KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra
Inga Banionytė
PROPOLIO ETANOLINIŲ EKSTRAKTŲ CHEMINĖS SUDĖTIES TYRIMAS IR
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO VERTINIMAS
Magistro diplominis darbas
Darbo vadovai:
prof. V. Briedis
doc. K. Ramanauskienė
TURINYS
SUTRUMPINIMAI ... 3
ĮVADAS ... 4
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 6
1.1. Propolio cheminė sudėtis ... 6
1.2. Antioksidacinis aktyvumas ... 7
1.3. Farmakologinis poveikis ... 9
1.4. Propolio panaudojimas ... 11
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 14
2.1. Tyrimo medţiaga ir metodai ... 14
2.1.1. Ţaliava ... 14
2.1.2. Medţiagos ... 14
2.1.3. Aparatūra ... 14
2.1.4. Propolio etanolinių ekstraktų gamyba maceracijos metodu ... 15
2.1.5. Sauso likučio nustatymas ... 15
2.1.6. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 15
2.1.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 16
2.1.8. Propolio ekstraktų cheminės sudėties nustatymas ESCh-DAD-MS metodu (tyrimas atliktas KTU Maisto produktų technologijos katedroje) ... 17
2.1.9. Parametrų apskaičiavimas ir statistinis duomenų apdorojimas ... 17
2.2. Tyrimo rezultatai ir jų aptarimas... 18
2.2.1. Ekstrahento koncentracijos įtaka propolio skystų ekstraktų kokybei... 18
2.2.2. Propolio etanolinių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 21
2.2.3. Propolio ekstraktų cheminės sudėties nustatymas ESCh–DAD-MS metodu... 22
2.2.4. Rinkoje esančių propolio preparatų kokybės analizė bei antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 24
IŠVADOS ... 29
LITERATŪRA ... 30
SUTRUMPINIMAI
DPPH• - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas
ESCh-DAD-MS – efektyvioji skysčių chromatografija ir masių spektrometrija DNR - deoksiribonukleorūgštis
GRE – galo rūgšties ekvivalentai FRE – ferulo rūgšties ekvivalentai
PGE – pinocembrino ir galangino ekvivalentai RNR - ribonukleino rūgštis
ĮVADAS
Propolis (bičių pikis, bičių klijai) yra sakinga medţiaga, kurią bitės darbininkės surenka nuo tuopų, berţų, liepų ar kitų augalų (priklausomai nuo tos geografinės zonos augmenijos). Surenkamos aktyviai augalų išskiriamos medţiagos bei augalų ţaizdų eksudatai. Tai sumaišoma su vašku, o gautas produktas naudojamas koriams sutvirtinti, plyšiams uţtaisyti, nuţudytiems įsibrovėliams, kurių bitės negali išnešti iš avilio, balzamuoti bei aseptinėms sąlygoms avilyje išlaikyti [1, 2].
Propolio spalva gali būti kreminė, geltona, ţalia, raudona, šviesiai ar tamsiai ruda. Kai kurie pavyzdţiai gali būti kieti, trapūs, o kiti - lankstūs, tąsūs [1]. Propolio cheminė sudėtis yra labai sudėtinga ir nepastovi. Daţnai randamos šios cheminių junginių grupės: fenoliniai junginiai (flavonoidai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai); alifatinės, aromatinės rūgštys ir jų esteriai; terpenoidai [3]. Manoma, jog pagrindiniai biologiškai aktyvūs junginiai yra flavonoidai [4].
Terminas „propolis― atsirado dar senovės Graikijoje: pro (pradţioje, priekyje, esantis gynyboje) ir polis (miestas ar bendruomenė); medţiaga, skirta miesto ar avilio gynybai [1, 2]. Liaudies medicinoje propolis vartojamas jau nuo 300 metų prieš Kristų [5, 6]. Yra atlikta nemaţa tyrimų, įrodančių jo farmakologinį aktyvumą. Propolis pasiţymi antibakteriniu, antigrybeliniu, antivirusiniu poveikiu. Be to, jis turi antioksidacinių, priešuţdegiminių, priešvėţinių, antihepatotoksinių, imunomoduliuojančių savybių [2, 4, 7, 6].
Temos aktualumas ir naujumas.
Kadangi propolio farmakologinis poveikis labai įvairus, jį galima pritaikyti gydant įvairias ligas bei jų profilaktikai. Kad vartojimas būtų racionalus, yra svarbu ištirti jo cheminę sudėtį.
Propolio cheminė sudėtis pavyzdţiuose iš skirtingų pasaulio vietų yra skirtinga bei kintanti, todėl svarbu nustatyti, kokie yra pagrindiniai junginiai lietuviškame propolyje.
Propolis – natūralus antioksidantas, o tai aktualu šiuolaikiniam ţmogui, kurio organizmą daţnai veikia kenksmingos sąlygos (stresas, nepilnavertė mityba, cigarečių dūmai, radiacija ir kt.), inicijuojančios laisvųjų radikalų susidarymą.
Tyrimo problema: propolio, surinkto skirtinguose geografiniuose regionuose, etanolinių
ištraukų cheminės sudėties kintamumas.
Tyrimo objektas: 30% propolio ištraukos, kai ekstrahentu naudojamas etanolis (50%, 60%,
Tyrimo tikslas: nustatyti bei palyginti pagrindinių veikliųjų medţiagų kiekius propolio
etanoliniuose ekstraktuose, įvertinti jų antioksidacinį aktyvumą.
Tyrimo uţdaviniai:
1. Pagaminti skystuosius etanolinius propolio ekstraktus, pritaikant maceracijos metodą. 2. Įvertinti etanolinių propolio ekstraktų kokybę, nustatant:
a) sauso likučio kiekį gravimetriniu metodu;
b) fenolinių junginių kiekį spektrofotometriniu metodu;
3. Atlikti propolio ekstraktų cheminės sudėties tyrimus efektyviosios skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos (ESCh–DAD–MS) metodu.
4. Ištirti propolio ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, pritaikant 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH•) radikalo sujungimo metodą.
5. Įvertinti ekstrahento įtaką veikliųjų medţiagų išsiskyrimui ir antioksidaciniam aktyvumui.
6. Ištirti rinkoje esančių propolio ekstraktų kokybę ir antioksidacinį aktyvumą.
Tyrimo metodai:
1. Literatūros apţvalga 2. Laboratoriniai tyrimai
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Propolio cheminė sudėtis
Jau nuo senovės ţmonės ţinojo, kad propolis yra svarbiausias bičių „cheminis ginklas― prieš patogeninius mikroorganizmus, ir jį naudojo kaip vaistą [8]. Dėl tokio populiarumo liaudies medicinoje, propolis traukia mokslininkų dėmesį (ypač nuo XX a. 7 dešimtmečio) [2]. Pasaulyje per paskutinius 50 metų yra atlikta daug propolio cheminės sudėties tyrimų. Iš viso, tiriant propolį, rasta daugiau nei 300 cheminių junginių [1], iš kurių daugiau nei 80 - 100 gali būti kiekviename pavyzdyje [9, 10]. Propolio ţaliavą sudaro apie 50% dervų (fenoliniai junginiai: flavonoidai, fenolinės rūgštys ir kt.), 30% vaško, 10% eterinių aliejų, 5% ţiedadulkių ir 5% įvairių organinių junginių ir mineralų (Ca, Mg, Fe, Zn ir kt.) [2, 4, 9, 11]. Neapdorota propolio ţaliava negali būti naudojama, ji turi būti išvalyta naudojant tirpiklį, kuris išekstrahuoja pagrindines sudėtines medţiagas (daţniausiai naudojamas etanolis, bet gali būti naudojamas ir vanduo bei kiti tirpikliai) [11].
Propolio cheminė sudėtis yra labai nepastovi. Ji nepriklauso nuo bičių rūšies (bitės nekeičia iš augalų surinkto produkto cheminės sudėties [8], tik vaškas yra sekretuojamas bičių, o ne surenkamas iš augalų [2]), bet priklauso nuo augalų, augančių apie 500 m. atstumu nuo bičių buvimo vietos, nuo klimato bei geografinių vietovės ypatybių [9, 12]. Skirtinga cheminė sudėtis sudaro sunkumų lyginant propolio pavyzdţius iš skirtingų pasaulio vietų, apsunkina propolio standartizavimą. Norint ţengti į priekį standartizuojant propolį, būtina išskirti propolio rūšis, kurioms būdingos panašios cheminės bei biologinės savybės. Tai ir siekiama atlikti, atsiţvelgiant į tai, kokiose vietovėse, nuo kokių augalų bitės surenka propolį (1 lentelė).
