LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA
ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Dalia Vertelytė
HEMOLIZINIŲ ANEMIJŲ LABORATORINIS VERTINIMAS
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas
doc. dr. Daiva Urbonienė
TURINYS
SANTRAUKA... 3
SUMMARY... 5
INTERESŲ KONFLIKTAS ... 7
BIOETIKOS CENTRO LEIDIMAS ... 7
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1 Hemolizinės anemijos, klasifikacija, priežastys ir aktualumas ... 12
1.2 Paroksizminės naktinės hemoglobinurijos paplitimas ir aktualumas ... 13
1.3 Etiologija ir patogenezė PNH ... 15
1.3.1 Genetika ... 15
1.3.2 Inkaro struktūra... 16
1.3.3 GPI inkariniai baltymai ... 17
1.3.4 Inkarinių baltymų pasiskirstymas ląstelių populiacijose. ... 18
1.3.5 Komplemento aktyvacija ir ląstelių lizė PNH metu ... 19
1.4 Klinikinė išraiška PNH ... 21
1.4.1 PNH klasifikacija ... 21
1.4.2. Pažeidimai pagal sistemas ... 21
1.5 Diagnostika ... 24
1.5.1 Bendrieji įprastiniai laboratoriniai tyrimai ... 24
1.5.2 Tėkmės citometrija ... 25
1.6 Ligos eigos ir gydymo monitoravimas ... 26
2. TYRIMO METODIKA ... 27
2.1 Tyrimo eiga ir tiriamųjų kontingentas ... 27
2.2 Tyrimų metodai ... 27
2.2.2 Bendro kraujo vaizdo tyrimas automatizuotu būdu ... 28
2.2.3 Tiesioginis antiglobulino testas ir biocheminiai tyrimai ... 28
2.2.4 Tėkmės citometrija ... 29
2.2.4.1 Tyrimo įrenginiai ir kiti prietaisai ... 29
2.2.4.2 Reagentai ... 30
2.2.4.3 PNH klono nustatymo darbo eiga ... 31
2.2.4.4 Ląstelių surinkimas ir analizė ... 32
2.2.4.5 Rezultatų įvertinimas ... 32
2.2.5 Statistinė duomenų analizė ... 34
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 35
IŠVADOS ... 48
SANTRAUKA
Magistro darbo autorius. Dalia Vertelytė
Magistro darbo pavadinimas. Hemolizinių anemijų laboratorinis vertinimas
Darbo tikslas: Įvertinti laboratorinių tyrimų pokyčius hemolizinių anemijų metu ir susieti juos su hemolizinės anemijos tipu.
Tyrimo uždaviniai: Atlikti ir įvertinti bendro kraujo tyrimo rodiklių, laktatdehidrogenazės, haptoglobino ir tiesioginio antiglobulino testo tyrimų rezultatus asmenims su hemolizinėmis būklėmis; Palyginti asmenų su hemolizinėmis būklėmis grupes, atsižvelgiant į laktatdehidrogenazės aktyvumo ir jo viršutinės referentinės ribos santykį; Įvertinti laboratorinių rodiklių skirtumus pacientams su hemolizinėmis anemijomis, atsižvelgiant į paroksizminės naktinės hemoglobinurijos ląstelių klono buvimą.
Tyrimo objektas ir metodai. Tyrimui atrinkti pacientai su hemopoezės sutrikimu. Iš jų atrinkti pacientai, kuriems buvo atlikti haptoglobino (HAPTO) ir laktatdehidrogenazės (LDH) tyrimai, o iš jų tyrime palikta 80 pacientų, kurių HAPTO koncentracija buvo maža. Į antrą tyrimo dalį įtraukti 26 pacientai, kuriems buvo atlikti tėkmės citometrijos tyrimai dėl PNH klono paieškos. Bendras kraujo vaizdas buvo tirtas analizatoriumi XE-5000 (Sysmex, Japonija), biocheminiai tyrimai atlikti naudojant automatinę sistemą – SYNCHRON UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, JAV), o
tiesioginis antiglobulino testas (DAT) buvo atliekamas taikant hemagliutinacijos stulpelyje metodą (Biorad, JAV). PNH klono nustatymui buvo atliktas eritrocitų ir leukocitų imunofenotipavimas, naudojant tėkmės citometrą BD FacsCanto (BD Immunocytometry Systems, JAV).
Rezultatai. Tiriant sergančiuosius su hemolizinėmis būklėmis DAT teigiamų ir neigiamų rezultatų dažnis tarp lyčių nesiskyrė. Nustatytos statistiškai reikšmingai mažesnės RBC, HGB, HCT ir didesnės TBIL koncentracijos pacientų pogrupyje su LDH/URL1,5. Spearman‘o koreliacinė analizė parodė statistiškai reikšmingą atvirkštinį ryšį tarp LDH ir HAPTO – didėjant LDH, mažėja HAPTO koncentracija (R=-0,239; p=0,033). Anemiją charakterizuojančių rodiklių – HGB ir RBC atvirkštinis ryšys su LDH rodikliu taip pat statistiškai reikšmingas. PNH-jai būdingo rodiklių derinio – DAT neigiamo rezultato ir padidėjusio LDH aktyvumo dažnis tarp vyrų ir moterų statistiškai reikšmingai nesiskyrė. Nustatyta, kad sergančiųjų su PNH klonu grupėje LDH/URL buvo didesnis net 12 kartų, o HAPTO, RBC ir HGB buvo statistiškai reikšmingai mažesni, nei pacientams be PNH klono. Išvados. Pacientams su hemolizėmis būklėmis nustatytas eritrocitų, hemoglobino kiekių sumažėjimas bei laktatdehidrogenazės aktyvumo padidėjimas. Skirtumų tarp lyčių nenustatyta. Asmenims, kurių laktatdehidrogenazės aktyvumo ir jo viršutinės referentinės ribos santykis buvo didesnis nei 1,5, nustatyti statistiškai reikšmingai sumažėję eritrocitų, hemoglobino, haptoglobino bei
padidėję bendro bilirubino (padidėjusio netiesioginio bilirubino sąskaita) kiekiai. Laktatdehidrogenazės aktyvumas tiesiogiai siejosi su anemijos išreikštumu. Šie radiniai nurodo išreikštą hemolizės aktyvumą, kuris nepriklausė nuo lyties. Hemolize sergantiems pacientams, turintiems paroksizminės naktinės hemoglobinurijos ląstelių kloną, hemolizę ir anemiją atspindintys laboratoriniai rodikliai buvo pakitę labiau, nei pacientams, neturintiems paroksizminės naktinės hemoglobinurijos ląstelių klono. Uždegimui būdingų neutrofilų, nei neutrofilų/limfocitų rodiklių pokyčių ir skirtumų tarp tiriamųjų grupių neaptikta.
SUMMARY
Author of a master‘s thesis. Dalia Vertelytė
The title of the master‘s thesis. Laboratory evaluation of hemolytic anemia.
The aim: To evaluate changes of laboratory tests during hemolytic anemia and relate them with of type of hemolytic anemia.
Objectives: To evaluate hematology test results, lactate dehydrogenase (LDH) activity, haptoglobin (HAPTO) concentration and direct antiglobulin test (DAT) in patients with hemolytic status; To compare groups of patients according to levels of LDH activity to LDH upper reference limit ratio LDH/URL; To evuluate the changes of laboratory parameters in patients with hemolytic anemia according to presence of clone of paroxysmal norturnal hemoglobinuria (PNH).
Patients and methods. Patients with disorders of hemopoiesis were included in the study, then patients tested for HAPTO and LDH were chosen, and additional selection was done – 80 patients with HAPTO concentration lower than 360 mg/l were left for the final analysis. 26 patients were included in flow cytometry analysis. Hematology tests were done using automated hematologic s XE–5000 (Sysmex, Japan). The biochemistry tests were run using clinical system – SYNCHRON UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, USA) and DAT were tested by column hemagglutination technique (Biorad, USA). The immunophenotyping of RBC and WBC was carried out for identification of PNH clone using flow cytometre BD FacsCanto (BD Immunocytometry Systems, USA).
Results. The prevalence of negative DAT results didn‘t differ between male and female patients with hemolytic anemias. RBC, HGB, HCT values were significantly lower and TBIL – significantly higher in patients with LDH/URL1.5. Spearman‘s correlative test revealed reverse significant correlation between LDH and HAPTO (R=-0,239; p=0,033). The anemia markers –RBC and HGB significantly negatively correlated with the LDH. Frequency of markers characteristic to PNH (combination of DAT negative results and increased LDH) didn‘t differ between male and female patients. Patients having PNH clone had 12-fold increased of LDH/URL and lower HAPTO, RBC, HGB compared to patients without PNH clone.
Conclusions. Patients with hemolytic statuses had decreased erythrocyte and hemoglobin values and increased lactate dehydrogenase activity. There were no differences in laboratory values between men and women. Patients with LDH/URL1.5 had significantly reduced erythrocyte, hemoglobin, haptoglobin and increased total bilirubin (due to increase of indirect bilirubin). LDH activity was directly related to anemia expression. These findings didn‘t depend on gender. Changes of markers indicating anemia and hemolysis were more pronounced in patients with hemolysis and PNH clone.
There were no changes and differences of inflammatory markers – neutrophils, as well neutrophil to lymphocyte ratio – between investigated groups.
INTERESŲ KONFLIKTAS
Autorė deklaruoja, jog atliekant šį darbą, interesų konflikto nebuvo.BIOETIKOS CENTRO LEIDIMAS
Tyrimui atlikti ir archyviniams duomenims naudoti gautas LSMU Bioetikos centro pritarimas 2018-01-24 Nr. BEC-LMB(M)-198.
