KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Farmacijos fakultetas
Farmakognozijos katedra
Kanadin÷s jakšūn÷s (Desmodium canadense (L.) DC.)
fitocheminis tyrimas
Magistro diplominis darbas
Darbo vadovai:
doc. G. Puodžiūnien÷ prof. L. IvanauskasDarbą atliko:
FF V k. 6 gr. student÷ Vaiva Kairyt÷.
2
SUMMARY
Key words: showy tick-trefoil, phytochemical analysis, flavonoids.
Showy tick-trefoil is not widely explored medical plant. Therefore it is reasonable to carry out a phytochemical research for the plant which was grown in Lithuania in order to identify its composition of active compounds. Accumulated information of analysis can be useful in standardization of pharmaceutical preparations from showy tick-trefoil, also in researching previously unidentified pharmacological effects.
Object and methods: raw material of showy tick-trefoil was examining by methods of high pressure liquid chromatography.
Objectives: To perform accumulated flavonoids and fenilpropanoids quality and quantity analysis on showy tick-trefoil and identify in which organ and which vegetation period they are mostly compiled; to identify dominating active compounds in herb and individual organs; to make a comparative analysis of outgrowth raw material.
Also to investigate total amounts of compiled flavonoids in showy tick-trefoil herb and leaves in different vegetation periods from second till seventh year of herb growing; to give recommendations for picking raw material. Finally to indicate whether the age of the plant has any influence for quantity of active compounds.
Findings:
The biggest amount of active compounds in every vegetation period is concentrated in leaves, except blooming period. In the sixth year of growing most of active compounds in leaves and in herb are founded during budding period, in stems – during the end of vegetation. During seventh year of growing most of active compounds in leaves, in herb and in stems are founded correspondingly in vegetation, budding and full fruit ripeness periods. A very small amount of active compounds is founded in roots.
During all vegetation periods of herb, in leaves and buds of showy tick-trefoil the dominanting compounds was orientin and homoorientin, in blow – astragalin, in fruit – rutin. In the herb, leaves and stems of showy tick-trefoil outgrowth, comparing with raw material of budding period, correspondingly 1.26, 1.09 and 1.80 times less active compounds was found.
The biggest amount of active compounds in all vegetation periods is founded in leaves and in herb during budding and blooming phase. Therefore the best times for the raw material picking are these phases. Furthermore the decrease of quantity of active compounds during the aging of the plant was noticed (p<0.05).
3
SANTRAUKA
Raktiniai žodžiai: kanadin÷ jakšūn÷, fitocheminis tyrimas, flavonoidai.
Kanadin÷ jakšūn÷ n÷ra gerai ištyrin÷tas vaistinis augalas, tod÷l buvo tikslinga atlikti Lietuvoje išaugintos žaliavos fitocheminius tyrimus augalo veikliųjų junginių sud÷čiai nustatyti. Sukaupti duomenys gali būti naudojami iš kanadin÷s jakšūn÷s gaminamų preparatų standartizacijai ir naujų, dar nenustatytų farmakologinių poveikių paieškai.
Tyrimo objektas ir metodai: kanadin÷s jakšūn÷s žaliava ištirta efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Darbo tikslas ir uždaviniai: atlikti kanadin÷s jakšūn÷s kaupiamų flavonoidų ir fenilpropanoidų kokybin÷s ir kiekybin÷s sud÷ties tyrimą bei nustatyti, kokiame augalo organe ir kokiu vegetacijos tarpsniu jų kaupiama daugiausiai. Taip pat nustatyti dominuojančius veikliuosius junginius žol÷je ir atskiruose organuose bei atlikti palyginamąja ataugusios žaliavos analizę.
Ištirti kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je ir lapuose sukauptų flavonoidų suminių kiekių dinamiką skirtingais vegetacijos tarpsniais antraisiais – septintaisiais augimo metais ir pateikti žaliavos rinkimo rekomendacijas bei nustatyti, ar augalo amžius turi įtakos kaupiamų veikliųjų junginių kiekiui.
Išvados:
Daugiausiai veikliųjų junginių visais vegetacijos tarpsniais susikaupia kanadin÷s jakšūn÷s lapuose, išskyrus žyd÷jimo tarpsnį, kai didžiausias nustatytų veikliųjų junginių kiekis randamas žieduose. Lapuose ir žol÷je daugiausiai veikliųjų junginių šeštaisiais augimo metais sukaupta butonizacijos tarpsniu, o stiebuose – vegetacijos pabaigoje. Septintaisiais augimo metais lapuose, žol÷je ir stiebuose daugiausiai veikliųjų junginių rasta atitinkamai vegetacijos, butonizacijos ir pilnos vaisių brandos tarpsniais. Šaknyse sukaupti labai maži veikliųjų junginių kiekiai.
Visos vegetacijos metu kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je, lapuose, stiebuose ir butonuose daugiausiai sukaupta orientino ir homoorientino, žieduose – astragalino, vaisiuose – rutino. Ataugusios kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je, lapuose ir stiebuose sukaupta atitinkamai 1,26, 1,09 ir 1,80 karto mažiau veikliųjų junginių, lyginant su atitinkama žaliava, surinkta butonizacijos tarpsniu.
Didžiausi veikliųjų junginių kiekiai antraisiais – septintaisiais augimo metais kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je ir lapuose sukaupti butonizacijos ir žyd÷jimo tarpsniais, tod÷l žaliavą rekomenduojama rinkti būtent šiais periodais. Nustatyta, kad augalui senstant maž÷ja jo kaupiamų junginių kiekis (p<0,05).
4
TURINYS
SUMMARY ... 2 SANTRAUKA ... 3 1.ĮVADAS ... 6 2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 82.1. Kanadin÷s jakšūn÷s apibūdinimas ... 8
2.1.1. Botaninis apibūdinimas ... 8
2.1.2. Augimo sąlygos ir paplitimas ... 8
2.1.3. Ekologin÷ reikšm÷ ... 8
2.2. Kanadin÷s jakšūn÷s kaupiamos farmakologiškai aktyvios medžiagos ... 9
2.2.1. Fenolin÷s rūgštys ... 9
2.2.1.1. Fenolinių rūgščių bendrasis apibūdinimas ... 9
2.2.1.2. Kavos rūgšties struktūra ir panaudojimas medicinoje ... 10
2.2.1.3. Chlorogeno rūgšties struktūra ir panaudojimas medicinoje ... 12
2.2.2. Flavonoidai ... 14
2.2.2.1. Flavonoidų bendrasis apibūdinimas ... 14
2.2.2.2. Viceninas ... 16 2.2.2.3. Orientinas ... 17 2.2.2.4. Homoorientinas ... 18 2.2.2.5. Viteksinas ... 18 2.2.2.6. Izoviteksinas ... 19 2.2.2.7. Rutinas ... 20
2.3. Kanadin÷s jakšūn÷s panaudojimas medicinoje ... 21
2.4.Efektyvioji skysčių chromatografija ... 22
2.5.Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 23
3.TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 24
4.TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25
4.1.Šeštųjų augimo metų kanadin÷s jakšūn÷s fitocheminio tyrimo rezultatai ir jų aptarimas ... 25
4.1.1. Vegetacijos tarpsnis ... 25
4.1.2.Butonizacijos tarpsnis ... 27
4.1.3. Žyd÷jimo tarpsnis ... 29
4.1.4. Vaisių brandos pradžios tarpsnis ... 31
4.1.5.Pilnos vaisių brandos tarpsnis ... 33
4.1.6.Vegetacijos pabaigos tarpsnis ... 35
4.1.7.Veikliųjų junginių suminių kiekių, sukauptų skirtingais vegetacijos tarpsniais, palyginimas...36
4.2.Septintųjų augimo metų kanadin÷s jakšūn÷s fitocheminio tyrimo rezultatai ir jų aptarimas 38 4.2.1. Vegetacijos tarpsnis ... 38
5
4.2.2 Butonizacijos tarpsnis ... 40
4.2.3. Žyd÷jimo tarpsnis ... 42
4.2.4. Vaisių brandos pradžios tarpsnis ... 44
4.2.5. Pilnos vaisių brandos tarpsnis ... 46
4.2.6. Vegetacijos pabaigos tarpsnis ... 48
4.2.7.Veikliųjų junginių suminių kiekių, sukauptų skirtingais vegetacijos tarpsniais, palyginimas... ... 49
4.2.8. Nupjautos, ataugusios ir butonizacijos tarpsniu surinktos kanadin÷s jakšūn÷s žaliavos tyrimas... ... 51
4.3. Antraisiais – septintaisiais augimo metais kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je ir lapuose sukauptų flavonoidų suminių kiekių palyginimas ... 53
4.3.1. Antraisiais – septintaisiais augimo metais kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je sukauptų flavonoidų suminių kiekių palyginimas ... 53
4.3.2. Antraisiais – septintaisiais augimo metais kanadin÷s jakšūn÷s lapuose sukauptų flavonoidų suminių kiekių palyginimas ... 54
4.4 Antraisiais – septintaisiais augimo metais kanadin÷s jakšūn÷s šaknyse sukauptų veikliųjų junginių kiekių palyginimas ... 56
5.IŠVADOS ... 57
6.LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 58
6
1.
ĮVADAS
Pastaruoju metu vis did÷ja susidom÷jimas augaliniais vaistais kaip natūraliais, mažai šalutinių poveikių sukeliančiais preparatais. Pasaulyje daugyb÷ mokslininkų tiria vaistinguosius augalus. Vieni jų siekia moksliškai pagrįsti nuo seno liaudies medicinoje vartojamų augalų gydomąsias savybes, kiti ieško naujų perspektyvių vaistinių augalų. Svarbiausias jų uždavinys yra nustatyti augalin÷je žaliavoje besikaupiančių veikliųjų junginių kokybinius ir kiekybinius rodiklius, būtinus standartizuojant žaliavą ir iš jos gaminamus preparatus. Fitocheminiai tyrimai šiuo metu dažniausiai atliekami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, nes jis pasižymi didele skiriamąja geba ir jautrumu.
