BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas

Medicinos akademija

Biochemijos katedra

Leonid Ivanov, Artūras Kašauskas, Ramunė Morkūnienė,

Dalė Vieţelienė, Laima Ivanovienė

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

Farmacijos fakulteto studentams

Mokymo knyga

Aprobavo LSMU Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto taryba ir LSMU Leidybos komisija 2015-09-09. Protokolas Nr. 9/15

ISBN 978-9955-15-404-4

Recenzentai:

prof. dr. Liudas Ivanauskas

prof. dr. Ilona Sadauskienė

Autoriai:

© Leonid Ivanov, 2015

© Artūras Kašauskas, 2015

© Ramunė Morkūnienė, 2015

© Dalė Vieţelienė, 2015

© Laima Ivanovienė, 2015

TURINYS

1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindinės taisyklės...5

2. Vitaminai...9

2.1. Kokybinės vandenyje tirpių vitaminų reakcijos...10

2.1.1. Reakcija vitaminui B1 nustatyti...10

2.1.2. Reakcija vitaminui B2 nustatyti...10

2.1.3. Reakcija vitaminui B6 nustatyti...11

2.1.4. Reakcija vitaminui PP nustatyti...11

2.2. Vitamino C kiekio nustatymas šlapime...12

Klausimai saviruošai...13

3. Fermentai...14

3.1. Fermentų savitumas ir termolabilumas...14

3.2. pH įtaka fermentų aktyvumui...16

3.3. Seilių -amilazės aktyvumo nustatymas...17

3.4. Kokybinės fermentų reakcijos...18

3.4.1. Tirozinazė...18

3.4.2. Ureazė...19

3.4.3. Peroksidazė...20

Klausimai saviruošai...21

4. Angliavandeniai ir jų apykaita...22

4.1. Glikogeno išskyrimas iš raumenų ir kepenų bei kokybinės reakcijos jam paţinti...23

4.2. Gliukozės kiekio nustatymas kraujo serume fermentiniu būdu...24

4.3. Gliukozės kiekio nustatymas kraujo serume automatiniu analizatoriumi „Cardio Chek“...26

4.4. Laktato dehidrogenazės aktyvumo nustatymas kraujo serume fermentiniu būdu...26

4.5. Kiekybinis piruvo rūgšties nustatymas šlapime...28

Klausimai saviruošai...29

5. Lipidai ir jų apykaita...31

5.1. Cholesterolio koncentracijos nustatymas kraujo serume fermentiniu būdu...32

5.3. Tulţies įtaka lipazės aktyvumui...35

Klausimai saviruošai...36

6. Baltymų (aminorūgščių) apykaita...38

6.1. Kiekybinė skrandţio sulčių analizė...38

6.2. Alanino aminotransferazės koncentracijos kraujo serume nustatymas...40

6.3. Baltymų kiekio nustatymas kraujo serume biureto metodu...41

6.4. Baltymų kiekio nustatymas kraujo serume Bradfordo metodu...43

6.5. Baltymų skaidymas pepsinu...44

6.6. Kreatinino kiekio nustatymas šlapime...45

6.7. Baltymų išskyrimas ir gryninimas...46

6.7.1. Gelfiltracija kolonėlėje...47

6.7.2. Baltymų elektroforezė poliakrilamido gelyje...47

6.8. Karbamido koncentracijos nustatymas kraujo serume...50

Klausimai saviruošai...53

7. Nukleorūgštys ir jų apykaita...54

7.1. Mielių nukleoproteinų hidrolizė ir analizė...55

7.2. Kokybinis šlapimo rūgšties nustatymas šlapime...56

Klausimai saviruošai...56

8. Hormonai...58

8.1. Kokybinės reakcijos adrenalinui nustatyti...58

8.2. Kalcio kiekio nustatymas kraujo serume atvirkštiniu permanganatometriniu metodu...59

8.3. Kalcio kiekio nustatymas kraujo serume naudojant specifinius daţus...60

Klausimai saviruošai...62

9. Šlapimo tyrimas...63

9.1. Šlapimo patologinių sudedamųjų dalių nustatymas...63

9.2. Šlapimo tyrimas automatiniu analizatoriumi „CLINITEK-100“...64

Literatūra...66

1. SAUGAUS DARBO BIOCHEMIJOS LABORATORIJOJE

PAGRINDINĖS TAISYKLĖS

I. BENDRI REIKALAVIMAI

1.1. Studentui, nesilaikančiam šios instrukcijos reikalavimų, taikoma Lietuvos Respublikos įstatymų numatyta drausminė, materialinė, administracinė ir baudţiamoji atsakomybė, priklausomai nuo paţeidimo pobūdţio ir pasekmių. 1.2. Laboratorinius darbus studentams leidţiama dirbti tik išklausius darbų saugos

instruktaţą ir pasirašius instruktaţo registracijos ţurnale, ţinant galimas traumas ir apsinuodijimus ir mokant suteikti pirmąją pagalbą.

1.3. Laboratorijoje leidţiama dirbti tik susipaţinus su laboratorijos įranga:

1.3.1. ţinant vandentiekio ir gamtinių dujų čiaupų išdėstymą ir mokant jais naudotis; 1.3.2. ţinant elektros išjungėjų išdėstymo vietas, jų paskirtį ir mokant jais naudotis; 1.3.3. ţinant gaisro gesinimo priemonių išdėstymo vietas ir mokant jomis naudotis; 1.3.4. ţinant vaistinėlės vietą ir joje esančių pirmos pagalbos priemonių paskirtį. 1.4. Laboratorijoje draudţiama:

1.4.1. būti be chalato;

1.4.2. vaikščioti be reikalo po laboratoriją; 1.4.3. valgyti ir gerti;

1.4.4. įeiti pašaliniams asmenims;

1.4.5. dirbti nesant dėstytojo arba laboranto; 1.4.6. dirbti pašalinius darbus;

1.4.7. vykdyti eksperimentus, nenumatytus mokymo planuose;

1.4.8. naudotis sugedusiais prietaisais, įrengimais, suskilusiais indais ir neţinomomis medţiagomis.

1.5. Studentai privalo:

1.5.1. vykdyti dėstytojų arba jų įgaliotų asmenų nurodymus; 1.5.2. mokėti saugiai dirbti ir netrukdyti saugiai dirbti kitiems; 1.5.3. esant reikalui naudoti individualias saugos priemones;

1.5.4. informuoti dėstytoją apie susiţalojimus laboratorinių darbų metu;

1.5.5. laikytis vidaus tvarkos taisyklių, nevartoti alkoholinių gėrimų bei narkotinių medţiagų. Rūkyti Lietuvos sveikatos mokslų universitete draudţiama; 1.5.6. laikytis asmens higienos taisyklių, priţiūrėti, kad chalatai būtų švarūs.

II. RIZIKOS VEIKSNIAI. SAUGOS PRIEMONĖS NUO JŲ POVEIKIO

2.1. Pavojingi, kenksmingi veiksniai studento darbo vietoje: 2.1.1. elektros srovė dėl netvarkingų elektros prietaisų ir aparatų;

2.1.2. koncentruotų rūgščių ir šarmų poveikis dėl neatsargaus elgesio su jais; 2.1.3. darbas su stikliniais indais – galimi mechaniniai suţalojimai;

2.2. Būtinos saugos priemonės: 2.2.2. medvilninis chalatas;

2.2.3. esant reikalui – guminės pirštinės, neperšlampama prijuostė, apsauginiai akiniai.

III. VEIKSMAI PRIEŠ DARBO PRADŢIĄ

3.1. Prieš pradedant darbą būtina:

3.1.1. susipaţinti su darbo aprašymu ir išsiaiškinti neaiškius klausimus;

3.1.2. išsiaiškinti darbe naudojamų reagentų ir reakcijose susidariusių medţiagų savybes ir saugaus darbo su jais taisykles;

3.1.3. patikrinti darbo vietą, kad ji būtų švari ir tvarkinga, neapkrauta pašalinėmis medţiagomis ir prietaisais;

3.1.4. patikrinti dujų ir vandentiekio čiaupus;

3.1.5. patikrinti elektros prietaisų (centrifugos, oro termostato, vandens termostato) įţeminimą ir įjungimo laidų tvarkingumą;

3.1.6. gauti dėstytojo leidimą dirbti.

IV. VEIKSMAI DARBO METU

4.1. Darbo metu laboratorijoje reikia laikytis tylos, tvarkos ir švaros. Eksperimentus reikia atlikti ramiai, neskubant, susikaupus ir sąmoningai.

4.2. Darbo metu draudţiama:

4.2.1. palikti be prieţiūros veikiančius elektrinius prietaisus ir dujų degiklius; 4.2.2. išeiti iš laboratorijos be dėstytojo leidimo;

4.2.3. dirbti su sugedusiais prietaisais ir suskilusiais indais; 4.2.4. dirbti su neţinomomis medţiagomis;

4.2.5. dirbti su neįţemintais elektros prietaisais; 4.2.6. nešioti reagentus iš jiems skirtų vietų;

4.2.7. apkrauti darbo vietą knygomis, nereikalingais reagentais, indais ir prietaisais; 4.2.8. laikyti be reikalo įjungtus elektros prietaisus ir dujų degiklius;

4.2.9. pilti chemines medţiagas į kriauklę (panaudotus reagentus pilti į specialius indus, esančius traukos spintoje).

4.3. Dirbant būtina sekti bandymo eigą, laikytis aprašyme nurodyto darbo reţimo. 4.4. Dirbant su koncentruotomis rūgštimis, šarmais, degiomis ir nemalonaus kvapo medţiagomis bandymus reikia atlikti tik traukos spintoje, naudojantis individualiomis saugos priemonėmis: akiniais, skydeliais ir pirštinėmis.

4.5. Šildant skysčius mėgintuvėliuose reikia naudotis specialiais laikikliais, o mėgintuvėlį nukreipti į tą pusę, kur nėra ţmonių.

4.6. Išpiltus ant grindų ar stalo reagentus, taip pat sudauţytus indus būtina tuoj pat, vadovaujant dėstytojui ar laborantui, pašalinti laikantis reikalingų atsargumo priemonių.

4.7. Dirbant su centrifuga svarbu: įjungti galima tik sudėjus priešpriešai subalansuotus mėgintuvėlius ir uţdengus; atidengti tik pilnai sustojus rotoriui.

4.8. Naudojantis termostatu sandariai uţdaryti termostato duris.

V. STUDENTO VEIKSMAI AVARINIAIS (YPATINGAIS) ATVEJAIS

5.1. Sugedus įrengimams ar susidarius pavojingai situacijai, reikia nedelsiant nutraukti darbus ir apie tai pranešti dėstytojui.