SANTRUMPOS
AA − aplastinė anemija
AIHA − (angl. autoimmune hemolytic anemia) – autoimuninė hemolitinė anemija BCS − (angl. Budd-chiari syndrome) – budd-Chiari sindromas
C3c − komplemento komponento komponentas C5 − komplemento komponentas
CD − (angl. cluster of differentiation) – deferenciacijos grupė
CD34+ − (angl hematopoietic precursor cells) – hematopoetinių pirmtakų ląstelės CD55/
DAF
− (angl. decay-accelerating factor) – skilimą pagreitinantis faktorius CD59/
MIRL
− (angl. membrane inhibitor of reactive lysis) – reaktyviosios lizės membranos inhibitorius
CO2 anglies dioksidas
DAT − (angl. direct antiglobulin test) – tiesioginis antiglobulino tyrimas DBIL − (angl. direct bilirubin) – tiesioginis bilirubinas
EBV − Epstein-Barro virusas
FLAER − (angl. fluorescein-labeled proaerolysin) – fluorescinu žymėtas proaerolizinas FSC − (angl. forvard scatter) – priekinė šviesos sklaida
g − (angl. relative centrifuge force expressed in units of gracity) – išcentrinė jėga Glu − (angl. glucosamine) – gliukozaminas
GPI − (angl. glycosylphosphatidylinositol) – glikozilfosfadilinozitolis
GPI-AP − (angl. glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins) – glikozilfosfadilinozitolio inkariniai baltymai
HAPTO − Haptoglobinas
HCT Hematokritas
HGB − Hemoglobinas
HSC − (angl. hematopoietic stem cell) – hematopoetinės kamieninės ląstelės JAV − Jungtinės Amerikos Valstijos
JK − Jungtinė Karalystė
K3EDTA − (angl. ethylene diamine tetra acetic tribasic potassium salt) – tribazis kalio etilen diamin tetra acetatas
LMK − Laboratorinės medicines klinika LDH − Laktatdehidrogenazė
LDH/URL − (angl. lactate dehydrogenase/ upper reference limit) – laktatdehidrogenazės aktyvumo santykis su laktatdehidrogenazės aktyvumo viršutine referentine riba
LSMU − Lietuvos sveikatos mokslų universitetas LSMU
ligoninė KK
− Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė Kauno klinikos
LY − (angl. lymphocyte) – limfocitai
MAC − (angl. membrane attack 2mplex) – membranos atakos kompleksas MDS − mielodisplazinis sindromas
MFI − (angl. Mean fluorescence intensity) – fluorescencijos intensyvumo vidurkis NEU − neutrofilai
NEU/LY − neutrofilų ir limfocitų santykis NK − (angl. natural killer) – NK ląstelės NO − (angl.nitric oxide) – azoto monoksidas ºC − celsijaus laipsnis
PBS − (angl. phosphate buffer solution.) – fosfatinio buferio tirpalas PBS (angl. phosphate-buffered saline) – fosfatinio buferio tirpalas
PIGA − (angl. phosphatidylinositol N-acetylglucosaminyltransferase subunit A) – fosfatidilinozitolio N-acetilglukozaminiltransferazės A subvienetas PMN − (angl. polymorphonuclear leukocytes) - polimorfonukleariniai leukocitai PNH − (angl. paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) – paroksizminė naktinė
hemoglobinurija
PNH-sc − (angl. subclinical paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) – subklinikinė Paroksizminė naktinė hemoglobinurija
proc. − procentas RBC − eritrocitai
RNR − ribonukleino rūgštis
SSC − (angl. side scatter) – šoninė šviesos sklaida TBIL − (angl. total bilirubin) – bendras bilirubinas
URL − (angl. upper reference limit) – viršutinė referentinė riba WBC − leukocitai
ĮVADAS
Hemolizinė anemija yra būklė, kai raudonosios kraujo ląstelės (eritrocitai) yra sunaikinamos ir pašalinamos iš kraujo plazmos. Eritrocitai perneša deguonį po visą organizmą ir iš jo pašalina anglies dioksidą (CO2). Šios ląstelės yra gaminamos kaulų čiulpuose ir jų gyvavimo trukmė kraujyje siekia apie šimtą dvidešimt dienų (normos atveju). Kai eritrocitai žūsta, kaulų čiulpai stengiasi žuvusias ląsteles pakeisti naujomis, dėl to intensyviai jas gamina. Tačiau esant hemolizinei anemijai, kaulų čiulpai nebegali kompensuoti žuvusių eritrocitų, dėl to gali pasireikšti anemija, o esant anemijai kraujas nebegali pernešti pakankamai deguonies į visus audinius ir organus, dėl to gali atsirasti audinių hipoksija (1).
Bendras hemolizinės anemijos paplitimo mąstas nėra aiškiai žinomas, nes jas gali sukelti skirtingos priežastys – tokios kaip: Micoplasma pneumonia, stafilokokai, streptokokai, parazitinės infekcijos, autoimuninės ligos, pvz., raudonoji vilkligė ir kt., limfoma, reumatoidinis artritas, paroksizminė naktinė hematurija ir kt. Detalesnė informacija apie hemolizinių ligų paplitimą pateikiama tik pagal atskirus tipus. Pvz., nurodoma, kad autoimuninių hemolizinių anemijų (AIHA) naujų atvejų skaičius siekia nuo 1 iki 3 atvejų 100 000 gyventojų per metus (2–6). Hemolizinės anemijos yra grėsmingos – dėl jų sutrinka širdies ir plaučių funkcijos, išsivysto insktų funkcijos pažeidimas, trombozės ir kt., todėl sutrinka sergančiųjų sveikata, kyla pavojus jų gyvybei. Nežiūrint į tai, kad tikslių statistinių bendro hemolizinių anemijų paplitimo duomenų nėra, galima numanyti, kad hemolizinių anemijų aktualumas visuomenei pakankamai didelis. Svarbu tai, kad hemolizinių būklių priežasčių yra daug, todėl tikslus (detalus) etiologijos išaiškinimas leidžia ne tik diagnozuoti ir diferencijuoti hemolizinių anemijų formas, bet ir kryptingai parinkti gydymo priemones (7).
Įvairūs laboratoriniai rodikliai (hemoglobinas, laktatdehidrogenazė, hematokritas, haptoglobinas, tiesioginis antiglobulino tyrimas (DAT) ir kiti tyrimai yra naudojami siekiant diagnozuoti hemolizines anemijas ir atskirti jas vieną nuo kitos, tačiau išlieka problema, nes klinikiniai požymiai yra panašūs, o laboratorinių rodiklių informatyvumas ribotas, todėl kasdieninėje praktikoje atskirti hemolizines anemijas vieną nuo kitos yra sudėtinga (1)(6). Šiuo darbu buvo siekta išanalizuoti šiandien prieinamus laboratorinius rodiklius, kaip priemones hemolizinėms anemijoms diferencijuoti ir diagnozuoti.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – Įvertinti laboratorinių tyrimų pokyčius hemolizinių anemijų metu ir susieti juos su hemolizinės anemijos tipu.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti ir įvertinti bendro kraujo tyrimo rodiklių, laktatdehidrogenazės, haptoglobino ir tiesioginio antiglobulino testo tyrimų rezultatus asmenims su hemolizinėmis būklėmis. 2. Palyginti asmenų su hemolizinėmis būklėmis grupes, atsižvelgiant į laktatdehidrogenazės
aktyvumo ir jo viršutinės referentinės ribos santykį.
3. Įvertinti laboratorinių rodiklių skirtumus pacientams su hemolizinėmis anemijomis, atsižvelgiant į paroksizminės naktinės hemoglobinurijos ląstelių klono buvimą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Hemolizinės anemijos, klasifikacija, priežastys ir aktualumas
Hemolizinė anemija (mažakraujystės rūšis), kurios metu eritrocitai žūsta greičiau organizme, negu jie yra pagaminami. Kai raudonųjų kraujo ląstelių gyvavimo trukmė sutrumpėja nuo šimto dvidešimt dienų iki kelių savaičių, ši būklė vadinama – hemolize. Kuomet eritrocitai taip greitai žūsta, kaulų čiulpai nebespėja pagaminti naujų eritrocitų, dėl to išsivysto anemija. Eritrocitai gali žūti intravaskuliariai arba ekstravaskuliariai (1). Anemijos sunkumas priklauso nuo to, ar hemolizė prasidėjo palaipsniui ar staiga, ir nuo eritrocitų sunaikinimo laipsnio. Lengvos anemijos dažniausiai yra besimptomės, o sunkios gali būti pavojingos gyvybei ir sukelti krūtinės anginą, bei širdies ir plaučių funkcijos sutrikimą (8).
Intravaskulinės hemolizės metu eritrocitai sunaikinami ląstelės viduje ir atsiranda tada, kai pagaminti eritrocitai yra neaktyvūs. Ši hemolizė dažniausiai atsiranda dėl įgimtų ligų (pjautuvinės anemijos, talasemijos). Ekstravaskulinės hemolizės metu eritrocitai sunaikinami už ląstelės ribų ir viskas vyksta blužnyje. Ši hemolizė būdinga įvairiems navikams, kai kurioms infekcinėms ligoms, leukemijai, limfomoms, autoimuniniams susirgimams. Hemolizinė anemija gali pasireikšti tiek moterims tiek ir vyrams, bet kuriame amžiuje. Dažniausios hemolizinių anemijų priežastys yra šios: hepatitai, pjautuvinė anemija, streptokokinė infekcija, leukemija, limfoma, įvairūs navikai, penicilino vartojimas, įvairių nuskausminamųjų vartojimas, e.coli infekcija, epstein-barro virusas (EBV), reumatoidinis artritas, raudonoji vilkligė (5,6).
Hemolizines anemijas gali sukelti įvairios priežastys, tačiau kartais anemijos priežastys ne visada yra išaiškinamos, dėl to siekiant geriau sužinoti apie hemolizines anemijas ir jų etiologija jos yra klasifikuojamos į atskiras grupes. Remiantis Barcellini W ir kt., Sudulagunta SR ir kt., Go R ir kt. (1,5,6), pateikiama hemolizinių anemijų klasifikacija:
1. Įgimtos:
– Eritrocitų membranos defektų anemija, – Fermentų defektų anemija,
– Hemoglobino sintezės defektų anemija. 2. Įgytos:
– Imuninė hemolizinė anemja
– Autoimuninė hemolizinė anemija: – Šalčio antikūnų hemolizinė anemija, – Šilumos antikūnų hemolizinė anemija.
– Aloimuninė hemolizinė anemija:
– Netapataus kraujo grupės transfuzijos sukelta hemolizinė anemija, – Naujagimio hemolizinė anemija,
– Vaistų sukelta imuninė hemolizinė anemija. – Neimuninė hemolizinė anemija:
– Toksinės medžiagos, – Mechaninė trauma, – Vaistai,
– Mikroangiopatinės hemolizinės anemijos, – Paroksizminė naktinė hemoglobinurija, – Infekcinės ligos
Viena sudėtingesnių, rečiau prisimenamų ir diagnozuojamų hemolizinių ligų yra paroksizminė naktinė hemoglobinurija (PNH) ir kitos būklės, susijusios su hemolize ir PNH klono buvimu.
