KAUNO
MEDICINOS UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra
Rūta Švobaitė
Antocianų nustatymas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas doc. Liudas Ivanauskas
KAUNAS 2006
Turinys
ĮVADAS ... 3
LITERATŪROS APŢVALGA ... 5
1.MĖLYNĖ - SAVYBĖS IR PRITAIKYMAS ... 5
1.1. Vaccinium myrtillus (L) biologiniai duomenys ir cheminė sudėtis ... 5
1.1.1. Apibrėţimas ... 5
1.1.2. Išorinis augalo apibūdinimas ir paplitimas ... 5
1.1.3. Vaistinė ţaliava ... 6
1.1.4. Pagrindiniai cheminiai komponentai ... 7
1.3. Šiuolaikinis mėlynės farmacinių savybių pritaikymas ... 8
1.3.1. Klinikinis pritaikymas ... 9
1.3.1.1. Oftalmologiniai sutrikimai ... 9
1.3.1.2. Diabetinė retinopatija ... 10
1.3.1.3. Kraujagyslių sutrikimai ... 10
1.3.2. Dozavimas ... 10
1.3.3. Toksiškumas ir vaistų sąveika ... 11
2.ANTOCIANAI ... 12
2.1. Antocianai ... 12
2.2. Antocianų molekulinė struktūra ir cheminė sudėtis... 13
2.3. Antocianų svarba augalams ir gyvūnams ... 15
2.3.1. Antocianų svarba augalams ... 15
2.3.2. Antocianų poveikis ţmogaus organizmui... 16
EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 20
1.MEDŢIAGOS IR REAGENTAI ... 20
2.ŢALIAVOS PARUOŠIMAS ... 21
3. ANTOCIANŲ KIEKYBINIS NUSTATYMAS ... 21
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26
IŠVADOS ... 33
ĮVADAS
Šiuo metu vis labiau domimasi vaistais ir maisto papildais, gautais iš natūralių šaltinių. Augalinės kilmės vaistus lengviau pasisavina ţmogaus organizmas, jie veikia švelniau ir sukelia maţiau šalutinių poveikių. Todėl vis aktualesnis tampa vaistingųjų augalų pritaikymas medicinoje ir farmacijoje.
Mėlynė (Vaccinium myrtillus) – gerai ţinomas Erikinių (Ericaceae) šeimos augalas. Jau Viduramţiais pastebėtos šio augalo gydomosios savybės. Bėgant laikui, mėlynių vaisių ir lapų ekstraktai, uţpilai ir nuovirai vartoti gydant vis daugiau ligų.
Visame pasaulyje mėlyne ypač susidomėta po Antrojo pasaulinio karo. Nuo to laiko atlikta nemaţai mokslinių tyrimų ir nustatyta vaisių kokybinė ir kiekybinė sudėtis, domėtasi, kiek moksliškai pagrįstas vartojimas liaudies medicinoje, nustatytos naujos indikacijos.
Svarbiausia mėlynių vaisiuose esančių cheminių junginių grupė – antocianai. Jau įrodyta, kad jie turi antioksidacinį, priešuţdegiminį, kraujagysles apsaugantį bei priešvėţinį veikimą.
Iki šiol Lietuvoje nėra atlikti išsamūs fitocheminiai mėlynių vaisių tyrimai. Todėl šiuo darbu siekta nustatyti ir įvertinti Lietuvoje augančių mėlynių kokybinę ir kiekybinę sudėtį ir palyginti ją su kitose šalyse – Baltarusijoje, Rusijoje ir Švedijoje – augančių mėlynių vaisių sudėtimi.
Gautus rezultatus bus galima panaudoti pasirenkant šalį ar regioną ţaliavų paruošai bei kuriant naujus vaistinius preparatus.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas – nustatyti ir palyginti antocianų sudėtį ir kiekį mėlynių (Vaccinium
myrtillus) vaisiuose, surinktuose įvairiuose Lietuvos regionuose ir Baltarusijoje, Rusijoje bei Švedijoje.
Darbo uţdaviniai:
Plačiau išstudijuoti literatūrą apie mėlynių (Vaccinium myrtillus) vaisius, juose kaupiamus cheminius junginius – antocianus ir jų panaudojimą medicinoje; Nustatyti antocianų kiekį mėlynių vaisių ekstrakte spektrofotometrijos pagalba;
Parinkti tinkamiausias sąlygas antocianų ir jų aglikonų, esančių mėlynių vaisių ekstrakte, kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodo pagalba.
LITERATŪROS APŢVALGA
1. MĖLYNĖ - SAVYBĖS IR PRITAIKYMAS
1.1. Vaccinium myrtillus (L) biologiniai duomenys ir cheminė sudėtis
1.1.1. Apibrėţimas
Karalystė: Augalai (Plantae)
Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis: Dilenijaţiedţiai (Dilleniidae) Šeima: Erikiniai (Ericaceae)
Gentis: Šilauogė (Vaccinium)
Rūšis: Mėlynė (Vaccinium myrtillus) [1].
1.1.2. Išorinis augalo apibūdinimas ir paplitimas
Mėlynė (lot. Vaccinium myrtillus) - Erikinių šeimos (Ericaceae) augalas (1 pav.).
1 pav. Mėlynės ir jų uogos
Daţniausiai auga vidutinio drėgnumo ir drėgnuose, nelabai ūksminguose miškuose, rūgščiuose, puveninguose dirvoţemiuose, kartais ir kimininėse pelkėse, aukštesnėse vietose [1]. Geografiškai labiausiai paplitęs šiaurės ir vakarų Europoje, vakarų Azijoje ir Šiaurės Amerikoje [2,3].
ţalios, minkštos ir ţiemą gali apšalti. Šakniastiebis ilgas, šliauţiantis. Lapai odiški, ovališki, pliki, nusmailėjusia viršūne, trumpakočiai, smulkiai dantytais kraštais, numetami kiekvienais metais. Pavasarį, ką tik išsiskleidę, būna rausvi, vėliau tampa gelsvai ţali, rudenį paraudonuoja ir yra dekoratyvūs [1,4].
Mėlynė praţysta geguţės pabaigoje ir ţydi iki birţelio vidurio, o pavienių ţiedų galima rasti iki rudens. Ţiedai balti arba rausvi, rutuliški, pavieniai, išauga ant trumpų kotelių. Taurelė priaugusi prie mezginės, vos įţiūrima. Vainikėlis rausvas, suaugtinis, pūstas, išlikusi viršūninė anga su trumpomis, bukomis skiautėmis. Yra keturi arba penki ţiedlapiai.
Vaisiai - rutuliškos, maţdaug 5 mm skersmens, viršūnėje šiek tiek suplotos, tamsiai mėlynos su apnašomis uogos. Jų apatinėje dalyje yra rumbas, retais atvejais – ţiedkočio fragmentas. Viršutinė dalis plokščia, turinti liemenėlio ir taurelės likučius, kurie atrodo kaip apvali raukšlė. Violetinis mėsingas mezokarpas turi 4 arba 5 lokules su daug smulkių, rudų, ovalių sėklų. Mikroskopinės analizės metodu nustatyta, kad uogos susideda iš šių dalių [5]:
violetiniai roţinės spalvos endokarpo ir mezokarpo sklereidţių, daţnai susijungusių tarpusavyje ir turinčių storas su kanalėliais sieneles;
raudonai rudų epikarpo fragmentų, sudarytų iš daugiabriaunių ląstelių su vidutinio storio sienelėmis;
rudai geltono išorinio sėklos luobelės sluoksnio fragmentų, sudarytų iš ištįsusių, su U formos sustorėjimais, ląstelių;
kalcio oksalato kristalų telkinių.
Uogos prinoksta liepos pradţioje ir laikosi iki rugsėjo [1,2,6].
1.1.3. Vaistinė ţaliava
Renkami mėlynių vaisiai (Fructus Myrtilli) ir mėlynių lapai (Folium Myrtilli). Mėlynės uogos skinamos rankomis, kai yra gerai sunokusios. Vaisiai perrenkami, išmetamos priemaišos (lapai, vaiskočiai, nesunokusios uogos), pavėsyje apvytinami ir tuomet dţiovinami dţiovykloje ne aukštesnėje 60 °C temperatūroje. Išdţiovintos uogos labai raukšlėtos, silpno kvapo, rūgščiai saldaus skonio.
