LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Živilė Zakarauskaitė
JŪRŲ KIAULYČIŲ KIAUŠIDŽIŲ ĮVAIRIŲ STADIJŲ FOLIKULŲ PALYGINIMAS IR CHARAKTERISTIKA
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: doc. dr. Vidmantas Lasys
2 DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Jūrų kiaulyčių kiaušidžių įvairių stadijų folikulų palyginimas ir charakteristika“:
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
Živilė Zakarauskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ
LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Živilė Zakarauskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO Vidmantas Lasys
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE Judita Žymantienė
(aprobacijos data) (katedros vedėjos vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės/riaus vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamasis darbas yra patalpintas į ETD IS
3 TURINYS Santrumpos ... 4 Santrauka... 5 Summary ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8 1.1. Jūrų kiaulytė ... 8
1.2. Patelių lytiniai organai ... 8
1.3. Lytinis ciklas ... 9
1.4. Kiaušidė (ovary) ... 9
1.5. Folikulogenezė ... 10
1.6. Kiaušidės folikulų klasifikacija ... 11
1.7. Užuomazginis kiaušidės folikulas (folliculus ovaricus primordialis) ... 12
1.8. Pirminis kiaušidės folikulas (folliculus ovaricus primarius) ... 12
1.9. Antrinis kiaušidės folikulas (folliculus ovaricus secundarius) ... 13
1.10. Pūslinis kiaušidės folikulas (folliculus ovaricus vesiculosus)... 14
1.11. Atreziniai folikulai (folliculi atretici) ... 15
2. TYRIMO METODIKA ... 16
2.1. Histologinės medžiagos fiksavimas ... 16
2.2. Histologinės medžiagos paruošimas pjaustymui... 16
2.3. Histologinės medžiagos pjaustymas... 17
2.4. Histologinės medžiagos dažymas... 17
2.5. Histologinių preparatų tyrimas ... 17
3. REZULTATAI ... 19
3.1. Užuomazginių kiaušidžių folikulų morfometriniai matavimai ... 19
3.2. Pirminių kiaušidžių folikulų morfometriniai matavimai ... 25
3.3. Antrinių kiaušidžių folikulų morfometriniai matavimai ... 31
REZULTATŲ APTARIMAS ... 38
IŠVADOS ... 40
4 Santrumpos
FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas µm – mikrometrai
Nr. – numeris P – patikimumas
5 Santrauka
Baigiamojo darbo tikslas buvo ištirti 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių folikulų ir jų ovocitų morfometrinius ypatumus. LSMU Patologijos centre buvo atliktas trijų jūrų kiaulyčių preparavimas ir paimta tyrimams reikalinga medžiaga. Anatomijos ir Fiziologijos katedroje buvo atliktas histologinių preparatų paruošimas. Preparatai buvo naudojami atlikti mikroskopines nuotraukas naudojant histologinių vaizdų analizatorių (mikroskopą) „Olympus DP72 BX63“. Naudojant UTHSCSA Image Tool for Windows Version 3 programą buvo atlikta 3 jūrų kiaulyčių, kurių amžius 3 metai, užuomazginių, pirminių ir antrinių kiaušidės folikulų, bei juose esančių ovocitų, ovocitų branduolių, folikulinių ląstelių bei pamatinės membranos morfometriniai matavimai. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant statistinę programą ANOVA (Statistica Version 10, StatSoft inc.). Mūsų tyrimo metu buvo nustatyta, kad 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių užuomazginių folikulų diametras svyravo nuo 23,22±2,62 µm iki 26,16±3,58 µm, ovocitų diametras svyravo nuo 6,26±1,13 µm iki 7,37±0,51 µm. Pirminių kiaušidžių folikulų diametras svyravo nuo 48,68±1,47 µm iki 61,78±4,33 µm, ovocitų dydis siekė nuo 13,56±5,48 µm iki 14,61±2,79 µm. Antrinių kiaušidžių folikulų diametras svyravo nuo 149,34±29,97 µm iki 209,46±52,54 µm, ovocitų diametras svyravo nuo 41,6±8,35 µm iki 63,59±4,67 µm. Visų tirtų jūrų kiaulyčių užuomazginių kiaušidžių folikulų diametras, plotas, ovocitų diametras ir plotas, ovocitų branduolių diametras ir plotas, folikulinių ląstelių aukštis ir plotis bei pamatinės membranos storis buvo panašūs. Ištyrus kiaušidžių pirminių folikulų diametras ir plotas, folikuluose esančių ovocitų diametras, folikulinių ląstelių aukštis ir plotis bei pamatinės membranos plotis buvo panašus ir reikšmingai nesiskyrė (P≥0,05). Tirtų 3 jūrų kiaulyčių, kurių amžius 3 metai, kiaušidžių antrinių folikulų diametras ir plotas, folikulinių ląstelių aukštis ir plotis ir spindulinio vainiko storis buvo panašūs.
6 Summary
Comparison and characteristic of various stages guinea pigs’ ovarian follicles The author: Živilė Zakarauskaitė
Supervisor: doc. dr. Vidmantas Lasys
Master ending work includes 43 pages, 35 pictures, to write the work was used 32 literary sources.
The aim of this work was to investigate morphometric features of different stages ovarian follicles and oocytes in 3 years old three guinea pigs. 3 guinea pigs‘ preparation was performed in the LSMU Pathology center, was taken required material for the research. Histological preparations laying in were performed in the Anatomy and Physiology department. Preparations were used perform microscopic images using histological image analyzer (microscope) „Olympus DP72 BX63“. Using UTHSCSA Image Tool for Windows Version 3 program was performed 3 guinea pigs, with age 3 years, primordial, primary and secondary ovarian follicles’, oocytes’, oocyte nucleis’, follicular cells’ and basement membranes’ morphometric measurements. Statistical analysis of the data performed using the statistical program ANOVA (Statistical Version 10, Stat Soft inc.). Our research showed, that 3 years old guinea pigs‘ primordial ovarian follicle diameter ranged from 23,22±2,62 µm till 26,16±3,58 µm, oocyte diameter ranged from 6,26±1,13 µm till 7,37±0,51 µm. Primary ovarian follicle diameter ranged from 48,68±1,47 µm till 61,78±4,33 µm, oocyte size was from 13,56±5,48 µm till 14,61±2,79 µm. Secondary ovarian follicle diameter ranged from 149,34±29,97 µm till 209,46±52,54 µm, oocyte diameter ranged from 41,6±8,35 µm till 63,59±4,67 µm. All guinea pigs primordial follicles’ diameter and area, oocytes’ diameter and area, oocytes’ nuclei diameter and area, follicular cells’ height and width, basement membranes’ thickness were similar. Primary ovarian follicles’ diameter and area, oocytes’ diameter, follicular cells’ height and width, basement membranes’ thickness were similar and did not differ significantly (P≥0,05). Secondary ovarian follicles’ diameter and area, follicular cells’ height and width and radiant crowns’ thickness were similar.
7 ĮVADAS
Biologiniai eksperimentai su jūrų kiaulytėmis buvo pradėti daryti XVII amžiuje. XIX ir XX amžiuje šie gyvūnai buvo dažnai naudojami kaip organizmo modelis, tačiau ilgainiui jas pakeitė kiti graužikai tokie kaip pelės ir žiurkės. Jūrų kiaulytės ir toliau naudojamos tyrimuose, dažnai naudojamos žmonių medicininiuose eksperimentuose, kadangi turi daug tapatumų su žmogumi, dažniausiai atliekami tyrimai susiję su cukriniu diabetu, tuberkulioze, skorbutu bei nėštumo komplikacijomis.
