 80-96%.

4. Balz-shieman reakcija klasikiniu būdu su 1,3,4-tiadiazolais nevyksta. Modifikavus sąlygas, palaikant ţemą pH reikšmę, temperatūrą ir naudojant perteklių tetrafluorborato rūgšties, bei natrio nitrito, reakcija įvykdyta.

2. Summary

Master thesis „Synthesis of 1,3,4-thiadiazoles based on in silico by using Balz-Shiemann reaction“ was written by Arminas Urbonavičius. Scientific adviser: prof. dr. Hiliaras Rodovičius.

Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry, Kaunas.

The aim of the research: Synthesis of 1,3,4-thiadiazole derivatives, reaction optimization and

fluorine introduction by Balz-shiemann reaction.

Objectives:

1. To synthesize 1,3,4-thiadiazole derivatives

2. To determine the synthesized compounds, physico-chemical properties 3. To adapt Balz-Shiemann reaction to the radical (SR) substitution

4. To optimize reaction and conditions of the reaction

Method of the research: 1,3,4-thiadiazole derivatives were made by using the classical

chemistry methods (Eva Akerblom and Kurt Skagius, Rao and Srinivasan, C. Ainsvort). These derivatives were used in the further synthesis in order to change amino group, which is at the second place, into fluorine by adapting Balz-Schiemann reaction. Structure of the synthetic derivatives was proven by methods of: infra-red (IR), ultraviolet (UV) radiation and mass spectrometry. Melting point set by Kofler device. Purity determined by high performance liquid chromatography with mass spectrometry (ESC-MS) method.

Results of the research: The purity of synthetic derivatives is 80-96%. Three of the four

synthesized 1,3,4-thiadiazole derivatives were able to modify by getting Schiff base.

Conclusions:

1. Four 1,3,4-thiadiazole derivatives were synthesized by using different methodologies of: Eva Akerblom and Kurt Skagius, Rao and Srinivasan, Pedro Ortega-Luoni, and C. Ainsvort.

2. An optimization of the reactions were conducted and it was concluded that when anhydrous iron (III) chloride is used as oxidizing agents and ethyl acetate as extractant the reaction was faster and the yield was higher.

3. The structures of the derivatives are approved by the FT - IR and MS spectral analysis, and impurity analysis by ESC-MS method. The purity of the obtained derivatives: 80-96%.

4. It was found that the Balz-Shiemann reaction in classical manner did not occur with 1,3,4-thiadiazoles. The reaction has been conducted with modifications: supporting low pH value, temperature, using excess tetrafluoroborate acid and sodium nitrite.

3. Santrumpos

 COX-2 - ciklooksigenazės 2 inhibitorius

 DABCO - 1,4-diazabiciklo[2.2.2]oktanas

 DCC - N,N'-dicikloheksilkarbodiimidas

 EDCI - 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimidas

 Ekv. - ekvivalentas

 ESC-MS – efektyvioji skysčių chromatografija - masių spektrometrija

 ESI - elektropurkštuvinis

 FT-IR - Furjė transformacijos infraraudonųjų spinduliuotė

 Konc. - koncentracija  Min. – minutė/minutės  MSCl – rimetilsilil-chloridas  PCl5 - fosforo pentachloridas  PPh3 - trifenilfosfinas  SOCl2 – tionil-chloridas  T3P - propilfosfoninis anhidridas  TsCl - 4-toluensulfonil-chloridas  Val. - valanda

4. Sąvokos

Azo-kopuliavimas – junginio sintezė sujungiant azoto ir kito junginio fragmentus Dehidratorius – junginys, atskeliantis vandenį iš kito junginio

Lavesono reagentas - 2,4-bis(4-metoksifenil)-1,3,2,4-ditiadifosfetan-2,4-disulfidas. Šis reagentas naudojamas sudaryti tropotionus in situ kambario temperatūroje

m/z dydis – dydis, kuris atspindi santykį tarp masės ir krūvio jonizuotoje formoje Sierinimas – organinių sieros junginių sintezė veikiant siera arba jos halogenidais

5. Įvadas

Farmacijos pramonei besivystant, ir vis ieškant naujų aktyvių molekulių į jų sudėtį yra įtraukiamas heterociklą turintis fragmentas. Heterociklai būdami biologiškai aktyvių junginių struktūroje suteikia jiems pageidaujamas farmakokinetines/farmakodinamines savybes. Unikali heterociklų klasė yra tiadiazolai. Šį heterociklą turintys junginiai pasiţymi plačiu biologiniu poveikiu (priešvėţiniu, priešuţdegiminiu, raminamuoju ir kt.). Nors tiadiazolai plačiai ištyrinėta farmakologiškai aktyvių junginių klasė, tačiau maţai yra ţinoma apie fluorintų tiadiazolų analogus. Fluoro atomas, esantis heterociklinio ţiedo struktūroje, yra išskirtinis savo lipofilinėmis savybėmis. Be to, mėgdţiojant vandenilio atomą suteikia molekulei padidėjusį metabolinį stabilumą, kuris sąlygoja išreikštą praeinamumą per biologines membranas ir pasiskirstymą organizme.

Tyrimo tikslas: susintetinti 1,3,4-tiadiazolo darinius pritaikant Balz-Shieman reakciją Tyrimo uždaviniai:

1. Sintezuoti 1,3,4-tiadiazolo darinius;

2. Nustatyti sintezuotų junginių tapatybę, fiziko-chemines savybes; 3. Pritaikyti Balz-Shieman reakciją radikaliniai (SR) substitucijai;

6 Literatūros apžvalga

6.1 Fluorintų heterociklų sintezė

Dar apie 1900 metus atlikta pirmoji fluorinimo reakcija, kurios metu Čičibabinas (Chichibabin et

al) susintetino 2-fluorpiridiną [1]. Didesnis susidomėjimas fluorintais junginiais įvyko tik po maţdaug 50

metų.

Fluorintų heterociklų sintezės problemas kėlė keletas veiksnių, kurie susiję su tuo, jog vienoje sąlyginai nedidelėje molekulėje kombinuojamos specifinės heteroatomo savybės ir specifinės fluoro atomo savybės. Pavyzdţiui, Balz–Schieman reakcija, kurios metu nepavyksta gauti fluorinto imidazolo [2].

Egzistuoja trys pagrindiniai metodai kaip gauti fluorintus heterociklus: a) sintezė iš fluorintų fragmentų (paveikslas 1) [3],

N H₂ NH N H₂ S

+

Pav. 1. Principinė reakcija, kurios metu gaunamas heterociklas panaudojant fluorintą fragmentą

b) fluorintų heterociklų cheminės modifikacijos apsaugant fluoro atomą (paveikslas 2) [4],

N F N F OH O Li N F OH O Li 1)n-BuLi/DABCO MTBE 2) CO2, -45 o C 1) n-BuLi, THF 2)CO2, -45 o C

Pav. 2. Principinė reakcija, kurios metu modifikuojami heterociklai savo sudėtyje turintys fluoro atomą

c) fluoro įvedimas į jau suformuotą heterociklą (paveikslas 3) [5]. S N N F _R S N N N H₂ R HF / NaNO₂

Pav. 3. Reakcija, kurios metu fluoro atomas įvedamas į suformuotą heterociklą

Visi trys metodai turi savo privalumų ir trūkumų. Mokslinėje plotmėje taikomi visi trys metodai, bet daţniausiai pasirenkamas metodas yra a), o b) ir c) metodai derinami kartu.

Fluorintų heterociklų sintezė yra tokia patraukli, nes galima panaudoti jau fluorą turinčius fragmentus. Heterociklizacijoje svarbus ţingsnis yra anglies ir heteroatomo jungties susidarymas, jis ir yra sąlyginai lengvai vykstantis procesas, ir tuo pačiu svarbus faktorius fluorintų komponentų įvedimui į heterociklą. Dėl sintezės giminingumo šie metodai labiausiai tinka sintetinant fluoralkyl- ir fluoraryl- pakeistus heterociklus, o maţiau tinka sintetinant cikle fluorintus heterociklus, kryptingai įvedant fluoro atomą į heterociklo ţiedą. Tarp fluoralkyl- ir fluoraryl- fragmentų daţniau naudojami yra trifluormetil- ir monoflorinti orto-, meta-, para-fluorfenil fragmentai. O pastaruoju metu jų vietą uţima kiti fluorinti fragmentai, tokie kaip trifluormetoksi-, ir pentafluorsulfonil- [6].

Kita populiari fluorintų heterociklų sintezės strategija yra modifikuoti jau fluorintą heterociklą, apsaugant fluoro atomą, ir taip gaunant naują fluorintą heterociklą. Ţinoma, fluorintų heterociklų transformacijos gali būti pasiektos daugybe moderniosios sintezės būdų. Vienas iš jų litinimas ir tolimesnės reakcijos su litintu fluorheterociklu [7].

Fluoro įvedimas į jau suformuotą heterociklą yra trečias metodas gauti fluorintus heterociklus. Daţniausiai naudojami du komplementarūs metodai įvykdyti šiai transformacijai – elekrofiliniai mainai tarp vandenilio atomo ir „elektrofilinio“ fluoro, bei fluoro inicijuota lengvai atskylančios grupės nukleofilinė substitucija. Kitas rečiau naudojamas metodas yra vandenilio atomo pakeitimas performuojant ir pertvarkant halogeno ir heteroatomo vietas.