Mėlynių lapai skinami prieš augalui ţydint ar ţydėjimo pradţioje – geguţės - liepos mėn. Dţiovinama gerai vėdinamoje patalpoje, pavėsyje [7].
1.1.4. Pagrindiniai cheminiai komponentai
Literatūroje paţymima, kad bendras antocianų kiekis mėlynių vaisiuose yra 0,4 – 0,7%. Išgarinus vandenį iš mėlynių vaisių, juose lieka apie 10% sausų likučių, kuriuose yra šių junginių [2,3,7-9]:
25 iki 36% antocianų grupės junginių (malvidin-3-galaktozidas, delfinidin-3-galaktozidas, delfinidin-3-arabinozidas, petunidin-3-galaktozidas,
petunidin-3-arabinozidas, malvidin-3-arabinozidas, cianidin-3-gliukozidas,
cianidin-3-galaktozidas, cianidin-3-arabinozidas, delfinidin-3-gliukozidas,
malvidin-3-gliukozidas, peonidin-3-gliukozidas, peonidin-3-galaktozidas,
peonidin-3-arabinozidas ir peonidin-3-gliukozidas), apie 30 % sacharidų;
5-10 % taninų;
apie 1 % vaisių rūgščių;
alkaloidų (mirtino ir epimirtino);
fenolinių rūgščių (kavos ir chlorogeno),
flavonoidų (kvercitrino, izokvercitrino, astragalino, hiperozido); apie 30 % pektinų;
triterpenų; polifenolių;
vitaminų (C, P, B1, B2, PP);
mineralinių medţiagų (mangano, geleţies, kalio, kalcio); karotino.
1.2. Mėlynės vaidmuo liaudies medicinoje
Mėlynės uogų, kaip augalinio vaisto, vartojimas siekia viduramţius. Šventoji Hildegarda iš Bingeno, pirmoji aprašiusi augalą, rekomendavo mėlynę menstruacijų sukėlimui [2,10]. Be to, mėlynės preparatai buvo vartoti norint sustabdyti motinos pieno gamybą [3].
XVI amţiuje vokiečių ţolininkai rekomendavo šiomis uogomis gydyti tulţies pūslės akmenis, kepenų sutrikimus, ruošti sirupus nuo kosulio ir plaučių susirgimų.
XVIII amţiuje mėlynės uogas plačiai naudojo daugelis ţolininkų ir gydytojų, ypač Vokietijoje. Mėlynės preparatai buvo vartojami vidurių šiltinės, burnos, odos, šlapimo takų infekcijų, podagros ir reumato gydymui.
XX amţiaus pradţioje dţiovintų uogų arbata arba sirupas vartotas kaip sutraukianti priemonė sergant diarėja ar dizenterija; diuretikas; gaivinantis maistingas gėrimas; apsauga nuo skorbuto; kraujavimo stabdymui. Be to, burnos uţdegimų gydymui kaip sutraukianti ir dezinfekuojanti priemonė [2,4,11].
Ne vien uogos, bet ir lapai vartoti liaudies medicinoje. Tačiau Vokietijos Komisijos E monograma, augalų reglamentavimo bazė Vokietijoje, abejotinai atsiliepia apie mėlynės lapus. Pasak jos, lapai ir jų preparatai tradiciškai rekomenduojami diabeto, virškinimo trakto sutrikimų, artrito, podagros, odos susirgimų, hemorojaus, sutrikusios kraujo cirkuliacijos, širdies problemų gydymui, kraujo valymui ir metabolinių procesų stimuliavimui. Nors ir yra atlikta keletas senesnių laboratorinių tyrimų, teoriškai patvirtinančių priešuţdegiminį ir cukraus kiekį kraujyje maţinantį poveikį, vis dėl to trūksta mokslinių duomenų, kurie pagrįstų tradicinį lapų vartojimą. Todėl šios indikacijos nėra patvirtintos. Be to, diskutuojamas ir saugumo klausimas. Tyrimai su gyvūnais parodė, kad lapai gali sukelti anemiją, sutrikdyti virškinimo sistemos tonusą ir neigiamai paveikti maistingųjų medţiagų absorbciją. Vartojimo saugumas gali būti susijęs su lapuose esančiu dideliu taninų kiekiu [2].
Iš naujo mėlyne susidomėta po Antrojo pasaulinio karo, kai Britanijos Karališkųjų Oro Pajėgų pilotai pasakojo, kad mėlynių uogienė pagerino matymą tamsoje naktinių bombardavimų metu. Todėl 1960 m., remiantis šiais duomenimis atlikti pirmieji laboratoriniai, o vėliau ir klinikiniai tyrimai, įrodantys mėlynės uogų ekstrakto poveikį akims ir kraujagyslių sistemai [2,10].
1.3. Šiuolaikinis mėlynės farmacinių savybių pritaikymas
Šiuo metu mėlynės vaisių preparatai vartojami aktyvinti mikrocirkuliaciją, gydyti vištakumą ir diabetinę retinopatiją [2,12]. Vokietijos E Komisija sudarė monogramą, kuria leidţiama šioje šalyje mėlynės uogas vartoti ūmaus viduriavimo, nestipraus burnos ir gerklės gleivinių uţdegimo gydymui. Šiuolaikiniai uogų ekstraktų tyrimai patvirtino antioksidacinį poveikį, gebėjimą sumaţinti trombocitų agregaciją (sumaţina kraujo
klampumą, taigi ir krešėjimą), neţymiai atpalaiduoja kraujagyslių lygiuosius raumenis ir gali turėti įtakos faktorių, susijusių su lėtinėmis uţdegiminėmis ligomis, atpalaidavimui.
Laboratoriniais tyrimais nustatyta, kad mėlynių vaisių ekstraktai slopina fermentą elastazę, kuris sukelia kolageno degradaciją. Tai gali sąlygoti faktorių, susijusių su uţdegiminėmis ligomis, tokių kaip aterosklerozė, plaučių emfizema ir reumatoidinis artritas, suaktyvėjimą [2].
1.3.1. Klinikinis pritaikymas
Mėlynės ekstraktai plačiai vartojami regos, kraujagyslių sistemos sutrikimų, skrandţio ir dvylikapirštės ţarnos opų bei dismenorėjos gydymui [13].
1.3.1.1. Oftalmologiniai sutrikimai
Regėjimo pagerinimas
Mėlynių ekstrakto vartojimas pagerina naktinį matymą, greitina prisitaikymą prie tamsos, greičiau atstato regėjimo aštrumą ryškioje šviesoje [13,14]. Atlikti klinikiniai tyrimai, kurių metu buvo duota mėlynių vaisių ekstrakto vieno arba kartu su beta-karotinu ir vitaminu E pacientams su sutrikusiu jautrumu šviesai ar tinklainės mikrocirkuliacija [2]. Ryškesni rezultatai buvo pacientams su pigmentiniu retinitu ir hemeralopija. Tai įrodo, kad mėlynėse esantys antocianai turi savybių, panašių į epitelio
pigmentą bei tinklainės purpurinę zoną. Ši tinklainės vieta atsakinga uţ regėjimą ir
kontroliuoja prisitaikymą pereinant iš tamsos į šviesą ir atvirkščiai [13].
Glaukoma
Mėlynės ekstraktai, veikdami kaip antioksidantai, pagerina akių aprūpinimą deguonimi ir krauju, atlieka svarbų vaidmenį glaukomos prevencijoje ir gydyme dėl stiprinamojo poveikio akies kolageno struktūroms. Kolagenas suteikia akims įtempimo jėgą ir audinių vientisumą, kuris senstant susilpnėja, dėl to padidėja akispūdis, prarandamas periferinis matymas. Tyrimas, kurio metu aštuoniems glaukoma sergantiems pacientams buvo duota vienkartinė 200 mg Vaccinium myrtillus antocianų dozė, parodė pagerėjimą, nustatytą elektroretinogafijos būdu [13,14].