Pirmieji moksliniai eksperimentai su jūrų kiaulytėmis buvo atlikti XVII amžiuje. Šių mokslinių eksperimentų metu buvo ištyrinėta jūrų kiaulyčių anatominė struktūra, šiuos tyrimus atliko Italijos biologai Marcello Malpighi ir Carlo Fracassati (Guerrini, Anita 2003).
Graužikų organizmo sistemos yra pakankamai gerai ištyrinėtos. Dėl šios priežasties ši gyvūnų grupė yra plačiai naudojama detaliau tyrinėti ovocitų augimą, folikulų vystymąsi ir jų funkcionavimą (Sadeu ir kt., 2007).
Moksliniai tyrimai susiję su jūrų kiaulyčių kiaušidėmis nėra dažni ir būtent apie šių graužikų anatominius bei histologinius ypatumus nėra daug duomenų. Didžiąją dalį mokslinių tyrimų, susijusių su jūrų kiaulytėmis, apima kiaušidžių cistų nagrinėjimas bei paplitimas šių gyvūnų tarpe. Taip pat nagrinėjama folikulų atrezija. Dažniau moksliniams tyrimams naudojami graužikai yra žiurkės bei pelės. Tačiau tiek jūrų kiaulytės, tiek ir kiti graužikai priskiriami žinduoliams, kurių lytinis ciklas bei lytiniai anatominiai ir histologiniai ypatumai yra panašūs ir turi daug bendro.
Šio darbo metu nagrinėjome šios rūšies graužikų kiaušidžių folikulų struktūrą bei folikulų ir jų sudedamųjų dalių morfometriją. Kaip ženkliai gali skirtis tos pačios amžiaus grupės jūrų kiaulyčių patelių skirtingų stadijų folikulai.
Darbo tikslas:
Ištirti 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių folikulų ir jų ovocitų morfometrinius ypatumus. Darbo uždaviniai:
1. Ištirti 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių užuomazginių folikulų ir jų ovocitų bei juose esančių branduolių morfometrinius ypatumus.
2. Ištirti 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų ir jų ovocitų bei juose esančių branduolių morfometrinius ypatumus.
3. Ištirti 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų ir jų ovocitų bei juose esančių branduolių morfometrinius ypatumus.
8 1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Jūrų kiaulytė
Didžiausią ir įvairiausią žinduolių dalį apima graužikai. Jiems galima priskirti net 1700 skirtingų rūšių (Besselsen, 2002). Jūrų kiaulytė (Cavia porcellus) priklauso graužikų rūšiai, kuri priskiriama Caviidae šeimai ir Cavia genčiai. Nepaisant šio gyvūno pavadinimo šie žinduoliai nepriklauso kiaulių šeimai ir nėra kilę iš jūros. Jūrų kiaulytės yra kilusios iš Andų kalnų. Naujausi biocheminiai bei hibridizacijos tyrimai parodė, kad jos yra Cavia aperea, Cavia fulgida, ir Cavia tschudii, jūrų kiaulyčių kilusių iš Pietų Amerikos, prijaukinti palikuonys, todėl jos negali išgyventi natūralioje laukinėje gamtoje (Weir, 1974; Nowak, 1999). Naujausi molekulinių žymenų tyrimai, papildomai tiriant dabartinių ir mumifikuotų šios rūšies gyvūnėlių kaukolę ir skeleto morfologiją, atskleidė, kad jūrų kiaulytė artimiausia Cavia tschudii protėviui (Dunnum ir Salazar-Bravo, 2010).
Jūrų kiaulytė yra palyginti didelis graužikas, kuris gali sverti nuo 700 – 1200 gramų, o jų ilgis gali siekti nuo 20 – 25 centimetrų (Vanderlip, 2003). Jūrų kiaulytės gali veistis ištisus metus, visliausios jos būna pavasarį, jos gali atsivesti penkias vadas jauniklių per metus (Nowak, 1999). Jūrų kiaulyčių nėštumas trunka nuo 59 – 72 dienų, vidutinis nėštumo periodas 63 – 68 dienos (National Resource Council, 1996). Patelės lytiškai subręsta būdamos 60 – 90 dienų amžiaus. Po vados atvedimo jau po 6 – 48 valandų jūrų kiaulyčių patelės gali būti iš naujo apvaisintos (Richardson, 2000).
1.2. Patelių lytiniai organai
Jūrų kiaulyčių lytinis aparatas susideda iš penkių anatominių dalių. Pirma anatominė dalis tai makštis (vagina), makštis kontaktuoja su išore bei patelės vidiniais lytiniais takais, jūrų kiaulyčių patelės turi makšties plėvę, kuri atsidaro poravimosi ir jauniklių vedimo metu, makšties plėvė skiria patelės vidinius anatominius takus nuo aplinkos. Sekantis organas tai gimda (uterus), kuri yra dviragė. Ši sudaryta iš gimdos kaklelio, kūno bei dviejų ragų. Gimdos kaklelis atsiveria į makšties prieangį. Gimdos ragus su kiaušidę jungia kiaušintakis (tuba uterine). Ant pasaito (mesovarium), kaudolateraliai inkstų, kabo jūrų kiaulyčių patelių kiaušidės (ovarium). Jose vyksta vienas iš svarbiausių procesų - ovogenezė. Jūrų kiaulytės turi vieną porą spenių, kurie išsidėstę kirkšnies srityje (J. Žymantienė ir kt., 2008).
9 1.3. Lytinis ciklas
Lytinis ciklas yra suskirstytas į keturis etapus. Pirmasis tai priešrujis (proestrus), antrasis - ruja (oestrus), trečiasis – poovuliacinis (metoestrus) etapas, šis dar suskirstytas į dvi fazes: porujo pirmoji fazė ir porujo antroji fazė, po šių etapų vėl seka priešrujo fazė, viskas vyksta nenutrūkstamai ir cikliškai (Gulinello, 2002). Vienas iš svarbiausių lytinio ciklo etapų tai ruja (oestrus). Jūrų kiaulyčių ruja trunka nuo 15 iki 17 dienų. Rujos etapas prasideda iškart po ovuliacijos (Sadeu ir kt., 2007). Šių graužikų kiaušidžių folikulų augimas yra dvifazis. Bland (1980) atliko tyrimus su šiais gyvūnais, tyrime dalyvavo dvi jūrų kiaulyčių grupės, vieną grupę sudarė 8, o kitą 7 patelės. Vienos grupės jūrų kiaulyčių kiaušidės pasiekė savo augimo kulminacinį tašką 10 - 11 rujos dieną ir siekė 853±13 μm dydį, o kitos grupės kiaušidžių folikulų augimas sustojo prasidėjus ovuliacijai ir siekė 724±5 μm (P< 0-0,1).
1.4. Kiaušidė (ovary)
Kiaušidės paviršius sudarytas iš pavienių kubiškųjų epiteliocitų, kurie vietomis gali būti plokštesni arba įgauti stulpiškųjų epiteliocitų formą, tačiau tai pavieniai reiškiniai. Šis kubiškųjų epiteliocitų sluoksnis vadinamas kiaušidės paviršiniu epiteliu (epithelium supperficiale) (1 pav.). Balzganasis dangalas (tunica albugnea) sudaro pamatą paviršiniam kiaušidės epiteliui. Tai antrasis pagal eilę sluoksnis dengiantis kiaušidę ir sudarytas iš glaudžiojo netaisyklingojo jungiamojo audinio (textus connectivus compactus irregularis) (Padaiga ir kt., 2006; Ozdemir ir kt., 2005).