1 lentelė. Propolio rūšys ir cheminė sudėtis (2, 8, 12).
Propolio rūšis Geografinė kilmė Pagrindiniai augalai, nuo kurių surenkamas
Pagrindinės biologiškai aktyvios
medţiagos
Europos („tuopų―) tipo propolis.
Europa, Šiaurės Amerika, kai kurie Azijos regionai (vidutinės klimato juostos), Naujoji tuopos (Populus spp., daţniausiai P. Nigra L.) flavonai, flavanonai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai
Zelandija Rusijos („berţų―) tipo
propolis. Rusija
berţai (daţniausiai
Betula verrucosa)
flavonai, flavonoliai (kiti nei „tuopų― tipo propolyje)
Ţaliasis propolis. Brazilija
varva (Baccharis spp., daţniausiai B. dracunculifolia) preniluotos p-kumaro rūgštys, diterpeninės rūgštys Raudonasis („kluzijos―
tipo) propolis. Kuba, Venesuela
kluzija (Clusia spp., Kuboje daţniausiai C. Rosea, Venesueloje – C. Major ir C. minor) polipreniluoti benzofenonai „Ramiojo vandenyno― tipo propolis. Ramiojo vandenyno regionas (Okinava, Taivanas)
neţinomi preniluoti flavanonai
„Kanarų― tipo
propolis. Kanarų salos neţinomi furofuranolignanai
Šioje klasifikacijoje paminėtos labiausiai ištirtos propolio rūšys. Ţinoma, yra daug daugiau augalų, nuo kurių surenkamas propolis, todėl būtų galima išskirti dar daugiau propolio tipų [12].
Lietuviškas propolis priskiriamas Europos („tuopų―) tipui. Tai reiškia, jog bitės propolį daugiausiai renka nuo tuopų, o jame vyrauja fenoliniai junginiai: flavonoidai (chrizinas, galanginas, kempferolis, kvercetinas, ramnetinas, pinocembrinas, pinobanksinas, pinostrobinas ir kt.), fenolinės rūgštys (kumaro rūgštis, ferulo rūgštis, kavos rūgštis, galo rūgštis ir kt.), jų esteriai (fenetilkofeatas, benzilkofeatas, dimetilalilkofeatas ir kt.). Pagal Lietuvos farmakopėjinį straipsnį FS 285 (2003 metai) fenolinių junginių kiekis propolio etanoliniame ekstrakte (1:10) turi būti ne maţesnis nei 2% [10]. Nustatyta, kad mūsų šalyje surinktame propolyje fenolinių junginių kiekis yra apie 22-32% [9]. Tačiau FS naudojama analizės metodika, nustatant fenolinius junginius, nėra informatyvi. Tai skatina naujų analizės metodų paieškas ir pritaikymą Lietuvoje.
1.2. Antioksidacinis aktyvumas
Nors propolio cheminė sudėtis pavyzdţiuose iš skirtingų pasaulio vietų labai skiriasi, dauguma jo farmakologinių savybių yra priskiriama fenoliniams junginiams, flavonoidams [5, 13,
14, 15]. Platus fenolinių junginių poveikio spektras yra bent iš dalies aiškinamas jų gebėjimu apsaugoti nuo kenksmingo laisvųjų radikalų poveikio (stipriu antioksidaciniu aktyvumu).
Laisvieji radikalai susidaro organizme kaip šalutiniai produktai, vykstant metabolizmui, veikiant aplinkos faktoriams. Šiuolaikinio ţmogaus organizmą daţnai veikia kenksmingos sąlygos (stresas, nepilnavertė mityba, infekcijos, cigarečių dūmai, oro tarša, radiacija ir kt.), todėl gali susidaryti didelis laisvųjų radikalų kiekis. Laisvieji radikalai – tai daţniausiai aktyviosios deguonies formos, sutrumpintai ROS (angl. k.- reactive oxygen species): •O2, •OH, NO•, NO2•. ROS gali būti
ir ne radikalų formos, pvz. H2O2, O3, ¹O2, HOCl, tačiau dėl didelio reaktyvumo šie junginiai gali
būti ne maţiau ţalingi ląstelėms. Ypač aktyvus yra •OH radikalas – jis paţeidţia artimiausius baltymus, DNR, lipidus. Kiti ROS gali būti naudingi fiziologiniams ląstelės procesams (svarbūs ląstelės dauginimuisi, dalyvauja signalų perdavime, yra kaip ląstelės „antiseptinis ginklas―, įeina į programuotos ląstelės mirties mechanizmą), tačiau •OH yra tik ţalingas [16, 17]. Sutrikus balansui tarp ROS ir antioksidantų, per dideli ROS kiekiai gali paţeisti ląsteles, sukeldami membranų lipidų peroksidaciją, fermentų sulfhidrilinių grupių inaktyvaciją, baltymų bei DNR (deoksiribonukleorūgšties) suardymą [13, 15, 18].
Organizmo antioksidacinė apsaugos sistema gali būti skirstoma į fermentinę (superoksido dismutazė, katalazė, glutationo peroksidazė) ir nefermentinę. Pastarajai priklauso maţos molekulinės masės medţiagos: vitaminai C, E, uratai, retinolio (vitamino A) esteriai, β-karotinas, glutationas ir kiti. Propolio antioksidacinis aktyvumas pasireiškia, sujungiant laisvuosius radikalus bei sąveikaujant su fermentais. Yra nustatyta, kad propolis ir jo fenoliniai junginiai stiprina superoksido dismutazės, katalazės, glutationo peroksidazės, glutationo reduktazės ir glutationo veikimą [17]. Taip pat propolis slopina ROS susidarymą, juos inaktyvuoja bei pašalina [13, 18].
Propolyje esantys fenoliniai junginiai pasiţymi nevienodu antioksidaciniu aktyvumu. Antioksidaciniam aktyvumui svarbus yra o-hidroksi fenolinis (pirokatecholio) ţiedas. Tokią struktūrą turi kavos rūgštis, kvercetinas, fenetilkofeatas (angl. Caffeic Acid Phenethyl Ester – CAPE). Taip pat antioksidaciniam aktyvumui svarbi yra flavonolinė struktūra bei laisva hidroksi grupė C-4' padėtyje. Tokia struktūra būdinga kempferoliui. Todėl kavos rūgštis, kvercetinas, feniletilkofeatas, kempferolis pasiţymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu. Stipriais antioksidantais dar laikomi ferulo rūgšties dariniai, Braziliškame propolyje sutinkamas artepilinas C [11, 14]. Šių junginių struktūra pavaizduota 1 pav.
Pirokatecholis Kavos rūgštis Kvercetinas
Fenetilkofeatas Kempferolis
Ferulo rūgštis
1 pav. Fenolinių junginių, pasiţyminčių stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, cheminė
struktūra.
1.3. Farmakologinis poveikis
Skirtinga propolio, surinkto skirtingose vietovėse, sudėtis, turėtų lemti skirtingas jo biologines savybes. Tačiau daugeliu atveju tai netiesa. Iš tikrųjų propolis yra bičių apsauga nuo infekcijų, todėl kiekvienas propolio pavyzdys pasiţymi antibakteriniu, antigrybeliniu aktyvumu. Kitos farmakologinės savybės yra taip pat panašios, nors tai maţiau akivaizdu [12].
Pagrindinis propolio panaudojimo gydymui aspektas - antibakterinis, antivirusinis, antigrybelinis jo veikimas. Propolio antibakterinis aktyvumas stipriau pasireiškia prieš Gram-teigiamas bakterijas (Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Streptococcus sobrinus,
Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus) . Gram-teigiamos
bakterijos jautrios net maţoms propolio koncentracijoms, o Gram-neigiamų bakterijų (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Enterobacter aerogenes) augimas sustabdomas tik didesnėmis propolio koncentracijomis. Taip pat gana stiprus yra
antigrybelinis poveikis prieš Candida albicans. Tarp labiausiai baktericidiškų junginių propolio ekstraktuose yra flavononas pinocembrinas, flavonolis galanginas, taip pat kavos rūgštis ir jos esteriai, ferulo rūgštis ir jos esteriai, chrizinas [4, 9, 19, 20]. Paţymėtinas ir priešvirusinis poveikis: chrizinas, kempferolis labai gerai inhibuoja A ir B tipo gripo, herpes, rotavirusus [9]. Manoma, kad antibakterinio veikimo mechanizmas gali būti pagrįstas bakterijų RNR-polimerazės inhibavimu [4]. Be tiesioginio poveikio mikroorganizmams, pasireiškia ir netiesioginis – imuninės sistemos stimuliacija, sinergistinis poveikis su antibiotikais (dėl to stiprėja ir pailgėja antibiotikų veikimas) [6, 9]. Propolio antimikrobinis poveikis yra kompleksinis ir gali būti priskiriamas sinergistiniam flavonoidų ir kitų junginių veikimui [4, 19]. Taigi propolis yra vienas stipriausių natūralių antibiotikų, turintis platų veikimo spektrą, o gydant juo, neišsivysto mikroorganizmų rezistentiškumas [9].