1.2 Paroksizminės naktinės hemoglobinurijos paplitimas ir aktualumas
Paroksizminė naktinė hemoglobinurija (PNH) yra kloninis, hematopoetinių kamieninių ląstelių sutrikimas, tačiau išsamių duomenų apie šios ligos paplitimą nėra ir dažniausiai ši liga yra įvardijama, kaip labai reta (9). Tačiau nežiūrint to, kad liga reta, bendras sergančiųjų skaičius pasaulyje per metus siekia nuo 1 iki 5 milijonų žmonių, o remiantis tyrimais visoje Šiaurės Amerikoje ir Europoje sergančių skaičius svyruoja nuo 10 000 iki 21 000 žmonių (10). Iš atliktų tyrimų galima matyti, kad paroksizminės naktinės hemoglobinurijos sergamumo dažnis skiriasi lyginant šalis: skirtingas tarp šalių pvz., JAV ir Europoje kiekvienais metais šiuose regionuose nustatoma apie 1 700 naujų sergamumo dažnių. Jungtinėje Karalystėje sergamumo dažnis yra 1 iš 77 0000 per metus, o Prancūzijoje 1 iš 80 000. Tikėtina, kad ne visi atvejai atpažįstami ir diagnozuojami, nes šios ligos simptomai yra nespecifiniai, diagnostika sudėtinga, todėl tikroji statistika gali būti ir dar didesnė (11,12).
Paroksizminė naktinė hemoglobinurija turi tris išskirtines klinikines savybes, kurios gali labai kisti ligos eigoje. Pirma: intravaskulinė hemolizė, dėl kurios atsiranda daug klinikinių ligos požymių: disfagija, mieguistumas, lėtinis inkstų nepakankamumas, plaučių hipertenzija, anemija ir hemoglobinurija. Antra: būdinga tromboembolija, kuri gali kelti pavojų gyvybei ir atsiranda ne tik ekstremaliose, bet ir neįprastose anatominėse vietose, tokiose kaip kepenų vartų ir blužnies venose. Trečia: kaulų čiulpų nepakankamumas, kuris priklausomai nuo ligos stadijos atsiranda pas visus
pacientus. PNH gali sukelti ankstyvą mirtingumą, nepaisant to, kad pacientams yra taikomas palaikomasis gydymas. Negydant paroksizminės naktinės hemoglobinurijos gali išsivysti komplikacijos, kaip ūminė mielogeninė leukemija, aplastinė anemija, mielodisplazija, geležies trūkumo anemija ir mirtis (13–15). Hillmen P. su bendraautoriais atlikto tyrimo metu nustatyta, kad JK mirė 35 proc. pacientų per penkis metus nuo ligos diagnozavimo, nepaisant to, kad buvo tinkamai gydoma (1 pav.) (16). Trombozė yra pagrindinė mirties priežastis pacientams sergantiems šia reta liga ir sudaro apie 40–67 proc. mirtingumo. Lėtinė inkstų liga pasireiškia daugumai šia liga sergančių pacientų tai sudaro apie 64 proc. ir dėl inkstų nepakankamumo miršta nuo 8 proc. iki 18 proc. pacientų. Remiantis kitais tyrimasi JAV dėl trombozių mirštamumas sudaro 42,1 proc., o Japonijoje siekia iki 7,9 proc. (16).
1 pav. Pacientų išgyvenamumas taikant palaikomąjį gydymą Jungtinėje Karalystėje (16)
Sergant PNH pacientus varginadiskomfortas, dėl pasireiškusių įvairių simptomų, kaip sunki anemija, pilvo ir galvos skausmai, dusulys, taip pat pacientai jaučią didelį nerimą dėl trombozės pavojaus (17). Pacientui sergant šia liga suprastėja gyvenimo kokybė, jis tampa nedarbingas, dėl to atsiranda finansinės problemos, o palaikomasis bendrasis gydymas ir medicininė priežiūra reikalinga visą gyvenimą. Šiuo metu daugiausiai vilčių teikiantis gydymas yra gydymas ekulizumabu. Šis vaistas veiksmingas, nes sumažina intravaskulinę hemolizę, tačiau jis nesustabdo ekstravaskulinės hemolizės ir neišgydo kaulų čiulpų funkcijos sutrikimo. Taigi ekulizumabas veiksmingas pacientams, turintiems klasikinį PNH. Gydymas šiuo vaistu mažina arba pašalina kraujo perpylimų poreikį, pagerina gyvenimo kokybę ir sumažina trombozės riziką. Tačiau šis vaistas turi būti naudojamas visa laiką, nes jis neišgydo pagrindinės ligos, o tik sumažina ligos simptomatiką. Vis dėl to didžiausią
ekulizumabo naudojimo kliūtis yra kaina, JAV gydymas gali siekti iki 400 000 dolerių, o JK maždaug 250 000 dolerių per metus. Tačiau ir tai neturi įtakos kitoms pagrindinėms formoms gydyti, kaip intravaskulinės hemolizės ar trombozės, o tai reiškia, kad reikės neapibrėžto gydymo ir tai dar labiau padidina išlaidas (16,18,19)
1.3 Etiologija ir patogenezė PNH
1.3.1 Genetika
Nurodoma, kad paroksizminę naktinę hemoglobnuriją sukelia mutacijos PIGA (fosfatidilinozitolio N-acetilglukozaminiltransferazės A subvienetas) gene. Jis susideda iš šešių egzonų ir jo citogenetinė vieta yra: Xp22.2, X chromosomos trumpojo (p) peties 22.2 padėtyje, (2pav.) (20,21).
2 pav. PIGA geno schematinis vaizdas (pagal 11).
PIGA genas pateikia instrukcijas, kaip gaminti baltymą, vadinama fosfatidilinozitolio glikano A klase. Konkrečiai, fosfatidilinozitolio glikano A klasė dalyvauja pirmoje sekos pakopoje, kuri gamina tarpinę molekulę, vadinamą GPI inkaru. Šis žingsnis vyksta ląstelės endoplazminiame retikulume, struktūrose, kurios susijusios su baltymų apdorojimu ir transportavimu. GPI inkaras yra galutinis sekos produktas, kuris prijungia daug skirtingų baltymų ląstelės membranoje kartu užtikrinant, kad šie baltymai būtų laisvi, kai reikia ląstelės paviršiuje (22).
Per žmogaus gyvenimą, kai kurios mutacijos yra įgytos ir yra tam tikrose ląstelėse. Šie pokyčiai, kurie vadinami somatinėmis mutacijomis, nėra paveldimi. Pacientams, sergantiems PNH, PIGA geno somatinės mutacijos atsiranda kraujodaros ląstelėse, kurios dažniausiai randamos kaulų čiulpuose. Šios ląstelės dar vadinamos hematopoetinėmis kamieninėmis ląstelėmis (HSC) (3 pav.) Šios mutacijos sukelia pakitusių „nenormalių“ kraujo ląstelių gamybą. Kadangi kamieninės ląstelės
dauginasi ir jų susidaro vis daugiau, nenormalių kraujo ląstelių kartu su normaliomis kraujo ląstelėmis, kurias gamina normalios HSC. Imuninės sistemos komponentas – komplementas – sukelia priešlaikinį sveikų, t.y. nepakitusių eritrocitų sunaikinimą PNH metu (21).
3 pav. Kraujo ląstelių vystymasis kaulų čiulpuose (pagal 51)
1.3.2 Inkaro struktūra
GPI inkaras jungia baltymus prie išorinės ląstelės paviršiaus ir jis sudarytas iš: fosfatidilinozitolio (riebalų rūgščių, fosfatų ir inozitolių) molekulės, prie kurios pridedama N gliukozamino (Glu) molekulė. Prie to prisiriša trys manozės molekulės ir fospoetanolamino molekulė, prie kurio prisiriša baltymas. PNH ląstelėse N gliukozaminas negali būti pridedamas, todėl sintezė yra nutraukiama – nebejungiamos manozės molekulės ir fospoetanolamino molekulė, prie kurio rišasi baltymai (4 pav.) (23,24).
4 pav. Schematinė Glikozilfosfatidilinozitolio inkaro, būdingo nepakitusioms ląstelėms (kairėje pusėje) ir PNH ląstelėms būdingo inkaro pokyčio struktūra (dešinėje pusėje) (pagal 52)
1.3.3 GPI inkariniai baltymai
Dauguma ląstelės baltymų turi transmembraninį regioną, kuriame randasi lipidinis dvisluoksnis. Išoriniai membraniniai baltymai prie ląstelės membranos yra sukabinti GPI glikolipidiniais fragmentais (5 pav.). Hematopoetinės ląstelės turi daugiau nei dešimt skirtingų, svarbių glikozilfosfadilinozitolio inkarinių baltymų (GPI-AP), kuriems taip pat priklauso kraujo grupių antigenai, adhezinės molekulės, komplemento reguliaciniai baltymai, hormonai ir receptoriai. GPI-AP dalyvauja membraninių baltymų transportavime, ląstelių sukibime, ląstelių sienelės sintezėje ir ląstelių paviršiaus apsaugoje. Šie baltymai sukelia klinikinius simptomus sergant PNH, nes izoliuoja DAF (CD55) iš eritrocitų membranos, kuris slopina komplemento kelio C3 konvetazę. Tai pat nustatyta, kad DAF trūksta PNH pacientų kraujo ląstelėse ir šis trūkumas paaiškina PNH eritrocitų silpnumą prieš komplemento ataką. GPI-AP yra ląstelinės sienelės komponentai ir yra būtini ląstelių vientisumui (25,26). Jei yra šių inkarinių baltymų nepakankamumas, prasideda intravaskulinė hemolizė, nes komplemento reguliaciniai baltymai (CD55 ir CD59) negali dalyvauti komplemento susidaryme (27–29).
5 pav. Transmembraninių ir GPI inkarinių baltymų schematinis vaizdas (pagal 26)
1.3.4 Inkarinių baltymų pasiskirstymas ląstelių populiacijose.
Somatinės PIGA mutacijos gali įvykti vienoje ar keliose HSC. Šis sutrikimas atsiranda dėl neįprastų HSC mutacijų ir dalyvauja visos hematopoetinės kilmės ląstelės: mieloidinės, eritroidinės ir limfoidinės. Inkarinių baltymų trūkumas, kaip pavaizduota 6 paveiksle, gali būti ne tik eritocituose, bet ir monocituose, NK, PMN, B ir T ląstelėse. Tai pat gali būti aptinkamas ir kitų inkarinių baltymų trūkumas, tokių, kaip CD14, CD24 ar CD16 (30).