10 Kiaušidę sudaro dvi pagrindinės zonos – kiaušidės žievė (cortex ovarii) ir kiaušidės šerdis (medulla ovari) (2 pav.). Žievėje galima rasti daug, tik pradedančių formuotis, užuomazginių kiaušidės folikulų (folliculus ovaricus primordialis) ir pirminių kiaušidės folikulų (folliculus ovaricus primarius), taip pat antrinių kiaušidės folikulų (folliculus ovaricus secundarius), tretinių kiaušidės folikulų (folliculus ovaricus tertiarius) ir atrezinių folikulų (folliculi atretici). Visus šiuos žievės darinius supa tankus kraujagyslių tinklas, kuris maitina kiaužidėje esančius folikulus ir folikulų ovocitus. Kiaušidės šerdį sudaro kiaušidės griaučiai (stroma ovarii). Griaučiai sudaryti iš intersticinio audinio (textus interstitialis), kraujagyslių ir limfagyslių tinklo. Šerdis sudaryta iš netaisyklingojo jungiamojo audinio (Ozdemir ir kt., 2005).
2 pav. A - jūrų kiaulytės kiaušidės žievė; B – jūrų kiaulytės kiaušidės šerdis; (http://www.pathpedia.com)
1.5. Folikulogenezė
Folikulogenezė - procesas, kurio metu bręsta kiaušidės folikulai. Šio proceso pirminiai komponentai - somatinės ląstelės ir nesubrendę ovocitai, kurie palaipsniui, augant folikului, bręsta ir didėja. Folikulogenezės metu maži užuomazginiai folikulai augdami etapais pasiekia gulitinį ketvirtąjį lygį ir virsta pūsliniais (tretiniais) kiaušidės folikulais (folliculus ovaricus vesiculosus (tertiarius)).
B A
11 Folikulogenezė yra pagrindiniai folikulų augimo etapai, kurie vyksta jūrų kiaulyčių organizme. Jos metu folikuluose vyksta morfologiniai jų pokyčiai (Sadeu ir kt., 2007).
Jūrų kiaulyčių folikulogenezė panaši į žmogaus organizme vykstančią folikulogenezę. Daugumos užuomazginių folikulų formavimasis prasideda vaisiaus vystymosi laikotarpyje, didžioji dalis jų vystosi toliau ir tampa daugiasluoksniais kiaušidės folikulais. Jauniklių atvedimo metu ir dvi dienos po atvedimo jau būna susiformavę keletas antrinių kiaušidės folikulų (Bookhout, 1945). Folikulų brendimas vyksta etapais (Bland, 1945; Hutz ir kt., 1990).
1.6. Kiaušidės folikulų klasifikacija
Kiaušidėje esantys folikulai pagal dydį bei augimo etapą suskirstyti į keturias grupes, pirmai grupei priskiriama užuomazginiai, antrai pirminiai, trečiai antriniai, o paskutiniąjai grupei tretiniai, arba dar kitaip vadinami pūsliniai, kiaušidės folikulai.
Walsh (1917) suskirstė jūrų kiaulyčių folikulus į mažus, kurių diametras svyruoja nuo 130 iki 215 μm, vidutinius, kurių diametras svyruoja nuo 450 iki 506 μm ir didelius, kurių dydis siekia nuo 611 iki 788 μm.
Deanesly (1972) kiaušidžių folikulų morfometrinius matavimus atliko skirtingo svorio jūrų kiaulytėms. Jūrų kiaulyčių, kurių svoris siekė 80 – 90 gramų folikulų diametras buvo 160 - 190 μm, 125 gramų svorio patelių kiaušidžių folikulų diametras siekė 215 μm dydį. Sveriančių 150 gramų jūrų kiaulyčių kiaušidžių folikulų diametras buvo 420 μm, 200 gramų svorio jūrų kiaulyčių kiaušidžių folikulų diametras svyravo nuo 540 iki 700 μm, o 225 gramų svorio jūrų kiaulyčių folikulų diametras siekė 780 μm.
Pasak Sadeu ir kt. (2007) rujos etapo metu 10 – 11 ciklo dieną folikulai pasiekę savo didžiausią diametrą. Buvo atlikti morfometriniai jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių ir antrinių folikulų matavimai. Tyrimų rezultatai parodė, kad pirminių kiaušidės folikulų diametras buvo 67,9±10,1 μm, o folikuluose esančių ovocitų dydis 44,8±6,2 μm. Antrinius kiaušidžių folikulus suskirtė į mažus, vidutinio dydžio ir didelius. Mažų antrinių folikulų dydis buvo 96,5±11,9 μm, juose esantys ovocitai 52,2±6,0 μm dydžio. Vidutinio dydžio antrinių kiaušidžių folikulų dydis siekė 136,5±19,4 μm, ovocitų dydis buvo 59,3±6,7 μm. Didelių antrinių kiaušidžių folikulų dydis buvo 188,9±29,7 μm, folikuluose esančių ovocitų dydis buvo 72,8±9,1 μm. Tretinių kiaušidžių folikulų dydis buvo 231,0±56,1 μm, ovocitų diametras 78,9±9,3 μm.
12 1.7. Užuomazginis kiaušidės folikulas (folliculus ovaricus primordialis)
Pagrindinė užuomazginio kiaušidės folikulo dalis yra ovocitas, kuris susidaro mejozės pirmojo dalijimosi metu (Padaiga ir kt., 2006). Jūrų kiaulytės nėštumas trunka 68 dienas, šio periodo metu vyksta ląstelių formavimasis mejozės dalijimosi būdu, kuris prasideda 35 vaikingumo dieną, o pirmieji užuomazginiai kiaušidės folikulai susiformuoja ir tampa matomi 48 vaikingumo dieną (Deansley, 1975). Visi užuomazginiai kiaušidės folikulai būna išsidėstę kiaušidės žievės periferinėje dalyje po balzganuoju dangalu (3 pav.). Folikulų centre matomas pirminis ovocitas, jį dengia kūbiškosios folikulinės ląstelės, kurias supa pamatinė membrana (Wallace ir Kelsey, 2010; Fortune ir kt., 2000; Ozdemir ir kt., 2005).
3 pav. Užuomazginiai kiaušidės folikulai (http://www.uoguelph.ca)
1.8. Pirminis kiaušidės folikulas (folliculus ovaricus primarius)
Jūrų kiaulyčių kiaušidėse galima rasti pirminių folikulų sankaupų, pirminius folikulus sudaro pirminis ovocitas apgaubtas vieno sluoksnio kubiškųjų arba stulpiškųjų epiteliocitų, kuriuos dengia pamatinė membrana (4 pav.). Pirminiai ovocitai susidaro pirmojoje mejozės profazės stadijoje iki
13 ovuliacijos pradžios arba iki lytinio ciklo išnykimo. Pirminių ovocitų susiformavimas vyksta ankstyvąjame naujagimio formavimosi etape (Hirshfield, 1991; Ozdemir ir kt. 2005).
Folikulai palieka savo pirminę lokalizaciją ramybės būsenoje ir pradeda augti. Signalai, kurie gali įtakoti jų perėjimą iš ramybės būsenos į tolesnio augimo etapą, nėra tiksliai išaiškinti. Folikulas auga tol kol pasiekia ovuliacijos stadiją, jei folikulas neovuliuoja įvyksta jo atrezija. Tik nedidelis skaičius augančių folikulų ovuliuoja, kiti nyksta ir sudaro atrezinį kūną (Fortune, 1994).