Heteroatomo buvimas cikle apsunkina tiesioginį fluorinimą ir trukdo šį metodą naudoti C-fluorintų heterociklų sintezėje. Elektrofilinės pakaitų reakcijos heterocikluose vyksta silpniau nei karbocikluose dėl cikle esančių N, O atomų, kurie pasiţymi elektronus pritraukiančiomis savybėmis. Atsiţvelgus į maţą fluoro atomo regiospecifiškumą ir ankstesnėse studijose naudotus elektrofilinius fluorinančius agentus [8], įvyksta C-F ryšio susidarymo procese neregioselektyvi reakcija. Be to, gaunamas fluorintų izomerų mišinys kartu su nesureagavusiu substratu. Kadangi gautame mišinyje yra fluorintų izomerų ir nesureagavusio substrato, atskyrimas ir gryninimas tampa sudėtingas, nes fluorinti

heterocikliai junginiai ir nefluorinti vandenilį turintys substratai turi labai panašias fizikines savybes. Situacija pagerėjo, kai atsirado šiuolaikinių elekrofilinių fluorinimo reagentų, įskaitant komerciškai prieinamus N-fluorintus tokius kaip N+-F 1,4-diazobiciklo[2.2.2]oktanas (DABCO) pakaitus ir N-F sulfonimidus, taip pat pramonei svarbų fluoroksisulfato druskas M+

-OSO2OF ir labiau egzotiškus, tokius

kaip fluorintas fulerenas C60F48 [9], fluornitratas [10].

6.2 Diazonio druskos stabilumas

Pirminė nukleofilinė aminogrupė yra stabili, todėl naudojama tam, kad sudarytų diazonio joną, paveikiant ją nitritu [11]. Diazonio jonai pasiţymi aukštu elektrofiliškumu dėl α-azoto, kuris įtakoja lengvą azo-kopuliavimą su atitinkamais nukleofilais, pavyzdţiui CN

-, NO2-, Cl-, F-, Br-. Kadangi

molekulinis azotas yra gerai atskylantis nuo molekulės, kai kurios diazonio druskos jo netenka labai lengvai. Diazonio druskų stabilumui įtakos turi tirpalo pH vertė, anijonai, priemaišų pėdsakai tirpale, tokie kaip pereinamųjų metalų jonai [12].

6.3 Biomedicininis fluorintų heterociklių junginių panaudojimas

Vaistų paieškoje heterocikliniai junginiai turi ypatingai didelę reikšmę. Šios struktūros paplitusios gamtoje biologiškai svarbiose molekulėse – DNR ir RNR bazėse, alkaloiduose, metabolituose ir kt. Siekiant praplėsti struktūrinę gamtoje sutikamų ir sintetinių heterociklų įvairovę, jie yra modifikuojami, siekiant pagerinti jų biologines savybes. Heterocikliniai fragmentai pasiţymi vandenilinių ryšių sudarymu ir tirpumą gerinančiomis savybėmis, kurios didina molekulės panašumą į vaistus (angl.

drug-like). Ypatingomis biologinėmis savybėmis pasiţymi fluoro atomą turintys heterociklai. Fluoro

atomas, dėl gebėjimo struktūriškai „mėgţioti“ vandenilio atomą, daţnai įterpiamas į modernių vaistų molekulę, taip pagerinant modernaus vaisto farmakokinetinį-farmakodinaminį aktyvumą. Tokiu būdu molekulei suteikiamos didesnės lipofilinės savybės, ko pasekoje molekulė geriau absorbuojama, plačiau pasiskirsto po organizmą [13]. Fluoras esantis molekulėje apsaugo ją nuo metabolizmo ir molekulė lieka nepakeista toje vietoje kur yra šis unikalus atomas. Moderniuose vaistuose tai pritaikoma norint „apsaugoti“ vaistą nuo inaktyvavimo [14]. Apie 20% naujų vaistų savo sudėtyje turi fluoro atomą [15]. Be

to, fluorinti dariniai, kurie naudojami veterinarijoje/agrochemijoje uţima dar didesnę dalį [16]. Pavyzdţiui (paveikslas 4), vienas populiariausių lipidų koncentraciją maţinantis vaistas atorvastatinas (1), priešvėţiniu poveikiu pasiţymintis cepecitabinas (2), gefitinibas (3) ir gemcitabinas (4), lateralinės amiotrofinės sklerozės vaistas riluzolis (5), priešuţdegiminis vaistas COX-2 inhibitorius celekoksibas (6)

O O H OH OH N F O N H C H3 C H3 atorvastatinas 1 N O O N N O C H3 N H F Cl gefitinibas 3 2 O O H OH C H₃ N N O F NH O O CH₃ cepecitabinas O N N F F O H OH O NH2 gemcitabinas 4 S N H NH2 O F F F riluzolis 5 O N N S N H2 O F F F CH3 celekoksibas 6

Pav. 4. Modernių vaistų molekulės

6.4 1,3,4-tiadiazolų sintezė

Pastaraisiais dešimtmečiais didesnis chemikų susidomėjimas buvo heterociklų ir jų darinių pritaikymu farmacijos ir chemijos srityse. Viena iš unikaliausių heterociklinių junginių klasių yra

tiadiazolai. Jų struktūrą sudaro penkianarė sistema, kuri aromatiniame ţiede turi du azoto ir vieną sieros atomus. Paveiksle 5 pavaizduota 1,3,4-tiadiazolo ţiedo numeracija.

2

S

N

N

Pav. 5. 1,3,4-tiadiazolo ţiedo numeracija

Tiadiazolai turi keletą izomerų: 1,2,3-tiadiazolą, 1,2,4-tiadiazolą, 1,2,5-tiadiazolą, 1,3,4-tiadiazolą (Paveikslas 6). N S N N S N N S N S N N

1,2,3-tiadiazolas 1,2,4-tiadiazolas 1,2,5-tiadiazolas 1,3,4-tiadiazolas

Pav. 6. Tiadiazolo izomerai

1,3,4-tiadiazolo ţiedas yra silpna bazė dėl indukcinio efekto, sieros padėties ir sąlyginai didelio aromatiškumo [17]. Ţiedas stabilus vandeniniame rūgšties tirpale, bet gali suirti šarminėje terpėje. Taip pat ţiedas rodo elektronų deficitą dėl azoto atomų, kurie pritraukia link savęs elektronus, ir nedalyvauja elektrofilinėse pakaitų reakcijose, bet yra aktyvūs nukleofilinėms atakoms 2-oje ir 5-oje ţiedo padėtyse. Įtraukus pakaitus minėtose padėtyse 1,3,4-tiadiazolo ţiedas tampa aktyvuotas, tuomet galima įvesti pakaitus, gaunant aktyvius junginius. Mokslinės literatūros duomenimis iš keturių paminėtų izomerų, 1,3,4-tiadiazolas pasiţymi plačiausiu biologiniu aktyvumu. Pavyzdţiui, 1,3,4-tiadiazolo dariniai plačiai naudojami farmacijoje, agrokultūroje ir chemijos sintezėje. 1,3,4–tiadiazolo struktūroje esanti poliheteroatomų sistema, kurioje teigiamų ir neigiamų dalinių krūvių suma yra neutrali, leidţia šiam ţiedui sąveikauti su biomolekulėmis ir lengviau transportuoti molekulę per membranas. Ši savybė yra patraukli ir reikšminga vaistų chemijoje [18].

Šis ţiedas įeina į junginių struktūrą, kurie pasiţymi plačia biologinių efektų palete: priešmikrobiniu [19], prieštuberkulioziniu [20], antioksidaciniu [21], priešuţdegiminiu [22,23], prieštraukuliniu [24], antidepresiniu ir anksiolitiniu [25], antihipertenziniu [26], priešvėţiniu [21,27] ir priešgrybeliniu [28]. 1,3,4-tiadiazolo dariniai turi didelį potencialą kaip pesticidai, herbicidai, fungicidai,

insekticidai, bakteriocidai ir netgi augalų augimo reguliatoriai [29]. Kai kurie šio ţiedo junginiai yra uţdrausti naudoti agrokultūroje.

Tiadiazolų chemijos vystymas siejamas su hidrazinų ir fenilhidrazinų atradimu XIX amţiaus antroje pusėje.

Šie heterocikliniai ţiedai daţniausiai gaunami:

I. Ciklizuojant acilhidrazinus (N,N`-diacilhidrazinai, monoacilhidrazinai) (paveikslas 7);

R1 NH NH R2 O O R1 NH NH R2 S S S N N R1 R2

Pav. 7. Principinė reakcija gaunant tiadiazolo ţiedą ciklizuojant acilhidrazinus

II. Transformuojant 1,3,4–oksadiazolo ţiedą (paveikslas 8);

O N N R1 R2 S N N R1 R2 1,3,4-oksadiazolas _{1,3,4-tiadiazolas}

Pav. 8. Oksadiazolo transformacija į tiadiazolą

III. Sintetinant tiohidrazidus (tiosemikarbazidai, tiokarbazidai, tioacilhidrazidai) (paveikslas 9).

R1 NH NH₂ S R1 NH NH R2 S S S N N R1 R2 tiohidrazinas

Pav. 9 Principinė reakcijos lygtis, gaunant tiadiazolus iš tiohidrazinų

6.4.1 1,3,4-tiadiazolo žiedo gavimas iš acilhidrazinų

Vienas iš būdų gauti 1,3,4–tiadiazolo ţiedą yra 1,4–dikarbonilo ar acilo pirmtako sierinimas (paveikslas 10), panaudojant sierinančius reagentus, pavyzdţiui P2S5 ir Lavesono reagentą [30]. Šis būdas

reikalauja grieţtų reakcijos sąlygų ir daţnai gaunami neaiškūs nepageidaujami produktai. Kita publikacija [31] pateikia vienpakopės sintezės metodą, tačiau reakcijai reikalingos specifinės sąlygos. 1,3,4–

tiadiazolo ţiedą galima gauti karboksirūgštis veikiant propilfosfoniniu anhidridu (T3P), jis veikia dvejopai - susijungia su karboksirūgštimi ir dehidratuoja ciklą.