1.3.5 Komplemento aktyvacija ir ląstelių lizė PNH metu
Komplemento sistema – tai gynybinė sistema, kuri apsaugo intravaskulinę erdvę, tai yra naikina svetimus įsibrovėlius, tokius, kaip virusai ir bakterijos. Ši sistema susideda iš plazmos baltymų, kurie sąveikauja per tris pagrindinius kelius: klasikinį, alternatyvų ir lektino, (7 pav.). Komplemento sistema apima skirtingas kaskadas su atskiromis funkcijomis, kurias visas suvienija į bendrą galutinį efekto mechanizmą – membranas atakos kompleksą (MAC). (15) Šie trys keliai sukelia C3 ir C5 konvertazių aktyvavimą. Klasikiniam ir lektino keliui reikia aktyvatorių (pvz. infekcijos), o alternatyvus kelias savaime pasireiškia dėl žemo laipsnio nepertraukiamos C3 spontaninės hidrolizės ir šis fenomenas vadinasi – atskyrimu (angl. ‘‘tick-over‘‘ phenomenon) (31). GPI inkaro sintezės stoka lemia įvairių baltymų nepakankamumą ant HSC paviršiaus ir jos generuojamose ląstelių linijose. Dėl to stebimas dviejų svarbių reguliuojančių baltymų stygius: skilimą pagreitinačio faktoriaus (angl. decay-accelerating factor, DAF) dar kitaip vadinamas CD55 ir reaktyviosios lizės membranos inhibitoriaus (angl. membrane inhibitor of reactive lysis, MIRL) dar vadinamas CD59 (32–34).
7 pav. Komplemento poveikis sveikiems asmenims (A) ir paroksizmine naktine hemoglobinurija (PNH) sergantiems pacientams (B) (pagal 23).
Siekiant apsaugoti savo pačių ląsteles nuo sunaikinimo, šį procesą griežtai kontroliuoja komplementą reguliuojantys baltymai. Šie baltymai apsaugo raudonąsias kraujo ląsteles nuo
komplemento sunaikinimo. Tačiau žmonėms, sergantiems PNH, ,,nenormaliose“ kraujo ląstelėse trūksta dviejų komplementą reguliuojančių baltymų, kuriais jie galėtų GPI-AP pritvirtinti prie ląstelės membranos. Taip eritrocitai sunaikinami per anksti ir sukeliama hemolizinė anemija (8 pav.) (19,35).
1.4 Klinikinė išraiška PNH
1.4.1 PNH klasifikacija
Tarptautinė PNH interesų grupė (angl. International PNH interest group) 2005 metais pasiūlė priimtiniausią PNH klasifikaciją. PNH pacientai grupuojami pagal hemolizę ir pagrindinę inkstų ligą bei pagal PNH kloną ir jo dydį, kuris, kaip manoma, yra ir susijęs su atrankos procesu, atliekamu imuninės sistemos, o klono didėjimas yra santykinis, bet ne absoliutus (36,37).
Atitinkamai nustatomi trys skirtingi potipiai, kurie matomi 1 lentelėje (38).
1 lentelė. PNH klasifikacija (pagal 37).
1. Klasikinė PNH
2. PNH su kaulų čiulpų funkcijos sutrikimu, pvz., PNH/Aplastinė anemija arba PNH/Mielodisplazinis sindromas
3. Subklinikinis PNH (PNH-sc)
1. Klasikinis PNH. Pacientams, pasireiškia intravaskulinė hemolizė (retikulocitozė, didelis laktatdehidrogenezės (LDH) aktyvumas ir didelė netiesioginio bilirubino koncentracija, bei sumažėjusi haptogobino koncentracija), tačiau nenustatoma kaulų čiulpų anomalijų;
2. PNH su kaulų čiulpų funkcijos sutrikimu. Šioje subkategorijoje esantys pacientai turi klinikinius ir laboratorinius hemolizės požymius ir kaulų čiulpų funkcijos sutrikimus. Kaulų čiulpų analizė ir citogenetinė analizė yra naudojama nustatyti ar PNH atsirado kartu su aplastine anemija (AA), mielodisplaziniu sindromu (MDS) ar kita mielopatija (pvz., mielofibroze). Standartiniai kriterijai yra naudojami diagnozuojant kaulų čiulpų anomalijas (pvz., aplastinę anemiją, MDS ir mielofibrozę).
3. Subklinikinis PNH (PNH-sc). Pacientai neturi klinikinių ar laboratorinių hemolizės požymių. Mažoje populiacijoje, GPI-AP hematopoetinių ląstelių stoka buvo aptikta tėkmės citometrijos būdu. Tai pat PNH-sc stebimas kartu su aplastine ir refrakterine anemija (15,19).
1.4.2. Pažeidimai pagal sistemas
Hemolizinė anemija
Hemolizė yra tipiškas pasireiškimas, kuris paveikia visus pacientus, sergančius PNH. Tačiau, hemolizės laipsnis pacientams skiriasi priklausomai nuo PNH klono dydžio, eritrocitų tipo (II, III) ir komplemento aktyvacijos lygio. Hemolizė yra lėtinė, pasireiškianti intravaskuliariai ir
ekstravaskuliariai, kartais su infekcijomis ir galimais paūmėjimais, kurie atsiranda dėl didelio komplemento aktyvinimo. Dažniausiai PNH sergantiems pacientams hemoglobinurija (tamsios spalvos šlapimas) pasireiškia ryte. Manoma, kad pH sumažėjimas nakties metu yra dėl silpnesnio kvėpavimo dažnio, kuris padidina komplemento aktyvumą ir tuo pačiu hemolizę, tačiau tai klinikiniais tyrimais nėra patikrinta. Simptomai, atsirandantys naktį, gali pasireikšti dėl didesnės lipopolisacharidų absorbcijos, bakterijų bioprodukto, kuris aktyvina komplemento sistemą ir jungiasi prie monocitų per GPI inkaro baltymą (CD14), kurio neturi PNH pacientai. Hemolizinės anemijos metu padidėja biocheminis žymuo – LDH. Anemija priklauo nuo kitų veiksnių, kaip kompensacinės eritropoezės ar geležies/vitaminų trūkumo. Dėl to kai kuriems pacientams hemolizinė anemija yra sunki, dėl jos pacientams prireikia dažnesnio kraujo perpylimo (39).
Hemolizinė anemija gali būti su staigiais pablogėjimais ar pagerėjimais, pasireiškiančiais dėl nežinomos priežasties. Eritrocitai gali būti jautrūs arba nejautrūs komplementui ir tai priklauso nuo GPI sujungto baltymo kiekio. Pacientams, kurių ląstelės yra ,,nenormalios“ (PNH III tipo), yra stebima intensyvesnė hemolizė, nei pacientams, turintiems nepakitusias ląstelių. Kaip ir ūminės anemijos atvejais, pacientai, sergantys PNH, patiria silpnumą, pykinimą, yra blyškesni ir dažnai dūsta dėl uždegiminių procesų. Pacientai, kuriems yra hemolizė, silpnumas yra proporcingas anemijos dydžiui. Eritrocitai morfologiškai atrodo nepakitę, nors tam tikrais atvejais stebima lengva ar vidutinio sunkumo poikilocitozė ir anizocitozė. Haptoglobinas dažniausiai žemas, o LDH aktyvumas yra padidėjęs, kartais net didesnis nei 3 000 IU/L, priklauso nuo hemolizės laipsnio (21).
Inkstų pažeidimas
Esant sutrikusiai inkstų funkcijai ir sergant PNH, klinikinių požymių dažniausiai nepastebima, tačiau, gali pasireišti inkstų ligos, tokios, kaip ūminis inkstų nepakankamumas. Jei viršijama hemoglobino talpa, hemoglobino dimerai cirkuliuoja plazmoje ir yra filtruojami per inksto glomerulą. Šie dimerai reabsorbuojami proksimaliniame kanalėlyje ir suardomi, taip geležis yra kaupiama kaip feritinas proksimalinio kanalėlio epitelyje. Geležis yra aptinkama beveik visiems pacientams, kurie serga PNH. Ne tik hemolizė, bet ir kiti veiksniai, tokie, kaip mikroinfarktai ir audinių fibrozė sukelia ūmų inkstų nepakankamumą. Inkstų ligos PNH metu gali tapti lėtinės ir lemti proksimalinio kanalėlio acidozę ar ūminį inkstų nepakankamumą. Pacientai taip pat gali prarasti gebėjimą sukoncentruoti šlapimą, net kai serumo kreatinino lygis yra normalus. Tai gali vykti dėl hemosiderino kristalų kaupimo ar mikro infarktų (39).
Trombozė
Dažniausia mirties priežastis tarp PNH sergančių pacientų yra venų trombozės, kurios gali pažeisti kepenų ir portalines sistemos venas. Hepatinė venų trombozė paveikia pagrindines kepenų venas dažnai kartu yra įvairaus dydžio hemolizė arba mažųjų radikalų kiekio laipsniškas didėjimas kepenų venoje. Kai pažeidžiama kepenų vartų vena, rengenografijos ir sonografijos tyrimais
aptinkama padidėjusios ir minkštos kepenys. Kartu su padidėjusiu kepenų fermentų kiekiu aptinkama ascitai ir gelta. PNH yra žinoma Budd-Chyari sindromo (BCS) priežastis, tačiau nepaisant didesnio PNH sergančių pacientų sisteminės venų trombozės dažnio, šių pacientų trumpalaikė prognozė nesiskiria nuo nesergančių PNH/BCS. Klinikiniais tyrimais sunkiau pastebimi mažųjų venų pažeidimai, tačiau atsiranda požymiai, kaip skausmas dešiniajame viršutiniame ketvertyje, kepenų padidėjimas, ascitas, portalinės hipertenzijos ženklai. Kepenų fermentų lygis, ypatingai šarminės fosfatazės, yra dažniausiai padidėjęs. Trombozė gali atsirasti odos venose ir kartai sukelti odos nekrozę. Dažniau atsiranda jeigu vieta pažeista traumos arba alerginės reakcijos, o retais atvejais stebima arterijų trombozė (39).