5.2. Įvykus nelaimingam atsitikimui, reikia suteikti pirmąją medicinos pagalbą nukentėjusiam, prireikus iškviesti gydytoją, išsaugoti nepakeistą įvykio vietą, jei tai negresia aplinkinių gyvybei ir sveikatai; apie įvykį pranešti tiesioginiam darbų vadovui.

5.3. Pirmoji pagalba nukentėjusiam turi būti suteikta nedelsiant.

5.4. Patekus cheminėms medţiagoms į akis, ant veido, rankų arba rūbų tuoj pat tas vietas gausiai plauti vandeniu. Jei nukentėjęs negali to padaryti pats, jam turi padėti kiti asmenys, esantys laboratorijoje.

5.5. Apie kiekvieną nelaimingą atsitikimą būtina informuoti dėstytoją.

5.6. Esant rimtoms traumoms, nudegimams arba apsinuodijimams, nedelsiant iškviesti greitąją medicininę pagalbą.

5.7. Gavus elektros smūgį, nedelsiant išjungti elektros srovę. Jei nukentėjęs neteko sąmonės (arba net atrodo miręs), iki atvykstant greitajai pagalbai daryti dirbtinį kvėpavimą ir širdies masaţą.

VI. VEIKSMAI BAIGUS DARBĄ

6.1.1. išjungti elektrinius prietaisus, dujas, vandenį;

6.1.2. sutvarkyti darbo vietą, sustatant prietaisus, reagentus, indus į jiems skirtas vietas;

6.1.3. išplauti indus ir nuvalyti stalą; 6.1.4. nusiplauti rankas.

2. VITAMINAI

Vitaminai – nedidelės molekulinės masės biologiškai aktyvūs organiniai junginiai, būtini organizmo medţiagų apykaitai ir gyvybinei veiklai. Ţmogaus ląstelėse jie nesintetinami, todėl turi būti gaunami su maistu. Ţmogui jų reikia labai nedaug (paros norma – nuo kelių mikrogramų iki keliolikos miligramų, tik vitamino C reikia daugiau – keliasdešimt miligramų per parą). Kai kuriuos vitaminus (B grupės ir vitaminą K) sintetina ţarnyno bakterijos, tačiau jų organizmui nepakanka.

Terminą vitaminai pasiūlė lenkų chemikas M. Funkas, kuris vitamino B1 struktūroje nustatė aminogrupę ir norėjo paţymėti šio junginio svarbą gyvybei: vitaminai – gyvybės aminai (lot. vita – gyvybė, gyvenimas + aminum – aminai). Vėliau, atradus kitus vitaminus, paaiškėjo, kad vitaminai yra įvairios struktūros organiniai junginiai. Kai kurie jų neturi nei aminogrupės, nei azoto.

Vitaminai, atsiţvelgiant į jų tirpumą, skirstomi į dvi grupes:

1) riebaluose tirpūs vitaminai: vitaminas A (retinolis, antikseroftalminis), vitaminas D (kalciferolis, antirachitinis), vitaminas E (tokoferolis, antisterilinis), vitaminas K (filochinonas, antihemoraginis);

2) vandenyje tirpūs vitaminai: vitaminas B1 (tiaminas, antineuritinis), vitaminas B2 (riboflavinas, augimo vitaminas), vitaminas PP arba B3 (nikotino rūgštis arba nikotinamidas, antipelagrinis), vitaminas B5 (pantoteno rūgštis, antidermatitinis), vitaminas B6 (piridoksolis, piridoksalis arba piridoksaminas, antidermatitinis), folio rūgštis (vitaminas B9, antianeminis), vitaminas B12 (kobalaminas, antianeminis), vitaminas H (biotinas, antiseborėjinis), vitaminas C (askorbo rūgštis, antiskorbutinis).

Visi vandenyje tirpūs vitaminai, išskyrus vitaminą C, vadinami B grupės vitaminais. Kai vandenyje tirpių vitaminų koncentracija kraujo plazmoje didesnė uţ inkstų slenkstį, jie išskiriami su šlapimu. Iš vandenyje tirpių vitaminų organizme susidaro kofermentai, būtini fermentų veikimui.

Ligos, kuriomis susergama, kai ţmogus negauna vitaminų, vadinamos avitaminozėmis. Jeigu vitaminų gaunama nepakankamai, išsivysto hipovitaminozės. Daţnesnės yra ne vieno, bet kelių vitaminų hipovitaminozės (polihipovitaminozės). Kai organizmas gauna vitaminų per daug, prasideda hipervitaminozės. Daţniausiai perdozuojami riebaluose tirpūs vitaminai A, D ir K. Dideli jų kiekiai organizmui yra

toksiški. Pavyzdţiui, vitamino D hipervitaminozės atveju iš kaulinio audinio išsiskiria daug kalcio, jis patenka į organizmo skysčius, ima kalkėti minkštieji audiniai.

2.1. KOKYBINĖS VANDENYJE TIRPIŲ VITAMINŲ REAKCIJOS 2.1.1. Reakcija vitaminui B1 nustatyti

Veikiant oksidatoriams tiaminas virsta tiochromu:

Darbo eiga:

1. Į mėgintuvėlį įlašinamas 1 lašas 0,1% tiamino tirpalo, 5 lašai 5% NaOH (natrio hidroksido) tirpalo ir 1 lašas 5% K3[Fe(CN)6] (raudonosios kraujo druskos; kalio heksacianoferato III) tirpalo. Sumaišoma.

2. Mėgintuvėlio turinys pašildomas. Tiaminas virsta tiochromu, tirpalas nusidaţo geltona spalva.

2.1.2. Reakcija vitaminui B2 nustatyti

Redukuojamas riboflavinas iš pradţių virsta raudonos spalvos rodoflavinu, vėliau – bespalviu leukoflavinu.

Darbo eiga:

1. Į mėgintuvėlį įlašinama 10 lašų 0,25% riboflavino tirpalo ir 5 lašai koncentruoto HCl (vandenilio chlorido; druskos rūgšties) tirpalo.

2. Įmetamas gabalėlis cinko. Tirpalas iš pradţių įgauna raudoną spalvą, o paskui spalva išnyksta.

2.1.3. Reakcija vitaminui B6 nustatyti Vitaminas B6 yra piridino darinys.

Jis su FeCl3 (geleţies (III) chloridu) sudaro raudonos spalvos junginį.

Darbo eiga:

1. Į mėgintuvėlį įlašinami keli lašai 5% vitamino B6 tirpalo ir 1 lašas 5% FeCl3. Tirpalas nusidaţo raudona spalva.

2.1.4. Reakcija vitaminui PP nustatyti Darbo eiga:

1. Apie 10 mg nikotino rūgšties ištirpinama 10-20 lašų 10% CH3COOH (etano (acto) rūgšties) tirpalo. Tirpinama šildant.

2. Į verdantį tirpalą įpilamas toks pats tūris 5% (CH3COO)2Cu (vario acetato) tirpalo. Mišinys susidrumsčia, įgauna ţydrą spalvą, o pastovėjus išsiskiria mėlynos nuosėdos.

Riboflavinas Leukoflavinas

2.2. VITAMINO C KIEKIO NUSTATYMAS ŠLAPIME

Vitamino C (asko rbo rūgštis) kiekis ţmogaus kraujo plazmoje yra 0,7-1,2 mg/100 ml. Kai maiste nedaug vitamino C, jo šlapime nerandama. Suvartojus didesnius vitamino C kiekius, dalis jo išsiskiria su šlapimu.

Vitaminui C yra būdingos stiprios redukcinės savybės, jis dalyvauja organizme vykstančiose oksidacijos-redukcijos reakcijose, pavirsdamas dehidroaskorbo rūgštimi.

Darbo eiga:

1. Į 200 ml kolbą įpilama 10 ml tiriamo šlapimo, 100 ml vandens ir 1 ml ledinės CH3COOH tirpalo.

2. Tirpalas titruojamas 0,001 N 2,6-dichlorfenolindofenolio tirpalu, kol jis įgauna silpnai roţinę spalvą.

3. Atsiţvelgiant į suvartotą titravimui 0,001 N 2,6-dichlorfenolindofenolio kiekį, apskaičiuojamas vitamino C kiekis paros šlapime. 1 ml 0,001 N

2,6-4. Ţinant, kad paros šlapimo kiekis yra 1500 ml, vitamino C kiekis paros šlapime randamas pagal tokią išraišką:

KLAUSIMAI SAVIRUOŠAI Vitaminai, jų biologinis vaidmuo:

1. Ką vadiname vitaminais?

2. Išvardinkite: a) vandenyje tirpius vitaminus, b) riebaluose tirpius vitaminus. 3. Kuriems (vandenyje ar riebaluose tirpiems ) vitaminams būdingi hipervitaminozės

reiškiniai? Apibūdinkite šiuos reiškinius.

4. Apibūdinkite riebaluose tirpių vitaminų biologinį vaidmenį organizme. 5. Apibūdinkite biochemines funkcijas bei hipovitaminozių poţymius šiems

vitaminams: tiaminas (vitaminas B1); riboflavinas (vitaminasB2); niacinas, nikotino rūgštis (vitaminas PP, vitaminas B3); pantoteno rūgštis (vitaminas B5); piridoksolis (vitaminas B6 ); ; ciankobalaminas (vitaminas B12); folio rūgštis (vitaminas B9); biotinas (vitaminas H); askorbo rūgštis (vitaminas C).

3. FERMENTAI

Fermentai (enzimai) – biologinėse sistemose vykstančių reakcijų katalizatoriai. Dauguma fermentų yra tirpūs globuliniai baltymai (išskyrus nedidelę grupę RNR molekulių – ribozimų, kurioms būdingas katalizinis aktyvumas).

Fermentai, kaip ir visi katalizatoriai, didina tik energiškai palankių reakcijų greitį, maţindami aktyvacijos energiją. Jie vienodai greitina pusiausvyrinės reakcijos tiesiogines ir grįţtamąsias reakcijas, t.y. nekeičia reakcijos krypties, bet pagreitina reakcijos pusiausvyros pastovumą. Fermentams būdingos išskirtinės savybės: didelis katalizinis pajėgumas – pagreitina reakciją 107-1010 kartų (pvz., fermentas ureazė - net 1014 kartų); savitumas – veikia tik vieną ar keletą panašios struktūros junginių. Fermentai yra labai jautrūs aplinkos sąlygų (pvz., temperatūros ir pH) pokyčiams; denatūruojami praranda aktyvumą. Fermentų aktyvumas gali būti reguliuojamas, jiems sąveikaujant su savitosiomis molekulėmis, fiziologiniais efektoriais (kovalentinė modifikacija, alosoterinė sąveika). Dėl šios savybės sudėtingos fermentinės sistemos veikia suderintai ir garantuoja ląstelės cheminių procesų atitikimą besikeičiančiomis aplinkos sąlygomis.