4 pav. Pirminis kiaušidės folikulas
1.9. Antrinis kiaušidės folikulas (folliculus ovaricus secundarius)
Antrinį kiaušidės folikulą sudaro pirminis ovocitas, kurio dydis, skersmuo ir plotas, palyginus su užuomazginio ir pirminio kiaušidės folikulo pirminiu ovocitu, yra žymiai didesnis (5 pav.). Pirminį ovocitą gaubia daugiasluoksnis stulpiškasis epitelis, sudarytas iš sulpiškųjų folikulinių ląstelių. Pirminį ovocitą gaubiantys epiteliocitai sudaro spindulinį vainiką (corona radiata). Jie sintetina skaidriąją zoną (zona pellucida). Folikului besiformuojant tarp epiteliocitų atsiranda ertmės, šioms susiliejus susidaro folikulinė ertmė (antrum folliculare). Toliau augant formuojasi tretinis kiaušidės folikulas (folliculus ovaricus tertiarius) (Ozdemir ir kt., 2005).
14 5 pav. A - antrinis kiaušidės folikulas (http://www.uoguelph.ca) B – antrinis kiaušidės
folikulas
1.10. Pūslinis kiaušidės folikulas (folliculus ovaricus vesiculosus)
Pūslinį kiaušidės folikulą (6 pav.) sudaro pirminis ovocitas, kuris apgaubtas krūvelėmis susitelkusių stulpiškųjų epiteliocitų. Granuliacinį sluoksnį supa apvalkalėlis, kuris pūsliniame kiaušidės folikule diferencijuoja į du sluoksnius: pirmasis - vidinis kraujagyslinis apvalkalėlis ir išorinis pamatinis apvalkalėlis. Vidinio apvalkalėlio ląstelės išsidėsčiusios verpstės forma. Išorinį apvalkalėlį sudaro plonas netaisyklingojo jungiamojo audinio sluoksnis kartu su koncentriškai, aplink vidinį apvalkalėlį, išsidėsčiusiais fibroblastais (Ozdemir ir kt., 2005).
6 pav. Pūslinis kiaušidės folikulas A
15 1.11. Atreziniai folikulai (folliculi atretici)
Kiaušidėje vyksta atrezija, kurios metu susidaro atreziniai folikulai, dar kitaip vadinami žūstančiais folikulais (Padaiga ir kt., 2006) (7 pav.). Manyta, jog folikulų atrezija gali įvykti bet kurioje folikulo augimo fazėje, tačiau paaiškėjo jog atrezija vyksta visuose etapuose skirtingai, t.y. vienuose folikulo augimo etapuose šis procesas pasireiškia dažniau, kituose rečiau (Fortune, 1994). Pasak Hirshfield (1991) dauguma folikulų pasiekę antrąjį formavimosi etapą jau būna nugyvenę didžiąją savo egzistavimo laiko dalį ir pasiekę savo maksimalų dydį.
Pradinis folikulų augimas vyksta lėtai, tačiau kai susiformuoja ertmė šis procesas paspartėja. Atrezijos proceso metu folikulai gali keisti dydį ir tokiu būdu sustiprinti ovuliaciją. Dauguma folikulų tampa atreziški po šios stadijos. Folikulų gausoje išsiskiria dominuojantys folikulai, kadangi tik dominuojantys folikulai gali dalyvauti tolesniame folikulų augime ir pasiekti ovuliacijos stadiją. Folikulus neigiamai veikia prasta mityba, o jų dominavimui, kitų folikulų atžvilgiu, turi įtakos Folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) išskyrimo kiekis. Teka ląstelių išskiriamas androgenų kiekis ir grūdėtųjų ląstelių sugebėjimas androgenus paversti estradioliu taip pat įtakoja folikulų dominavimą (Fortune, 1994).
7 pav. A – atrezinis folikulas; B – besivystantis folikulas; C – Paviršinis epitelis; D – balzganasis dangalas;
B
A
C D
16 2. TYRIMO METODIKA
Tyrimai buvo atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete (LSMU) veterinarijos akademijoje. LSMU Patologijos centre buvo atliktas trijų jūrų kiaulyčių preparavimas ir paimta tyrimams reikalinga medžiaga. Histologinių preparatų ruošimas bei tyrimas buvo atliktas Anatomijos ir Fiziologijos katedroje. Moksliniai tyrimai buvo atlikti laikantis „Lietuvos Respublikos Gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo“, leidimo Nr. 0149, 2006-04-24.
Histologinių preparatų gamyba apima daug svarbių etapų. Pirmas etapas medžiagos paėmimas, fiksavimas formaline, sekantis etapas paruošimas pjaustymui, pjaustymas, nuopjovų dažymas ir uždengimas, žymėjimas (Kublickienė, 1987).
Preparatams pagaminti skirta medžiaga buvo paimta iš trijų jūrų kiaulyčių, kurių amžius buvo trys metai, o svoris 700 gramų. Jūrų kiaulytės buvo eutanazuotos 0,3 ml Dolethal injekcija į širdį (0,75 ml/kg).
2.1. Histologinės medžiagos fiksavimas
Paimtas jūrų kiaulyčių kiaušides fiksavome 10% formalinu, svarbu kad histologinė medžiaga formaline būtų fiksuojama ne trumpiau nei 24 valandas. Pasak Laurinavičienės A. (2007) fiksavimas tai procesų seka, kurios metu audiniai išsaugomi nuo irimo ir parengiami sekantiems etapams.
2.2. Histologinės medžiagos paruošimas pjaustymui
Medžiagą, fiksuota formaline, reikia paruošti pjaustymui, pirmas etapas apima plovimą vandeniu, šis procesas truko 12 valandų. Antras etapas tai vandens pašalinimas - dehidratavimas. Šis procesas buvo atliktas naudojant didėjančios koncentracijos etanolį. Dehidracija 70º etanoliu 24 valandas, 96º I etanoliu 1 valandą, 96º II etanoliu 1 valandą, 100º (absoliutus) I etanoliu 1 valandą, 100º (absoliutus) II etanoliu 1 valandą (Kublickienė, 1978).
Prieš pradedant pjaustyti mikrotomu fiksuota medžiaga buvo sustandinta parafinu. Tai kruopštus ir sudėtingas etapas. Visų pirma histologinė medžiaga 30 minučių įmerkiama į absoliutaus etanolio ir chloroformo mišinį. Vėliau medžiaga perkeliama į gryną chloroformą 30 minučių. Trečio etapo metu fiksuota medžiaga įmerkiama į chloroformo ir parafino mišinį (1:1) (58ºC) ir ten laikoma 45 minutes. Galiausiai medžiaga perkeliama į parafiną I (58ºC) 60 minučių ir 90 minučių į parafiną II (58ºC).
17 Išimta iš parafino II histologinė medžiaga dedama į keturkampes formeles, kuriose yra nedidelis kiekis ištirpusio parafino. Papildomai dar užpilama nedidelis kiekis ištirpinto parafino, tuomet uždedamas plastikinis blokelio laikiklis ir paliekama kol sustings. Kuomet blokelis sustingsta išimamas iš formelės.
2.3. Histologinės medžiagos pjaustymas
Parafininis blokelis su patologine medžiaga buvo atvėsinama ant šaldomo stalelio, kad įgytų reikiamą mėginio tvirtumą. Iš suformuotų parafininių blokų buvo pjauti 4 µm storio parafininiai audinių pjūviai (mikropjūviai), naudojant „Sakura Accu-Cut® SRM ™, Japonija“ pusiau automatinį rotacinį mikrotomą. Atpjautas pjūvis perneštas adatėlių pagalba į 37 ºC temperatūros termostatinę vandens vonelę ir pjūvis buvo tiesinamas. Vandens vonelėje parafininių pjūvių juosta ištiesinta ir padalinta atskirais pjūviais, kurie vėliau perkelti ant objektinio stiklelio. Objektinis stiklelis su pjūviu 5 val. perkeltas ant reguliuojamos kaitinimo plokštės „Thermo Scientific Hotplate“, kurios temperatūra 37 ºC. Vėliau objektiniai stikleliai sudėti į termostatą „Binder“ 24 valandoms 37 ºC temperatūroje.