Lygiųjų raumenų distonija
Pilvo skausmas, stemplės spazmas, disfagija ir erekcijos disfunkcija yra dažnai atsirandantys siptomai, kurie susiję su klasikine PNH ir yra tiesioginės intravaskulinės hemolizės ir laisvo hemoglobino išsiskyrimo pasekmė (21). Laisvas hemoglobinas paprastai išvalomas haptoglobinu, CD163 ir hemopeksinu. Šie valymo mechanizmai apima PNH ir sukelia laisvo hemoglobino kaupimąsi kraujo plazmoje, todėl išeikvojamas azoto monoksidas (NO). Laisvas hemoglobinas stipriai veikia NO pralaidumą. Paprastai, NO yra sintezuojamas endotelio ląstelių, todėl išlaiko lygiųjų raumenų atsipalaidavimą ir slopina trombocitų aktyvaciją bei agregaciją. NO trūkumas atsiranda dėl laisvo hemoglobin pašalinimo ir prisideda prie lygiųjų raumenų tonuso ir trombocitų aktyvacijos reguliavimo panaikinimo. Atitinkamai, lygiųjų raumenų distonijos dažniau pasitaiko pacientams, turintiems didelį PNH klono dydį (21)
Kaulų čiulpų nepakankamumas
Kaulų čiulpų ląstelių struktūra PNH pacientams varijuoja: galima aplazija ar eritroidinė hiperplazija. Diagnozės metu PNH pacientams stebima įvairaus laipsnio anemija, granulocitopenija ir trombocitopenija. Šalia periferinės raudojųjų kraujo ląstelių hemolizės citopenijas dažniausiai sukelia kaulų čiulpų nepakankamumas, negu periferiniai pažeidimai, nes neutrofilų ir trombocitų gyvenimo trukmė yra normali. Net jei kai kuriais atvejais periferiniame kraujyje ir kaulų čiulpuose citopenijos nėra matoma, hematopoetinių pirmtakų ląstelių (CD34+) ir kolonijas sudarančių ląstelių kiekis PNH sergantiems pacientams yra sumažėjęs (39).
1.5 Diagnostika
1.5.1 Bendrieji įprastiniai laboratoriniai tyrimai
Hemolizinės būklės, tame tarpe ir PNH, diagnozuojamos pagal anamnezę, klinikinius požymius, atliktus kraujo, šlapimo, išmatų, kaulų čiulpų tyrimus. PNH metu pastebimi klinikiniai požymiai – hemoglobinurija (šlapimas nuo šviesiai raudonos iki tamsiai rudos spalvos), anemija bei gelta, o taip pat stebima trombozė, hemoraginė diatezė ir padidėjęs jautrumas infekcijai. PNH diagnostika gali būti gana sudėtinga dėl simptomų įvairovės, jų išreikštumo/stiprumo skirtumų, o tai, kad liga yra gana reta, taip pat sukelia problemų, nes yra mažiau žinoma ir rečiau prisimenama. Be to labai panašūs simptomai yra būdingi ir kitems hemolizinių anemijų tipams (9 pav.).
9 pav. Hemoliznių anemijų diagnostinė schema (pagal 1)
Tačiau diagnostikos laikas gali būti trumpesnis, kai naudojamas diagnostinis algoritmas ir taikoma didelės rizikos pacientų atranka. Esant PNH būdingi šie laboratoriniai pakitimai (16):
1. Citopenijos (anemija, trombocitopenija, leukopenija ir pancitopenija);
2. Intravaskulinės hemolizės požymiai (padidėjęs LDH, netiesioginis bilirubinas ir sumažėjas haptoglobinas)
3. Geležies trūkumas;
5. Padidėjęs eritroblastų kiekis kaulų čiulpuose (daugeliu atvejų kaulų čiulpai yra hiperplaziniai, tačiau kai kuriais atvejais yra hipoplastiniai);
6. Teigiamas hamo testas (parūgštinto serumo lizės testas) arba cukraus-vandens tyrimas; 7. Neigiamas DAT.
Kaulų čiulpų biopsija neprivaloma diagnozuojant PNH, bet ji turi būti atliekama pacientams, sergantiems sunkia pancitopenija. PNH pacientams kaulų čiulpai dažnai yra su eritroidiška hiperplazija. Eritroidinė hiperplazija yra įprasta dėl eritrocitų greitos kaitos, todėl kaulų čiulpai gali būti panašūs į pacientų, kurie serga mielodisplaziniu sindromu (40).
1.5.2 Tėkmės citometrija
Tėkmės citometrija yra ne tik auksinis standartas PNH diagnostikai ir monitoravimui, bet ir informatyviausias tyrimas pacientams, turintiems mažus PNH klonus. Ląstelių populiacijų nustatymas atliekamas tėkmės citometrijos metodu, panaudojant tiesioginę imunofluorescenciją. Naudojami monokloniniai antikūnai, žymėti fluorochromais, kurie jungiasi su ląstelės paviršiuje ekspresuojamais antigenais. Ląstelės, praeinančios pro argono lazerį, vertinamos pagal tiesioginį šviesos (koreliuoja su ląstelių dydžiu) ir šoninį šviesos (koreliuoja su ląstelių grūdėtumu) išskaidymą. Ląstelių tipai identifikuojami apsibrėžtame analizės regione pagal fluorochromo, konjuguoto su monokloniniu antikūnu, šviesos srauto emisiją – atskiriamos ląstelių populiacijos, turinčios ir/ar neturinčios tiriamų žymenų. Pasižymi dideliu jautrumu ir specifiškumu, atliekama ir kokybinę, ir kiekybinę GPI inkarinių baltymų analizę. Šiems tyrimams ilgą laiką buvo naudojami monokloniniai antikūnai prieš CD55 ir CD59, kurie įprastai prie hematopoetinių ląstelių (eritrocitų, granuliocitų ir monocitų) jungiasi per GPI. Diagnozei patvirtinti reikia nustatyti mažiausiai dviejų skirtingų GPI baltymų trūkumą dviejose skirtingose ląstelių, tokių, kaip granulocitų, monocitų ir eritrocitų linijose (41,42).
Leukocitų (granulocitų ir monocitų) analizė leidžia pasiekti patikimesnių rezultatų, nei tiriant eritrocitus, kurie dėl kraujo perpylimų ar didelės hemolizės gali sąlygoti netikslius rezultatus. Pacientams, kuriems yra nustatyta PNH, rekomenduojama kasmet analizuoti periferinio kraujo GPI-AP ekspresiją, tačiau esant klinikinių parametrų pakitimui (dažnesnių hemolizių ar tromboembolinių atvejų) būtina nedelsiant iš naujo atlikti analizę. Jei stebimas klinikinis pagerėjimas taip pat reikėtų atlikti tarpinę analizę, nes mutantinis klonas kartais tampa mažesnis arba neaptinkamas. FLAER (fluorescinu žymėtas proaerolizinas) – tai žymuo, kurio pagalba patikimai nustatomi PNH leukocitų klonai. Jis tiesiogiai jungiasi prie GPI inkarinių baltymų ir todėl, kai trūksta GPI inkaro granulocituose ir monocituose, nustatoma ekspresijos stoka (43).
1.6 Ligos eigos ir gydymo monitoravimas
Vienintelė PNH ligos modifikuota terapinė strategija yra komplemento slopinimo terapija ekulizumabu, bet galima taikyti ir kaulų čiulpų transplantaciją. Ekulizumabas yra patvirtintas vaistas “JAV maisto ir vaistų administracijos”, kuris naudojamas PNH terapijai. Šis vaistas sumažina kaulų čiulpų transplantacijų poreikį ir yra taikomas, kaip antros eilės priemonė PNH terapijai šalyse, kuriose jis yra prieinamas. Kaulų čiulpų transplantacija gali būti alternatyvus pasirinkimas, jei gydymas ekulizumabu pacientams yra neskiriamas (per brangus arba yra priešparodymai gydymui), be to, tai yra pats tinkamiausias gydymas PNH sergantiems pacientams su sunkiu kaulų čiulpų nepankamumu. Pacientams taip pat gali būti skiriama papildoma terapija (pvz., imunosupresija), tačiau šis papildomas gydymas nėra specifinis PNH ir neturi atitinkamo poveikio PNH klonų sumažinimui. Vienintelė gydomoji priemonė PNH yra alogeninė kamieninių ląstelių transplantacija, tačiau ši procedura turi didelę mirtingumo riziką. Atsižvelgiant į tai, kad nedidelė dalis PNH sergančių pacientų patiria spontanines remisijas dėl ekulizumabo, alogeninė kamieninių ląstelių transplantacija ypač rekomenduojama PNH/AA, PNH/MDS pacientams, kuriems yra akivaizdus kaulų čiulpų nepakankamumas, ir pacientams, atspariems gydymui ekulizumabu, dėl kurio pasireiškia pasikartojantys tromboemboliniai atvejai. (44–46).
Ekulizumabas yra monokloninis antikūnas, kuris blokuoja terminalinį komplementą per C5. Ekulizumabas slopina MAC susidarymą ir tuo pačiu kompensuoja PNH sergančių pacientų CD59 trūkumą (33,47–49). Pacientams, kurie vartoja ekulizumabą, pirmąsias keturias savaites reikėtų stebėti bendrą kraujo vaizdą, retikulocitų skaičių, LDH ir biocheminius rodiklius, o vėliau šiuos rodiklius tikslinga tikrinti kartą per mėnesį. Pacientams, turintiems nuolatinius hemolizės požymius, turėtų būti atliekamas DAT testas, o PNH tėkmės citometrija turėtų būti atliekama kartą per metus, nes PNH klonų dydis laikui bėgant gali svyruoti. LDH dažniausiai grįžta į normos ribas per kelias dienas po pradinio ekulizumabo vartojimo, tačiau retikulocitų skaičius paprastai išlieka padidėjęs, o hemoglobinas ženkliai svyruoja. Retikulocitų skaičius dažnai padidėjęs, nes daugumai PNH pacientų, vartojančių ekulizumabą, ir toliau atsiranda ekstravaskulinė hemolizė dėl C5 fragmentų nusėdimo į PNH eritrocitus. Taigi, hemoglobino atsakas labai priklauso nuo ekstravaskulinės hemolizės laipsnio ir kaulų čiulpų nepakakamumo. Intravaskulinė hemolizė ir PNH simptomai atsiranda 5-iems proc. pacientų, kurie buvo gydyti ekulizumabu. Tai pastebima vieną arba dvi dienas prieš kitą skiriamą vaisto doze, kartu stebimas LDH padidėjimo lygis. Jeigu tai įvyksta reguliariai, pertrauka tarp dozių gali būti sutrumpinta iki dvylikos ar trylikos dienų arba šio vaisto dozė gali būti padidinta. Komplemento aktyvacija esant infekcijoms ar traumoms, taip pat gali sukelti laikina hemolizę. Šie laikini hemolizės proveržiai ir hemoglobino svyravimai dažnai normalizuojasi, kai infekcija ar uždegimas praeina (21).
