LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
GYVULININKYSTöS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTAS
Jūrat÷ Antanavičien÷
Karvių genomo nestabilumo ryšys su pieno produktyvumu
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. dr. Natalija Makštutien÷
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas: „Karvių genomo nestabilumo ryšys su pieno produktyvumu“
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
Jūrat÷ Antanavičien÷
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ
LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Jūrat÷ Antanavičien÷
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO
Doc. dr. Natalija Makštutien÷
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
Prof. dr. Ilona Miceikien÷
Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į ETD IS
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
TURINYS
Santrumpos...4 Santrauka...6 Summary...8 Įvadas...10 1. Literaturos apžvalga...111.1. Galvijų kariotipas ir chromosomos...11
1.2. Chromosomų aberacijos...13
1.2.1. Chromosomų struktūros pakitimai, bei jų ryšys su karvių produktyvumu...13
1.2.2. Chromosomų skaičiaus pakitimai, bei jų ryšys su galvijų produktyvumo savyb÷mis...21
1.3. Veiksniai lemiantys chromosomų aberacijų atsiradimą...23
1.4. Chromosomų aberacijų tyrimo metodai...25
1.5. Tirtų karvių veisl÷s apibūdinimas...25
2. Tyrimų metodika ir organizavimas...28
2.1. Tyrimo schema ...28
2.2. Tyrimo medžiaga...29
2.3. Preparatų ruošimas...31
2.4. Preparatų vertinimas ...31
2.5. Statistin÷ duomenų analiz÷ ...32
3. Tyrimų rezultatai...33
4. Rezultatų aptarimas...37
Išvados...40
Literatūra...41
SANTRUMPOS
X, Y – lytin÷s chromosomos
DNR – dezoksiribonukleinin÷ rūgštis Rob – Robertsono translokacija
LSMU VA – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Veterinarijos akademija pH – vandenilio jonų (H+) koncentracijos tirpale matas
FGA – fitohemagliutinas
LH – konservantas Lithium heparin KCl – kalio chloridas
S1 – spraga (vienoje chromatid÷je) S2 – spraga (abiejose chromatid÷se) D1 – delecija (trūkis vienoje chromatid÷je) D2 – delecija (trūkiai abiejose chromatid÷se) F – fragmentas Ž – žiedin÷ chromosoma Dic – dicentrikas P – poliploidija CA – chromosomin÷s aberacijos UV – ultravioletiniai spinduliai LJ – Lietuvos juodmarg÷s
Darbo tikslas: ištirti karvių genomo nestabilumo ryšį su pieno produktyvumu. Darbo uždaviniai:
1. Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie galvijų chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimus bei jų ryšį su produktyvumo savyb÷mis.
2. Paruošti karvių chromosomų preparatus.
3. Ištirti chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimus aukšto ir žemo produktyvumo pienin÷ms karv÷ms.
4. Apskaičiuoti chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimų dažnį ir spektrą aukšto ir žemo produktyvumo pienin÷ms karv÷ms.
5. Nustatyti ryšį tarp chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimų ir pieno produkcijos kiekio.
Darbo metodai: mokslin÷s literatūros, straipsnių, statistinių duomenų analiz÷. Praktin÷je dalyje atlikti karvių chromosomų tyrimai. Rezultatai aptarti juos apibendrinus. Darbe remtasi įvairiais užsienio ir lietuvių moksliniais darbais, straipsniais, tyrimų medžiaga, darbe analizuojama tema.
Darbo struktūra: santrauka (lietuvių, anglų kalba), įvadas, literatūros apžvalga, tyrimo metodika ir organizavimas, rezultatai, rezultatų aptarimas, išvados, literatūra, priedai. Darbe pateiktos 5 lentel÷s, 16 paveikslų. Darbo apimtis 43 puslapiai.
SANTRAUKA
Autorius: Jūrat÷ Antanavičien÷
Darbo tema: Karvių genomo nestabilumo ryšys su pieno produktyvumu. Raktiniai žodžiai: chromosomos, aberacijos, kariotipas, karvių produktyvumas. Darbo vadovas: doc. dr. Natalja Makštutien÷.
Atlikimo vieta: magistrinis darbas atliktas 2011–2014 metais. Tyrimai atlikti LSMU Veterinarijos akademijoje, Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute, K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.
Darbo objektas: citogenetin÷ analiz÷ atlikta 20 karvių iš LSMU VA praktinio mokymo ir bandymų centro, 10 aukšto produktyvumo karvių ir 10 žemo produktyvumo karvių. Tyrimai atlikti standartiniu citogenetiniu metodu.
Darbo apimtis: 43 puslapiai.
Darbo tikslas: ištirti karvių genomo nestabilumo ryšį su pieno produktyvumu.
Darbo uždaviniai: Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie galvijų
chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimus bei jų ryšį su produktyvumo savyb÷mis. Paruošti karvių chromosomų preparatus. Ištirti chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimus aukšto ir žemo produktyvumo pienin÷ms karv÷ms. Apskaičiuoti chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimų dažnį ir spektrą aukšto ir žemo produktyvumo pienin÷ms karv÷ms. Nustatyti ryšį tarp chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimų ir pieno produkcijos kiekio.
Rezultatai ir aptarimas: žemo produktyvumo karv÷s tur÷jo žymiai daugiau chromosominių pakitimų. Daugiausiai chromosomų struktūros pakitimų, t.y. 37,5 proc., sudaro spragos vienoje chromatid÷je (S1), 15,6 proc. – spragos abiejose chromatid÷se (S2), 17,2 proc. – chromatidžių trūkiai (D1), 9,4 proc. – fragmentai (F). Mažiausią dalį chromosomų struktūros pakitimų, t. y. 3,1 proc. sudaro chromosomų trūkiai (D2), žiedin÷s chromosomos (Ž) ir dicentrikai (dic). Šioje grup÷je aptikta chromosomų skaičiaus pakitimų –
poliploidijų (P), jų rasta – 10,9 proc. Ištyrus aukšto produktyvumo karves rasta: spragos vienoje chromatid÷je (S1) sudaro 34,6 proc., 19,2 proc. – sudaro chromatidžių trūkiai (D1), 11,5 proc.– spragos abiejose chromatid÷se (S2), 15,4 proc. – fragmentai (F). Mažiausiai rasta chromosomų trūkių (D2), jie sudar÷ 3,8 proc. Taip pat rasta poliploidijų (P). t.y. chromosomų skaičiaus pakitimas, jis sudaro 15,4 proc. Trisomijų, dicentrikų, žiedinių chromosomų šioje grup÷je nenustatyta.