R1 OH O R2 NH NH₂ O S N _N R1 R2

+

Lavesono reagentas arba P₂S₅ (₁.₅ ekiv)

Pav. 10. Reakcijos lygis, kurios metu Kuo, Li, ir kolegos sintezavo 1,3,4-tiadiazolą panaudodami Lavesono reagentą.

6.4.2 1,3,4-tiadiazolo žiedo gavimas iš diacilhidrazinų

N,N`-diacilhidrazino ciklizacija yra daţnai naudojama gauti 1,3,4-tiadiazolo ţiedą (paveikslas 11). N H NH NH R2 O O R1 S N H N N R2 R1 Lavesono reagentas THF, t°

Pav. 11. Principinė N,N`-diacilhidrazino ciklizacijos reakcija, gaunant 1,3,4-tiadiazolo ţiedą

Šis metodas turi trūkumų. Jis reikalauja aukštos temperatūros ir reakcija trunka ilgai, be to, gaunama maţa išeiga, bei didelis priemaišų kiekis. Dėl toksinių tirpiklių ir sierinimo reagentų panaudojimo šis metodas yra ţalingas aplinkai. Esama tobulesnių N,N`-diacilhidrazinų ciklizacijos metodų (paveikslas 12), panaudojant mikrobangų sintezės principą, kurie nereikalauja tirpiklių, o reakcija įvyksta greičiau [32].

O NH O NH C₁₃H₂₇ N N C₁₃H₂₇ S Lavesono reagentas Mikro bangos 13min, 91%

Pav. 12. Principinė ciklizacijos reakcija, gaunant 1,3,4-tiadiazolą iš N,N`-diacilhidrazino panaudojant mikrobangas

6.4.3

1,3,4-tiadiazolo žiedo gavimas iš tiohidrazinų

Ciklizuojant tiohidrazinus arba jų darinius galima gauti 1,3,4–tiadiazolo ţiedą. Kiekvienas tiohidrazino darinys 1,3,4-tiadiazolo ţiedui gali suteikti skirtingą reaktyvumą ir bioaktyvumą. Tiohidrazinų grupė skirstoma į: tiosemikarbazidus, tiokarbazidus, ditiokarbazidus, tioacilhidrazinus, bitiošlapalus ir kt.

1,3,4-tiadiazolo žiedo gavimas iš tiosemikarbazidų

Ciklizuojant tiosemikarbazidus ir tiosemikarbazonus ar substituotus jų analogus, gaunami 2-amino-1,3,4–tiadiazolai. Tai vienas daţniausiai naudojamų būdų gauti šiuos ciklus, panaudojant tiohidrazidų grupę. Šioje reakcijoje acilinimas ar Šifo bazės sudarymas vyksta prie α-aminogrupės, in situ dehidrinant molekulę vyksta ciklizacija dėl dehidrinančių reagentų (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimido (EDCI), N,N'-dicikloheksilkarbodiimido (DCC), trimetilsililhlorido (MSCl), 4-toluensulfonilchlorido (TsCl), trifenilfosfino (PPh3), tionilchlorido (SOCl2), fosforo pentachlorido (PCl5))

ir gaunamas 1,3,4–tiadiazolas (paveikslas 13).

O OH R

+

Pav. 13. Principinė reakcijos lygtis kuomet, reaguojant tiosemikarbazidui su aldehidu, gaunama Šifo bazė, kuri yra dehidrinama ir, persislinkus elektronams, įvyksta ciklizacija ir gaunamas

Taip pat ciklizacijai naudojami oksiduojantys metalai, tokie kaip rūgštinis aliuminio oksidas, geleţies(III) chloridas [24,33]. Nukleofilams atakuojant izotiocianatus, įmanoma, kad tiosemikarbazidas bus tioacilinamas [34].

Tiosemikarbazidai veikiami anglies disulfidu, gali sudaryti 1,3,4–tiadiazolą, bet prieš tai suformuoja ditiokarbazidą [35] (paveikslas 14).

S S

+

Pav. 14. Ditiokarbazido suformavimo reakcija

1,3,4-tiadiazolo žiedo gavimas iš tiokarbazatų

Tiokarbazidai, kitaip dar vadinami karbonotioniniais dihidrazinais, ir jų dariniai dalyvauja panašiose reakcijose kaip ir tiosemikarbazidai gaunant tiadiazolus. Ciklizuojant tiokarbazidus ar tiosemikarbazatus, esminis skirtumas yra substituento vieta antroje 1,3,4-tiadiazolo ţiedo padėtyje [36]. Stengiantis išvengti gamtos taršos, propaguojant „ţalią“ sintezę, Li ir kolegos (Li et al.) [37] pateikia ekologišką būdą gauti 2-substituotą benzaldehido hidrazoną (5-aril-1,3,4-tiadiazol-2-il), panaudojant tiokarbohidrazidą kaip pradinį reagentą ir dichlorfosfatą kaip dehidratorių, o kaip šilumos šaltinį – mikrobangas (paveikslas 15). N H₂ NH NH NH₂ S O R Cl R NH NH NH NH R O O S R S N N NH NH R O

+

Pav. 15. Principinė reakcija, gaunant tiadiazolus, panaudojant tiokarbazatus

1,3,4-tiadiazolo žiedo gavimas iš tiohidrazidų

Tiohidrazidai ir tiosemikarbazidai savo chemine struktūra yra labai panašūs, bet turi vieną pagrindinį skirtumą - tiohidrazinų struktūroje trūksta α-aminogrupės. Dėl struktūros panašumų ši grupė dalyvauja panašiose, 1,3,4-tiadiazolo ţiedo ciklizacijos, reakcijose kaip ir tiokarbazatai. Reakcijos metu tiohidrazidai yra acilinami su karboksirūgštimis, halogenidų rūgštimis ar rūgščių anhidridais, arba suformuoja Šifo bazes panaudojant aldehidus ir tuomet dehidratuojamas ţiedas in situ - gaunamas 1,3,4– tiadiazolas. Fararas su kolegomis (Farrar et al.) šiuo metodu susintetino 2,5-dimetilfenil-1,3,4-tiadiazolą.

Jie tiobenzhidrazidą paveikė benzaldehidu ir gavo tiohidrazido derivatą, o kaip oksidatorių naudojo K2S2O8 [38]. NH₂ NH NH S N H₂

+

Pav. 16. Principinė reakcijos lygtis, kurios metu gaunamas 1,3,4–tiadiazolas, panaudojant tiohidrazidų darinį

1,3,4-tiadiazolo žiedo gavimas iš bitiošlapalo darinių

Šis būdas aktualus, nes gaunamas 2,5-amino-1,3,4-tiadiazolas, antroje ir penktoje padėtyje turi aktyvias grupes, kurių pagalba gali būti panaudotas tolimesnėse sintezėse kuriant aktyvius junginius.

Bitiošlapalas su α-aminais iš abiejų galų, gaunamas reaguojant iztiocianatams su hidrazinais ar tiosemikarbazidais (paveikslas 17). Gautas bitiošlapalas dehidratuojamas ir ciklizuojamas, suformuojant 1,3,4-tiadiazolą [39]. R N S 2

+

Pav. 17. Hidrazino sąveika su tiociano grupe, suformuojant bitiošlapalo darinį

Prieš susiformuojant ciklui, molekulėje vyksta nukleofilinės atakos, kuriose dalyvauja 2-tiolio ir antrinė aminogrupė. Dėl šių atakų galimos dvi baigtys (paveikslas 18). Pirmuoju atveju nuo molekulės atskyla –SH grupė ir suformuojamas 2,5-amino-tiadiazolas. Antruoju atveju atskyla –NH2 grupė ir

S NH NH NH R S NH R .. S H S N NH NH R NH R NH R S N N NH R S S N N H NH R -RNH₂ -H₂S

Pav. 18. Reakcijos mechanizmas, kurios metu vyksta nukleofilinės atakos, atskyla šalutinės priemaišos ir gaunami skirtingi galutiniai produktai

6.4.4

1,3,4-tiadiazolo žiedo gavimas iš oksadiazolų

Teoriškai įmanoma epoksidus transformuoti į episulfidus, panaudojant tiocianato ar tiošlapalo darinius. Apie oksadiazolų transformavimą nėra daug literatūros, nors Padmavatis su kolegomis (Padmavathi et al.) sėkmingai transformavo 1,3,4-oksadiazolą, panaudodami tiošlapalą (paveikslas 19). Reakcija atlikta tetrahidrofurane (THF). Šio eksperimento metu jiems pavyko gauti didelę 1,3,4-tiadiazolo išeigą [41]. O N N S NH O O R R S N N S NH O O R R H₂NCSNH₂ THF

Pav. 19. Oksadiazolo darinio transformacijos reakcija, gaunant tiadiazolo darinį

Hipotetinis reakcijos mechanizmas galėtų būti tiošlapalo sieros atomo, 1,3,4-oksadiazolo ţiedo 2` ir 5` padėčių, ataka, kuriai vykti padeda papildomi elektronai, patraukti nuo azoto atomų. Toliau vyksta ţiedo atsidarymas ir susidaro tiouroniaus druska. Vėliau molekulė persitvarko taip, kad suformuoja mezomerinę oksourininę druską, iš kurios suformuoja oksatioadiazepino darinys. Oksouroniaus druska suformuoja tiadiazolo ţiedą ir šlapalo molekulė pašalinama. Reakcijos schema pateikta paveiksle 20 [42].

