LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Augustas Bieliauskas
BROILERIŲ MUSCULUS PECTORALIS MAJOR MIOPATIJOS PRIEŽASTYS IR PATOMORFOLOGINĖ ANALIZĖ
ETIOLOGICAL AND PATHOMORFOLOGICAL ANALYSIS OF BROILER MUSCULUS PECTORALIS MAJOR MYOPATHY
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr. Alius Pockevičius
2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas:
„BROILERIŲ MUSCULUS PECTORALIS MAJOR MIOPATIJOS PRIEŽASTYS IR PATOMORFOLOGINĖ ANALIZĖ“:
1. yra atliktas mano paties.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros vedėjo vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS... 7 1. ... LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 1.1 Anatomija ... 91.2 Krūtinės raumenų histologinė struktūra ... 9
1.3 Dažniausiai aptinkamos krūtinės raumenų patologijos paukštynuose. ... 10
1.4 Fibrozė ... 10
1.5 „Kietos krūtinėlės“ (m. pectoralis major) miopatija ... 11
1.6 „Baltųjų juostelių“ miopatija ... 12
1.7 Aplinkos veiksnių įtaka broilerių raumenų augimui ... 12
1.8 Stresas ... 13
2. ... TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 14
3. ... TYRIMO REZULTATAI ... 20
3.1 „Kietos krūtinėlės“ miopatijos makroskopinis tyrimas ... 20
3.2 Skerdenų svorių analizė ... 23
3.3 Histopatologinio tyrimo rezultatai naudojant „Olympus BX 41“ mikroskopą ... 24
3.4 Histopatologinio tyrimo rezultatai naudojant „Olympus BX 63“ mikroskopą ... 25
3.5 Histomorfometrinio tyrimo rezultatai ... 30
3.6 Apklausos rezultatai ... 32 4. ... REZULTATŲ APTARIMAS... 33 IŠVADOS ... 35 REKOMENDACIJOS ... 36 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 37 PRIEDAI ... 40 PADĖKA ... 41
4 BROILERIŲ MUSCULUS PECTORALIS MAJOR MIOPATIJOS PRIEŽASTYS IR
PATOMORFOLOGINĖ ANALIZĖ Augustas Bieliauskas
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Sparčiai augantiems broileriams raumenų patologijos pasireiškia labai dažnai, todėl nukenčia bendras paukščių sveikatingumas, sumažėja gaunamos produkcijos kiekis, patiriami ekonominiai nuostoliai. Didžiausi raumenys broilerio kūne – krūtinės (m. pectoralis). Jie sudaro didžiąją broilerio skerdenos masę. Kertinė paukštininkystės problema pripažįstama „kietos krūtinėlės“ miopatija. Dažnai į skerdyklą patenka paukščiai, turintys standžią krūtinėlę. Didelė dalis tokios produkcijos lieka nerealizuota dėl pakitusių savybių, kurios netinkamos vartotojų rinkai. Norint spręsti problemos priežastis, būtina žinoti jos etiologiją.
Šiame darbe analizuojama „kietos krūtinėlės“ (m. pectoralis major) miopatija. Tyrimo metu apklausti paukštynai, išanalizuotas patologijos pasireiškimo dažnis „X paukštyno skerdykloje“. Savarankiškai atlikta 30000 broilerių krūtinės raumenų poskerdiminių apžiūrų, paimta 30 patologinių ir 5 sveiki mėginiai. Iš surinktų mėginių parengti histologiniai preparatai, nudažyti hematoksilinu ir eozinu. LSMU VA Patologijos centro laboratorijoje atlikti 35 histologiniai tyrimai. Duomenys susisteminti ir išanalizuoti.
Tyrimo rezultatai rodė, kad ištyrus 30000 broilerių, nustatyti 1298 patologijai teigiami miopatijos atvejai, kurie sudaro 4,66 proc. tirtų paukščių. Išanalizavus m. pectoralis major patomorfologinius pokyčius nustatyta, kad tirtuose 30 mėginių dažniausiai vyrauja 2 balų „kietos krūtinėlės“ miopatija, priskirta 60 proc. mėginių. Mikroskopuojant, dažniausiai pastebimos degeneruotos raumenų skaidulos. Atlikus histomorfometrinę analizę, gauti duomenys, jog sergančiųjų „kietos krūtinėlės“ miopatija, histopatologiniai preparatai turi santykinai didesnį kiekį jungiamojo audinio, negu tirtų sveikų (p<0,05). Sveikų broilerių analizės metu ištirta, kad raumeninis audinys dominuoja jungiamojo atžvilgiu (p<0,05). Įvertinti veiksniai, galintys sąlygoti patologijų pasireiškimą, tai neproporcingas svorio augimas, stresas.
5 ETIOLOGICAL AND PATHOMORFOLOGICAL ANALYSIS OF BROILER MUSCULUS
PECTORALIS MAJOR MYOPATHY Augustas Bieliauskas
Master’s Thesis
SUMMARY
Broilers with excessive growth rate apt to have muscle related pathologies. Since these myopathies occur quite often general health of birds is affected. Decreasing poultry sale rates result in distributors economic losses. The largest muscles in a broiler are breast muscles (m. pectoralis major). They form the biggest mass of carcass. One of the most common problems in the global poultry industry is the wooden breast myopathy. The anomaly is observed when birds arrive to a slaughterhouse. A lot of broilers tend to have hard breast muscles. Large portion of production becomes useless because of damaged poultry quality which doesn‘t meet consumer indicated standards. In order to alter the main cause of the global problem we should know it‘s etiology.
Wooden breast disease (broiler musculus pectoralis major myopathy) is analysed in this master‘s thesis. A survey has been carried in which the occurrence rate of the pathology in "slaughterhouse X" was evaluated. Post-mortem evaluation of breast muscles has been carried out in 30000 broiler carcasses. Out of 35 samples selected 30 contained myopathy-positive specimens while 5 were clinically healthy. The study data was systemized and analyzed.
The study of 30000 broilers resulted in 1298 myopathy-positive carcasses that comprised 4.66 % of all analyzed cases. During the pathomorphological analysis of m. pectoralis major it was discovered that 30 pathological specimens contained of type-2 wooden breast disease. While inspecting microscopically degenerated muscle fibres (18 of 18 occured) were observed. Meanwhile histomorphometrical analysis showed that wooden breast disease-positive specimen, in comparison with clinically healthy, had a larger portion of connective tissue than muscular (p<0,05). In healthy broiler analysis information was attained that muscular tissue dominates over connective one (p<0,05). This thesis also evaluates various factors significant to the occurrence of breast muscle myopathy. The main cause of this pathology is excessive growth rate and stress.
6
SANTRUMPOS
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. VA – Veterinarijos akademija
Proc. – procentai d. – dienų
Žr. – žiūrėti
Temp. – temperatūra Angl. – anglų kalba M. – musculus – raumuo
M. pectoralis major – didysis krūtinės raumuo M. pectoralis minor - mažasis krūtinės raumuo
M. pectorales superficiales – paviršiniai krūtinės raumenys M. supracoracoideus – antvarnakaulinis raumuo
Canallis triosseus – trikaulis kanalas
IBM "SPSS" – statistinės analizės programa „IBM SPSS Statistics“
MS Excel - Microsoft Office programų paketo elektroninė skaičiuoklė „Microsoft Office Excel“ „Kieta krūtinėlė“ – kietos konsistencijos m. pectoralis major miopatija
7
ĮVADAS
Didėjant žmonių skaičiui pasaulyje, atitinkamai didėja maisto poreikis (1). Pagrindinį žmogaus racioną sudaro mėsa (2). Žvelgiant globaliai, pagal 2013 m. statistinius duomenis, kiekvienas asmuo per metus vidutiniškai suvartojo 15 kilogramų paukštienos (3). Didėjant mėsos suvartojamam kiekiui, maisto pramonė stengiasi neatsilikti, siekia patenkinti vartotojų poreikius. Šie veiksniai lemia, kad auginama vis daugiau mėsinės paskirties paukščių – broilerių (4,5). Paukštienos kokybės standartus darosi vis sunkiau išlaikyti (6,7). Didėjant laikomų paukščių skaičiui, išauga rizika tarp jų plisti infekcinėms ligoms, padidėja traumų rizika, dažniau pasireiškia paukščių lėtinių ligų. Laikomasi griežtos biosaugos – vykdomos ligų prevencijos programos, taikomos moderniausios auginimo technologijos, vykdoma paukščių selekcija (8,9).
