Citologinio tyrimo efektyvumas diagnozuojant kalių ir kačių pieno liaukų navikus

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Akvilė Kučaitė

Citologinio tyrimo efektyvumas diagnozuojant kalių ir kačių

pieno liaukų navikus

Evaluation of accuracy of cytology for diagnosis of canine and

feline mammary gland tumors

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovė: doc. dr. Nomeda Juodžiukynienė

2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Citologinio tyrimo efektyvumas diagnozuojant kalių ir kačių pieno liaukų navikus“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVRITINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

... (data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai

1)________________________________________________________________________________ 2)________________________________________________________________________________

(vardas, pavardė) (parašai)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

1.1. Kalių ir kačių pieno liaukos morfologija ... 8

1.2. Kalių ir kačių pieno liaukos citologija ... 9

1.3. Kalių ir kačių pieno liaukos histologija ... 10

1.4. Kalių ir kačių pieno liaukų navikų morfologija ... 11

1.5. Kalių ir kačių pieno liaukų navikų citologija ... 13

1.6. Kalių ir kačių pieno liaukų navikų histologija ... 14

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 21

2.1. Informacija apie tyrimą ... 21

2.2. Patologinės medžiagos paruošimas citologiniam tyrimui ... 21

2.3. Pieno liaukos navikų citologinių preparatų tyrimas ... 22

2.4. Patologinės medžiagos paruošimas histologiniam tyrimui ... 23

2.5. Pieno liaukos naviko histologinių preparatų tyrimas ... 24

2.6. Statistinės analizės metodai ... 24

3. TYRIMO REZULTATAI ... 25

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 35

IŠVADOS ... 38

4

SANTRAUKA

Citologinio tyrimo efektyvumas diagnozuojant kalių ir kačių pieno liaukų navikus Akvilė Kučaitė

Magistro baigiamasis darbas

Tyrimas buvo atliktas Lietuvoje, Vilniaus ir Kauno miestuose esančiose smulkiųjų gyvūnų klinikose. Mokslinis tiriamasis darbas susideda iš 43 puslapių, kuriuos sudaro 10 lentelių, 19 paveikslų, bei 51 literatūros šaltinis.

Tyrimo tikslas: Įvertinti citologinio tyrimo efektyvumą diagnozuojant kalių ir kačių pieno liaukų navikus.

Tyrimo medžiagos ir metodai: Iš dviejų privačių klinikų buvo surinkta 20 pieno liaukos navikų. Citologija atlikta plonos adatos biopsijos metodu, o mėginiai dažyti MGG dažais. Histologiniams mėginiams dariniai dedami į 10 proc. formaliną, specialiai paruošti, supjaustyti mikrotomu ir nudažyti HE dažais yra mikroskopuoti. Išanalizuoti histologiniai pieno liaukų preparatų mėginiai, nustatytas navikų tipas, piktybiškumo laipsnis, remiantis ląstelių ir ją sudarančių elementų patologijomis. Rezultatai palyginti su citologinių pieno liaukos navikų preparatų mėginiais.

Tyrimo rezultatai ir išvados: Daugiausiai buvo nustatyta solidinių karcinomų, šviesių ląstelių karcinomų, tubulinių karcinomų bei piktybinių mioepiteliomų su branduolio pleomorfizmu, hiperchromatizmu, anizokarioze, makrokarioze, membranos pakitimais, branduolio ir citoplazmos santykio padidėjimu, branduolėlių kiekio ir formos pakitimais, mitozių skaičiaus padidėjimu, branduolio ir citoplazmos vakuolizacija. Pagal šių požymių pasireiškimo intensyvumą nustatyta, kad 10 proc. sudarė I – o laipsnio, 74 proc. II – o laipsnio ir 16 proc. III – io piktybiškumo laipsnio pieno liaukos navikai. Lyginant dviejų tiriamųjų technikų rezultatus gauta, kad citologiniu tyrimo metodu diagnozė nustatyta 85 proc. tikslumu. Citologinio tyrimo metodo jautrumas buvo 93 proc., specifiškumas - 50 proc., teigiama prognostinė vertė - 88 proc., neigiama prognostinė vertė - 30 proc. Apskaičiavus Maknemaro chi kriterijų (χ2_{), nustatyta, kad histologinis tyrimas tikslesnis įvertinant tik}

mitozių kiekio padidėjimą (χ2 _{= 9,09091, p < 0,01) ir citoplazmos vakuolizaciją (χ}2 _{= 5,81818, p <}

0,05). Šie rezultatai rodo, kad priešoperacinis citologinis pieno liaukos navikų tyrimas gali gelbėti diagnozuojant piktybiškumą ir pasirenkant tolimesnio gydymo schemą.

5

SUMMARY

Evaluation of accuracy of cytology for diagnosis of canine and feline mammary gland tumors Akvilė Kučaitė

Master‘s thesis

The study was performed at two small animal clinics in Vilnius and Kaunas, Lithuania. The MsSc Thesis consists of 43 pages including – 10 Tables, 19 Pictures and 51 sources of literature.

The objectives of the study: to evaluate accuracy of cytology for diagnosis of canine and feline mammary gland tumors.

Materials and Methods of the study: We gathered 20 mammary gland tumors from two private clinics. Cytology was performed by fine needle aspiration technique and specimens were stained with May-Grünwald-Giemsa dye. As for histological microscopy, specimens were fixed with 10 % formalin, routinely processed, cut into pieces with a microtome and stained with Hematoxylin-Eosin dye. The histological samples of mammary gland tumors were analyzed, their type and malignancy, based on the pathologies of their cells and cell constituting elements, was defined. The results were compared with the samples of cytology of mammary gland tumors.

Results and conclusions: The most commonly found type of tumors were solid carcinomas, lipid – rich carcinomas, tubular carcinomas and malignant myoepitheliomas with nuclear pleomorphism, hyperchromatism, anisokaryosis, macrokaryosis, membrane alterations, increased nuclear to cytoplasmic ratio, variations of nucleolar shape and quantity, increased mitotic count, nuclear and cytoplasmic vacuolisation. Based on the intensity of these criteria there was determined that 10 % were 1st grade, 74 % - 2nd grade, 16 % of specimens were 3rd grade malignancy. The agreement scores of histological and cytological analysis were 85 %. Cytologic examination had a sensitivity of 93 %, specificity of 50 %, positive predictive value of 88 % and negative predictive value of 30 %. McNemar’s chi criteria (χ2_{) showed that histological examination is more accurate when counting}

mitotc index (χ2 _{= 9,09091, P < 0,01) and cytoplasmic vacuolisation (χ}2 _{= 5,81818, P < 0,05). These}

results show that preoperative cytology of mammary gland tumors may assist in evaluating the malignancy and choosing a further therapy method.

6

SANTRUMPOS

pav. – paveikslas; proc. – procentai; PL – pieno liauka;

PSO – pasaulio sveikatos organizacija;

HPF – (ang. High-power field) regėjimo laukas didžiuoju padidinimu; MGG – May – Grünwald - Giemsa;

HE – hematoksilinas – eozinas; p – patikimumas.

7

ĮVADAS

Pieno liaukos navikai yra liga, kuri nesirenka, kuriam gyvūnui pasireikšti. Ši neoplazija dažnai pasitaiko ir žmonių tarpe, bet šunims ir katėms ji pasireiškia dažniau. Kadangi šie gyvūnai dažniausiai yra naminiai augintiniai, jų gyvenimo kokybė artimai susijusi su šeimininkų gyvenimo sąlygomis. Kitaip tariant, susirgimo etiopatogenezė ir morfologija yra itin panašios, tad veterinarijos gydytojai turi svarbią rolę palyginamosios onkologijos tyrimuose (1-3). Šveicarijoje atliktais retrospektyviais tyrimais nustatytas didėjantis šunų onkologinių susirgimų skaičius, kuomet 1955 metais tik 13 iš 100000, o 2008 metais net 695 iš 100000 šunų sirgo navikinėmis ligomis iš kurių 20,53 proc. buvo pieno liaukos navikai (4). Šių rezultatų priežastis gali būti didėjantis auginamų kačių ir šunų kiekis ir didėjanti šeimininkų savimonė. Taip pat gerėja augintinių gyvenimo sąlygos, ko pasekoje daugėja vyresnio amžiaus gyvūnų, kuriems ir būdingesni navikiniai susirgimai. Galiausiai geresnė ekonominė situacija pasaulyje leidžia daugiau gyvūnų turėti veterinarinę priežiūrą (1,4,5).

Veterinarinėje medicinoje pieno liaukos navikų diagnozavimui populiarėja imunohistocheminis tyrimo metodas. Jo metu vertinama estrogeno, progesterono receptorių, žmonių epidermio augimo faktoriaus receptorių 2, kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus receptorių 2 ekspresija (6-8).

Dėl didelio patikimumo histopatologinis tyrimas vis dar laikomas auksiniu standartu. Kita vertus pasaulyje vyrauja tendencija ieškoti greičiauso ir pigiausio metodo pieno liaukos navikų diagnozavimui, kas šiuo metu ir yra citologinis tyrimo metodas (9-11).

Tuo vadovaujantis išsikėlėme sau darbo tikslą: įvertinti citologinio tyrimo efektyvumą diagnozuojant kalių ir kačių pieno liaukų navikus.

Šiam darbo tikslui įgyvendinti buvo suformuluoti ir sprendžiami šie darbo uždaviniai: 1. Atlikti pieno liaukos navikų histologinius tyrimus;

2. Atlikti pieno liaukos navikų citologinius tyrimus; 3. Nustatyti pieno liaukos navikų piktybiškumo kriterijus; 4. Palyginti citologinio ir histologinio tyrimų rezultatus.