N N O R1 R2 NH₂ NH₂ S R1 N N S N H₂ O R2 NH_{.. 2} R1 N N S -O R2 N H₂ NH₂+ NH₂ N H₂ + R1 N N S O -R2 N N S R1 R2 NH₂ NH₂ O + +

Pav. 20. Oksadiazolo darinio transformacijos metu vykstantis molekulės persitvarkymas, gaunant tiadiazolo darinį

7 Tyrimo metodika ir metodai

7.1 Naudotos medžiagos

2-nitrobenzaldehidas (98 proc.), 3-nitrobenzaldehidas (99 proc.), 4-chlorbenzaldehidas (97 proc.), 4-nitrobenzaldehidas (98 proc.), tiosemikarbazinas (98 proc.), metalinis natris (99.9 proc.), jodas (99 proc.), druskos rūgštis (37 proc.), vandenilio fluorido rūgštis (40 proc.), benzaldehidas (99 proc.), metanolis (99.8 proc.), anglies disulfidas (99 proc.), monochloracto rūgštis (99 proc.), kalio hidrokarbonatas (99 proc.), natrio šarmas (98 proc.), aktyvuota anglis (99 proc.), geleţies(III) chloridas (99 proc.), amoniakinis tirpalas (28 proc.), etilacetatas (99 proc.), etiloeteris (99 proc.), boro rūgštis (99 proc.), natrio nitritas (99% proc.) įsigyti iš „Sigma-Aldrich GmbH“ (Bunch, Šveicarija), etanolis (96.3 proc.) iš „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva)

7.2 In silico tyrimas

In silico molekulinis modeliavimas atliktas panaudojant Schrodinger programinį paketą [43].

Tiriamų junginių citochromo CYP450 metabolizmo tyrimui panaudotas physics-based adme-tox modulis. Tridimensinė junginių struktūra sukurta bei molekulių energijos minimizacija atlikta panaudojant programiniame pakete esantį cheminių struktūrų modeliavimo bei optimizavimo modulį. Panaudojant programiniame modulyje esančią CYP 450 metabolizmo skaičiavimo funkciją, molekulinis dokinimas atliktas panaudojant izofermento 2d6 kristalinę struktūrą. Physics-based adme-tox modulio pagalba tiriamiems junginiams buvo nustatytas empirinis (metabolizmo) taškų vertinimas. Tiriamų junginių ir CYP450 duomenų vizualizacijai taip pat buvo panaudotas Schrodinger programinis paketas.

7.3 Junginių sintezės metodikos.

7.3.1

5-metoksi-1,3,4-tiadiazol-2-amino sintezė.

Junginys 2-amino-5-fenil-1,3,4-tiadiazolas gautas daugiapakopės sintezės būdu panaudojant Eva Akerblom ir Kurt Skagius metodą [44]. Pirmiausia į apvaliadugnę kolbą įpilama 50ml metanolio, kolba

įstatoma į ledo vonelę ir maţais gabalėliais į kolbą dedamas metalinis natris (4,6g). Vėliau, ištirpus natriui ir susidarius natrio metanoliatui, lėtai lašinamas anglies disulfidas (reakcijos mišinio temperatūra turi nepakilti aukščiau 40o

C) ir maišoma apie 2 valandas. Po to tirpiklis nugarinamas su rotoriniu vakuuminiu garintuvu, o likutis tirpinamas vandenyje.

Paruošiame monochloracto rūgšties kalio druską (0,2 mol/l).

Ištirpintas likutis ir paruošta monochloracto rūgšties kalio druska sumaišomi ir paliekami maišytis per naktį. Ryte 18ml konc. druskos rūgšties įpilama į tirpalą. Gaunamas aliejinis sluoksnis, kuris atskiriamas nuo vandeninio. Vandeninis sluoksnis estrahuojamas su etilacetatu (3x25ml). Aliejinis sluoksnis sumaišomas su organiniu tirpikliu. Tirpiklis pašalinamas rotorinio vakuuminio garintuvo pagalba. Gautas koncentruotas aliejinis skystis neutralizuojamas 5N natrio šarmu. Įdedamas tiosemikarbazido perteklius ir mišinys pašarminamas naudojant 5N natrio šarmą. Maišoma apie 14 val. Po to į mišinį dedama aktyvintos anglies, jis pašildomas ir dar šiltas filtruojamas. Į atvėsusį filtratą įpilama 25ml koncentruotos acto rūgšties, pradeda kristi balti kristalai. Po kurio laiko tirpalas filtruojamas, o balti kristalai (O-metil-2-karbamotioilhidrazin-1-karbotioatas) surenkami ir išdţiovinami. Į apavaliadugnę kolbą pasveriama (6,0g) gautų baltų kristalų ir įpilama 25ml vandens. Kai kristalai ištirpsta kolba patalpinama į ledo vonelę. Į kolbą lėtai lašinama vandenilio peroksido 60ml 3%. Temperatūra turi nepakliti daugiau kaip 3°C. Baigus lašinti vandenilio peroksidą, mišinio temperatūra pakeliama iki 20°C ir maišoma 3 val. Po to filtruojama, filtratas surenkamas, į jį įpilama 50ml vandens ir virinama 1 val. Tada karštas tirpalas filtruojamas ir ant filtro lieka geltonos nuosėdos (siera). Tirpalui atvėsus gaunamos baltos nuosėdos 5-metoksi-1,3,4-thiadiazol-2-aminas. Gauta medţiaga filtruojama ir dţiovinama.

7.3.2

Aril-1,3,4-tiadiazolų sintezė

Aril-1,3,4-tiadiazolams gauti buvo naudota Rao ir Srinivasano modifikuota metodika [45].

Į apvaliadugnę kolbą pasveriame tiosemikarbazido ir jį ištirpiname minimaliame kiekyje išgryninto vandens ir įpilame benzaldehido, prijungiame grįţtamąjį šaldytuvą ir kaitiname 1 val. Po to gautos nuosėdos filtruojamos ir dţiovinamos. Gautas tarpinis junginys 2-benzilhidrazin-1-karbotioamidas. Į apvaliadugnę kolbą įpilama etanolio, kuriame ištirpinamas 2-benzilhidrazin-1-karbotioamidas ir įdedamas FeCl3,prijungiamas grįţtamasis šaldytuvas ir reakcijos mišinys paliekamas maišytis 12 valandų.

konc. druskos rūgšties ir įpilama išgryninto vandens, mišinys paliekamas maišytis iki 1 valandos. Tirpalas neutralizuojamas amonio hidroksidu. Iškritusios nuosėdos filtruojamos ir išdţiovinamos, vėliau surenkamos ir tirpinamos metanolyje. Gautas tirpalas ekstrahuojamas etilacetatu, naudojant besitęsenčios ekstrakcijos metodą. Etilacetatas surenkamas į vieną apvaliadugnę kolbą ir nugarinamas rotoriniu vakuuminiu garintuvu, paliekant nedidelę dalį tirpiklio. Susidarę kristalai filtruojami, praplaunami lediniu distiliuotu vandeniu, lediniu etanoliu ir lediniu eteriu, po to išdţiovinami.

Šiuo būdu buvo bandoma gauti: 2-amino-5-fenil-1,3,4-tiadiazolą, 2-amino-5-(p-nitrorofenil)-1,3,4-tiadiazolą, 2-amino-5-(m-nitrorofenil)-2-amino-5-(p-nitrorofenil)-1,3,4-tiadiazolą, 2-amino-5-(p-etilfenil)-1,3,4-tiadiazolą.

7.3.3

5-amino-1,3,4-tiadiazol-2-tiolio sintezė

Junginys 5-amino-1,3,4-tiadiazol-2-tiolas gautas laikantis Pedro Ortega-Luoni metodikos [46]. Į apvaliadugnę kolbą pasveriama kalio hidrokarbonato (5,34 mmol), kuris ištirpinamas etanolyje 96% (15ml) ir įpilama anglies disulfido (5,52 mmol). Vėliau įpilama tiosemikarbazido (5,49 mmol) ištirpinto 96% etanolyje, prijungiamas gįţtamasis šaldytuvas ir reakcijos mišinys kaitinamas 8 val. Po to tirpiklis pašalinamas naudojant rotorinį vakuuminį garintuvą, likutis ištirpinamas vandenyje (50ml). Tirpalas parūgštinamas druskos rūgštimi (2-5ml), pradeda kristi kristalai. Nuosėdos filtruojamos ir praplaunamos lediniu vandeniu. Vėliau išdţiovinamos ir rekristalinamos iš etanolio. Gaunami balti kristalai.

7.3.4

1-amino-1,3,4-tiadiazolo sintezė

1-amino-1,3,4-tiadiazolas gautas laikantis C. Ainsvort’o metodo [47].