Šiuo metu vis daugėja atliekamų mokslinių tyrimų, susijusių su broilerių mėsos kokybe. Norint ją tirti, verta analizuoti, kokie padariniai lemia gaunamos paukštienos produkcijos kokybę. Mokslininkai ne viename straipsnyje pateikia svarbius duomenis, rodančius, jog spartus paukščių augimas gali būti žalingas broilerių sveikatai. Skerdyklos produkcijos kontrolės metu randama vis daugiau paukščių, turinčių „kietos krūtinėlės“ (m. pectoralis major) sindromą. Fiksuojama ir įvairių kitų patologijų: taškinės kraujosruvos, jungiamojo audinio išvešėjimas krūtinėlės paviršiuje, giliųjų krūtinės raumenų miopatija (m. pectoralis minor) (10). Stebimas dėsningumas, susijęs su broilerio dydžiu: kuo stambesnis broileris, tuo dažniau turi vieną ar kitą produkcijos kokybę mažinančią patologiją (11).
Broileriams sparčiai augant, kyla rizika išsivystyti patologijoms. Spartaus augimo išprovokuotos nepalankios organizmo reakcijos pažeidžia išorinę paukščio struktūrą, vidaus organus, raumenis. Skerdyklų produkcijos kokybės kontrolės metu, nemaža skerdenos dalis išbrokuojama, kita – utilizuojama, dar kita priskiriama prie šalutinių gyvūninių produktų. Šiandienos veterinarijos gydytojas – maisto higienos inspektorius turi rasti priežastį dėl ko ši problema kyla ir kaip ją būtų galima išspręsti. Laikantis geros praktikos taisyklių, visuomenę pasiekia tik saugus maistas, tačiau verta tirti, kodėl kyla nepalankios reakcijos mūsų vartojamų paukščių organizmuose. Kadangi ši sparčiai auganti problema atsirado neseniai, dar nežinomas tokios mėsos poveikis žmogaus organizmui. Vartotojas gali suvartoti paukštienos, kurios raumeninėse dalyse jau gali būti pasireiškusi ankstyvoji patologinė reakcija, nepasižyminti ryškiais klinikiniais požymiais (10).
Temos aktualumas apima visas sveikatingumo kontrolės grandis. Veterinarijos gydytojams svarbu užtikrinti gyvūnų gerovės standartus, broilerių sveikatą, saugios, kokybiškos produkcijos tiekimą visuomenei. Augintojams svarbu rasti prastėjančios produkcijos kokybės priežastį, sumažinti
8 finansinius nuostolius, kuriuos lemia brokuota produkcija. Nuo šių suinteresuotų grupių pastangų darnos priklauso visos visuomenės sveikata.
Darbo tikslas: įvertinti m. pectoralis major miopatijos priežastis ir atlikti patomorfologinę analizę.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti m. pectoralis major miopatijos dažnumą, atliekant tyrimą skerdykloje. 2. Išanalizuoti m. pectoralis major miopatijos morfologinius pokyčius.
3. Atliekant histomorfometrinę analizę, įvertinti m. pectoralis major skaidulinio jungiamojo ir raumeninio audinio kiekį miopatijos atveju.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Anatomija
Paukščių krūtinės raumenys yra itin gerai išsivystę. Broilerių krūtinėlės mėsa vadinama „baltąja mėsa“. Ji taip vadinama, nes šie broilerių raumenys mažai aktyvūs, tinkami tik trumpiems, neefektyviems judesiams - plasnojimams. Kai kurių paukščių veislių krūtinės raumenys sudaro net 20 procentų ar daugiau kūno svorio. M. pectoralis superficialis raumuo kyla nuo krūtinkaulio dalies (Angl. Keel) ir varnakaulio, tiesiai nukeliauja į žastikaulio dorsalinio tuberkulo ventralinį paviršių. Šio raumens susitraukimas lemia stiprius paukščio plasnojimus, ypač grįžtant jiems į pradinę padėtį (nuleidžiant sparnus). Mažesnis raumuo supracoracoideus taip pat prasideda nuo krūtinkaulio ir varnakaulio. Jo sausgyslė yra nukreipta dorsaliai pro canallis triosseus ir tuomet pro šlaunikaulio galvutę priartėja prie savo antagonisto. Šis raumuo atsakingas už paukščio pakilimą iš vietos, tačiau ne už patį skrydį. Norint nustatyti paukščio bendrą sveikatos būklę, rutiniškai palpuojami m. pectoralis major. Į krūtinės raumenis leidžiami vaistai, kai kontraindikuotina vaistams patekti į vidaus ertmes. Neteisinga injekcija į kranialinę krūtinės raumens dalį gali sukelti mirtiną kraujavimą – hemoragiją (12).
1.2 Krūtinės raumenų histologinė struktūra
Griaučių ruožuotasis raumuo (textus
muscularis striatus skeletalis) sudarytas iš
parenchimos ir stromos. Parenchimos funkcinę dalį sudaro griaučių miocitai (myocytus skeletalis), o stromą – kolageninis jungiamasis audinys (textus connectivus collagenosus). Ruožuotuose raumenyse yra somatinių nervinių skaidulų, nervinių galūnėlių ir riebalinių ląstelių. Į raumens, kaip funkcinio organo, sudėtį įeina griaučių miocitai, kolageninis jungiamasis audinys, vienalašės riebalinės ląstelės, kraujagyslės, limfagyslės nervai ir jų galūnėlės. Griaučių miocitai būna padengti puriuoju kolageniniu 1 pav. Raumeninio audinio struktūra
https://biologydictionary.net/wp- content/uploads/2017/12/Muscle-Fibers.jpg
10 jungiamuoju audiniu (textus connectivus collagenosus laxus), raumenyse išsidėsto lygiagrečiai vienas kito. Iš šių dalių formuojasi įvairių skirstymų pirminiai ir antriniai raumeniniai pluošteliai (fasciculi musculares).
Raumens paviršiaus visumą dengia netaisyklingojo glaudžiojo kolageninio jungiamojo audinio kapsulė, vadinama epimiziumu (epimysium). Nuo epimiziumo išsišakoja plonos pertvaros, vadinamos endomiziumu (endomysium) (13,14). Į jo sandarą įeina retikulinių skaidulų tinklas ir griaučių miocitus gaubianti pamatinė membrana. Visos jungiamojo audinio pertvaros susijungia tarpusavyje ir sudaro vientisą tinklą. Kiekviename griaučių ruožuotame raumenyje aptinkama aferentinių (nervinės raumeninės, nervinės sausgyslinės verpstės), eferentinių (nervinės raumeninės, nervinių raumeninės verpstės galūnėlių) ir nervinių galūnėlių. Griaučių ruožuotųjų raumenų ribos tęsiasi iki sausgyslių, kurios tvirtinasi prie kaulų, siūlių, antkaulio ar tikrosios odos glaudžiojo kolageninio jungiamojo audinio (14).
1.3 Dažniausiai aptinkamos krūtinės raumenų patologijos paukštynuose.
Pasaulio mokslininkai, mėsos kokybės inspektoriai pastebi vis didėjantį nekokybiškos paukščių krūtinėlės produkcijos kiekį. Analizuojant bendrąsias patologijas, labiausiai paplitę yra šios: „kietos krūtinėlės“ miopatija, jungiamojo audinio išvešėjimas krūtinėlės paviršiuje („Baltųjų juostelių“ miopatija), giliųjų krūtinės raumenų miopatija. Manoma, jog šios ligos tarpusavyje susijusios, tačiau mokslininkams patvirtinti ar paneigti šiuos faktus dar nepakanka informacijos. Patologijų kontrolė lemia produkcijos realizavimo kiekius bei vartotojų sveikatą. Visuomenei ir augintojams rūpi svarbiausi klausimai – produkcijos kokybė ir finansinė nauda (15).