Kanadine jakšūne (Desmodium canadense (L.) DC.) kaip perspektyviu vaistiniu augalu susidom÷ta pakankamai neseniai – XX amžiaus antroje pus÷je iš jos antžemin÷s dalies buvo išskirtas sausasis ekstraktas, pavadintas Helepinu D. Vienas svarbiausių jo poveikių – antivirusinis aktyvumas ir stiprus Herpes virusų slopinimas. Ne paslaptis, kad pūslelin÷ yra viena iš labiausiai paplitusių virusinių infekcijų. Žinomos septynios Herpes viruso rūšys, galinčios pažeisti žmogaus organizmą. Apie 95 % suaugusiųjų žmonių populiacijos yra HSV-1 viruso nešiotojai, o HSV-2 užsikrečiama subrendus ir 10 – 30 % suaugusiųjų populiacijos yra šio viruso nešiotojai.
Darbo naujumas.
Kanadin÷ jakšūn÷ n÷ra gerai ištyrin÷tas vaistinis augalas, tod÷l buvo tikslinga atlikti Lietuvoje išaugintos žaliavos fitocheminius tyrimus augalo veikliųjų junginių sud÷čiai nustatyti. Kanadin÷s jakšūn÷s fitocheminiai tyrimai atlikti 2003 – 2008 metais. Per šį laikotarpį buvo išvystyta veikliųjų junginių nustatymo metodika efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ir ištirta šešių metų augalin÷ žaliava. Gautų duomenų apibendrinimas pad÷s suprasti veikliųjų junginių kaupimosi dinamiką daugiamečio augalo vegetacijos metu ir pateikti racionalias žaliavos rinkimo rekomendacijas. Sukaupti duomenys gali būti naudojami iš kanadin÷s jakšūn÷s gaminamų preparatų standartizacijai ir naujų, dar nenustatytų farmakologinių poveikių paieškai.Darbo tikslas:
atlikti kanadin÷s jakšūn÷s žaliavos kaupiamų flavonoidų ir fenilpropanoidų kokybin÷s ir kiekybin÷s sud÷ties tyrimą.Darbo uždaviniai:
1. Ištirti kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je ir vegetatyviniuose bei generatyviniuose organuose šeštaisiais ir septintaisiais augimo metais sukauptų flavonoidų kokybinę ir kiekybinę sud÷tį bei nustatyti, kokiame augalo organe ir kokiu vegetacijos tarpsniu veikliųjų junginių kaupiama daugiausiai.
7 2. Nustatyti dominuojančius veikliuosius junginius kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je ir atskiruose organuose.
3. Atlikti veikliųjų junginių, sukauptų kanadin÷s jakšūn÷s lapuose, stiebuose ir žol÷je, nupjautoje žyd÷jimo tarpsniu ir ataugusioje iki butonizacijos tarpsnio, kokybinę ir kiekybinę analizę ir gautus duomenis palyginti su butonizacijos tarpsniu surinktos žaliavos duomenimis.
4. Nustatyti kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je ir lapuose skirtingais vegetacijos tarpsniais sukauptų flavonoidų suminių kiekių dinamiką antraisiais – septintaisiais augimo metais ir pateikti žaliavos rinkimo rekomendacijas.
5. Nustatyti, ar augalo amžius turi įtakos kaupiamų veikliųjų junginių kiekiui.
6. Nustatyti veikliųjų junginių kaupimosi dinamiką kanadin÷s jakšūn÷s šaknyse antraisiais – septintaisiais augimo metais.
8 1 pav. Žydinti Kanadin÷ jakšūn÷
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Kanadin÷s jakšūn÷s apibūdinimas
Kanadin÷ jakšūn÷ (lot. Desmodium canadanse (L.) DC (sinonimas – Meibomia canadensis
(L.) Kuntze), angl. Canadian tick-trefoil, showy tick-trefoil, showy ticktrefoil, Canada tickclover)
priklauso pupinių (Fabaceae) šeimai. [1, 2] Desmodium graikiškai reiškia „ilga šaka, grandin÷l÷“. Toks pavadinimas greičiausiai kilo nuo ankšties formos ir prisitvirtinimo būdo. Canadense – iš (arba nuoroda į) Kanados. [2]
2.1.1. Botaninis apibūdinimas
Tai daugiametis žolinis augalas. Jos stiebas status, šakotas, iki 2 m aukščio, vertikaliai vagotas su stačiais kibiais plaukeliais. Lapai trilapiai, kotuoti, su prielapiais. Prielapiai linijiški, anksti nukrenta. Lapalakščiai 3,5 – 14 cm ilgio ovaliai lancetiški ar lancetiški su lenktais plaukeliais apačioje. Žiedai (apie 1cm dydžio) nuo rožin÷s iki violetin÷s spalvos, tankiai išsid÷stę šluotel÷s (rečiau kek÷s) pavidalo žiedynuose (iki 40 cm ilgio). Žydi liepą – rugpjūtį. Vaisus – šiek tiek lenkta ankštis, sudaryta iš 3-5 ar daugiau apvalios formos segmentų. Vaisius brandina rugpjūčio – rugs÷jo m÷nesiais. [2-5]
2.1.2. Augimo sąlygos ir paplitimas
Šis augalas natūraliai auga Šiaur÷s Amerikoje (Kanadoje ir JAV), ypač rytin÷je žemyno dalyje. [6, 7] Lietuvoje kanadin÷ jakšūn÷ savaime neauga, nors ir yra tinkamos klimato sąlygos, tačiau kaip perspektyvus vaistinis augalas prof. V Janulio iniciatyva nuo 1994 m. introdukuojama Kauno VDU botanikos sode.
Kanadin÷ jakšūn÷ gerai auga dr÷gnoje ar drenuotoje dirvoje tiek saul÷kaitoje, tiek paunksm÷je. M÷gstamas dirvožemis – sm÷lis. Dažnai sutinkama dr÷gnų miškų proskynose ir pakraščiuose, ežerų pakrant÷se, pievose, pakel÷se. [3,5,8]
2.1.3. Ekologin÷ reikšm÷
Kanadin÷ jakšūn÷ užima pakankamai svarbų vaidmenį vietin÷se Šiaur÷s Amerikos ekosistemose: lapus ir stiebus ÷da elniai, s÷klomis minta smulkesni gyvūnai kaip oposumai, laukiniai kalakutai, pel÷s ir kt. Augalų lapais minta kai kurių vabzdžių lervos, o nektaru – tokie drugiai kaip Epargyreus clarus, Achalarus lyciades ir kitos rūšys. [9, 10]
9 Kanadinei jakšūnei kaip ir daugumai pupinių šeimos atstovų yra būdingos azotofiksacin÷s savyb÷s ir geb÷jimas praturtinti dirvožemį azoto druskomis d÷l susiformavusių simbiotinių ryšių su
Rhizobium genties bakterijomis. Jos fiksuoja laisvą azotą ir tiekia jį augalui, iš jo pasiimdamos
fotosintez÷s metu susintetintus anglies junginius. Šios bakterijos gyvena ant šaknų susiformavusiuose gumbeliuose, matomuose plika akimi. [4, 11]
2.2. Kanadin÷s jakšūn÷s kaupiamos farmakologiškai aktyvios
medžiagos
Iš ankstesnių Desmodium canadense žaliavos fitochemin÷s analiz÷s tyrimų yra žinoma, kad ji kaupia dviejų svarbių klasių augalinius junginius – fenolines rūgštis ir flavonoidus, kurie ir lemia šios augalin÷s žaliavos ir iš jos gaminamų preparatų farmakologinį poveikį. [12, 13]
2.2.1. Fenolin÷s rūgštys
2.2.1.1. Fenolinių rūgščių bendrasis apibūdinimas
Augaluose plačiai paplitusios dvi fenolinių rūgščių klas÷s: C6-C1 ir C6-C3. Pirmos iš jų
struktūros pagrindą sudaro benzeno rūgštis, antros – cinamono rūgštis. Abiems šioms klas÷ms priklausančios fenolin÷s rūgštys dažniausiai sutinkamos konjuguotos ar esterių formos. Benzeno rūgšties dariniams priklauso 4-hidroksibenzeno, vanilino, galo ir kitos rūgštys. Cinamono rūgšties dariniai (kavos, sinapo, ferulo ir kitos fenolin÷s rūgštys) yra labai plačiai paplitę ir randami daugelyje aliejinių augalų s÷klų bei dažnai sutinkami esterių formos kartu su chino rūgštimi ar cukrumis. Chlorogeno rūgštis, kuri randama saul÷grąžose, kavos pupel÷se, bulv÷se ir kitur, yra kavos rūgšties ir chino rūgšties esteris, sutinkamas įvairių izomerų formos. Tokios fenolin÷s rūgštys kaip kavos, protokatechino, chlorogeno, kurios randamos grybuose, bulv÷se, batatuose, tabako lapuose, obuoliuose, pomidoruose, bananuose ir kitur, yra tinkami substratai fermentui fenolazei, aktyvuojančiai fermentinio rudavimo reakcijų seką. Fenolaz÷ vykdo fenolių oksidaciją iki chinonų, kuriems polimerizuojantis susidaro raudonai rusvi polimerai, dažnai vadinami melaninais. Būtent jie ir susiformuoja parudavusiose mechaninio bulvių, obuolių ar kitų vaisių bei daržovių pažeidimo vietose d÷l fenolaz÷s ir kitų fermentinio rudavimo reakcijų sekos fermentų poveikio fenolin÷ms rūgštims. [14]
Aromatin÷s amino rūgštys, tokios kaip tirozinas ir fenilalaninas, yra dažniausiai randamos C6
-C3 (cinamono rūgšties) tipo fenolin÷s rūgštys visose gyvose ląstel÷se ir yra gyvybiškai svarbūs
ląstel÷s baltymų komponentai. Dihidroksifenilalanino (DOPA) glikozidai randami pupinių šeimos augaluose. DOPA taip pat yra pigmento melanino prekursorius gyvūnuose. [14]
10
2 pav. Kavos rūgšties
struktūra.
3 pav. Kavos rūgšties metabolizmo kelias
Desmodium canadense kaupia abiems fenolinių rūgščių klas÷ms priklausančius junginius
(chlorogeno, kavos, vanilino, galo ir 4-hidroksicinamono rūgštis). Daugiausiai randama kavos ir chlorogeno rūgščių. [13]
2.2.1.2. Kavos rūgšties struktūra ir panaudojimas medicinoje
Kavos rūgštis yra cinamono rūgšties darinys, gautas prie cinamono rūgšties 3 ir 4 pad÷tyse prijungus hidroksilo grupes (2
pav).