Propolis pasiţymi hepatoprotekcinėmis (kepenis saugančiomis) savybėmis. Pirmą kartą šios savybės buvo tirtos 1994 metais, kai pelėms paracetamoliu buvo paţeistos kepenys. Raudonasis propolis iš Kubos sumaţino kepenų fermentų kiekį kraujyje, pagerino kepenų funkciją. Vėliau atlikti tyrimai patvirtino, kad propolis turi hepatoprotekcinių savybių ir prieš cheminėmis medţiagomis, ir prieš imuninės sistemos sukeltą kepenų paţeidimą. Hepatoprotekcinio poveikio mechanizmai kol kas nėra visiškai aiškūs, tačiau ţinoma, jog vienas svarbiausių kepenų ląstelių apsaugos mechanizmų yra propolio gebėjimas sujungti ROS [5].
Dar viena naudinga propolio farmakologinė savybė yra priešuţdegiminis poveikis. Nustatyta, kad etanolinis propolio ekstraktas maţina prostaglandinų ir leukotrienų (svarbių uţdegimo mediatorių) susidarymą. Be to, propolis slopina arachidono rūgšties metabolizmą lipoksigenazės keliu [5].
Propolis pasiţymi stipriu imunomoduliaciniu poveikiu. Tyrimai in vitro ir in vivo parodė, jog propolis aktyvina makrofagus, padidindamas jų mikrobicidiškumą. Taip pat stimuliuoja antikūnų gamybą, todėl jį galima naudoti vakcinų gamyboje kaip adjutantą. Viena iš svarbių propolio sudėtinių dalių - fenetilkofeatas - dalyvauja antikūnų produkcijos reguliavime, T limfocitų, citokinų ir periferinio kraujo leukocitų bei kituose kraujodaros procesuose [5].
Pastaruoju metu literatūroje vis daţniau randama duomenų, kad propolis stabdo vėţinių ląstelių vystymąsi. Įrodyta, kad jis efektyvus vartojant kartu su kitais cheminiais vaistais. Kartu jis sumaţina nepageidaujamą jų poveikį, stabdo metastazes, pasiţymi radioprotekcinėmis savybėmis. Šiomis savybėmis ypač pasiţymi fenetilkofeatas [5, 6, 12].
Propoliui būdingas ir lygiuosius raumenis atpalaiduojantis poveikis. Pagrindinės medţiagos, propoliui suteikiančios šias savybes, yra kvercetinas ir apigeninas [9, 19].
nustatyta, kad slibinas turi anabolinį ir nėštumą slopinantį poveikį [9].
Propolis pasiţymi anestezuojančiu poveikiu, kurį jam suteikia eteriniai aliejai. Propolio nuskausminamasis efektas 3,5 karto viršija kokaino ir 5,2 kartus novokaino poveikį. Kuo stipriau kvepia propolis, tuo didesnis eterinių aliejų kiekis jame, todėl ir stipresnis anestezuojamasis poveikis [9].
Literatūroje minimas propolio poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Propolis pasiţymi vazodiliataciniu (kraujagysles atpalaiduojančiu) poveikiu, maţina trombocitų agregaciją. Propolis didina didelio tankio lipoproteinų kiekį kraujyje ir maţina maţo tankio lipoproteinų, taip maţina aterosklerozės, širdies ir kraujagyslių ligų riziką [21].
Nepaisant visų naudingų propolio savybių, reikia ţinoti, kad propolis, nors ir retai, gali sukelti alergines reakcijas. Tai labiausiai būdinga Europietiškam propoliui, o kaip daţniausiai sukeliantis alergines reakcijas komponentas - 1,1-dimetilalil kavos rūgštis [5, 9, 12]. Be to, bitės į propolį gali pririnkti pavojingų medţiagų, pvz. asfalto vietovėse, kur vyksta kelių rekonstrukcija. Taip pat propolyje gali atsirasti ir sunkiųjų metalų (pvz. švino). Kenksmingų medţiagų atsiradimui propolyje įtakos turi bites supanti aplinka [5].
1.4. Propolio panaudojimas
Pačios bitės propolį pritaiko labai įvairiai:
propolis apsaugo bičių šeimą nuo virusų, bakterijų, infekcijų;
propoliu uţklijuojami avilio plyšiai;
propoliu ištepamos avilio sienelės ir sutvirtinami koriai;
propoliu padengiamos korio akutės;
propolis neleidţia dygti į avilį suneštoms ţiedadulkėms;
propolis neleidţia gesti bičių produktams, pvz., bičių pieneliui;
propoliu balzamuojami į avilį patekę svetimkūniai, įsibrovėliai.
Ţmonės propolio gydančias savybes pastebėjo jau seniai ir vartoja kaip vaistą daugiau kaip 2000 metų. Egiptiečiai puikiai ţinojo, kad propolis stabdo puvimo procesus, todėl jį naudojo kaip vieną iš medţiagų mirusiųjų kūnams balzamuoti. Be to, šis bičių produktas senovėje buvo pripaţįstamas garsių graikų bei romėnų gydytojų (Aristotelio, Dioskoridţio, Plini ir Galeno). Net senoji Inkų civilizacija naudojo bičių pikį kaip priešuţdegiminę medţiagą. XVII-XX amţiuje bičių pikis dėl savo gydomųjų savybių Europoje tapo itin populiarus. Liaudies medicinoje buvo
vartojamas šalinti blogą kvapą, maţinti ar visai nuslopinti skausmą ir tinimą, padėti ţaizdoms, nudegimams, karpoms, nuospaudoms gyti [9, 20, 22].
Šiais laikais propolio preparatus rekomenduojama vartoti esant kvėpavimo takų ligoms gydyti. Slogai ir faringitui rydyti geriausiai tinka aliejinis propolio tirpalas, o laringitą ir tracheitą galima gydyti propolio inhaliacijomis su medaus tirpalu. Propolio preparatus yra rekomenduojama vartoti peršalimo ligų, gripo profilaktikai, nes jis pasiţymi imunitetą stimuliuojančiu, priešuţdegiminiu veikimu, veikia prieš virusus, bakterijas [9].
20-30% propolio etanolinis tirpalas yra efektyvus skrandţio ir dvylikapirštės ţarnos opaligei gydyti. Propolis opą padengia apsaugine plėvele, apsaugo nuo uţdegimo, sumaţina padidėjusį skrandţio sulčių rūgštingumą ir spazmus. Be to, viena iš opos atsiradimo prieţasčių gali būti
Helicobacter pylori. Todėl gydant opas propoliu, svarbus yra ir jo antibakteriniu poveikis. Vartojant
propolio preparatus, nesukeliama disbakteriozė, o tai yra labai svarbu gydant skrandţio - ţarnyno ligas [9, 12, 18].
Propolis gali būti naudojamas ir stomatologinių ligų profilaktikai bei gydymui. Yra nustatyta, jog propolis pasiţymi stipriu antimikrobiniu aktyvumu prieš Streptococcus mutans, Streptococcus
sobrinus, Streptococcus sanguinis, Candida albicans, kurie yra svarbūs burnos ertmės ligų
sukėlėjai. Streptococcus mutans bakterijų produkuojamas fermentas glikoziltransferazė yra patogenas, dėl kurio gali išsivystyti kariesas. Streptococcus sanguinis taip pat produkuoja fermentą glikoziltransferazę. Šios bakterijos suformuoja biofilmus dantų paviršiuje, taip kolonizuodamos jį, o dėl išskiriamo fermento glikoziltransferazės, gali pradėti kauptis dantų akmenys [4, 23].