1.4 Fibrozė
Tai patologinis procesas, kuris pasireiškia skaidulinio jungiamojo audinio išvešėjimu. Tokia patologija įprastai pastebima, kuomet pažeidžiamos audinių struktūros. Po sužalojimo audinių ląstelės ima atstatinėti pažeidimo vietą, vyksta natūralus procesas – gijimas. Traumos vietoje ima daugintis jungiamojo audinio ląstelės, didėja kolageno kiekis (16). Itin sparčiai vystantis broilerių krūtinės raumenims, pasireiškia „kietos krūtinėlės“ miopatija. Ši patologija mikroskopiškai regima kaip jungiamojo audinio išvešėjimas raumens epimiziume. Skirtingose patologijos stadijose pastebimi atskiri patologiniai procesai, vienas iš jų – fibrozė. Pastebima tendencija, kad kuo ūmesnė miopatijos eiga, tuo didesnė raumeninio audinio fibrozė (10). Histologiniuose preparatuose
11 pastebimos uždegiminės ląstelės: heterofilai, limfocitai, tai indikuoja apie kitos patologijos (nekrozės) pradžią. Vyksta sparti miodegeneracija, suyra miofibrilės. Fibrozės proceso paveiktas broileris makroskopiškai pasižymi: pabalimu, padidėjusiu krūtinėlės kietumu, sustorėjimu, pastebimas eksudatas raumens paviršiuje (17,18).
1.5 „Kietos krūtinėlės“ (m. pectoralis major) miopatija
„Kietos krūtinėlės“ patologija (Angl. – wooden breast disease) dažniausiai pastebima sparčiai raumenis vystančiose broilerių veislėse (specifinės mėsinės veislės, kurios selekcionuojamos greitam krūtinės raumenų augimui). Miopatija pasireiškia standžia didžiojo krūtinės raumens (musculus pectoralis major) konsistencija. Palpuojant jaučiama standi raumeninė masė, raumenys itin dideli, gerai išsivystę, lyginant su kitų broilerių raumenimis (19). Ši produkcijos vertę mažinanti miopatija pasižymi jungiamojo audinio išvešėjimu kranialinėje krūtinėlės dalyje, stambiausioje raumens vietoje. Broileriai augimo metu nepasižymi išskirtiniu elgesiu ar ligų simptomatika. Paukščiai darniai auga pulkuose, o sulaukę 35-45 d. amžiaus, skerdžiami. Moksliniai tyrimai genomo, lyties, vitamino E ir seleno atžvilgiu neatskleidė priežasties, dėl ko kyla patologija (10,20-22).
Kaupiami tyrimų duomenys rodo, jog spartus augimas tankiose paukštidėse gali lemti patologijos pasireiškimą. Makroskopiškai m. pectoralis major pažeidimų vietos charakterizuojamos kaip lėtinė raumenų degeneracija su intersticine edema ir jungiamojo audinio sankaupomis (fibrozė) (21,23). Ši patologija pasižymi bendra išorine charakteristika su „baltųjų juostelių“ miopatija. Diagnozuojant šiuos sutrikimus dažniausiai pastebimos blyškios, baltos juostelės įsiterpusios tarp raumenų skaidulų. Mikroskopiškai „kietos krūtinėlės“ patologijos specifinių bruožų negalime išskirti iš kitų raumenų miopatijų.
Broileriui augant, sparčiai jungiantis miofibrilėms, gali neužtekti esamo kraujagyslių kapiliarų tinklo raumenų aprūpinimui deguonimi. Silpnėjant kapiliarinei kraujotakai - nepakankamai efektyviai šalinamos medžiagų apykaitos produktai. Šių procesų rezultatas - hipoksija, organizmas stimuliuojamas kurti naujus kraujagyslių tinklus. Genų žymenys, histomorfologiniai tyrimai indikuoja, jog sparčiai augančių broilerių krūtinės raumenys patiria hipoksiją (23,24). Sąlygojami raumeninio audinio pakitimai (19).
12 1.6 „Baltųjų juostelių“ miopatija
Įprastai ši patologija (Angl. – white striping) pasireiškia didelio svorio broileriams. Miopatija pasižymi specifine morfologija – m. pectoralis paviršiuje matomos daugybinės jungiamojo audinio juostelės. Ši struktūra lemia raumenų skaidulų atsidalijimą. Patologija nesusijusi su sisteminėmis ligomis ar uždegimu, kylančiais stresinėse situacijose. Pastebėti pakilę serumo rodikliai: kreatinkinazė (CK), alanino aminotransferazė (ALT), aspartato aminotranferazė (AST), laktato dehidrogenazė (LDH). Kai audinio pažeidimai įvyksta staigiai ar tolygiai, o bandymai pataisyti raumenų pažeidimus nepavyksta, raumeninio audinio satelitinės ląstelės virta į fibroblastus ar adipocitus. Atsiradus šioms ląstelėms, išsivysto audinio fibrozė ir lipidozė (25). Nors manoma, kad „baltųjų juostelių“ patologija žmonių sveikatai grėsmės nekelia, tačiau didelis produkcijos kiekis išbrokuojamas (10). Išoriškai matome blyškias m. pectoralis išsiskaidžiusias raumenines skaidulas. Raumenys praranda savo struktūrinį vientisumą. Kertine patologijos priežastimi laikomas per greitas broilerių užauginimas iki kada pasiekia realizacijai reikalingą svorį. Sparčiai augant raumeniniam audiniui, skaiduloms jungiantis tarpusavyje, įvyksta raumens augimo klaidų. Nepakankamai greitas medžiagų įsisavinimas lemia audinių trapumą. Pateikiama literatūros šaltinių, jog šios patologijos priežastimi gali būti nepakankamas vitamino E ir seleno įsisavinimas, dažnas plasnojimas sparnais (dėl karščio, streso) (25). Pastebimas dėsningumas, jog ši liga dažnai pasireiškia kartu su „kietos krūtinėlės“ liga. Mokslininkai linkę manyti, jog šios ligos yra susijusios tarpusavyje ir jas vienija bendra priežastis – per daug spartus raumens masės augimas (10,15,20,23,25).
1.7 Aplinkos veiksnių įtaka broilerių raumenų augimui
Pagrindinis broilerių industrijos siekis – efektyviai parduodama vištiena. Siekiant šio tikslo, svarbu kiek įmanoma sumažinti gamybos nuostolius ir gauti maksimalų mėsos kiekį. Kokybiškiems mėsos gaminiams reikalinga speciali darbų schema, kad būtų užtikrinami maisto higienos reikalavimai bei išlaikoma produkcijos gamybos sparta. Prieš patenkant broileriams į skerdyklą, jie turi būti užauginti iki prekybai tinkamo svorio standarto. Paukščiai atskiriami pagal amžių, pagaunami, uždaromi į narvelius, šeriami kol priauga tinkamą svorį, transportuojami ir galiausiai iškraunami skerdyklose. Skerdyklose broileriai pakabinami kojomis į viršų ant specialių metalinių fiksatorių, apsvaiginami, nukraujinami, nupešamos plunksnos, pašalinami vidaus organai. Tuomet skerdenos keliauja bendra skerdimo linija, patikrinami dėl ligų, atvėsinami, suskirstomi pagal kokybės klases ir supakuojami. Dėl sudėtingo produkcijos auginimo ir kokybės kontrolės proceso,
13 kai kurie faktoriai gali lemti skerdenos kokybę. Skerdenos išeigos mažėjimą sąlygoja įvairios ligos, paukščių susižalojimai tarpusavyje ar prieš skerdžiant, netinkamai sureguliuota skerdyklos įranga, žmonių klaidos gamybiniame procese (26,27).
1.8 Stresas
Paukščiai, laikomi uždarose patalpose, yra itin jautrūs aplinkos veiksniams. Pasikeitęs personalas, rutininių darbų režimas gali staigiai sukelti visuotinę paniką pulkuose. Broileriai negeba skraidyti, tačiau plasnodami sparnais gali šiek tiek atsiplėšti nuo žemės paviršiaus. Fermose, sutrikus ventiliacijai ar padidėjus lauko temperatūrai, jie ima bėgioti bei plasnoti (15). Broileriai neturi gerai išvystytų prakaito liaukų. Aplinkoje padidėjus santykinei drėgmei, paukščiai negeba išsklaidyti sukauptą šilumą organizme. Plasnoja sparnais, sutrinka įprasta hormoninė veikla, sumažėja pašaro įsisavinimo indeksas (28).