Vidutiniai chromosominių aberacijų dažniai tarp tirtų karvių įvairavo: aukšto produktyvumo karvių grup÷je nuo 0 iki 0,0116 (p<0,01) ir nuo 0 iki 0,0347 (p<0,01) žemo produktyvumo karvių grup÷je. Vidutinis chromosominių aberacijų dažnis vienai ląstelei – 0,0326 aber./ląst. (p<0,001) aukšto produktyvumo karvių grup÷je ir 0,0910 (p<0,001) aber./ląst. žemo produktyvumo karvių grup÷je.
Bendra išvada: Tyrimo metu nustat÷me žymiai didesnį chromosominių aberacijų dažnį žemo produktyvumo karvių grup÷je, tai įtakoja karvių produktyvumo sumaž÷jimą.
SUMMARY
Author: Jūrat÷ Antanavičien÷.The theme: Cow genome instability in connection with milk productivity. The keywords: chromosomes, aberration, caryotype, cow productivity. The supervisor of the work: doc.dr. Natalja Makštutien÷.
The place: this Master work was written in 2011–2014. The research was carried on at LSMU Faculty of Veterinary Medicine, Biological Systems and Genetic Research Department, K. Janušauskas Laboratory of Animal Genetics.
The Object of the work: cytogenetic analysis was performed on 20 cows from LSMU VA practice and research centre, 10 productive cows and 10 unproductive cows. The research was performed by standard citogenetical laboratory.
The extent of the work: 43 pages.
The aim of the work: to evaluate the influence of chromosomal aberrations on cow high productivity.
The tasks of the work: collect and analyze scientific literature on bovine chromosome number and structure of the environment and their relationship with performance traits. Prepared bovine chromosome preparations. To investigate the chromosome number and structure changes in high and low productivity of dairy cows. Calculate the number of chromosomes and structural changes in the frequency and range of high and low productivity of dairy cows. Determine the relationship between chromosome number and structure changes and milk production levels.
The results and their discussion: after the examination of the unproductive cows the structural and numeral variations of chromosomes were identified. Most part of structural variations in chromosomes, i.e. 37,5 proc., consisted of gaps in one chromatid (S1), 15,6 proc.of gaps in both chromatids (S2), 17,2 proc. of cracks in chromatids (D1) .There were 10,9 proc. of poliploidies (P) found in numeral variations of chromosomes. There were also
identified both the structural and numerical variations of chromosomes after examining the productive cows. These structural variations of chromosomes were identified: 34,6 proc. of gaps in one chromatid (S1), 19,2 proc. of cracks (D1) in chromatids. There were 15,4 proc. of poliploidies (P). A number of productive and variations in the cells in the group of unproductive cows is 2,9 times bigger (p<0,01) then in the control group.
The conclusion: The study found significantly higher frequency of chromosomal aberrations in non-productive group of cows, it affects cow productivity losses.
ĮVADAS
Lietuvoje galvijininkyst÷ yra pagrindin÷ ir svarbiausia gyvulininkyst÷s šaka.Tinkamos gamtin÷s ir gyvulių auginimo tradicijos – pagrindin÷s prielaidos pl÷toti galvijininkystę (Jukna, 1998).
Genetika galvijininkyst÷je vaidina vis didesnį vaidmenį, kadangi tyrin÷jant galvijų kariotipą išssiaiškinama nemažai genetinių pokyčių, tokiu kaip chromosomų skaičiaus ir chromosomų struktūros persitvarkymus, kurie turi įtakos karvių produktyvumui, sveikatingumui ir reprodukcin÷ms savyb÷ms.
Genetika taip pat yra svarbi norint pasiekti gerų rezultatų pieno ūkyje. Galvijų produktyvumas yra ekonomiškai svarbus bruožas. Fizin÷s karvių savyb÷s, kurias mes matome ir galime įvertinti – tai yra jų bruožai – nulemti genetiškai. Genai įtakoja juos visus. Yra trys pagrindiniai veiksniai lemiantys karvių produktyvumą:
1. Genai 2. Aplinka
3. Genų ir aplinkos sąveika (Berardino et al.,1990; Philips, 2001).
Genetin÷s mutacijos pasitaiko gana dažnai. Mokslininkai įrod÷, kad chromosomų mutacijos veikia galvijų reprodukcines savybes ir produktyvumą tod÷l jų paplitimas populiacijoje yra labai nuostolingas (Patel et al., 2011). Didelę įtaką karvių produktyvumo lygiui turi chromosomų sandaros pokyčiai – chromosomų aberacijos, tod÷l d÷l šios priežasties netenkame apie trečdalį gimusių veršelių. O tai aišku, sukelia ekonominių nuostolių. Tod÷l efektyviausias būdas to išvengti yra kariotipo analiz÷, įvertinus chromosomų skaičių ir chromosomų struktūrą, galime efektyviau planuoti veislinį darbą, tuo pačiu pagerindami galvijų produktyvumą (Khatun et al., 2011).
Atlikus galvijų kariotipo analizę, galima įvertinti genetinius pakitimus, kurie gali sukelti neigiamas pasekmes galvijų sveikatai. Kadangi genetikos mokslas šiuo metu sparčiai tobul÷ja, citogenetinis galvijų ištyrimas tampa pažangesnis, o tai leidžia anksti identifikuoti įvairius genetinius nukrypimus, tai sumažintų galvijų mirtingumą ir apsigimimus (Hasanbašič et al., 2007). Atlikti citogenetiniai tyrimai gali sumažinti embrionų ir vaisiaus mirtingumą iki 20 – 30 proc. (Javed et al., 2004).
Šio darbo tikslas panaudojus chromosominių aberacijų tyrimo metodiką įvertinti chromosominių aberacijų ryšį su karvių pieno produktyvumu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Galvijų kariotipas ir chromosomos
Kariotipas – tai organizmo chromosomų visuma, apibūdinama chromosomų dydžiu, išvaizda ir skačiumi. Kariotipas yra paveldimas kiekvienai organizmo rūšiai būdinga savyb÷, kaip ir kiti požymiai (Rančelis, 2000). Kiekviena chromosomų pora žymima skaičiais išskyrus lytines. Kiekvienos rūšies organizmo chromosomų skaičius yra būdingas tik jam. Galvijai turi 60 chromosomų (2n), morfologiškai vadinamų akrocentrik÷mis, išskyrus submetacentrikes – lytines chromosomas (Pierce, 2012).
Žodis "chromosoma" (1 pav.) pažodžiui reiškia "spalvotas kūnas" (graikiškai: chroma – spalva, soma – kūnas). Chromosomos, randamos visose organizmo ląstel÷se, turinčiose branduolius ir sudarytose iš DNR dvigubos spiral÷s, kuri tam tikru būdu jungiasi su rūgščiaisiais ir baziniais branduoliais (Kučinskas, 1998).
1 pav. Chromosoma: 1. Chromatid÷, 2. Centromera, 3. Trumpasis petys, 4. Ilgasis petys (http://www.Chromosome-Structure-Assignment-Help.html.)