Fermentų yra visuose audiniuose ir kūno skysčiuose. Viduląsteliniai fermentai katalizuoja metabolinių kelių reakcijas; plazminės membranos fermentai, reaguodami į ląstelės išorės signalus, katalizuoja reakcijas ląstelės viduje; kraujo fermentai dalyvauja krešėjimo procese. Beveik visi gyvybiniai procesai priklauso nuo fermentų veikimo.

Atsiţvelgiant į sudėtį, fermentai skirstomi į paprastuosius ir sudėtinius. Paprastieji fermentai sudaryti tik iš baltymo, o sudėtiniuose fermentuose yra ir nedidelė organinė molekulė – kofermentas (pvz., NAD+_{, FAD). Labai daţnai} sudėtinių fermentų kofermentų pirmtakai yra vandenyje tirpūs vitaminai.

3.1. FERMENTŲ SAVITUMAS IR TERMOLABILUMAS

Svarbiausia fermentų savybė yra jų savitumas substratams. Pavyzdţiui, sacharazė skaido sacharozę į gliukozę ir fruktozę, o seilių amilazė hidrolizuoja glikogeną ir krakmolą iki maltozės.

Kita būdinga fermentų savybė yra jų termolabilumas. Virinant fermentai denatūruojami ir praranda biologinį aktyvumą. Fermentai yra aktyviausi esant temperatūrai, kuri vadinama optimalia fermento veikimo temperatūra. Daugelio

Darbo eiga:

1. Imami 6 mėgintuvėliai ir sunumeruojami. Į pirmą, antrą ir trečią mėgintuvėlius įpilama po 3 ml 2% sacharozės tirpalo, o į 4, 5 ir 6 – po 3 ml 1% krakmolo tirpalo.

2. Į pirmą ir ketvirtą mėgintuvėlius įpilama po 0,5 ml sacharazės tirpalo (mielių ekstrakto).

3. Į antrą ir penktą mėgintuvėlius įpilama po 0,5 ml 5 kartus praskiestų seilių. 4. Į trečią mėgintuvėlį įpilama 0,5 ml pavirinto sacharazės tirpalo.

5. Į šeštą mėgintuvėlį įpilama 0,5 ml 5 kartus praskiestų ir pavirintų seilių.

6. Kiekvieno mėgintuvėlio turinys gerai sumaišomas ir visi šeši mėgintuvėliai įdedami į 38 ºC temperatūros termostatą ar vandens vonią.

7. Po 10 min. mėgintuvėliai išimami iš termostato ir ataušinami.

8. Norint patikrinti, ar susidarė sacharozės skilimo produktai, pirmame, antrame ir trečiame mėgintuvėliuose atliekama Felingo reakcija: iš jų paimama po 2 ml tirpalo ir perpilama į kitus atskirus mėgintuvėlius. Po to į juos įpilama po 1 ml Felingo I ir Felingo II reagentų (Felingo I – 4% CuSO4 (vario (II) sulfato) tirpalas; Felingo II – šarminis K, Na tartrato tirpalas). Sumaišoma ir kaitinama, kol susidaro oranţinės spalvos nuosėdos.

9. Norint patikrinti, ar suskilo krakmolas, į 4, 5 ir 6 mėgintuvėlius įlašinama po 1 lašą jodo tirpalo. Jei krakmolas suskilo, mėgintuvėlio turinys nusidaţo ruda spalva, jei nesuskilo – mėlyna.

10. Reakcijų rezultatai paţymimi lentelėje nurodant spalvą.

Mėgintuvėlio Nr. Substratas Nevirintas fermentas Virintas fermentas Felingo reakcija Reakcija su jodu 1 sacharozė sacharazė - 2 sacharozė amilazė - 3 sacharozė - sacharazė 4 krakmolas sacharazė - 5 krakmolas amilazė - 6 krakmolas - amilazė

3.2. pH ĮTAKA FERMENTŲ AKTYVUMUI

Fermentų aktyvumas priklauso nuo terpės rūgštingumo, t.y. nuo pH. Kiekvienas fermentas aktyviausias, esant optimaliai vandenilio jonų koncentracijai. Pavyzdţiui, seilių α-amilazei optimalus pH yra apie 7, o skrandţio pepsinui jis yra nuo 1,5 iki 2,5.

Darbo eiga:

1. Į 8 mėgintuvėlius pilami lentelėje nurodyti 0,2 M Na2HPO4 (natrio hidrofosfato) ir 0,1 M citrinos rūgšties tirpalų kiekiai. Gaunami atitinkamo pH (5,0 – 8,0) buferiniai tirpalai.

2. Į kiekvieną mėgintuvėlį pripilama po 5 ml 0,5% krakmolo tirpalo ir po 2,5 ml 250 kartų praskiestų seilių.

3. Kiekvieno mėgintuvėlio turinys gerai sumaišomas ir visi 8 mėgintuvėliai dedami į 38 ºC temperatūros termostatą ar vandens vonią.

4. Po 15 min. iš penkto mėgintuvėlio keli lašai tirpalo įlašinami į atskirą mėgintuvėlį, į kurį prieš tai įlašintas 1 lašas jodo tirpalo. Jei tirpalas nusidaţo mėlynai, t.y. krakmolas dar nesuskilo, bandymas kartojamas kas minutę, kol krakmolas suskyla ir tirpalas nusidaţo ruda spalva.

5. Į visus mėgintuvėlius, pradedant nuo pirmo, įlašinama po 2 lašus jodo tirpalo. Gerai sumaišoma. Stebima, kuriame mėgintuvėlyje krakmolas visiškai suskilo. 6. Rezultatai surašomi į lentelę.

Mėgintuvėlio Nr. 0,2 M Na2HPO4 tirpalo (ml) 0,1 M citrinos rūgšties tirpalo (ml) pH Reakcija su jodu (spalva) 1 1,29 1,21 5,0 2 1,51 0,99 5,8 3 1,65 0,85 6,2 4 1,82 0,68 6,6 5 1,93 0,57 6,8 6 2,06 0,44 7,0 7 2,27 0,23 7,4 8 2,43 0,07 8,0

3.3. SEILIŲ -AMILAZĖS AKTYVUMO NUSTATYMAS

Seilių -amilazės aktyvumas nustatomas remiantis pakitusiu substrato (krakmolo) kiekiu per tam tikrą laiko vienetą, esant optimalioms veiklos sąlygoms. Jis išreiškiamas mililitrais 0,1% krakmolo tirpalo, kurį suskaido 1 ml nepraskiestų seilių, esant 38 ºC temperatūrai per 30 min.

Seilių -amilazės aktyvumui turi įtakos aktyvikliai ir slopikliai: NaCl (natrio chloridas) aktyvina, CuSO4 (vario sulfatas) slopina šį fermentą.

Darbo eiga:

1. Į 10 sunumeruotų mėgintuvėlių pilama po 1 ml distiliuoto vandens.

2. Į atskirą mėgintuvėlį pilama 1 ml seilių, jos praskiedţiamos 9 ml vandens. Mėgintuvėlio turinys gerai sumaišomas. Gaunama 10 kartų praskiestos seilės. 3. Į pirmą mėgintuvėlį pipete įpilama 1ml 10 kartų praskiestų seilių.

4. Mišinys pirmame mėgintuvėlyje sumaišomas, įtraukiant į pipetę tirpalo ir vėl jį išpilant. Po to 1 ml gauto mišinio pipete perpilamas į antrą mėgintuvėlį, mišinys sumaišomas, 1 ml gauto mišinio perpilamas į trečią mėgintuvėlį ir t.t. Iš dešimto mėgintuvėlio 1 ml tirpalo išpilamas lauk. Gaunami įvairiai praskiestų seilių (-amilazės) tirpalai: kiekviename po jo esančiame mėgintuvėlyje fermento yra dvigubai maţiau negu prieš jį esančiame (1/20, 1/40, 1/80 ir t.t.).

5. Kai tiriamas seilių -amilazės aktyvumas, į visus mėgintuvėlius įpilama po 1 ml vandens. Kai tiriama aktyviklių įtaka -amilazės aktyvumui, vietoj 1 ml vandens į visus mėgintuvėlius pilama po 1 ml 1% NaCl tirpalo, jei tiriama slopiklių įtaka – pilama po 1 ml 1% CuSO4 tirpalo. Tiriant seilių -amilazės aktyvumą, aktyviklių ir slopiklių įtaką -amilazės aktyvumui, vartojamos tos pačios seilės.

6. Į visus10 mėgintuvėlių (pradedant nuo dešimto, po to į devintą ir t.t.) įpilama po 2 ml 0,1% krakmolo tirpalo ir mėgintuvėlių turinys gerai sumaišomas.

7. Visi mėgintuvėliai šildomi, esant 38 ºC temperatūrai, termostate arba vandens vonioje 30 min.

8. Po 30 min. mėgintuvėliai išimami iš termostato, ataušinami šalto vandens srove, kiekvieno mėgintuvėlio turinys sumaišomas.

9. Į kiekvieną mėgintuvėlį įlašinama po 2 lašus jodo tirpalo ir stebima, kokia spalva nusidaţys mėgintuvėlių turinys (nuo geltonos ik mėlynos spalvos). Geltona spalva rodo, kad krakmolas visiškai suskilo, rausva – yra tarpinių

krakmolo skilimo produktų (dekstrinų), mėlyna – yra krakmolo ar pradinių jo skilimo produktų.

10. Apskaičiuojamas tiriamųjų seilių -amilazės aktyvumas. Mėgintuvėlyje, kuriame tirpalas yra mėlynos spalvos, krakmolas nesuskaidytas. Mėgintuvėlyje, kuriame tirpalas yra rudos spalvos, krakmolas pakankamai suskaidytas.

Pavyzdţiui, penktasis mėgintuvėlis yra paskutinis, kuriame tirpalas yra rudos spalvos. Šiame mėgintuvėlyje nepraskiestų seilių buvo 1/320 ml, todėl galima parašyti:

1/320 ml seilių suskaidė 2 ml 0,1% krakmolo tirpalo 1ml seilių suskaidė x ml 0,1% krakmolo tirpalo

x 2 1 

1 320/ 640 (ml)

Matome, kad 1 ml nepraskiestų seilių per 30 min, esant 38 ºC temperatūrai suskaidė 640 ml 0,1% krakmolo tirpalo.