2.4. Histologinės medžiagos dažymas
Po 24 valandų išdžiūvę termostate parafininiai audinių pjūviai buvo dažyti naudojant histologinių pjūvių automatinį dažymo įrenginį „Sakura Tissue-Tek® DRS ™, Japonija“.
Dažymas Hematoksilinu - eozinu:
1. Pjūvio deparafinavimas ksilenu - 13 min., jo metu yra pašalinamas parafinas iš pjūvio; 2. Pjūvio dehidravimas izopropanolio alkoholiu - 2 min., 96° etilo alkoholiu - 4 min. Prieš dažymą skalaujama vandeniu, kuris pašalina alkoholį;
3. Pjūvio dažymas hematoksilinu - 10 min., merkiamas į vandenį - 5 min., etilo alkoholis 96°- 2 min., vanduo - 5 min., eozino dažai - 5 min., vanduo - 1 min.;
4. Pjūvių dehidratavimas 96° etilo alkoholiu - 1 min., izopropolio alkoholiu - 1 min.;
5. Pjūvių skaidrinimui naudojamas ksilenas - 1 min. Nudažius, objektiniai stikleliai dengiami ilgalaikio saugojimo dengiamąja terpe „Thermo Shandon Consul-Mount histology formulatio“.
2.5. Histologinių preparatų tyrimas
Mėginiai buvo analizuojami ir diagnozuojami „Olympus BX41“ mikroskopu. Mikroskopinės nuotraukos darytos naudojant histologinių vaizdų analizatorių (mikroskopą) „Olympus DP72 BX63“. Folikulai sugrupuoti į užuomazginius, pirminius ir antrinius.
18 Naudojant UTHSCSA Image Tool for Windows Version 3 programą buvo atlikti šių trijų suskirstytų grupių folikulų, jų ovocitų, branduolių, folikulinių ląstelių ir pamatinės membranos morfometriniai matavimai. Iš kiekvienos jūrų kiaulytės kiaušidžių matuota 5 užuomazginiai, 4 pirminiai ir po 3 antrinius folikulus.
Atlikti matavimai: užuomazginių ir pirminių folikulų diametras bei jų plotas, ovocitų diametras ir jų plotas, ovocito branduolio diametras ir jo plotas, pamatinės membranos storis ir trijų folikulinių ląstelių ilgis bei plotis. Taip pat tirta antrinių folikulų diametras bei plotas, juose esančių ovocitų diametras ir plotas, branduolių diametras ir plotas, pamatinės membranos storis, skaidriosios zonos storis ir trijų folikulinių ląstelių ilgis ir plotis bei sluoksnių skaičius.
19 3. REZULTATAI
3.1. Užuomazginių kiaušidžių folikulų morfometriniai matavimai
8 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių užuomazginių kiaušidžių folikulų diametras, µm Tyrimai parodė, kad pirmos jūrų kiaulytės užuomazginių kiaušidžių folikulų diametras buvo didžiausias Nr. 1 - 26,16±3,58 µm, antros jūrų kiaulytės mažiausias Nr. 2 - 23,22±2,62 µm, o trečios vidutinio dydžio Nr. 3 - 25,04±1,12µm. Jūrų kiaulyčių užuomazginių kiaušidės folikulų diametras reikšmingai nesiskyrė P≥0,05 (8 pav.).
20 9 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių užuomazginių kiaušidžių folikulų plotas, µm²
Ištyrus užuomazginių kiaušidžių folikulų plotą paaiškėjo, jog didžiausias buvo jūrų kiaulytės Nr. 1 – 559,82±72,94 µm², trečios šiek tiek mažesnis Nr. 2 – 499,23±18,38 µm², o antros mažiausias Nr. 2 – 425,04±18,38 µm². Jūros kiaulyčių kiaušidžių užuomazginių folikulų plotas nesiskyrė P≥0,05 (9 pav.).
10 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių užuomazginių kiaušidžių folikulų ovocitų diametras, µm
21 Užuomazginių kiaušidžių folikulų ovocitų diametras buvo panašus P≥0,05. Nr. 3 – 14,61±2,79 µm tai didžiausias diametras, Nr. 1 mažesnis 14,26±1,97 µm, mažiausias Nr. 2 – 13,56±5,48 µm (10 pav.).
11 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių užuomazginių kiaušidžių folikulų ovocitų plotas, µm²
Ištyrus užuomazginių kiaušidžių folikulų ovocitų plotą šis buvo panašus P≥0,05. Trečios jūrų kiaulytės jis buvo didžiausias 169,27±14,89 µm², pirmos jūrų kiaulytės jis buvo mažesnis 160,96±94,65 µm², mažiausias antros jūrų kiaulytės 147,83±26,40 µm² (11 pav.).
22 12 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių užuomazginių kiaušidžių folikulų ovocitų
branduolių diametras, µm
Užuomazginių kiaušidžių folikulų ovocitų branduolių diametras didžiausias buvo jūrų kiaulytės Nr. 3 – 7,37±0,51 µm, šiek tiek mažesnis jūrų kiaulytės Nr. 1 – 6,36±3,68 µm, o mažiausias Nr. 2 – 6,26±1,13 µm. Diametras nesiskyrė P≥0,05 (12 pav.).
13 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių užuomazginių kiaušidžių folikulų ovocitų branduolių plotas, µm²
23 Ištyrus ovocitų branduolių plotą paaiškėjo, jog jūrų kiaulytės Nr. 3 jis didžiausias – 42,92±7,23 µm². Jūrų kiaulytės Nr.1 vidutinis - 34,03±3,43 µm², mažiausias jūrų kiaulytės Nr. 2 - 21,95±2,18 µm². Ovocitų branduolių plotas nesiskyrė P≥0,05 (13 pav.).
14 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių užuomazginių folikulų folikulinių ląstelių aukštis, µm
Kiaušidžių folikulų folikulinių ląstelių aukštis reikšmingai nesiskyrė P≥0,05. Pirmos jūrų kiaulytės jis buvo didžiausias, antros šiek tiek mažesnis, trečios mažiausias. Nr. 1 – 2,30±0,45 µm, Nr. 2 – 1,94±0,03 µm, Nr. 3 – 1,72±0,27 µm (14 pav.).
24 15 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių užuomazginių folikulų folikulinių ląstelių plotis, µm
Ištyrus folikulinių ląstelių plotį paaiškėjo, kad jis skiriasi reikšmingai P≤0,05. Pirmos jūrų kiaulytės jis buvo didžiausias – 6,60±1,08 µm, antros mažiausias – 4,83±0,27 µm, o trečios vidutinis – 5,34±0,80 µm (15 pav.).
16 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių užuomazginių folikulų pamatinės membranos storis, µm
25 Pamatinės membanos storis reikšmingai nesiskyrė P≥0,05. Jūrų kiaulytės Nr. 2 ji buvo storiausia 1,22±0,01 µm. Jūrų kiaulytės Nr. 1 šiek tiek plonesnė 1,17±0,02 µm, jūrų kiaulytės Nr. 3 ploniausia pamatinė membrana – 0,97±0,12 µm (16 pav.).