8

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Kalių ir kačių pieno liaukos morfologija

Pieno liauka yra egzokrininė, apokrininė liauka, kurią išskirtinai turi tik žinduoliai, o tarp jų – kalės ir katės. Liauka sudaryta iš latakų ir alveolių bei juos supančio audinio. Daugelis šaltinių teigia, kad tai yra modifikuota prakaito liauka, bet kiti autoriai ginčijasi, kad ji kilusi iš riebalų liaukos (12). Daugumai kalių išsivysto 5 poros pieno liaukų kai tuo tarpu 4 poros pieno liaukų dažniau sutinkamos katėms. Kalių poros įvardijamos kaip dvi torakalinės (PL1 ir PL2), dvi abdominalinės (PL3 ir PL4) ir viena ingvinalinė (PL5), o kačių - aksiliarinė (PL1), torakalinė (PL2), abdominalinė (PL3) ir ingvinalinė (PL4), kurios taip pat dar gali būti skirstomos į torakalinę ir abdominalinę sritis su kaudaline ir kranialine liaukomis (13). Apžiūrint pacientą svarbu suskaičiuoti kiek yra pieno liaukų, nes neretai pasitaiko ir kalių su 4, kartais 6, bei kačių su 5 pieno liaukų poromis (12).

Nerujojusios kalės pieno liaukos liaukinis audinys vos pastebimas, o subrendusios kalės pieno liauka kinta paraleliai kiaušidėse vykstančių ciklų. Nustatyta ramybės, proliferacijos, diferenciacijos ir regresijos stadijos, kurios pavaizduotos ir 1 pav. (14). Remiantis atliktais tyrimais su biglių kalėmis, priešrujo (proestrus) metu liauka būna ramybės fazėje, sudaryta iš neaktyvių latakų, kuriuose gali būti randama hemosiderino, pavienių apoptozių, nematyti mitozių. Rujos (estrus) metu taip pat nematyti didelių morfologinių pakitimų. Daug pokyčių vyksta porujo (diestrus) metu, tad pieno liaukos kitimo laikotarpis papildomai skirstomas į keturias fazes (I, II, III, IV), kurių metu keičiasi dominuojantis, proliferuojantis audinys. Nors ramybės (anestrus) periodas ilgas, jo metu pieno liauka kinta mažai. Ankstyvoje stadijoje matomi regresuojantys acinusai su apoptozėmis, vėlyvoje – gausu jungiamojo audinio, kurio vaizdas nedaug skiriasi nuo priešrujo ar rujos periodo (15,16).

9

1.2. Kalių ir kačių pieno liaukos citologija

Laktuojančios ir nelaktuojančios pieno liaukos citologija skiriasi. Laktuojančios pieno liaukos aspirate bus daug ląstelių, kai tuo tarpu nelaktuojančios – nė vienos ar vos kelios audiniui specifiškos ląstelės (17). Pastarosios aspirate matomos sekretuojančios ląstelės, taip pat makrofagai bei neutrofilai eozinofiliame, bazofiliniame fone. Sekretuojančios ląstelės būna retai išsidėsčiusios, didelės ląstelės su apvaliu / ovaliu, tamsiu branduoliu bei vidutiniu kiekiu granuliuotos, bazofilinės citoplazmos (18). Aspirate iš laktuojančios pieno liaukos gali būti randamos galimai iš histiocitų kilusios vakuolėtos putotos ląstelės (17). Sveikos pieno liaukos aspirate matomas nedidelis kiekis kraujo, nedaug nukleininių ląstelių ir nuo vidutinio iki didelio kiekio bazofilinės, proteininės medžiagos, skaidrių lipidų lašelių. Sekretuojančios epitelinės ląstelės yra vienodos formos ir dydžio, ir gali išsidėstyti pavieniui, plonais sluoksniais ar mažomis kekėmis, o kartais ir acinusų forma (18,19). Latakus išklojančios ląstelės turi ovalų, bazalinį branduolį ir nedidelį kiekį citoplazmos. Mioepitelinės ląstelės gali būti matomos kaip tamsiai nusidažiusios ovaliu branduoliu, verpstės formos ląstelės (19). Aspiravus pieno liaukos sekretą matomos lipidinės vakuolės eozinofiliname, bazofiliniame, baltymingame fone ir nedidelis kiekis ląstelių: putotos (2 pav.), sekretuojančios ar latakus išklojančios ląstelės (3 pav.), makrofagai, neutrofilai ar limfocitai (17).

3 pav. Pailgos, tamsesnės mioepitelinės

ląstelės (rodyklės) su ovaliais branduoliais, išsidėsčiusios tarp latakus išklojančio epitelio ląstelių (17).

2 pav. Dvi vakuolizuotos putotos ląstelės

10

1.3. Kalių ir kačių pieno liaukos histologija

Pieno liauka sudaryta iš parenchimos – alveolių, stromos – jungiamojo audinio, latakų, kraujagyslių ir nervų (4 pav.). Viena pieno liauka sudaryta iš 8 – 14 skiltelių (20). Pieno liauka užsibaigia speniu, padengtu epidermiu, bet jo neoplazijos yra retos (13). Dvi skirtingos ląstelių populiacijos iškloja pieno liaukos latakus ir alveoles. Vidinį sluoksnį iškloja liuminalinės epitelinės ląstelės su apsaugine / sekrecine funkcija, o išorinį sluoksnį sudaro mioepitelinės ląstelės, kurios būna verpstės arba žvaigždiškos formos ir turi susitraukimo funkciją (20).

Didesni tarpskiltiniai latakai, iškloti dvisluoksniu kubiniu epiteliu ir verpstiškomis mioepitelinėmis ląstelėmis prie pamatinės membranos, atsiveria į distalinį sinusą. Mažesni distaliniai tarpskilteliniai latakai iškloti vienu sluoksniu kubinio epitelio su mažesniu mioepitelinių ląstelių kiekiu. Tarpskilteliniai latakai nusitęsia į skiltelinius latakus, išklotus vienasluoksniu kubiniu epiteliu su retai išsidėsčiusiomis mioepitelinėmis ląstelėmis (12). Alveolės išklotos vienasluoksniu epiteliu, apsuptu pamatine membrana ir žvaigždiškomis mioepitelinėmis ląstelėmis. Alveolių sekretuojantis kubinis / stulpinis epitelis yra su citoplazminiais lipidų lašeliais, kurie vėliau akumuliuojasi alveolės ertmėje. Mioepitelinės ląstelės geba susitraukti, tad jos yra atsakingos už pieno atpalaidavimą (19). Stroma skirstoma į dvi dalis: tarpskiltelinę ir skiltelinę. Skiltelinė stroma sudaryta iš retesnių ir plonesnių kolageno pluoštų, o tarpskiltelinį jungiamajį audinį sudaro tankesnės ir storesnės kolageno skaidulos, kurios atskiria skilteles vieną nuo kitos (12,13).

Vertinant pieno liaukos histopatologijas būtina atsižvelgti į kalės rujos ciklo fazę, jos subrendimo lygį dėl galimos liaukos hiperplazijos ar hipertrofijos ir kitų pokyčių. Vyksta nepertraukiama proliferacija ir regresija, kurios gali skirtis tarp atskirų ar net toje pačioje pieno liaukoje (20). Kiek sudėtingiau yra su katėmis dėl jų sezoninio poliestriškumo ir spontaninės ovuliacijos, todėl yra tik tikėtina, kad pieno liaukos histologija kinta reprodukcijos organų įtakoje ir detalesnių tyrimų nėra atlikta (13).

11

4pav. Kalės pieno liaukos histologinis vaizdas. Ilgi tarpskiltiniai latakai (juodos rodyklės) pereina į

mažesnius skiltelinius latakus (raudonos rodyklės), apsuptus tankesnėmis epitelinėmis ląstelėmis (13).

1.4. Kalių ir kačių pieno liaukų navikų morfologija

Pieno liaukos navikai yra antra pagal dažnumą pasitaikanti po odos navikų neoplazija tarp šunų, bet dažniausiai pasitaikanti tarp kalių (3). Patinams ši patologija pasitaiko retai, vos 4 individams iš 100000, kai tuo tarpu 207 kalės iš 100000 turi pieno liaukos navikų. Katėms pieno liaukos navikai yra trečia pagal dažnumą pasitaikanti po hematopoetinių ir odos neoplazijų (19).

Palpuojant gėrybiniai pieno liaukos navikai dažniausiai užčiuopiami kaip maži, su ryškiomis ribomis ir kieti mazgeliai, kai tuo tarpu piktybiniai dažniau pasitaiko kaip infiltratyvūs, > 5 cm skersmens, greitai augantys dariniai (19,21). Prie pastarųjų greta prisideda ir vietinis uždegimas, išopėjimai, eritema ar edema, tačiau tai pasitaiko prie toli pažengusių metastatinių susirgimų ar uždegiminės karcinomos su sisteminiais klinikiniais požymiais (12).

