KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
MONTPELLIER 1 UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
Vacis Tatarūnas
POLIMERAZĖS GRANDININĖS REAKCIJOS METODO
TAIKYMAS FARMAKOGENETINIUOSE TYRIMUOSE
MAGISTRO DARBAS
Darbo vadovai : Prof., dr. Catherine Gozé
Prof., dr. Vitalis Briedis
KAUNAS
MONTPELLIER
TURINYS SANTRUMPOS (5)
ĮVADAS (6)
I. LITERATŪROS APŽVALGA (8) A. FARMAKOGENETIKA (8)
1. Vaistų metabolizmas ir transportas (8) 2. Genetiniai polimorfizmai (9)
3. Genotipo ir fenotipo nustatymo metodai (11) 3.1. Fenotipavimas (11)
3.2. Genotipavimas (11)
B. PRIEŠVĖŽINIŲ VAISTŲ FARMAKOGENETIKA (12) 1. Tiopurin-S-metil transferazė (TPMT) (12)
1.1. Tiopurinai (13) 1.2. Geno mutacijos (14) 1.3. Mutacijos aleliuose (14)
1.4. Geno TPMT seka su mutacijomis (15) 1.5. Nepageidaujamas tiopurinų poveikis (16)
2. Uridin-difosfat-gliukuronoziltransferazė (UGT1A1) (16) 2.1. Geno mutacijos (16)
2.2. UGT1A1 TATA-BOX (16)
2.3. Topoizomerazės – 1 inhibitoriai (17) 2.4. Metabolizmas (18)
2.5. Nepageidaujamas vaistų poveikis (19) 3. Aromatazė (19)
3.1. Aromatizacijos reakcijos mechanizmas (20) 3.2. Geno mutacijos (21)
3.3. Vaistai (22)
3.4. Pašaliniai poveikiai (23)
C. DARBO POLIMERAZĖS GRANDININĖS REAKCIJOS METODU PRINCIPAS (24)
1. DNR ekstrahavimo principai (24) 2. DNR ekstrahavimo metodai (24)
2.1. Ekstrahavimas natrio chloridu (druskinis metodas) (24) 2.2. Ekstrahavimas panaudojant DEAE polimerus (25) 3. DNR kiekio nustatymas spektrofotometriškai (26) 4. DNR plazmoje bei serume (27)
4.1. DNR nustatymas plazmoje (27)
4.2. Padidintas plazmos DNR kiekis pas pacientus, sergančius onkologinėmis ligomis (27)
5. DNR izoliavimas ir konservavimas (27) 6. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) (28)
6.1. Principas (28) 6.2. Etapai (28) 6.2.1. Denatūravimas (29) 6.2.2. Hibridizacijos fazė (29) 6.2.3. Elongacijos fazė (29) 6.3. DNR kiekio didėjimas (29)
6.4. Pradmenys polimerazės grandininei reakcijai (30) 6.5. Lizdinės PGR metodas (30)
6.6. PGR produktų valymas (31) 6.7. Gel-elektrofarezė (31)
6.8. Nukleino rūgščių vizualizavimas (31) 6.9. Sekvenavimas (32)
D. RNR – RIBONUKLEINĖ RŪGŠTIS (33) 1. RNR ekstrahavimo metodas (33) 2. Atvirkštinės transkripcijos reakcija (34) 3. Geno ekspresijos matavimas (35)
3.1. Metodas (35)
3.2. Detekcijos ‘realiu laiku’ sistemos (36) 3.3. Strategijos (37)
II. EKSPERIMENTINĖ DALIS (38)
A. KRAUJO, PLAZMOS BEI SERUMO GENOTIPAVIMAS (38) 1. Medžiagos ir instrumentai (38)
2. Sąlygos (39)
3. Gauti pavyzdžiai (39) 4. DNR ekstrahavimas (40)
4.1. Ekstrahavimo procedūros tobulinimas serumui ir plazmai, ekstrahuojant natrio chloridu (druskiniu metodu) (40) 4.1.1. Ekstrahavimo protokolas (40)
4.2. Ekstrahavimo procedūros, ekstrahuojant iš plazmos ir serumo, panaudojant QIAGEN (QIAAMP DNA BLOOD MIDI KIT) rinkinį, tobulinimas (41)
4.2.1. Ekstrahavimo protokolas (41) 5. Optinės skvarbos matavimas (41)
6. Genas TPMT (42)
6.1. “Ilgųjų” pradmenų patvirtinimo procedūra, panaudojant DNR, ekstrahuotą iš kraujo (42)
6.2. PGR reakcijos optimizavimas egzonui 5 (45)
7. Lizdinės PGR strategija : DNR, ekstrahuotos iš plazmos ir serumo, genotipavimas (46)
7.1. Plazma paciento 42 (46)
7.2. Paciento 44 plazmos ekstraktas (48)
7.3. Sekvenavimas PGR produkto, gauto panaudojant DNR ekstraktą iš 370µL paciento 44 plazmos (49)
7.4. Ilgalaikio užšaldymo įtaka : DNR buvo ekstrahuota iš serumo, kuris buvo užšaldytas metus –200C temperatūroje (50)
8. UGT1A1 genas (51)
8.1. Pradmenys UGT1A1 genui (51)
8.2. Naujųjų pradmenų patvirtinimas, panaudojant kraujo DNR ekstraktą (51)
8.3. Lizdinės PGR strategija : plazmos ir serumo genotipavimas (54) 8.3.1. Paciento 42 ir paciento 44 plazma (54)
8.3.2. Paciento 0007 serumas : pavyzdys buvo užšaldytas esant – 200C ir laikomas metus (56)
B. GENO EKSPRESIJOS MATAVIMAS (56) 1. Pasirinktas analizės metodas (56) 2. Medžiagos ir instrumentai (57) 3. Sąlygos (57)
4.1. Ekstrahavimo protokolas (58) 5. Optinės skvarbos matavimo rezultatai (58) 6. kDNR gel-elektrofarezė (58)
7. Atvirkštinės transkripcijos reakcija (59) 8. Kiekybinis metodas (59)
8.1. Ląstelių, galinčių tapti pavyzdžiu, paieška (60) 8.1.1. MCF-7 ląstelės (60)
8.2. PGR sąlygų patvirtinimas (60) 8.3. Hela ląstelės (62)
8.4. Palyginamoji studija su MCF-7 (64)
8.5. Aromatazės geno ekspresija pirmos stadijos krūties vėžio ląstelėse (65)
IŠVADA (66) LITERATŪRA (67)
SANTRUMPOS
6-MP – 6-merkaptopurinas 6-TGN – 6-tioguaninas
B2 - genas, naudojamas kaip standartas
CYP19 – citochromo P450 šeimos fermentas, aromatazė CYP2D6 – citochromo P450 šeimos fermentas
CPT-11 – irinotekanas
ddNTP – didezoksiribonukleotidai DEAE – dietilamino etanas
DEPC – dietil pirokarbonatas dNTP – dezoksiribonukleotidai EDTA – etildiamino tetraacto rūgštis GSTP1 – gliutation-S-transferazė
HPRT - genas, naudojamas kaip standartas iRNR – informacinė RNR
kDNR – DNR kopija (cDNR) Mg – magnis
oligo(dX) – oligonukleotidas sudarytas iš tam tikros bazės grandinės PGR – polimerazės grandininė reakcija
poly(A) – RNR dalis, sudaryta iš adeninų RT – atvirkštinė transkriptazė
SDS – natrio duodecil sulfatas
SN-38 – aktyvus irinotekano metabolitas SNP – vieno nukleotido polimorfizmas
TATA-BOX – tai promotoriaus sritis, prie kurios jungiasi transkripcijos faktoriai ar histonai
TBE – tris borat EDTA
TBP89 – genas, naudojamas kaip standartas Topo-1 – topoizomerazė 1
TPMT – tiopurin-metiltransferazė
UGT1A1 – uridin-difosfat-gliukuronoziltransferazė 1 UV spinduliai – ultravioletiniai spinduliai
ĮVADAS
Aš atlikau praktiką Prancūzijoje, Montpellier mieste, Arnaud de Villeneuve ligoninės ląstelių biologijos ir hormonologijos laboratorijoje.
Laboratorijoje vykdoma veikla:
• Onkologinių ligų nustatymas, remiantis vėžio žymenimis • Onkogenetika
• Žmogaus papilomos viruso nustatymas • Farmakogenetika
Mano darbas – farmakogenetika. Rėmiausi 2 metodais:
1. lizdinė polimerazės grandininė reakcija, po kurios atliekamas sekvenavimas
2. realaus laiko polimerazės grandininė reakcija
Žingsnis po žingsnio įvaldžiau abi technikas : pradėjau nuo DNR ir RNR ekstrahavimo, bei klasikinės PGR, o užbaigiau realaus laiko PGR metodu.
1. Ligoninių laboratorijose, tiriant tam tikrą geną, naudojamas pacientų kraujas, kuriame gausu DNR (10-15mg/mL) (Quinque D. ir kt., 2006). Daroma klasikinė PGR, po kurios seka sekvenavimas. Tačiau dažna yra tokių situacijų, kai neturima pakankamai kraujo, kaip pvz.:
• Siekiant atlikti retrospektyvius seroteko tyrimus • Audiniams, fiksuotiems pat-anatomų, pvz.: parafinu • Kriminologijoje, kai turimi tik maži kiekiai kraujo
Šių dienų technologijos neleidžia identifikuoti DNR sekų (atlikti sekvenavimą), neturint pakankamai matricos.
2. Norint identifikuoti geno raiškos lygį, daroma kiekybinė PGR (realaus laiko). Tai metodas, leidžiantis “suskaičiuoti” geno kopijas (mano darbo atveju – RNR), remiantis cheminių medžiagų fluorescencija.
Eksperimento tikslai
1. Patikrinti galimybę gausinti serume ir plazmoje esančią DNR nauju būdu ir atlikti genetinius tyrimus.
2. Patvirtinti realaus laiko polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodiką aromatazės genui, panaudojus ląsteles, kurių šio geno raiška yra pakankama.
Uždaviniai
1. Pritaikyti druskinį ir Qiagen metodus DNR ekstrahavimui iš plazmos bei serumo.
2. Sumodeliuoti pradmenis lizdinei PGR ir nustatyti jų tinkamumą, naudojant kraujo DNR ekstraktus.
3. Pritaikyti sąlygas bei patvirtinti lizdinę PGR darbui su plazmos bei serumo ekstraktais, lyginant gautas eksperimento metu sekas su patvirtintomis sekomis.
4. Palyginti druskinį ir Qiagen DNR ekstrahavimo metodus.
5. Sekvenuoti DNR, gautą iš mažo kiekio plazmos, ekstrahuotos Qiagen metodu ir rasti tyliąją mutaciją 7 egzone.
6. Ištirti ilgalaikio biologinės medžiagos užšaldymo efektą : sekvenuoti DNR iš serumo, laikyto metus esant –200C.
7. Surasti ląstelių tipą, kurių aromatazės geno raiška yra pakankama, kad galėtų būti naudojama kaip standartas tolimesniems tyrimams.