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo eiga ir tiriamųjų kontingentas
Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Laboratorinės medicinos klinikoje. Pacientai, kurie sudarė tiriamąjį kontingentą, buvo gydyti LSMU ligoninėje Kauno klinikose Hematologijos skyriuje nuo 2017-01-01 iki 2017-12-29. Įtraukimo kriterijai:
− tiriamųjų amžius ≥18 m., − vyrai ir moterys,
− pacientai tirti ir gydyti dėl hemopoezės sutrikimų.
Į tiriamųjų imtį neįtraukti asmenys, kurių amžius <18 m., ir pacientai, kurie buvo gydyti ambulatoriškai.
Iš 379 pacientų buvo atrinkti tie pacientai, kuriems buvo daryti haptoglobino (HAPTO) ir laktatdehidrogenazės (LDH) tyrimai, o iš jų atrinkti tik tie, kurių HAPTO koncentracija buvo mažesnė nei norma, tai yra mažiau nei 360 mg/l. Taigi galutinai tyrimui atrinkta 80 pacientų.
Į antrą tyrimo dalį įtraukti 26 pacientai, kuriems buvo atlikti tėkmės citometrijos tyrimai dėl PNH klono paieškos.
2.2 Tyrimų metodai
2.2.1 Ėminiai, jų gabenimas ir laikymas
Visiems tiriamiesiems kraujas imtas laikantis standartinių kraujo paėmimo sąlygų, nerūkius, nevalgius ir laikantis kraujo paėmimo technikos reikalavimų.
Veninio kraujo tyrimui automatizuotu būdu, DAT ir tėkmės citometrijai kraujas buvo imtas
iš periferinės venos punkcijos būdu į vakuuminius mėgintuvėlius su K3EDTA (Vacutainer ®, BD, JAV). Mėgintuvėliai buvo švelniai suvartomi (8 – 10 kartų). Kraujo ėminiai su K3EDTA pristatyti į laboratoriją:
- Bendro kraujo vaizdo tyrimui automatizuotu būdu ir DAT – per mažiau nei 8 valandas nuo paėmimo esant (15–25)ºC temperatūrai.
- Tėkmės citometrijai – per mažiau nei 24 valandas nuo paėmimo esant (15–25)ºC temperatūrai.
Biocheminiams tyrimams kraujas buvo imtas iš periferinės venos punkcijos būdu į
vakuuminius mėgintuvėlius be priedų (Vacutainer ®, BD, JAV). Mėgintuvėliai buvo švelniai suvartomi 6 – 8 kartus. Šie kraujo ėminiai pristatyti į laboratoriją per mažiau nei 1,5 valandos nuo paėmimo esant (15–25)ºC temperatūrai. Serumui atskirti, ėminiai buvo centrifuguoti 1600xg 15 min.
2.2.2 Bendro kraujo vaizdo tyrimas automatizuotu būdu
Bendras kraujo vaizdas buvo tirtas automatiniu hematologiniu analizatoriumi XE-5000 (Sysmex, Japonija), kurio metu buvo nustatyti periferinio kraujo leukocitų, eritrocitų rodikliai.
Hematologiniu analizatoriumi buvo atskiriamos leukocitų populiacijos panaudojant fluorescencinės tėkmės citometrijos principus. Buvo naudojamas fluorescencinis žymuo, kuris jungiasi prie ląstelių nukleorūgščių ir taip buvo sukuriamas ląstelių suspencijos srautas, kuriame ląstelės buvo išrikiuojamos po vieną arba eile ir tekėjo į tiriamąjį tašką. Ląstelės pagal morfologines savybes buvo atskiriamos, fiksuojant priekinę (atspindinčią ląstelių dydį) ir šoninę (atspindinčią ląstelių grūdėtumą, vidaus struktūrų sudėtingumą) lazerio šviesos sklaidą, o taip pat ir fluorescencinę sklaidą (DNR, RNR kiekį ląstelėse). Leukogramoje buvo nustatyti procentiniai bei absoliutūs rodiklių dydžiai ir išskiriamos limfocitų, monocitų, neutrofilų, eozinofilų ir bazofilų populiacijos. Analizatoriumi nustatant eritrocitų absoliutų kiekį buvo naudojamas tiesioginės srovės metodas.
2.2.3 Tiesioginis antiglobulino testas ir biocheminiai tyrimai
DAT (tiesioginis antiglobulininis testas)
DAT buvo atliekama taikant hemagliutinacijos stulpelyje metodą, naudojant LISS-Koombs plokšteles (Biorad, JAV). Nesant nepilnų antikūnių arba komplemento komponentų (C4d, C3d), prisitvirtinusių prie tiriamojo individo eritrocitų, reakcija buvo vertinama kaip neigiama. Norma: neigiamas testas. Rezultatai vertinami taip:
– Neigiama reakcija 0, – Teigiama reakcija 1+, – Silpnai teigiama reakcija 2+.
Haptoglobino koncentracijos nustatymas serume
Haptoglobino koncentracija nustatyta naudojant klinikinės chemijos automatine Sistema -
SYNCHRON UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, JAV) metodu. Naudotas SYNCHRON® SYSTEMS
Haptoglobin regentų rinkinys. Matavimo ribos: 150–3000 mg/l. Referentiniai intervalai suaugusiems:
Laktatdehidrogenazės aktyvumo nustatymas serume
Laktatdehidrogenazės aktyvumas nustatyta naudojant klinikinės chemijos automatinę sistemą SYNCHRON UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, JAV). Naudotas SYNCHRON® SYSTEMS
Lactate dehydrogenasis regentų rinkinys. Matavimo ribos: 5–750 U/l. Mėginiai, kurių rezultatai
viršijo viršutinę matavimo ribą, buvo tiriami atliekant skiedimą, tokiais atvejais viršutinė laktatdehidrogenazės aktyvumo matavimo riba siekė 2700 U/l. Referentiniai intervalai suaugusiems: 0 – 248 U/l.
Bendro bilirubino koncentracijos nustatymas serume
Bendro bilirubino koncentracija nustatyta naudojant klinikinės chemijos automatinę sistemą
SYNCHRON UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, JAV). Naudotas SYNCHRON® SYSTEMS Total
bilirubin regentų rinkinys. Matavimo ribos: 1,7 – 513 μmol/l. Referentiniai intervalai suaugusiems:
6,8 – 34,3 μmol/l.
Tiesioginio bilirubino koncentracijos nustatymas serume
Tiesioginio bilirubino koncentracija nustatyta naudojant klinikinės chemijos automatinę sistemą SYNCHRON UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, JAV). Naudotas SYNCHRON® SYSTEMS
Direct bilirubin regentų rinkinys. Matavimo ribos: 1,7 – 171 μmol/l. Referentiniai intervalai
suaugusiems: 1,7 – 8,6 μmol/l.
2.2.4 Tėkmės citometrija
PNH klono nustatymui buvo atliktas eritrocitų ir leukocitų imunofenotipavimas, naudojant tėkmės citometrą BD FacsCanto (BD Immunocytometry Systems, JAV), taikant tiesioginio dažymo metodiką ir daugiaspalvę citometrinę analizę.
2.2.4.1 Tyrimo įrenginiai ir kiti prietaisai
1. Centrifuga Eppendorf 5810 (Eppendorf, Vokietija),
2. Tėkmės citometras BD FACSCanto® (BD Immunocytometry Systems, JAV), 3. Kratytuvas Heidolph REAX 2000 (Heidolph,Vokietija),
4. Automatiniai kintamo tūrio dozatoriai 2-20 µl, 10-100 µl ir 100-1000 µl, 5. BD Falcon polistireno mėgintuvėliai 12×75mm,
6. Pastero pipetės.
2.2.4.2 Reagentai
1. Monokloniniai antikūnai (žr. 2 lentelėje),
2. BD FACSLysing Solution – koncentruotas eritrocitus lizuojantis tirpalas.
2 lentelė. Naudoti monokloniniai antikūnai
Eil.
Nr. Monokloniai antikūnai
Izotipas,
klonas Gamintojas
1. Antikūnai prieš žmogaus CD66abce, žymėti FITC Izotipas: pelės IgG2b; Klonas
TET2 BD Pharmingen TM, JAV
2. Antikūnai prieš žmogaus CD55, žymėti FITC Izotipas: pelės IgG2a, κ; Klonas
IA10 BD Pharmingen TM, JAV
3. Flaer, žymėtas Alexa Fluor 488
50 μg of FLAER / 1.0 ml
PBS-albumino, 0,05% Sodium Azide Cedarlane Corporation, Kanada 4. Antikūnai prieš žmogaus CD235a, žymėti FITC Izotipas: pelės IgG2b, κ; Klonas
GA-R2 / HIR2 BD Pharmingen TM, JAV
5. Antikūnai prieš žmogaus CD16, žymėti PE Izotipas: pelės IgG1, κ; Klonas
B73.1 BD Pharmingen TM, JAV
6. Antikūnai prieš žmogaus CD33, žymėti PE Izotipas: pelės IgG1, κ; Klonas
P67.6 BD Pharmingen TM, JAV
7. Antikūnai prieš žmogaus CD59, žymėti PE Izotipas: pelės IgG2a, κ; Klonas
MEM-43 BD Pharmingen TM, JAV
8.