Apvaisinimo metu viena chromosomaįgyjama iš motinos, o kita – iš t÷vo pus÷s, nes gametose yra užkoduota pus÷ genetin÷s informacijos. Genomų pakitimai, nors jų nebuvo ankstesn÷se kartose, gali atsirasti įvykus mutacijai, chromosomų persitvarkymui ar paveikus DNR technologijomis (Maria et al., 2004).
Chromosomos išvaizda labiausiai priklauso nuo centromeros. Ji esti pirmin÷je sąsmaukoje. Iš abiejų jos pusių susidaro kinetochoras, prie kurio tvirtinasi achromatin÷s
verpst÷s mikrovamzdeliai. Centromera dalija chromosomą į pečius. Pagal centromeros pad÷tį ir petukų ilgį chromosomos gali būti metacentrik÷s – lygiapet÷s, submetacentrik÷s, kai
centromera yra ne ties chromosomos viduriu, susidarę pečiai yra ne visai lygūs, akrocentrin÷s, kai centromera yra beveik chromosomos gale (Rančelis, 2000).
Kariograma – tai chromosomų išsid÷stymas pagal dydį ir formą, o chromosomų grafinis vaizdas – idiograma. Kariogramoje chromosomos išd÷stomos pagal ilgį maž÷jančia tvarka (Eldridge, 1985). Pagal kariotipą galima apibūdinti organizmus. Jis atlieka svarbų vaidmenį paveldimumo procese. Atlikus kariotipo tyrimą galima nustatyti morfologines, anatomines, ir fiziologines chromosomų savybes (Ashari et al., 2012). Geriausiai chromosomų morfologin÷s ypatyb÷s įžiūrimos mitoz÷s ir mejoz÷s metafaz÷je (Paulauskas ir kt., 2003).
Galvijų kariotipą (2 pav.) sudaro 60 chromosomų, 29 autosomų poros ir 1 lytinių chromosomų pora (Abdullah et al., 2009). Karv÷s chromosomų rinkinio citogenetin÷ formul÷ – 2n = 60 = 58A + XX, buliaus 2n = 60 = 58A +XY. Galvijų kariotipą sudaro 29 poros akrocentrinių chromosomų, X chromosoma yra didelis submetacentrikas, Y chromosoma – mažas submetacentrikas. Lytinių chromosomų centromera n÷ra chromosomos centre, X didesn÷ už Y (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007).
2 pav. Karv÷s kariotipas (Autor÷ J.Antanavičien÷)
1.2. Chromosomų aberacijos
1.2.1. Chromosomų struktūros pakitimai, bei jų ryšys su
karvių produktyvumo savyb÷mis
Chromosomų aberacijos (lot. aberatio - nukrypimas) CA (3 pav.) – tai įvairūs chromosomų sandaros pokyčiai, atsiradę spontaniškai arba jas paveikus mutagenais (Rančelis, 2000). Pagal pokyčių pobūdį chromosomų mutacijos skirstomos į viduchromosomines ir tarpchromosomines:
Viduchromosomin÷s mutacijos yra delecijos, duplikacijos, inversijos, insercijos, viduchromosomin÷s translokacijos;
Tarpchromosominių mutacijų yra vienas tipas – tarpchromosomin÷s translokacijos (Pierce, 2012).
3 pav. Chromosomų aberacijos
(http://www.tutorhelpdesk.com/homeworkhelp/Biology-/Modification-)
Pagrindin÷s mutacijų savyb÷s:
1. Pokyčiai atsiranda staiga, šuoliškai. Pokyčių turinčio individo t÷vai jų netur÷jo arba dalis to individo kūno ląstelių yra pakitę naujai.
2. Mutacijos yra tiksliai apriboti pokyčiai. Nesusidaro nepertraukiamų kintamumo eilių, būdingų variaciniam kintamumui (modifikacijoms).
3. Mutacijų pagrįstų požymių kitimų kryptis yra įvairi. Taigi mutacijos gal būti ir naudingos, ir žalingos.
4. Naujos mutacijų formos išlieka pastovios kartų sekoje.
5. D÷l mutacijos pakitusiame organizme gali įvykti nauja mutacija, lemiant naują organizmo savybę (tiesiogin÷ mutacija) arba pradin÷s organizmo savyb÷s atkūrimą (grįžtamoji mutacija).
6. Kadangi mutacijos įvyksta labai retai, naują mutaciją dažniausiai galima aptikti tik ištyrus didelį skaičių individų (4 pav.) (Kučinskas, 2001).
4 pav. Mutacijų klasifikacija
Chromosomų aberacijos yra įvairių tipų – chromosomin÷s, chromatidin÷s ir kt. Paprasčiausias ir dažniausias chromosomų aberacijų tipas yra fragmentas. Kai fragmentas atitrūksta nuo chromosomos galo, ši netenka telomeros. Štai tada ir išaišk÷ja chromosomos galų reikšm÷. Trūkio vietoje chromosomų fragmentų (tiek su centromera – centrikių, tiek be jos – acentrikių) galai yra lipnūs, labai lengvai jungiasi. Kai susijungia du fragmentai, kurie turi centromerą, susidaro dicentrikas (Rančelis, 2000).
Pasitaiko ir tokių atvejų, kai fragmentai atitrūksta nuo abiejų chromosomos galų. Likusi vidin÷ chromosomos dalis galais gali jungtis ir sudaryti žiedą – žiedinę chromosomą (5 pav.) (Hartwell et al., 2011).
5 pav. Žiedin÷ chromosoma
(http://php.med.unsw.edu.au/embryology/index.php?title=File:Chromosome_ring_chr omosome.jpg)
Sąveikos tarp chromosomų, priklauso nuo telomerų sandaros, būtent nuo kartotinių sekų, ypač nuo paprastųjų kartotinių sekų. Šiomis sekomis gali konjuguoti net nehomologin÷s chromosomos, nes viso kariotipo paprastosios kartotin÷s sekos yra tapačios. Tai ir yra ektopin÷ konjugacija. Telomerose, paprastųjų kartotinių sekų sankaupose, lengvai vyksta netolygus krosingoveris (Rančelis, 2000; Griffits, 2012).
Ektopin÷s konjugacijos pasekm÷s gali būti dvejopos:
1. Telomeriniuose galuose esantys genai lengvai perkeliami iš vienos chromosomos į kitą.
2. Gali vykti netolygus krosingoveris tarp nehomologinių chromosomų – susidaryti delecijos ir translokacijos (Paulauskas ir kt., 2003).
Vidin÷je chromosomos dalyje d÷l kartotinių sekų irgi gali įvykti tokios pačios chromosomų mutacijos (Rančelis, 2000; Hartwell et al., 2011).
Normaliai chromosomos veiklai būtinos dar dvi dalys: DNR replikacijos pradžios seka ir centromera (Rančelis, 2000).