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad žmogaus organizmas pasisavina 95± 4 proc. kavos rūgšties, patekusios į virškinamąjį traktą. Beveik visa ji yra absorbuojama plonajame žarnyne. [16]
Kavos rūgštis žmogaus organizme yra aktyviai metabolizuojama (metabolizmo kelias yra pavaizduotas 3 pav.), o metabolitai šalinami su šlapimu. [17]
Kavos rūgštis pasižymi plačiu farmakologiniu poveikiu organizmui.
Antioksidantinis poveikis. Kavos rūgštis pasižymiu stipriu antioksidantiniu aktyvumu. In
11 emulsijos lipidų peroksidaciją atitinkamai 68,2 proc. ir 75,8 proc., kai tuo tarpu antioksidantų standartai α-tokoferolis ir troloksas – 54,7 proc. ir 20,1 proc.. Taip pat nustatytas kavos rūgštis geb÷jimas sujungti ABST (2-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties)), DPPH (1-difenil-2-pikril-hidrazilo) ir superoksido anijono laisvuosius radikalus. [18]
Ši rūgštis pasižymi ir antiapoptotiniu bei citoprotekciniu poveikiu. Oksiduoti mažo tankio lipoproteinai (MTL) yra citotoksišti ląstelių kultūroms. Nustatyta, kad oksiduoti MTL, veikdami per nuo kalcio priklausantį mechanizmą, sąlygoja apoptozę endotelio ląstelių kultūroje. Kavos rūgštis pasižymi stipriu tiesioginiu citoprotekciniu poveikiu endotelio ląstelių kultūrai, veikiamai oksiduotų MTL, nes blokuoja viduląstelin÷s Ca2+ koncentracijos padid÷jimą ir tuo pačiu apoptoz÷s procesą. Netiesioginis kavos rūgšties citoprotekcinis poveikis yra siejamas MTL oksidacijos slopinimu. Lyginant tiesioginį ir netiesioginį kavos rūgšties antiapoptotinį poveikį, buvo nustatyta, kad netiesioginis (antioksidantinis) poveikis sukelia žymiai stipresnį citoprotekcinį ir antiapototinį poveikį nei viduląstelin÷s Ca2+ koncentracijos padid÷jimo slopinimas. [19]
Antiparkinsoninis poveikis. Nustatyta, kad kavą geriantys žmon÷s mažiau rizikuoja susirgti Parkinsono liga. Manoma, kad tai lemia kavos rūgštis ir dihidrokavos rūgštis (kavos rūgštis, metabolizuota žarnyno bakterijų). Kadangi jos yra katecholiai, tai kraujyje tur÷tų būti metabolizuojamos fermento katechol-O-metiltransferaz÷s (COMT) kaip ir adrenalinas bei kiti ketecholiai. Gali būti, kad kavos rūgštis ir dihidrokavos rūgštis konkuruoja su dopaminu d÷l COMT ir taip mažina dopamino metabolizmą bei apsaugo nuo Parkinsono ligos vystymosi. [20]
Antikancerogeninis poveikis. Nustatyta, kad kavos rūgštis apsaugo peles nuo kencerogeninio benzpireno poveikio, o žiurkes – nuo 4-nitrochinolin-1-oksido sukeltos kencerogenez÷s. [21] Taip pat nustatyta, kad kavos rūgštis inhibuoja nitrozaminų formavimąsi ir detoksifikuoja galutinius kancerogeniškus policiklinių aromatinių angliavandenilių metabolitus. [22] Visgi kavos rūgšties antikancerogeninis poveikis yra diskutuotinas, nes mokslin÷ literatūra pateikia gana prieštaringus duomenis. Nustatyta, kad pelių patin÷liams ir žiurkių patel÷ms bei patin÷liams su ÷dalu skiriama kavos rūgštis sukelia prieskrandžio karcinomą, o pel÷ms dar papildomai išsivysto inkstų kanal÷lių hiperplazija bei adenoma. Tačiau mokslinikai nesutaria, ar galima šių tyrimų rezultatus pritaikyti žmon÷ms, nes trūksta duomenų, pagrindžiančių kavos rūgšties kancerogeninį poveikį žmogaus organizmui. Eksperimentų metu kavos rūgšties doz÷s, skirtos gyvūnams, buvo pakankamai didel÷s, be to žmogus neturi prieskrandžio, o inkstų pakitimai tirtiems gyvūnams greičiausiai išsivyst÷ d÷l toksinių pažeidimų. Vis d÷l to 1993 m. prieita prie išvados, kad kavos rūgštis gali būti kancerogeniška žmogui ir priskirta 2B kancerogenų grupei. [23]
Kavos rūgštis yra vienas iš selektyviausių lipoksigenaz÷s inhibitorių. Ji inhibuoja 5-lipoksigenazę nekonkurenciniu būdu. D÷l šios priežasties buvo manoma, kad ji mažina leukotrienų,
12
4 pav. Chlorogeno rūgšties
struktūra.
bet skatina prostaglandinų sintezę. Tačiau nustatyta, kad maža kavos rūgšties koncentracija skatina, o didel÷ slopina prostaglandinų sintezę. Taigi kavos rūgštis turi ir priešuždegiminių savybių. [24]
Antibakterinis ir priešgrybelinis poveikis. Nustatyta, kad kavos rūgštis slopina Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae ir Bacillus cereus augimą bei visiškai inhibuoja Aspergillus flavus ir Aspergillus parasiticus augimą ir aflatoksino išskyrimą. [25]
Literatūroje randama daugiau kaip 50 įvairių kavos rūgšties sukeliamų farmakologinių poveikių žmogaus organizmui, iš kurių svarbesni, bet dar nepamin÷ti būtų antivirusinis, antihepatotoksinis,antimutageninis, priešopinis, antispazminis ir kt. [26]
2.2.1.3. Chlorogeno rūgšties struktūra ir panaudojimas medicinoje
Chlorogeno rūgštis yra kavos rūgšties ir chino rūgšties esteris (4 pav.). Moksliniais tyrimais nustatyta, kad žmogaus organizmas iš virškinamojo trakto absorbuoja 33 ± 17 proc. suvartotos chlorogeno rūgšties. [16] Virškinimo trakte ji yra hidrolizuojama į kavos ir chino rūgštis. Kavos rūgštis toliau metabolizuojama į o-metilato junginius kaip ferulo, dihidroferulo ir vanilino rūgštys bei metahidroksifenilo junginius, kurie išskiriami su šlapimu. [27] Chino rūgštis yra paverčiama hipuro rūgštimi ir taip pat šalinama su šlapimu. Chino rūgšties metabolizme svarbų vaidmenį atlieka žarnyno mikroflora. [28]
Chlorogeno rūgštis yra farmakologiškai aktyvus junginys ir pasižymi plačiu poveikio spektru žmogaus organizmui.
Antioksidacinis efektas. Tiriant in vitro paaišk÷jo, kad chlorogeno rūgštis pasižymi antioksidacin÷mis savyb÷mis, tačiau antioksidacinio efekto stiprumas in vivo lieka neaiškus, nes šis junginys organizme aktyviai metabolizuojamas, o metabolitai dažnai turi gerokai mažesnį antioksidacinį aktyvumą nei pati chlorogeno rūgštis. [29]
Nustatytas ir chlorogeno rūgšties priešv÷žinis poveikis. Ji slopina nitrozinimo reakcijas ir nitrozaminų formavimąsi, detoksifikuoja galutinius kancerogeniškus policiklinių aromatinių angliavandenilių metabolitus, inhibuoja lipidų peroksidaciją žiurkių kepenyse, sukeltą anglies tetrachlorido – potencialaus kepenų kancerogeno, slopina pelių prieskrandžio neoplazijos, žiurk÷nų storosios žarnos v÷žio, žiurkių kepenų v÷žio vystymąsi bei pelių epidermio v÷žio plitimą. [22]
Antidiebetinis poveikis. Rusijos Maskvos modernios medicinos centro atlikta studija rodo, kad po 90 mg per dieną vartojama chlorogeno rūgštis sumažina gliukoz÷s kiekį kraujyje 15-20 proc. lyginant su placebu. [30]
13 Chlorogeno rūgštis veikia ir kaip aldoz÷s reduktaz÷s (svarbus polihidroksilių alkoholių metabolizmo kelio fermentas, katalizuojantis gliukoz÷s redukciją į sorbitolį) inhibitorius. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad chlorogeno rūgštis veiksmingai slopina žiurkių lęšiuko aldoz÷s reduktazę, nors veikia ir šiek tiek silpniau už sintetinį epalrestatą. Tokiu būdu mažindama sorbitolio kaupimąsi audiniuose, ji gali atitolinti vieną iš chroniško cukrinio diabeto komplikacijų – kataraktą. [31]
Antimutageniniu poveikis. Chlorogeno rūgštis inhibuoja metilšlapalo nitrinimą ir taip blokuoja mutageninio aktyvumo atsiradimą Eimso (Ames) bakterin÷je mutagenez÷s sistemoje, nes nesusidaro metilšlapalo ir nitrito junginys, pasižymintis mutageniškumu. [32]
Chlorogeno rūgštis didina homocisteino koncentraciją kraujo plazmoje. Mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad pra÷jus 4-5 valandoms po 2 g chlorogeno rūgšties suvartojimo, homocisteino kiekis kraujo plazmoje padid÷ja 12 proc., lyginant su kontroline grupe. Kadangi žinoma, jog padid÷jusi homocisteino koncentracija yra širdies ir kraujagyslių ligų rizikos veiksnys, galima teigti, kad chlorogeno rūgštis turi neigiamos įtakos šių ligų vystymuisi. [33]
Nustatyta, kad gryna chlorogeno rūgštis n÷ra alergenas. [34]
Chlorogeno rūgščiai būdingas stiprus priešuždegiminis ir skausmą malšinantis poveikis. [35] Antivirusinis aktyvumas. Chlorogeno rūgštis pasižymi stipriu antivirusiniu poveikiu prieš pirmo tipo Herpes simplex virusus [36] ir adenovirusus (ADV-11) [37] Kai kurių autorių duomenimis ji veikia ir prieš žmogaus imunodeficito (ŽIV-1) virusus. [28]
Antibakterinis aktyvumas. Chlorogeno rūgštis pasižymi antibakterin÷mis savyb÷mis kaip ir dauguma polifenolinių junginių. Šių junginių oksidacijos produktai inhibuoja daugumą fermentų, oksiduodami SH grupes ar sudarydami tam tikrus junginius su kai kuriomis baltymų amino grup÷mis. [39] Įrodytas stiprus chlorogeno rūgšties antimikrobinis poveikis Serratia marcescens ir
Enterobacter cloacae. [40]
Priešgrybelinis ir antiartritinis poveikis. Atlikta studija, tyrusi chlorogeno rūgšties įtaką C.