Dažniausiai pieno liaukos navikai vystosi kaudalinėse pieno liaukose, dėl jose esančio didesnio liaukinio audinio kiekio. Dauguma navikų yra epitelinės kilmės. Rečiau pasitaiko epitelinės ir mioepitelinės kilmės navikų su kremzlinio ar kaulinio audinio dariniais. Mažiausiai randama tik mioepitelinės kilmės neoplazijų (19,21). 50 – 60 proc. kalių turi daugybinius pieno liaukos navikus, kurie tarpusavyje gali skirtis histologine sandara (22). 50proc. kalių navikų nustayta piktybinė histologinė sandara ir tik 50 proc. jų baigiasi letaliai, kai tuo tarpu > 80 proc. kačių vystosi piktybiniai navikiniai procesai (23). Pieno liaukos navikai patinams vystosi esant tam tikrose riziko grupėse: vyresnio amžiaus, nutukimas, pažeistos sėklidės, ginekomastija, Klinefelterio sindromas ir paveldimumas. Tyrimais nustatyta, kad dauguma sirgusiųjų patinų buvo kokerspanieliai arba pudeliai ir

12 kiti grynaveisliai, 10 - 11 metų amžiaus gyvūnai. Dauguma auglių buvo gėrybinės epitelinės kilmės (24). Diagnozuojant pieno liaukų navikus, dažniausiai naudojami trys pagrindiniai terminai:

 Paprastas - navikas, kurį sudaro tik viena ląstelių rūšis (epitelinės arba mioepitelinės). Tai adenoma, karcinoma, mioepitelioma ir kt.;

 Kompleksinis – navikas, kurį sudaro dviejų tipų ląstelės (epitelinės ir mioepitelinės);

 Mišrus – navikas, kurį sudaro epitelinės ir / arba mioepitelinės ląstelės bei jungiamojo audinio elementai (dažniausiai kremzilinis, kaulinis audinys) (21).

Pieno liaukos naviko stadija gali būti skirstoma pagal auglio dydį, paveiktus limfmazgius ir metastazes į kitus organus (1 lentelė, 2 lentelė).

1 lentelė. Kalių pieno liaukos navikų skirstymas į stadijas (21).

Stadija Auglio dydis Limfinių mazgų statusas Metastazės į kitus organus 1 stadija < 3 cm Histologiškai ar citologiškai metastazių nerasta Nėra 2 stadija 3 – 5 cm Histologiškai ar citologiškai metastazių nerasta Nėra 3 stadija > 5 cm Histologiškai ar citologiškai metastazių nerasta Nėra 4 stadija Bet kokio dydžio Histologiškai ar citologiškai metastazių rasta Nėra 5 stadija Bet kokio dydžio Bet koks statusas Yra

2 lentelė. Kačių pieno liaukos navikų skirstymas į stadijas (23).

Stadija Auglio dydis Limfinių mazgų statusas Metastazės į kitus organus 1 stadija < 2 cm Histologiškai ar citologiškai metastazių nerasta Nėra 2 stadija 2 – 3 cm Histologiškai ar citologiškai metastazių nerasta Nėra 3 stadija < 2 cm arba 2 – 3 cm

> 3 cm

Histologiškai ar citologiškai metastazių rasta Bet koks statusas

Nėra Nėra 4 stadija Bet kokio dydžio Bet koks statusas Yra

13

1.5. Kalių ir kačių pieno liaukų navikų citologija

Pasaulyje vis labiau populiarėja pieno liaukos citologija, ypač plonos adatos aspiracija, dėl jos mažo invazyvumo, sąlyginai gero tikslumo bei palyginus nedidelių kaštų. Pasitelkiant anamnezę ir klinikinius požymius, aspiratas padeda diferencijuoti neoplazijas nuo cistų, mastito ar lipomų (12,25). Tačiau pieno liaukos hiperplazija, displazija, gėrybiniai navikai ir gerai diferencijuotos karcinomos yra morfologiškai panašios struktūros, tad citologiniame mėginyje jas atskirti sunku. Norint atskirti piktybinį auglį nuo gėrybinio, daug ką pasako naviko invazija į stromą, o citologiniame mėginyje šis kriterijus negali būti įvertintas (10). Citologija gali būti atliekama ir ultragarso pagalba, kas ypač aktualu esant itin mažam navikui (26). Taip pat aprašyta atvejų atliekant spenelio aspirato skysčio citologiją. Jeigu jos metu nerandama ląstelių ar jų būna labai mažai, tai rodo mažą navikinio proceso riziką (27). Kadangi katėms dauguma neoplazijų yra piktybinės, joms plonos adatos aspiracija yra labiau patikima negu šunims diagnozės patvirtinimui (28).

Aspiratuose iš gėrybinių neoplazijų vienodo dydžio epitelinės ląstelės pasiskirsto sluoksniais arba grupelėmis, adenomos - acinusais, o verpstiškos mioepitelinės ląstelės pavienės arba sukibusios. Aspiruojant mišrų naviką randamos ir verpstiškos arba ovalios formos mezenchiminės kilmės ląstelės (fibroblastai, chondorblastai, osteoblastai ir kt.) (29). Tarp šių ląstelių taip pat gali būti matomos kraujo ląstelės, bazofilinės, baltymingos medžiagos, lipidų lašeliai ir pieno egzokrinocitai. Mezenchiminiai navikai arba navikai turintys daugiau skaidulinio audinio sunkiai išsisluoksniuoja, tad mėginyje gali būti per mažai ląstelių audinio diferenciacijai (10). Dėl mišrių navikų heterogeniškumo aspiratą reikėtų imti iš kelių vietų, kad į mėginį patektų įvairių tipų ląstelių (30).

Adenokarcinomos, kilusios iš liaukinio epitelio, yra dažniausiai pasitaikančios piktybinės pieno liaukos neoplazijos. Epitelinių piktybinių pieno liaukos navikų diagnozavimui, svarbu rasti pleomorfines epitelines ląsteles su ryškia anizocitoze. Ląstelės gali būti pavieniui arba išsidėsčiusios sluoksniais, grupelėmis (17,19). Adenokarcinomos dažnai nustatomos radus acinusais išsidėsčiusias ląsteles, kurie dažniau randami mėginį imant atspaudo metodu. Ląstelės tipiškai būna apvalios arba daugiakampės, su ryškia sienele, turi ovalų arba apvalų, centre lokalizuotą branduolį ir vidutinį kieki bazofilinės citoplazmos (10). Kartais ląstelės gali būti vakuolizuotos ir atrodo kaip su permatomomis pūslelėmis arba difuziškai skaidria zona ląstelės periferijoje (18,31). Piktybiškumas dažnai nustatomas remiantis branduolio parametrais: didelis mitozių skaičius, hiperchromatizmas, anizokariozė, megakariozė, didelis branduolio ir citoplazmos santykis, branduolio moldingas, daugiabranduoliškumas, keletas ryškių branduolėlių, makrobranduolėliai, įvairios formos branduolėliai (29).

14 Uždegiminė karcinoma yra agresyvios formos karcinoma, kurios mėginyje matytumėme didelį kiekį neutrofilų, kiek mažiau makrofagų, dideles, pleomorfines, anaplastines epitelines ląsteles. Ji dažniau pasitaiko šunims negu katėms (17). Mikropapilinė karcinoma atrodo labai panašiai, tik mėginyje matomas didelis ląstelių kiekis telkiasi į mikropapilines grupes (32). Mokslininkų tyrimo duomenimis, piktybinė mikropapilinė karcinoma buvo nustatyta ir iš spenelio išskyrų citologinio mėginio (33).

1.6. Kalių ir kačių pieno liaukų navikų histologija

Veterinarinės patologijos žurnale 2011 metais išleista modifikuota PSO 1974 metų pieno liaukos navikų klasifikavimo sistema remiantis jų histologine morfologija. Jų skirstymas yra ganėtinai sudėtingas, tad klasifikavimas artimai susijęs ir su navikų anatomija, fiziologija. Kai kurie klinikiniai požymiai (greitas augimas, auglio dydis, išopėjimas, peraugimas į aplinkinius audinius) taip pat gali būti naviko rūšies indikatorius, tačiau tiksliai diferencijuoti auglio vien tik iš anamnezės yra neįmanoma (13). Kačių pieno liaukos navikai yra mažiau heterogeniški nei kalių, tad jų subtipų taip pat yra mažiau. Kalių ir kačių pieno liaukų navikų histologinė klasifikacija:

I. Piktybinė epitelinė neoplazija:

a. Karcinoma in-situ – gerai demarkuotas neinvazyvus mazgelis (-iai) su tankiai išsidėsčiusiomis ląstelėmis nepereinančiomis pamatinės membranos ir formuojančiomis įvairius latakėlius ar lizdus;

b. Paprastoji karcinoma:

i. Tubulinė – ląstelės formuoja latakus, o tarplatakinėje stromoje matomos kraujagyslės ir fibroblastai;

ii. Tubulopapilinė – į latako spindį nusitęsios papilės, kurias palaiko fibrovaskulinė jungiamojo audinio stroma;

iii. Cistinė-papilinė – į cistinį latako spindį nusitęsusios papilės;

iv. Kribfriforminė – itin mažo spindžio, sietą formuojančios, proliferuojančios navikinės ląstelės;

c. Invazyvi mikropapilinė karcinoma – latako spindyje įvairius agregatus ir mažus spenelius, be jas palaikančio fibrovaskulinio audinio, formuojančios navikinės ląstelės; d. Solidinė karcinoma – lizdeliais, glaudžiai išsidėsčiusios ląstelės formuoja tankias,