Centromera paskirsto DNR kopijas/chromatides (dukterines chromosomas) dukteriniams branduoliams, nes visi pagrininiai eukariotų požymių paveld÷jimo reiškiniai
susiję su centromeros veikla. Chromosomos be centromeros prilygsta acentriniam, t.y. neturinčiam centromeros, fragmentui. Per kiekvieną ląstel÷s dalijimąsi kas dešimta chromosoma be centromeros prarandama (Hartwell et al., 2011).
Tačiau gali būti priešingai – susidaryti chromosoma su dviem centromeromis (dicentrikas) (Rančelis, 2000).
Chromosomin÷s aberacijos gali būti skirstomos į stabilias ir nestabilias, priklausomai nuo jų sugeb÷jimo išsilaikyti besidalijančių ląstelių populiacijoje. Nestabilioms aberacijoms priklauso centriniai fragmentai, dicentrin÷s chromosomos, centriniai žiedai, ir kt. asimetriniai mainai. Stabilioms CA priklauso išbalansuotos translokacijos, inversijos, simetriniai chromatidžių mainai (Rančelis, 2000).
Delecija (6 pav.) – chromosomos dalies iškrita. Kai delecija yra chromosomos vidin÷je dalyje, kad chromosomų konjugacija vyktų lokusas į lokusą, toje homologin÷je chromosomoje, kuri yra normalios sandaros, susidaro kilpa: segmentas, neturintis homologo, „praleidžiamas“. Tuo tarpu chromosoma su delecija chromosomos gale yra tik trumpesn÷ už normalią chromosomą (Rančelis, 2000).
Iškritus segmentui, kuriame yra dominuojantis genas, d÷l hemizigotin÷s būsenos fenotipe pasireiškia recesyvieji genai. Stambios delecijos, taip pat gyvybei svarbių genų delecijos yra letalios (Rančelis, 2000).
6 pav. Chromosomos delecija
(http://uvmgg.wikia.com/wiki/Deletion)
Delecijos gali būti ir naudingos. Jeigu iškritusiame fragmente buvo nereikalingi genai, susijungia atskiri genai, tod÷l pasikeičia jų veikimas ir susidaro polifunkciniai baltymai (Nicholas, 2010).
Delecijos gali būti dviejų rūšių: terminalin÷ (delecija yra chromosomos gale), intersticin÷ (prarandama dalis chromosomos peties vidurio) (Hartwell et al., 2011).
Terminalinių chromatidžių delecijų, apimančių daugelį chromosomų, dažnai aptinkama nuolat abortus patiriančių karvių ląstel÷se. Galvijams būdinga X chromosomos delecija (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007).
Spraga – tai baltyminio chromosomos apvalkalo pažeidimas, nenutrūkstant DNR grandin÷lei (Kučinskien÷, Miceikien÷, 2002). Spraga gali būti ir vienoje, ir abiejose chromatid÷se (Rančelis, 2000). Tai ne visiškas chromosomos pažeidimas, kuris gali išsivystyti į chromosomines ar chromatidines delecijas (Hartwell et al., 2011).
Didelis ląstelių skaičius su spragomis koreliuoja su blogomis reprodukcin÷mis galvijų savyb÷mis (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007). Daug ląstelių su spragomis (21proc.) rasta karvių servis periodu (Miceikien÷ ir kt., 1996; Janušauskas ir kt., 1991).
Duplikacija (7pav.) – chromosomų mutacija, kai chromosomoje segmentas yra padvigub÷jęs. Kai pasikartojantys segmentai seka vienas paskui kitą, tokios duplikacijos vadinamos tandemin÷mis. D÷l duplikacijų, ypač didelių segmentų, gali sumaž÷ti gyvybingumas. Tačiau, d÷l kai kurių genų duplikacijų organizmai tampa atsparesni įvairiems aplinkos poveikiams. Taip atsiranda genome kartotiniai genai. Nuo duplikacijų prasideda ir naujų genų evoliucija: d÷l mutacijų iš pradžių du visiškai tapatūs lokusai pradeda skirtis, pasireiškia jų divergencija (Hartwell et al., 2011).
7 pav. Duplikacija
(http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/mutationtypes?show=duplication) Inversija (8 pav.) būna tada, kai chromosomos segmentas pasisuka 180°. Po inversijos genetin÷s medžiagos lieka tiek pat, bet pakinta genų vieta.
Konjugavus chromosomoms, kurių vienoje yra normali genų seka, o kitoje inversija, susidaro sud÷tinga kilpa. Inversijos skirstomos į įvairius tipus pagal pokyčių pobūdį:
Paracentrin÷ inversija, kai pasisukantis 180° chromosomos segmentas neturi centromeros;
Pericentrin÷ inversija, kai invertuotame segmente yra centromera. Kilpa šiuo atveju sud÷tingesn÷ (Rančelis, 2000).
2001 m. JAV mokslininkai atliko citogenetinius tyrimus, ištyr÷ 16 Podol÷s bulių, 11 bulių buvo aptikta pericentrin÷ inversija Y chromosomoje (Iannuzzi, 2001). Kitų mokslininkų tyrimų duomenimis inversija pas galvijus aptinkama 14 ir X lytin÷je chromosomoje (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007).
8 pav. Inversija
(http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/inversion)
Insercijos (9 pav.) arba intarpai, atsiranda įvairiais būdais įsiterpus svetimai DNR. Jas sukelia virusai egzogenin÷ DNR. Mejoz÷je jos sudaro kilpas, panašias į delecijų. Tik šiuo atveju atvirkščiai: nehomologinį, „atliekamą“ segmentą turi pakitusi chromosoma (Rančelis, 2000).
Galvijams pasitaiko insercija 16 chromosomoje, tai toks struktūros pakitimas, kuriame aptinkami trys trūkiai vienoje autosomoje (Hasanbašič et al., 2007).
9 pav. Insercija
(http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/mutationtypes?show=insertion)
Žiedin÷s chromosomos (5pav.) – tai žiedo formos struktūros, turinčios centromerą. Jos atsiranda pažeidus abu chromosomos pečius. Paprastai žiedinę chromosomą „lydi“ porinis fragmentas (Paulauskas ir kt., 2003).
Acentriniai fragmentai – tai poriniai įvairaus dydžio fragmentai. Retais atvejais jie matomi šalia chromosomos, nuo kurios atitrūko, dažniausiai kaip savarankiški elementai. Kartais matomi labai maži būdingos sferin÷s formos poriniai fragmentai („minut÷s“) – tai intersticin÷s delecijos, iš chromosomos vidurio iškritę nedideli segmentai. Kai šie segmentai pakankamai dideli, iš jų gali susidaryti acentriniai žiedai (Paulauskas ir kt., 2003).