Pakitus šviesos šaltiniui ar paros metui, paukščiai taip pat patiria didžiulį stresą. Mokslininkų atlikto tyrimo duomenys parodė, kad vien pasikeitus šviesos spalvai paukščiai stresavo, broilerių organizme buvo didelis heterofilų ir limfocitų santykis (29). Kitas tyrimas patvirtino gautus rezultatus, nustatyta, kad broileriai laikomi paukštynuose, kuriuose įrengtas dirbtinis „LED“ lempų apšvietimas patiria mažesnį stresą nei kituose, kur naudojami „CFL“ tipo apšvietimo įrenginiai (30). Broileriai patiria daug streso vykdant paukščių „atgaudymus“, transportuojant, kintant dirbančiam personalui, vykdomai infekcinių ligų prevencijai – vakcinuojami broileriai (18). Aplinkoje gausu triukšmą sukeliančių veiksnių: ventiliatoriai, vaikštantis personalas, kiti darbui naudojami prietaisai. Dokumentuota, kad kinta biocheminiai parametrai tų broilerių, kuriuos veikia garsinis stresas. Pastebimas padidėjęs cholesterolio kiekis, bendras baltymų skaičius (31).
14
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Tyrimai buvo atlikti 2019 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Patologijos centre ir „X“ paukštyno skerdykloje. Savarankiškai atlikta 30000 broilerių krūtinės raumenų poskerdiminių apžiūrų, norint identifikuoti „kietos krūtinėlės“ miopatiją. Patologijos centro laboratorijoje atlikti 35 histopatologiniai tyrimai. 30 mėginių tirta šviesiniu mikroskopu „Olympus BX 41“, 35 mėginiai tirti naudojant histologinę vaizdinės diagnostikos sistemą su mikroskopu „Olympus DP72 BX 63“. Išsiųsta apklausa (1. priedas) keturiems broilerius tiekiantiems paukštynams. Duomenys susisteminti ir išanalizuoti.
2 pav. Tyrimo schema Broilerių krūtinės raumenų palpacija ir duomenų fiksavimas. (n=3000) Pasirinktinai atrinkti broileriai su pasireiškusia patologija. (n=30) Kontrolinei grupei sudaryti, parinkti kliniškai sveiki broileriai (n=5) Chirurginiu skalpeliu paimti raumeninio audinio mėginiai. Netraumuojant audinių, mėginiai įmerkti į mėgintuvėlius, užpildytus 10 proc. formalino tirpalu. Suteiktas unikalus serijos numeris atsekamumui. Pateikta anoniminė anketa elektroniniu paštu skerdžiamo paukščių pulko savininkui. (1 Priedas) Mėginiai pristatyti į LSMU Veterinarijos akademijos Patologijos centrą ir laikyti apie savaitę laiko, kad
raumenys gerai fiksuotųsi formalino tirpale. Paruošti histologiniai mėginiai. (n=35) Histologiniai mėginiai mikroskopuoti. Duomenys interpretuoti. (n=30) Kompiuterinės analizės programos pagalba, nustatytas jungiamojo audinio procentinis kiekis mikropreparate. (n=35) Duomenys fiksuoti, lygintas raumeninio audinio procentinis kiekis
su jungiamojo audinio procentine išraiška mikropreparate. Duomenys interpretuoti naudojant statistinės analizės programas. (IBM "SPSS" ir MS Excel).
15 Tyrimas buvo vykdomas individualiai, atskirai įvertintas kiekvienas atvežtų broilerių pulkas. Broilerių skerdenoms keliaujant skerdimo linija, palpuojant m. pectoralis major, vertinta broilerių krūtinės raumenų konsistencija. Paspaudus raumenis įvertinamas kietumas, jei raumuo itin sunkiai įspaudžiamas, tai priskiriamas m. pectoralis major miopatijai. Gauti duomenys buvo dokumentuoti (patologijai teigiami atvejai žymimi „+“). Tyrimas vykdytas paukščių skerdykloje „X“, analizuojami duomenys pateikti iš paskerstų 4 paukštynų broilerių. Dokumentuota 10 atskirų broilerių pulkų. Duomenys grupuoti pagal tirtus paukštynus ir jų pristatytus pulkus. Iš kiekvieno paukštyno buvo tirta po du atskirus pulkus po 3000 paukščių. Paukštynų duomenys išskirstyti pagal raides „A“, „B“, “C“, „D1“, „D2“. Visų paukštynų duomenų imtys buvo lygios 6000 paukščių, išskyrus „D1“ ir „D2“ (n=12000), duomenys gauti iš to paties paukštyno. Tyrimo imtis lygi 30000, analizuoti 4 paukštynų broileriai. Elektroniniu paštu išsiųsta anoniminė anketa paukštynų (paskerstų broilerių) veiklos kuratoriams.
Keliaujant produkcijos linijai pirmyn, atrinkta miopatijai teigiama paukščių skerdena. Atskirame veterinarijos gydytojo – inspektoriaus kabinete paimti m.pectoralis mėginiai į mėgintuvėlius, užpildytus 10 proc. formalino tirpalu. Pasirinktinai broileriai pasverti analoginėmis svarstyklėmis (10 miopatijai prisikirtų skerdenų, 10 sveikų). Histologinei analizei paimti 5 sveiki raumenų pjūviai bei 30 su patologija.
Patologinė medžiaga buvo supjaustyta, padarytas skersinis ir išilginis pjūviai, sudėta į plastiko kasetes ir 24 valandas plauta šaltu tekančiu vandeniu, kad būtų išplautas iš audinių 10 proc. formalino tirpalas. Toliau kasetės su patologine medžiaga sudėtos į audinių įmirkymo procesorių „Shandon Pathcentre, USA“, kuriame patologinė medžiaga dehidratuota 2 - 3 valandas 60º, 80º ir 96º stiprumo etilo alkoholyje bei 1 - 3 valandas izopropanolio alkoholyje. Skaidrinimas atliktas chloroforme 1 - 3 val. Po dehidratavimo ir skaidrinimo, patologinė medžiaga po 1 - 3 val. impregnuota parafinu A, B, C, D. Visas procesas truko 24 val. Pasibaigus automatiniam audinių paruošimo etapui, tiriamieji mėginiai įlieti į parafininius blokus, naudojant audinių įliejimo įrangą „Tes 99“.
Parafininis blokelis su patologine medžiaga atvėsintas ant šaldomo stalelio, kad įgytų reikiamą mėginio tvirtumą. Iš suformuotų parafininių blokų, 4 μm storio parafininiai audinių pjūviai (mikropjūviai) pjaustomi, naudojant „Sakura Accu-Cut® SRM™“ pusiau automatinį rotacinį mikrotomą. Atpjautas pjūvis adatėlių pagalba perneštas į 37 ºC temp. termostatinę vandens vonelę ir pjūvis ištiesintas. Parafininių pjūvių juosta vandens vonelėje ištiesinta ir padalinta individualiais pjūviais, kurie vėliau perkelti ant objektinio stiklelio. Objektinis stiklelis su pjūviu perkeltas 5 val. ant reguliuojamos kaitinimo plokštės „Thermo Scientific Hotplate“, kurios temp. 37 ºC. Vėliau objektiniai stikleliai sudėti į termostatą „Binder“ 24 val. 37 ºC temp.
16 Po 24 val. išdžiūvę termostate parafininiai audinių pjūviai nudažyti, naudojant histologinių pjūvių automatizuoto dažymo įrenginį „Sakura Tissue-Tek® DRS™“. Mėginiai buvo nudažyti baziniais (hematoksilinas) ir rūgštiniais (eozinas) dažais bei nuskaidrinti ksilenu. Pirmiausia, norint pašalinti parafiną iš mėginių, jie buvo automatiškai įmerkti į ksileną 13 minučių. Tada pjūvis dehidratuotas izopropanolio alkoholiu 2 minutes ir 96° etilo alkoholiu, papildomai 4 minutes. Prieš dažymą šiuo įrenginiu, skalauta vandeniu, kuris išstumia alkoholį. Tolimesniame etape pjūvis dažytas hematoksilinu 10 minučių, merktas į vandenį 5 minutėms, 96° etilo alkoholį 2 minutėms ir vėl į vandenį 5 minutėms. Eozinu dažytas 5 minutes ir vėl merktas į vandenį 1 minutei. Po dažymo įrenginys automatiškai pjūvius dehidratavo 96° etilo alkoholiu 1 min. ir izopropilio alkoholiu 1 min. Galutinis etapas – pjūviai skaidrinti ksilenu - 1 min.