Darbo objektas
1. Kraujo, plazmos bei serumo DNR:
• tiopurin-S-metiltransferazės, metabolizuojančios tiopurino grupės vaistus, ir
• uridin-difosfat-gliukuronoziltransferazės, metabolizuojančios topo-1 inhibitorių grupės vaistus, genai.
2. MCF-7 ir Hela ląstelių RNR bei kDNR iš pirmos stadijos krūties naviko ląstelių:
LITERATŪROS APŽVALGA
A. Farmakogenetika
Kiekvieno vaisto sukeltas tiek farmakologinis (veiksmingumo), tiek toksikologinis poveikis kiekvienam pacientui yra skirtingas, todėl gana dažnai vaistų skyrimas ir vartojimas tampa labai komplikuotas. Prancūzijoje 3.2% hospitalizacijos atvejų yra sąlygoti vaistų. Tai sudaro 320 milijonų eurų sumą per metus. JAV 100000 mirčių per metus sąlygojamos gydytojo išrašytų vaistų toksinio poveikio. Genetiniai faktoriai, sąlygojantys vaistų farmakokinetiką ir farmakodinamiką, dalinai paaiškina skirtingą vaistų poveikį žmogui (Allorge D. ir kt., 2004).
Farmakogenetikos era prasidėjo 1950 metais, kai mokslininkai nustatė, kad pašalinis vaistų poveikis gali būti nulemtas individo genetiniame lygmenyje (Meyer A., 2000). Tačiau tuo metu buvo galima tik fenotipo raiškos analizė, paremta fermentų įvairovės nustatymu tarp individų grupių ir vaistų metabolitų tyrimu (Bouquier M., 2003).
Farmakogenetika nagrinėja genetinius veiksnius, kurie sąlygoja atsaką ir toleranciją į
pavartotą vaistą. Vaisto veiksmingumas ir toksiškumas yra šio mokslo prioritetai (Bouquier M., 2003; IPSEN, 2000).
Farmakogenomika tai mokslas, kuris tiria genetinius veiksnius, lemiančius
farmakologinį poveikį. Šio mokslo mąstelis – visas genomas. T.y. identifikuojamas visas genas tam tikros ligos atveju tam tikram vaistui (Bouquier M., 2003).
1. Vaistų metabolizmas ir transportas
Vaistai – tai svarbi cheminių, organizme nesintetinamų (ksenobiotinių) medžiagų grupė, su kuria žmogus susiduria kasmet vis dažniau. Vaistai dažniausiai yra hidrofobinės medžiagos. Organizme jos dažniausiai verčiamos hidrofilinėmis (metabolizuojamos) ir pašalinamos pagrinde su tulžimi ir šlapimu.
Pavartojus vaistų per os, vaistas turi praeiti tam tikrus barjerus (žarnyno sienelė, skrandis, burnos gleivinė), kad patektų į kraują. Gana dažnai vaistus per barjerą perneša specialūs nešikliai. Organizme metabolizmas pagrinde vyksta kepenyse. Fermentai, dalyvaujantys biotransformacijoje, skiriami į dvi grupes :
1. pirmos fazės fermentai. Tai fermentai, tokie kaip oksigenazės,
oksidoreduktazės, hidrolazės, kurių poveikyje molekulės tampa poliškesnės (hidroksilinimas, dealkilinimas). Dauguma pirmos fazės reakcijų
2. antros fazės fermentai. Tai transferazės, kurios katalizuoja konjugacijos reakcijas, padarydamos molekulę dar poliškesnę. Konjugacijos būdu prijungiamos karboksi, sulfo, gliukurono, gliutationo ir kt. grupės. 3. pagaliau, norint pašalinti iš lastelės metabolitus, pernašai per lastelės
membraną panaudojami trečios fazės fermentai : ABC baltymai (ATP binding cassette) (Allorge D. ir kt., 2004)
Metabolizmo ląstelėje pavyzdys Pav.1.
Fermentai ir pernašos baltymai turi keletą savybių :
Pav.1. Vaisto metabolizmas ir transportas lastelėje (Allorge D. ir kt., 2004)
¾ jie priklauso šeimoms (kaip cyp 450), turinčioms daug izoformų, kurios yra labai homologiškos amino rūgščių sekos atžvilgiu.
¾ Jie yra santykinai specifiški substratui
Jų ekspresija, palyginti su jų aktyvumu, kinta veikiant tam tikriems fiziologiniams, patologiniams, aplinkos ir genetiniams faktoriams (Allorge D. ir kt., 2004).
2. Genetiniai polimorfizmai
Genetinis polimorfizmas – tai buvimas tam tikroje genetinėje srityje mažiausiai 2 alelių populiacijos atžvilgiu (Kaplan J.C. ir kt., 1990). Genetiniu polimorfizmu vadinama, kai mutacija ar genetinė variacija pasireiškia dažniau kaip pas 1% visų populiacijos individų (Nebert D.W ir kt., 2001).
1. SNP – vienetinis nukleotidų polimorfizmas (liečia vieną mutaciją – punktuali mutacija)
2. bazių įterpimas ar delecija, kuri liečia vieną, keletą ar net tūkstančius nukleotidų
3. pasikartojančių DNR fragmentų įterpimas arba delecija (mikrosatelitai, AluI segmentai ir kt.) (Bouquier M., 2003).
Taigi, kaip ir visų organizmo baltymų, fermentų, dalyvaujančių biotransformacijoje, kokybė ir kiekis priklauso nuo juos koduojančio geno. Skirtingos to geno versijos išreiškiamos skirtingų alelių ir kiekvienas individas turi 2 to pačio geno alelių versijas (viena iš mamos, kita - iš tėvo), kurios ir apibrėžia genotipą.
Mutacijos, kurios yra genuose, koduojančiuose baltymus, gali sąlygoti ekspresijos įvairovę (pakeisdamos amino rūgštis baltymo sekoje), tuo pačiu gali sąlygoti baltymo funkcijų praradimą. Pvz., fermentų aktyvumas gali būti sumažėjęs, padidėjęs arba jo gali išvis nebūti (Allorge D. ir kt., 2004).
Priklausomai nuo metabolizmo greičio, populiacija skirstoma (pav.2): ¾ lėtai metabolizuojantys (pasireiškia toksiškumas)
¾ greitai metabolizuojantys (normalus metabolizmas)
¾ labai greitai metabolizuojantys (nepakankamas terapinis efektas)
Fermentų polimorfizmas svarbus, kai vaistas daugiau nei 50% metabolizuojamas vieno fermento, kai vaistas turi siaurą terapinį langą, ar kai vaisto aktyvumas
priklauso nuo polimorfinio fermento suformuoto metabolito (Samer C.F. ir kt., 2004).
3. Genotipo ir fenotipo nustatymo metodai
3.1. FenotipavimasFenotipavimo metodas paremtas tiesioginio fermento aktyvumo matavimu, arba, gana dažnai, naudojant substrat-testą (dažniausiai vaistinį preparatą) kai tiriamas likusio substrato ar suformuotų metabolitų kiekis, paveikus fermentu (Allorge D. ir kt., 2004).
3.2. Genotipavimas
Metodas paremtas tiesioginiu genetinių anomalijų nustatymu, kurios lemia fermentų ekspresijos ir jų aktyvumo įvairovę. Genotipavimo metodai sąlygoja tokių
molekulinės biologijos įrankių kaip polimerazės grandininė reakcija, panaudojimą (Allorge D. et al., 2004).
Genotipavimas netiesiogiai susietas su fenotipavimu, nes pvz. analizuojant 1-5000000 SNP, gaunama 1-5000 klaidingai teigiamų rezultatų (Wilkins M.R. ir kt., 2000). Taigi, fermento aktyvumas priklauso nuo jį koduojančio geno azotinių bazių sekoje esančių polimorfizmų (mutacijų). Mutacijos
gali būti (pav.3):
A. promotoriuje (UGT1A1, CYP19) B. introninėje dalyje (TPMT, CYP19) C. egzone – koduojančioje srityje
(TPMT, CYP19, CYP2D6). Pav.3. supaprastinta geno struktūra
Kadangi amino rūgštys baltymuose koduojamos nukleotidų tripletais, tai SNP, esantis koduojančioje srityje gali pakeisti amino rūgštį baltyme. Tai sąlygoja baltymo savybių pablogėjimą arba netgi išnykimą. Pavyzdžiui, ląstelių atsparumas oksaliplatinui buvo stebėtas pas žmones, kurie turi ERCC2 (kinta amino rūgštis 751 lys/gln pozicijoj) ir taip pat, GSTP1 (kinta amino rūgštis 105 ile/val) geno polimorfizmą (Chaisemartin L., 2005)
B. PRIEŠVĖŽINIŲ VAISTŲ FARMAKOGENETIKA
Vaistai, vartojami onkologijoje, dažniausiai turi siaurą terapinį indeksą, todėl jų pritaikymas pacientui, siekiant išvengti jų toksiškumo, išlaikant terapinį poveikį yra komplikuotas (Allorge D. ir kt., 2004).
1. Tiopurin-S-metil transferazė (TPMT)
TPMT – tai citozolinis antros fazės fermentas, kuris katalizuoja aromatinių ir heterociklinių sulfhidrilinių grupių S-metilinimą (tokių, kaip tiopurinai), suformuodamas neaktyvius metabolitus (Burnat P. ir kt., 2003). S-adenozil-metioninas yra šio fermento radikalų donoras.
Pav.4 tiopurinų metabolizmas
Tiopurinai kaip azatioprinas ir 6-merkaptopurinas yra provaistai. Fermentinių reakcijų pagalba, jie tampa aktyviomis formomis in vivo. Azatioprino metabolizmas pagrinde vyksta kepenyse.
6-tioguanino nukleotidai (6-TGN) atsakingi už imunosupresinį ir citotoksinį tiopurinų poveikį. Priešingai, metilinant per TPMT ar XO (ksantinoksidazę), tiopurinai
inaktyvuojami (pav.4).
1.1. Tiopurinai
6 – merkaptopurinas (6-MP) – naudojamas ūmios limfoblastinės vaikų leukemijos atveju.
Mercaptopurine (APRD01096)
Tioguaninas – ūmiai mieloidinei ir ūmiai limfoblastinei vaikų leukemijai.
Thioguanine (APRD00290)
Azatioprinas – naudojamas (IBD) uždegiminei žarnyno ligai, autoimuniniam hepatitui, sisteminiam lupus erytematosus (SLE), reumatoidiniam artritui, įvairioms odos būklėms ir organų transplantacijos metu.
Azathioprine (APRD00811)
1.2. Geno mutacijos
Gene TPMT buvo rastos 4 mutacijos, kurios atsakingos už fermentinio aktyvumo praradimą pas 80-95% kaukaziečių : tai aleliai TPMT*2, 3A, 3B ir 3C. Pacientai, turintys šiuos alelius, lėtai metabolizuoja tiopurinus, todėl jiems pasireiškia šių vaistų toksinis poveikis – mielosupresija. Tuo tarpu pacientai, kurių šio fermento aktyvumas padidėjęs, nepakankamai gerai išgydomi. Pacientai su vidutiniškai greitu tiopurinų metabolizmu yra heterozigotai mutavusiam aleliui, o pacientai su sumažėjusiu – homozigotai mutavusiam aleliui (Zhou S., 2006).