Acentriniai žiedai – tai poriniai žiedo formos chromatidžių segmentai, neturintys centromeros. Atsiranda įvykus intersticinei delecijai viename chromosomos petyje ir susijungus intersticinio segmento galams. Pro mikroskopą matomi aštuoniuk÷s formos struktūros arba poriniai ovalin÷s formos dariniai (Paulauskas ir kt., 2003).
Dicentrin÷s ir policentrin÷s chromosomos (asimetriniai mainai) – tai tarpchromosominiai mainai, kuriems įvykus formuojasi di – ar policentrin÷s chromosomos ir acentriniai fragmentai. Dažniausiai būna dicentrin÷s chromosomos. Jos lengvai identifikuojamos (Paulauskas ir kt., 2003).
Translokacijos. Plačiąja prasme translokacijomis vadinami visi pokyčiai, kai chromosomos segmentas pakeičia vietą: iš vienos vietos patenka į kitą toje pačioje chromosomoje arba iš vienos homologin÷s chromosomos pereina į kitą. Visa tai yra
viduchromosomin÷s translokacijos. Chromosomos segmentas gali būti perkeltas ir iš vienos nehomologin÷s chromosomos į kitą nehomologinę chromosomą. Tai tarpchromosomin÷s translokacijos. Jos skiriasi nuo viduchromosominių translokacijų genetiniu ir fenotipiniu reiškimusi. Translokacijos gali įvykti įvairiais būdais: d÷l judriųjų genomo elementų, genetin÷s rekombinacijos, mutagenez÷s (Rančelis, 2000; Nicholas, 2010).
Tarpchromosomin÷s translokacijos. Kai keičiamasi fragmentais tarp nehomologinių chromosomų, translokacija vadinama reciprokine. Translokacija yra nereciprokin÷, kai vienoje iš nehomologinių chromosomų yra translokuotas segmentas, o kitoje – delecija (Rančelis, 2000; Gardner et el., 2004; Nicholas, 2010).
Robertsono translokacijos. 1916 m. amerikietis, citogenetikas W.R.B. Robertson, pirmasis apraš÷ translokuotas chromosomas, kurios sudar÷ susijungus 2 akrocentrin÷ms chromosomoms. Tod÷l mokslininko garbei, toks chromosomų persitvarkymas buvo pavadintas Robertsono translokacija (Gardner et al., 2004). Skirtingai nuo izochromosomų, gali susilieti nehomologin÷s chromosomos (Rančelis, 2000).
Robertsono translokacijos atsiranda susiliejant nehomologinių chromosomų centromeroms (10 pav.).
10 pav. Robertsono translokacija
(http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0534-0012/2005/0534-00120501015K.pdf)
Kad Robertsono translokacija būtų gyvybinga, t.y. kad susidarytų subalansuota (nepraradusi genų) chromosoma, turi susilieti dvi akrocentrin÷s chromosomos per jų centromeras, panašiai kaip susidarant izochromosomai. Keitimasis chromosomų pečiais vyksta centromerinio heterochromatino sankaupos viduje.
D÷l Robertsono translokacijos kariotipe sumaž÷ja viena chromosoma (Rančelis, 2007; Hartwell et al., 2011).
Galvijams pasitaiko pirmos ir dvidešimt devintos (1/29) chromosomų translokacijos. Šis chromosomų pakitimas turi įtakos galvijų apvaisinimo galiai, embrionų mirtingumui ir palikuonių produktyvumui (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007).
1.2.2. Chromosomų skaičiaus pakitimai, bei jų ryšys su galvijų
produktyvumo savyb÷mis
Galvijų chromosomų sakičiaus anomalijos retai matomos po gimimo, nes paprastai pašalinami n÷štumo metu (Nicholas, 2010).
Aneuploidija – pavienių chromosomų skaičiaus pokyčiai. Ji atsiranda d÷l trijų priežasčių:
1. Chromosomų neišsiskyrimo keliaujant dukterin÷ms ląstel÷ms į polius.
2. Chromosomų atsilikimo (turi daug bendro su pirmąja priežastimi, irgi netaisyklingai paskirstomos dukterin÷s chromosomos).
3. Endoreprodukcijos – reiškinio, kai padvigub÷ja tik pavien÷s chromosomos arba jų dalys (Rančelis, 2000).
Organizmai, kurie turi pakitusį pavienių chromosomų skaičių, yra vadinami aneuploidais, skirtingai, negu tie kurie turi normalų chromosomų skaičių vadinami euploidais (Nicholas, 2010).
Viena iš labai paplitusių mutacijų galvijams yra X chromosomos nebuvimas (Nicholas, 2010).
Tai toks aneuploidijos tipas, kai trūksta vienos chromosomos, vadinamas monosomija (Hartwell et al., 2011).
Organizmas, kuriam trūksta chromosomos, vadinamas monosomiku. Jeigu monosomikas vaisingas, pus÷ jo lytinių ląstelių yra (n–1) kariotipo, o kita pus÷ normalių. Abiem atvejais nustatyta genomo imprintingo tvarka yra pažeista. Viena chromosoma yra tik t÷vo arba motinos. Tod÷l vien d÷l to turi būti nukrypimai nuo normalaus fenotipo. Nenormalų monosomikų fenotipą nul÷m÷ pažeisto genomo imprintingas (Nicholas, 2010).
Be to, genomo imprintingas atskleid÷ naują aneuploidijos tipą , kai kariotipas normalus, diploidinis, o fenotipas su nukrypimais nuo normalios būsenos. Tai disomikai. Jie yra paveld÷ję abi homologines chromosomas tik iš motinos arba tik iš t÷vo pus÷s (Rančelis, 2000).
Kaip ir kitų mutacijų, aneuploidijos pobūdis priklauso nuo to , kada įvykusi mutacija. Kai tai atsitinka somatin÷se ląstel÷se , atsiranda mozaikos (Rančelis, 2000).
Kai aneuploidin÷s yra lytin÷s ląstel÷s, aneuploido tipą daugiausia lemia apsivaisinimas. Galvijams aneupoidija dažniausiai aptinkama lytin÷se ląstel÷se (Nicholas, 2010).
Heteroploidija - kai padid÷ja pavienių chromosomų skaičius. Vienas chromosomų skaičiaus sutrikimų yra trisomija. Kai galvijai turi tris XXX chromosomas. Lyginant su monosomikais, šių fenotipas yra "nenormalus" (Nicholas, 2010).
Žinomiausias pavyzdys pas gyvūnus yra galvijų 18 chromosomos trisomija, kuri pasireiškia letalia brachignatija. Veršeliai turintys trisomiją miršta iškart po gimimo (Bayomi et al., 2011).