Antikūnai prieš žmogaus CD24, žymėti PerCP-Cy™5.5
Izotipas: pelės IgG2, κ; Klonas
ML5 BD Pharmingen TM, JAV
9. Antikūnai prieš žmogaus CD14, žymėti PerCp Izotipas: pelės IgGMφP9 2b; Klonas BD Pharmingen TM, JAV 10. Antikūnai prieš žmogaus CD15, žymėti APC Izotipas: pelės IgM, κ; Klonas
HI98 BD Pharmingen TM, JAV
11. Antikūnai prieš žmogaus CD48, žymėti APC Izotipas: rekombinantinis žmogaus IgG1; Klonas REA426 Miltenyi Biotec, JAV 12. Antikūnai prieš žmogaus
CD33. Žymėti APC
Izotipas: pelės IgG1, κ, Klonas
P67.6 BD Pharmingen TM, JAV
13. Antikūnai prieš žmogaus CD45, žymėti APC-H7 Izotipas: pelės IgG1, κ; Klonas
2.2.4.3 PNH klono nustatymo darbo eiga
PNH klonui nustatyti tiriami tiek eritrocitai, tiek ir leukocitai. Jų paruošimas aprašomas 3-ioje ir 4-toje lentelėse.
3 lentelė. Eritrocitų paruošimo protokolas
Eil.
Nr. Etapo aprašymas
1. Buvo imta 100 µl paciento kraujo ir 10 ml PBS tirpalo, kurie sumaišyti pastero pipete.
2. Į 100 µl citometrinį mėgintuvėlį buvo įdėda 5 µl CD59-PE ir 5 µl CD235a-FITC (praskiesto santykiu 1:50).*
3. Mėgintuvėlio turinys buvo sukratomas braukomaisiais judesiais, staigiu judesiu per stovelio paviršiaus plokštumą.
4. Inkuobuota 30 min., kambario temperatūroje, tamsoje ir inkubacijos metu kas 5 minutes braukomaisiais judesiais buvo sukratoma per stovelio plokštumą.
5. Plovimas (2 kartus). Į kiekvieną mėgintuvėlį buvo pilama 2 ml PBS tirpalo, sukratoma žemu dažniu 3s ir centrifuguojama 300xg 5 min. Mėgintuvėlio dugne liko apie 50 l skysčio ir ląstelių plokštelės. 6. 5 punkto veiksmai kartojamai dar kartą.
7. Toliau į mėgintuvėlį buvo pilama 1 ml PBS tirpalo ir sukrečiama kratytuvu žemu dažniu 3s.
8. Iki ląstelių surinkimo tėkmės citometru paruošti mėginiai buvo laikomi (2–8ºC) temperatūroje tamsoje. Ląstelių surinkimas buvo pradėtas ne vėliau kaip per 15 min.
* Monokloninio antikūno CD235a-FITC darbinis tirpalas buvo ruošiamas (skiedžiant jį santykiu 1:50): į eppendorf tipo mėgintuvėlį buvo įpilama 1 µl CD235a-FITC ir 49 µl BD FACS FlowTM ir sumaišoma. Paruoštą darbinį tirpalą galima naudoti 48 valandas, kai jis laikomas, esant (2–8ºC) temperatūrai, sandariai uždarytas, tamsoje.
4 lentelė. Leukocitų paruošimo protokolas
Eil. Nr.
Etapo aprašymas
1. Leukocitų tyrimui buvo ruošiami trys Falcon tipo mėgintuvėliai.
2. Į atitinkamus mėgintuvėlius buvo įpilta po 5 µl monokloninių antikūnių (žr. žemiau pateiktoje 5 lentelėje).
3. Į kiekvieną mėgintuvėlį buvo pilama po 100 µl neskiesto paciento kraujo tiesiai į mėgintuvėlio dugną (neleidžiama kraujui tekėti mėgintuvėlio sienele).
4. Mėgintuvėliai buvo sukratomi kratytuvu žemu dažniu 3s ir inkubuojami 20 min., kambario temperatūroje, tamsoje.
5. Toliau mėgintuvėliai buvo lizuoti naudojant BD FACSLysing Solution darbinį tirpalą (BD FACS Lysing Solution atskiedus santykiu 1:10) 10 min. 2 ml
6. Plovimas. Į kiekvieną mėgintuvėlį buvo įpilama 2 ml PBS tirpalo, sukrečiama kratytuvu žemu dažniu 3s ir centrifuguojama 410xg 5 min. Supernatantas buvo nupilamas apverčiant ir nukratant kiekvieną mėgintuvėlį – mėgintuvėlio dugne buvo palikta apie 50 l skysčio ir ląstelių plokštelės.
7. Į kiekvieną mėgintuvėlį buvo pilama 0,5 ml PBS tirpalo sukrečiama kratytuvu žemu dažniu 3s 8. Iki ląstelių surinkimo tėkmės citometru paruošti mėginiai buvo laikomi (2–8ºC) temperatūroje
5 lentelė. Monokloninių antikūnių išpilstymas PNH leukocitų tyrimui
Mėgintuvėlis Monokloniniai antikūnai
FITC PE PerCP-Cy5,5 APC APC-H7
1. CD66abce CD16 PerCP-CD24 CD15 CD45
2. CD55 CD33 PerCP-CD14 CD48 CD45
3. Flaer CD16 PerCP-CD14 CD33 CD45
2.2.4.4 Ląstelių surinkimas ir analizė
Siekiant 0,01 proc analizės jautrumo, kiekvienam mėginiui buvo renkama 500 000 eritrocitų ir 50 000 granulocitų, atitinkamai. Darbo eiga rėmėsi BD Facs Canto vartotojo vadovu.
Pagal monochrominės lazerio šviesos sklaidą vertintas ląstelių dydis (pagal priekinę šviesos sklaidą; FSC) ir grūdėtumas (pagal šoninę šviesos sklaidą; SSC). Analizei, dominančiai ląstelių populiacijai pasirinkti, naudotos taškinės diagramos su šoninės šviesos sklaidos (SSC) ir CD45 ekspresijos deriniu (leukocitams) arba CD235a deriniu (eritrocitams), kurio dėka taškinėse diagramose pasiekiamas patikimesnis ląstelių populiacijos atskyrimas. Ląstelės atrinktos, taškinėje diagramoje aplink tiriamas ląsteles apibrėžiant regioną (angl. gate). Tolimesnė imuninė analizė, vertinant CD žymenų ekspresiją, atlikta tik su pasirinkto regiono ląstelėmis.
2.2.4.5 Rezultatų įvertinimas
Eritrocitų (RBC) analizės tikslas yra patikimai identifikuoti, kiekybiškai įvertinti ir atskirti ląsteles į tris kategorijas:
- RBC I tipo yra normalios ląstelės;
- RBC II tipo, kurios iš dalies stokoja GPI-AP ir - RBC III tipo, kai nėra išreikšta GPI-AP ekspresija.
PNH RBC klonų išsidėstymas tiriant tėkmės citometrijos metodu pavaizduotas taškinėje diagramoje (10 pav.). Vienos spalvos diagramos padeda palyginti RBC dažymosi lygį su normaliomis ir stokojančiomis ląstelėmis. Šis metodas yra labiau tinkams atskirti ir kiekybiškai įvertinti II ir III tipo RBC. Atliekant tėkmės citometrijos tyrimą labai svarbu žinoti ar pacientui nebuvo atlikti kraujo hemolizės ir eritrocitų masės perpylimai, nes šie du veiksniai gali iškreipti gautus tyrimų rezultatus (9). Visais atvejais buvo tirtos eritrocitų eilės ląstelės, taip pat visada buvo tirti ir granulocitai.
10 pav. CD59 ekspresijos pasiskirstymas tarp I, II ir III tipo RBC ląstelių (LSMU ligoninės Kauno klinikų LMK vaizdai)
PNH klono identifikacijai buvo naudoti šie kriterijai: - ≥2 skirtingų GPI-AP baltymų stoka;
- ≥2 skirtingose ląstelių populiacijose (išskyrus limfocitus);
Visais atvejais buvo tirtos granulocitinės ląstelės, o monocitų eilės ląstelės vertintos granulocitų rezultatams patvirtinti. Atsižvelgiant į tai, kad leukocitų analizei klonui aptikti naudoti monoklonai CD59 ir CD55, šiuo metu nėra optimalūs, buvo naudoti šie žymenys:
- Granulocitų populiacijai – CD16, CD24, CD66abcde, CD55, FLAER; - Monocitų populiacijai – CD14, CD48, CD55, FLAER.
11 pav. GPI-AP baltymų ekspresijos pasiskirstymas granuliocitų populiacijoje (LSMU ligoninės Kauno klinkų LMK vaizdai)
A – 96 proc. granuloctų CD66abcde-/CD16-; B – 96 proc. granuloctų CD16-/CD24-; C – 96 proc. granuloctų FLAER-/CD16-.
2.2.5 Statistinė duomenų analizė
Duomenų analizė buvo atlikta naudojant statistinės analizės programos IBM SPSS Statistics 23.0 versiją (IBM Corporation, JAV). Naudojant Shapiro-Wilks testą, buvo tikrintas duomenų pasiskirtymas pagal Gauss‘-o skirstinį. Buvo apskaičiuotas standartinis nuokrypis − SN (angl.
standard deviation) ir atskirų grupių kiekybinių dydžių duomenų vidurkiai. Dviem atskiroms
grupėms lyginti buvo naudotas Mann-Whitney U testas. Neparametrinis Chi kvadrato (χ²) kriterijus buvo naudotas kokybinių požymių tarpusavio ryšiui nustatyti, o Spearman koreliacijos koeficientas buvo naudotas kiekybiniam ryšiui nustatyti. Statistiškai reikšmingais skirtumais yra buvo laikoma, kai p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Tyrimai atlikti nuo 2017-01-01 dienos iki 2017-12-29 dienos Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Laboratorinės medicinos klinikoje.
Tyrimui atrinkti (n=379) pacientai su hemopoezės sutrikimais. Jauniausias pacientas tiriamųjų grupėje buvo 18 metų amžiaus, o vyriausiojo paciento amžius siekė 94 metus. Iš jų atrinkti pacientai, kuriems buvo atlikti haptoglobino (HAPTO) ir laktatdehidrogenazės (LDH) tyrimai, o iš jų dar papildomai daryta atranka – tyrime palikti tik tie 80 pacientų, kurių HAPTO koncentracija buvo mažesnė nei norma, tai yra mažiau nei 360 mg/l. O į antrą tyrimo dalį įtraukti tik tie pacientai, kuriems buvo atlikti tėkmės citometrijos tyrimai.
Iš tyrime dalyvavusių 80 pacientų buvo 31 (38,75 proc.) vyras ir 49 (61,25 proc.) moterys. Atlikto tyrimo duomenimis, vyrų ir moterų amžiaus grupių vidurkiai skyrėsi statistiškai reikšmingai (p=0,017), vyrai buvo jaunesni nei tiriamosios moterys. Detali tiriamųjų vyrų ir moterų charakteristika pateikiama 6 lentelėje.