albicans pel÷ms sukelto artrito gydymui, nustat÷, kad šis junginys 40 proc. sumažino edemą ir
septinio artrito piką. Antiartritinį aktyvumą sąlygoja chlorogeno rūgšties sukeliamas visiškas NO gamybos makrofaguose sustabdymas ir T-ląstelių proliferacijos slopinimas. Be to, šis junginys inhibuoja C. albicans ląstelių augimą ir nesukelia hemoliz÷s, tod÷l gali būti saugiai leidžiamas tiesiai į kraujotakos sistemą C. albicans sukeltų artritų gydymui. [41]
Tulžies išskyrimą skatinantis poveikis (cholagogus). Chlorogeno rūgštis skatina tulžies tek÷jimą ir taip sumažina nemalonius cholestaz÷s simptomus. Daugiausiai šio junginio (apie 8 proc. [42]) kaupia kavos pupel÷s. Vadinasi, kavos m÷g÷jai, suvartojantys apie 1 gramą chlorogeno rūgšties kasdien, tur÷tų jausti terapinį jos poveikį. Tuo remdamasis Harvardo universitetas atliko plačios apimties tyrimą (dalyvavo daugiau kaip 80 000 moterų) ir nustat÷ kavos vartojimo įtaką
14 tulžies akmenų formavimuisi. Paaišk÷jo, kad reguliarus kavos vartojimas labai sumažina chirurginio akmenlig÷s gydymo tikimybę (kasdien išgeriant tris puodelius kavos chirurgin÷s intervencijos tikimyb÷ gydant tulžies akmenligę sumaž÷ja 22 proc.). Chlorogeno rūgštis taip pat pasižymi ir hepatoprotekciniu poveikiu, nes sumažina įvairių kepenų ligų (tarp jų kepenų ciroz÷s ir kepenų v÷žio) riziką. [43]
Ši rūgštis kaip ir kiti polifenoliniai jungiai yra linkusi sudaryti chelatinius junginius su sunkiaisiais metalais ir ženkliai mažina geležies absorbciją iš virškinimo trakto. Kavos ar arbatos vartojimas (turi ne tik chlorogeno rūgšties, bet ir kitų polifenolinių junginių) sumažina geležies pasisavinimą iš virškinimo trakto 35-83 proc., priklausomai nuo arbatos ir kavos rūšies, jei ji geriama per pirmą valandą po valgio. [44]
Imunomoduliacinis efektas. Yra žinoma, kad chlorogeno rūgštis didina žmogaus limfocitų proliferaciją ir γ interferono sekreciją. [45]
Literatūroje taip pat yra duomenų, kad chlorogeno rūgštis pasižymi daugiau kaip 50 įvairių biologinių poveikių. Iš jų dar nepamin÷ti ir verti didesnio d÷mesio būtų: antihistamininis, antitiroidinis, CNS stimuliuojantis, diuretinis, leukotrienų inhibicinis, ornitino dekarboksilaz÷s inhibicinis, antigonadotropinis, lipoksigenaz÷s inhibicinis ir priešopinis poveikiai. [46, 47]
2.2.2. Flavonoidai
2.2.2.1. Flavonoidų bendrasis apibūdinimas
Terminas „flavonoidai“ kilo iš lotynų kalbos žodžio flavus, reiškiančio geltonas, nes pirmieji iš augalų išskirti šios klas÷s junginiai buvo geltonos spalvos. Flavonoidai yra didžiausia gamtinių fenolinių junginių grup÷. Jie randami įvairiose augalų dalyse laisvi (aglikonai) arba susijungę su cukrumis (glikozidai). Flavonoidai taip pat žinomi kaip augalų pigmentai, ne tik suteikiantys žievei, lapams, žiedams, vaisiams ir s÷kloms savitas spalvas ir taip pritraukiantys vabzdžius, bet ir sukeliantys įvairius farmakologinius poveikius. [48]
Ši junginių grup÷ turi C6-C3-C6 pagrindu suformuotą struktūrą. Flavonoidų molekul÷je yra du
benzeno žiedai (C6), tarpusavyje sujungti propaininiu fragmentu (C3). Būtent d÷l šio propaininio
fragmento daugelis flavonoidų sudaro heterociklą, kuris yra pirano ar γ pirono darinys. Labiausiai paplitusi flavonoidų klasifikacija ir yra pagrįsta junginių chemine sandara bei propaininio fragmento oksidacijos laipsniu ir flavonoidus skirsto į 12 grupių [49]:
1. Flavonai (turi benzo-γ-pirono žiedą su fenilo pakaitu pirono žiedo 2 pad÷tyje [48]) (5 pav.) 2. Flavonoliai (flavono 3-hidroksi derivatai [48]) (6 pav.)
3. Flavononai (dihidroflavononai) (tai flavonų 2,3-dihidro derivatai [48]) (7 pav.) 4. Flavanololiai (dihidroflavanololiai) (flavonono 3-hidroksi derivatai [48]) (8 pav.) 5. Flavan-3-oliai (jų dimerai ar polimerai žinomi kaip taninai [48]) (9 pav.)
15 6. Leukoantocianidinai (flavan-3,4-dioliai [48]) (10 pav.)
7. Antocianai (antocianidinų glikozidai [48]) (11 pav.)
8. Chalkonai (neturi γ-pirono žiedo ir yra atviros grandin÷s flavonoidai, turintys du benzeno žiedus, sujungtus 3 anglies atomų grandin÷le, o chalkono dihidroderivatai yra vadinami dihidrochalkonais [48]) (12 pav.)
9. Auronai (turi 2-benzyliden-kumaranono arba 2-benzyl-3-(2H)-benzofuranono skeletą [48]) (13 pav.)
10. Izoflavonoidai (izoflavonai turi benzo-γ-pirono žiedą su fenilo pakaitu pirono žiedo 3 pad÷tyje, izoflavanonai yra izoflavonų dihirdo derivatai [48]) (14 pav.)
11. Neoflavonoidai.
12. Biflavonoidai (tai įvairių flavonoidų dimerai [48]) (15 pav.)
Daugiausiai flavonoidai augaluose randami glikozidų pavidalo. Cukrūs gali tur÷ti įvairią glikozidin÷s jungties konfigūraciją. Jie prisijungę būna C7, C4, C3 ir retai C5, C6, C8 pad÷tyse β
5 pav. Flavonų karkasas 6 pav. Flavonolių karkasas 8 pav. Flavanonolis
ampelopsinas
7 pav. Flavononų karkasas
9 pav. Flavan-3-olis katechinas 10 pav. Leukoantocianidinas leukocianidinas 11 pav. Antocianų karkasas 12 pav. Chalkonas 13 pav. Auronas trihidroksiauronas 14 pav. Izoflavonoidų karkasas - izoflavonas 15 pav. Biflavonoidas
16 16 pav. Viceninas-2
jungtimi per aglikono hidroksilines grupes (5 pav.). Dažniausiai cukrūs būna monosacharidai (D-gliukoz÷, L-arabinoz÷ ir kt.), retai – disacharidai (rutinoz÷, soforoz÷) ir labai retai – trisacharidai. Cukrūs glikoziduose gali prisijungti daugiausiai prie dviejų aglikono hidroksilo grupių.
Glikozidai randami dviejų tipų:
1. O-glikozidai. Tai dažniausia flavonoidų glikozidų forma. Glikozidinimas dažniausiai
vyksta 3 pad÷tyje. Jei jungiasi antrasis cukrus – 7 pad÷tyje.
2. C-glikozidai. Cukrus, jungdamasis per C atomą prie aglikono, dažniausiai jungiasi 8
pad÷tyje. Visi C glikozidų aglikonai priklauso flavonams. [49]
Flavonoidai pasižymi daugeliu farmakologinių poveikių (antimikrobiniu, antiartritiniu, antiopiniu, estrogeniniu, proteinkinaz÷s inhibiciniu, prostaglandinų sintez÷s inhibiciniu ir kitais), tod÷l yra labai svarbūs medicinos praktikoje. [48]
Kanadin÷ jakšūn÷ kaupia kelių rūšių flavonoidus, kurie randami tiek anglikonų, tiek glikozidų formos. Šis augalas daugiausiai kaupia vicenino-2, orientino ir homoorientino, viteksino, izoviteksino ir rutino. [12]
2.2.2.2. Viceninas
Viceninas yra C-glikozidas. Jo anglikonas apigeninas yra priskiriamas flavonų grupei. Pagal prijungtus glikozidinius pakaitus, viceninas yra trijų formų:
1. Viceninas-1 (6 pad÷tyje yra prisijungusi ksiloz÷, o 8 – gliukoz÷) 2. Viceninas-2 (6 ir 8 pad÷tyse yra prisijungusi gliukoz÷) (16 pav.) 3. Viceninas-3 (6 pad÷tyje yra prisijungusi gliukoz÷, o 8 – ksiloz÷) [50]
Desmodium canadense kaupia viceniną-2. [51] Literatūroje
pateikiama nemažai duomenų apie šio flavonoido antioksidacines ir antiradiacines savybes. Nustayta, kad veikiant E. coli bakterijų štamą ir du jo mutantų tipus, kurių vienas stokojo superoksido dismutaz÷s, kitas – katalaz÷s (antioksidaciniai fermentai), menadionu (vitaminas K3) ir peroksidu, viceninas ir orientinas žymiai padidino jų
išgyvenamumą. Su tomis pačiomis bakterijų kultūromis nustatytas ir abiejų šių flavonoidų antiradiacinis aktyvumas. Mikroorganizmus paveikus 0-150 Gy gama spinduliais, viceninas ir orientinas labai padidino jų išgyvenamumą. Taigi šie flavonoidai efektyviai slopina radiacijos ir cheminių medžiagų suketą citotoksiškumą. Manoma, kad citoprotekcinį vicenino ir orientino poveikį galima paaiškinti jų sugeb÷jimų neutralizuoti laisvuosius radikalus. [52]
Atliekant tyrimus su pel÷mis nustatyta, kad viceninas ir orientinas efektyviai sumažina neigiamą radiacijos poveikį pelių kaulų čiulpų ląstel÷ms ir padidina kamieninių ląstelių
17 17 pav. Orientinas
išgyvenamumą. Ši studija rodo, kad labai mažos vicenino ir orientino doz÷s (50µg/kg) gali efektyviai apsaugoti audinius nuo žalingo radiacijos poveikio radioterapijos procedūrų metu. [53]
Antiradikalinis vicenino poveikis nustatytas tiriant pasifloros (Passiflora incarnata) žol÷s etanolinio ir vandeninio ekstraktų antiradikalines savybes. Nustatyta, kad viceninas, izoviteksinas ir orientinas pasižymi stipresniu antiradikaliniu poveikiu už chlorogeno ir kavos rūgštis, hiperozidą, kvercetiną, liuteoliną, rutiną ir viteksiną. [54]
Literatūroje yra duomenų, kad viceninas pasižymi ir antimikrobiniu aktyvumu. [55] 2.2.2.3. Orientinas
Orientinas yra liuteolino 6-C-glikozidas. Jo anglikonas liuteolinas yra priskiriamas flavonų grupei. (17 pav.)