Katarakta
Klinikiniais tyrimais įrodyta, kad antocianai padeda uţkirsti kelią kataraktos progresavimui. Tyrimų metu pacientams buvo duodama 180 mg mėlynių ekstrakto (antocianų - 25%) su vitaminu E. 48 iš 50 pacientų, sergančių senatvine katarakta, sustabdytas ligos vystymasis [13,14].
1.3.1.2. Diabetinė retinopatija
Diabetinė retinopatija gali sukelti aklumą. Taip gali atsitikti, nes nenormaliai pagreitėja jungiamojo audinio sintezė siekiant atstatyti pralaidţius kapiliarus arba formuojant naujus kapiliarus [15]. Dvigubai aklo tyrimo metu 14 pacientų, sergantys diabetine arba hipertenzine retinopatija, du mėnesius kasdien gaudavo mėlynių ekstrakto, atitinkančio 115 mg antocianų. 11 pacientų pagerėjo oftalmoskopinių, o 12 pacientų – angiografinių tyrimų rezultatai [14].
1.3.1.3. Kraujagyslių sutrikimai
Klinikiniai tyrimai įrodė teigiamą antocianų poveikį gydant kapiliarų trapumą, smegenų kraujotakos sutrikimus, venų nepakankamumą ir varikozę [13]. Mėlynės antocianai efektyvūs gydant mikrokraujagyslių sutrikimus, nes jie sustiprina endotelio barjerinę funkciją stabilizuodami fosfolipidus, sumaţina leukocitų adheziją, skatina jungiamojo audinio, kuris dengia kraujagysles, biosintezę ir pagerina kapiliarų perfuziją [13,16].
1.3.2. Dozavimas
Daugeliu atvejų standartizuotas mėlynių ekstraktas, turintis 25% antocianų, gali būti vartojamas kapsulėmis ar tabletėmis. Daţniausiai gydytojai rekomenduoja nuo 240 iki 480 ar net 600 mg per dieną [17,18].
Diarėjos gydymui tradiciškai siūloma dţiovintų vaisių 4 – 8 g du kartus per dieną arba tris kartus per dieną dţiovintų vaisių nuoviro (virti 5 -10 g sutrintų vaisių 150 ml vandens 10 minučių ir dar karštą nukošti), arba tris kartus per dieną šalto macerato (sutrintus dţiovintus vaisius uţpilti 150 ml vandens ir palaikyti kelias valandas).
Ekspertai pataria vartoti dţiovintus vaisius, nes švieţi gali labiau sustiprinti viduriavimą [19].
1.3.3. Toksiškumas ir vaistų sąveika
Mėlynių vartojimo saugumas buvo tirtas įvairiais metodais. Ţiurkėms buvo duodama 400 mg/kg kūno svorio ir nepastebėta toksiškumo. Tyrimuose su ţmonėmis pacientai šešis mėnesius kasdien gaudavo 180 mg/kg antocianų ir nebuvo jokio toksinio poveikio. Taip pat nebuvo mutageninio ar karcinogeninio poveikio [14,20].
Kadangi mėlynės ekstraktas maţina trombocitų agregaciją, pacientams, turintiems kraujotakos sutrikimų ar vartojantiems antikoaguliantus, didelės antocianų dozės turi būti skiriamos atsargiai. Be to, vartojantiems cukraus kiekį kraujyje maţinančius vaistus, mėlynių lapai gali sustiprinti vaistų poveikį, todėl gali reikėti sumaţinti vaistų dozes. Gali trukdyti geleţies absorbcijai [14,20].
Lapai, vartojami ilgą laiką, gali būti nuodingi, todėl reikia neviršyti rekomenduojamos dozės. Kai kuriems gyvūnams kasdieninė 1,5g/kg dozė buvo mirtina [21,22].
1.3.4. Šalutinis poveikis
Pastebėta atvejų, kai mėlynių ekstraktas sukėlė nestiprų šalutinį poveikį virškinimo, odos ar nervų sistemoms [14,20]. Suvalgius daug švieţių vaisių galimas viduriavimas [21,22].
Ţmonėms, kurie yra alergiški Ericaceae šeimos augalams ar antocianams, gali pasitaikyti alerginių reakcijų, tačiau nėra patikimų jas aprašančių šaltinių [19].
1.3.5. Nėštumas ir ţindymas
Nėra pakankamų mokslinių įrodymų, kurie rekomenduotų mėlynes nėštumo ar ţindymo metu, nors, atsiţvelgiant į istorinį šių uogų kaip maisto vartojimą, jos yra saugios. Vieno tyrimo metu mėlynių ekstraktas buvo panaudotas kojų tinimui (edemos) dėl nėštumo gydyti ir nepastebėtas joks neigiamas poveikis [19].
2. ANTOCIANAI
2.1. Antocianai
Antocianai yra natūralūs gamtoje plačiai paplitę pigmentai. Jie sudaro didţiausią flavonoidų grupę. Šie pigmentai randami tik sausumos augaluose, jų neturi gyvūnai, mikroorganizmai ar vandens augalai. Taip yra todėl, kad antocianų biosintezei reikalingi cheminiai elementai, gaunami fotosintezės metu. Vandens augalai jų neturi, nes po vandeniu per maţas šviesos intensyvumas. Be to, tai evoliucijos pasekmė. Teigiama, kad antocianų sintezė yra evoliucijos atsakas augalams, prisitaikiusiems prie pirmykščio atšiauraus gamtovaizdţio ir intensyvių UV spindulių. Ryškaus ţemės paviršiaus išsiskirstymo dėl UV radiacijos nebuvo, kol neatsirado sausumos augalai. Pirmiausia buvo pagaminti dideli deguonies kiekiai augalų fotosintezės metu, tik vėliau susiformavo UV spindulius skirstantis ozono sluoksnis [23,24]. Tačiau ne visi sausumos augalai gamina antocianus. Caryophyllales, Cactus ir Galium mollugo jie pakeisti betacianais [24].
Antocianai augalų ţiedams, vaisiams ir lapams suteikia nuo gelsvai rausvos ar raudonos spalvos iki violetinės ar tamsiai mėlynos. Uogos ir vaisiai yra didţiausias natūralus antocianų šaltinis. Daţniausiai jie kaupiami vaisių odelėje, tačiau randami ir vaisių minkštime, taip pat šaknyse, šakniagumbiuose ar svogūnuose [25,26]. Tai svarbiausi, vandenyje tirpūs, augalų pigmentai [27]. Daugiausia antocianų yra Vitaceae(Vynmediniai) ir Rosaceae(Erškėtiniai) šeimų valgomuose augaluose – vynuogėse, vyšniose, slyvose, avietėse, braškėse, mėlynėse, obuoliuose, persikuose ir t.t. Taip pat antocianai randami ir Solanaceae(Bulviniai) (baklaţanas), Saxifragaceae (Uolaskėliniai) (raudonieji ir juodieji serbentai), Cruciferae(Kryžmažiedžiai) (raudonasis kopūstas) ir Ericaceae(Erikiniai) (mėlynė, spanguolė) šeimų augaluose [9]. Antocianais papildyti racioną galima valgant ne tik švieţias uogas, vaisius ir darţoves, bet ir daugelį jų produktų – sultis, vyną, dţemą [27].
Šie natūralūs pigmentai plačiai tyrinėjami ir dėl technologinio pritaikymo, ypač maisto pramonėje. Pastaruoju metu domimasi, kaip pakeisti sintetinius daţus natūraliais produktais. Pigmentai iš natūralių šaltinių įdomūs tuo, kad jie saugūs vartoti ir maistui suteikia įvairių atspalvių [28].
2.2. Antocianų molekulinė struktūra ir cheminė sudėtis
Šiuo metu iš augalų yra išskirti 539 antocianai. 277 iš jų identifikuoti jau po 1992 metų [26].