15 e. Komedokarcinoma – navikinių ląstelių centre besiformuojanti amorfinė, eozinofilinė,

nekrotinė masė;

f. Anaplastinė karcinoma – piktybiškiausia karcinoma, kurią formuoja pavienės arba mažomis grupelėmis ląstelės, kurios iššaukia dezmoplastinį atsaką ir matomi navikinių ląstelių embolai limfagyslėse. Kliniškai nustatoma uždegiminė karcinoma;

g. Mišrus auglys / karcinoma kylanti iš kompleksinės adenomos (kurios vienoje srityje dar randama ir gėrybinės auglio dalies) (katėms ši klasifikacija nepriklauso);

h. Karcinoma – kompleksinis tipas, kuriame epiteliniai komponentai piktybiniai, mioepiteliniai - gėrybiniai (katėms ši klasifikacija nepriklauso);

i. Karcinoma ir piktybinė mioepitelioma - epiteliniai ir mioepiteliniai komponentai piktybiniai (katėms ši klasifikacija nepriklauso);

j. Karcinoma – mišrus tipas, kuriame epiteliniai komponentai piktybiniai, mioepiteliniai – gėrybiniai, o mezenchiminiai komponentai - kremzilinis arba kaulinis audinys (katėms ši klasifikacija nepriklauso);

k. Latakų karcinoma – ląstelės išsidėsčiuosios vamzdeliais ir sudaro plyšio formos spindį, išklotą dvisluoksniu epiteliu;

l. Intralatakinė papilinė karcinoma – daugiasluoksnio epitelio proliferacija, formuojanti spenelius, kuriuos palaiko skaidulinis jungiamasis audinys ir mioepitelinės ląstelės; II. Piktybinės epitelinės neoplazijos – specifiniai tipai:

a. Plokščialąstelinė ragėjanti karcinoma – didelės ragėjančios epitelinės ląstelės su dideliais branduoliais formuoja keratino perlus;

b. Adenoplokščialąstelinė karcinoma – bet kokio karcinomos tipo zona ir plokščialąstelinės ragėjančios karcinomos zona;

c. Gleives gaminanti karcinoma - pavienės ar susigrupavusios ląstelės, gaminančios gleives;

d. Šviesių ląstelių karcinoma – ryškiomis sienelėmis ląstelės su gausiomis, smiulkiomis ar viena didele vakuole;

e. Šeivinių ląstelių karcinomos:

i. Piktybinė mioepitelioma – verpstiškos formos ląstelės bazofiliniame, skaiduliniame, jungiamajame audinyje (katėms ši klasifikacija nepriklauso);

16 ii. Plokščialąstelinės karcinomos – šeivinių ląstelių variantas – epitelinių ląstelių zonos, apsuptos siaura, jungiamojo audinio stroma, o mioepitelinės ląstelės gamina intracitoplazminį keratiną;

iii. Karcinoma – šeivinių ląstelių tipas – dominuojančios navikinės mioepitelinės ląstelės;

f. Uždegiminė karcinoma – limfagyslių invazija su navikinių ląstelių embolu, kas sukelia ir įvairius klinikinius požymius;

III. Piktybinės mezenchiminės neoplazijos – sarkomos:

a. Osteosarkoma - dažniausiai pasitaikantis mezenchiminis navikas su osteoidų salelėmis; b. Chondrosarkoma – daug skiltelių sudarantis navikas su daugiabranduolėmis ląstelėmis; c. Fibrosarkoma – susipynusių verpstiškųjų ląstelių proliferacija;

d. Hemangiosarkoma – identiška blužnies ir paodžio hemangiosarkomoms; e. Kitos sarkomos;

IV. Karcinosarkoma – gėrybins, mišrus pieno liaukos navikas, sudarytas iš epitelinų ir jungiamojo audinio elementų (katėms ši klasifikacija nepriklauso);

V. Gėrybinės neoplazijos:

a. Paprastoji adenoma – minimali anizokariozė ir anizocitozė, matomi latakėliai, iškloti kubiniu / stulpišku epiteliu;

b. Intralatakinė papilinė adenoma (latakų papiloma) – spenelinis šakojimasis, apsuptas fibrovaskuliniu audiniu;

c. Latakų adenoma (bazaloidinė adenoma) – latakai, iškloti epitelinėmis ir pamatinėmis ląstelėmis;

d. Fibroadenoma – latakai, apsupti dideliu stromos kiekiu;

e. Mioepitelioma – verpstiškos ląstelės, apsuptos skaiduline, bazofiline medžiaga (katėms ši klasifikacija nepriklauso);

f. Kompleksinė adenoma – adenomioepitelioma – epitelinių ir mioepitelinių ląstelių proliferacija ir įvairus skaidulinės stromos kiekis (katėms ši klasifikacija nepriklauso); g. Gėrybinis mišrus navikas – epitelinių ir mioepitelinių ląstelių proliferacija su kaulo ar

kremzlės fragmentais (katėms ši klasifikacija nepriklauso); VI. Hiperplazija/displazija:

a. Latakų ektazija – latakų išsiplėtimas su nekrotinių masių, putotų makrofagų ir lipidų kaupimųsi;

17 b. Skilčių hiperplazija (adenozė);

i. Reguliari (adenozė) – ne neoplastinė latakų proliferacija;

ii. Su sekretiniu aktyvumu – laktacinė - ne neoplastinė latakų proliferacija su sekretuojančiomis kubinėmis ląstelėmis;

iii. Su fibroze – interskiltiniu fibroziniu jungiamuoju audiniu - ne neoplastinė latakų proliferacija ir didesniu jungiamojo audinio kiekiu;

iv. Su atipija - ne neoplastinė latakų proliferacija su atipinėmis ląstelėmis; c. Epiteliozė – latakus išklojančių ląstelių proliferacija;

d. Papilomatozė – spenelinė proliferacija be jungiamojo audinio;

e. Fibroadenominiai pakitimai – tarpksiltinių latakų ir juos supančios stromos proliferacija; f. Ginekomastija – pieno liaukų padidėjimas patinams dėl latakų ektazijos ir skiltelių

hiperplazijos;

VII. Spenelio neoplazijos (katėms ši klasifikacija nepriklauso):

a. Adenoma – išdidėjusio, sukietėjusio spenelio audinyje plyšio formos latakus iškloja vienas ar keli sluoksniai epitelinių ląstelių su silpnu pleomorfizmu;

b. Karcinoma - išdidėjusio, sukietėjusio spenelio audinyje plyšio formos latakus iškloja vienas ar keli sluoksniai epitelinių ląstelių su anizokarioze ir anizocitoze;

c. Karcinoma su epidermio infiltracija – navikinės ląstelės spenelio epidermyje; VIII. Spenelio hiperplazija/displazija (katėms ši klasifikacija nepriklauso):

a. Spenelio odos melanozė – lentigo tipo melanocitų proliferacija epidermyje (21,34). Suskirčius navikus į tipus, jiems pritaikytos ir piktybiškumo laipsnio matavimo sistemos. Pagal šį laipsnį galima prognozuoti gyvūno išgyvenamumą. Pieno liaukos neoplazijų agresyvumo laipsniui įvertinti naudojama Ellston - Ellis sistema žmonių medicinoje, bet modifikuota ir pritaikyta katėms ir kalėms (3 lentelė, 4 lentelė) (35,36). Katėms taip pat neseniai pradėta taikyti ir antra - Novel navikų laipsniavimo sistema su kitais kriterijais (5 lentelė, 6 lentelė) (37).

18

3 lentelė. Histologiniai piktybiškumo kriterijai pagal L. Peña ir W. Misdorp. (35,36).

Taškai Latakėlių formavimasis Branduolių pleomorfizmas Mitozės 10 HPF / hiperchromatizmas 1 taškas L. Peña Latakėlių formavimasis > 75 proc. mėginio Tolygus, reguliarius, mažas branduolys su vietomis pasitaikančiais ryškiais branduolėliais; 0 – 9 mitozės / 10 HPF W. Misdorp Gerai išreikštas formavimasis; Silpnas pleomorfizmas ar dėmėtumas; Vietomis pasitaikantys hiperchromatiniai branduoliai ar mitotinės figūros / HPF; 2 taškai

L. Peña Vidutinio lygio formavimasis (10 – 75 proc. mėginio) kartu su vientiso auglio augimo zonomis

Vidutinio lygio įvairaus dydžio ir formos branduoliai, hiperchromatinis branduolys ir matomi ryškūs branduolėliai; 10 – 19 mitozių / 10 HPF W. Misdorp Vidutinio lygio latakėlių formavimasis; Vidutinio lygio branduolio pleomorfizmas ir dėmėtumas; 2 - 3 hiperchromatiniai branduoliai ar mitotinės figūros / HPF* 3 taškai L. Peña Minimalus < 10 proc. arba nematomas latakėlių formavimasis; Didelė branduolių dydžių variacija ir hiperchromatinis branduolys, su vienu ar daugiau ryškių branduolėlių; > 20 mitozių / 10 HPF; W. Misdorp Keli arba nė vieno latakėlio; Ryškus pleomorfizmas ar dėmėtumas; 2 - 3 hiperchromatiniai branduoliai ar mitotinės figūros.

19

4 lentelė. Pieno liaukos naviko piktybiškumo laipsnis pagal L. Peña ir W. Misdorp (35,36).

Taškai Piktybiškumo laipsnis

3 - 5 L. Peña I (mažas)

W. Misdorp Gerai diferencijuotas

6 - 7 L. Peña II (vidutinis)

W. Misdorp Vidutiniškai diferencijuotas 8 - 9 L. Peña III (didelis)

W. Misdorp Prastai diferencijuotas

5 lentelė. Histologiniai piktybiškumo kriterijai katėms pagal Novel sistemą. (37).