Propolis gali būti naudojamas, gydant tuberkuliozę. Esant šiai indikacijai, skiriamas propolio vanduo, aliejus, tinktūros ir ekstraktai. Rekomenduojama propolio preparatus derinti su kitais tuberkuliozei gydyti skirtais preparatais [5, 9].
Propolis ir jo preparatai yra efektyvūs, sergant odos ligomis, tokiomis kaip egzema, neurodermitas, psoriazė, slenkant plaukams, esant furunkulams, herpetiniams odos ir lūpų bėrimams. Taip pat propolio tepalu ar aliejiniu tirpalu galima gydyti nudegimus, nušalimus, sunkiai gyjančias ţaizdas, opas. 10–15% propolio tepalas efektyvus gydant krūties spenelių įtrūkimus, taip pat suskilus kojoms ar rankoms. Propolis ne tik nuskausmina, pagerina kraujotaką bei limfos nutekėjimą, stimuliuoja audinių regeneraciją, veikia kaip antimikrobinis preparatas, bet pasiţymi ir dezodoruojančiu veikimu [9].
Propolio ţvakutės ir tepalai efektyvūs gydant hemorojų ir tiesiosios ţarnos įtrūkimus. Jau po 2-3 dienų maţiau pasireiškia skausmas, o po 2-3 savaičių stebimas ir visiškas įtrūkimų uţgijimas [9].
Propolio tepalas ir ţvakutės yra efektyvūs preparatai ginekologinių ligų – gimdos kaklelio erozijų, trichomoninių, grybelinės ar bakterinės kilmės vaginitų, kolpitų gydymui [9, 19].
Propolio preparatai vartojami hipertenzijai, kojų venų trombozėms, aterosklerozei gydyti, nes maţina kraujo spaudimą, lipidų peroksidaciją, kraujo krešėjimą, stiprina kapiliarus [7, 9, 21].
Pastaruoju metu mokslininkus labai domina propolio potencialas vėţinių ligų gydymui. Literatūros duomenys rodo, jog keletas propolio komponentų stimuliuoja vėţinių ląstelių apoptozę (programuotą ląstelių mirtį) bei skatina šių ląstelįų pašalinimą iš organizmo. Propolio preparatai gali padėti slopinti vėţinio proceso vystymąsi, taip pagerindami išgyvenamumą [5, 6, 9, 12].
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS
2.1. Tyrimo medţiaga ir metodai
2.1.1. Ţaliava
Propolis, surinktas įvairiuose Lietuvos regionuose, kur vyrauja tuopos ir spygliuočiai medţiai.
2.1.2. Medţiagos
Acto rūgštis (Merck, Vokietija)
Chrizinas (ChromaDex, JAV)
2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalas, chromatografinio grynumo > 99% (Sigma-Aldrich, Vokietija)
Etanolis 96% (UAB „Stumbras― Lietuva)
Ferulo rūgštis (ChromaDex, JAV)
Folin-Ciocalteau fenolinis reagentas (Sigma, Šveicarija)
Galanginas (ChromaDex, JAV)
Galo rūgštis, 98% (Sigma, Šveicarija)
Išgrynintas vanduo (KTU laboratorija)
Kavos rūgštis, chromatografinio grynumo >98% (Sigma, Šveicarija)
Metanolis, grynas analizei (Barta a Cihlar, Čekija)
Natrio karbonatas, grynas analizei > 99,5% (Merck, Vokietija)
Pinocembrinas (ChromaDex, JAV)
Pinostrobinas (ChromaDex, JAV)
2.1.3. Aparatūra
Spektrofotometrinių matavimų aparatūra:
UV spektrofotometras UNICAM Helios α (Unicam, Cambridge, UK).
Efektyviosios skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos (ESCh-DAD-MS) aparatūra:
MA) su rankiniu Rheodyne 7725i bandinio įleidimo įrenginiu (Rheodyne, Rohnert Park, CA) bei diodų matricos detektorių Waters 996 (Waters, Milford, MA). Junginiai buvo skirstomi naudojant Synergy MAX-RP, 2504,6 kolonėlę (Phenomenex, Torrance, CA). Iš kolonos išeinančių junginių masių spektrai buvo registruojami Waters-Micromass ZQ 2000 masių detektoriumi (Waters, Milford, MA) su elektrinės išpurškiančiosios jonizacijos šaltiniu.
2.1.4. Propolio etanolinių ekstraktų gamyba maceracijos metodu
Paruošiami 30% propolio etanoliniai tirpalai, naudojant skirtingų koncentracijų tirpiklį. 30 g propolio uţpilama reikiamu kiekiu 50%, 60%, 70%, 80%, 96% etanolio. Maceracija vykdoma 3 paras [24]. Nufiltruojama, naudojant popieriaus filtrą. Pakuojama į tamsaus stiklo buteliukus su uţsukamu uţdoriu.
2.1.5. Sauso likučio nustatymas
2 ml ekstrakto 3 val. kaitinami dţiovinimo spintoje 100-105ºC temperatūroje [Ph. Eur. 2.8.16].
2.1.6. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas, naudojant spektrofotometrinį metodą, kuris remiasi oksidacijos-redukcijos reakcija su Folin-Ciocalteau reagentu.
2.1.6.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas pagal galo rūgštį [25]
Kalibracinė kreivė nubrėţta naudojant galo rūgšties vandeninį tirpalą (0,02-170 mg/ml). 0,1 ml tiriamojo propolio ekstrakto iki 50 ml praskiedţiama vandeniu, centrifuguojama. 1 ml skiedimo sumaišoma su 5 ml Folin-Ciocalteau reagento (10 kartų praskiesto vandeniu) ir 4 ml natrio karbonato tirpalo (75g/l). Po 30 minučių absorbcija matuojama spektrofotometru (bangos ilgis 765 nm), palyginamuoju tirpalu naudojant vandenį. Rezultatai apskaičiuojami galo rūgšties ekvivalento miligramais viename mililitre etanolinio ekstrakto (GRE mg/ml).
2.1.6.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas pagal pinocembrino ir galangino mišinį (2:1) [26]
Kalibracinė kreivė nubrėţta naudojant pinocembrino ir galangino mišinį (2:1), ištirpintą metanolyje (0,02-0,326 mg/ml).
1 ml tiriamojo propolio ekstrakto iki 100 ml praskiedţiama atitinkamos koncentracijos etanoliu. 1 ml skiedimo pernešama į 50 ml kolbą, į kurią dar įpilama 15 ml vandens, 4 ml Folin-Ciocalteau reagento ir 6 ml 20% natrio karbonato tirpalo. Visa tai iki 50 ml praskiedţiama vandeniu. Po 2 val. absorbcija matuojama spektrofotometru (bangos ilgis 760 nm), palyginamuoju tirpalu naudojant vandenį. Rezultatai apskaičiuojami pinocembrino ir galangino ekvivalento miligramais viename mililitre etanolinio ekstrakto (PGE mg/ml).
2.1.6.3. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas pagal ferulo rūgštį
Kalibracinė kreivė nubrėţta naudojant ferulo rūgšties vandeninį tirpalą (0,04-0,24 mg/ml). 1 ml tiriamojo propolio ekstrakto iki 100 ml praskiedţiama atitinkamos koncentracijos etanoliu. 1 ml skiedimo pernešama į 50 ml kolbą, į kurią dar įpilama 15 ml vandens, 4 ml Folin-Ciocalteau reagento ir 6 ml 20% natrio karbonato tirpalo. Visa tai iki 50 ml praskiedţiama vandeniu. Po 2 val. absorbcija matuojama spektrofotometru (bangos ilgis 760 nm), palyginamuoju tirpalu naudojant vandenį. Rezultatai apskaičiuojami ferulo rūgšties ekvivalento miligramais viename mililitre etanolinio ekstrakto (FRE mg/ml).
2.1.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Propolio ekstraktų antioksidacinis aktyvumas nustatytas naudojant spektrofotometrinį metodą. Antioksidacinis aktyvumas nustatomas pagal DPPH• radikalo sujungimą [14]. Paruošiamas DPPH• tirpalas: 0,01183 g DPPH• iki 100 ml uţpilama 96% etanoliu. Sumaišoma 2,5 ml šio tirpalo ir 0,5 ml tiriamo propolio ekstrakto. Po 16 min spektrofotometru (bangos ilgis515 nm) matuojama absorbcija, palyginamuoju tirpalu naudojant 96% etanolį. Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas inaktyvuoto DPPH• radikalo kiekio procentais (DPPH• inaktyv. proc.).