Antocianai turi C6C3C6-sandarą, būdingą flavonoidams. Antocianai yra
glikozilinti polihidroksi ir polimetoksi 2-fenilbenzopirilo (flavilo katijono) dariniai. Šis katijonas sudarytas iš deguonį turinčio heterociklo pirano, sujungto su benzeno ţiedu. Prie pirano ţiedo 2 padėtyje prisijungusi fenilo grupė, kuri gali turėti skirtingų radikalų.
Pagrindinė antocianų dalis yra aglikonas, flavilo katijonas. Jis turi konjuguotas dvigubas jungtis, atsakingas uţ šviesos absorbciją (apie 500 nm bangos ilgio), dėl kurios pigmentai ţmogui atrodo raudonos spalvos. Aglikonai vadinami antocianidinais, jie daţniausiai būna penta- (3,5,7,3´,4´) arba hexa-substitutai (3,5,7,3´,4´,5´). Ţinomi yra 22 antocianidinai, tačiau svarbiausi yra delfinidinas, cianidinas, petunidinas, malvidinas, peonidinas ir pelargonidinas. Šie aglikonai skiriasi hidroksi ir metoksi grupių skaičiumi flavilo katijono B ţiede [24-26].
4' 5' 3' 6' 2' 1' 2 3 O+ 1 4 6 5 7 8
A
C
B
1 lentelė Junginio pavadinimasGrupės padėtis struktūrinėje formulėje Junginio spalva
3 5 6 7 3´ 4´ 5´
Karajurinas H H OH OH H OCH3 OCH3 -
Arabidinas H H OH OH H OH OCH3 - 3´-hidroksiarabidinas H H OH OH OH OH OCH3 - Apigeninas H OH H OH H OH H Oranţinė Liuteolinas H OH H OH OH OH H Oranţinė Tricetinidinas H OH H OH OH OH OH Raudona Pelargonidinas OH OH H OH H OH H Oranţinė Aurantinidinas OH OH OH OH H OH H Oranţinė Cianidinas OH OH H OH OH OH H Oranţiniai raudona
5-metilcianidinas OH OCH3 H OH OH OH H Oranţiniai raudona
1 lentelės tęsinys 6-hidroksicianidinas OH OH OH OH OH OH H Raudona 6-hidroksidelfinidinas OH OH OH OH OH OH OH Mėlynai raudona Delfinidinas OH OH H OH OH OH OH Mėlynai raudona Petunidinas OH OH H OH OCH3 OH OH Mėlynai raudona
Malvidinas OH OH H OH OCH3 OH OCH3
Mėlynai raudona
Pulchelidinas OH OCH3 H OH OH OH OH Mėlynai raudona
Eupinidinas OH OCH3 H OH OCH3 OH OH
Mėlynai raudona
Kapensinidinas OH OCH3 H OH OCH3 OH OCH3
Mėlynai raudona
Hirsutidinas OH OH H OCH3 OCH3 OH OCH3
Mėlynai raudona Riciniodinas OH H OH OH H OH H - OH O+ O H OH OH OH O+ O H OH OH OH OH O+ O H OH OH OCH3
Pelargonidinas Cianidinas Peonidinas
OH O+ O H OH OH OH OH OH O+ O H OH OH OCH3 OCH3 OH O+ O H OH OH OH OCH3
Delfinidinas Malvidinas Petunidinas
2 pav. Svarbiausi gamtiniai antocianidinai
Gamtoje antocianidinai retai randami tokios formos. Daţniausiai jie būna glikozilinti, t.y. antocianai. Dėl to jie tirpesni ir stabilesni vandenyje nei antocianidinai. Antocianai klasifikuojami pagal turimų glikozidinių grupių skaičių.
Monoglikozidai turi vieną glikozidinę grupę (gliukozę, galaktozę, ramnozę, arabinozę, ksilozę ar gliukuroninę rūgštį), prisijungusią prie aglikono 3-hidroksilo grupės.
Diglikoziduose du monosacharidai prijungti prie 3 ir 5 arba 3 ir 7 hidroksilo grupės. Tačiau galimi atvejai, kai abu monosacharidai yra prisijungę prie C-3.
Triglikoziduose monosacharidai prie aglikono prisijungę taip, kad du iš jų yra prie 3 ir vienas prie 5 arba prie 7. Triglikozidiniai antocianai taip pat gali prie C-3 turėti linijinį arba šakotą radikalą iš trijų monosacharidų. Taip pat galimas monosacharidų prisijungimas prie 3´-, 4´-, ir 5´- padėčių. Daţniausi di- ir triglikozidai antocianuose yra rutinozė, soforozė, sambubiozė ir gliukorutinozė [25,26].
Antocianai gali būti ir acilinti. Organinės rūgštys, prie antocianų prisijungusios esterinėmis jungtimis, daţniausiai būna aromatinės fenolinės rūgštys, dikarboksi rūgštys arba jų abiejų deriniai. Rūgštys prie monosacharido prisijungia 6 padėtyje, o aciliniai pakaitai – prie monosacharido 2, 3, ir 4 padėties. Daţniausios fenolinės rūgštys antocianuose yra hidroksicinamono rūgšties dariniai (p-kumarino, ferulinė, kavos, sinapinė r.) ir hidroksibenzoinės rūgštys (galo r.). Taip pat prie antociano molekulės randama prisijungusių alifatinių rūgščių (malono, acto, obuolių, gintaro ir oksalo r.) [25].
Antocianai yra jautrūs pH pokyčiams. Jie stabilesni rūgštinėje terpėje nei neutralioje ar šarminėje. Tačiau per ilgą laiką stipriai rūgštinėje terpėje deguonies aplinkoje gali įvykti rūgštinė hidrolizė [27].
2.3. Antocianų svarba augalams ir gyvūnams
2.3.1. Antocianų svarba augalams
Antocianai augalams svarbūs dėl keleto prieţasčių. Viena jų – pritraukti vabzdţius ir gyvūnus (svarbu vabzdţiaėdţiams augalams), sugeriant tam tikro ilgio bangas. Šie pigmentai atlieka įvairiapusį vaidmenį apdulkinime, ypač Bromeliaceae (Bromeliniai) šeimos augalams. Šios šeimos atstovai tampa ryškiai raudoni prieš pat apdulkinimą arba jam jau prasidėjus, bet greitai vėl paţaliuoja dėl chlorofilo. Taigi, antocianai yra dinamiška signalizuojanti priemonė, kuri panaudojama reikalui esant. Vėliau juos suskaido augalo fermentai.
Kita prieţastis – jie veikia kaip UV spindulių ekranas ir yra gaminami kaip atsakas į augalą veikiančią UV radiaciją ir apsaugantis augalo DNR. Dėl UV spindulių dviguba DNR grandinė persikryţiuoja, todėl sutrukdomas ląstelės dalijimasis ir kiti
gyvybiniai procesai, pvz.: baltymų sintezė. Tai paaiškina, kodėl antocianai būna išoriniuose augalų sluoksniuose, nes tik čia jie gali tinkamai atlikti savo funkciją.
Ne maţiau svarbu tai, jog antocianai dėl nemalonaus skonio atbaido gyvūnus. Dėl gynybinio mechanizmo, antocianų sintezė gali suaktyvėti dėl jonizuojančios radiacijos, kuri, kaip ir UV spinduliai, gali paţeisti DNR [23,24].
Antocianų biosintezę atlieka fermentai, esantys ląstelės membranoje. Jie padeda du pagrindinius biocheminius elementus (acto rūgštį ir amino rūgšties fenilalaniną), gautus fotosintezės metu, per daugelį cheminių reakcijų paversti galutiniais produktais – pigmentais. Tada jie išskiriami į epidermio ląstelių vakuoles. Ţymūs DNR genetinio kodo pakitimai sąlygoja pigmentų sintezės sustojimą [23].
Antocianų gamybą veikia aplinkos faktoriai: šviesa, svarbus jos intensyvumas ir bangos ilgis, o mėlyni ir UV spinduliai – patys efektyviausi; temperatūra; vandens ir angliavandenių lygis; azoto, fosforo ir boro koncentracija augimo metu [23].