Analogiškai apskaičiuojamas ir seilių -amilazės aktyvumas, pridėjus aktyviklių ar slopiklių. Duomenys, gauti nustačius seilių -amilazės aktyvumą, lyginami su rezultatais, gautais, pridėjus aktyviklio ar slopiklio. Daromos išvados.

3.4. KOKYBINĖS FERMENTŲ REAKCIJOS

Fermentams nustatyti savitų reagentų nėra. Fermento buvimas tirpale nustatomas pagal pridėto atitinkamo substrato pokytį. Substrato pokytis arba jo skilimo produktai nustatomi savitosiomis spalvinėmis reakcijomis.

3.4.1. Tirozinazė

Tirozinazės – tai fermentai oksidazės, kurie oksiduoja substratus molekuliniu (oro) deguonimi. Tirozinazė katalizuoja dvi reakcijas:

2. Oksiduoja difenolius.

Tirozinas, veikiamas šio fermento, virsta tamsios spalvos medţiaga, kuri yra panaši į natūralius plaukų, odos ir panašius pigmentus – melaninus.

Tirozinazės yra grybuose, bulvėse, cukriniuose runkeliuose, grūduose ir kt.

Darbo eiga:

1. Ţalios, nuluptos bulvės paviršinis sluoksnis plonai supjaustomas ir suberiamas į grūstuvę.

2. Bulvės sutrinamos dalimis, uţpilant 10 ml vandens, ir filtruojamos.

3. Į du mėgintuvėlius įpilama po 1 ml filtrato. Vieno mėgintuvėlio turinys virinamas 1 - 2 min. ir atšaldomas.

4. Į abu mėgintuvėlius įlašinama po 5 -10 lašų 0,1% tirozino tirpalo, jie statomi į 35 - 40 ºC temperatūros vandens vonią.

5. Kas 5 min. mėgintuvėliai supurtomi. Jei yra tirozinazės, tirpalas iš pradţių įgauna rausvą, vėliau rudą ir net juodą spalvą.

3.4.2. Ureazė

Ureazė yra hidrolazių klasės fermentas. Ji hidrolizuoja CO(NH2)2 (karbamidą, urea, šlapalą):

CO(NH2)2 + H2O → CO2 + 2NH3

Ureazės yra kai kuriose bakterijose, sojos pupelėse. Jos veikimo pH ribos yra labai plačios, geriausiai veikia neutralioje aplinkoje.

Darbo eiga:

1. Į 2 ml 2% karbamido tirpalo (arba šlapimo) įberiama 0,5 g sojos miltelių ir suplakama. Jaučiamas išsiskiriančio amoniako kvapas.

2. Po kelių minučių įlašinami 2 lašai 0,1% fenolftaleino tirpalo. Mišinys parausta.

3.4.3. Peroksidazė

Peroksidazės yra fermentai, katalizuojantys medţiagų oksidaciją atominiu deguonimi. Atominis deguonis gaunamas skaidant H2O2 (vandenilio peroksidą) ar kitus peroksidus:

H2O2 → H2O + O

Peroksidazės oksiduoja junginius, turinčius fenolinę struktūrą. Susidaro spalvoti junginiai.

Darbo eiga:

1. Į 4 mėgintuvėlius įpilama po 1 ml 1% pirogalolio tirpalo. 2. Į pirmą mėgintuvėlį įlašinami 2 lašai 2% H2O2 ir 1 ml H2O.

3. Į antrą mėgintuvėlį įpilama 1 ml tirpalo, turinčio aktyvios peroksidazės – krienų ekstrakto.

4. Į trečią mėgintuvėlį įpilama 1 ml krienų ekstrakto ir 2 lašai H2O2.

5. Į ketvirtą mėgintuvėlį įpilama 1 ml pavirinto krienų ekstrakto ir 2 lašai H2O2. 6. Stebimas spalvų pokytis. Rezultatai surašomi į lentelę.

Mėgintuvėlio Nr. Substratas (pirogalolio tirpalas, ml) Vandenilio

akceptorius Fermentas Spalva

1 1 H2O2 –

2 1 – +

3 1 H2O2 +

4 1 H2O2 +*

KLAUSIMAI SAVIRUOŠAI Fermentai, jų savybės

1. Kuo skiriasi fermentai nuo kitų katalizatorių? Išvardinkite fermentinės katalizės ypatybes.

2. Kokie yra fermentų klasifikacijos principai? Išvardinkite fermentų klases. 3. Fermentų aktyvumo matavimo vienetai.

4. Koveiksniai ir kofermentai: jų struktūra ir vaidmuo fermentinėse reakcijose. 5. Apibūdinkite fermentų aktyvųjį centrą: kas sudaro aktyvųjį centrą, kokia jo

paskirtis?

6. Kokie veiksniai turi įtakos fermentinės reakcijos greičiui?

7. Pavaizduokite grafiškai, kaip priklauso fermentų aktyvumas nuo temperatūros, pH, substrato koncentracijos ir fermento kiekio. Paaiškinkite.

8. Į kokias grupes skirstomi fermentų slopikliai pagal veikimo mechanizmą? 9. Paaiškinkite fermentų aktyvumo reguliavimą (alosteriniu ir kovalentiniu būdais)

principus.

10. Izofermentai, jų charakteristika. Kokia izofermentų reikšmė ligų diagnostikoje? 11. Pateikite fermentų, naudojamų ligų diagnostikai ir gydymui, pavyzdţių.

4. ANGLIAVANDENIAI IR JŲ APYKAITA

Angliavandeniai (sacharidai) yra polihidroksialdehidai arba polihidroksiketonai bei jų dariniai. Bendra monosacharidų formulė (CH2O)n. Tai labai gausi organinių junginių klasė. Angliavandeniai sintetinami augaluose fotosintezės metu panaudojant saulės energiją iš CO2 (anglies dioksido) ir vandens, o gyvūnai juos turi gauti su maistu. Angliavandeniams būdinga biologinių funkcijų įvairovė: jie yra energijos šaltinis; įeina į kitų junginių sudėtį (nukleorūgščių, kofermentų); yra pagrindinis augalų ir bakterijų sienelių komponentas; jie svarbūs tarpląsteliniams ryšiams, ląstelės atpaţinimo, signalo perdavimo procesuose. Organizme yra nedidelės angliavandenių atsargos (krakmolas – augaluose, glikogenas – gyvūnuose).

Monosacharidai reaguoja tarpusavyje, sudarydami glikozidinius ryšius. Dvi monosacharidų molekulės sudaro disacharidus; nuo 2 iki 10-ies monosacharidų – oligosacharidus. Polisacharidais vadinami polimerai, kuriuos sudaro daugiau nei dešimt monomerų. Tiek oligosacharidai, tiek polisacharidai gali būti homologiški (monomerai vienodi) arba mišrūs (sudaryti iš skirtingų monosacharidų). Polisacharidų molekulės gali būti linijinės arba šakotos struktūros, nes bet kuri iš daugelio monosacharidų molekulėje esančių hidroksigrupių gali sudaryti ryšį su kito monosacharido keto- arba aldehidine grupe. Svarbiausias ţmogaus monosacharidas – gliukozė. Gyvūninėse ląstelėse kaupiamas glikogenas – šakotas polimeras, kuriame gliukozės monomerai tarpusavyje susijungę -1,4 ir -1,6 glikozidiniais ryšiais. Augalinėse ląstelėse kaupiamą polisacharidą krakmolą sudaro amilozė – linijinis polimeras, sudarytas iš gliukozės monomerų, tarpusavyje susijungusių -1,4 glikozidiniais ryšiais ir amilopektinas, kuriame, kaip ir gyvūnų glikogene, gliukozės monomerai tarpusavyje susijungę -1,4 ir -1,6 glikozidiniais ryšiais. Augalų ląstelių sienelėse esančiame linijiniame polisacharide celiuliozėje gliukozės molekulės susijungusios -1,4 glikozidiniais ryšiais. Šio ryšio gyvūnų fermentai neskaido.

4.1. GLIKOGENO IŠSKYRIMAS IŠ RAUMENŲ IR KEPENŲ IR REAKCIJOS GLIKOGENUI ATPAŢINTI

Glikogeno koncentracija raumenyse yra 0,5 – 1%, o kepenyse – apie 8% drėgno audinio masės. Šis polisacharidas lengvai nusodinamas iš tirpalų etanoliu. Sąveikaudamas su jodu jis nusidaţo raudona spalva.

Darbo eiga:

1. Imama apie 1 g švieţių raumenų ar kepenų, susmulkinama atšaldytoje grūstuvėje, uţpilama 4 ml verdančio vandens.

2. Turinys perpilamas į platų stiklinį mėgintuvėlį ir virinamas 2-3 min. Nusėda baltymų nuosėdos.

3. Iš plataus mėgintuvėlio turinys perpilamas į grūstuvę ir trinamas, kol pasidaro vienalytė masė – košelė.

4. Košelė skiedţiama 5 ml vandens, perpilama į platų stiklinį mėgintuvėlį, parūgštinama 5 lašais 1% CH3COOH tirpalo ir 20 min. virinama, visą laiką lašinant vandenį, kad neišdţiūtų. Glikogenas pereina į tirpalą.

5. Nuosėdos filtruojamos, o filtratas (glikogeno tirpalas) dalinamas į tris dalis ir atliekamos reakcijos glikogenui atpaţinti:

a) Glikogeno nusodinimas etanoliu.

Į 5 lašus filtrato įpilami 5 lašai 96% C2H5OH (etanolio). Glikogeno dalelės netenka vandens apvalkalėlio ir nusėda kaip amorfinės nuosėdos.

b) Reakcija su jodu.

Imami 2 mėgintuvėliai. Į vieną mėgintuvėlį lašinami 5 lašai filtrato, o į kitą – 5 lašai vandens. Į abu mėgintuvėlius įlašinama po 1-2 lašus 1% jodo tirpalo. Pirmame mėgintuvėlyje tirpalas nusidaţo raudona spalva, nes jodas adsorbuojamas ant glikogeno dalelių. Antrame mėgintuvėlyje tirpalas nusidaţo geltona spalva.

c) Glikogeno hidrolizė seilių α-amilaze.

Į mėgintuvėlį įlašinami 5 lašai filtrato ir 1 lašas 10 kartų praskiestų seilių. Sumaišoma ir po 5 min. įlašinamas 1 lašas 1% jodo tirpalo. Mėgintuvėlyje esantis turinys nusidaţo geltona spalva, nes seilių α-amilazė suskaidė glikogeną.