2.1.8. Propolio ekstraktų cheminės sudėties nustatymas ESCh-DAD-MS metodu (tyrimas atliktas KTU Maisto produktų technologijos katedroje)
Propolio ekstraktų cheminė sudėtis buvo tiriama efektyviosios skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos metodu (ESCh-DAD-MS). Buvo atliekama kokybinė ir kiekybinė analizė. Ekstraktų junginiai buvo identifikuoti sulyginant tiriamų junginių ir standartų sulaikymo laiką (Rt)
bei UV-Vis ir MS spektrus.
Skirstymas buvo atliekamas naudojant binarinį mobilios fazės gradientą. Kaip tirpiklis A buvo naudojamas 5% CH3COOH tirpalas ultra gryname vandenyje (laidumas 0,054 µS/cm), o
tirpiklis B buvo metanolis. Mobilios fazės tėkmės greitis buvo 1,0 ml/min. Pradinė eliuento A koncentracija mobilioje fazėje buvo 100% (0% B), po to per 50 minučių B koncentracija buvo padidinama iki 100% ir tokia išlaikoma 5 minutes. Tada per 3 minutes buvo grįţtama prie pradinių sąlygų ir 5 minutes leidţiama kolonai nusistovėti. UV-Vis spektrai buvo registruojami 210 – 400 nm bangų ilgio intervale, o chromatograma uţrašoma kiekviename taške pasirinkus maksimalią absorbciją turinčius bangos ilgius (MAX). Masių spektrometro darbo sąlygos buvo tokios: kintanti neigiama ir teigiama jonizacija (spektrai skanuojami m/z ribose nuo 80 iki 800 Da), dţiovinančių dujų (azoto) temperatūra 250 ºC, tėkmės greitis 250 l/h, kapiliaro įtampa 3,0 kW, o jonų šaltinio įtampa 25 V. Į masių spektrometrą buvo nukreipiama tik 1:5 (0,2 ml) iš skysčių chromatografo išeinančio eliuento srauto.
2.1.9. Parametrų apskaičiavimas ir statistinis duomenų apdorojimas
Sausas likutis (procentinė išraiška) apskaičiuojamas pagal formulę (1): m% = 𝑚2−𝑚1V × 100% (1)
Čia: m% - sauso likučio procentinė išraiška; m1 – lėkštelės masė (g); m2 – lėkštelės ir ekstrakto sauso likučio masė (g); V – tyrimui paimtas ekstrakto tūris (ml).
Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/ml) apskaičiuojamas remiantis naudojamo standarto gradavimo grafiku ir skaičiuojamas naudojant gautą tiesės lygtį (2), (3), (4):
pagal galo rūgšties gradavimo grafiką (1 priedas) gauta tiesės lygtis: y = 10,56x + 0,2318 (2)
pagal pinocembrino ir galangino mišinio (2:1) gradavimo grafiką (2 priedas) gauta tiesės lygtis:
y = 2,594x + 0,09245 (3)
pagal ferulo rūgšties gradavimo grafiką (3 priedas) gauta tiesės lygtis: y = 4,391x – 0,1886 (4)
Antioksidacinis aktyvumas inaktyvuoto DPPH• kiekio procentais apskaičiuojamas pagal formulę (5):
DPPH• inaktyv. proc. =
𝐴2−𝐴1
𝐴2 × 100% (5)
Čia: DPPH• inaktyv. proc. - inaktyvuoto DPPH• kiekio procentinė išraiška; A1 – bandinio su
ekstraktu absorbcija (matuojama po 16 min); A2 – tuščio bandinio absorbcija (matuojama iš karto).
Nustatymai (išskyrus chromatografinius) su kiekvienu propolio etanoliniu ekstraktu buvo atlikti 5 kartus (n = 5). Tyrimų duomenys apdoroti statistiškai, naudojant statistinį paketą ―Statistica‖. Apdoroti vidurkiai, kaip patikimumo lygmuo 95 proc.
Pastaba. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu tyrimai atlikti 2 kartus.
2.2. Tyrimo rezultatai ir jų aptarimas
2.2.1. Ekstrahento koncentracijos įtaka propolio skystų ekstraktų kokybei 2.2.1.1. Propolio etanolinių ekstraktų sauso likučio tyrimas
Pagaminus propolio etanolinius ekstraktus, vienas pirmųjų kokybės vertinimo kriterijų yra sauso likučio kiekio analizė.
2 pav. Etanolio koncentracijos įtaka sauso likučio kiekiui propolio etanoliniuose
ekstraktuose.
Antrame paveiksle pateikti tyrimų rezultatai, kaip propolio ekstraktų sauso likučio kiekis priklauso nuo ekstrahento koncentracijos. Šiame paveiksle pastebima tendencija, kad sauso likučio kiekis didėja, didėjant etanolio koncentracijai. Tyrimų metu nustatyta, kad kai ekstrahento koncentracija 80%, sauso likučio gaunama maţiau, nei kai 70%. Didţiausias sausųjų medţiagų liekanos kiekis yra ištraukose, kai ekstrahentas 70%, 80% bei 96% etanolis. Remiantis tyrimų rezultatais, galima iškelti hipotezę, kad naudojant didesnės koncentracijos etanolį, išekstrahuojamas didesnis bendras veikliųjų medţiagų kiekis. Šios hipotezės patvirtinimui bus atliekami tolimesni tyrimai, nustatant veikliųjų medţiagų kiekius.
2.2.1.2. Bendro fenolinių junginių kiekio propolio etanoliniuose ekstraktuose nustatymas
Buvo atlikti tolimesni tyrimai, nustatant ekstrahento įtaką veikliųjų medţiagų išsiskyrimui iš propolio ţaliavos. Spektrofotometriniu metodu tirtas bendras fenolinių junginių kiekis pagamintuose propolio etanoliniuose ekstraktuose.
Mokslinėje literatūroje randama, jog vienas iš daţniausiai naudojamų standartų fenolinių junginių analizei yra galo rūgštis [10, 27]. Todėl pirmajame tyrimų etape fenolinių junginių kiekis propolio etanoliniuose ekstraktuose buvo tirtas, kaip standartą naudojant galo rūgštį (3 pav.).
2,68% 6,43% 15,88% 15,20% 18,78% 0,00% 2,00% 4,00% 6,00% 8,00% 10,00% 12,00% 14,00% 16,00% 18,00% 20,00% 50% 60% 70% 80% 96% Etanolio koncentracija Sausas likutis
3 pav. Etanolio koncentracijos įtaka fenolinių junginių kiekiui propolio etanoliniuose
ekstraktuose (nustatant pagal galo rūgštį).
Nustatant pagal galo rūgštį (3 pav.), didţiausias bendras fenolinių junginių kiekis gaunamas, kai ekstrahentas 70, 80 ir 96% etanolis, tačiau skirtumas tarp skirtingos koncentracijos etanolio ekstraktų yra gana neţymus ir bendras fenolinių junginių kiekis nedidelis. Todėl remiantis literatūra [26, 28], parengta fenolinių junginių analizės metodika pagal pinocembrino ir galangino mišinį (2:1). Tyrimų rezultatai pateikti 4 pav.
4 pav. Etanolio koncentracijos įtaka fenolinių junginių kiekiui propolio etanoliniuose
ekstraktuose (nustatant pagal pinocembrino ir galangino mišinį (2:1)).
Diagramoje (4 pav.) pastebima tendencija, kad didėjant etanolio koncentracijai, bendras
7,2 8,88 9,17 9,57 9,07 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 50% 60% 70% 80% 96% Etanolio koncentracija
Propolio etanolinių ekstraktų fenolinių junginių kiekis (GRE mg/ml) 11,32 16,52 29,19 27,44 32,70 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 50% 60% 70% 80% 96% Etanolio koncentracija
Propolio etanolinių ekstraktų fenolinių junginių kiekis (PGE mg/ml)
fenolinių junginių kiekis didėja. Didţiausias fenolinių junginių kiekis gautas ištraukose, kai ekstrahentas 70% ir didesnės koncentracijos etanolis. Ši metodika daţnai naudojama tiriant Europoje surinkto propolio ekstraktus, tačiau dr. Liudo Ivanausko, prof. Audriaus Maruškos, dr. Audriaus Pukalsko atlikti moksliniai propolio tyrimai rodo, kad lietuviškame propolyje dominuoja ferulo rūgštis. Todėl buvo atliktas bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas pagal ferulo rūgštį (5 pav.).