2.3.2. Antocianų poveikis ţmogaus organizmui
Aktyvusis deguonis, gaunamas iš endogeninių ir egzogeninių šaltinių, gali sąlygoti įvairias ligas, tokias kaip koronarinių arterijų liga, insultas, reumatoidinis artritas ir vėţys. Vaisių ir darţovių vartojimas sumaţina šių patologijų riziką, kuri aiškinama vitaminų-antioksidantų (vitaminas C, vitaminas E ir β-karotinas) poveikiu [29]. Farmakologiniu aktyvumu pasiţymi ir antocianai. Jie turi antioksidacinį poveikį, todėl apsaugo akis, kraujagysles, veikia priešuţdegimiškai, skatina ţaizdų, skrandţio opų gijimą ir lėtina aterosklerozės vystymąsi [30]. In vitro tyrimais įrodyta, kad, apsaugodami fermento laktatdehodrogenazės atsipalaidavimą iš širdies izofermentų, padeda išvengti pasikartojančios širdies anginos. Tinklainę antocianai apsaugo
inhibuodami fosfogliukomutazę ir gliukoz-6-fosfatazę. Sąveikaudami su
prostaglandinais, antocianidinai maţina trombocitų agregaciją [3].
Cianidino glikozidai stipriau veikia kaip antioksidantai nei peonidino ar malvidino glikozidai, nes turi laisvas hidroksilo grupes 3- ir 4- padėtyse [29].
Kolageną stabilizuojantis poveikis
Kolagenas yra baltymas, palaikantis kūno vientisumą ir pagrindinė sausgyslių, raiščių ir kremzlių sudedamoji medţiaga. Mėlynėse esantys antocianai kolageno metabolizmą veikia šiais būdais:
antocianai skatina persikryţiuoti kolageno skaidulas, taip sustiprindami natūralų jų persikryţiavimą, kuris iš kolageno suformuoja jungiamąjį audinį (kremzlę, raiščius ir t.t.);
dėl antioksidacinio poveikio apsaugo nuo laisvųjų radikalų daromos ţalos; uţdegimo metu slopina kolageno segmentaciją, kurią sukelia leukocitų išskiriami fermentai;
antocianai, kartu su kitais flavonoidų komponentais, slopina uţdegimo mediatorių (histamino, serino proteazių, prostaglandinų ir leukotrienų) atsipalaidavimą ir sintezę;
skatina mukopolisacharidų ir kolageno skaidulų biosintezę [13].
Laisvieji radikalai
Laisvieji radikalai sukelia daugelį patologijų. Jie tarpininkauja medţiagoms, dalyvaujančioms uţdegiminiame procese, ciklinių nukleotidų ir eikozanoidų gamyboje. Peroksido radikalai sustiprina uţdegiminį procesą didindami kraujagyslių pralaidumą ir stimuliuodami trombocitų agregaciją [30].
Dėl savo struktūros antocianai gali atiduoti vandenilio atomą, todėl manoma, kad jie turi antioksidacinį poveikį in vivo. Jie gali prisijungti peroksido ir azoto oksido
radikalus, sumaţinti H2O2 sukeltą citotoksiškumą ir tokoferoksilo radikalą paversti
α-tokoferoliu [31].
Palyginus antocianų aglikonų antioksidacinį poveikį, pagal jo stiprumą pigmentus galima išdėlioti tokia tvarka: cianidinas > delfinidinas > malvidinas, peonidinas, petunidinas. Skirtingas veikimas priklauso nuo molekulės struktūros:
didėjantis hidroksilo grupių skaičius didina antioksidacinį aktyvumą; B ţiede esanti o-dihidroksi struktūra suteikia radikalui didesnį stabilumą ir dalyvauja elektrono pasidalijime, todėl dihidroksilinimas B ţiedo 3' ir 4' padėtyse svarbus antioksidaciniam poveikiui;
flavonoidų glikozilinimas sumaţina jų aktyvumą lyginant su atitinkamais aglikonais;
neprisotinimas C ţiede skatina elektrono delokalizaciją visoje molekulėje siekiant stabilizuoti ariloksi radikalus dėl esančios konjugacijos;
A ir C ţiede esančios 3- ir 5- OH grupės reikalingos maksimaliam radikalus surišančiam poveikiui.
Lyginant antocianų aglikonus, pastebėta, kad skirtingi hidroksi ir metoksi grupių pakaitalai įtakoja antioksidacinį poveikį, nors turi tą pačią struktūrą A ir C ţieduose [32]. Priešvėžinis veikimas
Antioksidacinis antocianų poveikis buvo įrodytas in vitro ir in vivo eksperimentais. Be to, šie pigmentai svarbūs mutagenezės ir karcinogenezės prevencijoje ir vėţio gydyme. Antocianai slopina vėţinių ląstelių augimą ir jų transformaciją. Jų veikimo mechanizmas skirstomas į:
antioksidacinį poveikį;
molekulinius mechanizmus, susijusius su antikarcinogeneze;
molekulinius mechanizmus, susijusius su apoptozės indukcija vėţinėse ląstelėse [33].
Neseniai tyrimais su ţiurkių lygiaisiais ir raumenimis ir kepenų ląstelėmis įrodyta, kad antocianai maţina DNR paţeidimus, kuriuos sukelia oksidacija. Vėliau buvo tiriamas antocianų aglikonų poveikis ţmogaus vėţinių ląstelių (gimdos karcinomos ir gaubtinės ţarnos adenokarcinomos) ir normalių fibroblastų gyvybinis ciklas ir apoptozės indukcija. Nustatyta, kad delfinidinas stabdo normalių fibroblastų ląstelių proliferaciją ir veikia pro-apoptoziškai vėţinėse ląstelėse [34]. Apoptozė – genetiškai kontroliuojama ląstelės mirtis – pagrindinis daugialąstelinių organizmų homeostazės palaikymo mechanizmas [35].
Japonijos mokslininkai tyrė 10 valgomų uogų ekstraktų poveikį vėţinių ląstelių augimo inhibicijai. Tyrimui in-vitro buvo panaudotos ţmogaus HL60 leukemijos ir HCT116 gaubtinės ţarnos karcinomos ląstelės. Nustatyta, kad HCT116 ląstelės buvo atsparesnės antocianų sąlygotai apoptozės indukcijai nei HL60 ląstelės. Šie rezultatai parodė, kad antocianai cianidin-3-gliukozidas ir cianidin-3,5-digliukozidas į ţmogaus
plazmą pateko nepakitusios struktūros. Taip pat paaiškėjo, kad ne tik aglikonai, bet ir glikozidai stabdo vėţinių ląstelių augimą ir skatina apoptozę [36].
Antocianai suriša laisvuosius radikalus, aktyvina arba slopina fermentus, veikia kaip chelatiniai junginiai taip apsaugodami lipidus, baltymus ir nukleino rūgštis. Be to, jie sumaţina leukocitų imobilizaciją, skatina apoptozę bei slopina ląstelių proliferaciją ir angiogenezę, todėl gali būti panaudoti vėţio prevencijai ir gydymui [37].
Antocianų poveikis akims
Autofluorescenciniai pigmentai, kurie tinklainės pigmentinėse epitelio ląstelėse kaupiasi dėl amţiaus ar kai kurių tinklainės sutrikimų, susiję su dėmės degeneracijos vystymusi. Pagrindinis komponentas – fluoroforas A2E, piridino bisretinoidas. Šviesos paveiktas A2E tinklainės epitelio pigmentas gali dalyvauti apoptozėje mėlyname šviesos spektre. Aiškinantis ląstelių ţūtį, pastebėta, kad spinduliavimo metu (430 nm), A2E pats pagamina aktyvųjį deguonį, kuris, reaguodamas su A2E, sudaro epoksidus. Atliktas tyrimas parodė, kad A2E-epoksidai, nepriklausomai nuo aktyviojo deguonies, veikia DNR su pakitusiomis bazėmis. Mėlynių ekstraktai sumaţina A2E epoksidaciją slopindami aktyvųjį deguonį [38].