Į apvaliadugnę kolbą pasveriama 0,1 mol tiosemikarbazino ir įpilama 50ml trietilortoformiato. Prijungiamas grįţtamasis šaldytuvas ir kaitinama per naktį. Ryte gautos nuosėdos filtruojamos ir praplaunamos eteriu. Gautas N,N`-bis-(1,3,4-tiadiazolo-2)-formamidas - gelsvi kristalai. Šie kristalai apvaliadugnėje kolboje sumaišomi su konc. druskos rūgštimi ir, prijungus grįţtamąjį šaldytuvą, paliekami kaitintis 6 valandas. Po to rūgštis nugarinama naudojant rotorinį vakuuminį garintuvą. Likutis pašarminamas ir gautos baltos spalvos nuosėdos filtuojamos bei dţiovinamos.

7.3.5

Balz-Shieman reakcija

Balz-Shieman reakcija naudota fluoro įvedimui į gautus junginius [48].

Į 100ml apvaliadugnę kolbą pasveriama 0,5g turimo tiadiazolo, įpilama 15-25ml paruoštos borotetrafluorido rūgšties ir kaitinama iki virimo. Po to tirpalas atvėsinamas ir įstatomas į recirkuliacinį šaldytuvą, kuriame palaikoma -10o

C temperatūra. Vandenyje ištirpinamas natrio nitritas (10 kartų daugiau, negu tiadiazolo). Kai mišinys atšąla iki -7 – -9oC supilamas natrio nitrito tirpalas. Toliau stebimas tirpalo spalvos pasikeitimas, dujų išsiskyrimas, temperatūros kilimas (neturi pakilti virš -5 o

C). Paliekama maišytis 30-60 min.

Reakcijai pasibaigus, mišinys filtruojamas per stiklo filtrą, praplaunamas lediniu distiliuotu vandeniu, po to nusausinamas, praplaunamas lediniu etanoliu, nusausinamas, vėliau praplaunamas lediniu eteriu ir išdţiovinamas. Gauta sausa diazonio fluorborato druska suberiama į nedidelę apvaliadugnę kolbą ir įpilama ksileno. Kaitinama apie 30 min prijungus grįţtamąjį šaldytuvą. Po to ksilenas nugarinamas naudojant rotorinį vakuuminį garintuvą. Gauta medţiaga išgryninama chromatografijos būdu.

5-fenil-1,3,4-tiadiazol-2-aminas (AT-1) – išeiga: 81%, TLyd.= 223-227 °C, λMax = 285 nm (UV),

FTIR: NH2 3199 cm-1, 89,01% T, 3010 cm-1 , 91,06% T, 1377 cm-1 , 81,87% T, C-S-C: T 748 cm-1,

70,88% T 701 cm-1, 67,22% T. MS (ESI+): C8H7N3S [M+H]+ = 178.0807 Da.

5-amino-1,3,4-tiadiazol-2-tiolas (AT-5) – išeiga: 79%, TLyd. =235 °C λMax = 310 nm (UV),

FTIR: NH2: 3244 cm-1, 86,99% T, 3088 cm-1 , 84,07% T, N=C: 1602 cm-1, 81,97% T, C-SH: 1464 cm-1,

81,57% T, 1054 cm-1, 76,61% T, S-C: 1325 cm-1, 79,00% T. MS (ESI+): C2H3N3S2 [M+H]+ = 134.0129

Da.

1,3,4-tiadiazol-2-aminas (AT-6) –išeiga: 67%, TLyd. = 188-191 °C, λMax = 254 nm (UV), FTIR:

NH2: 3232 cm-1, 73,99% T, 3094 cm-1 , 71,54% T, N=C: 1587 cm-1, 53,20% T, S-C: 1301 cm-1, 74,93%

T. MS (ESI+): C2H3N3S [M+H]+ = 102.0371 Da.

5-metoksi-1,3,4-tiadiazol-2-aminas (AT-8) – išeiga: 42%TLyd. = 223-228 °C λMax = 255 nm

(UV), FTIR: NH2: 3402 cm-1, 88,34 % T, 3258 cm-1 , 86,46% T, N=C: 1497 cm-1, 75,37% T, S-C: 1217

7.3.6

Reakcijų optimizavimas

7.3.6.1

Aril-1,3,4-tiadiazolų reakcijų optimizavimas.

Šifo bazės buvo gautos su visais bandytais aldehidais (benzaldehidu, chlorbenzaldehidu, 4-etilbenzaldehidu, 4-hidroksibenzaldehidu, 2-nitrobenzaldehidu, 3-nitrobenzaldehidu, 1-nitrobenzaldehidu), tačiau ne visus pavyko ciklizuoti į atitinkamą 1,3,4-tiadiazolo ţiedą. Metanolis panaudotas kaip tirpiklis. Ciklizacijai kaip oksidatoriai naudoti: jodas, geleţies (III) chloridas, bevandenis geleţies (III) chloridas, 4-toluensulfonil chloridas, tionil chloridas, fosforo oksichloridas. Ciklizacijai įvykdyti buvo bandomi įvairūs laiko intervalai. Ekstrahentu naudoti chloroformas, etilacetatas, dietileteris.

7.3.6.2

Balz-Shieman reakcijos optimizavimas

Balz-Shieman reakcijai naudoti susintetinti AT junginiai, turintys laisvą aminogrupę -

protonizuojant juos druskos rūgštimi arba tetrafluorboro rūgštimi. Reakcija buvo vykdoma, palaikant skirtingas pH reikšmes ir temperatūrinius rėţimus. Diazonio jono sudarymui panaudotas natrio nitrito tirpalas ir tetrafluorboro rūgštis. Gauta diazonio tetrafluorborato druska buvo skaldoma dviem būdais: termolize arba termolize tirpiklyje.

7.4 Analizės metodai

7.4.1

FT–IR spektroskopija

Gautų medţiagų IR spektrai uţrašyti PerkinElmer UATR Two spektrometru. Atliekant FT–IR spektro analizę, IR spinduliuotė nukreipiama tik į bandinį, todėl gautos medţiagos milteliai uţnešami plonu sluoksniu ant prietaiso deimanto ir uţrašomas jo FT–IR spektras 450–4000cm-1

bangos skaičiaus intervale.

7.4.2

Plonasluoksnė chromatografija

Junginių sintezės metu, reakcijų monitoravimui ir pirminiam identifikavimui naudojamas greitas ir universalus medţiagų tyrimas – plonasluoksnė chromatografija. Ant silicio gelio plokštelės starto linijos uţlašinami keli μl tiriamojo tirpalo ir sintezės metu naudojami reagentai, tam panaudojami mikrokapiliarai. Kiekvieno tiriamojo lašo dėmė išdţiovinama ir tik tada dedamas kitas lašas. Chromatografinė kamera uţpildoma judančiąja faze, kuri priklauso nuo kiekvieno junginio savybių. Eksperimentiškai parinkus tinkamą judančią fazę, tiriamojo mišinio komponentai per sorbento sluoksnį juda skirtingu greičiu. Tirpikliui pakilus plokštele iki pabaigos taško, ji išimama ir dţiovinama. Tiriamosios zonos identifikuojamos stebint apšvietus UV spinduliuote. Junginys nustatomas apskaičiuojant Rf vertes ir lyginant jas su pradiniu reakcijos junginiu. Rf apskaičiuojama pagal šią formulę: Rf = 𝒂/𝒉

a – nueitas tiriamosios medţiagos kelias; h – tirpiklių sistemos nueitas kelias.

7.4.3

UV spektrofotometrija

Gautų junginių spektrai buvo uţrašyti naudojantis Agilent Technologies Cary 8454 UV-VIS. Pasveriamas 1mg gauto junginio ir ištirpinamas 1ml metanolio. Iš paruošto koncentrato paimama 10 µl tirpalo ir skiedţiama 1ml metanolio, taip gaunamas 10 µg/ml tirpalas. Metanolis pilamas į kiuvetę, dedamas į spektrofotometrą ir uţrašomas jo sugerties spektras, kuris yra atimamas. Tada tiriamas paruoštas 10 µg/ml tirpalas, matuojamas tuo pačiu principu – uţrašomas gauto junginio UV sugerties spektras, matuojant UV absorbciją esant 200-600 nm bangos ilgiams.

7.4.4

ESC – tandeminės MS/MS spektrometrija

Susintetinti AT ir AR junginiai buvo analizuojami naudojant Agilent Technologies 6530

Accurate-Mass QTOF ESC/MS prietaisą. Mėginiai buvo paruošiami pagal tą pačią metodiką, kaip ir

efektyvųjį skysčių chromatografą Agilent Technologies Infinity 1260 chromatografinei ir masių spektrometrinei analizei.

1 lentelė. Skysčių chromatografijos junginių išskirstymo parametrai gauto reakcijos mišinio ir gautų junginių įvertinimui.