4.2. GLIUKOZĖS KONCENTRACIJOS NUSTATYMAS KRAUJO SERUME FERMENTINIU BŪDU

Pagrindinis kraujo angliavandenis – gliukozė. Ji tolygiai pasiskirsto tarp kraujo plazmos ir eritrocitų. Gliukozės koncentracija kraujyje, nustatant savituoju gliukozoksidaziniu metodu, yra 3,33-5,55 mmol/l (60-100 mg/100 ml; perskaičiavimo koeficientas – 0,05555), serume arba plazmoje – 3,61-6,4 mmol/l (65-116 mg/100 ml), likvore – 2,78-3,89 mmol/l (50-70 mg/100 ml). Gliukozės koncentracijos padidėjimas kraujyje vadinamas hiperglikemija, sumaţėjimas – hipoglikemija.

Gliukozės koncentracija kraujyje labai priklauso nuo antinksčių simpatinių nervų sujaudinimo bei insulino, gliukagono, adrenalino, gliukokortikoidų, tiroksino ir somatotropinio hormono (STH) sekrecijos. Insulinas – vienintelis hormonas, kuris maţina gliukozės kiekį kraujyje. Kiti hormonai didina gliukozės kiekį kraujyje. Gliukagono ir adrenalino poveikyje susidaro cAMP. Jis suaktyvina baltymų kinazę A. Pastaroji per fosforilazės kinazę suaktyvina glikogeno fosforilazę (glikogenolizės fermentą) bei slopina glikogeno sintazę (glikogenezės fermentą). Gliukokortikoidai aktyvina gliukoneogenezę reguliuojančių fermentų sintezę; be to, jų poveikyje irsta organizmo baltymai – susidaro aminorūgštys, iš kurių sintetinama gliukozė. Tiroksinas didina gliukozės rezorbciją iš ţarnyno. STH veikia netiesiogiai, skatindamas gliukagono sekreciją.

Sumaţėjus insulino sekrecijai (ar jai visai nevykstant) gliukozės koncentracija kraujyje padidėja. Kai ji viršija 9-10 mmol/l, inkstų kanalėliuose gliukozė nereabsorbuojama ir ima skirtis su šlapimu (gliukozurija). Esant nedidelei hiperglikemijai, gliukozurijos nebūna.

Nustatymo principas:

Gliukozę oksiduoja oro deguonis, dalyvaujant gliukozės oksidazei. Reakcijos metu susidaro vandenilio peroksidas, kuriam sąveikaujant su fenoliu, 4-aminoantipirinu bei esant peroksidazės, susidaro spalvotas junginys – raudonas chinoniminas, kurio spalvos intensyvumas yra tiesiog proporcingas gliukozės koncentracijai ir yra įvertinamas spektrofotometriniu metodu:

Tirpalai:

Reagentas: 100 mM fosfatinis buferis (pH 7,5), 5 mM fenolis, gliukozės oksidazė ( >

10 Vnt./ml), peroksidazė (> 1 Vnt./ml), 0,4 mM 4-aminoantipirinas.

Standartas: Gliukozės tirpalas: 100 mg/100 ml (5,55 mmol/l). Darbo eiga:

1. Į pirmąjį mėgintuvėlį („kontrolė“) įpilame 1 ml reagento. Jis bus naudojamas spektrofotometro nulinės reikšmės nustatymui.

2. Į antrąjį mėgintuvėlį („standartas“) įpilame 1 ml reagento ir 10 μl standarto (ţinomos koncentracijos gliukozės tirpalo).

3. Į trečiąjį mėgintuvėlį („mėginys“) įpilame 1 ml reagento ir 10 μl tiriamo kraujo serumo.

Kontrolė Standartas Mėginys

Reagentas 1 ml 1 ml 1 ml

Standartas - 10 μl -

Kraujo serumas - - 10 μl

4. Atsargiai sumaišome ir laikome kambario temperatūroje 10 min.

5. „Standarto” ir „mėginio” turinį perpylus į atskiras 1 cm kiuvetes, spektrofotometru nustatome šviesos sugerties (A) dydţius, kai bangos ilgis yra 500 nm.

Apskaičiavimas:

A – šviesos sugertis, kai bangos ilgis yra 500 nm;

Cstandarto – standarto koncentracija (100 mg/100 ml, 5,55 mmol/l); Cmėginio – mėginio koncentracija.

Rekomenduojamos reikšmės Neišnešiotas naujagimis Naujagimis Vaikas, suaugęs 25-80 mg/100 ml = 1,39-4,44 mmol/l 30-90 mg/100 ml = 1,67-5,00 mmol/l 70-105 mg/100 ml = 3,89-5,83 mmol/l

4.3. GLIUKOZĖS KONCENTRACIJOS NUSTATYMAS KRAUJO SERUME AUTOMATINIU ANALIZATORIUMI „CARDIO CHEK“

Cardio Chek yra rankinis matuoklis, kuriuo galima greitai ir tiksliai nustatyti įvairius kraujo biocheminius ţymenis pilname kraujyje – tam tereikia tik maţo kraujo lašelio ir atitinkamos tyrimo juostelės.

Matuoklio tyrimų sistemą sudaro analizatorius, mikroschema ir analitinių tyrimų juostelės. Nustatymas vyksta fotometrinio atspindţio metodu. Matuoklis nuskaito testų juostelės spalvos pasikeitimą po to, kai ant jos yra uţlašinamas kraujo lašas.

Veikimo principas:

Tai fermentinis nustatymo metodas. Gliukozės koncentracija nustatoma pagal susidariusį H2O2:

Gliukozė + O2 →Gliukono laktonas + H2O2 Fermentas – gliukozės oksidazė

H2O2 oksiduoja o-toluidiną, susidaro ţalios spalvos junginys. Juostelės spalvos intensyvumas proporcingas gliukozės koncentracijai.

Normali gliukozes koncentracija kraujyje yra 3,33-5,55 mmol/l.

4.4. LAKTATO DEHIDROGENAZĖS AKTYVUMO NUSTATYMAS KRAUJO SERUME FERMENTINIU BŪDU

Laktato dehidrogenazė (LDH) yra tirpus oksidoreduktazių klasės fermentas, randamas širdies, griaučių raumenų, kepenų, inkstų, smegenų ir kitų organų ląstelių citoplazmoje bei eritrocituose. LDH katalizuoja grįţtamą piruvato virtimo laktatu reakciją:

LDH išėjimas iš ląstelės į kraujo plazmą parodo plazminės membranos trūkius ir yra susijęs su audinio paţaida.

Metodo principas:

LDH katalizuoja laktato oksidavimą NAD+, susidarant piruvatui ir NADH.

Laktatas + NAD+ → Piruvatas + NADH + H+

LDH aktyvumas įvertinamas spektrofotometriniu metodu pagal NADH kiekio pokytį, kai bangos ilgis yra 340 nm. Vykstant reakcijai, NADH kiekis didėja, todėl didėja ir šviesos sugerties reikšmės.

Darbo eiga:

1. Į du mėgintuvėlius (tiriamąjį ir kontrolinį) įpilama po 1 ml LDH aktyvumui nustatyti skirto reagento, kurio sudėtis: 0,406 mM N-metil-D-glukaminas, 62,5 mM laktatas, 50 mM NAD+. Tirpalo pH 9,4.

2. Kontrolinio mėgintuvėlio turinys perkeliamas į spektrofotometrinę kiuvetę. Matuojama šviesos sugertis, kai bangos ilgis yra 340 nm.

3. Į tiriamąjį mėgintuvėlį įpilame 0,025 ml kraujo serumo, sumaišome.

4. Tiriamojo mėgintuvėlio turinys perkeliamas į spektrofotometrinę kiuvetę. Palaikius 30 s kambario temperatūroje matuojama šviesos sugertis, kai bangos ilgis yra 340 nm. Matavimas pakartojamas po 1 min.

5. Apskaičiuojamas šviesos sugerties pokytis per 1 min. – ΔA.

6. LDH aktyvumas išreiškiamas tarptautiniais aktyvumo vienetais Vnt./l. 7. LDH aktyvumas apskaičiuojamas pagal formulę:

kur – Vt – tiriamojo mėgintuvėlio turinio tūris (1,025 ml);

 – NADH sugerties koeficientas; jis lygus 6300, kai bangos ilgis yra 340 nm; L – kiuvetės skersmuo (1 cm);

Vs - tiriamo kraujo serumo tūris (0,025 ml).

4.5. KIEKYBINIS PIRUVO RŪGŠTIES NUSTATYMAS ŠLAPIME

Piruvo rūgštis, reaguodama su 2,4-dinitrofenilhidrazinu (2,4-DFH) šarminėje aplinkoje sudaro geltonai oranţinės spalvos, kurios ryškumas proporcingas piruvo rūgšties koncentracijai, junginius.

Α-ketoglutarato, oksaloacto, dehidroaskorbo rūgšties hidrazonai šarminėje aplinkoje neatsparūs ir greitai išnyksta.

Reagentai: 0,1% 2,4-DFH tirpalas, 2,5% spiritinis KOH tirpalas. Priemonės: spektrofotometras, mėgintuvėliai, 1 ml pipetės. Darbo eiga:

Darbui imame 2 mėgintuvėlius. Į pirmąjį kontrolinį įpilame 1 ml distiliuoto vandens, į antrąjį tiriamąjį – 1 ml šlapimo. Po to į abu mėgintuvėlius pilame po 1 ml 2,5% spiritinio KOH (kalio hidroksido) tirpalo, sumaišome, 1 min. bėgyje įpilame po 0,5 ml 0,1% 2,4-DFH tirpalo. Reakcijos komponentus sumaišome ir paliekame 15 min. kambario temperatūroje.

Reakcijos pavyzdţių šviesos sugertį matuojame spektrofotometru, kai bangos ilgis yra 440 nm. Piruvo rūgšties koncentraciją apskaičiuojame iš kalibracinės kreivės. Gautą dydį perskaičiuojame paros šlapimui. Vidutinis vyrų paros šlapimo kiekis – 1500 ml, moterų – 1200 ml. Perskaičiavimo koeficientas į tarptautinę vienetų sistemą lygus 0,009 (μmol/l).