Po mėginių nudažymo, objektiniai stikleliai padengti ilgalaikio saugojimo dengiamąja terpe „Thermo Shandon Consul-Mount histology formulatio“ ir ant jų uždėti itin ploni dengiamieji stikleliai, prispausti specialia adatėle, siekiant pašalinti po stikleliu esančius oro burbuliukus. Mėginiai suženklinti, nurodant mėginio paruošimo metus ir tų metų eilės numerį (Pvz.: S19 042 XX).
Paruošti histologiniai mėginiai buvo analizuojami „Olympus BX63“ šviesiniu mikroskopu. Vertintas visas histopreparato plotas. Stebėti audinių ir ląstelių pokyčiai. Pagal veiksnius, sąlygojančius m. pectoralis major miopatijos atsiradimą, išskirta patologinės eigos klasifikacija. Duomenys vertinti skalėje nuo 1 iki 3. 1 – lengva (patologinio proceso pradžia), 2 – vidutinio sunkumo (prasidėjęs miodegeneracinis procesas), 3 – sunki (miopatijai teigiamas broileris, akivaizdi audinių degeneracija, išvešėjęs jungiamasis audinys). Analizuota 30 histologinių preparatų (tik miopatijai teigiami broileriai). Patologijai specifiški parametrai, kurie pastebėti mikroskopo matymo lauke: fibrozė, nekrozė, kraujosruvos, degeneruotos raumeninės skaidulos, riebalinės ląstelės, heterofilai, limfocitai.
17 3 pav. 1 balu įvertintas histologinis preparatas.x40 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu
4 pav. 2 balais įvertintas histologinis preparatas. x40 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu Jungiamasis audinys Degeneruotos raumeninės skaidulos Riebalinio audinio ląstelės Heterofilų, limfocitų infiltracija Jungiamasis audinys Degeneruotos raumeninės skaidulos Nekrozės židinys
18 5 pav. 3 balais įvertintas histologinis preparatas. x40 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu
Tyrimui buvo naudoti 35 paruošti histopreparatai. 30 su m. pectoralis major „kietos krūtinėlės“ miopatija ir 5 sveikų broilerių preparatai. Mikroskopuojamo vaizdo nuotraukos užfiksuotos, naudojant histologinių vaizdų analizatorių „Olympus DP72 BX63“. Naudojant įtaiso programinę įrangą „OLYMPUS cellSens Dimension“, atlikti histomorfometriniai tyrimai. Pirmiausia, užfiksuota patologijos analizei reikšminga vieta, realaus laiko vaizdas sustabdytas. Padaryta fotografija. Kitas veiksmas apima fotografijos įkėlimą į vaizdinės analizės sistemą. Programine įranga charakterizuotas raumeninis ir skaidulinis jungiamasis audiniai. Raumeninis audinys pažymėtas mėlyna spalva, o jungiamasis – geltona (6 pav.). Rankiniu būdu fiksuotos tikslios audinių ribos. Galiausiai, programine įranga išmatuotas procentinis audinių pasiskirstymas histopreparate. Duomenys dokumentuoti raštu.
Degeneruotos raumeninės skaidulos Išvešėjęs jungiamasis audinys Heterofilų, limfocitų infiltracija
19 6 pav. Audinių skirstymas histomorfometriniam tyrimui
Analizės metu gauti duomenys išanalizuoti, naudojant „IBM SPSS Statistics“ ir „Microsoft Excel 2016“ programą. Statistinis patikimumas įvertintas, naudojant chi kvadrato, Stjudento testą, skaičiuotas tarpusavio veiksnių Pearsono koreliacijos koeficientas. Duomenys laikyti patikimais, kai p<0,05, nepatikimais, kai p>0,05. Apskaičiuotos gautų duomenų išraiškos ir palygintos tarpusavyje.
20
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 „Kietos krūtinėlės“ miopatijos makroskopinis tyrimas
Ištyrus 30000 broilerių, nustatyti 1298 patologijai teigiami atvejai (organoleptiškai nustatyta, kad krūtinėlė kieta, užfiksuoti duomenys buvo dokumentuoti raštu). Gauti duomenys pateikti procentine išraiška diagramoje. Analizuoti paukštynai (A,B,C,D) (7. pav.)
7 pav. Patologijos pasiskirstymas tarp individualių paukštynų
Tyrimų duomenys parodo, jog paukštyne „A“ pasitaikė daugiausiai patologijai teigiamų atvejų (34 proc.), 447 broileriai pasižymėjo kieta krūtinėle (p< 0,05). Mažiausiai patologijai teigiamų atvejų identifikuoti paukštyne D2 (9 proc.) ir C (18 proc.) (p<0,05).
34 proc.
19 proc.
18 proc.
20 proc.
9 proc.
A B C D1 D221 8 pav. Miopatijai teigiamas atvejis
Išoriškai matomi įsitempę broilerio krūtinės raumenys, įtempta oda (8 pav.). Krūtinės viduryje, ties krūtinkauliu, ant odos išryškėjusios nedidelės kraujosruvos. Kitų patologiją indikuojančių simptomų nematome.
9 pav. Miopatijai teigiamas atvejis, nuėmus krūtinėlę dengiančią odą
(9 pav.) Matome edemišką raumenų dalį ties krūtinkauliu. Kairiajame krūtinėlės šone regime taškines kraujosruvas. Raumenų ruožuotumas padidėjęs, ryškūs tarpai tarp raumeninių skaidulų,
Edemiška zona Taškinės kraujosrūvos Išvešėjęs jungiamasis audinys Kraujosruvos
22 išvešėjęs jungiamasis audinys. Galime teigti, kad yra pasireiškusi „baltųjų juostelių“ miopatija. Palpuojant, krūtinėlė itin kieta. Tokio tipo broileriai patenka į mūsų rinką. Praėjus ilgesniam periodui po skerdimo, itin sparčiai pakeičiama raumenų spalva (pilkšvėja), tampa patogiškai minkšta per itin greitą laiko tarpą. Visapusiškai prastėja prekinė išvaizda, sutrumpėja fasuoto produkto tinkamumo vartoti laikas, suprastėja skoninės savybės.
23 3.2 Skerdenų svorių analizė
Iš paukštyno „A“ buvo atrinkti broileriai su „kieta” krūtinėle (n=10) ir sveiki (n=10) svorių palyginimui (10 pav.). Broileriai buvo pasverti, svarstyklių duomenys dokumentuoti. Analizės duomenys rodo, kad sveiki broileriai (raudona žymė) daugeliu atvejų buvo mažesnio svorio, nei miopatijai teigiami (mėlyna žymė). Duomenys statistiškai patikimi (p<0,05).
10 pav. Svorio palyginimas: sveikų broilerių su sergančiais "kietos krūtinėlės“ miopatija
Pagal tyrimo duomenis, nustatyta, kad 9 iš 10 tirtų broilerių, kuriems pasireiškusi patologija, pasižymėjo didesniu skerdenos svoriu nei sveiki. Tik vienos sveikos skerdenos svoris pranoko patologinio broilerio svorį (Žr. 10 pav. 3 palyginimo grupę). Sveiko broilerio svoris siekė 2,04 kg, sergančio - 1.998 kg (skirtumas – 2,059 proc.).
2,276 2,364 1,998 2,152 2,031 2,39 2,283 2,08 2,165 2,421 1,97 2,03 2,04 1,86 2,01 1,94 1,831 2,01 1,962 1,89 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Broilerių svoris (kg) Sveiki Sergantys
24 3.3 Histopatologinio tyrimo rezultatai naudojant „Olympus BX 41“ mikroskopą
Tyrimui naudoti 30 histopatologinių preparatų. Tyrimo metu išanalizuotas visas mikropreparato plotas ir įvertintas audinių struktūrų pasiskirstymas. Duomenys suskaičiuoti ir pavaizduoti diagramoje (11 pav.).