3.2. Pirminių kiaušidžių folikulų morfometriniai matavimai
17 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų diametras, µm
Ištyrus pirminių kiaušidžių folikulų diametrą jis nesiskyrė P≥0,05. Trečios, 3 metų amžiaus, jūrų kiaulytės kiaušidžių pirminių folikulų diametras buvo didžiausias 61,78±4,33 µm, antros šiek tiek mažesnis 54,09±1,19 µm, o trečios jūrų kiaulytės pirminių folikulų diametras mažiausias 48,68±1,47 µm (17 pav.).
26 18 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų plotas, µm²
3 metų amžiaus jūrų kiaulytės Nr. 1 pirminių kiaušidžių folikulų plotas buvo mažiausias 1869,12±85,67 µm², 3 metų amžiaus jūrų kiaulytės Nr. 2 pirminių kiaušidės folikulų plotas buvo šiek tiek didesnis 2367,49±94,85 µm², o jūrų kiaulytės Nr. 3 didžiausias – 3021,71±40,65 µm². Visų trijų jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų plotas nesiskyrė P≥0,05 (18 pav.).
27 Ištyrus jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų ovocitų diametrus jie skyrėsi P≤0,05. Jūrų kiaulytės Nr. 3 jis buvo didžiausias - 36,85±1,97 µm, Nr. 1 šiek tiek mažesnis - 30,31±1,99 µm, o Nr. 2 mažiausias - 23,87±4,74 µm (19 pav.).
20 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų ovocitų plotas, µm² Jūrų kiaulyčių pirminių kiaušidžių folikulų ovocitų plotas skyrėsi reikšmingai P≤0,05. Trečios jūrų kiaulytės jis buvo didžiausias – 1077,29±65,97 µm², pirmos šiek tiek mažesnis – 732,92±39,05 µm², antros jūrų kiaulytės jis buvo mažiausias – 475,013±79,94 µm² (20 pav.).
28 21 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų ovocitų branduolių diametras, µm
Ištyrus ovocitų branduolių diametrus paaiškėjo, kad didžiausias buvo trečios jūrų kiaulytės – 14,84±1,01 µm, pirmos jūrų kiaulytės šiek tiek mažesnis – 13,24±4,24 µm, antros jūrų kiaulytės mažiausias – 9,18±2,85 µm. Branduolių diametras skyrėsi P≤0,05 (21 pav.).
22 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų ovocitų branduolių plotas, µm²
29 Ovocitų branduolių plotas skyrėsi P≤0,05. Jūrų kiaulytės Nr. 3 didžiausias – 178,75±51,86 µm², Nr. 1 vidutinis – 140,06±18,20 µm², Nr. 2 mažiausias – 67,76±6,06 µm² (22 pav.).
23 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų folikulinių ląstelių plotis, µm
Ištyrus, trijų metų amžiaus, jūrų kiaulyčių pirminių kiaušidžių folikulų folikulinių ląstelių plotį paaiškėjo, jog jis reikšmingai nesiskyrė P≥0,05. Trečios jūrų kiaulytės folikulinių ląstelių plotis buvo didžiausias – 4,24±0,19 µm, pirmos jūrų kiaulytės vidutinis – 3,68±0,55 µm, o antros mažiausias – 3,55±0,01 µm (23 pav.).
30 24 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų folikulinių ląstelių aukštis, µm
Folikulinių ląstelių aukštis nesiskyrė P≥0,05. Didžiausias jis buvo antros jūrų kiaulytės – 5,19±0,54 µm, trečios mažesnis – 4,75±2,02 µm, pirmos jūrų kiaulytės mažiausias – 4,15±0,10 µm (24 pav.).
25 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių pirminių folikulų pamatinės membranos storis, µm
31 Pamatinės membranos storis skyrėsi P≤0,05. Storiausia pamatinė membrana buvo antros jūrų kiaulytės Nr. 2 – 2,11±0,07 µm. Pirmos plonesnė Nr. 1 – 1,79±0,01 µm, o ploniausia trečios jūrų kiaulytės Nr. 3 – 1,45±0,02 µm (25 pav.).
3.3. Antrinių kiaušidžių folikulų morfometriniai matavimai
26 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų diametras, µm
Ištyrus trijų metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų diametrą jis nesiskyrė P≥0,05. Didžiausias jis buvo trečios jūrų kiaulytės (209,46±52,54 µm), antros jūrų kiaulytės jis buvo šiek tiek mažesnis (160,183±14,75 µm), mažiausias pirmos jūrų kiaulytės (149,34±29,97 µm) (26 pav.).
32 27 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų plotas, µm²
Ištyrus trijų metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų plotą paaiškėjo, jog jis nesiskyrė P≥0,05. Didžiausias jis buvo trečios jūrų kiaulytės (24971,28±640,01 µm²), vidutinis antros jūrų kiaulytės (20141,99±119,12 µm²), mažiausias jis buvo pirmos jūrų kiaulytės (19769,28±212,18 µm²) (27 pav.).
33 Antrinių kiaušidžių folikulų ovocitų diametras buvo didžiausias trečios jūrų kiaulytės – 63,59±4,67 µm, antros šiek tiek mažesnis – 53,08±12,16 µm, mažiausias pirmos jūrų kiaulytės – 41,6±8,35 µm. Ovocitų diametras skyrėsi P≤0,05 (28 pav.).
29 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų ovocitų plotas, µm² Folikulų ovocitų plotas skyrėsi P≤0,05. Didžiausias jis buvo trečios jūrų kiaulytės – 2538,98±144,24 µm², vidutinis antros jūrų kiaulytės – 2311,69±360,23 µm², mažiausias pirmos jūrų kiaulytės – 1617,23±60,14 µm² (29 pav.).
34 30 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušdžių antrinių folikulų ovocitų branduolių diametras, µm
Ovocitų branduolių diametras skyrėsi P≤0,05. Didžiausias jis buvo trečios jūrų kiaulytės (17,20±8,65 µm), antros jūrų kiaulytės šiek tiek mažesnis (15,56±8,65 µm), o mažiausias pirmos jūrų kiaulytės (12,53±6,22 µm) (30 pav.).
31 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų ovocitų branduolių plotas, µm²
35 Mažiausias antrinių folikulų ovocitų branduolių plotas buvo jūrų kiaulytės Nr. 1 – 126,5±21,81 µm², vidutinis jūrų kiaulytės Nr. 2 – 194,24±49,92 µm², o didžiausias jūrų kiaulytės Nr. 3 - 277,6±81,86 µm². Ovocitų branduolių plotas skyrėsi P≤0,05 (31 pav.).
32 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų folikulinių ląstelių plotis, µm
Folikulinių ląstelių plotis skyrėsi nereikšmingai P≥0,05. Didžiausias folikulinių ląstelių plotis buvo trečios jūrų kiaulytės folikuluose (4,69±0,17 µm), šiek tiek mažesnis antros jūrų kiaulytės folikuluose (3,98±0,07 µm), o mažiausias folikulų plotis pirmos jūrų kiaulytės folikuluose (3,74±0,25 µm) (32 pav.).
36 33 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų folikulinių ląstelių aukštis, µm
Folikulinių ląstelių aukštis nesiskyrė P≥0,05. Nr. 1 – didžiausias (5,57±1,28 µm), Nr. 3 – mažesnis (4,31±0,01 µm), Nr. 2 – mažiausias (3,83±0,21 µm) (33 pav.).