1.3. Mutacijos aleliuose
TPMT*2 : 238 G → C (EXON 5) TPMT*3A: 460 G → A (EXON 7) 719 A → G (EXON 10) TPMT*3B: 460 G → A (EXON 7) TPMT*3C: 719 A → G (EXON 10) (Zhou S., 2006).TPMT genas sudarytas iš 10 egzonų ir 9 intronų (chromosoma 6p22.3) TPMT geno aleliai (pav.5) (TAESPET, 2001):
DNR mutacijos keičia koduojamą amino rūgštį fermento sekoje, transliacijos momentu. TPMT fermento atveju aukščiau esančiame paveikslėlyje grafiškai pavaizduoti aleliai su juose esančiomis mutacijomis (pav.5). Tokie piešiniai palengvina darbą modeliuojant pradmenis.
1.4. Geno TPMT seka su mutacijomis
EXON 5
11221 taagtcagtt tttcagaatt tttataaggt ttgaaaataa tatagatctg ctttcctgca 11281 tgttctttga aaccctatga acctgaattc atataaattc ctctaaatta aagaaaatat 11341 atgcttactc taatataacc ctctatttag tcatttgaaa acataattta agtgtaaatg 11401 tatgatttta tgcaggtttg cagaccgggg acacagtgta gttggtgtgg aaatcagtga 11461 acttgggata caagaatttt ttacagagca gaatctttct tactcagaag aaccaatcac 11521 cgaaattcct ggaaccaaag tatttaaggt ttgttttgat ttgggtaaat aattgtatcc 11581 atatccccac aaaagttttt ctcagtgtga gtattatgag gataccattc atgtgtccga 11641 tggttcctat ttagcacgca gattcactgt agatactata tagtataaga agcaagggct 11701 taaaaatata ggtgatagct acctaaatag gtatagacat atgtatataa aagctgaggt
EXON 7
15901 aggctgctgc cacaggctcc taaaaccatg aggggatgga cagctctcca cacccaggtc 15961 cacacattcc tctaggagga aacgcagacg tgagatccta ataccttgac gattgttgaa 16021 gtaccagcat gcaccatggg ggacgctgct catcttctta aagatttgat ttttctccca 16081 taaaatgttt tttctctttc tggtaggacaaatattggca aatttgacat gatttgggat 16141 agaggagcat tagttgccat caatccaggt gatcgcaaatggtaagtaat ttttcttttt 16201 ttgtttagct gtcttaattt tttagtatac tatacttttt ctgggttcta gaaaatcagc 16261 ttagacttct atgagtttga aataggttat tatgtttgga atttataaaa acctaaatcc 16321 aatactagct ttgtctaaaa agtataggat ttgactacag agacctgggt gtaaggctat
EXON 10
24181 tttcaccatc ttggccaggc tggtcatgaa ctcctgacct caagtgatcc acctgcctcg 24241 gcctcccaaa gtgttgggat tacaggtgtg agccaccgca cccagccaat tttgagtatt 24301 tttaaaagaa tccctgatgt cattcttcat agtattttaa catgttactc tttcttgttt
24361 caggtaaaatatgcaatata cgttgtcttg agaaggttga tgcttttgaa gaacgacata 24421 aaagttgggg aattgactgt ctttttgaaa agttatatct acttacagaaaagtaaatga
238 G → C
460 G → A
719 A → G
24481 gacatagata aaataaaatc acactgacat gtttttgagg aattgaaaat tatgctaaag 24541 cctgaaaatg taatggatga atttttaaaa ttgtttataa atcatatgat agatctttac 24601 taaaaatggc tttttagtaa agccatttac tttttctaaa aaagttttag aagaaaaaga 24661 tgtaactaaa cttttaaagt agctcctttg gagaggagat tatgatgtga aagattatgc (PUBMED - NC_000006)
Žalios spalvos sekos dalis – egzonas ; bespalvė sekos dalis – intronas; mutacija pažymėta geltonai.
1.5. Nepageidaujamas tiopurinų poveikis
Pas pacientus, kurių TPMT aktyvumas sumažėjęs, 6-MP verčiamas į 6-TGN. Šie toksiški metabolitai kaupiasi ląstelėse ir lemia ryškų hematotoksiškumą :
leukoneutropeniją, trombopeniją, kaulų čiulpų aplaziją. (Welti M. ir kt., 2001).
2. Uridin-difosfat-gliukuronoziltransferazė (UGT1A1)
UGT1A1 – tai antros fazės fermentas. Jis metabolizuoja estrogenus, prijungdamas gliukurono rūgštį. Hormonas praranda sugebėjimą jungtis su savo receptoriumi (Duguay Y. ir kt., 2004). Jis taip pat atsakingas ir už bilirubino konjugaciją (Gilbert`o sindromas) (O'Dwyer ir kt., 2006). Taip pat už kai kurių vaistų metabolizmą, kaip irinotekanas.
2.1. Geno mutacijos
Buvo nustatyta, kad UGT fermento kiekis yra reguliuojamas transkripcijos reguliacijos metodu (promotoriumi) ir, kad tam tikrų grupių kiekis promotoriuje tiesiogiai veikia transkripciją. UGT atveju promotoriuje buvo rasta TA grupė, kuri įvairuoja nuo 5 iki 8 : kai TA yra mažiau, tai geno transkripcijos efektyvumas yra didesnis. Pvz. : Gilberto sindromas – žmogus heterozigotas TA7 (alelis –
UGT1A1*28) (Monaghan G. ir kt., 1996).
2.2. UGT1A1 TATA-BOX
Mutacijos detekcijos skirtumai genui UGT1A1
Gene UGT1A1 mutacija nustatoma “matuojant” promotoriaus DNR sekos ilgį, kuris priklauso nuo TA grupių promotoriuje : pvz TA6/TA7 (viena DNR grandinės dalis ilgesnė už kitą).
Principas : daroma polimerazės grandininė reakcija, naudojant pradmenis, žymėtus fluoroforais 5` pozicijoje. Padaroma daug promotoriaus srities, kurioje yra TA grupės
(lemiančios transkripciją) kopijų. Denatūruojama kaitinant ir staigiai šaldant. Denatūravimo metu perskiriama dvigrandė DNR. Pridedama specifinio masės
žymeklio (100-600 bazių porų mišinys). Denatūratas leidžiamas per chromatografines kolonėles. Matuojama fluorescencija. Sekvenavimo aparatas brėžia pikus,
priklausomai nuo to, kokio ilgio fragmentai pereina per kolonėlę : 1 pikas – homozigotas, 2 pikai – heterozigotas.
2.3. Topoizomerazės – 1 inhibitoriai
Natūralus CAMPTOTECINAS (campto)Tai medžio camptotheca acuminate derivatų mišinys. Jie turi topo-1 inhibitoriaus savybių. (topo-1 yra fermentas, kuris kontroliuoja ir modifikuoja DNR genetinės medžiagos replikacijos ir transliacijos metu). (CPA, 2006).
Topotekanas
Topotecan D.B. (APRD00687) Tai pusiausintetinis vaistas, campto analogas. Topotekanas
jungiasi prie TOPO1-DNR komplekso, stabdydamas DNR molekulės religaciją (DrugBank, APRD00687). Topotekanas, priklausomai nuo pH yra dvejose formose : laktono ir
karboksilato. Aktyvus yra laktonas. Topotekanas pašalinamas per kepenis ir inkstus (D.Armstrong ir kt., 1998). Vaistas naudojamas antrosios linijos kietųjų navikų terapijoje, pagrinde metastatinėms kiaušidžių karcinomoms, plaučių vėžiui, esant įvairioms kraujo vėžio formoms (D.Armstrong ir kt., 1998).
Irinotekanas (CPT-11)
Tai pusiausintetinis vaistas. Campto analogas. Tai provaistas. Topo-1 inhibitorius (SN-38 ir irinotekanas jungiasi prie topo-1-DNR komplekso ir stabdo grandinės religaciją) (CPA, 2006).
SN-38, priklausomai nuo pH yra 2 formų : laktono ir karboksilato.
Irinotecan D.B. (APRD00579) Tik laktonas aktyvus. Irinotekanas pagrinde pašalinamas per
Šis vaistas naudojamas kietųjų navikų, ypač kolorektalinio ir plaučių vėžio gydymui (D. Allorge ir kt., 2004), o taip pat įvairiems hematologiniams vėžiams (K.Seiter, 2005).
2.4. Metabolizmas
(pav.6)APC – AMINOPENTANO CARBOXY ACIDE NPC – 7-ETIL-10(4(1-PIPERIDINO)-1- AMINO)-CARBONYLOXYCAMPTOTECINE CPT-11 – IRINOTECAN SN-38 – 7-ETIL-10-HIDROCAMPTOTECINE SN-38-G - 7-ETIL-10-HIDROCAMPTOTECINE GLUCURONIDE UGT1A1 – UDP GLUCURONOSYLTRANSFERASE B-GLUC – BETA GLUCURONIDASE CYP3A4 – CYTOCHROME P-450 NF-KB – FACTEUR NUCLEAIR KAPPA CMOAT – FACTEUR CANNALICULIER DU TRANSFERT
Pav.6 irinotekano metabolizmas (Thorn C. F. ir kt., 2005).
2.5. Nepageidaujamas vaistų poveikis
Kamptotecinai sukelia mielosupresiją (anemija, neutropenija, trombocitopenija, leukopenija) (Armstrong D. et al., 1998). Topotekanas turi silpną ekstrameduliarinį toksinį poveikį pacientams su sumažėjusia inkstų filtracija (Seiter K., 2005).
Irinotekanas gali sukelti diarėją, mielosupresiją, žarnyno epitelio apoptozę (Yang X. ir kt., 2006).
Dėl irinotekano toksiškumo yra ginčijamasi. Yra dvi nuomonės :
1. Vieni kalba, kad UGT1A1 geno polimorfizmas yra atsakingas tik už hematotoksiškumą (leukopenija, neutropenija) : jie randa neutropeniją pas individus, homozigotus ar heterozigotus genui UGT1A1*28, bet neranda jokio sąryšio su diarėja (McLeod H.L., 2006).
2. Kiti pabrėžia, kad pastarojo geno mutacijos lemia ir diarėją : ūmi diarėja buvo stebėta pas pacientus, heterozigotus (4 laipsnio diarėja) ir
homozigotus (3 laipsnio diarėja/4 laipsnio neutropenija) (TA)7TAA sekai (Iyer L. ir kt., 2002).
UGT1A1 genotipavimas, prieš pradedant chemoterapiją, leidžia aptikti individus, turinčius polinkį į šio vaisto sukeltus ūmius toksinius efektus (Allorge D. ir kt., 2004).