Parametrai Agilent 1260 Infinity ESC sistema

Chromatografinė kolonėlė

Agilent Zorbax Rapid Resolution High Definition (RRHD) Eclipse Plus C18

2,1×50 mm, 1,8-µm, (p/n 959757-902) Kolonėlės

temperatūra

25oC

Injekavimo tūris 2,5 µl

Injekavimo greitis 500 µl/min

Mobili fazė Junginių grynumo tyrimai:

A: 0,1 % TFA vandeninis tirpalas

B: Metanolis, turintis 0,1 % TFA (analitinio švarumo >99,5%)

Tekmės greitis 340 µl/min

Gradientas

Junginio grynumo tyrimai

Laikas A: B: 0,05 min 90,0 % 10,0 % 1,45 min 60,0 % 40,0 % 8,75 min 60,0 % 40,0 % 13,00 min 10,0 % 90,0 % 16,25 min 10,0 % 90,0 % 18,50 min 90,0 % 10,0 % 20,00 min 90,0 % 10,0 %

Detektorius Agilent 1260 Infinity DMD, bangos ilgio intervalas 190–640 nm, diapazono plotis

po 1 nm, <0,0031 min (atsako laikas 0,031 s), (80 Hz)

A: 254/1 nm Ref. 550/100 nm B: 230/1 nm Ref. 550/100 nm C: 410/1nm Ref. 550/100 nm D: 215/1 nm Ref. 550/100 nm E: 360/1nm Ref. 550/100 nm F: 200/1nm Ref. 550/100 nm G: 310/1 nm Ref. 550/100 nm H: 280/1 nm Ref. 550/100 nm

Analizės trukmė 20 minučių sintezuotų junginių grynumo tyrimams

Post-analizės trukmė

7,5 minutės

Susintetinti AT, AR junginiai buvo analizuojami naudojant Agilent Technologies 6530

pačią metodiką, kaip ir atliekant UV spektrofotometrijos analizę. Pagaminti AT, AR mėginių tirpalai buvo filtruojami ir injekuojami į efektyvųjį skysčių chromatografą Agilent Technologies Infinity 1260 chromatografinei ir masių spektrometrinei analizei. Taip pat in silico sudarytas palyginamasis masių spektras pagal elementinę izotopų distribuciją su Agilent MassHunter Workstation Data Analysis Core moduliu.

2 lentelė. Optimizuoti masių spektrometrijos parametrai

Programinė įranga duomenų analizei:

• Agilent MassHunter Qualitative Analysis (Qual) B.07.00; • Agilent MassHunter Profinder B.06.00, sp. 1;

Parametrai Agilent 6530 Q–TOF MS sistema

Jonizacija Teigiama (+)

Jonizacijos šaltinis Agilent Dual Jet Stream elektropurkštuvinis jonizatorius (ESI)

Kapiliarinė įtampa 3250 V (+)

Purkštuvo įtampa 250 V

Fragmentatoriaus įtampa 150 V

Dţiovinimo dujų temperatūra 350oC

Dţiovinimo dujų tėkmė 10 l/min

Purkštuvo slėgis 45 psig

Apgaubiančių dujų temperatūra 380oC

Apgaubiančių dujų tėkmė 8 l/min

MS ribos 80 – 450 m/z

Kolizijos energija 0 – 40 V

MS registravimo daţnis 2 spektrai/s

MS/MS ribos MS: 100 – 1700 m/z

MS/MS: 100 – 1700 m/z

MS/MS registravimo daţnis MS: 2 spektrai/s

MS/MS: 3 spektrai/s, Auto MS/MS

Izoliavimo plotis Siauras (~1.3 m/z)

Kolizijos energija 0 – 40 V

Etaloninė masė (+): 121.050873 ir 922.009798

8 Rezultatai ir jų aptarimas

8.1 CYP metabolinio stabilumo in silico tyrimas

Literatūros apţvalgoje buvo minėta, apie fluoro įtaką biologiškai aktyvių junginių metabolizmui ir apie 1,3,4-tiadiazolo ţiedą turinčias molekules, kurios yra biologiškai aktyvios. Nusprendėme pasirinkti šias struktūras nes manėme, jog sujungus jas būtų galima gauti metaboliškai stabilesnius 1,3,4-tiadiazolus. Atlikus in silico modeliavimą ir palyginus CYP sistemos metabolizmo įtaką fluorintiems ir fluoro neturintiems heterociklams, pastebėta, kad fluoro atomo buvimas antroje heterociklo ţiedo padėtyje apsaugo šią padėtį nuo metabolinės oksidacijos taip pat iš dalies apsaugo sieros heteroatomą nuo galimo oksidavimo, bet neturi įtakos fenilo ţiedo metabolizmui (paveikslas 21b). Kaip pavyzdys buvo palyginti 5-fenil-1,3,4-tiadiazolas ir 2-fluor-5-fenil-1,3,4-tiadiazolas junginiai.

21a paveiksle matome ţalia spalva paţymėtas kryptis, iš kurių molekulė gali priartėti prie CYP450 šeimos specifinio 2d6 baltymo aktyviojo centro, dėl savo išsidėstymo erdvėje. 5-fenil-1,3,4-tiadiazolo darinys patekęs į CYP metabolitinę sistemą gali būti pakeistas 5-fenil-1,3,4-tiadiazolo ţiede prie sieros ir anglies atomų.

a) b)

Pav. 21 a,b. Galimos metabolizmo vietos molekulėje, kai ji yra veikiama CYP fermentų. A) paveiksle matoma molekulė, neturinti fluoro atomo ir tiadiazolo ţiedas gali būti pakeistas antroje padėtyje taip pat pirmoje heteroatomo padėtyje. B) paveiksle matoma molekulė turinti fluoro atomą antroje padėtyje. Tiadiazolo ţiedo antra padėtis yra apsaugoma nuo metabolinio pakeitimo, taip pat dalinai apsaugomas pirmoje padėtyje esantis heteroatomas. Ţali brūkšneliai ţymi puses iš kurių galimai bus pakeista molekulė.

Įvertinus gautus in silico palyginimo rezultatus, pasirinkta modifikavimo strategija naudojant

Balz-Shieman reakciją [48], kuri su penkianariais aromatiniais heterociklais vyksta daug sunkiau nei su

aromatiniais šešis atomus turinčiais ciklais.

8.2 1,3,4-tiadiazolų reakcijų optimizavimas

1,3,4-tiadiazolus gavome, panaudojus skirtingas metodikas (Eva Akerblom ir Kurt Skagius [44], Rao ir Srinivasano [45], Pedro Ortega-Luoni [46]ir C. Ainsvort’o [47]). Reakcijų optimizavimui buvo pasirinkta Rao ir Srinivasano metodika, nes ši metodika gali būti atlikta panaudojus kelis skirtingus oksidatorius. Oksidatoriai naudoti ekvimoliariniais kiekiais pradinėms reakcijos medţiagoms. Optimizacijos sąlygos pateiktos lentelėje 3. Šiuo metodu nepavyko gauti 7), 9), 10), (AT-11) junginių.

3 lentelė. 1,3,4-tiadiazolų reakcijų optimizavimo parametrai

Oksidatoriai reakcijos laikas ekstrahentas

1 val. 3 val. 5 val. 10 val. 12 val. chloroformas etilacetatas eteris

jodas 13% 24% 44% 72% 79% 73% 79% 69%

geleţies (III) chloridas 9% 19% 32% 77% 80% 77% 80% 74%

bevandenis geleţies

(III) chloridas 8% 18% 32% 81% 81% 78% 81% 76%

4-toluensulfonil

chloridas 14% 22% 37% 73% 75% 72% 75% 70%

tionil chloridas 10% 17% 29% 78% 78% 75% 78% 71%

Remiantis gautais duomenimis, reakcija vyksta greičiausiai ir išeiga yra didţiausia naudojant bevandenį geleţies (III) chloridą. Metodika nurodo, kad po reakcijos susidariusios nuosėdos lengvai iškristalinamos iš etanolio ar metanolio. Atliekant tyrimą, nepavyko atkartoti proceso, todėl buvo panaudotas skystis/skystis ekstrakcijos būdas. Iš naudotų ekstrahentų su etilacetatu išekstrahuota daugiausia galutinės medţiagos, bet naudojant klasikinį ekstrakcijos būdą etilacetato sluoksnis uţsiteršdavo priemaišų likučiais, prilipusiais prie dalomojo piltuvo sienelių. Todėl buvo bandomas kitas ekstrakcijos būdas, tam, kad būtų išgauta daugiau galutinio produkto. Pasirinktas besitęsiančios

ekstrakcijos metodas, kuris yra patogus tuo jog ekstrahentas cirkuliuoja ratu sistemoje sukoncentruodamas galutinį produktą apvaliadugnėje kolboje. Gautos negrynos nuosėdos sudedamos į ekstrakcijos aparato apačią, įstatomas nutekamasis vamzdelis ir prijungiamas grįţtamasis šaldytuvas taip, kad iš jo tirpiklis patektų į nutekamąjį vamzdelį. Prie jungiamosios alkūnės prijungus apvaliadugnę kolbą su etilacetatu, ji šildoma ir tirpiklis pradeda garuoti. Vis grįţtantis tirpiklis praplauna nuosėdas, taip išekstrahuodamas dalį galutinio junginio. Prisotintas tirpiklis nuteka į apvaliadugnę kolbą. Ciklas tęsiasi tol, kol tirpiklio spalva pasidaro skaidri aplink nuosėdas. Išekstrahuota galutinė medţiaga sukoncentruojama rotoriniu vakuuminiu garintuvu. Gauti kristalai filruojami ir išdţiovinami.

Pav. 22. Besitęsiančios ekstrakcijos aparatas

8.3 Junginių analizė

8.3.1

ESC-MS analizė

Reakcija (paveikslas 24) monitoruota naudojant Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass

QTOF ESC/MS prietaisą, nustatant pradines medţiagas ir reakcijos produktą. Paveiksle 25 matome

N NH S NH₂ N N S NH₂ FeCl₃ Metanolis °C

Pav. 23 Šifo bazės ciklizacija verdančiame metanolyje kai oksidatorius bevandenis geleţies chloridas, gautas AT-1 junginys

Pav. 24.Junginio masių spektras, nustatyta Šifo bazės masės ir krūvio santykis m/z, kuris patvirtina elementinę junginio sudėtį

Reakcija laikoma baigta, kai reakcijos mišinyje dominuoja AT-1 junginys. Paveiksle 26 pateiktas AT-1 junginio masės ir krūvio santykis (178,0807), taip pat matoma junginio ir natrio komplekso m/z reikšmė (200.0633). Gauti duomenys patvirtina junginio elementinę sudėtį.