Kalibracinė kreivė

KLAUSIMAI SAVIRUOŠAI Angliavandeniai, jų biologinis vaidmuo ir apykaita:

1. Pagrindiniai angliavandeniai, gaunami su maistu. Angliavandenių biologinė ir energetinė vertė.

2. Ką vadiname glikolize? Kokia glikolizės fiziologinė reikšmė? Parašykite anaerobinės glikolizės suminę lygtį.

3. Parašykite gliukozės skilimo iki piruvato reakcijas, kurių metu: a) ATP sunaudojamas, b) ATP sintetinamas.

4. Kiek molekulių ATP sintetinama iš gliukozės susidarant: a) piruvatui, b) laktatui? 5. Kokį procesą vadiname gliukoneogeneze? Išvardinkite gliukozės susidarymo iš

piruvato negrįţtamąsias reakcijas.

6. Kaip ATP, ADP ir AMP koncentracijos kitimai veikia glikolizės ir gliukoneogenezės greitį?

7. Gliukozės homeostazės reguliavimas.

8. Gliukozės apykaitos kelias, būtinas ląstelės sintezės procesams.

9. Pavaizduokite gliukozės aerobinį skilimą bendra schema. Kiek molekulių ATP susidaro visiškai oksiduojant gliukozę iki CO2ir H2O?

11. Išvardinkite kofermentus, kurie įeina į -ketoglutaratdehidrogenazinio komplekso sudėtį.

12. Kiek molekulių ATP sintezuojama, oksiduojant vieną molekulę: a) acetil-CoA, b) izocitrato, c) -ketogliutarato, c) malato, d) sukcinato?

5. LIPIDAI IR JŲ APYKAITA

Lipidai (gr. lipos – riebalai) – tai sunkiai arba visiškai netirpstančios vandenyje organinės medţiagos. Pagrindinę jų molekulių dalį sudaro prisotintos angliavandenilinės grandinės. Lipidų yra visose ląstelėse. Jie būtini gyvybinių organizmo funkcijų palaikymui. Šios molekulės, o ypač triacilgliceroliai, yra koncentruotos cheminės energijos šaltinis; fosfolipidai, steroliai (pvz., cholesterolis eukariotinėse ląstelėse) – svarbūs biologinių membranų struktūriniai komponentai; eikozanoidai valdo fiziologines funkcijas; iš lipidų sintetinami kai kurie vitaminai ir hormonai.

Riebalai (triacilgliceroliai arba trigliceridai) – yra trihidroksilio alkoholio glicerolio ir sočiųjų (turinčių tik viengubuosius ryšius) bei nesočiųjų (turinčių vieną ar daugiau dvigubųjų ryšių) riebalų rūgščių triesteriai.

Skysti riebalai (daţniausiai augalinės kilmės) vadinami aliejais. Riebalų konsistencija priklauso nuo riebalų rūgščių sotumo. Kuo daugiau riebaluose sočiųjų riebalų rūgščių, tuo jie kietesni ir lydosi aukštesnėje temperatūroje. Riebalai yra pagrindinė energijos atsargų forma gyvūnų ląstelėse. Jie sudaro apie 21% ţmogaus kūno masės.

To paties organizmo skirtinguose organuose gali būti skirtingos riebalų rūgštys. Pavyzdţiui, ţmogaus poodiniame riebaliniame sluoksnyje gausu sočiųjų riebalų rūgščių, o kepenų riebaluose – daugiau nesočiųjų. Kai kurios riebalų rūgštys (linolo, linoleno) ţmogaus organizme nesintetinamos, todėl jas būtina gauti su maistu – tai nepakeičiamosios riebalų rūgštys.

Kai kurių riebalų rūgščių lentelė Anglies

atomų skaičius

Pavadinimas Struktūra Sočiosios riebalų rūgštys

C14 Miristo CH3(CH2)12COOH

C16 Palmitino CH3(CH2)14COOH

C18 Stearino CH3(CH2)16COOH

C20 Eikozano CH3(CH2)18COOH

C18:1 Oleino CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH

C18:2 Linolo CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH

C18:3 Linoleno CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH

C20:4 Arachidono CH3(CH2)3(CH2CH=CH)4(CH2)3COOH

Ţmogus vidutiniškai per parą suvartoja apie 60-150 g riebalų. Normaliai maitinantis maisto riebalai organizmui suteikia apie 40 proc. energijos. Ilgą laiką negavus lipidų su maistu ir sutrikus jų apykaitai, paţeidţiama oda, gleivinė, vidaus organai, centrinė nervų sistema, susilpnėja imunitetas, sutrinka organizmo homeostazės mechanizmai.

5.1. CHOLESTEROLIO KONCENTRACIJOS NUSTATYMAS KRAUJO SERUME FERMENTINIU BŪDU

Cholesterolis – 27 C atomus turintis junginys.

Cholesterolis – gyvūnų audinių steroidinis alkoholis, randamas visų ląstelių plazminėje membranoje. Iš jo sintetinamos tulţies rūgštys, steroidiniai hormonai, vitaminas D3. Į ţmogaus organizmo ląsteles patenka egzogeninis cholesterolis, t.y. su maistu gaunamas cholesterolis (0,5-1g) ir endogeninis cholesterolis t.y. cholesterolis, kurį sintetina ţmogaus organizmo ląstelės. Didţiausias cholesterolio kiekis sintetinamas kepenyse (1 g/per dieną), nedideliais kiekiais sintetinamas antinksčių ţievėje, kiaušidėse, sėklidėse. Organizme cholesterolis gali būti laisvas arba sudaryti esterius su riebalų rūgštimis. Kraujo plazmoje cholesterolis bei jo esteriai pernešami lipoproteinų sudėtyje. Padidėjęs bendras cholesterolio kiekis siejamas su didėjančia aterosklerozės ir širdies kraujagyslių ligų rizika.

Bendro cholesterolio (laisvo ir esterifikuoto) koncentracija kraujo serume nustatoma fermentiniu metodu. Cholesterolio esterius hidrolizuoja fermentas cholesterolio esterazė.

Reakcijos metu susidariusį laisvą cholesterolį oksiduoja cholesterolio oksidazė:

Reakcijos metu susidaręs H2O2 oksiduoja 4-aminoantipiriną, susidaro spalvotas junginys chinonimas, kurio spalvos intensyvumas yra tiesiog proporcingas cholesterolio koncentracijai. Šviesos sugertį matuojame spektrofotometru, kai bangos ilgis yra 500 nm.

Darbo eiga:.

1. Į du mėgintuvėlius (tiriamąjį ir standartinį) įpilama po 1 ml cholesteroliui nustatyti skirto reagento, kurio sudėtis: 35 mM PIPES (piperazin-N-N'-bis [2-etansulfoninė rūgštis]), 28 mM fenolis, 0,2 Vnt./ml cholesterolio esterazė, 0,1 Vnt./ml cholesterolio oksidazė, 0,8 Vnt./ml peroksidazė, 0,5 mM 4-aminoantipirinas, pH 7,0.

2. Į standartinį mėgintuvėlį įpilame 0,01 ml cholesterolio standartinio tirpalo (200 mg/100 ml; 5,18 mmol/l), sumaišome.

3. Į tiriamąjį mėgintuvėlį įpilame 0,01 ml tiriamojo kraujo serumo, sumaišome.

4. Mėgintuvėliai inkubuojami kambario temperatūroje 20 min.

5. Šviesos sugertį (A) matuojame spektrofotometru, kai bangos ilgis yra 500 nm.

Lipidų tyrimo reikšmės aterosklerozės diagnostikai pateikiamos lentelėje (mmol/l).

Tiriamasis lipidas

Pageidaujama

koncentracija Rizikos ribos

Vidutinė

rizika Didelė rizika Bendrasis cholesterolis <5,2 5,2-6,5 >6,5 >7,8 MTL <3,4 3,4- 4,1 >4,1 >4,9 DTL >0,9 <0,9 TAG <2,3 2,3-4,1 >4,1 >11,3

MTL – maţo tankio lipoproteinai; DTL – didelio tankio lipoproteinai; TAG – triacilgliceroliai.

5.2. REAKCIJOS ACETONINĖMS MEDŢIAGOMS ŠLAPIME NUSTATYTI

Acetoninės medţiagos – acetonas, acetoacto rūgštis ir β-hidroksisviesto rūgštis, nustatomi nitroprusidiniais mėginiais.

Acetoninės medţiagos, reaguodamos su natrio nitroprusidu Na2[Fe(CN)5NO], sudaro raudonai rudos spalvos kompleksinius junginius. Analogiška reakcija vyksta ir su tam tikrais aminais (pvz., kreatininu), bet pridėjus etano rūgšties, susidariusi vyšninė spalva išnyksta, o esant acetoninėms medţiagoms, spalva neišnyksta, o dar labiau stiprėja.

Darbo eiga:

Langės reakcija.

1. Į mėgintuvėlį įlašinama 10 lašų šlapimo, 2 lašai koncentruotos CH3COOH tirpalo, 2 lašai naujai paruošto 5% natrio nitroprusido tirpalo ir sumaišoma. 2. Palenkus mėgintuvėlį 45º kampu, atsargiai sienele įpilamas toks pats tūris

koncentruoto amonio hidroksido tirpalo. Skysčių sąlyčio vietoje susidaro violetinis ţiedas, kurio intensyvumas ir susidarymo laikas priklauso nuo acetoninių medţiagų kiekio.

Legalio reakcija.

1. Į mėgintuvėlį įlašinama 10 lašų šlapimo, 2 lašai natrio nitroprusido tirpalo ir 2-4 lašai 10% NaOH tirpalo. Mišinys nusidaţo raudona spalva.

2. Po to įlašinami 4 lašai koncentruotos CH3COOH. Jeigu yra acetono ar acetoacto rūgšties, tirpalas įgauna tamsiai raudoną spalvą, o jei šių medţiagų nėra – spalva išnyksta.

Libeno reakcija.

Acetonas šarminėje aplinkoje reaguoja su jodu, sudarydamas jodoformo nuosėdas.

Į mėgintuvėlį įlašinama 10 lašų šlapimo, 2 lašai 10% NaOH tirpalo ir keli lašai Liugolio tirpalo (85 ml vandens ištirpinama 10 g KI (kalio jodido) ir 5 g jodo). Jei yra acetono, tirpalas drumstėja ir įgyja būdingą jodoformo kvapą. Jei acetono daug, nusėda gelsvos kristalinės nuosėdos.

5.3. TULŢIES ĮTAKA LIPAZĖS AKTYVUMUI

Tulţis emulsina riebalus ir aktyvina kasos sulčių lipazę. Veikiant lipazei, triacilgliceroliai skyla:

Darbo eiga:

1. Į dvi konusines kolbutes pipete įpilama po 10 ml pieno ir 10 ml vandens.