Orientino farmakokinetinių parametrų ir pasiskirstymo audiniuose tyrimai, atlikti su sveikomis žiurk÷mis, rodo, kad orientinas, injekuotas į veną, greitai pasiskirsto po audinius ir per 90 min nuo patekimo į organizmą yra eliminuojamas. Orientinas geriausiai pasiskirsto kepenyse, plaučiuose ir inkstuose, o hemetoencefalinį barjerą pereina sunkiai. Taip pat buvo pasteb÷ta, kad orientinas žiurkių audiniuose nesikaupia. [56]
Orientinui būdingi stiprūs antioksidacinis, antiradiacinis ir antiradikalinis poveikiai. [52, 53, 54]
Naudojant gyvūnų modelius yra nustatytas orientino apsauginis poveikis esant miokardo išemijai ir hipoksijai. Orientinas (1, 2, 4 mg/kg) žymiai pailgina išgyvenimo laiką pel÷ms su uždara normobarine hipoksija. Taip pat šis flavonoidas inhibuoja arachidono rūgšties sukeltą kraujo plokštelių agregaciją žiurk÷ms ir izoliuotose jūrų kiaulyčių širdyse pagerina vainikinę kraujotaką. Be to, orientinas reikšmingai antagonistiškai veikia pituitrino sukeltus EKG pakitimus ir slopina miokardo ląstelių apoptozę po išemijos. [57, 58]
Šis flavonoidas pasižymi stipriomis priešgrybelin÷mis savyb÷mis. Jo poveikis dermatofitams yra tolygus ketokonazolio poveikiui. [59]
Nustatyta, kad orientinas pasižymi ir vazodiliataciniu poveikiu. Su bandomaisiais triušiais atliktų tyrimu metu paaišk÷jo, kad jis atpalaiduoja krūtinin÷s aortos žiedinius raumenis per NO-cGMP mechanizmą ir slopina kraujagyslių lygiųjų raumenų susitraukimą, sukeltą receptoriais valdomų ir nuo įtampos priklausančių Ca2+ kanalų aktyvavimo. [60]
Šiam flavonoidui būdingas ir antivirusinis poveikis. Nustatyta, kad viteksinas ir orientinas pasižymi stipriu antivirusiniu poveikiu prieš 3 tipo parainfluenza virusą, sukeliantį kv÷pavimo takų ligas. [61]
18 19 pav. Viteksinas
18 pav. Homoorientinas
Spazmolitinis efektas. Tiriant raudonosios (Rooibos) arbatos poveikį virškinimo trakto funkcijai, nustatyta, kad ši arbata gali būti naudojama hiperaktyvių virškinimo trakto sutrikimų gydymui. Palyginus pagrindinių vandeninio Rooibos arbatos ekstrakto komponentų (orientino, viteksino ir kt.) spazmolitinį ir paties vandeninio Rooibos arbatos ekstrakto antispazminį poveikius, nustatyta, kad jie yra panašūs. [62]
Literatūros šaltiniuose taip pat minima, kad orientinas pasižymi priešuždegiminiu, cAMP-fosfodiesteraz÷s inhibiciniu bei antikancerogeniniu poveikiais. [63]
2.2.2.4. Homoorientinas
Homoorientinas (izoorientinas) yra orientino izomeras. (18
pav.)
Mokslin÷je literatūroje yra duomenų, kad pel÷ms po 15 mg/kg ir 30 mg/kg su ÷dalu skirtas homoorientinas pasižym÷jo stipriomis priešuždegimin÷mis ir skausmą malšinančiomis savyb÷mis, nesukeldamas jokio toksiškumo ir skrandžio pažeidimų.[64]
Hipoglikemin÷s ir antihiperlipidemin÷s savyb÷s. Ištyrus homoorientino poveikį žiurk÷ms, turinčioms su streptozocinu sukeltą diabetą, nustatyta, kad 15 mg/kg izoorientino doz÷ efektyviai sumažina gliukoz÷s ir lipidų kiekį kraujyje. [65]
Tyrimais in vivo įrodytas ir homoorientino hepatoprotekcinis poveikis. [66]
Isoorientinas pasižymi acetilcholinesterazę ir butirilcholinesterazę slopinančiomis savyb÷mis. [67]
Homoorinetinas pasižymi stipriomis antioksidacin÷mis savyb÷mis, nes ne tik tiesiogiai neutralizuoja laisvuosius radikalus, bet ir reguliuoja antioksidacinių genų ekspresiją. [68]
2.2.2.5. Viteksinas
Viteksinas yra apigenino 8-C-gliukozidas. Apigeninas, kaip jau min÷ta anksčiau, priskiriamas flavonų grupei. (19 pav.)
Antioksidacinis ir antiradikalinis aktyvumas. Viteksinui (>500 µg/ml) būdingas nežymus antioksidacinis aktyvumas lyginant su orientinu ( 444,61 µg/ml). Taip pat viteksinas pasižymi gerokai silpnesniu laisvuosius radikalus surišančiu poveikiu už orientiną. [69]
19 Kardiomiocitų protekcinis poveikis. Tyrimais in vitro su naujagimių žiurkių kardiomiocitais, pažeistais anoksijos/reoksigenacijos, nustatyta, kad viteksinas pagerina jų gyvybingumą, slopina anoksijos/reoksigenacijos sukeltą laktatdehidrogenaz÷s ir kreatinkinaz÷s atpalaidavimą, sumažina kardiomiocitų apoptoz÷s skaičių. [70]
Priešv÷žinis poveikis. Nustatyta, kad viteksinas slopina žiurkių feochromocitomos ląstelių metastazavimą. [71]
Priešuždegiminis poveikis. Viteksinas, skiriamas po 400 µg/kg pel÷ms, 80 proc. atvejų inhibuoja neutrofilų kaupimąsi plaučiuose, sukeltą Gram- bakterijų lipopolisacharidų. [72]
Radioprotekcinis poveikis. Tiriant preparatą „Vitexina“, pagamintą iš žaliosios pupel÷s (Vigna radiata L.) žol÷s (tradicin÷je Vietnamo medicinoje šis augalas naudojamas detoksikacijai), kurio pagrindinis komponentas viteksinas, nustatyta, kad jis pasižymi radioprotekciniu poveikiu pacientams, sergantiems krūties v÷žiu ir gydytiems radioterapija su cobalt-60. Buvo atlikta randomizuota ir placebu kontroliuojama studija, kurios metu nustatyta, jog preparatą „Vitexina“ vartojantys pacientai nepatyr÷ neigiamo radioterapijos poveikio (silpnumo, svorio netekimo ir kt.), kai tuo tarpu placebo grup÷je 73 proc. pacientų per 6 savaičių trukm÷s radioterapijos kursą neteko 1-2 kg ir patyr÷ kitus šalutinius poveikius. [73]
Hepatoprotekcinis poveikis. Nustatyta, kad viteksinas inhibuoja TNF-alfa (D-GalN/tumor
necrosis factor-alpha) indukuotą ląstelių žūtį pelių hepatocitų kultūroje [74]
Antitiroidinis poveikis. Viteksinas ir apigeninas yra stiprūs tiroido peroksidaz÷s (fermentas, tiroziną verčiantis tiroksinu) inhibitoriai. Net ir mažos šių flavanoidų doz÷ gali nuslopinti tiroksino gamybą ir suaugusiems žmon÷ms sukelti skydliauk÷s padid÷jimą (gūžį), o vaikams – kretinizmą. [75]
Hipotenzinį poveikį sąlygoja viteksino ganglioblokacin÷s, priešuždegimin÷s, antihistaminin÷s, antibradikininin÷s ir antiseratoninin÷s savyb÷s. [76] Taip pat žinoma, kad viteksinas slopina ir angiotenziną konvertuojantį faktorių (AKF). [77]
Taip pat viteksinui būdingas antivirusinis ir spazmolitinis poveikiai [61, 62] Literatūroje yra minima, kad viteksinas pasižymi ir aldoz÷s reduktaz÷s inhibiciniu, antiaritminiu, antidermatitiniu ir cAMP-fofodiesteraz÷s bei α-gliukozidaz÷s inhibiciniu poveikiais. [78,79]
2.2.2.6. Izoviteksinas Izoviteksinas – tai apigenino 6-C-gliukozidas. (20 pav.)
Antioksidacinis aktyvumas. Izoviteksino antioksidacinis aktyvumas yra didesnis už butilathidroksianizolo ir α-tokoferolio. [80]
20 20 pav. Izoviteksinas
21 pav. Rutinas
Šis flavanoidas pasižymi vidutiniu žiurkių lęšiuko aldoz÷s reduktaz÷s inhibiciniu poveikiu bei stipriu sud÷tingesnių galutinių glikacijos produktų formavimosi inhibiciniu poveikiu. [81] Aldoz÷s reduktaz÷ – tai fermentas, gliukozę paverčiantis sorbitoliu ir dalyvaujantis antrinių diabeto komplikacijų (katarakta, retinopatija, neuropatija, nefropatija)
formavimesi. Aldoz÷s reduktaz÷s inhibitoriai apsaugo nuo šių komplikacijų arba sul÷tina jų vystymąsi. [82]
Glikacija – tai nefermentinis procesas, kurio metu cukrūs susijungia su baltymais ar lipidais. Endogenin÷ glikacija dažniausiai vyksta kraujyje su nedidel÷ms porcijoms absorbuotų paprastųjų cukrų (gliukoz÷s, fruktoz÷s ar galaktoz÷s). Kai kurie sud÷tingesni galutiniai glikacijos produktai yra nepavojingi, tačiau kiti yra žymiai reaktyvesni negu cukrūs, iš kurių šie buvo suformuoti, ir dalyvauja daugelio chroniškų ligų (cukrinio diabeto, kardiovaskulinių ligų, onkologinių susirgimų, Alzhaimerio ligų ir kt.) patogenez÷je [83]
Priešuždegiminis ir antikancerogeninis poveikis. Atliekant bandymus su pel÷mis nustatyta, kad izoviteksinas slopina lipopolisacharidų (LPS) sukeltą vandenilio peroksido gamybą makrofaguose, TNF-alfa (tumor necrosis factor alpha) išskyrimą bei prostaglandino E2 gamybą. Jis taip pat mažina COX-2 ekspresiją. [84]
Izoviteksinas pasižymi antiradikaliniu poveikiu ir yra stiprus acetilcholinesteraz÷s ir butirylcholinesteraz÷s inhibitorius. [54, 85]
2.2.2.7. Rutinas
Rutinas yra sudarytas iš kvercetino ir rutinoz÷s. Jo anglikonas kvercetinas priskiriamas flavonoliams. (21 pav.)