EKSPERIMENTINĖ DALIS
1. MEDŽIAGOS IR REAGENTAI
Tyrimui naudoti Vaccinium myrtillus vaisiai, surinkti Lietuvoje, Baltarusijoje, Rusijoje ir Švedijoje. Lietuvoje vaisiai rinkti Seirijuose, Prienuose, Merkinėje, Valkininkuose, Onuškyje, Palangoje, Šilutėje, Vainiūnuose ir Lekėčiuose.
5 6 2 9 3 1 7 4 5 6 2 9 3 1 7 4 8
3 pav. Darbe naudotų mėlynės uogų rinkimo vietos Lietuvos respublikos teritorijoje: 1-Lekėčiuose, 2- Merkinėje, 3- Onuškyje, 4- Palangoje, 5- Prienuose, 6- Seirijuose, 7- Šilutėje, 8- Vainiūnuose, 9- Valkininkuose.
Darbo metu naudotas išgrynintas vanduo, gautas Millipore išgryninto vandens sistema bei šios cheminės medţiagos:
Standartai, nurodyti 2 lentelėje;
Metanolis (CH3OH), pagamintas ROTISOLV®, Vokietijoje;
Vandenilio chlorido rūgštis (HCl), pagaminta Rusijoje;
Fosforo rūgštis 85% (H3PO4), pagaminta LACHEMA, Čekijos Respublikoje;
2 lentelė
Standarto pavadinimas Gamintojas
Cianidinchloridas ROTICHROM®, Vokietija
Malvidinchloridas ROTICHROM®, Vokietija
Delfinidinchloridas ROTICHROM®, Vokietija
Peonidinchloridas ROTICHROM®, Vokietija
Petunidinchloridas ROTICHROM®, Vokietija
Antocianų kiekis Vaccinium myrtillus vaisiuose buvo nustatytas
spektrofotometrijos, o aglikonų sudėtis ir kiekis - efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodo pagalba.
2. ŽALIAVOS PARUOŠIMAS
Vaisiai analizei surinkti brendimo laikotarpiu (liepos – rugsėjo mėn.) ir uţšaldyti.
3. ANTOCIANŲ KIEKYBINIS NUSTATYMAS
Mėlynių vaisių ekstrakto paruošimas
Ekstraktas paruoštas remiantis 2005 metų Europos farmakopėja. Atsverta apie 5 g šaldytų vaisių. Uţrašytas kiekvieno mėginio tikslus svoris. Vaisiai sutrinti grūstuvėje ir uţpilti 90 ml vandens ir metanolio (1:1) mišiniu. Gautas tirpalas 30 min. šildytas autoklave 40°C temperatūroje. Po to vandens ir metanolio (1:1) mišiniu praskiestas iki 100 ml ir perfiltruotas. Gautas ekstraktas perpiltas į buteliukus ir paliktas tolimesnei analizei. Iš viso paruošti 54 mėginiai.
Kiekybinis nustatymas spektrofotometrijos metodo pagalba
Antocianų kiekis mėlynių vaisiuose buvo tiriamas UNICAM „Helios α“ spektrofotometru. Analizei imtas 0,5 ml jau paruošto ekstrakto ir jis praskiestas metanoliu, parūgštintu 0,1% vandenilio chlorido rūgštimi, iki 10 ml. Naudota 1 cm storio kiuvetė, optinis tankis matuotas prie 528 nm bangos ilgio, palyginamasis tirpalas – 0,1% vandenilio chlorido rūgštis metanolyje. Rezultatai apskaičiuoti pagal 2005 metų Europos farmakopėjoje nurodytą formulę:
m A
718 5000
718 – specifinė cianidin-3-gliukozidchlorido absorbcija prie 528 nm bangos ilgio; A – absorbcija prie 528 nm bangos ilgio;
m – atsverto mėginio tikslus svoris.
Antocianų identifikavimas
Taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą identifikuojamieji junginiai nustatomi pagal sulaikymo trukmę ir medţiagų spektrus matomos šviesos bangų ilgių intervale. Darbo metu naudotas chromatografas „Waters 2690“, fotodiodų detektorius „Waters 996“, kolonėlė - „Hypersil ODS (C18)“, kurios ilgis 15 cm, skersmuo – 4,6 mm, dalelių dydis – 5 μm.
Ekstrakto hidrolizė
Darbo metu siekta nustatyti aglikonų kiekį mėlynių vaisių ekstrakte. Kadangi antocianų glikozidų yra labai daug (10 pav.), visus juos kiekybiškai nustatyti yra sudėtinga ir netikslinga. Todėl atskirų aglikonų kiekiai buvo nustatyti atlikus hidrolizę, kad būtų gauti 5 pagrindiniai aglikonai, nurodomi literatūros šaltiniuose (delfinidinas, cianidinas, petunidinas, peonidinas ir malvidinas). Tokiu būdu metodas tampa paprastesnis. 25 ml jau anksčiau paruošto ekstrakto sumaišyta su 8,5 ml 4 N vandenilio chlorido rūgštimi. Paskui, prijungus grįţtamą šaldytuvą, vandens vonioje virintas 1 valandą. Po to hidrolizuotas ekstraktas atvėsintas, metanoliu praskiestas iki 50 ml ir perfiltruotas PVDF filtru, kurio poros 22 μm, panaudojus slėgį.
Tyrimui ESC paimta 2 ml paruošto hidrolizuoto mėlynių vaisių ekstrakto ir kolboje iki 10 ml praskiesta metanoliu. Iš gauto tirpalo paimta 10 μl ir įvesta į skysčių chromatografą.
Nustatyta, kad atliekant hidrolizę 1 valandą nepilnai hidrolizuojasi antocianų aglikonai (4 pav.), todėl nuspręsta hidrolizę pratęsti iki 2 val.
AU 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
Sulaikymo laikas, min
0 10 20 30 40 50 60 23 .54 2 25 .75 1 27 .53 5 30 .21 8 31 .21 3 34 .91 1 36 .34 4 41 .60 6 42 .26 7 AU 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
Sulaikymo laikas, min
0 10 20 30 40 50 60 23 .54 2 25 .75 1 27 .53 5 30 .21 8 31 .21 3 34 .91 1 36 .34 4 41 .60 6 42 .26 7
4 pav. Mėlynės ekstrakto chromatograma po 1 val. hidrolizės Kiekybinis aglikonų nustatymas
Darbo metu kiekybiškai nustatyti pagrindinių antocianų (cianidino, delfinidino, peonidino, petunidino ir malvidino) aglikonai. Kiekybinis nustatymas atliktas su chromatografu „Waters 2690“ ir UV detektoriumi „Waters 2487“. Naudota „Lichrosphere 100“ kolonėlė, kurios dalelių dydis 5 μm, ilgis - 12,5 cm, o skersmuo – 4 mm. Aglikonų kiekybiniam nustatymui naudota trumpesnė kolonėlė nei identifikavimui, nes uţtenka atskyrimo laipsnio, o tyrimas tampa greitesnis.
Tirpiklių sistema: A tirpiklis - 4% fosforo rūgštis vandenyje, B tirpiklis – ESC grynumo acetonitrilas. Nustatymui naudotas eliuavimo gradientinis metodas, nurodytas 3 lentelėje, tekėjimo greitis - 1,0 ml/min.
3 lentelė
Laikas, min. Tirpiklis A, % Tirpiklis B, %
0 7 93
45 25 75
46 30 70
Antocianų aglikonų kiekybiniam nustatymui buvo gaminami jų standartiniai tirpalai ir po 10 μl gautų tirpalų įvedami į skysčių chromatografą. Apskaičiuojami uţrašytų chromatogramų smailių plotai ir sudaromi kalibraciniai grafikai. Nustatyta antocianų aglikonų chromatografinių smailių ploto ir koncentracijos tiesinė
mg/ml (6 pav.), petunidino 0,016 – 0,048 mg/ml (7 pav.), peonidino 0,008 – 0,024 mg/ml (8 pav.), malvidino 0,008 – 0,024 mg/ml (9 pav.).