11 pav. Histopatologinio tyrimo duomenys
Atlikus analizę, pagal duomenis matome, kad daugiausia tiriamų sergančių broilerių atvejų buvo 2 balų vertės. Histopatologiniuose preparatuose daugiausiai pastebėta degeneruotų skaidulų – 18 histopreparatų. Vienodumu pasižymėjo 13 tirtų mėginių – nustatytas toks pat fibrozės ir nekrozės išvešėjimo laipsnis. 2 balų grupėje pastebėta mažiausiai kraujosruvų, aptikta tik dviejuose preparatuose. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
1 Balas 2 Balai 3 Balai
25 3.4 Histopatologinio tyrimo rezultatai naudojant „Olympus BX 63“ mikroskopą
Tyrimui buvo naudoti 35 histopreparatai, paimti iš „X“ paukštyne paskerstų broilerių krūtinės raumenų. Atlikta morfologinė analizė, histomorfometriniu metodu išskirtas procentinis audinių pasiskirstymas mikropreparate. Tyrimas atliktas, vertinant raumeninio ir jungiamojo audinio santykį. Analizės duomenys parodė, jog sergančiųjų „kietos krūtinėlės“ liga mikropreparatai turi santykinai didesnį kiekį jungiamojo audinio, negu tirtų sveikų (p<0,05).
12 pav. Skersinis m. pectoralis major pjūvis (Kliniškai sveiki broileriai). x40 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu
Raumeninio audinio ląstelės
26 13 pav. Išilginis pjūvis (Kliniškai sveiki broileriai) x40 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu
Fotografijose (12, 13 pav.) matyti, kad preparatuose aiškiai išreikštos miofibrilės. Tarpai tarp jų tolygiai užpildyti puriuoju kolageniniu jungiamuoju audiniu. Audinių santykis tolygus, raumeninis audinys nustelbia jungiamąjį.
14 pav. Skersinis m. pectoralis major pjūvis (miopatijai teigiami broileriai).
x40 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu Jungiamasis audinys Raumeninio audinio skaidulos Degeneruotos raumeninio audinio skaidulos, atrofija Riebalinio audinio infiltracija Jungiamojo audinio išvešėjimas, fibrozė Plazmocitų, limfocitų, heterofilų infiltratai
27 Skersinio pjūvio vaizde (14 pav.) matyti skirtingo dydžio miofibrilės. Kai kurių sarkoplazma vakuolėta. Endomiziumas išplėstas skaidrių tuščių ertmių. Keletas miofibrilių paveiktos nekrozės, pastebėta heterofilų infiltracija. Išvešėjęs jungiamasis audinys, ūmi fibrozė.
15 pav. Skersinis m. pectoralis major pjūvis (miopatijai teigiami broileriai). x100 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu
Histopatologiniame preparate (15 pav.) matoma daugiažidininė raumeninių skaidulų degeneracija, limfocitų infiltracija bei dalinė audinio fibrozė.
Degeneruotos raumeninio audinio skaidulos, atrofija Jungiamojo audinio išvešėjimas, fibrozė Plazmocitų, limfocitų, heterofilų infiltratai Riebalinio audinio infiltracija
28 16 pav. Musculus pectoralis major miopatija. x200 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu
Skersinio pjūvio vaizde (16 pav.) matomos skirtingo dydžio raumenų skaidulos. Endomiziumas išplėstas skaidrių tuščių ertmių, pastebėti heterofilai. Keletas raumeninių skaidulų paveiktos nekrozės, pastebėta heterofilų infiltracija. Histopatologinio preparato centre išvešėjęs jungiamasis audinys.
17 pav. M. pectoralis major miopatija, išilginis pjūvis. x200 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu Degeneruotos raumeninio audinio skaidulos, atrofija Jungiamojo audinio išvešėjimas, fibrozė Plazmocitų, limfocitų, heterofilų infiltratai Miofibrilių nekrozė Vakuolėta sarkoplazma
29 Histopreparate (17 pav.) regime limfocitų infiltraciją, raumeninių skaidulų degeneraciją, epimiziumo išsiplėtimą – užpildymą jungiamuoju audiniu.
18 pav. M. pectoralis major miopatija. x200 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu
Paveiksle (18 pav.) matome daugybinę riebalinio audinio infiltraciją, pastebimas didžiulis adipocitų kiekis. Jungiamasis audinys išvešėjęs. Pastebima didžiulė limfocitų infiltracija intersticiniame audinyje. Matomas akivaizdus miodegenaracinis procesas raumeninių skaidulų struktūroje. (19 pav.) Pastebime raumeninio audinio skaidulų nekrozę, heterofilus, limfocitus.
19 pav. M. pectoralis miopatija. Nekrozė ir fibrozė. x200 padidinimas. Dažyta hematoksilinu ir eozinu Riebalinio audinio infiltracija Raumeninio audinio skaidulų nekrozė Heterofilai Didžiulė limfocitų infiltracija išsiplėtusiame intersticiniame audinyje
30 3.5 Histomorfometrinio tyrimo rezultatai
20 pav. Sveikų broilerių raumeninio ir jungiamojo audinio palyginimas
Remdamiesi stulpelinės diagramos (20 pav.) duomenimis, galime teigti, kad sveikų paukščių raumeninis audinys daugeliu atvejų nustelbia jungiamąjį audinį. Daugiausiai raumeninio audinio užfiksuota 5 histopreparate – 73,59 proc., mažiausiai – 4 – 37,43 proc.
21 pav. Sergančių „kietos krūtinėlės" miopatija jungiamojo ir raumeninio audinio palyginimas (1-15 histopatologiniai preparatai) 29,08 36,1 26,66 49,79 13,88 63,04 44,04 61,59 37,43 73,59 92,12 80,14 88,25 87,22 87,47 0% 20% 40% 60% 80% 100% 1 2 3 4 5
Visas matuojamo histologinio preparato plotas proc. Raumeninis audinys proc.
31 22 pav. Sergančių „kietos krūtinėlės" miopatija jungiamojo ir raumeninio audinio palyginimas
(16-30 histopatologiniai preparatai)
Analizuojant sergančiųjų audinius (21, 22 pav.) pastebėta, kad jungiamasis audinys dominuoja raumeninio audinio atžvilgiu. Didžiausias jungiamojo audinio kiekis užfiksuotas trečiame histopreparate (79,12 proc.), mažiausias 26 – 28.55 proc. Gausiausias raumeninio audinio kiekis užfiksuotas 26 histologiniame preparate – 77,05 proc., mažiausias 12 – 23,67 proc.
32 3.6 Apklausos rezultatai
Buvo sudarytos anoniminės anketos, skirtos įvertinti paukščių laikymo sąlygas, siekiant sužinoti, dėl ko gali pasireikšti krūtinės raumenų miopatijos. Išsiųstos 4 anketos tirtiems paukštynams (paukštynai: A,B,C,D.). Tyrimui aktualiausi respondentų duomenys pateikti lentelėje (1 lentelė).
PAUKŠTYNAI: A B C D
1. Laikomų broilerių skaičius
paukštidėje 30000 33000 30000 30000
2. Išperėtų viščiukų tiekėjas "VP" "VP" "VP" "VP" 3. Duodami papildai vitamino
E ir seleno TAIP TAIP NE TAIP
4. Patiriamas stresas TAIP TAIP TAIP NE
5. Stresorius Ferminis stresas, šviesa, pašaras, vakcinacija, garsiai veikiantys ventiliatoriai. Išgąstis, staigi temperatūrų kaita. Nenurodė. Nenurodė.
6. Laikomų paukščių tankis
paukštidėje (m2) 18,5 18 19 19
1 lentelė. Anketų duomenys
Pagal gautus anketų duomenis, galime teigti, kad daugeliu aspektų laikymo sąlygos nesiskyrė, broileriai buvo laikyti nuo 30000 iki 33000 paukščių pulkuose. Išperėtų viščiukų tiekėjas buvo tas pats – „Vilniaus paukštynas“. Vitamino E ir seleno preparatai buvo duoti visuose ūkiuose, išskyrus paukštyną „C“. Duomenis apie broileriams sukeltą stresą pateikė visi apklaustieji. Stresas patiriamas visuose paukštynuose, išskyrus „D“. Anketos respondentas teigia, kad paukščiai, jų laikymo sąlygomis, nepatiria streso. „A“ ir „B“ konstatavo, kokie pagrindiniai stresoriai vyrauja jų aplinkoje. „A“ teigia, kad jų broileriams didžiausią stresą lemia fermos sukeltas stresas, šviesos kaita, pašaras, vakcinacija, garsiai veikiantys ventiliatoriai. „B“ atsako, kad jų pagrindinės streso priežastys yra broilerių išgąstis, staigi temperatūrų kaita patalpose. „C“ ir „D“ ūkiai nepateikė informacijos apie galimus stresorius. Prižiūrimų paukščių tankis paukštidėje vyravo nuo 18 iki 19 (m2).