Rutinas – labai plačiai paplitęs flavonoidas, sukeliantis daugiau kaip aštuoniasdešimt įvairių farmakologinių efektų [81], tačiau plačiausiai išnagrin÷ti yra antioksidacinis, antiradikalinis ir kapiliarų sieneles stiprinantis rutino poveikiai.
Antioksidacinis aktyvumas. Rutinas ir kvercetinas slopina ksantinoksidaz÷s gaminamų superoksidų poveikį tiek tiesiogiai juos neutralizuodami, tiek inhibuodami patį fermentą. Tyrimais in
vitro ir in vivo nustatyta, kad rutino-geležies ir rutino-vario kompleksai pasižymi žymiai stipresniu
21 Antiradikalinis poveikis. Nustatyta, kad rutinas ir kvercetinas laisvuosius radikalus neutralizuoja tiesiogiai juos surišdami arba sudarydami chelatus. Abiejų šių flavonoidų antiradikalinis poveikis liposominių ir mikrosominių lipidų peroksidacijai buvo lyginamas su klasikiniu antioksidantu 3,4-di-tert-butil-4-hidroksitoluenu (BHT), kuris neturi chelatinio aktyvumo, tačiau nepasteb÷ta jokio poveikio skirtumo. Rutinas ir kvercetinas inhibuoja nuo anglies tetrachlorido priklausančią lipidų peroksidaciją tiesiogiai neutralizuodami laisvuosius radikalus, o nuo NADPH priklausančią ir NADPH citochromo P-450 reduktaz÷s katalizuojamą lipidų peroksidaciją slopina sudarydami chelatus (ypač būdinga rutinui). [87]
Kapiliarų sieneles stiprinantis poveikis. Rutinas yra plačiai naudojamas kapiliarų trapumui ir flebosklerozei gydyti. Pagal sugeb÷jimą slopinti kapiliarų pralaidumą ir Artiuso fenomeną (lokali uždegimin÷ odos hiperjautrumo reakcija), flavonoidai yra išd÷styti į tokią poveikio stiprumo eilę: hesperidinas>rutinas>kvercetinas>naringeninas>kempferolis>izokvercetinas. Manoma, kad flavonoidai, kurie turi laisvas hidroksilo grupes 3, 3’ ir 4’ pad÷tyse, pasižymi kapiliarų sieneles stiprinančiu poveikiu. [88]
Rutinas d÷l savo stiprių antioksidantinių ir antiradikalinių savybių veikia priešuždegimiškai, antialergiškai ir antikancerogeniškai. Jam taip pat būdingi skrandžio gleivinę apsaugantis, hepatoprotekcinis, eritrocitų agregaciją slopinantis, antitiroidinis, antimikrobinis, antivirusinis ir kiti poveikiai. [88]
2.3. Kanadin÷s jakšūn÷s panaudojimas medicinoje
Kanadin÷ jakšūn÷ (Desmodium canadense (L.) DC) n÷ra plačiai liaudies medicinoje naudojamas augalas. D.E. Moerman knygoje „Native American Ethnobotany“ mini, kad šio augalo šaknų nuoviras irok÷zų (Šiaur÷s Amerikos ind÷nų genties) buvo vartojamas kepenų ir tulžies pūsl÷s ligoms gydyti. [89]
Kanadin÷ jakšūn÷ prad÷ta plačiau tyrin÷ti buvusioje Tarybų Sąjungoje XX a. antroje pus÷je. Paaišk÷jo, kad šis augalas pasižymi stipriu antivirusiniu poveikiu ir iš jo žol÷s buvo pagamintas ir standartizuotas sausasis ekstraktas – Helepinas D. Šio preparato antivirusinis aktyvumas didesnis nei bonaftono bei oksolino ir artimas acikloviro (preparatai „Zovirax“, „Virolex“ ir kt.) aktyvumui. Helepinas D yra 70 kartų mažiau toksiškas už bonaftoną ir 5 kartus mažiau toksiškas už aciklovirą. Jis nepasižymi embriotoksiniu, teratogeniniu, dirginančiu ir alergizuojančiu poveikiu. Klinikiniais tyrimais įrodyta, kad Helepinas D nesukelia pašalinių poveikių ir pasižymi stipriu terapiniu poveikiu gydant dedervinę, įvairios lokalizacijos paprastojo herpes viruso sukeltus (įskaitant lytinių organų ir burnos ertm÷s gleivin÷s) ūmius ir recidyvuojančius susirgimus. [51]
Taip pat nustatytas ir antimikrobinis kanadin÷ jakšūn÷s aktyvumas [85, 86]. Iš jos žol÷s pagamintas preparatas Helepinas D pasižymi mikrobostatiniu poveikiu Escherichia coli ir Bacillus
22
cereus augimui bei mikrobocidiniu Staphylococcus aureus ir Pseudomona aeruginosa veikimu.
[90]
Lieteratūros šaltiniuose minimas ir Helepino D nefroprotekcinis ir inkstų veiklą stimuliuojantis poveikis. [40]
Ištyrus Helepino D imunostimuliuojančias savybes, nustatyta, kad kai kurių iš jų poveikis yra ne silpnesnis už pripažintų ežiuol÷s ar kitų augalinių preparatų poveikį. Paaišk÷jo, kad jis stimuliuoja leukemoidinę reakciją, aktyvina imuninę T sistemą, didina CD4/CD8 limfocitų potipių santykį (tai rodo ir did÷jantį imunin÷s sistemos aktyvumą), aktyvina T ir B limfocitų brendimą centriniuose (čiobrialiauk÷) ir periferiniuose (blužnyje) imunin÷s sistemos organuose (nustatyta remiantis pelių timocitų ir splenocitų skaičiaus kitimu), paj÷gia ne tik atstatyti eksperimentin÷s imunosupresijos sumažintą imunokompetentinių ląstelių skaičių, bet ir jį padidinti, lyginant su kontroline grupe, aktyvina antikūnus sintetinančių ląstelių susidarymą blužnyje ir organizmo humoralinio imuninio atsako formavimąsi. [90]
Atlikti Helepino D įtakos hemagliutinacijos reakcijai tyrimai parod÷, kad šis preparatas kaip ir kiti augalin÷s kilm÷s preparatai gali agliutinuoti kai kurių gyvūnų bei žmogaus eritrocitus. Hemagliutinacinis efektas yra intensyvesnis žmogaus I ir IV kraujo grupių eritrocitams. [90]
Atlikti tyrimai su jūrų kiaulyt÷mis įrodo, kad Helepinas D pasižymi antihistamininiu poveikiu. [90]
Literatūroje minima, kad kanadin÷ jakšūn÷ pasižymi ir centriniu analgetiniu efektu. [87]
2.4.
Efektyvioji skysčių chromatografija
Tarp įvairių metodų, naudojamų medžiagoms atskirti ir kiekybiškai vertinti, svarbią vietą užima chromatografiniai analiz÷s metodai. Terminas „chromatografija“ pasiūlytas šio metodo kūr÷jo M. Cveto. Chlorofilams ir kitiems augaliniams pigmentams atskirti M. Cvetas panaudojo kolon÷lę, pripildytą kieto sorbento (kalcio karbonato). Praplaunant kolon÷lę judančiuoju tirpikliu (petroleteriu) buvo užfiksuotos natūralios pigmentų spalvos chromatografin÷s zonos, tod÷l metodo pavadinimui buvo pavartotas graikų kalbos žodis chromatos, t. y. spalva.
Chromatografija yra fizikin÷s – chemin÷s analiz÷s metodas, pagrįstas junginių išskirstymu d÷l skirtingos mišinio komponentų fizikin÷s – chemin÷s sąveikos su nejudria ir judria faz÷mis. Skirstymo metu bandinio komponentai pasiskirsto tarp nejudrios ir judrios faz÷s. Po atskyrimo juos galima nustatyti kiekybiškai ir kokybiškai. Chromatografin÷s analiz÷s stadijos: bandinio įleidimas, skirstymas, atskirtų analičių detekcija ir gautų duomenų apdorojimas bei įvertinimas.
Chromatografija paplito d÷l atrankumo, paprastumo, analiz÷s atlikimo spartos. Derinant chromatografiją su kitais analiz÷s metodais, galima automatizuoti metodą. Svarbu tai, kad chromatografiniai metodai universalūs, t. y. juos galima taikyti kietiems, skystiems, dujiniams
23 neorganiniams bei organiniams junginiams atskirti ir jų kiekiams nustatyti, be to yra labai platus nustatomųjų medžiagų koncentracijų intervalas.