8.3.2

FT-IR analizė

Reakcijų monitoravimas ir galutinių junginių identifikavimas atliktas naudojant FT-IR spektroskopijos metodą, lyginant pradines medţiagas su reakcijos mišiniu. Charakteringos smailės nustatomos 1500cm-1 – 450 cm-1 ruoţe. Paveiksle 27 matomos aminogrupių smailės. Pirminė aminogrupė nustatoma prie 3244 cm-1, 86,99% T, 3088 cm-1 , 84,07% T; N=C identifikuojama - 1602 cm-1, 81,97% T; C-SH smailės šiame junginyje stebimos dvejose vietose dėl tautomerijos 1464 cm-1, 81,57% T, 1054 cm-1, 76,61% T, taip pat matome S-C smailę 1325 cm-1, 79,00% T.

Pav. 26. AT-5 junginio FT-IR spektras NH2: 3244 cm-1, 86,99% T, 3088 cm-1 , 84,07% T,

N=C: 1602 cm-1, 81,97% T, C-SH: 1464 cm-1, 81,57% T, 1054 cm-1, 76,61% T, S-C: 1325 cm-1, 79,00% T

8.4 Balz-Shieman reakcijos optimizavimas

Gauti AT junginiai buvo modifikuoti bandant įvesti fluoro atomą, pakeičiant antroje padėtyje esančią aminogrupę. Optimizacijos sąlygos pateiktos 4 lentelėje.

4 lentelė. Balz-Shieman reakcijos optimizavimo parametrai

tirpiklis pH Protonizuojantis agentas kaitinimas min mišinio tempoC diazotinimas maišymo laikas min Fluorinimo agentas diazonio išeiga % vanduo 4 HCl 15 >5 NaNO2 30 HBF4 0 vanduo 3 HCl 15 <5 NaNO₂ 30 HBF₄ 22 HBF 4 1 HBF4 15 0 NaNO2 30 HBF4 35 HBF 4 1 HBF4 15 <-5 NaNO2 45 HBF4 50 HBF4 1 HBF4 15 <-5 Perteklius NaNO2 45 HBF4 56

Klasikiniu Balz–Schieman metodu buvo bandoma gauti fluorintus junginius, tačiau jų gauti nepavyko, todėl reikėjo modifikuoti reakcijos eigą. Principinė fluorinimo reakcija pateikta schemoje 19. Protonizavimui buvo naudota druskos rūgštis, kurios į mišinį įlašintas ekvimoliarinis kiekis suteikė tirpalui rūgštines savybes. Maţos išeigos prieţastis buvo aukšta pH reikšmė, tirpalo temperatūra ir lėtas natrio nitrito lašinimas į tirpalą. Todėl kaip tirpiklis buvo panaudota tetrafluoborato rūgštis, taip buvo pasiekta pakankamai ţema pH reikšmė ir tirpalo aplinkoje padidėjo BF4- jonų kiekis. Tirpalas atšaldytas

iki -8oC. Tuomet į reakcijos mišinį pilamas natrio nitrito tirpalas. Ţema reakcijos temperatūra įtakojo išeigos padidėjimą. Prieš vykdant diazonio florborato druskos skaldymą ji turi būti maksimaliai išdţiovinta.

Gauta diazonio florborato druska buvo skaldoma panaudojant termolizę ir termolizę aukštos virimo temperatūros tirpiklyje (ksilene). Vykdant termolizę, susidariusi diazonio fluorborato druska pašildţius skyla išspinduliuodama šilumą ir toliau vyksta autotermolizė. Gautas reakcijos mišinys buvo gryninamas skirtingais metodais. Dalis reakcijos mišinio ekstrahuojama klasikiniu būdu panaudojant etilacetatą. Jis vėliau nugarinamas panaudojant rotorinį vakuuminį garintuvą, o susidarę nuosėdos reksristalizuojamos iš etanolio. Dalis – distiliuojama ir po distiliacijos rekristalizuojama iš etanolio. Ir

maţa dalis reakcijos mišinio naudota analizei. Vykdant termolizę susidaro daug neaiškių priemaišų. Be to, reakcija vyksta labai audringai ir ją sunku kontroliuoti. Todėl pasirinktas švelnesnis termolizės metodas – termolizė ksilene. Diazonio fluorborato druska suberiama į apvaliadugnę kolbą, įpilamas ksilenas, prie kolbos prijungiamas grįţtamasis šaldytuvas ir mišinys kaitinamas iki virimo. Ksilenas pasirinktas dėl aukštos virimo temperatūros. Šis skaldymo metodas vyksta ne taip audringai ir gaunami švaresni produktai kurie tirpale matomi nuosėdų pavidalu. Įvykus termolizei, nuosėdos filtruojamos ir praplaunamos etanoliu ir eteriu, tam, kad būtų pašalinti ksileno likučiai ir junginys greičiau išdţiūtų.

S N N R NH₂ S N N R NH3 + BF₄ -HBF₄ S N N R N + N NaNO₂ HBF₄ BF4 -S N N R F °C -N2 -BF₃

Pav. 27 Principinė Balz-Shieman reakcijos schema

Atlikus reakcijos (paveikslas 28) mišinio ESC-MS analizę, pastebėtos kelios chromatografinės smailės (paveikslas 29). Neaiškios kilmės priemaišos nustatytos 1,47 ir 8,58 laiku. Pradinis junginys iš kolonėlės išsiplovė . Antroje padėtyje pakaito netekęs 5-R-1,3,4 tiadiazolas nustatytas praėjus beveik šešioms minutėms. Didelis kiekis 5-R-1,3,4-tiadiazol-2-il-diazen-1-olio nustatomas po 7,79 minutės. Sąlyginai nedidelis kiekis triazeno-bis-1,3,4-tiadiazolo darinio išsiplauna šešioliktąją analizės minutę. Ruošiant mėginį yra naudojamas vanduo, kuriame didţioji dalis šios priemaišos yra netirpi ir lieka ant filtro membranos.

Pav. 28. Diazonio druskos sudarymo reakcijos stebėsenos chromatograma

Išanalizavus gautus duomenis identifikuota, kad reakcijos metu susidaro ne vienas produktas: 5-R-1,3,4-tiadiazolas, triazeno-bis-1,3,4-tiadiazolo darinys, 5-R-1,3,4-tiadiazol-2-il-diazen-1-olis (paveikslas 30). 5-R-1,3,4-tiadiazol-2-il-diazen-1-olis aptinkamas todėl, kad diazonio druska nėra stabili ir ruošiant mėginį pasikeičia šią druską supanti aplinka, todėl atskyla BF4- jonas, o jo vietą uţima OH

-jonas. Taip pat pastebėta, kad reakcija vyksta ne pilnai, nors diazotinimo regento yra panaudotas perteklius (7 ekv.). Gautus rezultatus galima paaiškinti dėl vykstančios radikalinės nukleofilinės pakaitų (SR) reakcijos. Šį teiginį taip pat patvirtina anksčiau publikuoti rezultatai [49].

N N S R NH₂ HBF₄ N N S R H N N S R N+ N BF₄ -N _N S R N N N N S R NH N N S R N+ N OH -NaNO₂ H₂O -H₂O

Pav. 29. Diazotinimo reakcijos produktai

Nors mums ir pavyko sudaryti diazonio druską sąlyginai aukšta išeiga – o vykdant jos skaldymą buvo matomi būdingi reakcijai poţymiai, tačiau mums nepavyko identifikuoti fluorą turinčių molekulių. FT–IR spektro duomenys gali būti identifikuojami klaidingai, nes susidariusios giminingos priemaišos iškreipia spektrą, o C-F būdinga smailė turi platų bangos ruoţą, kuriame gali būti aptinkama.

Dėl Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass QTOF masių spektrometre naudojamo elektropurkštuvinio (ESI) jonizatoriaus, fluoro atomą turintys AR junginiai yra nejonizuojami. Fluorintų junginių atveju yra gautos tik UV signalo chromatogramos. Dėl to būtinas tolimesnis diazonio druskų skaldymo stebėjimas ir tikslesnis galutinių junginių identifikavimo metodas, pavyzdţiui, 19F BMR spektroskopija.

9 Išvados

1. Susintetinti keturi 1,3,4-tiadiazolo dariniai, panaudojant skirtingas, Eva Akerblom ir Kurt Skagius, Rao ir Srinivasan, Pedro Ortega-Luoni, ir C. Ainsvort metodikas.

2. Atliktas reakcijų optimizavimas, reakcija vyko greičiau ir išeiga buvo didesnė kai oksidatorius yra bevandenis geleţies (III) chloridas, o ekstrahentas etilacetatas.

3. Junginių struktūros patvirtintos FT–IR ir MS spektrinės analizės metu, o priemaišų analizė ESC–MS metodu. Gautų junginių grynumas 80-96%.

4. Balz-shieman reakcija klasikiniu būdu su 1,3,4-tiadiazolais nevyksta. Modifikavus sąlygas, palaikant ţemą pH reikšmę, temperatūrą ir naudojant perteklių tetrafluorborato rūgšties, bei natrio nitrito, reakcija įvykdyta.