5 pav. Etanolio koncentracijos įtaka fenolinių junginių kiekiui propolio etanoliniuose
ekstraktuose (nustatant pagal ferulo rūgštį).
Nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį propolio etanoliniuose ekstraktuose pagal ferulo rūgštį (5 pav.), buvo gautas apie 10 kartų didesnis bendras fenolinių junginių kiekis. Daugiausiai fenolinių junginių išekstrahuota naudojant 70% etanolį.
2.2.2. Propolio etanolinių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Literatūroje yra pateikta duomenų, kad propolis ir jo preparatai pasiţymi antioksidaciniu aktyvumu [13, 14, 15, 18]. Tikslinga nustatyti, kokia yra ekstrahento įtaka propolio ekstraktų antioksidaciniam aktyvumui (6 pav.).
250 264,2 291,07 273,2 269,2 220,00 230,00 240,00 250,00 260,00 270,00 280,00 290,00 300,00 50% 60% 70% 80% 96% Etanolio koncentracija
Propolio etanolinių ekstraktų fenolinių junginių kiekis (FRE mg/ml)
6 pav. Etanolio koncentracijos įtaka propolio etanolinių ekstraktų antioksidaciniam
aktyvumui.
Šeštame paveiksle pastebima tendencija, kad didėjant ekstrahento koncentracijai, propolio ekstrakto antioksidacinės savybės silpnėja, todėl nėra tiesioginės priklausomybės tarp ekstraktų antioksidacinio aktyvumo ir ištirtų biologiškai aktyvių junginių kiekio preparatuose.
2.2.3. Propolio ekstraktų cheminės sudėties nustatymas ESCh–DAD-MS metodu
Iš gautų propolio ekstraktų buvo paimta po 1 ml bandinio. Iš bandinių azoto srove buvo išgarinamas etanolis, o likęs vanduo išgarinamas liofilizacinėje dţiovykloje. Iš kiekvieno paimto propolio bandinio sauso likučio buvo paruošti 1% tirpalai atitinkamos koncentracijos metanolio-vandens mišinyje. 20 µl gauto tirpalo buvo įleidţiama į chromatografą. Išskirsčius junginius buvo uţrašyti jų UV ir MS spektrai. Palyginus gautus duomenis su pateikiamais literatūroje, galima daryti prielaidą, kad propolio bandiniuose aptiktos kavos ir ferulo rūgštys, bei flavonoidai pinocembrinas, pinostrobinas ir chrizinas. Kad galutinai būtų patvirtintas šių junginių identifikavimas bei nustatyti jų kiekiai, buvo paruoštas aptiktų junginių standartų ţinomų koncentracijų tirpalas ir ištirtas tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir propolio bandiniai. Chromatogramos pavyzdys su junginių pavadinimais pateiktas septintame paveiksle, o standartinio tirpalo chromatogramos pavyzdys - aštuntame paveiksle.
81,23 71,89 54,31 57,75 54,40 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 50% 60% 70% 80% 96% Etanolio koncentracija
Antioksidacinis aktyvumas (inaktyvuoto DPPH kiekio procentais)
7 pav. Propolio etanolinio ekstrakto (etanolis 96%) chromatograma.
Palyginus pagal literatūros duomenis propolyje identifikuotų junginių sulaikymo laikus su standartais galima teigti, kad pradinis junginių identifikavimas buvo teisingas. Kitas ţingsnis buvo kiekybinė biologiškai aktyvių propolio junginių analizė. Tam buvo paruošti keli skirtingų koncentracijų (nuo 12,5 iki 125 µg/ml) standartiniai tirpalai ir, atlikus jų analizę, pagal gautus standartų smailių plotus buvo nubrėţtos kalibracinės tiesės. Gauti koreliacijos koeficientai (min 0,997) leidţia atlikti gana tikslią kiekybinę analizę. Tiriamų junginių kiekiai buvo skaičiuojami pagal jų masių atsako smailių plotus, esant neigiamai jonizacijai. Kadangi pinostrobino atsakas panaudojant neigiamą jonizaciją labai maţas (8 pav.), todėl šio junginio kiekybinė analizė buvo atliekama pagal jo masės atsaką, esant teigiamai jonizacijai. Gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Biologiškai aktyvių junginių kiekiai propolio ekstraktuose.
Propolio ekstrakcijos būdas
Junginio kiekis ekstrakte, µg/ml Kavos
rūgštis
Ferulo
rūgštis Pinocembrinas Pinostrobinas Chrizinas
60% etanolis 40,92 53,13 4,88 5,02 12,21
70% etanolis 54,44 75,23 34,33 8,98 32,59
80% etanolis 51,95 68,40 40,42 11,99 41,81
96% etanolis 61,40 48,51 29,37 14,02 43,77
Iš 2 lentelėje pateiktų duomenų matyti, kad didėjant etanolio koncentracijai, flavonoidų kiekiai didėja. Tyrimų rezultatai parodė, kad iš flavonoidų propolio etanoliniuose ekstraktuose dominuoja chrizinas. Dominuojanti fenolinė rūgštis propolio etanoliniuose ekstraktuose yra ferulo rūgštis (tyrimų rezultatai sutampa su literatūros duomenimis), todėl tikslinga nustatant fenolinių junginių kiekį spektrofotometriškai, kaip standartą naudoti ferulo rūgštį.
2.2.4. Rinkoje esančių propolio preparatų kokybės analizė bei antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Atlikus eksperimentinius propolio etanolinių ekstraktų kokybės tyrimus, įvertinus ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, aktualu ištirti ir šiandieninėje rinkoje esančius etanolinius propolio preparatus.
3 lentelė. Etanoliniai propolio preparatai, dominuojantys Lietuvos rinkoje.
Nr. Tiriamasis preparatas Gamintojas Ekstrahentas
1. Propolio skystas ekstraktas (nereceptinis vaistinis preparatas)
UAB „Medicata Filia―, Lietuva 70% etanolis
2. Propolio tinktūra (maisto
papildas)
„Fitofarm NN―, Rusija 80% etanolis
3. Tirštas propolio ekstraktas UAB „Valentis―, Lietuva 70% etanolis, kuris
technologijos metu išgarintas
Buvo tirti rinkoje esantys skystas propolio etanolinis ekstraktas, propolio tinktūra ir tirštasis propolio etanolinis ekstraktas (3 lentelė), įvertinant jų kokybę pagal tuos pačius kriterijus. Nustatytas skystojo ekstrakto ir tinktūros sausasis likutis ir visų trijų preparatų bendras fenolinių junginių kiekis (pagal pinocembrino ir galangino mišinį (2:1) ir ferulo rūgštį) bei antioksidacinis aktyvumas.
2.2.4.1. Skystų propolio preparatų kokybės analizė bei antioksidacinio aktyvumo nustatymas
9 pav. Rinkoje esančių skystų propolio preparatų sausas likutis.
Tyrimais nustatyta, kad propolio skysto ekstrakto sausas likutis apie 5 kartus didesnis nei propolio tinktūros (9 pav.), vadinasi jame išsiekstrahavę daugiau medţiagų. Be to, skysto ekstrakto sausas likutis atitinka vaistų technologijos katedroje paruošto ekstrakto sauso likučio tyrimo rezultatus (2 pav., 19 psl.). 16,00% 3,25% 0,00% 2,00% 4,00% 6,00% 8,00% 10,00% 12,00% 14,00% 16,00% 18,00% Ekstraktas Tinktūra Sausas likutis
10 pav. Rinkoje esančių skystų propolio preparatų bendras fenolinių junginių kiekis
(nustatant pagal pinocembrino ir galangino mišinį (2:1)).
11 pav. Rinkoje esančių skystų propolio preparatų bendras fenolinių junginių kiekis
(nustatant pagal ferulo rūgštį).