Šiuolaikin÷ efektyvioji skysčių chromatografija – plačiai paplitusi chromatografijos rūšis. Klasikin÷ kolon÷lin÷ skysčių chromatografija turi nemažai trūkumų: nedidelis eliuento tek÷jimo greitis ir d÷l to l÷tas atskyrimas, atskirtas frakcijas reikia analizuoti kitais metodais. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo atsiradimą l÷m÷ ir tas, kad reik÷jo analizuoti aukštos virimo temperatūros (> 400° C) bei nepatvarius junginius, kurių dujų chromatografija atskirti nepavykdavo. Antra, reik÷jo padidinti skysčių atskyrimo spartą ir efektyvumą. Tam buvo panaudotos mažo vidinio skersmens kolon÷l÷s (2 – 6 mm). Mas÷s mainams padidinti buvo sumažintas sorbento dalelių skersmuo (5 – 50 µm), o tai savo ruožtu privert÷ iki 0,5 – 40 MPa padidinti sl÷gį.
Efektyviojoje chromatografijoje gali būti panaudojami visi chromatografinio atskyrimo mechanizmai: adsorbcija, pasiskirstymas, jonų mainai ir kt. Paprastai atskyrimą sudaro ne vienas mechanizmas, sulaikymui turi įtakos keli, pavyzdžiui, adsorbcija, pasiskirstymas, ekskliuzija ir panašiai. Pagal naudojamų sorbentų rūšį galimi du efektyviosios skysčių chromatografijos variantai: normaliųjų fazių ir atvirkštinių fazių chromatografija. Didelis efektyviosios skysčių chromatografijos pranašumas yra tas, kad galima taikyti izokratinį arba gradientinį eliuavimą ir taip pagerinti junginių atskyrimą.
Efektyvioji skysčių chromatografija yra vienas populiariausių augalų fitochemin÷s analiz÷s metodų.
2.5.
Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Kanadine jakšūne kaip perspektyviu vaistiniu augalu labiau susidom÷ta ir plačiau prad÷tos tyrin÷ti jos farmakologin÷s savyb÷s tik XX amžiaus antroje pus÷je. Geriausiai išnagrin÷tos yra kandin÷s jakšūn÷s antivirusinis aktyvumas ir imunostimuliacin÷s savyb÷s, nustatyta, kad ji pasižymi nefroprotekciniu ir inkstų veiklą stimuliuojančiu, antihistamininiu ir antibakteriniu poveikiais. Tačiau atlikus pagrindinių šio augalo kaupiamų farmakologiškai aktyvių junginių sukeliamų poveikių organizmui apžvalgą, galima manyti, kad kandin÷s jakšūn÷s sukeliamų farmakologinių poveikių spektras greičiausiai yra platesnis, nei nustatyta iki šiol. Tačiau šiam teiginiui pagrįsti būtina atlikti platesnius mokslinius tyrimus ir yra tikslinga taikant naujausius analiz÷s metodus nustatyti augalo fitocheminę sud÷tį ir jos dinamiką vegetacijos tarpsnių metu bei skirtingais augimo metais. D÷l šių priežasčių tęsti kanadin÷s jakšūn÷s fitocheminiai tyrimai šeštaisiais ir septintaisiais augimo metais bei atlikta palyginamoji veikliųjų junginių kiekių kitimų antraisiais – septintaisiais augalo vegetacijos metais analiz÷. Apibendrinus tyrimų rezultatus gali būti pateikiamos optimalios augalin÷s žaliavos rinkimo rekomendacijos
24
3.
TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
Tyrimo objektas: šeštųjų ir septintųjų augimo metų kanadin÷s jakšūn÷s žol÷, lapai, stiebai, ir generatyviniai organai, surinkti skirtingais vegetacijos tarpsniais (vegetacijos, butonizacijos, intensyvaus žyd÷jimo, vaisių brandos pradžios, pilnos vaisių brandos, vegetacijos pabaigos) bei šaknys, iškastos vegetacijos pabaigoje.
Tyrimo metodas: efektyvioji skysčių chromatografija (ESC)
Augalin÷ žaliava susmulkinama iki dalelių, prabyrančių pro 0,355 mm sietą. Atsveriamas 0,500 g (tikslus svoris) susmulkintos žaliavos pavyzdys (iš tos pačios susmulkintos žaliavos ruošiami 3 pavyzdžiai) ir užpilama 25 ml 70 proc. etanolio. Ekstrakcija vykdoma 6 valandas, laikant kambario temperatūroje, tamsioje vietoje.
Gauta ištrauka filtruojama pro popierinį filtrą į 25 ml matavimo kolbą ir praskiedžiama 70 proc. etanoliu iki žym÷s. Veikliųjų junginių nustatymui paimama 2 ml gauto ekstrakto ir filtruojama per membraninį 0,22 µm porų dydžio filtrą („Carl Roth GmbH“, Karlsruhe, Vokietija). 0,2 ml gauto filtrato praskiedžiama 1,8 ml 70 proc. etanolio.
Kiekybinis ir kokybinis flavonoidų nustatymas ESC metodu atliktas naudojant chromatografą Waters 2690 su dviem detektoriais: Waters 2487 UV/Vis ir Waters 996 PDA (Waters, Milford, JAV). Pasirinkta kolon÷le „XTerra RP 18“ (150 x 3,9 mm) su prieškolon÷le, sorbento dalelių dydis 3,5 µm. Nustatymas atliktas prie 360 nm bangos ilgio. Paruošto pavyzdžio buvo paimama po 10 µl ir įvedama į skysčių chromatografą. Eliuento tek÷jimo greitis 0,4 ml/min. Eliuavimas – gradientinis. Eliuentas A – 0,1 proc. trifluoracto rūgšties tirpalas acetonitrile, eliuentas B – 0,1 proc. trifluoracto rūgšties tirpalas vandenyje. Taikytas šis gradiento kitimas: 0 – 45 min 95 proc. – 55 proc. B, 5 proc. – 45 proc. A; 45 – 50 min 55 proc. B, 45 proc. A; 50 – 55 min 55 proc. – 95 proc. B, 45 proc. – 5 proc. A. Tyrimai atlikti kambario temperatūroje. Flavonoidų tapatyb÷ nustatyta palyginus analičių sulaikymo trukmes su standartų sulaikymo trukm÷mis ir spektrais, gautais su diodų matricos detektoriumi (PDA). Kiekybinis biologiškai aktyvių junginių nustatymas atliktas naudojantis kalibravimo kreiv÷mis, kurios sudarytos naudojant penkis kiekvienos analit÷s standarto skiedimus.
25
4.
TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
4.1.
Šeštųjų augimo metų kanadin÷s jakšūn÷s fitocheminio tyrimo
rezultatai ir jų aptarimas
4.1.1. Vegetacijos tarpsnis
Kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je ir atskiruose organuose vegetacijos tarpsniu sukauptų veikliųjų junginių kiekiai yra pateikti 1 lentel÷je.
1 lentel÷. Veikliųjų junginių kiekiai vegetacijos tarpsniu
Kaupiamas junginys
Veikliųjų junginių kiekis, µµµµg/g Žol÷je (X ± S)* Lapuose (X± S) Stiebuose (X± S) Chlorogeno rūgštis 345,55±44,60 365,77±47,46 40,79±26,33 Kavos rūgštis 1062,73±86,80 698,64±133,19 252,54±64,24 Viceninas-2 1752,88±228,81 2197,69±481,88 288,22±154,05 Orientinas ir homoorientinas 8385,50±1084,27 8955,88±1604,95 410,46±218,10 Viteksino ramnozidas 280,81±39,93 21,70±5,58 0,00±0,00 Viteksinas 1088,64±123,04 2919,16±546,45 140,17±9,97 Izoviteksinas 1977,32±318,61 2358,37±436,45 37,09±68,40 Rutinas 1182,55±252,48 1107,75±218,03 95,67±34,51 Hiperozidas 33,15±7,58 25,92±7,54 12,65±22,91 Apigenin-7-glikozidas 100,74±17,59 82,42±15,02 30,13±13,39 Astragalinas 2,71±2,12 0,00±0,00 0,00±0,00 Kvercitrinas 2,97±0,89 0,00±0,00 0,00±0,00 Liuteolinas 0,67±1,17 5,91±0,52 0,00±0,00 Kvercetinas 2,70±0,25 0,00±0,00 0,00±0,00 Apigeninas 4,29±1,32 0,00±0,00 0,00±0,00 Kemferolis 3,18±0,38 0,00±0,00 0,00±0,00 Bendras kiekis 16226,37±2129,89 19495,33±3486,72 1307,70±612,97
* X± S– aritmetinis vidurkis ± vidutinis kvadratinis nuokrypis
Išanalizavus 1 lentel÷je pateiktus duomenis, nustatyta, kad kanadin÷ jakšūn÷ vegetacijos tarpsniu didžiausią veikliųjų junginių suminį kiekį sukaupia lapuose, o mažiausią – stiebuose. Lapuose rastas 1,20 karto didesnis veikliųjų junginių suminis kiekis nei žol÷je ir 14,91 karto didesnis nei stiebuose. Daugiausiai vegetacijos tarpsniu yra sukaupiama orientino ir homoorientino. Šių junginių suminis kiekis sudaro 51,68 proc. visų kaupiamų junginių žol÷je, 45,94 proc. – lapuose ir 31,39 proc. – stiebuose.
Palyginus pagrindinių kaupiamų flavonoidų kiekius žol÷je, lapuose ir stiebuose (22 pav.), nustatyta, kad kanadin÷ jakšūn÷ vegetacijos tarpsnio metu lapuose sukaupia 1,25 karto daugiau vicenino-2 nei žol÷je ir 7,63 karto daugiau nei stiebuose. Orientino ir homoorientino suminis kiekis lapuose nežymiai didesnis nei žol÷je (1,06 karto), tačiau net 21,82 karto didesnis nei stiebuose. Viteksino taip pat daugiausia rasta lapuose: 2,68 karto daugiau nei žol÷je ir 20,83 karto daugiau nei
26 stiebuose. Izoviteksino kiekis tiek lapuose, tiek žol÷je panašus, tačiau jo net 63,58 karto daugiau lapuose nei stiebuose. Rutino šiek tiek daugiau (1,06 karto) aptikta žol÷je nei lapuose. Stiebuose rutino rasta 12,36 karto mažiau nei žol÷je.
22 pav. Vegetacijos tarpsniu kaupiamų pagrindinių flavonoidų kiekiai skirtinguose augalo organuose
Chlorogeno rūgšties žol÷je ir lapuose sukaupta panašūs kiekiai – atitinkamai 345,55 µ g/g ir 365,77 µg/g, tačiau stiebuose jos rasta gerokai mažiau – tik 40,79 µg/g. Kavos rūgšties daugiausiai sukaupta žol÷je: 1,52 karto daugiau nei lapuose ir 4,21 karto daugiau nei stiebuose.