6 lentelė. Vyrų ir moterų pogrupių charakteristikos
Požymis Pagal lytį Vyrai (n=31) Moterys (n=49) Amžius (metai) 62,7±17,3 70,4±14,8 HAPTO (mg/l) 94,48±86,75 74,67±98,75 LDH (U/l) 1248,6±1518,2 1001,5±1130,2 LDH/URL 5,03±6,12 4,04±4,56 TBIL (μmol/l) 31,91±22,25 38,67±24,08 DBIL (μmol/l) 5,11±3,85 7,12±6,94 RBC (x1012/l) 3,27±1,02 3,03±1,00 HGB (g/l) 103,19±18,43 93,12±24,59 HCT (%) 30,73±7,08 28,28±7,81 WBC (x109/l) 13,86±20,14 13,50±26,93 LY (x109/l) 7,19±18,43 9,11±25,91 NEU (x109/l) 5,98±7,19 3,66±3,15 NEU/LY 2,81±3,06 2,51±3,51
Pateikiamas vidurkis ± (SN). HAPTO – haptoglobinas, LDH – laktatdehidrogenazė, LDH/URL – laktatdehidrogenazės ir laktatdehidrogenazės viršutinės referentinės ribos santykis, TBIL – bendras bilirubinas, DBIL – tiesioginis bilirubinas, RBC – eritrocitai, HGB – hemoglobinas, HCT – hematokritas, WBC – leukocitai, LY – limfocitai, NEU – neutrofilai, NEU/LY – neutrofilų ir limfocitų santykis.
Hemolizinės anemijos išsivysto dėl labai skirtingų priežasčių, svarbu paminėti tai, kad jos gali būti tiek pirminės, tiek ir antrinės, kuomet lydi pagrindinę ligą, pvz. sistemines jungiamojo audinio ligas, mielominę ligą, leukemijas, kitas neoplazijas ir t.t. Kaip nurodoma, pirminių ir antrinių AHIA santykis yra 1:1 (6). Duomenys apie hemolizinių ligų ryšį su lytimi bei pacientų amžių jų pasireiškimo metu yra prieštaringi ir labiausiai priklauso nuo ligos etiologijos (1,5,6). Nurodoma, kad PNH sergančių vyrų ir moterų santykis yra labai panašus (13). Mūsų tyrimo metu vyrų buvo šiek tiek mažiau nei moterų, be to vyrai buvo šiek tiek jaunesni nei tiriamosios moterys, tačiau būtina įvertinti tai, kad pacientų imtis pagal ligos etiologiją buvo labai įvairi.
Mūsų tyrimo metu mes neidentifikavome hemolizės detalios etiologijos, neturėjome tikslo diferencijuoti visų autoimuninių hemolizinių anemijų, o kreipėme dėmesį į hemolizines būkles, siekdami rasti pokyčius, kurių pagalba galima būtų įtarti ir kryptingiau atrinkti pacientus su PNH ar bent jau turinčius PNH kloną.
Atsižvelgiant į tai, kad skirtingai nuo kitų hemolizinių būklių, sergant PNH ir esant hemolizei, yra būdinga neigiama DAT reakcija (1,53,54), tiriamiems pacientams vertinome DAT rezultatus. DAT testas atliktas 72 pacientams: iš jų 29 vyrams ir 42 moterims. 79 proc. tiriamųjų DAT testas buvo neigiamas, o 21 proc. gauti teigiami rezultatai. 9 pacientams DAT testas nebuvo atliktas. Neigiamų ir teigiamų DAT rezultatų dažnis tarp vyrų ir moterų nesiskyrė (12 pav.).
12 pav. DAT pasiskirstymas vyrų ir moterų pogrupiuose
Yra nurodoma, kad DAT neigiamas rezultatas gali būti klaidingai neigiamas ir gaunamas dėl techninių priežasčių, bet verta paminėti ir tai, kad tokį rezultatą gali sąlygoti ir infekcinės ligos, Wilsono liga, o dažniausiai – paprasta mechaninė hemolizė, sukeliama kraujo ėmimo ir laikymo metu (1,6). Visgi, šios priežastys tyrimo metu buvo atmestos ir rezultatams įtakos neturėjo.
0 20 40 60 80 100 Vyrai Moterys 5 (17,2 proc.) 10 (23,8 proc.) 24 (82,8 proc.) 32 (76,2 proc.) D až ni s, p roc . Chi2=0,444, ll=1, n=71, p=0,505 DAT teigiamas DAT neigiamas
Visiems tiriamiesiems buvo atliktas LDH tyrimas, kuris yra pripažįstamas kaip hemolizės indikatorius (1,48), todėl atskirai ir vertinome tiriamųjų LDH aktyvumą, kaip vieną iš svarbių hemolizės indikatorių. LDH aktyvumas buvo padidėjęs net 92,5 proc. (74 iš 80) tiriamųjų, o 7,5 proc. (6 iš 80) – išliko normos ribose. Vertindami LDH aktyvumo pasiskirstymą su pacientų lytimi, nustatėme, kad padidėjusio LDH aktyvumo dažnis vyrų ir moterų pogrupiuose statistiškai reikšmingai nesiskyrė (13 pav.).
13 pav. LDH aktyvumo pasiskirstymas vyrų ir moterų pogrupiuose
Tyrimo metu daugiau nei 90 proc. tiriamųjų nustatytas LDH aktyvumas, kuris viršijo referentines LDH ribas. LDH padidėjimas nurodo hemolizę, tačiau nėra tinkama priemonė diferencijuoti skirtingos kilmės hemolitinėms anemijoms, nes jos aktyvumo padidėjimas yra būdingas ir pirminių, ir antrinių hemolizių metu, o taip pat tiek AIHA, tiek membraninių defektų sąlygotoms hemolizėms, tiek vaistų indukuotoms, tiek PNH, tiek ir kt. hemolizėms (1,13,45).
Atsižvelgiant į ribotą LDH informatyvumą, nusprendėme vertinti LDH santykį su LDH viršutine referntine riba (LDH/URL) ir kaip atskaitos tašką tarp grupių pasirinkome 1,5 karto reikšmę. Pasirinkimą lėmė tai, kad mokslinių tyrimų metu kelios tyrėjų grupės nustatė, kad LDH/URL1,5 yra susijęs su prastesniu pacientų išgyvenamumu ir dažnesnėmis tromboembolinėmis komplikacijomis pacientams, sergantiems PNH (13,45,53,55).
Analizuodami hemolizines būkles, visus tiriamuosius suskirstėme į dvi grupes: į tiriamuosius, kurių LDH/URL<1,5 ir į tiriamuosius, kurių LDH/URL1,5, pastarųjų buvo net 73,8 proc. Mokslinių tyrimų duomenys nurodo, kad LDH/URL santykis, didesnis nei 1,5, yra aptinkamas pakankamai didelei daliai pacientų su hemolize, ypač PNH (55).
Analizuojant pacientų pogrupius, besiskiriančius LDH/URL santykiu, nustatėme, kad abiejuose pogrupiuose pacientų amžius reikšmingai nesiskyrė (7 lentelė). Lyginat kitus minėtų
0 20 40 60 80 100 Vyrai Moterys 3 (9,7 proc.) 3 (6,1 proc.) 28 (90,3 proc.) 46 (93,9 proc.) D až ni s, p roc Fisher, p=0,672 LDH norma LDH ↑
pogrupių pacientų rodiklius, buvo aptikti statistiškai reikšmingi LDH ir LDH/URL vidurkių skirtumai (p=0,000). Nustatyta, kad LDH aktyvumo vidurkiai pogrupiuose skyrėsi itin ženkliai – beveik 10 kartų, o LDH padidėjimas lyginant su jos viršutine referentine riba buvo beveik 5 kartus didesnis pacientų su LDH/URL1,5 grupėje. (7 lentelė).
7 lentelė. Laboratorinių rodiklių vidurkiai pacientų pogrupiuose, besiskiriančiuose LDH/URL santykiu Požymis Tiriamųjų rodikliai LDH/URL1,5 (n=59) LDH/URL<1,5 (n=21) p reikšmė Amžius (metai) 68,3±14,7 65,1±19,9 0,801 HAPTO (mg/l) 68,49±86,00 121,29±107,04 0,105 LDH (U/l) 1394,4±1387,8 262,4±58,8 0,000 LDH/URL 5,62±5,51 1,06±0,24 0,000 TBIL (μmol/l) 38,51±24,41 26,27±16,00 0,031 DBIL (μmol/l) 7,09±6,31 3,37±1,99 0,002 RBC (x1012/l) 2,88±1,00 3,82±0,66 0,000 HGB (g/l) 90,20±23,12 115,90±17,54 0,000 HCT (%) 27,24±7,31 34,82±4,94 0,000 WBC (x109/l) 11,95±21,33 18,31±31,58 0,177 LY (x109/l) 6,59±19,95 13,34±30,75 0,127 NEU (x109/l) 4,65±5,77 4,29±3,10 0,355 NEU/LY 2,68±3,25 2,81±3,62 0,780
Pateikiamas vidurkis ± (SN). HAPTO – haptoglobinas, LDH – laktatdehidrogenazė, LDH/URL – laktatdehidrogenazės ir laktatdehidrogenazės viršutinės referentinės ribos santykis, TBIL – bendras bilirubinas, DBIL – tiesioginis bilirubinas, RBC – eritrocitai, HGB – hemoglobinas, HCT – hematokritas, WBC – leukocitai, LY – limfocitai, NEU – neutrofilai, NEU/LY – neutrofilų ir limfocitų santykis.
Hemolizę nurodantys rodikliai yra TBIL ir DBIL ir nustatyta, kad tiek TBIL, tiek DBIL koncentracijos yra statistiškai reikšmingai didesnės pogrupyje su LDH/URL1,5 (p=0,031, p=0,002, atitinkamai). Anemiją charakterizuojančių rodiklių – RBC, HGB, HCT vidurkiai abiejuose pogrupiuose buvo mažesni nei norma, tačiau pogrupyje su LDH/URL1,5, kurį vertinome kaip hemolizės indikatorių, RBC, HGB, HCT vertės buvo statistiškai reikšmingai mažesnės nei pogrupyje su su LDH/URL<1,5 (visų rodiklių po p=0,000). Kitų tirtų laboratorinių rodiklių – HAPTO, LY,