5 pav. Delfinidino kalibracinis grafikas
7 pav. Petunidino kalibracinis grafikas
8 pav. Peonidino kalibracinis grafikas
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Atlikus tyrimą nustatyta, kad mėlynių vaisiuose yra 14 skirtingų antocianų. Šių išskirtų antocianų chromatograma pateikta 5 pav.
530 nm AU 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07
Sulaikymo laikas, min
8 16 24 32 36 15.42 7 16.89 4 17.73 5 18.53 8 19.44 7 20.28 2 20.98 3 21.82 6 22.58 1 23.52 4 24.42 6 24.78 2 26.38 6 28.19 0 AU 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07
Sulaikymo laikas, min
8 16 24 32 36 15.42 7 16.89 4 17.73 5 18.53 8 19.44 7 20.28 2 20.98 3 21.82 6 22.58 1 23.52 4 24.42 6 24.78 2 26.38 6 28.19 0
Nustatytų antocianų pavadinimai nurodyti 4 lentelėje. 4 lentelė
Smailė Sulaikymo trukmė, min. Antociano pavadinimas
1. 15,431 delfinidin-3-galaktozidas 2. 16,859 delfinidin-3-gliukozidas 3. 17,788 cianidin-3-galaktozidas 4. 18,581 delfinidin-3-arabinozidas 5. 19,484 cianidin-3-gliukozidas 6. 20,324 petunidin-3-galaktozidas 7. 21,090 cianidin-3-arabinozidas 8. 21,798 petunidin-3-gliukozidas 9. 22,702 peonodin-3-galaktozidas 10. 23,641 petunidin-3-arabinozidas 12. 24,490 peonidin-3-gliukozidas 13. 24,824 malvidin-3-galaktozidas 14. 26,316 malvidin-3-gliukozidas 15. 28,276 malvidin-3-arabinozidas
Antocianai turi jiems būdingą absorbciją, kuri ryškiausia prie 520 – 530 nm bangos ilgio. Pagal fotodiodų detektoriaus „Waters 996“ pagalba padarytus spektrus trimatėje erdvėje (11 pav.) ir absorbcijos spektrus (12 pav.) nustatėme, kad chromatografinės smailės yra antocianai.
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0.050 0.055 0.060 0.065 0.070 0.075 AU 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 Minutes 400.00 500.00 600.00
11 pav. Mėlynių ekstrakto chromatograma trimatėje erdvėje
AU
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
, nm
300
400
500
600
344.7 522.1 344.7 522.1 326.7 516.0 344.7 524.6 326.7 516.0 344.7 528.2 326.7 518.4 345.9 528.2 331.5 357.8 517.2 306.2 528.2 345.9 528.2 330.3 367.3 517.2 345.9 528.2 347.1 528.2AU
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
, nm
300
400
500
600
344.7 522.1 344.7 522.1 326.7 516.0 344.7 524.6 326.7 516.0 344.7 528.2 326.7 518.4 345.9 528.2 331.5 357.8 517.2 306.2 528.2 345.9 528.2 330.3 367.3 517.2 345.9 528.2 347.1 528.2Antocianų kiekybinė sudėtis buvo nustatyta spektrofotometrijos metodo pagalba. Gautus rezultatus galima palyginti. Nustatyta, kad Lietuvos skirtinguose regionuose augančių mėlynių kiekybinė sudėtis skiriasi labai neţymiai (13 pav.). Didţiausias antocianų kiekis nustatytas Vainiūnuose rinktuose mėlynių vaisiuose, o maţiausias – Seirijuose.
Antocian? kiekybin?s sud?ties palyginimas skirtingose
0,3977 0,3376 0,3777 0,3621 0,3433 0,3234 0,4013 0,4214 0,3696 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Lekėčiai Merkinė Onuškis Palanga Prienai Seirijai Šilutė Vainiūnai Valkininkai
Regionas Anto cia n ų k ie k is ,%
Antocian? kiekybin?s sud?ties palyginimas skirtingose
0,3977 0,3376 0,3777 0,3621 0,3433 0,3234 0,4013 0,4214 0,3696 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Lekėčiai Merkinė Onuškis Palanga Prienai Seirijai Šilutė Vainiūnai Valkininkai
Regionas Anto cia n ų k ie k is ,%
13 pav. Mėlynėse esančių antocianų kiekybinės sudėties palyginimas Lietuvos regionuose
Palyginus skirtingose šalyse rinktų mėlynių vaisių kiekybinę sudėtį, matome, kad didţiausias antocianų kiekis randamas Rusijoje, o maţiausias – Lietuvoje augančiose mėlynėse (14 pav.). Lietuvoje ir Baltarusijoje augančiose mėlynėse sukauptas antocianų kiekis beveik nesiskiria. Švedijoje ir Rusijoje augančiose mėlynėse taip pat labai panašus antocianų kiekis.
0,3705 0,3734 0,4287 0,4251 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Lietuva Baltarusija Rusija Švedija
Šalis
Anto
cia
n
ų
k
ie
k
is
,
%
0,3705 0,3734 0,4287 0,4251 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5Lietuva Baltarusija Rusija Švedija
Šalis
Anto
cia
n
ų
k
ie
k
is
,
%
14 pav. Mėlynėse esančių antocianų kiekybinės sudėties palyginimas skirtingose šalyse
Atlikus hidrolizę (2 val.), ESC pagalba nustatyti 5 aglikonai - delfinidinas, cianidinas, petunidinas, peonidinas ir malvidinas – ir jų sulaikymo laikai ( 15 pav.)
AU
0 0,005 0,01 0,014
Sulaikymo laikas, min
0 10 20 30 40 50 Del fi nidi n as -25.410 C ia nid ina s -30.918 Pe tuni dina s -32.938 Peonidi n as -38.954 Mal vidi n as -40.096 AU 0 0,005 0,01 0,014
Sulaikymo laikas, min
0 10 20 30 40 50 Del fi nidi n as -25.410 C ia nid ina s -30.918 Pe tuni dina s -32.938 Peonidi n as -38.954 Mal vidi n as -40.096
Suskaičiavus duomenis, gautus ESC metodu, galima palyginti antocianų kiekybinę sudėtį Lietuvos regionuose. Iš grafiko ( 16 pav.) matome, kad daugiausia Lietuvoje augančiuose mėlynių vaisiuose yra cianidino. Daug maţiau – delfinidino ir petunidino, jų yra panašus kiekis, ir maţiausiai – peonidino ir malvidino.
0.663 2.039 0.733 0.456 0.387 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
Aglikonas
Antocia
n
ų
k
iek
is
m mg/
ml
0.663 2.039 0.733 0.456 0.387 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
Aglikonas
Antocia
n
ų
k
iek
is
m mg/
ml
16 pav. Mėlynėse esančių antocianų kiekybinės sudėties palyginimas Lietuvos regionuose ESC metodu
Pagal gautus rezultatus galima palyginti ir visose 4 šalyse rinktų mėlynių vaisių kiekybinę sudėtį. Nustatytas kiekvieno aglikono kiekis skirtingose šalyse.
Iš 17 pav. matome, kad delfinidino daugiausia randama Rusijoje augančiose mėlynėse, kiek maţiau – Švedijoje, dar maţiau – Lietuvoje, o maţiausias jo kiekis – Baltarusijoje.
Cianidino daugiausiai randama Rusijoje augančiose mėlynėse, maţiau – Lietuvoje, maţiausiai – Baltarusijoje. Cianidino kiekis Lietuvoje ir Švedijoje rinktose uogose skiriasi labai neţymiai.
Palyginus petunidino kiekybinę sudėtį tyrime dalyvavusių šalių mėlynių vaisiuose, matome, kad rezultatai labai panašūs į delfinidino. Daugiausiai petunidino yra Rusijoje, o maţiausiai – Baltarusijoje augančiuose mėlynių vaisiuose.
Peonidino daugiausiai yra Rusijoje. Šioje šalyje rinktos mėlynių uogos turimu peonidino kiekiu gerokai išsiskiria iš kitų tyrime dalyvavusių šalių. Maţiausias peonidino kiekis nustatytas Švedijoje augančiose mėlynėse, nors jį tik labai neţymiai viršija Baltarusijoje surinkti mėlynių vaisiai.