33
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Išanalizavus tiriamų 30000 broilerių duomenis, pastebėtas „kietos krūtinėlės“ ligos dažnumas. Iš tirtų 4 paukštynų, nustatyti 1398 teigiami miopatijos atvejai, kurie sudaro 4,66 proc. tirtų paukščių. Tai lemia finansinius nuostolius paukščių augintojams. Didelė produkcijos dalis nepatenka į vartotojų rinką. Trumpėjant broilerių augimo laikui, ši patologija pasitaiko vis dažniau. Nežinomi ilgalaikiai padariniai sveikatai, vartojant subklinikinės išraiškos broilerių mėsą (1,5,20).
Pagal skerdenos tyrimo duomenis, nustatyta, kad 9 iš 10 tirtų broilerių su pasireiškusia patologija pasižymėjo didesniu skerdenos svoriu nei sveiki. Tik vienos sveikos skerdenos svoris pranoko patologinio broilerio svorį (Žr. 10 pav. 3 palyginimo grupę). Vidutinis tirtų sveikų broilerių svoris buvo 1,95 kg, o sergančių – 2,22 kg. Remiantis šiais duomenimis, galime daryti prielaidą, kad miopatijai teigiami (musculus pectoralis major miopatija) broileriai yra didesnės masės, lyginant su sveikais paukščiais (13,17,20).
Histopatologinio tyrimo rezultatai šviesiniu mikroskopu rodo, kad tirtuose 30 mėginių dažniausiai vyrauja 2 balų miopatijos, priskirta 18 mėginių. Mikroskopuojant, dažniausiai pastebimos degeneruotos raumenų skaidulos, 60 proc. atvejų. 13 mėginių (43 proc.) matymo lauke aptikta daugiažidininė nekrozė bei fibrozė. Mažiausiai pastebėta kraujosruvų – 2 histopatologiniuose preparatuose. Nekrozės židiniai, fibrozė bei degeneruotos raumeninės skaidulos indikuoja aktyvų patologijos vystymąsi (10). Gauti duomenys rodo, kad tiriama „kietos krūtinėlės“ patologija nesustoja ties antra vystymosi faze, progresuoja. Palaipsniui pastebimi vis didėjantys tarpai tarp miofibrilių, didėjantys nekrozės židiniai, jungiamasis audinys ima užimti vis didesnį plotą (15,32).
Histomorfometriniu metodu atlikta vaizdinė analizė, išskirtas procentalus audinių pasiskirstymas mikropreparate. Gauti duomenys parodė, jog sergančiųjų „kietos krūtinėlės“ miopatija, mikropreparatai turi santykinai didesnį kiekį jungiamojo audinio negu tirtų sveikų (p<0,05). Sveikų broilerių analizės metu ištirta, kad raumeninis audinys dominuoja jungiamojo atžvilgiu (p<0,05). Šie duomenys įrodo, jog „kietos krūtinėlės“ sindromas neigiamai veikia struktūrines raumenų dalis – miofibriles. Vešėjantis jungiamasis audinys suteikia nepatrauklų „baltųjų juostelių“ ligos įspūdį. Ilgainiui šie procesai supanašėja ir apsijungia. Histologinės analizės metu regimi itin dideli tarpai tarp miofibrilių, pastebimi nekrozės židiniai, heterofilų infiltracija, suardytos, degeneruotos raumenų skaidulos (32).
Surinkti anketų duomenys indikuoja, kad paukštynuose vyrauja panašios laikymo sąlygos. Vitamino E ir seleno preparatai buvo duodami visuose ūkiuose, išskyrus paukštyną „C“, tai gali lemti
34 didesnį „kietų krūtinėlių“ skaičių (23). Visi paukštininkystės ūkiai, išskyrus paukštyną „D“, nurodė, kad jų laikymo sąlygomis, broileriai patiria stresą. Neigiamai veikiama paukščių psichika, skatinama panika, plasnojama sparnais. Išsigandę paukščiai dažniau patiria traumas (susižaloja bėgdami nuo stresoriaus), prasčiau įsisavina teikiamus pašarus, maisto papildus. Šie veiksniai predisponuoja broilerių miopatijų atsiradimą ir skatina tolimesnį patologinio proceso vystymąsi. „A““ paukštyno respondentai pateikė duomenis, kad jų laikymo sąlygomis stresą sukelia: „ferminis stresas, šviesa, pašaras, vakcinacija, garsiai veikiantys ventiliatoriai.“. Pagal šiuos duomenis galime išskirti, kad paukščius veikia beveik visų rūšių stresas: darbuotojų kaita, apšvietimo pokyčiai (29), kintanti pašaro sudėtis, išgąstis - vakcinacija bei garsinis dirgiklis – ventiliatorius. Galima daryti prielaidą, kad labiausiai streso veikiami paukščiai pasižymėjo didžiausiu diagnozuotos krūtinės raumenų patologijos skaičiumi – 447 (34 proc.). Paukštyne „B“ taip pat rasta stresinių veiksnių ir išskirta: „išgąstis, staigi temperatūrų kaita.“. Šie veiksniai taip pat gali lemti didelį m. pectoralis major patologijų skaičių. Broileriai patiria karščio stresą, jeigu neužtikrinama pakankama ventiliacija, taip pat teigiama, kad aplinkoje gali būti kitų veiksnių, galinčių sukelti paukščiams išgąstį. Mėsinės paskirties paukščiai yra itin jautrūs karščio stresui, nes turi nedidelį kiekį prakaito liaukų. Kada temperatūra ir paukštidės oro santykinė drėgmė aplinkoje viršija paukščių fiziologines ribas, jie praranda gebėjimą efektyviai išsklaidyti sukauptą šilumą. Šis rodiklis lemia fiziologinius pokyčius organizme, sutrinka hormoninė veikla ir sumažėja suvartojamo pašaro kiekis (28). „D“ paukštynas pateikė duomenis, kad jų laikymo sąlygomis broileriai nepatiria streso. Sprendžiant iš gautų makroskopinės analizės rezultatų, galime daryti prielaidą, kad jeigu paukščių aplinkoje nėra streso šaltinio, rečiau pasireiškia „kietos krūtinėlės“ miopatija, paukštynas D2 (9 proc.) – 113 diagnozuotų atvejų.
35
IŠVADOS
1. Įvertintas „kietos krūtinėlės“ m. pectoralis major patologijų dažnumas skerdykloje. Ištyrus 30000 broilerių, nustatyti 1298 patologijai teigiami miopatijos atvejai, kurie sudaro 4,66 proc. tirtų paukščių. 2. Išanalizavus m. pectoralis major morfologinius pokyčius, nustatyta, kad tirtuose 30 mėginių dažniausiai vyrauja 2 balų „kietos krūtinėlės“ miopatija, priskirta 18 mėginių. Mikroskopuojant, dažniausiai pastebimos degeneruotos raumenų skaidulos, 60 proc. atvejų.
3. Atlikus histomorfometrinę analizę, gauti duomenys parodė, jog sergančiųjų „kietos krūtinėlės“ miopatija histopatologiniai preparatai turi santykinai didesnį kiekį jungiamojo audinio, negu tirtų sveikų (p<0,05). Sveikų broilerių analizės metu ištirta, kad raumeninis audinys dominuoja jungiamojo atžvilgiu (p<0,05).
4. Įvertinti veiksniai, galintys sąlygoti patologijų pasireiškimą, tai staigus broilerio svorio augimas, stresas. Vidutinis tirtų sveikų broilerių svoris buvo 1,95 kg, o sergančių – 2,22 kg, tai 12,16 proc. skirtumas (p<0,05).
36
REKOMENDACIJOS
1. Mažinti stresą broilerių aplinkoje.
2. Vykdyti tolimesnius tyrimus, norint nustatyti tikslesnius pirminio pažeidimo atvejus. 3. Tirti problemos sprendimo būdus, neilginant paukščių auginimo laikotarpio.