34 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų pamatinės membranos storis, µm
37 Pamatinės mebranos storis skyrėsi reikšmingai P≤0,05. Storiausia pamatinė membrana nustatyta jūrų kiaulytės Nr. 3 (4,53±1,91 µm), šiek tiek plonesnė pas jūrų kiaulytę Nr. 2 (3,21±1,38 µm), ploniausia jūrų kiaulytės Nr. 1 (2,73±0,23 µm) (34 pav.).
35 pav. 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių antrinių folikulų spindulinio vainiko storis, µm
Ištyrus trijų metų amžiaus jūrų kiaulyčių antrinių kiaušidžių folikulų spindulinio vainiko storį paaiškėjo, jog jis nesiskyrė P≥0,05. Storiausią spindulinį vainiką turėjo trečia jūrų kiaulytė – 2,71±0,78 µm, plonesnis spindulinis vainikas buvo nustatytas pirmai jūrų kiaulytei – 1,68±0,64 µm, o ploniausias antrai jūrų kiaulytei – 1,6±0,21 µm (35 pav.).
38 REZULTATŲ APTARIMAS
Tyrimo metu tirtus kiaušidžių folikulus suskirstėme į tris grupes. Pirmoji buvo užuomazginiai folikulai, antroji grupė buvo pirminiai kiaušidžių folikulai, o trečioji grupė antriniai jūrų kiaulyčių kiaušidžių folikulai. Buvo atlikti šių folikulų, juose esančių ovocitų, ovocitų branduolių, folikulų folikulinių ląstelių ir pamatinės membranos morfometriniai matavimai. Antriniuose folikuluose taip pat matuotas spindulinio vainiko storis.
Folikulogenezės metu folikulai, bei juose esantys ovocitai, auga ir didėja. Visų pirma susiformuoja užuomazginiai folikulai. Mūsų tyrimo metu buvo nustatyta, kad 3 metų amžiaus jūrų kiaulyčių kiaušidžių užuomazginių folikulų diametras svyravo nuo 23,22±2,62 µm iki 26,16±3,58 µm (P≥0,05), folikulų plotas svyravo nuo 425,04±18,38 µm² iki 559,82±72,94 µm² (P≥0,05). Užuomazginių folikulų ovocitų diametras svyravo nuo 6,26±1,13 µm iki 7,37±0,51 µm (P≥0,05), o jų plotas siekė nuo 147,83±26,40 µm² iki 169,27±14,89 µm² (P≥0,05). Pirminių kiaušidžių folikulų diametras svyravo nuo 48,68±1,47 µm iki 61,78±4,33 µm (P≥0,05), jų plotas svyravo nuo 1869,12±85,67 µm² iki 3021,71±40,65 µm² (P≥0,05). Ovocitų dydis siekė nuo 13,56±5,48 µm iki 14,61±2,79 µm. Mūsų tirtų, trijų metų amžiaus, jūrų kiaulyčių antrinių kiaušidžių folikulų diametras svyravo nuo 149,34±29,97 µm iki 209,46±52,54 µm (P≥0,05), o plotas svyravo nuo 19769,28±212,18 µm² iki 24971,28±640,01 µm² (P≥0,05). Ovocitų diametras svyravo nuo 41,6±8,35 µm iki 63,59±4,67 µm (P≤0,05), o ovocitų plotas svyravo nuo 1617,23±60,14 µm² iki 2538,98±144,24 µm² (P≤0,05). Mūsų gauti duomenys atitinka tai, jog folikulogenezės proceso metu kuomet folikulas vystosi jis palaipsniui didėja taip pat didėja ir jame esantis ovocitas.
Sadeu ir kt. (2007) atliko 2 metų amžiaus 20 Dunkin – Hartley veislės jūrų kiaulyčių, kurios svėrė nuo 562 iki 750 gramų, pirminių ir antrinių kiaušidžių folikulų morfometrinius matavimus. Tyrimų rezultatai parodė, kad pirminių kiaušidžių folikulų diametras 67,9±10,1 μm, o juose esančių ovocitų dydis 44,8±6,2 μm. Mūsų tirtų jūrų kiaulyčių pirminių folikulų diametras svyravo nuo 48,68±1,47 µm iki 61,78±4,33 µm, o ovocitų dydis siekė nuo 13,56±5,48 µm iki 14,61±2,79 µm. Tyrimų rezultatai reikšmingai nesiskyrė P≥0,05. Sadeu ir kt. (2007) antrinius kiaušidžių folikulus suskirtė į mažus, vidutinio dydžio ir didelius antrinius kiaušidžių folikulus. Mažų antrinių folikulų dydis buvo 96,5±11,9 μm, juose esantys ovocitai buvo 52,2±6,0 μm dydžio. Vidutinio dydžio antrinių kiaušidžių folikulų dydis siekė 136,5±19,4 μm, ovocitų dydis buvo 59,3±6,7 μm. Didelių antrinių kiaušidžių folikulų dydis buvo 188,9±29,7 μm, juose esančių ovocitų dydis buvo 72,8±9,1 μm. Mūsų
39 tirtų trijų metų amžiaus 3 jūrų kiaulyčių, kurių svoris buvo 700 gramų, antrinių kiaušidžių folikulų diametras svyravo nuo 149,34±29,97 µm iki 209,46±52,54 µm (P≥0,05), o juose esančių ovocitų diametras svyravo nuo 41,6±8,35 µm iki 63,59±4,67 µm (P≤0,05). Mūsų gauti duomenys sutampa su Sadeu ir kt. (2007) atliktų tyrimų gautais duomenimis.
Pirminių folikulų ovocitus gaubia kubiškosios ir stulpiškosios folikulinės ląstelės. Išmatavus jų aukštį nustatėme nuo 4,15±0,10 µm iki 5,19±0,54 µm dydį (P≥0,05), o išmatavus plotį jis svyravo nuo 3,55±0,01 µm iki 4,24±0,19 µm (P≥0,05). Taigi mūsų gauti duomenys sutampa su Ozdemir ir kt. (2005) literatūriniais duomenimis, kadangi mūsų tirtų folikulinių ląstelių morfometriniai matavimai parodė, jog folikulinės ląstelės pirminiuose folikuluose buvo stulpiškosios.
Walsh (1917) suskirstė jūrų kiaulyčių folikulus į mažus nuo 130 iki 215 μm diametro, vidutinius nuo 450 iki 506 μm diametro ir didelius nuo 611 iki 788 μm diametro. Mūsų gautus rezultatus galima būtų priskirti prie mažų folikulų, kadangi tirtų antrinių kiaušidžių folikulų diametras siekė nuo 149,34±29,97 µm iki 209,46±52,54 µm (P≥0,05).
Mūsų tirtų jūrų kiaulyčių svoris buvo 700 gramų. Didžiausių tirtų antrinių kiaušidžių folikulų diametras siekė nuo 149,34±29,97 µm iki 209,46±52,54 µm (P≥0,05). Pirminių kiaušidžių folikulų diametras svyravo nuo 48,68±1,47 µm iki 61,78±4,33 µm (P≥0,05). O užuomazginių kiaušidžių folikulų diametras svyravo 23,22±2,62 µm iki 26,16±3,58 µm (P≥0,05). Deanesly (1972) jūrų kiaulyčių folikulų morfometrinius matavimus atliko skirtingo svorio jūrų kiaulytėms. Jūrų kiaulyčių, kurių svoris siekė 80 – 90 gramų, folikulų diametras buvo 160 - 190 μm, 125 gramų svorio patelių diametras siekė 215 μm dydį. Sveriančių 150 gramų jūrų kiaulyčių kiaušidžių folikulų diametras buvo 420 μm, 200 gramų svorio nuo 540 iki 700 μm, o 225 gramų svorio kiaulyčių folikulų diametras siekė 780 μm. Mūsų gauti duomenys nesutampa su Deansley (1972) gautais duomenimis.