10 Praktikinės rekomendacijos

Šiame magistriniame darbe mums nepavyko identifikuoti fluorą turinčių molekulių, dėl to būtinas tolimesnis diazonio druskų skaldymo stebėjimas ir tikslesnis galutinių junginių identifikavimo metodas, pavyzdţiui, 19

F BMR spektroskopija.

Siekiant patikrinti gautų junginių metabolinį stabilumą in vitro reikėtų atlikti tolimesnius tyrimus. Taip pat gautus junginius būtų galima panaudoti kaip struktūrinius fragmentus tolimesnėje potencialių biologiškai aktyvių junginių sintezėje.

11 Literatūros sąrašas

1. Chichibabin, A. E.; Rjazancev JG. Fluor pyridine synthesis. Chem Abstr. 1916;10:1571–89. 2. Kenneth L. Kirk LAC. Photochemical Decomposition of Diazonium Fluoroborates. Application to

the Synthesis of Ring-Fluorinated Imidazoles. Communications. 1971;395:3060–1.

3. Building block approach - Synthesising fluorinated molecules without forming C-F bonds. Prieiga per internetą: http://www.manchesterorganics.com/article.php/24/fluorination-chemistry

4. Zuur, Alain F.; Ieno, Elena N.; Smith GM. Synthetic Methods in Drug Discovery. Vol. 2. Royal society of chemistry; 2007. 109 p.

5. Cresswell AJ, Davies SG, Roberts PM, Thomson JE. Beyond the Balz−Schiemann Reaction: The Utility of Tetrafluoroborates and Boron Trifluoride as Nucleophilic Fluoride Sources. Chem Rev. 2015;115:566–611.

6. Welch JT, Lim D. Pentafluorosulfanyl serotonin analogs: Synthesis, characterization, and biological activity. ACS Symp Ser. 2009;1003:165–81.

7. Schlosser M, Borel A, Patiny L. Site selective functionalization of fluorinated nitrogen heterocycles. ACS Symp Ser. 2009;1003:23–35.

8. Max Lustig, Carl L. Bumgardner, Frederic A. Johnson AJKR. Synthesis and Characterization of Fluorimidodisulfuryl Fluoride, (FS02)2NF, and Difluoramidosulf uryl Fluoride, FSO,NF,. Inorg Chem. 1964;3(8):8–11.

9. Shieh WC, Carlson JA, Shore ME. A novel kinetically-controlled peptide synthesis - Dramatic increase of chemical yield with retention of chiral integrity. Tetrahedron Lett. 1999;40(40):7167– 70.

10. A. A. Gakh, K. G. Nikishin NDK. Fluorine Nitrate (FONO2) As An Electrophilic Fluorinating Agent. Russ Chem Bull. 1992;2403–4.

11. Burgart Y V., Fokin AS, Kuzueva OG, Chupakhin ON, Saloutin VI. Synthesis of fluorinated 2(3)-arylhydrazones of their heterocyclization reactions. J Fluor Chem. 1998;92:101–108.

12. Ando W. Photochemistry of the diazonium and diazo groups. Diazonium and Diazo Groups (1978). 1978;341–487.

13. Wang J, Luis J, Pozo C, Sorochinsky AE, Fustero S, Soloshonok VA, et al. Fluorine in

Pharmaceutical Industry : Fluorine-Containing Drugs Introduced to the Market in the Last Decade ( 2001 − 2011 ). 2014;

14. Park BK, Kitteringham NR, Neill PMO. Metabolism Of Fluorine-Containing Drugs. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2001;41:443–70.

15. Müller K, Faeh C, Diederich F. Fluorine in pharmaceuticals: looking beyond intuition. Science. 2007;317(5846):1881–6.

16. Jeschke P. The unique role of fluorine in the design of active ingredients for modern crop protection. ChemBioChem. 2004;5(5):570–89.

17. Glossman-Mitnik D. A theoretical study on the aromaticity of thiadiazoles and related compounds. J Mol Struct. 2001;549(3):285–8.

18. Rodrigues RF, Castro-Pinto D, Echevarria A, Dos Reis CM, Del Cistia CN, Sant’Anna CMR, et al. Investigation of trypanothione reductase inhibitory activity by 1,3,4-thiadiazolium-2-aminide derivatives and molecular docking studies. Bioorganic Med Chem. 2012;20(5):1760–6. 19. Sah P, Bidawat P, Seth M, Gharu CP. Synthesis of formazans from Mannich base of

5-(4-chlorophenyl amino)-2-mercapto-1,3,4-thiadiazole as antimicrobial agents. Arab J Chem. 2014;7(2):181–7.

20. Gupta SK, Pancholi SS. Synthesis and evaluation of antitubercular activity of some thiobenzimidazolyl derivatives. Der Pharma Chem. 2011;3(1):274–9.

21. Sunil D, Isloor AM, Shetty P, Satyamoorthy K, Bharath Prasad AS. 6-[3-(4-Fluorophenyl)-1H-pyrazol-4-yl]-3-[(2-naphthyloxy)methyl][1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazole as a potent antioxidant and an anticancer agent induces growth inhibition followed by apoptosis in HepG2 cells. Arab J Chem. 2010;3(4):211–7.

22. Kadi AA, Al-Abdullah ES, Shehata IA, Habib EE, Ibrahim TM, El-Emam AA. Synthesis, antimicrobial and anti-inflammatory activities of novel 5-(1-adamantyl)-1,3,4-thiadiazole derivatives. Eur J Med Chem. 2010;45(11):5006–11.

23. Hafez HN, Hegab MI, Ahmed-Farag IS, El-Gazzar ABA. A facile regioselective synthesis of novel spiro-thioxanthene and spiro-xanthene-9`,2-[1,3,4]thiadiazole derivatives as potential analgesic and anti-inflammatory agents. Bioorganic Med Chem Lett. 2008;18(16):4538–43.

24. Jatav V, Mishra P, Kashaw S, Stables JP. Synthesis and CNS depressant activity of some novel 3-[5-substituted 1, 3, 4-thiadiazole-2-yl]-2-styryl quinazoline-4 (3H)-ones. Eur J Med Chem. 2008;43(1):135–41.

25. Clerici F, Pocar D, Guido M, Loche A, Perlini V, Brufani M. Synthesis of 2-amino-5-sulfanyl-1,3,4-thiadiazole derivatives and evaluation of their antidepressant and anxiolytic activity. J Med Chem. 2001;44(6):931–6.

26. Hasui T, Matsunaga N, Ora T, Ohyabu N, Nishigaki N, Imura Y, et al. Identification of benzoxazin-3-one derivatives as novel, potent, and selective nonsteroidal mineralocorticoid receptor antagonists. J Med Chem. 2011;54(24):8616–31.

27. Yang XH, Wen Q, Zhao TT, Sun J, Li X, Xing M, et al. Synthesis, biological evaluation, and molecular docking studies of cinnamic acyl 1,3,4-thiadiazole amide derivatives as novel antitubulin agents. Bioorganic Med Chem. 2012;20(3):1181–7.

28. Zoumpoulakis P, Camoutsis C, Pairas G, Soković M, Glamočlija J, Potamitis C, et al. Synthesis of novel sulfonamide-1,2,4-triazoles, 1,3,4-thiadiazoles and 1,3,4-oxadiazoles, as potential

antibacterial and antifungal agents. Biological evaluation and conformational analysis studies. Bioorganic Med Chem. 2012;20(4):1569–83.

29. Pérez-Balado C, Willemsens A, Ormerod D, Aelterman W, Mertens N. Development of a concise scaleable synthesis of 2-chloro-5-(pyridin-2-yl) pyrimidine via a Negishi cross-coupling. Org Process Res Dev. 2007;11(2):237–40.

30. Kuo HM, Li SY, Sheu HS, Lai CK. Symmetrical mesogenic 2,5-bis(6-naphthalen-2-yl)-1,3,4-thiadiazoles. Tetrahedron. 2012;68(36):7331–7.

31. Polshettiwar V, Varma RS. Greener and rapid access to bio-active heterocycles: one-pot solvent-free synthesis of 1,3,4-oxadiazoles and 1,3,4-thiadiazoles. Tetrahedron Lett. 2008;49(5):879–83. 32. Kiryanov AA, Sampson P, Seed AJ. Synthesis of 2-alkoxy-substituted thiophenes, 1,3-thiazoles,

and related S-heterocycles via Lawesson’s reagent-mediated cyclization under microwave irradiation: Applications for liquid crystal synthesis. J Org Chem. 2001;66(23):7925–9.

33. Jatav V, Kashaw S, Mishra P. Synthesis, antibacterial and antifungal activity of some novel 3-[5-(4-substituted phenyl) 1,3,4-thiadiazole-2-yl]-2-styryl quinazoline-4(3H)-ones. Med Chem Res. 2008;17(2–7):169–81.

34. Kumar H, Javed SA, Khan SA, Amir M. 1,3,4-Oxadiazole/thiadiazole and 1,2,4-triazole derivatives of biphenyl-4-yloxy acetic acid: Synthesis and preliminary evaluation of biological properties. Eur J Med Chem. 2008;43(12):2688–98.

35. Yusuf M, Khan RA, Ahmed B. Syntheses and anti-depressant activity of 5-amino-1, 3,

4-thiadiazole-2-thiol imines and thiobenzyl derivatives. Bioorganic Med Chem. 2008;16(17):8029– 34.

36. Sayed AR. Synthesis of novel thiadiazoles and bis-thiadiazoles from carbonothioic dihydrazide. Tetrahedron Lett. 2010;51(34):4490–3.