3. Aromatazė
Aromatazė (citochromas P450) – tai fermentas, kuris katalizuoja C18 steroidų konvertavimą į estrogenus. Aromatazės raiška vyksta tam tikruose audiniuose kaip kiaušidės, placenta, sėklidės, smegenys, oda, o taip pat ir patologijos apimtuose audiniuose, kaip krūtys, vėžio apimtuose endometriumo audiniuose (Shozu M. ir kt., 1998).
Aromatazė koduojama vieno geno, kuris yra 15q21.2 ir kurio ilgis 123 kbp (tūkstančiai bazių porų). Genas sudarytas iš 9 (10) egzonų : 2-10. Egzonas 1 nekoduojantis (Haiman C.A. ir kt., 2003).
Aromatazė – tai sudėtinis fermentas. Aromatazės kompleksas sudarytas iš 2
polipeptidinių dalių : NADPH-citochromo P450 reduktazės ir ubikvitinflavoproteino. C18 Androgenų konversija į C19 estrogenus katalizuojama 3 hidroksilinimo reakcijom
Pav.7. Konversijos reakcija (Kao Y.C. ir kt., 2001)
3.1. Aromatizacijos reakcijos mechanizmas
Aromatazė – aktyvusis centras ir hemas
Pav.8. estrogenų sintezė. A- hidroksilinimas B- aromatizacija (Kao Y.C.ir kt., 2001)
3.2. Geno mutacijos
Padidinta fermento ekspresija buvo pastebėta vėžio apimtuose krūtų audiniuose. Buvo rastas I.4 promotoriaus (specifinis adipocitų, gliukokortikoidų stimuliuojamas)
pakeitimas proksimaliniu II promotoriumi, kuris kontroliuoja kiaušidžių aromatazės ekspresiją ir promotoriumi I.3.
Labiausiai žinomas polimorfizmas – (TTTA)N tetranukleotido pasikartojimas I.4 – ame. Šiuo metu žinoma, kad tetranukleotido pasikartojimas nėra dominantinis
faktorius daugumoje atvejų, kai padidėjęs aromatazės aktyvumas (Haiman C.A. ir kt., 2003). Variacija C790T (C826T) egzone 7 (8) keičia amino rūgštį Arg264Cys (Hirose K. ir kt., 2004). Variacija C602T egzone 5(6), koduojanti Thr201Met, yra labai svarbi kaukaziečių krūties vėžio atveju (0.05) (Ma C.X. ir kt., 2005).
Egzone 2 esanti variacija, koduojanti Trp39Arg yra susijusi tik su japonų ir havajiečių krūties vėžiu (Miyoshi Y. ir kt., 2000).
Polimorfizmų variacija (pav.9)
3.3. Vaistai
Yra 2 struktūriniai aromatazės inhibitorių tipai : steroidiniai, substrato tokio kaip 4-hiroksiandrostenedionas (formestanas) ir eksemestanas analogai (pirmas tipas) ir nesteroidiniai, kurie jungiasi su prostetine citochromo P450 hemo grupe (antras tipas). Azoto atomas antro tipo vaistų struktūroje leidžia jungtis su geležies atomu (Kao ir kt., 1996). Antro tipo inhibitoriai yra svarbesni nei pirmo, nes jie inaktyvuoja fermentus (Lonning P.E., 2000). Fermentas konvertuoja vaistą, vaistas negrįžtamai jungiasi prie fermento kovalentinėmis jungtimis (Dowsett M. ir kt., 1987).
Vaistai vartojami pagrinde krūties vėžiui gydyti.
Aminogliutetimidas – grįžtamas konkurencinio tipo pirmos kartos aromatazės inhibitorius. Nenaudojamas šiuo metu, nes sukelia daug šalutinių reakcijų. Jungiasi su fermentais ir slopina hidroksilinimo reakcijas (Patrick G.L., 2005).
Aminogluthetimide (Patrick G.L., 2005)
Formestanas (4-hidroksiandrostendionas) – antros kartos vaistas. Vartojamas tik intramuskuliariai, todėl nepopuliarus (Fentiman I.S., 2004).
Formestane (Patrick G.L., 2005)
Anastrozolis ir letrozolis – trečios kartos grįžtamo konkurencinio tipo inhibitoriai, labiau selektyvūs CYP 19 (Patrick G.L., 2005)
Anastrozole
D.B. (APRD00016) D.B.(APRD01066) Letrozole
Eksemestanas – trečios kartos grįžtamas konkurencinio tipo inhibitorius. Jis yra steroidinės struktūros. Jungiasi 2,6 karto stipriau nei natūralus substratas
androstendionas (Coombes R.C. ir kt., 1999).
Exemestane D.B.(APRD00144)
Trečios kartos vaistai yra peroraliniai, naudojami, kai navikas atsparus hormono-terapijai, postmenopauzinis, metastatinis (Hamilton A. ir kt.,1999).
3.4. Pašaliniai poveikiai
Endometriumo vėžys, kraujavimas iš makšties, tromboembolija, ūmi venų trombozė, širdies-kraujagyslių išemija, skeleto raumenų skausmas, kaulų lūžis, artritas, artralgija (Arora A. ir kt., 2004).
C. DARBO POLIMERAZĖS GRANDININĖS REAKCIJOS
METODU PRINCIPAS
DNR (DEZOKSIRIBONUKLEINO RŪGŠTIS)
DNR – tai daugumos gyvybinių formų genetinė informacija. Tai polimeras, sudarytas iš struktūrinių vienetų, vadinamų nukleotidais (mononukleotidais) (Huret J.L., 2006).
1. DNR ekstrahavimo principai
DNR ekstrahavimas iš biologinės medžiagos reikalauja ląstelės lizės, ląstelės
nukleazių inaktyvavimo ir DNR atskyrimo nuo liekanų. Ląstelių suardymo procedūra turi būti atitinkamai suderinta, kad tinkamai ir efektyviai suardyti ląstelę, bei
neprarasti DNR. Lizės procedūros:
¾ mechaninis suardymas (hipotoninė lizė)
¾ cheminis suardymas (lizė detergentais, chaotropiniais agentais, redukcija tioliais)
¾ suardymas fermentais (proteinazė)
Membranos suardymas ir nukleazių inhibavimas dažnai suderinami (Somma M. ir kt. 2004).
2. DNR ekstrahavimo metodai
Praktikoje DNR ekstrahavimas dažniausiai daromas iš žmogaus kraujo. Naudojama keletas ekstrahavimo technikų:
1. ekstrahavimas fenoliu-chloroformu 2. ekstrahavimas natrio chloridu arba acetatu 3. komercinių rinkinių, kaip Qiagen panaudojimas
Metodai pritaikomi prie kiekio, kokybės ir kitokių biologinio objekto faktorių (Francina A., 2003).
2.1. Ekstrahavimas natrio chloridu (druskinis metodas)
Raudonųjų kraujo kūnelių lizėŠi operacija atliekama, kad pašalinti hemoglobiną, kuris stabdo PGR. Lizė atliekama panaudojant specialų buferinį tirpalą, skirtą raudoniesiems kraujo kūneliams lizuoti
(0,155M NH4Cl, 0,01M KHCO3, 0,001M EDTA), kuris sudaro hipotoninę terpę (Bienvenu T. ir kt., 1999). EDTA jungiasi su Mg ir mažėja laisvo Mg kiekis, nes didelis Mg kiekis didina DNR praradimo nuostolius (Lahiri DK ir kt., 1993). Baltųjų kraujo kūnelių lizė
Pridedama buferinio tirpalo, skirto baltiesiems kraujo kūneliams lizuoti (0,4M NaCl, 0,01M trishidroksimetilaminometano, 0,002M EDTA). Baltieji kraujo kūneliai suyra. Branduolio DNR atpalaiduojama į terpę (Bienvenu T. ir kt., 1999).
Proteinų ardymas
Pridedama fermento proteinazės, kad lizuoti proteinus, kurie gali būti prisijungę prie DNR. Pridedama SDS 10% tirpalo (natrio duodecil sulfato), kad destabilizuoti lipido-proteinines membranas ir sensibilizuoti nelizuotas ląsteles lizuojantiems reagentams (Kang T.J ir kt., 2004).
Ląstelės liekanų atskyrimas
Pridedama NaCl, kad precipituoti liekanas, kurios praranda savybę tirpti vandenyje, prisotintame stipraus elektrolito.
DNR precipitavimas
Pridedama 2 tūriai 100% etanolio, laikyto esant -200C (Kang T.J ir kt., 2004). Precipitacija greitinama šaldant. Po to daromas DNR plovimas 70% etanoliu. Darant plovimą, prarandamas tam tikras kiekis DNR. (Kang T.J ir kt., 2004).
DNR tirpinama mažame buferinio tirpalo kiekyje (TRIS, EDTA – slopina DNR`azes, esančias tirpale).
2.2. Ekstrahavimas panaudojant DEAE polimerus
Metodas turi privalumų, nes galima pašalinti tokias atliekas kaip hemoglobiną, plazmos proteinus arba jonus (geležies, mangano ir kt.) (Bienvenu T. ir kt., 1999). Ląstelių lizė
Pirmiausiai kraujas maišomas su lizės buferiniu tirpalu (NaOH/SDS/guanidino tiocianatas). Guanidino tiocianatas – tai chaotropinis agentas, kuris lengvai tirpina proteinus (Vallejo L.F. ir kt., 2004). Pridedama proteinazės K, kuri yra pakankamai efektyvi, nes po lizės, kuri vykdoma esant 700C, dauguma proteinų lizuojami (Dahlgren L., 2005).
Po ląstelių lizės pridedama etanolio, kad precipituoti DNR ir pagerinti sąlygas DNR fiksacijai ant DEAE polimerų.
DNR fiksavimas ant DEAE polimerų
Centrifūguojamas mišinys. DNR fiksuojasi ant membranos, sudarytos iš specifinių polimerų (dietilaminoetanolio darinys). Polimerai turi 100µm dydžio daleles, dideles poras ir hidrofilinį paviršių. DNR fosfatai turi neigiamą krūvį, o polimerai – teigiamą (pav.10). Reikiamos molekulės fiksavimas ir eliuavimas priklauso nuo NaCl
moliaringumo ir buferinio tirpalo pH. Nešvarumai, tokie kaip proteinai, valomi panaudojant silpnas elektrolitų koncentracijas (pav.11).
Pav.11 eliuavimas skirtingom druskų koncentracijom
Pav.10. fiksavimo molekulinis mechanizmas
Plovimas
Vykdomas panaudojant buferinį tirpalą, kuriame NaCl koncentracija yra didelė 1,25M (papildomai yra (CH3COO)2KH, kuris neutralizuoja NaOH).
Po to druskos pašalinimas ir precipitacija vykdoma su izopropanoliu ir natrio azidu (0.25 V/V NaN3), kuris skirtas apsaugoti nuo DNR gedimo (Nicole T. Vu ir kt., 1999).
DNR išplovimas iš kolonėlės
Pagaliau DNR eliuojama panaudojant eliuavimo buferinį tirpalą (10mM TRIS-Cl, 0,5mM EDTA, pH 9). Ši technika leidžia išgauti 90-95% pradinės DNR kiekio ir pašalinti fragmentus, kurie mažesni nei 100 bazių porų (Cere N., 1998).