Autosomų trisomija dažnai sukelia daug apsigimimų, kurie baigiasi mirtimi. Didžiąja embrionų mirties priežastimi yra chromosomų anomalijos. Tyrimai su embrionais parod÷, kad maždaug 7 proc. embrionų turi chromosominių pakitimų, kurie pasireiškia po gimimo. 30 proc. natūraliai abortuojasi, tod÷l galime daryti išvadą, kad ketvirtadalio embrionų netenkame d÷l chromosomų anomalijų (Nicholas, 2010).
Kartais pasitaiko, kad dalis vienos chromosomos yra sukeista su kita, šis procesas vadinamas reciprokine translokacija, tai chromosomų pokyčiai vykstantys tarp dviejų nehomologinių chromosomų, joms apsikeičiant segmentais (Nicholas, 2010). Šios translokacijos dažniausiai fenotipiškai nepasireiškia, bet ištyrus naminius galvijus pasteb÷ta, kad sumaž÷ja vaisingumas (Bayomi et al., 2011).
Poliploidija – kai chromosomų skaičius kinta ištisais kartotiniais chromosomų rinkiniais. Poliploidija priklausomai nuo to, kaip ji atsiranda, skirstoma taip:
1. Autopoliploidija (gr. autos – pats), kai įvyksta endomitoz÷ – padvigub÷jusios chromosomos, bet nesusidaro dukteriniai branduoliai, neišsiskiria, arba susilieja dvi tokių pačių genomų somatin÷s ląstel÷s (Rančelis, 2000).
2. Alopoliploidija (gr. allos – kitas), kai skirtingų rūšių genomai susilieja įvairiais tolimosios hibridizacijos, tarp jų ir tolimųjų taksonų somatinių ląstelių hibridizacijos, būdais (Rančelis, 2000).
Nors visos šios anomalijos retai, kada suderinamos su gyvybe, bet kaip teigia, australų mokslininkai 12 proc. viščiukų, turinčių triploidiją, pavyko išgyventi. Jie visi buvo vienos vados (Nicholas, 2010).
1.3. Veiksniai lemiantys chromosomų aberacijų atsiradimą
Veiksniai, sukeliantys mutacijas, vadinami mutagenais. Jie yra trijų tipų: fiziniai, cheminiai ir biologiniai.
Fizikiniams mutagenams priskiriami įvairūs jonizuojamieji spinduliai: ultravioletiniai, rentgeno, α, β, γ spinduliai. Švitinimas radioaktyviaisiais spinduliais gali sukelti tiek genų, tiek chromosomų struktūros pokyčius, gali atsirasti poliploidin÷s, daugiabranduol÷s ląstel÷s. Šie spinduliai, jeigu gaunamos didel÷s jų doz÷s, gali sukelti spindulinę ligą. Aplinkoje neišvengiamai susiduriame su ultravioletine spinduliuote (UV). UV yra saul÷s spindulių spektre. Šių spindulių perteklius gali pažeisti odos ląsteles ir sukelti odos v÷žį, pažeisti akis, susilpninti imuninę sistemą (Rančelis, 2007). Jonizuojančioji spinduliuot÷ buvo pirmasis aplinkos veiksnys, kurio mutageniškumas buvo įrodytas. 1927 m. amerikiečių mokslininkas Mioleris (H.J.Muller) įrod÷, kad jonizuojančioji spinduliuot÷ sukelia naujas drozofilos mutacijas. Jonizuojančios spinduliuot÷s biologiniai efektai labai įvairūs, jie sukelia: spindulinę ligą, morfozes, genų mutacijas, chromosomų degradaciją ir aberacijas, poliploidiją, rekombinaciją, v÷žį ir mirtį (Rančelis, 2007).
Cheminiams mutagenams priklauso įvairūs cheminiai junginiai: organiniai junginiai (tirpikliai, dervos), nitratai, aldehidai, sunkiųjų metalų druskos, peroksidai, kai kurie vaistiniai preparatai. Cheminiams mutagenams didelis skvarbumas, sugeb÷jimas pakeisti chromosomų koloidinę būseną, tam tikras neigiamas poveikis genų ir chromosomų struktūrai (Rančelis, 2007).
Chemin÷ mutagenez÷ prasid÷jo nuo silpnų mutagenų. 1932 m. mokslininkas V. Sacharovas nustat÷, kad drozofilų mutacijas sukelia cheminiai junginiai jodas, metalų druskos, kancerogeninis junginys metilcholantrenas (Paulauskas ir kt., 2003).
Chemin÷ mutagenez÷ viešai pripažinta tik po to, kai mokslininkai Auerbach ir Rapoportas aptiko labai stiprius mutagenus – alkilinančias medžiagas (Rančelis, 2007).
Stiprūs cheminiai mutagenai: alkilinančios medžiagos, peroksidai, antimetabolitai, alkaloidai ir gliukozidai, akridinai, hidroksilaminas, sunkiųjų metalų druskos (Rančelis, 2007). Be to gali būti netiesioginiai mutagenai – promutagenai. Pats junginys mutacijų nesukelia , bet mutageniški jo biodegradacijos produktai (Paulauskas ir kt., 2003).
Biologiniams mutagenams priklauso kai kurie virusai, antikūnai (Rančelis, 2007). Virusų mutageniškumas gali būti ir netiesioginis, sukeldami uždegiminį procesą, virusai aktyvina neutrofilus, o šie gamina laisvuosius radikalus. Slopinama DNR pažaidų reparacija (Rančelis, 2007).
Veiksniai, sukeliantys įgimtus naujagimių nenormalumus – teratologinius reiškinius, vadinami teratogenais. Teratologiniai reiškiniai yra įvairios prigimties – morfoz÷s arba mutacijos.
Dažnai tas pats aplinkos ar vidinis veiksnys sukelia įvairių tipų pokyčius: - mutacijas (įvairių tipų)
- rekombinacijas
- morfozes
Aplinkos mutagenai, esantys organizmo aplinkoje, d÷l specifinių saugos būdų ir strateginiais sumetimais genotoksikologijoje išskiriami į atskirą aplinkos mutagenų grupę. Jie yra įvairios prigimties: fiziniai, cheminiai ir netgi biologiniai, pvz., virusin÷s infekcijos (Kučinskas, 2001).
Mutacijų atsiradimas vadinamas mutageneze. Skiriami du mutagenez÷s tipai: gamtin÷, arba spontanin÷, be aktyvaus sąmoningo žmogaus įsikišimo indikuota, t.y. specialiai sukelta žmogaus.
Dažniausiai mutacijų atsiradimą lemia: jonizuojančioji spinduliuot÷, aukšta temperatūra, virusai, bakterijos, sunkieji metalai (Rančelis, 2007).
Cheminių mutagenų veikimas labai įvairus. Šiuo metu išsiaiškinta daug cheminių junginių, kurie pasižymi mutageniškumu. Skirtingi mutagenai su DNR sąveikauja specifiškai, tačiau bet kuriuo atveju pakinta įprasta DNR molekul÷s struktūra (Kučinskas, 2001).