Histologinė ypatybė Balai

Limfovaskulinė invazija Yra 0

Nėra 1

Branduolio forma < 5 proc. pakitusi

* ₀

> = 5 proc. pakitusi* 1

Mitozių skaičius 10 HPF** < = 62 0

> 62 1

*_{Pakitusiu branduoliu vadinamas bet koks nukrypmas nuo lygaus jo kontūro ar apvalios / ovalios}

formos. **HPF – (ang. High - power field) regėjimo laukas didžiuoju padidinimu.

6 lentelė. Pieno liaukos piktybiškumo laipsnis katėms pagal Novel sistemą (37).

Balai Laipsnis Išgyvenamumas

0 I – mažas laipsnis 31 mėnuo

1 II – vidutinis laipsnis 14 mėnesių

2 - 3 III – didelis laipsnis 8 mėnesiai

Karcinomos linkę metastazuoti į plaučius ir kitus organus, kas dažniausiai ir yra mirties priežastis. Apie metastazių tikimybę galime spręsti histologiniame mėginyje radę limfagyslių. Taip pat apie naviko piktybiškumą mums rodo ir mėginyje matomas infiltratyvus naviko augimas į stromą ir aplinkinius audinius (38). Nagrinėdami histologinius mėginius atskirai vertiname kiekvieną struktūrą. Stebime padidėjęs ar sumažėjęs citoplazmos kiekis, ar ji vakuolėta, bazofilinė ar eozinofilinė, tolygiai pasiskirsčiusi ar su skaidulomis, membranos pakitimais (2). Branduolio formos, dydžio, skaičiaus,

20 membranos pakitimai, vakuolizacija, branduolėlių formos ir kiekio, chromatino granulių pokyčiai taip pat itin svarbūs piktybiškumo rodikliai (39). Apžiūrimos kito tipo ląstelės, aplinkiniai audiniai ar nėra kraujotakos ir limfatinės invazijos, nekrozės zonų (25,31). Mokslininkų duomenimis didelis ląstelių kiekis ir mažas tarpląstelinis ryšys, šeivinių, uždegiminių ląstelių, atplaišų, makrofagų ir plokščiųjų ląstelių buvimas nesuteikia statistinio reikšmingumo nustatant piktybiškumą, bet yra vertingi morfologinei klasifikacijai (40). Nors nustatomas gėrybinis navikas, jis bet kada gali supiktybėti (5pav.) (2).

21

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

2.1. Informacija apie tyrimą

Mėginiai tyrimams buvo renkami dviejose privačiose veterinarijos klinikose: UAB „Jakovo veterinarijos centras“ Vilniuje ir Dr. L. Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikoje Kaune nuo 2016 metų birželio iki 2017 metų rugsėjo. Pieno liaukų biopsija buvo atlikta grynaveislių ir mišrių veislių šunų ir kačių patelėms, kurios atvyko į kliniką dėl įtariamo pieno liaukos naviko. Rinktų mėginių citologiniai preparatai paruošti klinikose iš karto po pieno liaukos naviko rezekcijos. Histologiniai preparatai paruošti ir kartu su citologiniais preparatais ištirti ir išanalizuoti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto veterinarijos akademijos patologijos centre.

Citologiniam ir histologiniam tyrimui naudoti 6 kačių ir 14 šunų patelių pieno liaukos navikų mėginiai, kurie buvo imamai iš minėtų klinikų po planinių pieno liaukos navikų šalinimo arba „lukštenimo“ operacijų.

2.2. Patologinės medžiagos paruošimas citologiniam tyrimui

Citologiniam tyrimui mėginiai imami plonos adatos biopsijos metodu (ang. fine - needle aspiration). Apčiuopos būdu, pašalintuose adiniuose, identifikuojamas ir tarp pirštų fiksuojamas dominantis darinys. Dėl galimo auglio audinio heterogeniškumo aspiratas imamas iš kelių vietų. Aspiruojant adata taikoma į periferiją dėl centre galimų fliuktuojančių masių, kuriose mažesnė ląstelių tikimybė ir didesnė nekrotinių masių galimybė. Aspiracijai buvo naudojamos 22 G (0,7 mm diametro) adatos ir 2,0 ml švirkštai. Jeigu darinys kietesnės konsistencijos, naudojama 21 G (0,8 mm diametro) adatos ir 5,0 ml švirkštai. Įbedus adatą į norimą vietą ir įsitikinus, kad adata gerai prisitvirtinusi, stūmoklis traukiamas atbuline eiga tris ketvirtadalius jo ilgio, sudarant neigiamą slėgį švirkšte, ko pasekoje darinio ląstelės patenka (įsiurbiamos) į adatos spindį. Palaikant sudarytą neigiamą slėgį, adata judinama pirmyn ir atgal bei į šonus, stengiantis jos neištraukti, nes kitu atveju adatos turinys patenka į švirkštą iš kurio mėginys gali būti nebeiššvirkščiamas bei užteršiamas naviko masę supančiomis ląstelėmis. Vienas aspiracijos epizodas trunka ~ 5 sekundes, adata nuimama tik prieš tai lėtai išleidus neigiamą slėgį. Į švirkštą pritraukiama oro ir tik tuomet atgal uždedama adata su aspiraciniu turiniu, kuris pritraukto oro pagalba, staigiu judesiu iššvirkščiamas ant objektinio stiklelio, arčiau to galo, kur bus rašomi duomenys. Antras objektinis stiklelis paruošiamas traiškymo metodu. Prie pirmojo paruošto objektinio stiklelio lygiagrečiai išilgai priglaudžiamas antrasis švarus objektinis stiklelis. Nespaudžiant,

22 išilgai ir tolygiai traukiant paskleidžiama ląstelių mąsė ant pirmojo objektinio stiklelio, o dalis ląstelių lieka ant antrojo objektinio stiklelio.

Gauti preparatai fiksuojami sausuoju būdu juos džiovinant ore, kambario temperatūroje, neilgiau nei 2 valandas. Išdžiūvę mėginiai dažomi rūgštiniais eozino ir metileno mėlio May – Grünwald - Giemsa (MGG) dažais:

1. Fiksuoti citologiniai preparatai dažomi May - Grünwald dažais 5 min; 2. Mirkoma 1,5 min fosfatiniame buferyje, kurio pH 7,2;

3. Dažoma 15 min Giemsa dažais, skiestais distiliuotu vandeniu 1 : 9; 4. Gausiai plaunama distiliuotu vandeniu;

5. Džiovinama ore, kambario temperatūroje.

Gautame mėginyje branduoliai nusidažo violetine, raudona spalva, o citoplazma ir granulės – įvairiais mėlynais, raudonais, violetiniais tonais. Išdžiūvę nudažyti preparatai uždengiami dengiamaisiais stikleliais, kad būtų aiškesnis mikroskopavimo vaizdas. Objektiniai stikleliai skaidrinami 1 min ksileno tirpale, užlašinamas 1 lašas „Thermo Scientific Shandon Consul - Mount Histology Formulation” dengiamosios terpės ilgalaikiam saugojimui. Uždedamas 24 x 60 mm dydžio borosilikatinis dengiamasis stiklelis ir lengvai paspaudinėjant pinceto galu išstumiami susidarę oro burbulai. Laikoma 24 valandas kambario temperatūroje kol sustingsta dengiamoji terpė.

2.3. Pieno liaukos navikų citologinių preparatų tyrimas

Mėginiai analizuojami „Olympus BX41“ mikroskopu, o mikroskopinės nuotraukos daromos histologinių vaizdų analizatoriumi (mikroskopu) „Olympus DP72 BX63“. Pirminė peržiūra atliekama mažuoju padidinimu įvertinant tepinėlio kokybę, lątelių kiekį ir išsidėstymą. Įvertinama ar ląstelės pavienės, ar formuoja grupes, sluoksnius, lakštus. Surandama vieta, kurioje gausu neįprastų, bet gerai nusidažiusių ląstelių. Vidutiniuoju padidinimu įvardijama ląstelių forma, dydis, sukibimas ir rūšis - epitelinės ar mezenchiminės kilmės. Įvertinamas ląstelių pleomorfizmas, anizocitozė, makrocitozė, ląstelingumas. Taip pat stebima ar fone esama uždegiminių ląstelių, makrofagų, ragėjančių ląstelių. Didžiuoju padidinimu įvertinami ląstelių komponentai. Stebint branduolius vertinama chromatino struktūra, esama makrokariozė, anizokariozė ir branduolio vakuolizacija. Vertinami branduolių formos, skaičiaus, branduolio ir citoplazmos santykio pakitimai, jo sienelės sustorėjimas, intesyvus dažymasis. Įvertinus branduolius lyginami branduolėliai, jų skaičius, dydis – makronukleoliozė ir forma - anizonukleoliozė. Galiausiai vertinama citoplazma, jos dažymosi intensyvumas, vakuolizacija, mitozių skaičius 10 regėjimo laukų. Identifikuoti pakitimai registruojami lentelėje, Microsoft Excel 2013

23 programoje. Remiantis pieno liaukos naviko citologiniu vaizdu jis klasifikuojamas ir susumavus pakitimus nustatomas piktybiškumo laipsnis.

2.4. Patologinės medžiagos paruošimas histologiniam tyrimui

Po operacijos pašalintame darinyje atliekama ekscizinė biopsija ir atidalinamas 2 x 2 x 1 cm dydžio audinio gabaliukas su vizualiai matomais patomorfloginiais pakitimais ir nedidele sveikąją jo dalimi. Paimti audiniai nedelsiant fiksuojami vienkartiniuose plastikiniuose indeliuose su 10 proc. formalino fosfatiniu buferiniu tirpalu. 1 cm3 audinio turi tekti 10,0 ml formalino tirpalo, kuriame medžiaga laikoma ne trumpiau nei 72 valandas.