3. DNR kiekio nustatymas spektrofotometriškai
DNR, RNR, oligonukleotidų ir netgi mononukleotidų kiekis gali būti nustatytas vandeniniuose tirpaluose, matuojant tirpalo absorbciją (optinį tankį) ultravioletinių
bangų ilgyje. Pagrindinę funkciją atlieka purino bazės, kurios ir absorbuoja matavimams naudojamo bangos ilgio spindulius.
Kai pavyzdys neužterštas tokiomis medžiagomis kaip baltymai, fenolis, agarozė, optinio tankio (absorbcijos) matavimas yra labai paprasta ir tiksli operacija.
Vietoj gryno vandens dažnai naudojami buferiniai tirpalai (TBE). Nukleino rūgščių nustatymas vykdomas panaudojant pagrinde 260nm bangos ilgio spindulius.
Priemaišos nustatomos matuojant absorbciją tirpalo prie 260nm ir lyginant su absorbcija, matuojant kito bangos ilgio spinduliais, leidžiančiais išmatuoti aktualias priemaišas (pvz. baltymams tai 280nm). Imamas santykis A260/A280. Jei DNR gryna, tai santykis turi būti apie 1,8, o RNR apie 2,0. Matuojant absorbciją esant 230nm, nustatomas užteršimas tokiais teršalais kaip angliavandeniliai, fenoliai, peptidai, aromatiniai dariniai (Somma M., 2004).
4. DNR PLAZMOJE BEI SERUME
4.1. DNR nustatymas plazmoje
DNR plazmoje cirkuliuoja pas sveikus ir ligonius. Yra aprašyta keletas metodų, kai DNR ekstrahuojama iš 20-250µl plazmos. Rašoma, kad šios mikroekstrakcijos leidžia amplifikuoti fragmentus iki 3789 bazių porų, panaudojant PGR. Gauti produktai tokios pačios kokybės kaip ir gauti panaudojant ekstraktus, padarytus iš kraujo (Andolfato S. ir kt., 2003).
4.2. Padidintas plazmos DNR kiekis pas pacientus, sergančius
onkologinėmis ligomis
Onkologinėmis ligomis sergančių pacientų plazmoje ir serume dažnai aptinkama dvigrandės DNR fragmentų. Buvo nustatyta, kad pas sveikus individus serume yra 13ng/ml laisvos DNR, kai tuo tarpu, pas onkologinėmis ligomis sergančius pacientus aptinkama vidutiniškai 180ng/ml. Buvo padaryta išvada, kad šis genetinės medžiagos kiekis yra navikų kilmės (Jahr S. ir kt., 2001).
5. DNR izoliavimas ir konservavimas
DNR gali būti išskirta iš įvairių objektų:1. kraujo, kuriame yra antikoaguliantų 2. koaguliavusio kraujo
3. sušaldytų leukocitų 4. sušaldytų limfocitų
5. ląstelių limfoblastoidinių linijų 6. burnos epitelio ląstelių ir kt.
Pagrinde, esant pakankamai medžiagos, naudojamas kraujas su antikoaguliantu, nes patogiausia vykdyti ekstrahavimą. Patariama DNR išekstrahuoti 2 savaičių
laikotarpyje (Francina A., 2003).
6.
POLIMERAZĖS GRANDININĖ REAKCIJA (PGR)
PGR išrasta 1983 metais K. Mullis. Principas paremtas DNR polimerazės
panaudojimu, kai vykdoma replikacija in vitro tam tikro DNR sekos fragmento. Per kelias valandas galima sintezuoti 106 kopijų tam tikro matricos DNR fragmento. Vienintelė sąlyga yra ta, kad būtų sekos dalis, kurią norima replikuoti, matricinėje DNR. Teoriškai, matricinės DNR kiekis nėra limituojantis faktorius (Siatka Ch., 2006; Kubista M. ir kt., 2006).
6.1. Principas
Imama pora oligonukleotidinių pradmenų, kurie komplementarūs tiriamai DNR sekai, bet nekomplementarūs viens kitam (Mullis K. ir kt., 1986 ; Guatelli J.C. ir kt., 1989). Pradmenų ilgis 16-30 nukleotidų. Veikiant DNR polimerazei, kiekvienas pradmuo, kuris prisijungęs prie viengrandės DNR, ilgėja 3’-5’ kryptimi, komplementariai sekai. Kopijų kiekis didėja eksponentiškai (Wahbi K., 1996).
Vartojamas termostabilus fermentas, kuris tampa aktyviu tik po tam tikro sužadinimo padidinta temperatūra (Kubista M.ir kt., 2006). Fermentas yra aktyvus tam tikrą kiekį PGR ciklų (dažniausiai tai 35 ciklai) (Guatelli J.C. ir kt., 1989).
6.2. ETAPAI (pav.12) Pradinės sąlygos
Kambario temperatūroje dvigrandė DNR yra dvivijės struktūros. Pradinis denatūravimas
Pirmas reakcijos etapas – DNR denatūravimas, kaitinant (Guatelli J.C. ir kt., 1989). Šis etapas leidžia išvynioti dviviję DNR, išardyti antrines struktūras, homogenizuoti
reakcinį turinį, termiškai maišant, aktyvuoti “hot start’ polimerazes, denatūruoti kitus fermentus, kurie galėtų būti terpėje (atvirkštinė transkriptazė) (Wikipedia).
6.2.1. Denatūravimas
Pav.12. PGR. (Guatelli J.C. ir kt., 1989) Šis etapas leidžia galutinai suardyti DNR struktūrą,
“atplėšti” polimerazes, kurios buvo prisijungusios prie matricos ir homogenizuoti reakcijos terpę (Kubista M. ir kt., 2006).
6.2.2. Hibridizacijos fazė
Pradmenys šio etapo metu jungiasi su viengrande DNR matrica, kuri perskirta denatūravimo metu. Pradmenys jungiasi tik tuo atveju, jei temperatūra yra atitinkama:
¾ jei ji per žema, tai pradmuo gali jungtis nespecifiškai, gali būti “susirietęs” dėl galimo komplementarumo (A-T, G-C) tarp pradmens nukleotidų rinkinių ir kt.
¾ Jei per aukšta, tai pradmuo gali nesijungti su matrica dėl per silpnų jėgų.
Kuo didesnis kiekis G-C nukleotidų, tuo hibridizacijos temperatūra didesnė, kuo daugiau A-T, tuo temperatūra mažesnė. Dalis pradmenų gali susijungti vieni su kitais, bet ne su matrica, nes jų kiekis reakcijos terpėje ženkliai didesnis (Kubista M. ir kt., 2006; Mullis K. ir kt., 1986).
6.2.3. Elongacijos fazė
Šis etapas polimerazei leidžia sintetinti komplementarią matricinei DNR grandinę, esant optimaliai temperatūrai. Ši grandinė sintetinama iš mononukleotidų, kurie pridedami į terpę. Šio etapo trukmė priklauso nuo sintetinamo fragmento ilgio (Kubista M. ir kt., 2006).
6.3. DNR kiekio didėjimas
Kartojant denatūravimą, hibridizaciją ir elongaciją, DNR kiekis didėja eksponentiškai (Mullis K. ir kt., 1986).
6.4. Pradmenys polimerazės grandininei reakcijai
Kad empyriškai nustatyti pradmenų hibridizacjos temperatūrą, pasitelkiamos formulės:
1. Tm=4(G+C)+2(A+T)*0C
Ši formulė tinka tokiu atveju, jei tai taisyklingi dupleksai, sudaryti iš 11-20 bazių porų nukleotidų. Esant didesniam kiekiui nukleotidų duplekse, temperatūra mažėja apie 5-100C kas nukleotidas.
Praktikoje naudojama 2-50C aukštesnė temperatūra, nei apskaičiuota panaudojant formulę (Wahbi K., 1996).
2. Mc Conaughy formulė
Td=81,5-16,6(log(Na+))+0,41%(G-C)-(600/N)
Ši formulė naudojama, kai dupleksai didesni nei 20 bazių porų ir: ¾ G ir C nukleotidai
¾ N – bendras pradmens azotinių bazių skaičius (Wahbi K., 1996).
6.5. lizdinės PGR metodas
Fragmentas, gautas pirmos PGR metu (su vienais pradmenimis) yra gausinamas dar kartą su pradmenimis, kurie jungiasi fragmento vidinėje dalyje (pav.13). Išauga metodo jautrumas ir specifiškumas, nes įvykdomos dvi viena paskui kitą sekančios PGR. Sumažėja veiksnių, kurie inhibavo pirmąją PGR (Durand G. ir kt., 2006) (Mullis K. ir kt., 1986).
6.6. PGR produktų valymas
Atlikus PGR-ją, daromas PGR-jos produktų valymas, kadangi tirpale kartu su galutiniu produktu yra nesureagavusių reagentų bei šalutinių produktų (polimerazė, pradmenys, mažos molekulinės masės PGR šalutiniai produktai) (pav.14).
Valymas dažniausiai atliekamas panaudojant komercinius rinkinius. Valymo principas remiasi tuo, kad amplifikuota DNR molekulė yra santykinai didesnė už kitas mišinyje esančias molekules. Taigi, pridėjus papildomai vandens į mišinį, kad būtų galima geriau išplauti ir patirti mažesnius DNR nuostolius, tirpalas leidžiamas per membranas, kuriose yra tam tikro dydžio poros : santykinai mažesnės molekulės praeina pro šias poras, o tokios kaip 100bp DNR – pasilieka ant membranos (pav.15). DNR, esanti ant membranos yra tirpinama vandenyje ir gaunamas grynos DNR tirpalas (Millipore, 2007).
Pav.15 PGR produkto Pav. 14 PGR mišinys
6.7. Gel-elektrofarezė
Elektrofarezė – tai krūvį turinčių molekulių judėjimas elektriniame lauke. DNR ir RNR molekulė yra įkrauta teigiamai, todėl elektriniame lauke juda link neigiamo elektrodo.
Gel-elektrofarezė – DNR bei RNR migruoja tarp gelio porų. Molekulių migravimo greitis priklauso nuo molekulės dydžio ir gelio porų kiekio bei dydžio (Brown T.A., 2006). Metodas leidžia atskirti DNR ir RNR molekules priklausomai nuo jų dydžio (Sinniger S., 2001).
6.8. Nukleino rūgščių vizualizavimas
Atliekamas veikiant etidiumo bromidu, kuris dedamas į gelį. Etidiumo bromidas įsiterpia į nukleino rūgščių struktūrą ir, veikiant UV spinduliais (200-300nm), spindi oranžine spalva, tuo pačiu leisdamas vizualizuoti ir nukleino rūgštis.
Norint žinoti gauto produkto molekulės dydį, į gelį, šalia tiriamo produkto dedamas ir standartinis molekulinis markeris. Migruojama tam tikrą laiko tarpą. Ir pagal
molekulinio markerio fragmentų išsidėstymą gelyje nustatomas tiriamo produkto molekulės dydis. Gali būti nustatomas ir produkto kiekis, dedant atitinkamą kiekį molekulinio markerio ir tiriamo produkto. Pastaruoju atveju lyginamas
fluorescencijos intensyvumas (INRP, 2001).