Mutagenų poveikyje atsirandančių mutacijų mechanizmas labai panašus į tų, kurios kyla savaime, jos atsiranda d÷l replikacijos, rekombinacijos ir reparacijos metu daromų klaidų.
Gyvyb÷ egzistuoja d÷l organizmų geb÷jimo prisitaikyti. Šis prisitaikomumas atsiskleidžia įvairiuose lygiuose ir yra ilgo evoliucinio kelio rezultatas. Reparacin÷s ląstel÷s sistemos, kurių paskirtis išsaugoti DNR molekulių įprastą struktūrą, atsirado labai seniai, nes gyvyb÷ egzistuoja tokioje aplinkoje, kurioje buvo ir yra mutagenų. Tokių mutagenų labai daug. Tai saul÷s radiacija, radioaktyvūs elementai, įvairūs neorganiniai cheminiai junginiai, virusai bei pačios ląstel÷s metabolizmo metu susidarančios organin÷s medžiagos. Visa tai sudaro natūralų gamtinių mutagenų foną. Vystantis chemijos pramonei, naudojant naftos produktus, chemizuojant žem÷s ūkį, did÷ja tarša ir atsiranda rimtų ekologinių pakitimų. Žmon÷s vis daugiau naudoja įvairių sintetinių vaistų, buitin÷s chemijos priemonių. Nemažai šių junginių yra ne tik toksiški, bet ir mutageniški. Labai svarbu išaiškinti šiuos naujus aplinkos mutagenus ir rasti būdų kaip nuo jų apsaugoti gyvus organizmus (Kučinskas, 2001).
1.4. Chromosominių aberacijų tyrimo metodai
Chromosomų aberacijoms tirti naudojami įvairus metodai. Plačiausiai naudojamas citogenetinis tyrimų metodas atliekant kariologin÷ chromosomų analiz÷. Kariologines chromosomų analiz÷s metodu galima tirti chromosomų sandaros ir skaičiaus pakyčius. Chromosominiams tyrimas reikia paruošti chromosominius preparatus. Chromosomų preparatai ruošiami dviem būdais: tiesioginiu ir netiesioginiu.
Tiesioginis būdas – chromosomos ruošiami iš organinių audinių (kaulų čiulpų, limfinių mazgų, blužnies), kuriuose intensyviai vyksta ląstelių dalijimasis ir yra randamas didelis mitozių kiekis, net ir nenaudojant ląstelių dalijimąsi skatinančios medžiagos – mitogeno.
Netiesioginis būdas – chromosomų preparatai ruošiami iš periferinio kraujo, naudojant ląstelių dalijimąsi skatinančią medžiagą – mitogeną (Kučinskien÷, Miceikien÷, 2002).
Dažniausiai chromosomų tyrimai atliekami iš periferinio kraujo ląstelių. Chromosomų analiz÷ atliekama metafaz÷s stadijoje, tada chromosomos būna smarkiai spiralizuotos ir turi aiškias formas. Chromosomos dažomos ir vertinamos optinių mikroskopu imersinio objektyvo pagalba. Chromosomoms nauduojami įvairūs dažymo metodai, tai G, R, C, SCM, FISH, Gimza dažymo metodai. Dažniausiai chromosomos dažomos Gimzos dažais. Taikant šį dažymą chromosomos tolygiai nusidažo rausvai violetine spalva. Šis metodas tinkamas chromosomų skaičiui ir struktūros pokyčiams nustatyti (Kučinskien÷, Miceikien÷, 2002).
1.5. Tirtų karvių veisl÷s apibūdinimas
Lietuvoje auginami pagrinde Lietuvos juodmargiai galvijai, tai sudaro 75 proc, visų laikomų galvijų. Šiame darbe buvo tiriami šios veisl÷s karv÷s.
Lietuvos juodmargiai galvijai (11 pav.) yra viena iš seniausių galvijų veislių Lietuvoje. Iki Pirmojo pasaulinio karo didžiausią poveikį vietiniams Lietuvos juodmargiams galvijams padar÷ taip pat Olandijos juodmargių veisl÷.
11 pav. Lietuvos juodmarg÷ karv÷ (fotografijos autor÷ J. Antanavičien÷)
Lietuvos juodmargiai galvijai išvesti kryžminant vietinius galvijus su Olandijos juodmargiais, Ostfryzais, Švedijos juodmargiais, o v÷liau mišrūnus veisiant tarpusavyje. Savarankiška veisle Lietuvos juodmargiai pripažinti 1951 m. (Stankūniene ir kt., 2008).
Lietuvos juodmargiai turi daug Olandijos juodmargių kraujo ir yra panašaus kūno sud÷jimo. D÷l Olandijos juodmargių įtakos truputį sumaž÷jo Lietuvos juodmargių ūgis ir šiek tiek padid÷jo visi krūtin÷s ir užpakalio matmenys, pager÷jo eksterjeras, tešmens morfologin÷s bei fiziologin÷s savyb÷s. Suaugusių dabartinių Lietuvos juodmargių karvių kūno matmenys tokie (cm): aukštis ties ketera – 129, krūtin÷s gylis 69 – 70, krūtin÷s plotis 48 – 50, klubų plotis 54 – 55, įstrižas liemens ilgis 152, krūtin÷s apimtis 197 – 199, plaštakos apimtis 18 – 19. Šiuolaikiniai Lietuvos juodmargiai yra stiprios konstitucijos, jų kūnas proporcingas, bet kartais per daug kompaktiškas. D÷l trumpų kojų, gilios ir plačios krūtin÷s, plačios keteros, nugaros, juosmens, ilgo ir plataus užpakalio bei gerai išsivysčiusių raumenų jie dažnai panašesni į pieninius - m÷sinius galvijus. Šiam tipui jie yra artimi ir pagal pagrindinius kūno sud÷jimo indeksus. Daugumos karvių tešmenys tinka mechanizuotai melžti. Jos per minutę išskiria po 1,5 – 1,9 kg, o priekiniuose ketvirčiuose telpa 42 – 43 proc. pieno.
Prieauglis pasižymi didele augimo sparta. Intensyviai penimi buliukai per parą priauga po 1000 – 1200 g, 1 kg priesvorio sunaudoja 5,8 – 6,5 pašarinio vieneto ir 15 – 18 m÷n. sveria 470 – 500 kg ir daugiau. To paties amžiaus telyčios sveria 380 – 420 kg ir veršiuojasi 27 – 28 m÷nesį.
Veislynuose pirmaveršių mas÷ 500 – 520 kg, antraveršių 520 – 530 kg, o suaugusių 550 kg ir daugiau. Geriausiose bandose yra daug karvių, sveriančių per 600 kg. Suaugę buliai sveria 950 – 1000 kg (Jukna, 1998).