Iš patologinės medžiagos išplaunamas formalinas šaltu tekančiu vandeniu per 24 valandas. Darinys supjaustomas skalpeliu ir sudedamas į biopsines kasetes taip, kad neliestų jos kraštų. Mėginiai dehidratuojami didėjančios koncentracijos (60°, 80°, 96°) etilo alkoholyje 2 – 3 valandas, o po to izopropanolio alkoholyje 1 – 3 valandas. Toliau patologinė medžiaga skaidrinama ksilenu 1 – 3 valandas ir impregnuojama skystu parafinu audinių įliejimo įranga „Tes 99“. Paruošti parafino blokai stingdomi ant šaldymo plokštelės „Pfm Cooling Plate 4100“. Sustingę blokai pjaustomi 3 µm storio nuopjovomis, naudojant „Leica RM 2135“ pusiau automatinį rotacinį mikrotomą. Tyrimui imama kas 5 nuopjova, kuri adatėlės pagalba perkeliama ir ištiesinama 37 °C vandens vonelėje „GFL 1052“. Ištiesinti mėginių pjūviai perkeliami ant objektinių stiklelių ir džiovinami 5 valandas ant 50 °C džiovinimo stalelio „Thermo Scientific Hotplate 312061“ ir 24 valandoms dedami į 37 °C termostatą.

Išdžiūvę mėginiai deparafinuojami pamerkiant į ksileno tirpalą 2 kartus po 10 minučių ir nusausinami nuo ksileno pertekliaus priliečiant prie sugertuko. Po to mėginiai merkiami į izopropanolio alkoholį 5 minutėms, vėliau į 96 ° etilo alkoholį 5 minutėms ir plaunami tekančio vandens srove taip pat 5 minutes. Galiausiai dažoma hematoksilino – eozino (HE) dažais. Pirmiausia mėginiai pamerkiami 10 minučių į Mejerio hematoksilino dažus, po to plaunami tekančio vandens srove 5 minutes ir 2 minutes pamirkomi 96 ° etilo alkoholyje. Dar kartą plaunama tekančio vandens srove ir dažoma eozino dažais 5 minutes ir vėl plaunama vandeniu iki kol dingsta rausva spalva. Baziniai hematokslino dažai jungiasi su bazofilinėmis ląstelės struktūromis (tarp jų ir su branduoliais) ir nudažo juos mėlyna spalva. Ląstelių citoplazmą nudažo ir daugelį jungiamojo audinio struktūrų rožinės – raudonos spalvos atspalviais išryškina rūgštiniai eozino dažai. Paskutinį kartą merkiama į 96 ° etilo alkoholį 3 kartus po 2 minutes dehidratavimui. Pačioje pabaigoje mėginiai skaidrinami 3 atskiruose ksileno tirpaluose, kiekviename palaikant po 5 minutes. Galiausiai užlašinama po 1 lašą „Thermo Scientific Shandon Consul-Mount Histology Formulation” dengiamosios terpės ilgalaikiam

24 saugojimui. Uždedamas 22 x 22 mm dydžio borosilikatinis dengiamasis stiklelis ir lengvai paspaudinėjant pinceto galu išstumiami susidarę oro burbulai. Laikoma 24 valandas kambario temperatūroje kol sustingsta dengiamoji terpė.

2.5. Pieno liaukos naviko histologinių preparatų tyrimas

Mėginiai analizuojami „Olympus BX41“ mikroskopu, o mikroskopinės nuotraukos daromos histologinių vaizdų analizatoriumi (mikroskopu) „Olympus DP72 BX63“. Pirminė peržiūra atliekama mažuoju padidinimu, įvertinant preparato kokybę, audinių struktūras. Surandama vieta, kurioje matomas pieno liaukos liaukinis audinys. Vidutiniuoju padidinimu matoma dominuojanti struktūra – stroma ar parenchima, dominuojančios ląstelės – epitelinės ar mioepitelinės, ar yra kremzlinio, kaulinio audinio elementų, nekrozės zonų, įvertinamas latakų formavimasis procentais. Didžiuoju padidinimu stebimi ląstelių komponentai – branduoliai, branduolėliai, citoplazma ir įvertinami atsižvelgiant į tuos pačius kriterijus kaip ir citologinio tyrimo metu. Identifikuoti pakitimai registruojami lentelėje, Microsoft Excel 2013 programoje. Remiantis pieno liaukos naviko histologiniu vaizdu, jis priskiriamas atitinkamam klasifikacijos tipui ir nustatomas piktybiškumas pasitelkiant 3 – 6 lenteles. Galiausiai palyginami citologinio ir histologinio tyrimų rezultatai.

2.6. Statistinės analizės metodai

Gauti duomenys apdoroti naudojantis Microsoft Excel 2013 programa. Apskaičiuotas citologinio tyrimo kriterijų jautrumas, specifiškumas, teigiamos ir neigiamos prognostinės vertės, apskaičiuoti maknemaro chi kriterijai (χ2) pagal 7 lentelę. Statistiškai reikšmingas rezultatas yra tas, kurio patikimumas yra didesnis nei 95 proc., t.y. kai statistinis reikšmingumas „p“ yra mažesnis nei 0,05 (p < 0,05).

7 lentelė. Histologinio ir citologinio tyrimų kriterijų dvireikšmės kintamosios reikšmės.

Maknemaro chi kriterijaus formulė:

χ2 =

25

3. TYRIMO REZULTATAI

Per metus laiko buvo surinkti 6 kačių ir 14 kalių pieno liaukos navikų mėginiai. Išanalizavus histologinio tyrimo rezultatus, navikai suskaičiuoti ir suskirtsyti pagal histologinės struktūros klasifikaciją (6 pav.). Tiriant kalių mėginius buvo nustatyta viena pieno liaukos hiperplazija ir viena liposarkoma užaugusi šalia pieno liaukos. Iš kitų 12 kalių pieno liaukos navikų didžiąją dalį (4 vnt.), sudarė solidinė karcinoma, kiti dominavę (po 2 vnt.) pieno liaukos navikai buvo tubulinė karcinoma ir piktybinė mioepitelioma. Taip pat pasitaikė po vieną tubulinės karcinomos komplekso, šviesių ląstelių karcinomos, karcinomos su piktybine mioepitelioma ir latakinės karcinomos komplekso atvejį. Tarp kačių taip pat dominavo solidinės karcinomos (2 vnt.). Kitus atvejus sudarė viena tubulopapilinė karcinoma, šviesių ląstelių karcinoma, kribriforminė karcinoma bei komedokarcinoma.

6 pav. Nustatytų pieno liaukos navikų tipas ir kiekis pagal gyvūno rūšį.

Histologiniame vaizde įvertinus darinių ląsteles ir ląstelės komponentus nustatyta, kad visi kalių ir kačių pieno liaukos navikai yra piktybiniai (7 pav.). Tarp jų, 60 proc. sudarė kalių, 30 proc. kačių pieno liaukos navikai. Displazinės kalių patologijos, kaip pieno liaukos skiltinė hiperplazija ir ties pieno liauka lokalizuota piktybinė liposarkoma sudarė po 5 proc. tirtų mėginių.

0 1 2 3 4 5

Karcinoma ir piktybinė mioepitelioma Latakinės karcinomos kompleksas Piktybinė mioepitelioma Solidinė karcinoma Šviesių ląstelių karcinoma Tubulinė karcinoma Tubulinės karcinomos kompleksas Komedokarcinoma Kribriforminė karcinoma Solidinė karcinoma Šviesių ląstelių karcinoma Tubulopapilinė karcinoma

K

alė

K

atė

Nustatytų navikų kiekis vienetais

Na vik ų ti pa s pa ga l g yv ūn o rū šį

26

7 pav. Kalių ir kačių pieno liaukos navikų piktybiškumo analizė.

Visos piktybinės pieno liaukos neoplazijos gali būti laipsniuojamos pagal piktybiškumo rodiklius į I - o, II - o ir III - io laipsnio navikus (8pav.). Suskaičiuota, jog 72 proc. tirtų pieno liaukos navikų mėginių sudaro II - o laipsnio neoplazijos, 17 proc. III - io laipsnio ir 11 proc. I - o laipsnio pieno liaukos navikai.

8 pav. Kalių ir kačių pieno liaukos navikų histologinio tyrimo analizė.

8 lentelėje pateikti nustatyti kalių pieno liaukos navikų tipai, suskirstyti pagal piktybiškumo laipsnį. Abejos tubulinės karcinomos ir piktybinės mioepiteliomos priskirtos II – o laipsnio navikui. Latakinės karcinomos kompleksui, karcinomai su piktybine mioepitelioma, šviesių ląstelių karcinomai taip pat nustatas II – as piktybiškumo laipsnis. Dvi iš keturių solidinių karcinomų buvo I – o, viena II –

30%

60% 5% 5%

Piktybiniai kačių pieno liaukos navikai Piktybiniai kalių pieno liaukos navikai

Displaziniai kalių pieno liaukos pakitimai Kalių sarkoma

11%

72% 17%

27 o ir viena III – io piktybiškumo laipsnio. Tubulinės karcinomos kompleksas priskirtas prie III – io laipsnio pieno liaukos navikų.

8 lentelė. Tirtų kalių pieno liaukos navikų piktybiškumo laipsniai pagal W. Misdorp.