Malvidino didţiausias kiekis rastas Rusijoje, o maţiausias – Baltarusijoje rinktuose mėlynių vaisiuose. Šio aglikono, palyginus su kitais aglikonais, nustatytas pats maţiausias kiekis visose 4 tyrime dalyvavusiose šalyse.
17 pav. Iš mėlynių išskirtų aglikonų kiekybinis palyginimas skirtingose šalyse
0 ,6 6 3 2 ,0 3 9 0 ,7 3 3 0 ,4 5 6 0 ,3 8 7 0 ,6 0 7 1 ,6 1 4 0 ,6 1 6 0 ,3 0 5 0 ,2 7 4 0 ,8 7 2 2 ,2 7 0 0 ,8 5 6 1 ,4 2 7 0 ,4 5 1 0 ,8 5 0 1 ,9 8 6 0 ,7 9 3 0 ,2 9 1 0 ,3 5 7 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500
Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
Aglikonas K ie k is , m g /m l Lietuva Baltarusija Rusija Švedija
IŠVADOS
Mėlynių (Vaccinium myrtillus) vaisiuose identifikuota 14 antocianų ir nustatyta, kad kokybinė mėlynių vaisių sudėtis Lietuvoje, Baltarusijoje, Rusijoje ir Švedijoje nesikeičia.
Nustatytas bendras antocianų kiekis spektrofotometrijos būdu ir išsiaiškinta, kad daugiausiai antocianų yra Rusijoje augančiuose mėlynių vaisiuose, o maţiausiai - Lietuvoje. Iš Lietuvos regionuose rinktų mėlynių vaisių didţiausias antocianų kiekis nustatytas Vainiūnuose, o maţiausias – Seirijuose.
Nustatyta mėlynių vaisiuose esančių antocianų aglikonų kiekybinė sudėtis pagal ESC. Šis metodas parodė, kad visose tyrime dalyvavusiose šalyse – Lietuvoje, Baltarusijoje, Rusijoje ir Švedijoje - augančiuose mėlynių vaisiuose didţiausias kiekis yra cianidino, o maţiausias – malvidino. Visų 5 tiriamų aglikonų – delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino – daugiausia rasta Rusijoje augančiuose mėlynių vaisiuose, o maţiausias jų kiekis – Baltarusijoje surinktuose vaisiuose.
LITERATŪRA
[1] http://lt.wikipedia.org/wiki/M%C4%97lyn%C4%97, [2] http://www.stevenfoster.com/education/monograph/bilberry.html, [3] http://www.herbalgram.org/iherb/expandedcommissione/he005.asp, [4] http://www.botanical.com/botanical/mgmh/b/bilber, [5] European Pharmacopoeia 5.0, 2005. [6] http://jeantosti.com/fleurs3/myrtille.htm, [7] http://www.e-vaistine.lt/vaistazoles/vaistiniai-augalai/melyne, [8] http://www.chromadex.com/Phytosearch/bilberry.htm, (2005-11-21)[9] V. Lohachoompol, G. Srzednicki, J. Craske, The Change of Total Anthocyanins in Blueberries and Their Antioxidant Effect After Drying and Freezing, J Biomed Biotechnol, 2004 [5] (2004) 248.
[10] http://plants.usda.gov/cgi_bin/topics.cgi?earl=plant_profile.cgi&symbol=VACCI,
[11] http://www.herbdatanz.com/blueberry_picture_monograph.htm,
[12] http://starthealthylife.com/page240.htm, (2006 03 17)
[13] Murray, M.T., Bilberry (Vaccinium myrtillus), American Journal of Natural Medicine, 4 [1] (1997) 17.
[14] Vaccinium myrtillus (Bilberry), Alternative Medicine Review, 6 [5] (2001) 500. [15] R. Boniface, A.M. Robert, Effect of anthocyanins on human connective tissue metabolism in the human, Klin Monatsbl Augenheilkd, 209 [6] (1996) 368.
[16] S. Bertuglia, S. Malandrino, A. Colantuoni, Effect of Vaccinium myrtillus anthocyanosides on ischaemia reperfusion injury in hamster cheek pouch microcirculation, Pharmacol Res, 31 [3-4] (1995) 183.
[17] http://www.kroger.com/hn/Concern/Night_Blindness.htm,
[18] http://www.kroger.com/hn/Supp/Flavonoids.htm,
[19] http://allnutritionals.com/drugs/b/bilberry-vacciniummyrtillus.shtml,
[20] http://www.swedish.org/111392.cfm, (2005_11_04)
[21] http://www.dietsite.com/dt/alternativenutrition/Herbs/bilberry.asp,
[22] J.A. Duke, M.J. Bogenschutz-Godwin, J.du Cellier, P.A. Duke Handbook of Medicinal Herbs, Second ed., CRC press, 2002.
[24] http://en.wikipedia.org/wiki/Anthocyanin,
[25] Rein, M.; University of Helsinki: Helsinki, 2005, p 87.
[26] O.M. Andersen, K.R.Markham Flavonoids:Chemistry, Biochemistry, and Applications, CRC Press, 2006.
[27] M.P. Kahkonen, J. Heinamaki, V. Ollilainen, M. Heinonen, Berry anthocyanins: isolation, identification and antioxidant activities, J Sci Food Agric, 83 (2003) 1403. [28] A. Faria, J. Oliveira, P. Neves, P. Gameiro, C, Santos-Buelga, V. de Freitas, N. Mateus, Antioxidant Properties of Prepared Blueberry(Vaccinium myrtillus) Extracts, J. Agric. Food Chem., 53 (2005) 6896.
[29] Prior, R.L., Fruits and vegetables in the prevention of cellular oxidative damage, Am J Clin Nutr, 78 (2003) 570S.
[30] S.M. Aragon, B. Basabe, J.M. Benedi, A.M. Villar, Antioxidant Action of Vaccinium myrtillus L, Phytother. Res., 12 (1998) S104.
[31] Y.P. Jang, J. Zhou, K. Nakanishi, J.R. Sparrow, Anthocyanins Protect Against A2E Photooxidation and Membrane Permeabilization in Retinal Pigment Epithelial Cells, Photochemistry and Photobiology, 81 (2005) 529.
[32] W. Zheng, S.Y. Wang, Oxygen Radical Absorbing Capacity of Phenolics in
Blueberries, Cranberries, Chokeberries, and Lingonberries, J. Agric. Food Chem., 51 (2003) 502_509.
[33] Hou, D.X., Potential mechanisms of cancer chemoprevention by anthocyanins, Curr Mol Med, 3(2) (2003) 149.
[34] M.C. Lazze, M. Savio, R. Pizzala, O. Cazzalini, P. Perucca, A.I. Scovassi, L.A. Stivala, L. Bianchi, Anthocyanins induce cell cycle perturbations and apoptosis in different human cell lines, Carcinogenesis, 25 [8] (2004) 1427.
[35] S. Martin, G. Giannone, R. Andriantsitohaina, M. C. Martinez, Delphinidin, an active compound of red wine, inhibits endothelial cell apoptosis via nitric oxide pathway and regulation of calcium homeostasis, British Journal of Pharmacology, 139 (2003) 1095.
[36] N. Katsube, K. Iwashita, T. Tsushida, K. Yamaki, M. Kobori, Induction of Apoptosis in Cancer Cells by Bilberry (Vaccinium myrtillus) and the Anthocyanins, J. Agric. Food Chem., 51 (2003) 68.
[37] W. Yi, J. Fisher, G. Krewer, C.C. Akoh, Phenolic Compounds from Blueberries Can Inhibit Colon Cancer Cell Proliferation and Induce Apoptosis, J. Agric. Food Chem., 53 (2005) 7320.
[38] J.R. Sparrow, H.R. Vollmer-Snarr, J. Zhou, Y.P. Jang, S. Jockusch, Y. Itagaki, K. Nakanishi, A2E-epoxides damage DNA in retinal pigment epithelial cells. Vitamin E and other antioxidants inhibit A2E-epoxide formation, J Biol Chem, 278 [20] (2003)