6.9. Sekvenavimas
DNR sekvenavimas – tai nukleotidų grandinės nustatymas (Delarue M. ir kt., 2005). Principas
Sekvenavimui naudojami fermentai – DNR polimerazės. Reakcijos vykdomos esant panašios komponentinės sudėties reakcijos mišiniui kaip ir PGR, tačiau pridedama didezoksiribonukleotidų (ddNTP), kurie yra pažymėti fluoroforu. Jų dedamas labai nedidelis kiekis. Taigi, DNR polimerazė, kaip ir PGR reakcijos metu sintetina DNR grandinę, naudodama dNTP (nukleotidus), kol prie grandinės nepridedamas ddNTP. ddNTP sustabdo reakciją (pav.16). ddNTP, pakeisdamas dNTP, leidžia ‘perskaityti’ seką.
Reakcijos mišinyje yra 4 tipų ddNTP, kurių bazės : adeninas, citozinas, guaninas, timinas. Visi jie žymėti skirtingais fluoroforais ir, paveikus tam tikro bangos ilgio spinduliais, fluorescuoja skirtingo bangos ilgio spindulius (Delarue M. ir kt., 2005).
Pav.16. DNR sekvenavimas
Automatiniais sekvenatoriais “perskaitoma” seka. Gauti fragmentai išskirstomi pagal ilgį, panaudojant chromatografiją kolonėlėse. Sekvenatorius “perskaito” seką, tuo
pačiu nustatydamas ir fragmento ilgį. Rezultatas vaizduojamas kreivių pagalba (pav.17), lyginant fluorescencijos pobūdį ir intensyvumą (Delarue M. ir kt., 2005).
Pav.17 nuskaityta seka
D. RNR – ribonukleinė rūgštis
Pav.18. RNR vaidmuo baltymų sintezėje
1. RNR ekstrahavimo metodas
Etapai :1) Ląstelių lizė guanidino tiocianatu ir beta merkaptoetanoliu. Guanidino tiocianatas denatūruoja baltymus, padeda atskirti branduolyje esančias
nukleino rūgštis nuo proteinų. Beta merkaptoetanolis soliubilizuoja proteinus, perskirdamas inter ir intramolekulines S-S jungtis, kurios gali susidaryti po kontakto su deguonimi (Guillaume G. ir kt., 1978 ; Vallejo L.F. ir kt., 2004). 2) RNR precipituoja veikiant 70% etanoliu.
3) Vėl pridedama guanidino tiocianato, kad pašalinti nepašalintus baltymus. Pridedama DNR`azės, siekiant suskaidyti DNR (nes reikia gauti tik RNR). 4) Vykdomas eliuavimas, panaudojant RNR`se free vandenį (vanduo iš kurio
pašalinta RNR`azė, nes ji skaido RNR). Šiame vandenyje yra nedidelė koncentracija NaCl.
Visas vanduo, naudotinas darbui su RNR, turi 0,1% DEPC (dietilpirokarbonatas). DEPC inhibuoja RNR`azę ją denatūruodamas.
2. Atvirkštinės transkripcijos reakcija
Kad sintezuoti kDNR, naudojamas fermentas, rastas pas retrovirusus : atvirkštinė transkriptazė. Jis sintezuoja komplementarią RNR matricai viengrandę DNR (Lodish H. ir kt., 2004).
Mišinys, naudojamas atvirkštinės transkriptazės reakcijoje, turi turėti 2 pagrindinius elementus :
• Oligo(dT), kuris jungiasi su poly(A) RNR dalimi : 3` padėtyje yra 1-2 ne timinai. Šis oligonukleotidas duoda startą fermentui veikti.
• Pasirenkamieji pradmenys (6-9 bazių dariniai), kurie gali būti visokiausių galimų sekų variantas, besijungiantys įvairiose RNR sekos vietose. Šie pradmenys būtini, kad fermentas galėtų sintetinti ilgos grandinės fragmentus (Kubista M. ir kt., 2006).
Mišinyje naudojamas DTT (ditiotreitolis), kad pašalinti S-S jungtis ir inhibuoti RNR`azę (Carlsson J. ir kt., 1978).
Buferinis tirpalas, kad pritaikyti terpę
fermentui veikti (250 mM Tris-HCl, pH 8,3 ; 375mM KCl ; 15mM MgCl2).
Įvykdžius reakciją, iRNR yra išplaunama šarmu, kuris ją hidrolizuoja. Gautos viengrandės DNR molekulės konvertuojamos į dvigrandę DNR, vykdant elongaciją nuo 3` veikiant terminalinei transferazei (specifinė polimerazė), į reakcijos mišinį pridedama deoksinukleotidų. Sintetinis oligo dC jungiasi su 3`esančiu oligo dG. Oligo polimerazė sintetina kDNR. Pastaroji polimerazė dC naudoja kaip startą. Taigi,
kiekviena kDNR turi viename gale oligo dC – oligo dG sritį ir oligo dT – oligo dA sritį kitame (Lodish H. ir kt., 2004 ; Guatelli J.C. ir kt., 1989).
3. Geno ekspresijos matavimas
Metodas paremtas informacinės RNR ekspresijos matavimu (pav.19). Atvirkštinės transkripcijos būdu gaunamas kDNR kiekis atitinkantis iRNR kiekį (Kubista M. ir kt., 2006).
Pav.19 ekspresijos matavimas
3.1. Metodas
PGR reakcijos realiu laiku principas
• PGR reakcijos produktų eksponentinis didėjimas PGR produktų kiekis didėja pagal šią formulę :
N = N0*2n
N – reakcijos pabaigoje gautas molekulių kiekis N0 – Matricos kiekis reakcijos pradžioje
n – ciklų skaičius (Tse C. ir kt., 2003).
• Reakcijos naudingumas
Eksperimento metu gauto produkto kiekis priklauso nuo amplifikacijos naudingumo faktoriaus (E). Reakcijos metu gali būti : 0<E<1 (0 – nesintezuojama DNR ; 1-sintezuojamos 2 DNR po 1 ciklo) (Tse C. ir kt., 2003).
Reakcijos pabaigoje gaunama : N=N0(1+E)n
logaritminės formos : Log N = Log N0 + nLog (1 + E) (Kubista M. ir kt., 2006).
• PGR reakcijos “PLATO” fazė
PGR reakcijos produktų kiekio eksponentinis didėjimas yra matomas tik po 20-35 ciklų. Reakcijai artėjant link pabaigos, sulėtėja reakcija ir produktų akumuliacija,
kadangi pasiekiamas limitas. Tai “PLATO” efektas. Paskutiniųjų ciklų metu DNR polimerazė inaktyvuojama, mažėja dNTP ir pradmenų, todėl lieka tik reikalingi galutiniai produktai, (Tse C. ir kt., 2003).
Ciklas
PGR realiu laiku principas tas, kad reakcijos metu, ciklas po ciklo, matuojama fluorescencija. Fluorescencija (pav.20) kinta priklausomai nuo sintezuoto produkto kiekio, nuo panaudotų pradmenų, įsiterpiančių į DNR medžiagų (SYBRGREENTM) ir kt.
Taigi, lyginant fluorescenciją ciklas po ciklo, galima nustatyti gautų produktų kiekį. Fluorescencijos intensyvumas vaizduojamas kreivėje (Tse C. ir kt., 2003).
Pav. 20. 3 fazės :
iniciacijos, eksponentinė ir plato
3.2. Detekcijos “realiu laiku” sistemos
Medžiagos, įsiterpiančios į dvigrandę nukleotidų seką
Šios medžiagos įsiterpia į dvigubą nukleotidų grandinę ir fluorescuoja specifinio bangos ilgio spindulius. Tai pati paprasčiausia detekcijos “realiu laiku” sistema. Yra keletas komercinių produktų, kaip SYBRTM Green I ar BOXTOTM , kurie įsiterpia į dvigrandę DNR, tačiau gali įsiterpti į trumpus DNR fragmentus, į susijungusius pradmenis (pradmenų dimerus) ir skleisti parazitinę (klaidinančią) fluorescenciją. Todėl metodas nėra labai tikslus (Tse C. ir kt., 2003).
3.3. Strategijos
Nukleino rūgšties kiekis gali būti matuojamas absoliutiniu metodu, po etaloninės kreivės gavimo, panaudojant išorinį homologišką standartą arba reliatyviuoju metodu, lyginant su genu, kuris yra validuotas, bei lyginant su kalibruojančiuoju pavyzdžiu. Absoliutinis metodas simbolizuoja : kopijų kiekis/µL arba koncentracijos vienetai/µL Reliatyvusis : koncentracija tiriamojo/koncentracija validuoto (Tse C. ir kt., 2003).
II.
EKSPERIMENTINĖ DALIS
A. KRAUJO, PLAZMOS BEI SERUMO GENOTIPAVIMAS
1. Medžiagos ir instrumentai
1) DNR :
a. DNR iš 2 pacientų plazmos ir kraujo. DNR iš kraujo ekstrahuota normaliomis sąlygomis ; DNR iš plazmos ekstrahuota modifikavus operacijas ir sąlygas.
b. DNR iš serumo. Serumas laikytas metus, esant –20 C. ekstrahavimo procedūros modifikuotos.
0
2) Ekstrakcija
a. QIAGEN rinkinys (QIAGEN, France). Rinkinys, DNR ekstrakcijoms b. Centrifūgos : Jouan Cr412, Jouan Mr1812 (Saint-Herblain, France),
DNA 110 Speedvac (Savant, Waltham, MA, USA).
c. Spektrofotometras BIO RAD SMART SPEC 3000. Skirtas DNR koncentracijai matuoti
3) PGR reakcija :
a. Pradmenys (Eurogentec S.A, Seraing, Belgium), (MWG-Biotech AG, Martinsried, Germany).
b. Fermentas Taq polimerazė (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
c. Buferinis tirpalas 10x (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). d. MgCl2 - (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
e. Mišinys dNTP`s - (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). f. Išgrynintas vanduo – Baxter (Baxter, Deerfield, IL, USA) ir aqua
B.Braun (B.Braun Melsungen AG, Deutscland).
g. Reakcijos buvo atliekamos THERMOCYCLERS`iuose (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
4) PGR produkto gryninimas
a. MILLIPORE MultiScreen® PCRµ96 (Millipore, Billerica, MA, USA). 5) Gel agarozė:
a. EUROBIO AGAROSE STANDARD (Laboratoires Eurobio, Courtaboeuf, France).
c. Molekulinis markeris (AB Fermentas, Vilnius, Lietuva). d. MP4+ INSTANT CAMERA – (Polaroid, S.A. Montigny le
Bretonneux, France) – kamera daryti gelio nuotraukas. 6) Sekvenavimo reakcija
a. Sephadextm g50 superfine (Ge Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suede). Polimerai sekoms valyti.
b. KIT BIG DYE TERMINATOR V 1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekų reakcijos mišinys.
c. pradmenys M13 (forward).
d. Buferinis tirpalas 5x (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). e. Išgrynintas vanduo – Baxter (Baxter, Deerfield, IL, USA) ir aqua
B.Braun (B.Braun Melsungen AG, Deutscland).
f. Sekų reakcijos vykdomos aparatu 3130 XL Genetic Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
7) Programos sekoms vizualizuoti :
a. AB sequencing analysis (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). b. AB genemapper (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
2. Sąlygos
PGR – tai labai jautrus užteršimui metodas. Tam, kad reakcijos pavyktų, mes dirbome visiškoje švaroje : stalai valomi NaOCl tirpalu, visuomet dėvimos pirštinės, specialūs drabužiai “PGR mišinio” patalpoje. Patalpos, kuriose atliekamos skirtingos reakcijos, yra atskirtos viena nuo kitos. Siekiant išvengti medžiagos praradimo, mes naudojome pipečių antgalius ir mini mėgintuvėlius iš polipropileno, nes polipropilenas mažiau adsorbuoja reagentus.