Naviko tipas (kalės) Navikų kiekiai (vnt.) pagal piktybiškumo laipsnį

I – o laipsnio II – o laipsnio III – io laipsnio

Tubulinė karcinoma - 2 -

Latakinės karcinomos kompleksas - 1 -

Karcinoma ir piktybinė mioepitelioma - 1 -

Piktybinė mioepitelioma - 2 -

Solidinė karcinoma 2 1 1

Šviesių ląstelių karcinoma - 1 -

Tubulinės karcinomos kompleksas - - 1

9 lentelėje analogiškai kalių pieno liaukos navikams, suskirstyti kačių pieno liaukos navikai pagal tipus ir jų piktybiškumo laipsnį. Nė vienas navikas nebuvo I – o ir net 5 buvo II – o piktybiškumo laipsnio. Tarp pastarųjų buvo viena komedokarcinoma, kribriforminė karcinoma, šviesių ląstelių karcinoma ir abejos solidinės karcinomos. Rasta tubulopapilinė karcinoma priskirta piktybiškiausiai, III – io laipsnio neoplazijai.

9 lentelė. Tirtų kačių pieno liaukos navikų piktybiškumo laipsniai pagal W. Misdorp.

Naviko tipas (katės) Navikų kiekiai (vnt.) pagal piktybiškumo laipsnį

I – o laipsnio II – o laipsnio III – io laipsnio

Komedokarcinoma - 1 -

Kribriforminė karcinoma - 1 -

Solidinė karcinoma - 2 -

Šviesių ląstelių karcinoma - 1 -

Tubulopapilinė karcinoma - - 1

Vertinant procentaliai pieno liaukos navikų piktybiškumo laipsnio pasiskirstymą tarp gyvūnų rūšių 9 pav., nustatyta, kad 15 proc. kalių rasti ir nei vienai katei nerasti I – o laipsnio pieno liaukos navikai. II – o laipsnio pieno liaukos navikai pasitaikė dažniausiai, kalėms jie sudarė 70 proc., o katėms – 83 proc. jų tirtų neoplazijų. III – io laipsnio pieno liaukos navikai pasitaikė 15 proc. kalių ir 17 proc. kačių.

28

9 pav. Kačių ir kalių pieno liaukos navikų nustatytų piktybiškumo laipsnių pasiskirstymas.

Paruoštuose pieno liaukos navikų histologiniuose ir citologiniuose mėginiuose buvo vertinama 11 kriterijų: branduolio pleomorfizmas, hiperchromatizmas, makrokariozė, anizokariozė, branduolio membranos pakitimai, branduolio ir citoplazmos santykio padidėjimas, mitozių skaičiaus padidėjimas, branduolėlių formos ir kiekio pakitimai, citoplazmos ir branduolio vakuolizacija. Suskaičiavus kuriuose mėginiuose šie požymiai pasireiškė, o kuriuose ne, apskaičiuotas ir 10 lentelėje surašytas jautrumas, specifiškumas, teigiama ir neigiama prognostinė vertė bei diagnozės tikslumas remiantis šiais kriterijais. Vertinant citologinius mėginius mažiausiai jautrus (15 proc.), bet tuo pačiu ir specifiškiausias (100 proc.), ir didžiausios teigiamos prognostinės vertės (100 proc.) požymis buvo mitozių skaičiaus padidėjimas, tačiau jis taip pat buvo ir netiksliausios diagnozės (40 proc. tikslumo) bei 61 proc. neigiamos prognostinės vertės. Nuo šio kriterijaus nedaug atsiliko ir citoplazmos vakuolizacijos požymis, kurio jautrumas siekė vos 28 proc., o specifiškumas - 83 proc., teigiama prognostinė vertė – 80 proc., neigiama prognostinė vertė – 66 proc. ir diagnozės tikslumas – 45 proc. Branduolio vakuolizacijos jautrumas siekė 45 proc., specifiškumas - 77 proc., teigiama prognostinė vertė – 72 proc., neigiama prognostinė vertė – 47 proc., o diagnozės tikslumas – 60 proc. Vieni labiausiai pasiteisinusių kriterijų buvo branduolėlių kiekio pakitimai, kurių jautrumas buvo 81 proc., specifiškumas 75 proc., teigiama prognostinė vertė – 81 proc., neigiama prognostinė vertė – 33 proc., o diagnozės tikslumas – 80 proc., ir branduolio pleomorfizmas, kurio jautrumas buvo 80 proc., specifiškumas – 66 proc., teigiama prognostinė vertė – 92 proc., neigiama prognostinė vertė – 55 proc., o diagnozės tikslumas – 80 proc. Branduolio ir citoplazmos santykio padidėjimo jautrumas buvo 80 proc., specifiškumas – 60 proc., teigiama prognostinė vertė – 40 proc., neigiama prognostinė vertė vos

83 % 17 % 15 % 70 % 15 % 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

I laipsnio II laipsnio III laipsnio

29 10 proc., o diagnozės tikslumas 65 proc. Kitų branduolio pakitimų kaip hiperchromatizmas jautrumas siekė 53 proc., specifiškumas – 60 proc., teigiama prognostinė vertė – 80 proc., neigiama prognostinė vertė – 70 proc., o diagnozės tikslumas – 60 proc. Makrokariozės jautrumas buvo 55 proc., specifiškumas net 90 proc., teigiama prognostinė vertė – 71 proc., neigiama prognostinė vertė – 67 proc., diagnozės tikslumas – 70 proc. Anizokariozės jautrumas siekė 60 proc., specifiškumas – 66 proc., teigiama prognostinė vertė – 70 proc., neigiama prognostinė vertė – 40 proc., o diagnozės tikslumas – 60 proc. Branduolio membranos pakitimų jautrumas buvo 77 proc., specifiškumas – 66 proc., teigiama prognostinė vertė taip pat 66 proc., neigiama prognostinė vertė – 44proc., diagnozės tikslumas siekė 70 proc. Branduolėlių formos pakitimų jautrumas siekė 72 proc., specifiškumas – 77 proc., teigiama prognostinė vertė – 80 proc., neigiama prognostinė vertė – 30 proc., o diagnozės tikslumas – 70 proc. Įvertinus citologinių mėginių radinius buvo nustatyti jų piktybiškumo laipsniai ir palyginti su histologinio tyrimo rezultatais. Tai leido apskaičiuoti, kad citologinio tyrimo metu nustatyto piktybiškumo jautrumas buvo net 90 proc., specifiškumas – 50 proc., teigiama prognostinė vertė – 88 proc., neigiama prognostinė vertė – 30 proc., o diagnozės tikslumas siekė 85 proc. Pagal apskaičiuotą Maknemaro chi kriterijų (χ2_{), nustatyta, kad tik mitozių kiekio padidėjimas (χ}2 _{= 9,09091,} p < 0,01) ir citoplazmos vakuolizacija (χ2 = 5,81818, p < 0,05) yra statistiškai reikšmingi.

10 lentelė. Citologinio pieno liaukų navikų tyrimo įvertinimas.

Vertinamas kriterijus Jautrumas proc. Specifiškumas proc. Teigiama prognostinė vertė proc. Neigiama prognostinė vertė proc. Diagnozės tikslumas proc. Branduolio pleomorfzimas 80 66 92 55 80 Hiperchromatizmas 53 60 80 70 60 Makrokariozė 55 90 71 67 70 Anizokariozė 60 66 70 40 60 Branduolio membranos pakitimai 77 66 66 44 70 Branduolio ir citoplazmos santykio padidėjimas 80 60 40 10 65

Mitozių skaičiaus padidėjimas 15 100 100 61 40

Branduolėlių formos pakitimai 72 77 80 30 70

Branduolėlių kiekio pakitimai 81 75 81 33 80

Citoplazmos vakuolizacija 28 83 80 66 45

Branduolio vakuolizacija 45 77 72 47 60

Naviko piktybiškumas 93 50 88 30 85

Histologinio tyrimo metu pagal audinių ir ląstelių išsidėstymą buvo nustatyti pieno liaukos navikų tipai ir kitos patologijos. Kiekvienam tipui priskirtas piktybiškumo laipsnis. Išnagrinėjus

30 citologinio mėginio ląsteles ir jų komponentų pakitimus, dariniai taip pat suskirstyti pagal piktybiškumą laipsniais. Abiejų tyrimų rezultatai palyginti 10 pav. nubraižytoje diagramoje. Vos 3 tipų, katės komedokarcinomos, vienos iš kalių solidinių karcinomių ir karcinomos su piktybine mioepitelioma, nustatyti laipsniai neatitiko vienas kito. Visų kitų 17 darinių nustatytų piktybiškumo laipsnių citologiniu ir histologiniu tyrimo metodu rezultatai atitiko vienas kito reikšmes.

10 pav. Kalių ir kačių pieno liaukos navikų histologinio ir citologinio tyrimų rezultatų pagal

piktybiškumo laipsnį atitikimo palyginimas.