Vegetacijos tarpsniu surinktos žol÷s chromatograma pateikiama 23 paveiksle.
23 pav. Vegetacijos tarpsniu surinktos žol÷s chromatograma: 1 - chlorogeno rūgštis, 2 - kavos rūgštis, 3 –
viceninas-2, 4 – orientinas ir homoorientinas, 5 - viteksino ramnozidas, 6 - viteksinas, 7 - izoviteksinas, 8 - rutinas, 9 - hiperozidas, 10 – apigenin-7-gliukozidas, 11 – astragalinas, 12 – kvercitrinas, 13 – liuteolinas, 14 – kvercetinas, 15 – apigeninas , 16 - kemferolis.
27
4.1.2.
Butonizacijos tarpsnis
Kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je ir atskiruose organuose butonizacijos tarpsniu sukauptų veikliųjų junginių kiekiai yra pateikti 2 lentel÷je. Juos išanalizavus nustatyta, kad butonizacijos kaip ir vegetacijos tarpsniu didžiausias veikliųjų junginių suminis kiekis rastas lapuose, mažiausias – stiebuose. Lapuose jis yra 1,30 karto didesnis nei žol÷je, 14,47 karto didesnis nei stiebuose ir 12,38 karto didesnis nei butonuose. Visuose augalo organuose daugiausiai rasta orientino ir homoorientino. Žol÷je šių dviejų flavonoidų suminis kiekis sudaro 48,27 proc. visų kaupiamų junginių, lapuose – 49,86 proc., stiebuose – 29,40 proc., o butonuose – 21,62 proc.
2 lentel÷. Veikliųjų junginių kiekiai butonizacijos tarpsniu
Kaupiamas junginys
Veikliųjų junginių kiekis, µµµµg/g Žol÷je (X ± S) Lapuose (X ± S) Stiebuose (X± S) Butonuose (X ± S) Chlorogeno rūgštis 477,22±146,95 508,38±64,32 49,02±6,27 50,57±3,53 Kavos rūgštis 1145,44±28,58 933,37±23,77 407,23±28,19 215,42±2,35 Viceninas-2 2140,45±54,97 2711,26±112,21 226,59±74,13 390,40±32,09 Orientinas ir homoorientinas 8704,17±156,19 11657,07±394,31 459,12±37,78 408,42±6,23 Viteksino ramnozidas 354,83±9,76 54,13±16,89 0,00±0,00 14,95±0,99 Viteksinas 1985,18±207,22 2951,79±161,61 134,25±73,70 221,58±22,54 Izoviteksinas 1554,47±433,62 2925,82±130,37 6,83±135,26 42,29±2,50 Rutinas 1537,86±132,64 1082,74±39,02 180,62±98,34 252,66±62,70 Hiperozidas 40,30±46,85 22,21±1,54 69,93±22,23 33,68±23,52 Apigenin-7-glikozidas 47,55±66,14 95,07±3,14 27,85±15,40 96,45±75,29 Astragalinas 4,06±5,13 0,00±0,00 0,00±0,00 63,64±90,00 Kvercitrinas 35,85±1,05 34,66±30,02 0,00±0,00 22,26±4,04 Liuteolinas 0,88±0,41 6,11±0,74 0,00±0,00 20,42±0,49 Kvercetinas 0,99±1,71 10,85±9,35 0,00±0,00 33,56±0,47 Apigeninas 3,57±0,86 0,00±0,00 0,00±0,00 22,97±1,05 Kemferolis 1,13±1,95 0,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00 Bendras kiekis 18033,94±683,68 23381,79±878,65 1561,43±111,64 1889,25±315,68
Palyginus pagrindinių kaupiamų flavonoidų kiekius žol÷je, lapuose, stiebuose ir butonuose (24 pav.), nustatyta, kad kanadin÷ jakšūn÷ butonizacijos tarpsniu vicenino-2 lapuose sukaupia 1,27 karto daugiau nei žol÷je, 11,97 karto daugiau nei stiebuose ir 6,94 karto daugiau nei butonuose. Orientino ir homoorientino daugiausiai rasta lapuose ir žol÷je (atitinkamai 11657,07 µg/g ir 8704,17 µg/g), o stiebuose ir butonuose jų suminis kiekis žymiai mažesnis – atitinkamai 25,39 ir 28,54 karto – lyginant su lapais. Viteksino taip pat daugiausia rasta lapuose: 1,49 karto daugiau nei žol÷je, 21,99 karto daugiau nei stiebuose ir 13,32 karto daugiau nei butonuose. Izoviteksino kiekis lapuose 1,88 karto didesnis nei žol÷je, tačiau butonuose jo aptikta net 69,18 karto mažiau nei lapuose, o stiebuose rasti tik p÷dsakai (6,83 µ g/g). Rutino kaip ir vegetacijos tarpsniu daugiau aptikta žol÷je nei lapuose (1,42 karto). Stiebuose ir butonuose jo rasta atitinkamai 8,51 ir 6,09 karto mažiau nei žol÷je.
28 24 pav. Butonizacijos tarpsniu kaupiamų pagrindinių flavonoidų kiekiai skirtinguose augalo organuose
Chlorogeno rūgšties, lyginant visus tirtus augalo organus ir žolę, butonizacijos tarpsniu daugiausiai sukaup÷ lapai (508,38 µg/g), kavos rūgšties – žol÷ (1145,44 µg/g). Abiejų fenolinių rūgščių kiekiai lapuose ir žol÷je panašūs, tačiau jų gerokai mažiau rasta stiebuose ir butonuose.
Butonizacijos tarpsniu surinktų lapų chromatograma pateikiama 25 paveiksle.
25 pav. Butonizacijos tarpsniu surinktų lapų chromatograma: 1 - chlorogeno rūgštis, 2 - kavos rūgštis, 3 -
viceninas-2, 4 – orientinas ir homoorientinas, 5 - viteksino ramnozidas, 6 - viteksinas, 7 - izoviteksinas, 8 - rutinas, 9 - hiperozidas, 10 – apigenin-7-gliukozidas, 11 – kvercitrinas, 12 – liuteolinas, 13 - kvercetinas.
29
4.1.3. Žyd÷jimo tarpsnis
Kanadin÷s jakšūn÷s žol÷je ir atskiruose organuose žyd÷jimo tarpsniu sukauptų veikliųjų junginių kiekiai yra pateikti 3 lentel÷je.
3 lentel÷. Veikliųjų junginių kiekiai žyd÷jimo tarpsniu
Kaupiamas junginys
Veikliųjų junginių kiekis, µµµµg/g Žol÷je ( X ± S) Lapuose ( X ± S) Stiebuose ( X ± S) Žieduose ( X ± S) Chlorogeno rūgštis 393,77±79,31 544,58±155,17 65,55±20,65 240,35±110,05 Kavos rūgštis 1006,09±166,34 857,00±47,11 733,85±74,91 339,28±120,78 Viceninas-2 1641,21±354,87 2467,62±128,56 331,60±6,69 1646,44±47,78 Orientinas ir homoorientinas 4837,68±984,51 9746,56±644,36 880,63±95,05 974,32±143,08 Viteksino ramnozidas 269,18±77,38 71,56±8,57 0,00±0,00 328,36±49,32 Viteksinas 1522,28±333,12 2180,39±151,67 217,20±14,40 1392,46±239,97 Izoviteksinas 1177,58±294,34 2247,96±132,48 31,46±4,60 274,84±36,31 Rutinas 1522,72±376,81 819,51±59,19 305,28±33,27 3715,13±780,29 Hiperozidas 492,11±180,46 26,88±4,72 44,32±38,39 2215,09±320,00 Apigenin-7-glikozidas 1038,43±401,11 60,22±9,73 42,31±27,27 4619,78±43,40 Astragalinas 130,09±53,82 8,65±7,53 14,98±4,41 7251,97±1142,02 Kvercitrinas 107,61±18,28 89,52±11,55 0,00±0,00 462,87±82,76 Liuteolinas 2,35±1,09 0,00±0,00 4,26±0,52 23,12±5,80 Kvercetinas 1,34±2,32 0,00±0,00 11,72±0,22 199,66±50,06 Apigeninas 2,53±0,76 0,00±0,00 10,32±9,05 0,00±0,00 Kemferolis 1,13±1,02 0,00±0,00 0,00±0,00 624,44±66,02 Bendras kiekis 14146,11±3312,73 19571,51±1158,99 2693,47±217,26 24308,12±3861,21
Išnagrin÷jus 3 lentel÷je pateiktus duomenis, nustatyta, kad žyd÷jimo tarpsniu didžiausias veikliųjų junginių suminis kiekis rastas žieduose – 24308,12µg/g, o lyginant vegetatyvinius augalo organus, išlieka ta pati tendencija kaip ir ankstesniais vegetacijos tarpsniais – lapuose randamas didžiausias veikliųjų junginių suminis kiekis, o stiebuose – mažiausias. Lapuose nustatytų veikliųjų junginių suminis kiekis yra 1,38 karto didesnis nei žol÷je, 17,27 karto didesnis nei stiebuose ir 1,24 karto mažesnis nei žieduose. Žol÷je, lapuose ir stiebuose daugiausiai rasta orientino ir homoorientino: žol÷je jų suminis kiekis sudaro 34,20 proc. visų kaupiamų junginių, lapuose – 49,80 proc., stiebuose – 32,69 proc.
Palyginus pagrindinių kaupiamų flavonoidų kiekius įvairiuose kanadin÷s jakšūn÷s organuose (26 pav.), nustatyta, kad vicenino-2, orientino, viteksino ir izoviteksino lapuose sukaupta daugiausiai, o stiebuose mažiausiai. Vicenino-2 lapuose sukaupta 1,50 karto daugiau nei žol÷je ir žieduose ir 7,44 karto daugiau nei stiebuose. Orientino ir homoorientino stiebuose ir žieduose sukaupta gerokai mažiau nei lapuose – atitinkamai 11,07 ir 10,00 kartų. Viteksino lapuose rasta 1,43 ir 1,57 karto daugiau nei atitinkamai žol÷je ir žieduose, tačiau stiebuose jo rasta net 10,04 karto mažiau nei lapuose. Izoviteksino kiekis lapuose 1,91, 71,45 ir 8,18 karto didesnis nei atitinkamai