40 IŠVADOS
1. Ištyrus 3 jūrų kiaulyčių, kurių amžius 3 metai, užuomazginių kiaušidžių folikulų diametrą, jų plotą, folikuluose esančių ovocitų diametrą ir plotą, ovocitų branduolių diametrą ir plotą, folikulinių ląstelių aukštį bei pamatinės membranos plotį paaiškėjo, jog visi jie reikšmingai nesiskyrė ir buvo panašūs (P≥0,05). Folikulinių ląstelių plotis skyrėsi reikšmingai (P≤0,05).
2. Ištyrus 3 jūrų kiaulyčių, kurių amžius 3 metai, pirminių kiaušidžių folikulų diametrą ir plotą, folikuluose esančių ovocitų diametrą, folikulinių ląstelių aukštį ir plotį bei pamatinės membranos plotį morfometriniai matavimai buvo panašūs ir nesiskyrė (P≥0,05). Ovocitų plotas, bei juose esančių branduolių diametras ir plotas skyrėsi (P≤0,05).
3. Tirtų 3 jūrų kiaulyčių, kurių amžius 3 metai, antrinių kiaušidžių folikulų diametras ir plotas buvo panašus (P≥0,05), folikuluose esančių ovocitų diametras ir plotas, ovocituose esančių branduolių diametras ir plotas buvo nepanašus ir skyrėsi (P≤0,05), folikulinių ląstelių aukštis ir plotis ir spindulinio vainiko storis reikšmingai nesiskyrė (P≥0,05). Antriniuose folikuluose esančių folikulinių ląstelių sluoksnių skaičius svyravo nuo 6 iki 8. Antrinių folikulų pamatinės membranos storis skyrėsi (P≤0,05).
41 LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Besselsen D. G. Biology of Laboratory Rodents. Research Animal Methods. 2002. P. 443-453.
2. Bland K. P. Biphasic follicular growth in the guinea-pig oestrous cycle. Great Britain. 1980. P. 73 – 76.
3. Bookhout CG. The development of the guinea-pig ovary from sexual differentiation to maturity. 1945. 77:233-265.
4. Dunnum Jonathan L., Salazar-Bravo Jorge. Molecular systematics, taxonomy and biogeography of the genus Cavia (Rodentia: Caviidae). Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research. 2010. 48 (4): P. 376–388.
5. Deansley Ruth. Follicle Formation in guinea pigs and rabbits: a comparative study with notes on the rete ovarii. Cambridge. 1972. P. 371 – 374.
6. Fortune J. E. Ovarian Follicular Growth and Development in Mammals'. Department and Section of Physiology. Cornell University. Ithaca. New York. 1994. P. 225-232.
7. Fortune J. E., Cushman R, Wahl C., Kito S. The primordial to primary follicle transition. 2000.
8. Guerrini Anita. Experimenting with Humans and Animals. 2003. P. 42.
9. Gulinello Maria Dr. Behavioral Core Facility. Albert Einstein College of Medicine. 2002. [Žiūrėta 2013-12-14]. Prieiga per internetą:
http://www.biobserve.com/downloads/maria-gulinello/Rodent-Estrous-Cycle.pdf 10. Hirshfield AN. Development of follicles in the mammalian ovary. 1991.
11. Hutz R, Bejvan SM, Durning M, Dierschke DJ. Changes in follicular population, in serum estrogens and progesterone, and in ovarian steroid secretion in vitro during the guinea pig estrous cycle. 1990. 42:266–272.
12. Joshi H.S., Watson D.J., Labhsetwar A.P. Ovarian secretion of oestradiol, oestrone, 20-dihydroprogesterone and progesterone during the oestrous cycle of the guinea-pig. J. Reprod. Fertil. 1973. P. 35(1):177-181.
13. Kelt D.A., Lessa E.P., Salazar-Bravo J. and Patton J.L. (eds.). The Quintessential Naturalist: Honoring the Life and Legacy of Oliver P. Pearson. University of California Publications in Zoology. P. 134:1–981.
42 14. Kublickienė O. Histologinė technika ir praktinė histochemija. Mokslas, Vilnius 1978, 139 p. 15. Laurinavičienė A., Smaliukienė R. Histologinių technologijų vadovas. Vilnius, 2007, 188 p. 16. Nowak Ronald M. Walker's Mammals of the World (6th ed.). Baltimore, Md.: Johns Hopkins University Press. 1999. P. 1667–1669.
17. National Resource Council. Laboratory Animal Management: Rodents. National Academy Press. 1996. P. 72–73.
18. Ozdemir Dervis, Aydin Ali, Yilmaz Sadik, Dinc Gursel, and Atalar Omer. Observations on the morphology of the ovaries of the porcupine (Hystrix cristata). 2005. Turkey. P. 129 – 135.
19. Richardson C.G. Virginia Diseases of Domestic Guinea Pigs (2nd ed.). Blackwell. 2000. P. 15–18.
20. Padaiga A., Lasys V., Sederevičius A. Naminių gyvūnų mikroskopinė anatomija. Kaunas: Naujasis lankas. 2006. 384 p.
21. Sadeu J.C., Adriaens I., Cortvrindt R., Smitz J. Study of folliculogenesis in vivo in guinea pig. 2007. Belgium. Theriogenology 68. P. 1228–1239.
22. Suzuki O., Koura M., Noguchi Y., Takano K., Yamamoto Y., Matsuda J. Optimization of superovulation induction by human menopausal gonadotropin in guinea pigs based on follicular waves and FSH-receptor homologies. Mol. Reprod. Dev. 2003. P. 64(2):219-225.
23. Shi F., Ozawa M., Komura H., Watanabe G., Tsonis C.G., Suzuki A.K., Taya K. Induction of superovulation by inhibin vaccine in cyclic guinea-pigs. J. Reprod. Fertil. 2000. P. 118(1):1-7.
24. Spotorno A.E., Marín J.C., Manríquez G., Valladares J.P., Rico E. and Rivas C. Ancient and modern steps during domestication of guinea pigs (Cavia porcellus L.). Journal of Zoology. 2006.
25. Spotorno A.E., Manríquez G., Fernández L.A., Marín J.C., González F. and Wheeler J. Domestication of guinea pigs from a southern Peru-northern Chile wild species and their middle pre-Columbian mummies. 2007. P. 367–388.
26. Trewin A.L., Chaffin C.L., Watanabe G., Taya K., Hutz R.J. Cyclic changes in serum follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone and inhibin during the guinea pig estrous cycle. J. Reprod. Dev. 1998. P. 44(4):353-357.
27. Van Kan C.M., de Vries J.I., Luchinger A.B., Mulder E.J., Taverne M.A. Ontogeny of fetal movements in the guinea pig. Physiol. Behav. 2009. P. 98(3):338-344.
43 29. Walsh L. S. N. The growth of the ovarian follicle of the guinea pig under normal and pathological conditions. Washington. 1917.
30. Weir Barbara J. Notes on the Origin of the Domestic Guinea-Pig. In Rowlands, I. W.; Weir, Barbara J. The Biology of Hystricomorph Rodents. Academic Press. 1974. P. 437–446.
31. Wallace WHB and Kelsey TW. Human Ovarian Reserve from Conception to the Menopause. 2010.
32. Žymantienė J., Monkevičienė I., Želvytė R., Oberauskas V. Laboratoriniai ir egzotiniai gyvūnai. Lietuva. 2008.