Nustatyti pieno liaukos navikų piktybiškumo laipsniai citologiniu ir histologiniu metodu taip pat palyginti ir stulpelinėje diagramoje (11 pav.). Citologinio tyrimo rezultatai atitiko histologinio tyrimo rezultatus 85 proc. tikslumu, o 15 proc. atsakymų skyrėsi. Atskirai įvertinti kačių piktybinių navikų

0 1 2 3 4 K rib rifo rm in ė ka rc in om a S oli din ė ka rc in om a Tu bu lo pa pil in ė ka rc in om a Š vies ių lą ste li ų ka rc in oma Ko m ed o k arc in o m a S oli din ė ka rc in om a Tu bu li nė k arc in om a Š vies ių lą ste li ų ka rc in oma Li p o sa rk o m a Tu bu li nė s k ar cin om os k om plek sa s Tu bu li nė k arc in om a Sk ilt elin ė h ip erp la zija Lata kin ės k arc in om os k om plek sa s S oli din ė ka rc in om a S oli din ė ka rc in om a P ik ty bin ė m io ep ite lio m a S oli din ė ka rc in om a Ka rc in om a ir pik ty bin ė m io ep it eli om a S oli din ė ka rc in om a P ik ty bin ė m io ep ite lio m a Katė Kalė L aip sn is

Naviko tipas pagal gyvūno rūšį

31 laipsnių atitikimo rezultatai. Katėms sutapo 83 proc. citologinio ir histologinio tyrimų rezultatų. Vos 17 proc. kačių citologinių ir histoliginių preparatų atsakymai skyrėsi. Taip pat įvertinti kalių piktybinių navikų laipsnių atitikimo rezultatai. Kalėms sutapo 86 proc. citologinio ir histologinio tyrimų rezultatų. Kalių citologinių ir histoliginių preparatų atsakymai skyrėsi 14 proc.

11 pav. Bendro navikų kiekio bei kačių ir kalių pieno liaukos navikų piktybiškumo laipsnio citologinio

ir histologinio tyrimo rezultatų palyginimas.

12 pav. vaizduojamas kalės pieno liaukos solidinės karcinomos histologinis vaizdas su tankiai išsidėsčiusiomis hiperchromatinėmis epitelinėmis ląstelėmis, kurios formuoja skilteles be latakų diferenciacijos, o 13 pav. vaizduojamas to paties naviko - solidinės karcinomos citologinis vaizdas, kuriame matomos pleomorfinės ląstelės su pleomorfiniais, hiperchromatiniais branduoliais, kurios formuoja solidinės struktūros masę.

85% _83% 86% 15% 17% 14% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Bendras pieno liaukų navikų kiekis

Kačių pieno liaukos navikai Kalių pieno liaukos navikai Citologinio tyrimo rezultatai neatitinka histologinio tyrimo rezultatų

32 14 pav. vaizduojamas kalės pieno liaukos intralatakinės karcinomos komplekso histologinis vaizdas, kuriame matomos pleomorfinės epitelinės ir mioepitelinės ląstelės. Epitelinės ląstelės dėstosi keliais sluoksniais ir formuoja latakus su išaugomis į latako spindį. 15 pav. matomas to paties naviko – intralatakinės karcinomos komplekso citologinis vaizdas su pleomorfinėmis epitelinėmis ir mioepitelinėmis ląstelėmis, apsuptomis rožine miksoidine matrica.

12 pav. Solidinės karcinomos histologinis vaizdas,

kalė. Stambios šviesiais dideliais branduoliais ląstelės su negausia pilkai melsva citoplzma formuoja ištisinius plotus (vietomis galima įžiūrėti į acinusus ar kanalėlius panašias struktūras (juodos rodyklės). HE, 20X.

13 pav. Solidinės karcinomos citologinis vaizdas,

kalė. Epitelinės ląstelės su ryškiais branduolėliais, formuojančios solidinę masę, be latakų ar acinusų fragmentų. MGG, 20X.

14 pav. Intralatakinės karcinomos komplekso

histologinis vaizdas, kalė. Pleomorfinės mioepitelinės (raudona rodyklė) ir epitelinės (juoda rodyklė) ląstelės formuojančios latakų išaugas. HE, 10X.

15 pav. Intralatakinės karcinomos komplekso

citologinis vaizdas, kalė. Pleomorfinės epitelinės (juodos rodyklės) ir mioepitelinės (raudonos rodyklės) ląstelės su rožine miksoidine matrica. MGG, 20X

33 16 pav. matomas kalės pieno liaukos piktybinės mioepiteliomos histologinis vaizdas su pleomorfiškomis verpstiškomis mioepitelinėmis ląstelėmis ir pleomorfiniais branduoliais. 17 pav. matomas to paties naviko – piktybinės mioepiteliomos citologinis vaizdas su pleomorfiniais ryškiais branduolėliais ir mioepitelinėmis ląstelėmis.

18 pav. matomas katės pieno liaukos šviesių ląstelių karcinomos histologinis vaizdas su vakuolėtomis ryškios membranos ląstelėmis ir periferijoje išsidėsčiusiais branduoliais. 19 pav. matomas to paties naviko – šviesių ląstelių karcinomos citologinis vaizdas su pleomorfinėmis vakuolėtomis ląstelėmis ir periferijoje išsidėsčiusiais jų pleomorfiniais, anizokariotiniais branduoliais su ryškiais branduolėliais.

16 pav. Piktybinės mioepiteliomos histologinis

vaizdas, kalė. Verpstės formos ląstelės su branduolio pleomorfizmu ir atipija (raudonos rodyklės). HE, 10X.

17 pav. Piktybinės mioepiteliomos citologinis

vaizdas, kalė. Verpstės formos pleomorfinės mioepitelinės ląstelės su ryškia atipija (raudonos rodyklės). MGG dažymo metodas, 20X.

34

18 pav. Šviesių ląstelių karcinomos histologinis

vaizdas, katė. Branduoliai išsidėstę ląstelės periferijoje (juodos rodyklės), o citoplazmoje viena didelė vakuolė arba kelios mažos vakuolės (raudonos rodyklės). HE, 10X.

19 pav. Šviesių ląstelių karcinomos citologinis

vaizdas, katė. Branduoliai išsidėstę ląstelės periferijoje (juodos rodyklės), o citoplazmoje viena didelė (raudona rodyklė) ar mažos daugybinės (žalia rodyklė) vakuolės. MGG, 20X.

35

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Šiuo metu dažniausiai naudojami citolignis ir histologinis tyrimo metodai nustatant kačių ir kalių pieno liaukų navikų piktybiškumą. Histologinis tyrimas yra sudėtingas, daug laiko sąnaudų reikalajauntis, tad ir brangus, bet tuo pačiu ir itin tikslus, tyrimo metodas. Tuo tarpu citologinis tyrimas yra paprastas, pigus ir greitas, todėl galimas atlikti pačioje klinikoje kol klientas laukia tyrimo rezultatų. Žinant citologinio tyrimo privalumus ir norint patikrinti ar jo pakanka nustanant kalių ir kačių pieno liaukos navikų piktybiškumą, buvo atliktas palyginamasis darbas su histologinio tyrimo rezultatais. Daugumoje tyrimų mikroskopuojant pieno liaukų navikų mėginius buvo vertinami bent 10 kriterijų norint nustatyti neoplazijos piktybiškumą. Dažniausiai tai būdavo branduolio parametrai: pleomorfizmas, hiperchromatizmas, makrokariozė, anizokariozė, membranos pakitimai, vakuolizacija branduolio ir citoplazmos santykio padidėjimas, mitozių skaičiaus padidėjimas. Kitus parametrus sudarė branduolėlio formos ir skaičiaus pakitimai, citoplazmos vakuolizacija.

Histologinių 20 pieno liaukos navikų tyrimų metu buvo nustatyta 5 proc. gėrybinių pieno liaukos pakitimų (skiltinė hiperplazija). Kitus 95 proc. sudarė piktybinės patologijos iš kurių 5 proc. buvo sarkomos. Yildrim F. ir Gurel A. atliktais tyrimais Turkijoje iš 100 pieno liaukos navikų displastinės patologijos taip pat sudarė 5 proc., o piktybiniai navikai – 76 proc., iš kurių sarkomos sudarė 8 proc. tirtų mėginių (22). Katėms ir kalėms daugiausiai nustatyta solidinių karcinomų (2 iš 6 ir 4 iš 14 atitinkamai). Tuo tarpu kituose tyrimuose solidinės karcinomos katėms pasitaikė retai, vos 2 atvejai iš 56 arba kitaip tariant šešta pagal dažnumą pasitaikiusi neoplazija, o kalėms ši patologija pasitaikė kiek dažniau, kaip ketvirta pagal dažnumą arba 11 iš 100 pieno liaukos navikų (22,41).

Vertinant piktybiškumo laipsnį, katėms nerasta nei viena I – o laipsnio, 83 proc. II – o laipsnio, ir 17 proc. III – o laipsnio pieno liaukos neoplazijų. Tuo tarpu 2011 metais atliktais tyrimais Portugalijoje, iš 92 pieno liaukos neoplazijų 5,4 proc. sudarė I – o laipsnio, 46,7 proc. buvo II – o laipsnio ir 47,8 proc. – III – io laipsnio navikai (42). Zapulli V. ir jo kolegų 2005 metais parašytame straipsnyje pateikta informacija, kad katėms dažniausiai nustatoma 16 proc. I – o laipsnio, 50 proc. II – o laipsnio ir 27 proc. III – io laipsnio pieno liaukos navikų (43). Tuo tarpu šiame tyrime šunims nustatyta 15 proc. I – o laipsnio, 70 proc. II – o laipsnio ir 15 proc. III – io laipsnio pieno liaukos navikų. Vokietijoje atliktais tyrimais navikų piktybiškumas buvo skirstomas į keturias stadijas ir gauti rezultatai parodė, kad iš 50 kalių pasitaikė 36 proc. I – o laipsnio, 24 proc. II – o laipsnio, 34 proc. III – io laipsnio ir 6 proc. IV – o laipsnio pieno liausko navikų (44).

Nustatant 20 gyvūnų pieno liaukų navikų piktybiškumą, nudažius mėginius MGG dažais citologinio tyrimo metodo jautrumas buvo 93 proc., specifiškumas - 50 proc., teigiama prognostinė