4. Ieškoti optimalaus laikotarpio, kad raumenys spėtų išsivystyti be rizikos susiformuoti struktūriniams pažeidimams.
37
LITERATŪROS SĄRAŠAS
(1) Ghafoor A, Badar H, Hussain M, Tariq N. An empirical estimation of the factors affecting demand and supply of poultry meat. Pak.Vet.J 2010;30(3):172-174.
(2) Daniel CR, Cross AJ, Koebnick C, Sinha R. Trends in meat consumption in the USA. Public Health Nutr 2011;14(4):575-583.
(3) Ritchie H, Roser M. Meat and Dairy Production. Our World in Data 2019.
(4) Mottet A, Tempio G. Global poultry production: current state and future outlook and challenges. Worlds Poult Sci J 2017;73(2):245-256.
(5) Petracci M, Berri C. Poultry quality evaluation: quality attributes and consumer values. Oxford: Woodhead Publishing; 2017. p. 18.
(6) Henchion M, McCarthy M, Resconi VC, Troy D. Meat consumption: Trends and quality matters. Meat Science 2014;98(3):561-568.
(7) Saeed M, Abbas G, Alagawany M, Kamboh AA, Abd El-Hack ME, Khafaga AF, et al. Heat stress management in poultry farms: A comprehensive overview. Journal of Thermal Biology 2019;84:414-425.
(8) Mullens BA, Murillo AC. Advances in Poultry Welfare: The future of poultry pest management. Woodhead Publishing; 2018;295-321.
(9) Meunier M, Guyard-Nicodème M, Dory D, Chemaly M. Control strategies against Campylobacter at the poultry production level: biosecurity measures, feed additives and vaccination. J Appl Microbiol 2016;120(5):1139-1173.
(10) Kuttappan VA, Hargis BM, Owens CM. White striping and woody breast myopathies in the modern poultry industry: a review. Poultry Science 2016;95(11):2724-2733.
(11) Ozmen O. Pathological examination of deep pectoral myopathy in house reared broilers. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 2017;23(5).
(12) Dyce KM, Sack WO, Wensing CJG. Textbook of veterinary anatomy. 4th ed. St. Louis, Mo.: Saunders/Elsevier; 2010. p. 792-793.
(13) Cunningham JG, Klein BG. Cunningham's textbook of veterinary physiology. St. Louis, Mo.: Elsevier/Saunders; 2013. p. 68-74.
(14) Padaiga A, Vitkus A. Bendroji histologija. Kaunas: Lietuvos veterinarijos akademija; 2002. p.182-193.
(15) Petracci M, Cavani C. Muscle Growth and Poultry Meat Quality Issues. Nutrients 2012;22;4(1):1-12.
38 (16) Ciba Foundation Symposium. Fibrosis. In: Evered D, Whelan J, editors. Somerset: John Wiley & Sons, Incorporated; 2008. p. 1.
(17) Sihvo HK, Immonen K, Puolanne E. Myodegeneration With Fibrosis and Regeneration in the Pectoralis Major Muscle of Broilers. Vet Pathol 2014;(3):619-623.
(18) Kawasaki T, Iwasaki T, Yamada M, Yoshida T, Watanabe T. Rapid growth rate results in remarkably hardened breast in broilers during the middle stage of rearing: A biochemical and histopathological study. PLoS One 2018;13(2):e0193307.
(19) Wang Y, Yang Y, Pan D, He J, Cao J, Wang H, et al. Metabolite profile based on 1H NMR of broiler chicken breasts affected by wooden breast myodegeneration. Food Chemistry 2019.
(20) Chen LR, Suyemoto MM, Sarsour AH, Cordova HA, Oviedo-Rondón EO, Wineland M, et al. Temporal characterization of wooden breast myopathy (“woody breast”) severity and correlation with growth rate and lymphocytic phlebitis in three commercial broiler strains and a random-bred broiler strain. Avian Pathol 2019;48(4):319-328.
(21) Sihvo HK, Airas N, Lindén J, Puolanne E. Pectoral Vessel Density and Early Ultrastructural Changes in Broiler Chicken Wooden Breast Myopathy. Journal of Comparative Pathology 2018;161:1-10.
(22) Saeed M, Abbas G, Alagawany M, Kamboh AA, El-Hack MEA, Khafaga AF, et al. Heat stress management in poultry farms: A comprehensive overview. Journal of Thermal Biology 2019;84:414-425.
(23) Sihvo HK, Lindén J, Airas N, Immonen K, Valaja J, Puolanne E. Wooden Breast Myodegeneration of Pectoralis Major Muscle Over the Growth Period in Broilers. Vet Pathol 2017;(1):119-128.
(24) Mutryn MF, Brannick EM, Fu W, Lee WR, Abasht B. Characterization of a novel chicken muscle disorder through differential gene expression and pathway analysis using RNA-sequencing. BMC Genomics 2015;16(399):6-19.
(25) Huang X, Ahn DU. The Incidence of Muscle Abnormalities in Broiler Breast Meat - A Review. Korean journal for food science of animal resources 2018;38(5):835-850.
(26) Leeson S, Summers JD. Chapter 8: Management of adult breeders Broiler Breeder Production. Nottingham: Nottingham University Press; 2010. p. 280-306.
(27) Svobodová I, Borilová G, Hulánková R, Steinhauserová I. Microbiological quality of broiler carcasses during slaughter processing. Acta Veterinaria Brno 2012;81(1):37-42.
(28) Song DJ, King AJ. Effects of heat stress on broiler meat quality. Worlds Poult Sci J 2015;71(4):701-709.
(29) Rogers AG, Pritchett EM, Alphin RL, Brannick EM, Benson ER. II. Evaluation of the impact of alternative light technology on male broiler chicken stress. Poultry Science 2015;94(3):331-337. (30) Huth JC, Archer GS. Comparison of Two LED Light Bulbs to a Dimmable CFL and their Effects on Broiler Chicken Growth, Stress, and Fear. Poultry Science 2015;94(9):2027-2036.
39 (31) Chloupek P, Voslárová E, Chloupek J, Bedánová I, Pišteková V, Vecerek V. Stress in Broiler Chickens Due to Acute Noise Exposure. Acta Veterinaria Brno 2009;78(1):93-98.
(32) Abdul-Aziz T, Fletcher OJ, Barnes HJ, Shivaprasad HL, Swayne DE, Riddell C. Avian histopathology: Muscular system. American Association of Avian Pathologists; 2016. p. 115-131.
40
PRIEDAI
1 priedas. Apklausos anketa „Broilerių musculus pectoralis major miopatijos priežastys ir patomorfologinė analizė“
Anketa
Esu Lietuvos sveikatos mokslų universiteto veterinarijos medicinos VI kurso studentas Augustas Bieliauskas. Rašau baigiamąjį magistro darbą tema: „Broilerių musculus pectoralis major miopatijos priežastys ir patomorfologinė analizė“. Norėdamas įvertinti miopatijų pasireiškimą bei jų galimas atsiradimo priežastis, būčiau labai dėkingas, jei atsakytumėte į anketoje pateiktus klausimus. Jūsų atsakymai bus naudojami tik magistro darbo analizėje. Dėkoju už atsakymus.
1. Broilerių skaičius, laikomas paukštidėje „X“
2. Iš kur yra perkami išperėti viščiukai (koks tiekėjas)? 3. Ar broileriai gauna papildomai vitamino E ir seleno? A. Taip;
B. Ne;
4. Ar yra veiksnių, galinčių sukelti paukščiams didelį stresą, dėl kurio paukščiai stipriai plasnotų sparnais ir aktyviai judėtų dėl stresoriaus?
A. Taip; B. Ne;
5. Koks stresorius?
41
PADĖKA
Širdingai dėkoju žmonėms, padėjusiems parengti šį magistro baigiamąjį darbą: baigiamojo darbo vadovui prof. dr. Aliui Pockevičiui už pagalbą atliekant tyrimą, reikalingų priemonių suteikimą, apmokymus, baigiamojo darbo gaires ir korekcijas. LSMU Patologijos centro darbuotojui, veterinarijos gydytojui Tomui Gudui, už suteiktą pagalbą ruošiant histologinius mėginius, taip pat Žanai Balčiauskienei - analizei reikiamų sąlygų suteikimą, visapusę pagalbą tyrimo metu, tarpininkavimą bendraujant su paukštynų atstovais.