Eksperimentų metu nustatyta, kad bendras fenolinių junginių kiekis didesnis propolio skystajame ekstrakte nei tinktūroje (apie 3 kartus didesnis nustatant pagal pinocembrino ir galangino mišinį (2:1) (10 pav.) ir apie 2 kartus didesnis nustatant pagal ferulo rūgštį (11 pav.)). Vadinasi propolio skystajame ekstrakte išsiekstrahavę daugiau fenolinių junginių. Be to, propolio skysto ekstrakto bendras fenolinių junginių kiekis pagal pinocembrino ir galangino mišinį (2:1) atitinka vaistų technologijos katedroje paruošto ekstrakto bendro fenolinių junginių kiekio rezultatus (4 pav., 20 psl.). Tačiau rinkoje esančių ekstraktų bendras fenolinių junginių kiekis negaunamas didesnis, kaip standartą naudojant ferulo rūgštį, kas buvo pastebėta tiriant vaistų technologijos katedroje paruoštus ekstraktus. Rekomenduotina būtų atlikti propolio ţaliavos veikliųjų medţiagų identifikavimą ir jų kiekio nustatymą, pritaikant ESCh metodą. Tai suteiktų išsamesnės informacijos apie tolimesniems tyrimams naudojamą ţaliavą, todėl atsirastų galimybė
33,63 11,59 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 Ekstraktas Tinktūra
Bendras fenolinių junginių kiekis (PGE mg/ml) 24,23 11,98 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 Ekstraktas Tinktūra
Bendras fenolinių junginių kiekis (FRE mg/ml)
pritaikyti priimtinesnį analizės metodą. Tyrimų rezultatai dar kartą patvirtino, kad propolio ţaliavos ir jo preparatų standartizacija yra didelė problema, tačiau ją būtina spręsti, kad būtų įvertinta propolio preparatų kokybė pasauliniu aspektu.
12 pav. Rinkoje esančių skystų propolio preparatų antioksidacinis aktyvumas.
Tyrimais nustatyta, kad propolio tinktūros antioksidacinis aktyvumas didesnis nei skysto ekstrakto (12 pav.), tačiau kaip matome 10 pav. ir 11 pav., jame išsiekstrahavę maţiau fenolinių junginių. Propolio skysto ekstrakto antioksidacinis aktyvumas panašus į vaistų technologijos katedroje paruošto ekstrakto antioksidacinį aktyvumą (6 pav., 22 psl.). Tyrimo rezultatai dar kartą patvirtino, kad propolio tirpalų antioksidacinis aktyvumas tiesiogiai nepriklauso nuo fenolinių junginių kiekio.
Nors rinkoje yra nemaţai propolio preparatų, tačiau norint įvertinti jų kokybę, reikia detalesnių tyrimų, tokių kaip biologiškai aktyvių medţiagų analizė, individualių junginių antioksidacinio aktyvumo tyrimai. Tyrimo rezultatai patvirtino literatūros duomenis [13, 14, 15, 18], kad antioksidaciniu aktyvumu pasiţymi visi propolio preparatai, nepriklausomai nuo veikliųjų medţiagų kiekio.
2.2.4.2. Tiršto propolio ekstrakto kokybės analizė bei antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Tirštas propolio ekstraktas naudojamas kaip veiklioji medţiaga, gaminant propolio preparatus (tabletes, tepalus, aliejus). Buvo įvertinta ir šio produkto kokybė, nustatant fenolinių junginių kiekį, bei jo antioksidacinis aktyvumas (4 lentelė).
58,43 81,79 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 Ekstraktas Tinktūra
Antioksidacinis aktyvumas (inaktyvuoto DPPH kiekio procentais)
4 lentelė. Tiršto propolio ekstrakto kokybės rodikliai ir antioksidacinis aktyvumas.
Bendras fenolinių junginių kiekis (PGE mg/g)
Bendras fenolinių junginių kiekis (FRE mg/g)
Antioksidacinis aktyvumas (inaktyvuoto DPPH kiekio procentais)*
107,5 401,25 89
* antioksidacinis aktyvumas išreikštas tiršto propolio ekstrakto tirpalui 96% etanolyje - 4 mg/ml.
Didelė fenolinių junginių koncentracija suteikia galimybes plačiam tiršto ekstrakto pritaikymui įvairių vaistų formų gamybai. Taip gaminant propolio preparatus, palengvinamas gamybos procesas, galima išvengti didelio šalutinių medţiagų kiekio, uţtikrinamas ţaliavos stabilumas, maţėja nedermių susidarymo tikimybė.
IŠVADOS
1. Pritaikius klasikinį maceracijos metodą, buvo pagaminti kokybiški skysti 30% propolio etanoliniai ekstraktai.
2. Didţiausias sausųjų medţiagų liekanos kiekis ištraukose yra, kai ekstrahentas 70%, 80% bei 96% etanolis, todėl tikslinga propolio etanolinių ištraukų gamyboje kaip ekstrahentą naudoti etanolį, ne maţesnės kaip 70% koncentracijos.
3. Pritaikius ESCh–DAD-MS metodą, nustatyta, kad viena iš dominuojančių fenolinių rūgščių propolio etanoliniuose ekstraktuose yra ferulo rūgštis; tyrimų duomenys patvirtino mokslinės literatūros duomenis. Todėl nustatant fenolinių junginių kiekį, kaip standartą patartina naudoti ferulo rūgštį.
4. Antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatai parodė, kad propolio etanolinių ekstraktų antioksidacinis aktyvumas tiesiogiai nepriklauso nuo ištirtųjų biologiškai aktyvių junginių kiekio preparatuose. Todėl reikalingi tolimesni ir detalesni antioksidacinio aktyvumo tyrimai, įvertinant individualiai kiekvieno biologiškai aktyvaus junginio antioksidacinį aktyvumą ir jo įtaką bendram preparato antioksidaciniam aktyvumui.
5. Remiantis atliktais antioksidacinio aktyvumo tyrimais, galima teigti, kad ruošiant propolio preparatą, kuris bus vartojamas kaip antioksidantas, tikslinga ekstrahentu naudoti 50% etanolį, nes toks propolio ekstraktas pasiţymi stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu.
6. Ištyrus rinkoje esančių propolio preparatų kokybę, nustatyta, kad jie visi pasiţymi antioksidaciniu aktyvumu. Tačiau reikalingi detalesni tyrimai, nustatant veikliąsias medţiagas preparatuose bei vertinant antioksidacinio aktyvumo priklausomybę nuo veikliųjų medţiagų kiekio.
LITERATŪRA
1. Salatino A, Teixeira EW, Negri G, Message D. Origin and Chemical Variation of Brazilian Propolis. Evid Based Complement Alternat Med. 2005; 2(1): 33-38.
2. Bankova VS, Castro SLD, Marcucci MC. Propolis: recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie 2000; 31: 3–15.
3. Majienė D, Trumbeckaitė S, Grūnovienė D, IvanauskasL, Gendrolis A. Propolio ekstrakto cheminės sudėties tyrimai. Medicina (Kaunas) 2004; 40(8): 771-774.
4. Uzel A, Sorkun K, Oncag O, Cogulu D, Gencay O, Salih B. Chemical compositions and antimicrobial activities of four different Anatolian propolis samples. Microbiol. Res. 2005; 160: 189—195.
5. Banskota AH, Tezuka Y, Kadota S. Recent progress in pharmacological research of propolis. Phytother Res 2001; 15: 561–571.
6. Sforcin JM. Propolis and the immune system: a review. J Ethnopharmacol 2007; 113: 1–14. 7. Nagai T, Inoue R, Inoue H, Suzuki N. Preparation and antioxidant properties of water
extract of propolis. Food Chem 2003; 80: 29–33.
8. Bankova V. Chemical diversity of propolis and the problem of standardization. J Ethnopharmacol 2005; 100: 114–117.
9. Majienė D, Trumbeckaitė S, Buinevičiūtė J, Buivydaitė R, Vaidelys A, Gendrolis A. Bičių produktai mūsų sveikatai: propolio cheminė sudėtis ir gydomosios savybės. Sveikatos mokslai 2003; 2: 89-93.
10. Savickas A, Majiene D, Ramanauskiene K, Pavilonis A, Muselik J, Masteikova R, Chalupova Z. Chemical composition and antimicrobial activity of Lithuanian and Czech propolis. Biologija (Vilnius) 2005; 4: 59–63.
11. Pietta PG, Gardana C, Pietta AM. Analytical methods for quality control of propolis. Fitoterapia 2002; 73 (Suppl. 1): S7–S20.
12. Bankova V. Recent trends and important developments in propolis research. Evid Based Complement Alternat Med 2005; 2(1): 29-32.
13. Russo A, Longo R, Vanella A. Antioxidant activity of propolis role of caffeic acid phenethyl ester and galangin. Fitoterapia 2002; 73 (Suppl. 1): S21–S29.
14. Kumazawa S, Hamasaka T, Nakayama T. Antioxidant activity of propolis of various geographic origins. Food Chem 2004; 84: 329–339.
15. Nagai T, Sakai M, Inoue R, Inoue H, Suzuki N. Antioxidative activities of some commercially. Food Chem 2001; 75: 237–240.