2. Į abi kolbutes įberiama po 0,05 g pankreatino (jame yra lipazės). Kolbų turinys sumaišomas, kad ištirptų pankreatinas.

3. Į vieną kolbutę įlašinami 6 lašai tulţies, į kitą – 6 lašai vandens.

4. Į abi kolbutes įlašinama po 1-2 lašus indikatoriaus fenolftaleino ir titruojama 0,1 N NaOH tirpalu.

5. Abi kolbutės laikomos oro termostate 37 ºC temperatūroje. Tirpalai titruojami kas 15 min.

6. Titravimo duomenys surašomi į lentelę, braiţomas grafikas. Abscisių ašyje paţymimas laikas, o ordinačių – nutitruoto 0,1 N NaOH tirpalo kiekis mililitrais.

Inkubacijos laikas (min.)

Kolbutė su tulţimi. NaOH tirpalo tūris (ml).

Kolbutė su vandeniu. NaOH tirpalo tūris (ml). 0 15 30 45 60 KLAUSIMAI SAVIRUOŠAI Lipidai ir jų apykaita

1. Išvardinkite pagrindines lipidų grupes.

2. Kokios riebalų rūgštys yra ţmogaus lipidų sudėtyje? Išvardinkite jas. 3. Kokie lipidų ypatumai nulemia jų dalyvavimą membranų susidaryme? 4. Išvardinkite pagrindines kraujo lipoproteinų grupes ir apibūdinkite jų sudėtį. 5. Kokie yra pagrindiniai riebalų rūgščių -oksidacijos etapai?

6. Kiek molekulių ATP susidarys pilnai oksiduojantis iki CO2ir H2O: a) stearino

rūgščiai, b) palmitino rūgščiai?

9. Kokių junginių pavidale cholesterolis pašalinamas iš organizmo?

10. Pateikite ligų pavyzdţių, kurių prieţastis galima paaiškinti cholesterolio apykaitos sutrikimais.

11. Kodėl pacientams turintiems per didelę kūno masę rekomenduojama dieta, turinti maţiau angliavandenių?

12. Kokias medţiagas vadiname acetoninėmis? Išvardinkite jas.

13. Kokie hormonai ir kaip valdo lipidų apykaitą? Pateikite pavyzdţių. 14. Pateikite schemą, iliustruojančią lipidų ir angliavandenių apykaitos ryšį.

6. BALTYMŲ (AMINORŪGŠČIŲ) APYKAITA

Baltymai sudaryti iš 20 genetiškai koduojamų aminorūgščių, kurių 8 yra nepakeičiamosios ir 2 nepakeičiamosios tam tikromis sąlygomis (lentelė). Baltymai sudaro apie 19% ţmogaus kūno masės. Per parą ţmogus turėtų suvartoti apie 100 g baltymų. Ţmogaus organizme baltymai virškinami skrandyje ir ţarnyne iki aminorūgščių. Pagrindiniai aminorūgščių apykaitos keliai organizme yra peramininimas, deamininimas ir dekarbokslinimas.

Organizme aminorūgštys atlieka šias pagrindines funkcijas: jos panaudojamos specifinių organizmui baltymų sintezei, 20% organizmui reikalingos energijos gauti (oksiduojant 1 g baltymų susidaro 4 kcal), aminorūgštys panaudojamos įvairių biologiškai aktyvių junginių, tokių kaip hemo, purino, pirimidino bazių, kai kurių kofermentų, hormonų, pigmentų, biogeninių aminų sintezei.

Lentelė. Pakeičiamosios ir nepakeičiamosios aminorūgštys ţmogui Pakeičiamosios Nepakeičiamosios

Alaninas Argininas*

Asparaginas Histidinas* Asparto rūgštis Izoleucinas

Cisteinas Leucinas

Glutamo rūgštis Lizinas Gliutaminas Metioninas

Glicinas Fenilalaninas

Prolinas Treoninas

Serinas Triptofanas

Tirozinas Valinas

*– būtinos tik jauniems, greitai augantiems organizmams.

6.1. KIEKYBINĖ SKRANDŢIO SULČIŲ ANALIZĖ

Per parą ţmogaus organizme išsiskiria apie 1,5-2,5 litrų skrandţio sulčių. Rūgšti skrandţio terpė (pH 1,5-2,5) veikia bakteriocidiškai, be to denatūruoja globulinius baltymus, todėl juos greičiau pasiekia virškinimo fermentai. Nevalgiusio ţmogaus skrandţio sultys yra rūgščios dėl sultyse esančios HCl. Ţmogaus skrandţio sultyse yra apie 0,07-0,17% HCl.

Skrandţio sulčių rūgštingumu vadinamas titravimui suvartotas 0,1 N NaOH tirpalo kiekis mililitrais, apskaičiuojant jį 100 ml skrandţio sulčių. Nustatant bendrąjį

rūgštingumą, naudojamas indikatorius fenolftaleinas. Nustatant laisvosios HCl kiekį – indikatorius p-dimetilaminoazobenzolas. Normalus bendras rūgštingumas yra 40–60, laisvasis rūgštingumas – 20–40, nelaisvasis rūgštingumas – 10–20.

Bendrojo skrandţio sulčių rūgštingumo nustatymas.

Bendrąjį skrandţio sulčių rūgštingumą sudaro laisvoji HCl, rūgštis sujungta su maisto baltymais ir jų skilimo produktais, kitos skrandţio sultyse esančios rūgščiosios medţiagos (acto, sviesto, pieno rūgštys, rūgštūs fosfatai ir kt.).

Darbo eiga:

1. Į konusinę kolbutę pipete įpilama 10 ml skrandţio sulčių ir įlašinami 1-2 lašai indikatoriaus fenolftaleino.

2. Titruojama 0,1 N NaOH tirpalu, kol atsiranda rausva spalva. Suvartotas 0,1 N NaOH kiekis perskaičiuojamas 100 ml skrandţio sulčių.

Pavyzdţiui, 10 ml skrandţio sulčių nutitruoti sunaudota 5 ml 0,1 N NaOH tirpalo.

Bendrasis rūgštingumas: 5x100:10 = 50.

Laisvosios HCl nustatymas Darbo eiga:

1. Į konusinę kolbutę įpilama 10 ml skrandţio sulčių ir įlašinami 3 lašai 0,5% p-dimetilaminoazobenzolo tirpalo.

2. Titruojama 0,1 N NaOH, kol kolbutės turinys nusidaţo nekintančia geltona spalva. Analogiškai, kaip ir nustatant bendrąjį rūgštingumą, apskaičiuojamas laisvasis rūgštingumas 100 ml skrandţio sulčių.

3. Apskaičiuojama HCl koncentracija skrandţio sultyse procentais, ţinant, kad 1 ml 0,1 N NaOH tirpalo reaguoja su 0,0001 moliu HCl, o tai atitinka 0,00365 g HCl:

nNaOH = nHCl = 0,001 l·0,1 mol/l= 0,0001 mol,

mHCl=MHCl·nHCl= 36,5 g/mol·0,0001 mol=0,00365 g.

Tada HCl kiekis 100 ml skrandţio sulčių apskaičiuojamas pagal išraišką:

Kadangi 100 ml skrandţio sulčių sveria apie 100 gramų, tai gauta HCl masė ir yra lygi procentinei HCl koncentracijai.

Nelaisvojo rūgštingumo nustatymas

Nelaisvasis rūgštingumas apskaičiuojamas iš bendrojo rūgštingumo atėmus laisvąjį rūgštingumą.

6.2. ALANINO AMINOTRANSFERAZĖS KONCENTRACIJOS KRAUJO SERUME NUSTATYMAS

Metodo principas:

Alanino aminotransferazė (ALT) katalizuoja alanino aminogrupės pernašą α-ketoglutaratui, susidarant piruvatui ir glutamatui. Šio fermento koncentracija nustatoma pagal redukuoto nikotinamidadenindinukleotido (NADH), dalyvaujančio laktato dehidrogenazės (LDH) katalizuojamoje reakcijoje, koncentracijos sumaţėjimą. Tai atliekama spektrofotometrijos būdu matuojant šviesos sugertį, kai bangos ilgis yra 340 nm.

Sudėtis:

A reagentas: 0,15 M Tris, 0,75 M L-alaninas, >1350 Vnt./l LDH, pH 7,3.

B reagentas: 1,3 mM NADH, 75 mM α-ketoglutaratas, 148 mM NaOH, 9,5 g/l NaN3.

Reagento paruošimas:

Darbinis tirpalas: reagentas B supilamas į reagento A butelį. Atsargiai išmaišoma. Galima paruošti tik tam tikrą tūrį tirpalo: 4 ml reagento A + 1 ml reagento B. Tirpalas išlieka stabilus 2-8 ºC temperatūroje 2 mėnesius.

Tiriamasis pavyzdys:

Kraujo serumas. ALT kraujo serume išlieka stabili 7 dienas.

Darbo eiga:

1. Į spektrofotometro kiuvetę (1 cm) įpilama:

Reakcijos temperatūra 37 ºC 30 ºC Darbinis tirpalas Tiriamasis pavyzdys 1,0 ml 50 μl 1,0 ml 100 μl

2. Gerai sumaišoma. Kiuvetė dedama į spektrofotometro šulinėlį. Šviesos sugertis matuojama spektrofotometru, kai bangos ilgis yra 340 nm. Įjungiamas laikmatis. 3. Po 5 min. uţrašoma pradinė šviesos sugertis. Po to ji matuojama kas 1 min. 4. Paskaičiuojamas skirtumas per 1 min. (∆A/min.).

Apskaičiavimas:

ALT koncentracija pavyzdyje apskaičiuojama pagal formulę:

ε – NADH molinės sugerties koeficientas; jis lygus 6300, kai bangos ilgis yra 340 nm.

Šviesos nueitas kelias tirpale I yra 1 cm.

Bendras reakcijos mišinio tūris (Vb) yra 1,05 ml esant 37 ºC temperatūrai ir 1,1 ml esant 30 ºC temperatūrai.

Tiriamojo pavyzdţio mišinio tūris (Vp) yra 0,05 ml esant 37 ºC temperatūrai ir 0,1 ml esant 30 ºC temperatūrai.