3. Gauti pavyzdžiai
Gavom 3 pacientų pavyzdžius : paciento 42, paciento 44 ir pacento 0007
Tai plazma paciento 42 ir paciento 44 bei serumas paciento 0007. Pastarojo paciento serumas leido ištirti ilgalaikio užšaldymo efektą biologiniame pavyzdyje ir ištirti DNR.
4. DNR ekstrahavimas
Mes atlikom 2 DNR ekstrahavimo metodus. Tai metodai, naudojami laboratorijoje, todėl yra tam tinkamos sąlygos, bei medžiagos.
Metodai :
• ekstrakcija, panaudojant NaCl (druskinis metodas) • ekstrakcija, panaudojant QIAGEN rinkinį
4.1. Ekstrahavimo procedūros tobulinimas serumui ir plazmai,
ekstrahuojant natrio chloridu (druskiniu metodu)
Mes dirbome su tokiais mažais medžiagos kiekiais kaip 250µL plazmos ar serumo, kadangi buvo naudojami serotekuose saugomi pavyzdžiai.
Eliuento tūrį, kuris panaudojamas eliuoti DNR, sumažinome iki 100µL, kadangi DNR kiekis, gautas iš šaltinio, kurio kiekis sumažintas ir jame yra mažiau DNR (plazma, serumas turi mažiau DNR, nei jos galima išgauti iš kraujo). Tačiau, eliuento tūris pakankamai didelis, kad galima būtų gerai ištirpinti DNR, siekiant išvengti didelių nuostolių, o taip pat, kad galima būtų įvykdyti atitinkamą kiekį reakcijų.
4.1.1. Ekstrahavimo protokolas
1. baltųjų kraujo kūnelių lizėMes įdėjome 750µL buferinio tirpalo WLB 1X (NaCl 0,4M; trishidroksimetilaminometano 0,01M ; EDTA 0,002).
2. baltymų suskaidymas
Įdėjom 100µL proteinazės K (20mg/ml), 50µL SDS 10% (natrio duodecilsulfatas). Maišėme lėtais judesiais, sukdami. Laikėme 370C temperatūroje visą naktį.
3. ląstelių liekanų atskyrimas
Įdėjome 300µL 6M NaCl tirpalo ir maišėme energingai 15s, kol susidarė baltos putos. Centrifūgavome 15min, esant 4700aps/min. Ant dugno susidarė nuosėdos iš baltymų ir druskų.
Perkėlėme tirpalą į kitą mėgintuvėlį ir į jį įpylėme 3 tūrius 100% etanolio, kuris atšaldytas iki -200C.
Lėtai maišėme ir visą tūrį perkėlėme į 3 eppendorf`us po 1500µL. Centrifūgavom 30min, esant 16000aps/min, bei esant +50C temperatūrai. Išėmėme visą tirpalą ir DNR, susidariusią ant mėgintuvėlio dugno, perplovėme 70% etanoliu : į kiekvieną
eppendorf`ą įdėjome po 500µL 70% etanolio ir centrifūgavome 30min, esant 16000aps/min ir +50C.
Džiovinimą atlikome SPEED VAC centrifūgomis, esant kambario temperatūrai, 10 min. DNR eliuavome 100-u mikrolitrų vandens.
4.2. Ekstrahavimo procedūros, ekstrahuojant iš plazmos ir
serumo, panaudojant QIAGEN (QIAAMP DNA BLOOD
MIDI KIT) rinkinį, tobulinimas
Plazmos kiekį, naudotą ekstrakcijai, sumažinome iki 1000µL, o serumo – iki 370µL (vietoj 2000µL kraujo, kurie naudojami standartinės ekstrakcijos iš kraujo, metu). Eliuento tūrį sumažinome iki 100µL, kad gerai išeliuoti DNR iš QIAGEN kolonos ir, kad gauto eliuato užtektų tam tikram reakcijų kiekiui.
4.2.1. Ekstrahavimo protokolas
Įdėjome 100µL proteazės K (QIAGEN), 1,7mL buferinio tirpalo AL (NaOH/SDS/guanidin tiocianatas). Gerai išmaišėme (2min minimum). 15 min patalpinom į vonelę, esant 700C.
Po to įdėjome 1mL 100% etanolio ir išmaišėme. 1,65 mL šio mišinio įleidome į koloną ir centrifūgavome 3min esant 3000aps/min. Pakartojome operaciją su likusiu kiekiu tirpalo.
Atlikome kolonos plovimą 1mL buferinio tirpalo AW1 (NaCl 1,25M) ir centrifūgavom 1 min, esant 5000aps/min (operacija kartojama 2 kartus). Atlikome kolonos plovimą 2mL buferinio tirpalo AW2 (izopropanolis ir natrio azidas). Centrifūgavom 15 min, esant 5000aps/min (operacija kartojama 2 kartus). Atlikom DNR eliuavimą 100µL buferinio tirpalo AE (10mM Tris-Cl ; 0,5Mm EDTA ; pH 9). Užpylus AE buferiniu tirpalu, laikėm 5min ir po to 5 min
centrifūgavom 5min, esant 5000aps/min. (operacija kartojama 2 kartus, panaudojant pirmą eliuatą).
5. Optinės skvarbos matavimas
Siekiant išmatuoti optinę skvarbą, naudojamas 1/50 DNR tirpalas (tam, kad kuo mažiau prarasti medžiagos). Buvo gauti rezultatai :
Pacientas 44 ekstraktas KIT Qiagen (1ml plazma) c→0 Pacientas 0007 ekstraktas KIT Qiagen (1ml serumas) c→0 Pacientas 0007 ekstraktas NaCl (250 µl serumas) c→0 Pacientas 44 ekstraktas KIT Qiagen (370 µl plazma) c→0 Pacientas 44 ekstraktas NaCl (250 µl plazma) c→0
Iš gautų rezultatų padarėme išvadą, kad jei ir yra DNR mūsų ekstraktuose, tai jos yra toks nežymus kiekis, kad, atskiedus 50 kartų, naudotas spektrofotometras negali jos aptikti.
6. Genas TPMT
6.1. “Ilgųjų” pradmenų patvirtinimo procedūra, panaudojant
DNR, ekstrahuotą iš kraujo
Kadangi mes planavome dirbti su mažais kiekiais DNR, ekstrahuotos iš plazmos ir serumo, reikėjo rasti metodą kaip sustiprinti signalą. Mes pasirinkom lizdinės PGR metodą. Mes sumodeliavome 2 pradmenų poras : viena pora – “ilgieji”, kita pora – “trumpieji”. Kad sumodeliuoti šiuos pradmenis, mes susiradome geno TPMT sekas interneto tinklapyje “PUBMED”.
“Ilgieji” pradmenys
5F2 - 5`-CAT-TCC-AAC-TGT-TTC-ATA-C-3` 693 Bp 5R2 - 5`-GTC-TGG-CAC-TGA-TGG-GTT-C-3` 542 Bp 7F2 - 5`-TTG-CAC-ACT-GTC-CTT-TGT-TC-3` 7R2 - 5`-CAA-GCC-TTA-TAG-CCT-TAC-AC-3` 10F2 - 5`-TCC-CAA-GTA-GCT-GGG-ATT-AC-3` 631 Bp 10R2 - 5`-GCA-ATC-TGC-AAG-ACA-CAT-AG-3`“Trumpieji” pradmenys
”Trumpieji” pradmenys jau naudojami laboratorijoje, DNR ekstrahuotai iš kraujo. 507 Bp 5F1 - 5`-CCT-GCA-TGT-TCT-TTG-AAA-CCC-TAT-GAA-3` 5R1 - 5`-GCT-TGA-GTA-CAG-AGA-GGC-TTT-GAC-CTC-3` 7F1 - 5`-CTC-CAC-ACC-CAG-GTC-CAC-ACA-TT-3` 280 Bp 7R1 - 5`-GTA-TAG-TAT-ACT-AAA-AAA-TTA-AGA-CAG-CTA-AAC-3` 401 Bp 10F1 - 5`-AAT-CCC-TGA-TGT-CAT-TCT-TCA-TAG-TAT-TT-3` 10R1 - 5`-CAC-ATC-ATA-ATC-TCC-TCT-CC-3`
Pradmenų paruošimas darbui
Pradmenys gauti liofilizuotos formos. Mes paruošėme 3 eiles skiedimų : 500µM, 100µM ir 10µM.
Pradmenų patvirtinimas
Mes atlikome naujų pradmenų patvirtinimą, panaudodami pacientų 41 ir 42 kraujo DNR ekstraktus.
PGR reakcija. Mišinio sudėtis:
P. 41 P. 42 vanduo 38,75µl vanduo 38,25µl Buferis 10X 5µl Buferis 10X 5µl MgCl2 3µl MgCl2 3µl dNTP 0.5µl dNTP 0.5µl Pradmuo F2 1µl Pradmuo F2 1µl Pradmuo R2 1µl Pradmuo R2 1µl Taq polymerazė 0,25µl Taq polymerazė 0,25µl DNR(200ng/µl) 0,5µl DNR(100ng/µl) 1 µl
DNR buvo gausinta, panaudojant programą TPMT BIS 620C : Denatūravimas 950C – 5 min Denatūravimas - 950C – 1 min 35 ciklai Hibridizacija - 620C – 1 min Elongacija - 720C – 2 min Elongacija - 720C – 7 min
Po reakcijos gauti produktai buvo valomi plokštelėmis PCRµ96.
Buvo atlikta gel-elektrofarezė 2% agarozės gelyje. Elektrofarezė buvo atliekama naudojant 1X TBE buferinį tirpalą, esant 21W galiai (200v/100mA).
Kad galima būtų vizualizuoti DNR, buvo naudojamas etidiumo bromidas. DNR panirimas į šulinėlius gelyje buvo pagerintas panaudojant orange G.
Nufotografavus, matomi 3 ilgių fragmentai (pav.21) : egzonas 5 - 693Bp, – egzonas 10 – 631Bp ir egzonas 7 – 542Bp.