16. Mildaţienė V, Jarmalaitė S, Daugelavičius R. Ląstelės biologija: bendrasis vadovėlis. Kaunas: VDU leidykla; 2004. p. 293-312.
17. Benkovic V, Orsolic N, Knezevic AH, Ramic S, Dikic D, Basic I et al. Evaluation of the Radioprotective Effects of Propolis and Flavonoids in Gamma-Irradiated Mice: The Alkaline Comet Assay Study. Biol. Pharm. Bull. 2008; 31: 167—172.
18. Teixeira EW, Message D, Negri G, Salatino A, Stringheta PC. Seasonal Variation, Chemical Composition and Antioxidant activity of Brazilian Propolis Samples. Evid Based Complement Alternat Med. 2008.
19. Marcucci MC, Ferreres F, Garcı́a-Viguera C, Bankova VS, De Castro SL, Dantas AP et al. Phenolic compounds from Brazilian propolis with pharmacological activities. J Ethnopharmacol 2001; 74: 105–112.
20. Hegazi AG, Abd El Hady FK. Egyptian propolis: 3. Antioxidant, antimicrobial activities and chemical composition of propolis from reclaimed lands. Z Naturforsch [C] 2002;57(3-4): 395-402.
21. Mani F, Damasceno HCR, Novelli ELB, Martins EAM, Sforcin JM. Propolis: Effect of different concentrations, extracts and intake period on seric biochemical variables. J Ethnopharmacol 2006; 105: 95–98.
22. Castaldo S, Capasso F. Propolis, an old remedy used in modern medicine. Fitoterapia 2002; 73 (suppl 1): S1-S6.
23. Prieiga per internetą:
http://www.skrynia.lt/modules.php?name=News&file=article&sid=1270
24. Briedis V, Grincevičius J, Savickas A, Švambaris LK. Vaistų technologija (ketvirtasis tomas). Kaunas: Kauno medicines universiteto Spaudos ir leidybos centrro leidykla; 2002. p. 136-139
25. Povilaityte V, Cuvelier M-E, Berset C. Antioxidant properties of Moldavian dragonhead (Dracocephalum Moldavica L.). J of Food Lipids 2001; 8 (1): 45-64.
26. Popova M, Bankova V, Butovska D, Petkov V, Nikolova-Damyanova B, Sabatini AG et al. Validated Methods for the Quantification of Biologically Active Constituents of Poplar-type Propolis. Phytochem Anal 2004; 15: 235-240.
27. Alencar SM, Oldoni TLC, Castro ML, Cabral ISR, Costa-Neto CM, Cury JA et al. Chemical composition and biological activity of a new type of Brazilian propolis: Red propolis. J Ethnopharmacol 2007; 113: 278–283.
28. Popova M, Silici S, Kaftanoglu O, Bankova V. Antibacterial activity of Turkish propolis and its qualitative and quantitative. Phytomedicine 2005; 12: 221–228.
29. Estrada E, Quincoces JA, Patlewicz G. Creating molecular diversity from antioxidants in Brazilian propolis. Combination of TOPS-MODE QSAR and virtual structure generation. Mol. Divers 2004; 8: 21-33.
30. Gendrolis A, Pavilonis A, Lasinskaitė-Čerkašina A, Ivanauskas L. Prokalmento tirpalo antimikrobinio aktyvumo tyrimai. Medicina (Kaunas) 2005; 41 (3): 221-225.
31. Sahinler N, Kaftanoglu O. Natural product propolis: chemical composition. Nat. Prod. Res. 2005; 19: 183-188.
32. Bankova V, Popova M, Bogdanov S, Sabatinic AG. Chemical Composition of European Propolis: Expected and Unexpected Results. Z. Naturforsch. 2002; 57c: 530-533.
33. Havsteen BH. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacology & Therapeutics 2002; 96: 67– 202.
4 priedas. Publikacijos.
1. Ramanauskiene K, Savickas A, Banionyte I et. al. Analysis of Phenolic Acids in Propolis Using the High-Performance Liquid Chromatography Technique. Current Nutrition & Food Science, Volume 4, Number 3, August 2008, pp. 209-212(4) Publisher: Bentham Science Publishers.
2. Inga Banionytė. Propolio etanolinių ekstraktų cheminės sudėties tyrimas ir antioksidacinio aktyvumo vertinimas. Lietuvos sveikatos mokslų studentų ir jaunųjų tyrėjų konferencija, 2009 (Ţodinis pranešimas).
Santrauka
Raktaţodţiai: propolis, etanolinis ekstraktas, cheminė sudėtis, antioksidacinis aktyvumas.
Propolis (bičių pikis, bičių klijai) yra sakinga medţiaga, kurią bitės surenka nuo tuopų, berţų, liepų ar kitų augalų (priklausomai nuo tos geografinės zonos augmenijos). Propolio farmakologinis poveikis yra labai įvairus, todėl jis nuo seno populiarus liaudies medicinoje ir traukia mokslininkų dėmesį (ypač nuo XX a. 7 dešimtmečio). Viena iš svarbiausių propolio savybių yra stiprus antioksidacinis aktyvumas.
Tyrimo tikslas - nustatyti bei palyginti pagrindinių veikliųjų medţiagų kiekius propolio etanoliniuose ekstraktuose, įvertinti jų antioksidacinį aktyvumą. Pritaikius maceracijos metodą, buvo pagaminti skystieji propolio etanoliniai ekstraktai (etanolis 50%, 60%, 70%, 80% ir 96% koncentracijos). Buvo įvertinta ekstraktų kokybė gravimetriniu, spektrofotometriniu bei efektyviosios skysčių chromatografijos su diodų matricos ir masių spektrometrijos detektoriais (ESCh-DAD-MS) metodais. Pritaikius efektyviosios skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos metodą, nustatyta, kad viena iš dominuojančių fenolinių rūgščių propolio etanoliniuose ekstraktuose yra ferulo rūgštis. Todėl nustatant fenolinių junginių kiekį propolio etanoliniuose ekstraktuose spektrofotometriškai, kaip standartas buvo panaudota ferulo rūgštis. Bendras fenolinių junginių kiekis gautas apie 10 kartų didesnis, nei naudojant pinocembrino ir galangino mišinį (2:1). Daugiausiai fenolinių junginių nustatyta ekstraktuose, gautuose ekstrahuojant 70%, 80% bei 96% etanoliu. Buvo atliktas antioksidacinio aktyvumo tyrimas pagal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH•) radikalo sujungimą. Šio tyrimo rezultatai parodė, kad propolio etanolinių ekstraktų antioksidacinis aktyvumas tiesiogiai nepriklauso nuo fenolinių junginių kiekio preparatuose. Didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasiţymėjo ekstraktas, pagamintas naudojant 50% etanolį.
Summary
Analysis of chemical composition and antioxidant activity of ethanolic extracts of propolis
Key words: propolis, ethanolic extract, chemical composition, antioxidant activity.
Propolis (bee glue) is a resinous material that honeybees collect from poplar, birch or other plants (the plant source depends on the geographic origin of propolis). Because of its popularity in folk medicine, propolis has become the subject of intense pharmacological and chemical studies for the last 30 years. Numerous studies have proven its versatile pharmacological activities. One of the most important is its antioxidant activity.
The objective of this study was to identify and compare the main active substances in the ethanolic extracts of propolis and to evaluate their antioxidant activity. The classical maceration method was used for the production of liquid ethanolic extracts of propolis (the concentration of used ethanol: 50%, 60%, 70%, 80% and 96%). The quality of popolis was evaluated by gravimetric, spectrophotometric and High Performance Liquid Chromatography with Diode Array and Mass Spectrometric detectors (HPLC-DAD-MS) methods. The results of the HPLC-DAD-MS analysis showed that one of the main phenolic acids in the ethanolic extracts of propolis is ferulic acid. That was the reason for using it as a standard in the spectrometric analysis of total phenolic compounds. Spectrophotometric method showed about 10 times higher results than the analysis with the standard of pinocembrin and galangin mixture (2:1). The highest concentrations of phenolic compounds were found in the extracts made with the ethanol of 70%, 80% and 96% concentrations. The antioxidant activity of the extracts was evaluated by the radical scavenging activity against 2.2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•) radical. The results showed that antioxidant activity does not depend directly on total fenolic compounds. The highest antioxidant activity showed the extract, made with ethanol of 50% concentration.