1 Vnt./l yra 0,0166 μkat/l.

ALT koncentraciją galima apskaičiuojama pagal formulę:

∆A/min. 37 ºC 30 ºC × 3333 = Vnt./l × 55,55 = μkat/l × 1746 = Vnt/l ×29,1 = μkat/l Rekomenduojamos reikšmės: Reakcijos temperatūra 37 ºC 30 ºC

ALT koncentracija 41 Vnt./l = 0,68 μkat/ 29 Vnt./l = 0,48 μkat/l

6.3. BALTYMŲ KIEKIO NUSTATYMAS KRAUJO SERUME BIURETO METODU

Biureto reakcija yra būdinga junginiams, turintiems du ar daugiau peptidinių ryšių. Paveikus šarminį baltymų tirpalą vario sulfatu, jis nusidaţo mėlynai violetine spalva. Reakcijos metu peptidinės grupės prisijungia vario jonus, susidaro spalvoti kompleksiniai junginiai. Spalvos intensyvumas tiesiog proporcingas baltymų koncentracijai kraujo serume ir nustatomas spektrofotometru, kai bangos ilgis yra 540 nm.

Darbo eiga:

1. Imami 2 mėgintuvėliai. Į pirmąjį (tiriamąjį) mėgintuvėlį įpilama 0,1 ml kraujo serumo, į antrąjį (kontrolinį) – 0,1 ml distiliuoto vandens.

2. Į abu mėgintuvėlius pilama po 5 ml biureto reagento (vario sulfato šarminio tirpalo). Mėgintuvėlių turinys sumaišomas ir laikomas 20 min. kambario temperatūroje (iki +25 ºC).

3. Spalvos intensyvumas tiriamajame mėgintuvėlyje nustatomas spektrofotometru (bangos ilgis – 540 nm).

4. Baltymų koncentracija (g/l) kraujo serume nustatoma remiantis kalibracine kreive. Pavyzdţiui, 0,1 ml kraujo serumo yra 8,0 mg baltymų, tai 1 litre jų yra 80 g.

Normalus baltymų kiekis kraujo serume yra 65-85 g/l.

6.4. BALTYMŲ KIEKIO NUSTATYMAS KRAUJO SERUME BRADFORDO METODU

Bradfordo reagentas naudojamas nustatyti bendrą baltymų koncentraciją tirpaluose. Tai daţo Kumasi briliantinio mėlio G-250 fosfato rūgštyje ir metanolyje tirpalas. Metodo principas pagrįstas mėlynos spalvos komplekso tarp baltymų ir daţo susidarymu rūgštinėje aplinkoje. Komplekso susidaryme dalyvauja baltyme esančios bazinės amino rūgštys (argininas, lizinas, histidinas). Spalvos intensyvumas yra proporcingas baltymo molekulėje esančių teigiamų krūvių skaičiui. Laisvos amino rūgštys ir peptidai nesudaro spalvotų kompleksinių junginių su šiuo reagentu.

Darbo eiga:

1. Į matavimo kolbutę (100 ml) įpilama 1 ml kraujo serumo ir 99 ml distiliuoto vandens, gaunama 100 ml 100 kartų praskiesto kraujo serumo.

2. Imami du mėgintuvėliai. Į pirmą (tiriamąjį) mėgintuvėlį įpilama 0,1 ml kraujo serumo (1:100) , į antrą (kontrolinį) – 0,1 ml distiliuoto vandens.

3. Į abu mėgintuvėlius pilama po 3 ml Bradfordo reagento. Mėgintuvėlių turinys sumaišomas ir laikomas 10 min. kambario temperatūroje.

4. Spalvos intensyvumas tiriamajame mėgintuvėlyje nustatomas spektrofotometru, kai bangos ilgis yra 595 nm. Matavimus atlikti 30 min. laikotarpyje.

5. Baltymų koncentracija (g/l) kraujo serume nustatoma remiantis kalibracine kreive. Pavyzdţiui, 0,1 ml kraujo serumo (1:100) yra 0,9 mg/ml baltymo, gautą reikšmę reikia padauginti iš 100 – gauname 90 mg/ml arba 90 g/l baltymo. Normalus baltymų kiekis kraujo serume yra 65-85 g/l.

Kalibracinė kreivė

6.5. BALTYMŲ SKAIDYMAS PEPSINU

Skrandţio sulčių fermentas pepsinas yra endopeptidazė (optimalus veikimo pH – 1,5-2,5). Jis skaido peptidinius ryšius baltymo molekulės viduje tarp šių amino rūgščių:

X—Phe-; -X—Tyr-; X—Trp

Hidrolizuojant pepsinu netirpų baltymą fibriną, į tirpalą pereina atskilę peptidai, kurie nustatomi biureto reakcija.

Darbo eiga:

1. Į 5 sunumeruotus mėgintuvėlius, kaip nurodyta pateiktoje lentelėje, supilami atitinkami 1% pepsino tirpalo, 0,2% HCl ir vandens kiekiai.

2. Pirmame mėgintuvėlyje pepsino tirpalas neutralizuojamas NaHCO3 (natrio hidrokarbonatu) iki pH 7,0. pH tikrinamas lakmuso indikatoriumi.

3. Ketvirtame mėgintuvėlyje pepsino tirpalas pavirinamas.

4. Į visus mėgintuvėlius dedama po gabalėlį ţirnio dydţio fibrino. Mėgintuvėlių turinys maišomas purtant.

5. Visi mėgintuvėliai laikomi termostate 60 min., esant 37 ºC temperatūrai.

6. Iš kiekvieno mėgintuvėlio imama po 1 ml (20 lašų) filtrato ir daroma biureto reakcija. Į 20 lašų filtrato įlašinami 5 lašai 10% NaOH ir 1 lašas 1% CuSO4 tirpalų. Sumaišoma. Jei tirpale yra peptidų, tirpalas nusidaţo violetine spalva.

Darbo rezultatai ir išvados: Mėginys 1% pepsino tirpalas (ml) 0,2% HCl tirpalas (ml) H2O (ml) Fibrinas Rezultatai (biureto reakcija) 1 5,0 – – + 2 – 5,0 – + 3 2,5 2,5 – + 4 2,5* 2,5 – + 5 – – 5,0 + * pavirintas pepsinas

6.6. KREATININO KIEKIO NUSTATYMAS ŠLAPIME

Kreatininas susidaro iš raumenyse kaupiamo didţiaenergio junginio – kreatino fosfato. Kreatininas yra kreatino fosfato spontaninio defosforilinimo bei iš jo raumenyse susidariusio kreatino dehidratacijos produktas.

Kreatininas nustatomas pagal spalvinę Jofės reakciją.

Darbo eiga:

1. Į mėgintuvėlį įpilama 2,7 ml 17,5 mM pikrino rūgštis ir 0,29 M NaOH mišinio (1:1).

2. Pridedama 0,3 ml tiriamojo šlapimo, praskiesto 50 kartų. Gerai sumaišoma. 3. Inkubuojama kambario temperatūroje 20 min.

4. Matuojama šviesos sugertis (bangos ilgis 492 nm) 1 cm kiuvetėje.

5. Pagal kalibracinę kreivę įvertinamas kreatinino kiekis (mg) paros šlapime. 6. Perskaičiuojama kreatinino koncentracija šlapime mmol/l (Mkreatinino= 113,12

g/mol).

Kalibracinė kreivė

6.7. BALTYMŲ IŠSKYRIMAS IR GRYNINIMAS

Individualių baltymų išskyrimo metodai pagrįsti skirtingomis fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis. Baltymus galima išskirti tik esant ţemai temperatūrai. Tinkamiausia temperatūra yra artima tirpalo uţšalimo temperatūrai. Esant ţemai temperatūrai, susilpnėja mikroorganizmų dauginimasis, nuslopinamas proteazių poveikis.

Tiriant maţai ţinomus baltymus, reikia vengti rūgščių ir šarmų, nes daugelis baltymų nekinta kai pH artimas 7. Esama ir išimčių, pvz., tripsinas, chimotripsinas ir pepsinas yra patvaresni rūgščioje terpėje. Organiniai tirpikliai (etanolis, acetonas) tinka baltymams išskirti tik esant ţemai temperatūrai (apie -10 ºC).

Pagrindiniai baltymų išskyrimo etapai: 1. Baltymų ekstrahavimas iš ląstelių ir audinių. 2. Nebaltyminių medţiagų pašalinimas.

3. Baltymų mišinio frakcionavimas. 4. Druskų pašalinimas iš baltymų.

Druskoms ir kitoms maţos molekulinės masės priemaišoms pašalinti iš baltymų naudojamas dializės metodas, gelfiltracija. Šių metodų pagrindą sudaro tai, kad baltymų molekulės, turėdamos didelę molekulinę masę, negali prasiskverbti pro membranų poras arba įsiskverbti į gelio granules.

Baltymams išskirti plačiai taikomas elektroforezės metodas, kuris pagrįstas tuo, kad skirtingi baltymai nevienodai jonizuojami, įgyja skirtingą krūvį ir todėl nevienodu greičiu juda elektros lauke.

6.7.1. Gelfiltracija kolonėlėje

Gelfiltracijai naudojami molekuliniai tinkleliai – inertinės hidratuotos medţiagos, pvz., polisacharidai kaip poringos granulės. Jos gaunamos iš bakterijų polisacharidų (sefadeksai), agaro arba polimerizuotų akrilamido gelių (akrileksas).

Nedidelės molekulės prasiskverbia į granules per poras, todėl pro geliu pripildytą kolonėlę juda lėčiau negu didelės molekulės, negalinčios patekti į granulių vidų.

Darbo eiga:

1. Kolonėlė pripildoma išbrinkintu izotoniniame (0,9%) NaCl tirpale molselektu G-50.

2. Paruošiamas dviejų komponentų mišinys: sočiojo mėlynojo dekstrano tirpalo, kurio molekulinė masė yra 107

Da, ir sočiojo K2Cr2O7 (kalio bichromato) tirpalo, kurio molekulinė masė yra 294 Da, santykiu 1:1.

3. Ant gelio paviršiaus uţlašinami 2-3 lašai frakcionuoto mišinio ir palaukiama, kol gelis sugers tirpalą.

4. Atsargiai per stiklinę lazdelę, priglaustą prie sienelės, į kolonėlę įpilama apie 2 ml 0,9 % NaCl tirpalo ir prijungiamas lašintuvas su NaCl tirpalu. Šio tirpalo reikia išskiriamų medţiagų eliucijai (išplovimui).

5. Perėjęs per kolonėlę mišinys pasiskirsto skirtingų spalvų frakcijomis. Kiekviena frakcija surenkama į skirtingus mėgintuvėlius.

6.7.2. Baltymų elektroforezė poliakrilamido gelyje (PAAG)

Baltymų molekulės elektrinio krūvio dydis ir ţenklas priklauso nuo bazinių ir rūgštinių jonizuotų grupių santykio molekulėje. Leidţiant pastovią elektros srovę baltymų molekulės tirpale juda priešingai įkrauto poliaus link.