Pav.21. fragmentų išsidėstymas gelyje 542 Bp 693 Bp 631 Bp Sekvenavimas
Atlikome sekvenavimą, kad išsiaiskintume ar gauname laukiamą geno seką. Sekvenavimo reakcijos mišinys:
vanduo – 3,5µl
buferinis tirpalas 5X - 2µl pradmuo – 2µl
Big dye polimerazė – 1 µl DNR – 1,5µl Programa: Denatūravimas 960C – 2 min Denatūravimas - 960C – 30 min 25 ciklai Hybridizacija - 500C – 15 sec Elongacija - 600C – 4 min
Po to reakcijos mišinį išgryninome SEPHADEX`u (jo sudėtyje yra polimerų, kurie adsorbuoja mažas molekules).
Iliustruoti rezultatui pasirinkome 10-ojo egzono pradžią (pav.22) ir pabaigą (pav.23):
Seka, kurios laukiama: AGGCATGTGCCACCATACCCAGCTCATTTTGTATTTTTAAGTTTCACCATCTTGGC Pav.22
Seka kurios laukiama:GATTATGATGTGAAAGATTATGCCTATGTGTCTTGCAGATTGC Pav.23
Gelio nuotraukoje matome 7 ir 10 egzonų fragmentus, kurie išsidėsto atitinkamai pagal savo ilgį. Jie yra reikiamo ilgio. 5-ojo egzono fragmento sintezės sąlygas reikia modifikuoti, nes jis nuotraukoje nėra tokio ryškumo kaip egz. 7 ir 10.
Analizuojant sekas, iliustravome naudodami 10-ojo egzono seką. Seka atitinka laukiamą nukleotidų seką. Sekos pradžia ir pabaiga nėra gerai “nuskaitoma”, kadangi sekvenavimo aparatas nevisada “nuskaito” sekos pradžią ir pabaigą, kurioje yra pradmenų prisijungimo vieta.
6.2. PGR reakcijos optimizavimas egzonui 5
Modifikavome hibridizacijos temperatūrą egzonui 5, norėdami gauti ryškesnį jo vaizdą gelyje, o tuo pačiu ir daugiau produkto sekvenavimui.Vietoj 620C
hibridizacijos temperatūros, atlikome reakciją, esant 600C. Naudojome paciento 42 kraujo DNR ekstraktą. Gelyje gavom tokį rezultatą (pav.24).
Sumažinus hibridizacijos temperatūrą, gavome ryškų egzoną 5, mažiau ryškų egzoną 7, o egzono 10 pradmenys degradavę – tai nustatėme atlikdami keletą reakcijų paeiliui ir panaudodami skirtingas pradmenų hibridizacijos temperatūras.
Pav.24 fragmentų išsidėstymas gelyje
693 Bp
7. Lizdinės PGR strategija : DNR, ekstrahuotos iš plazmos ir
serumo, genotipavimas
7.1. Plazma paciento 42
Naudojome DNR, ekstrahuotą iš paciento 42 plazmos, pasitelkiant QIAGEN rinkinį. Kad turėtume pakankamai matricos sekvenavimui, naudojome 2 poras pradmenų : “ilguosius” ir “trumpuosius”. Darėme 2 PGR: iš pradžių su “ilgaisiais” pradmenimis F2,R2, o po to – su “trumpaisiais” F1,R1.
Pakeitėm DNR ekstrakto kiekį, kuris dedamas į PGR mišinį. Dirbom su ekstraktais, kuriuose yra labai maži DNR kiekiai, todėl į pirmos PGR reakcinį mišinį dėjom 10µL ekstrakto, o į antros PGR reakcinį mišinį - 5µL pirmos PGR tirpalo. Nedarėm pirmo PGR produkto valymo ant plokščių PCRµ96. Darėm valymą po antros PGR.
Naudojom 620C hibridizacijos temperatūrą.. Reakcijos mišinys: P. 42 1-a PGR 2-a PGR vanduo 29,25µl vanduo 33,25µl buferis 10X 5µl buferis 10X 5µl MgCl2 3µl MgCl2 3µl dNTP 0.5µl dNTP 0.5µl pradmuo F2 1µl pradmuo F1 1µl pradmuo R2 1µl pradmuo R1 1µl Taq polimerazė 0,25µl Taq polimerazė 0,25µl DNR (plazmos
ekstraktas)
10 µl DNR (1-oji PGR) 5 µl
Gel-elektrofarezė (pav.25)
280 Bp
Pav.25 fragmentų išsidėstymas gelyje
Sekvenavom 10 egzoną
Panaudojom “trumpuosius” pradmenis. Iliustravom seką, imdami jos pradžią (pav.26) ir pabaigą (pav.27).
Laukiama seka: TCATAGTATTTTAACATGTTACTCTTTCTTGTTTCAGGTAAAATATGCAATATACGTTGTCTTGAG Pav.26
Laukiama seka: TAGAAGAAAAAGATGTAACTAAACTTTTAAAGTAGCTCCTTTGGAGAGGAGATTATGATGTG Pav.27
Sekvenavom 5 egzoną
Abiejų PGR hibridizacijos temperatūrą pasirinkom 600C, kadangi prieš tai buvo gauti geresni rezultatai esant 600C. Visos kitos sąlygos – kaip ir egz.10, bet į sekvenavimo mišinį dėjom ne 1,5, bet 2,5µL antros PGR, tam, kad turėti daugiau matricos.
Iliustravimui pasirinkom egzono 5 pradžią (pav.28) ir pabaigą (pav.29)
Laukiama seka:
CCTGCATGTTCTTTGAAACCCTATGAACCTGAATTCATATAAATTCCTCTAAATTAAAGAAAATATATGCTTACTCTAATAT Pav.28
Laukiama seka:
GGGCTTAAAAATATAGGTGATAGCTACCTAAATAGGTATAGACATATGTATATAAAAGCTGAGGTCAAAGCCTCTCTGTA CTCAAGC
Pav.29
Gelyje gavom egzono 7 ir 10 laukiamo ilgio fragmentus. Egzono 10 sekos mums rodo, kad yra fono triukšmas, lyginant su sekomis, darytomis panaudojant kraujo ekstraktą, nes ekstraktai gauti iš plazmos, o ne iš kraujo ir darytos 2 PGR reakcijos. O tai sąlygoja fono triukšmo atsiradimą.
Egzono 5 sekoje fono triukšmo daugiau nei egzono 10. Egzono 5 sekos pabaiga prasčiau “nuskaitoma”.
7.2. Paciento 44 plazmos ekstraktas
PGR mišiniui mes naudojome DNR ekstrahuotą iš paciento 44 plazmos, pasitelkiant ekstrahavimą natrio chloridu (druskinis metodas).
Hibridizacijos temperatūrą pasirinkome 600C. DNR ekstrakto kiekį 1-ąjai PGR - 10µL, o PGR produkto kiekį 2-ąjai PGR - 5µL.
Mes sekvenavome 10 egzoną
Sekvenavimo reakcijos mišiniui naudojome 2,5µL 2-osios PGR (kad turėtume daugiau matricos).
Rezultatas: sekos pradžia (pav.30) ir pabaiga (pav.31)
Laukiama seka:
TCATAGTATTTTAACATGTTACTCTTTCTTGTTTCAGGTAAAATATGCAATATACGTTGTCTTGAGAAGGT Pav.30
Laukiama seka: GAAAAAGATGTAACTAAACTTTTAAAGTAGCTCCTTTGGAGAGGAGATTATGATGTG Pav.31
10 egzono sekos “perskaitomos”. Laukiama seka atitinka gautą eksperimento metu. Yra daugiau fono triukšmo, lyginant su sekomis iš kraujo.
7.3. Sekvenavimas PGR produkto, gauto panaudojant DNR
ekstraktą iš 370µL p.44 plazmos
Panaudodami QIAGEN rinkinį, ekstrahavom paciento 44 plazmos DNR. Panaudojome 370µL plazmos, nes daugiau jos neturėjome.
PGR ir sekvenavimo sąlygos tokios pačios kaip ir prieš tai esančiame skirsnyje. Vizualizuodami sekas, mes paaukštinome pikus, pasinaudodami programos
galimybėmis. Mes radom mutaciją, kuri buvo rasta pas šį pacientą, genotipuojant jo kraujo DNR ekstraktą.
Palyginom savo gautą rezultatą (pav.32), su gautuoju panaudojant kraują (pav33):
Seka, gauta panaudojant 370µL plazmos (tai apie 6 kartus mažesnis tūris, nei kraujo, kuris naudojamas rutininės operacijos metu), panaudojus 2 poras pradmenų, leidžia mums nustatyti tyliąją mutaciją gene. Gautas pikas yra mažesnio aukščio nei kraujui.
7.4. Ilgalaikio užšaldymo įtaka : DNR buvo ekstrahuota iš serumo,
kuris buvo užšaldytas metus –20
0C temperatūroje
Mes ekstrahavom paciento 0007 serumo DNR, panaudodami ekstrahavimą natrio chloridu.
Naudojom lizdinę PGR. Hibridizacijos temperatūrą pasirinkom 600C. DNR ekstrakto kiekis 1-ąjai PGR - 10µL, 2-ąjai - 20µL pirmosios PGR.
Į sekvenavimo mišinį dėjom 2,5µL antrosios PGR, kad turėtume kuo daugiau matricos. Gavom tokias sekas 10 egzonui : pradžia (pav.34) ir pabaiga (pav.35)
Laukiama seka: TCATAGTATTTTAACATGTTACTCTTTCTTGTTTCAGGTAAAATATGCAATATACGTTGTCTTGAGAAGGT Pav.34 Laukiama seka: TAGAAGAAAAAGATGTAACTAAACTTTTAAAGTAGCTCCTTTGGAGAGGAGATTATGATGTGGGTCATA G Pav.35
Sekos mums leidžia spręsti, kad galima daryti genotipavimą net iš serumo, kuris buvo laikomas užšaldytas –200C temperatūroje metus. Sekos yra “nuskaitomos”, nes galima “perskaityti” tam tikras sekos dalis.
8. UGT1A1 genas
Mes pasirinkom 2 poras pradmenų kaip ir genui TPMT, nes taip pat naudojom lizdinės PGR metodą. Atlikom tas pačias procedūras kaip ir TPMT genui.
8.1. Pradmenys UGT1A1 genui
A. pradmenys, kai fragmentas gaunamas 253-255bp SENS2 - 5`-M-AAG-TGA-ACT-CCC-TGC-TAC-CTT-3` ANTISENS2 - 5`-CCA-CTG-GGA-TCA-ACA-GTA-TCT-3`
B. pradmenys, kai fragmentas gaunamas 98-100bp SENS1 - 5`- M-GTC-ACG-TGA-CAC-AGT-CAA-AC-3` ANTISENS1 - 5`-TTT-GCT-CCT-GCC-AGA-GGT-T-3`
8.2. Naujųjų pradmenų patvirtinimas, panaudojant kraujo DNR
ekstraktą
Mes naudojome paciento 42 ir paciento 44 kraujo DNR ekstraktą. PGR mišinys : P. 42 Vanduo 11,9µl buferis 10X 2µl MgCl2 4µl dNTP 0.5µl pradmuo sens bis 0,2µl
pradmuo antisens 2 0,2µl
Taq polimerazė 0,25µl DNR (100ng/µl) 1µl