2. TYRIMŲ METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
2.1.Tyrimo schema
Tiriamasis darbas atliktas LSMU VA Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute, K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje. Chromosomų ruošimas atliktas šiais etapais (12 pav.) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
12 pav. Chromosomų ruošimo etapai Medžiagos pa÷mimas Transportavimas Kultivavimas Veikimas kolchicinu Veikimas hipotoniniu tirpalu
Preparatų gamyba ant objektyvinių stiklelių
2.2. Tyrimo medžiaga
Kraujo m÷giniai buvo paimti iš 20 LJ karvių LSMU VA praktinio mokymo ir bandymo centro, Girait÷s galvijų fermos. Karv÷s buvo suskirstytos į dvi grupes pagal pieno primilžį per laktaciją (1 lentel÷). Pirmoji grup÷ (aukšto produktyvumo) 10 karvių, kurių produktyvumas buvo 8000±0,3 kg primelžto pieno per laktaciją. Antroji grup÷ (žemo
produktyvumo) 10 karvių, kurių primilžis per laktaciją buvo mažiau 4869±0,9 kg pieno. Tiriamos karvių grup÷s buvo laikomos vienodomis sąlygomis, buvo vienodo amžiaus (2 laktacija). Karvių duomenis pateik÷ LSMU VA praktinio mokymo ir bandymų centras.
1 lentel÷. Tiriamų karvių produktyvumo (per laktaciją) duomenys. Eil. Nr. Tirtų karvių skaičius Vidutinis primilžis
(kg) 1 grup÷ (aukšto produktyvumo) 10 8000±0,3 2 grup÷ (žemo produktyvumo) 10 4869±0,9
Chromosominei analizei atlikti naudojome šias medžiagas: optinis mikroskopas, termostatas, centrifuga, šaldytuvas, sterilizatorius, medicininiai švirkštai, mikrodozatoriai, plastikiniai m÷gintuv÷liai 15 ml (kultūros auginimui), Pastero pipet÷s, objektiniai stikleliai, sterilūs indai. Taip pat chemin÷s medžiagos: mitybin÷ terp÷ (RPMI 1640), gliutaminas, mitogenas – fitohemagliutininas, antibiotikas gentamicinas, ledin÷ acto rūgštis, etanolis, metanolis, dažai –“Gimza”.
Kariotipas buvo nustatomas periferinio kraujo limfocituose pagal D. E. Rooney ir B. H. Czepulkowski (1992 m.) aprašytą metodiką.
1. Tyrimui atlikti buvo paimta 10 ml kraujo, kuris buvo paimtas iš karvių Jungo venos į heparinizuotą vakutainerį su (LH). M÷ginys lengvai sukratomas, kad kraujas nekreš÷tų. Transportuojant meginį temperatūra turi būti ne aukštesn÷ kaip 38 b ir ne žemesn÷ 4 b, m÷giniai nuolat lengvai sukratomi visą transportavimo laiką, kad nesusidarytų krešuliai. Toliau tyrimas buvo atliekamas LSMU Veterinarijos akademijoje, K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.
kanamicino atskiedus 10 ml fiziologinio tirpalo) ir fitohemagliutinino 0,4 ml darbinio tirpalo (darbinis tirpalas ruošiamas 5 mg FGA flakono turinį atskiedus 5 ml terp÷s).
3. Į sterilius 15 ml m÷gintuv÷lius įpilama po 4 ml paruoštos terp÷s.
4. M÷gintuv÷liai su 10 ml heparinizuoto kraujo centrifuguojami 1500 aps./min. greičiu 25 minutes.
5. Švirkštu nutraukiamas viršutinis centrifugato sluoksnis su leukocitų mase ir perkeliama (1 ml) į m÷gintuv÷lį su terpe.
6. M÷giniai kultivuojami termostate (38 bC temperatūroje) 72 val.
7. Likus 2 val. iki kultivavimo pabaigos, įlašinama 0,02 ml kolchicino darbinio tirpalo (darbinis tirpalas ruošiamas 10 ml kolchicino ištirpinus 50 ml fiziologinio tirpalo).
8. Po 72 val. vyksta kultūros nu÷mimas, m÷giniai centrifuguojama 1000 aps./min. greičiu 10 min.
9. Vandens siurblio pagalba nutraukiamas skaidrus centrifugatas ir paliekama apie 1 ml nuos÷dų.
10. Ant gerai suplaktų nuos÷dų užpilama 8 ml 38°C temperatūros hipotoninio tirpalo (hipotoninis tirpalas ruošiamas: 250 ml distiliuoto vandens ir 1,387 g KCl). Gerai sumaišoma ir hipotonizuojama termostate 15 min.
11. Atliekama priešfiksacija. Pipete įpilama 1 ml šalto fiksažo (fiksažui imama 3 dalys metanolio ir 1 dalis ledin÷s acto rūgšties), gerai išmaišoma ir centrifuguojama 1000 aps./min. greičiu 10 min.
12. Rusvas, skaidrus centrifugatas vandens siurbliu nusiurbiamas paliekant apie 1 ml nuos÷dų.
13. Ant gerai suplaktų nuos÷dų l÷tai užpilama (6 – 7 ml) šalto fiksažo, gerai sumaišoma. Fiksuojama 20 min. laikant šaldytuve.
14. Centrifuguojama 1000 aps./min. greičiu 10 min., nusiurbiamas skaidrus centrifugato sluoksnis, nuos÷dos gerai suplakamos, užpilama nauja porcija fiksažo, sumaišoma.
15. Pakartotinai centrifuguojama, skaidrus centrifugatas nusiurbiamas, užpilama nauja porcija fiksažo (5 – 6 ml).
16. Centrifuguojama 10 min 1000 aps./min. greičiu, nusiurbiamas viršutinis centrifugato sluoksnis, paliekant apie 1 ml sluoksnį, gerai suplakama, užpilama naujo fiksažo (6 – 7 ml), pakartotinai centrifuguojama, nusiurbiamas viršutinis centrifugato sluoksnis, paliekant 1 ml. Gerai sumaišoma ir gaminami preparatai.
17. Chromosomų preparatai gaminami ant švarių, nuriebalintų ir distiliuotu vandeniu perplautų objektyvinių stiklelių.
18. Džiovinama termostate.
19. Preparatai dažomi "Gimzos" dažais (pH 7,0), atskiestais Sorenseno buferiu. Chromosomos tolygiai nusidažo rausvai violetine spalva.Šis dažymo būdas naudojamas chromosomų skaičiui bei struktūrosm pokyčiams nustatyti.
Chromosomų preparatai tirti ir analizuoti optiniu mikroskopu „Nikon“ su imersiniu objektyvu. Kiekvienam individui buvo tiriama iki 100 metafazių.
2.3. Preparatų ruošimas
Ląstelių suspensiją (4 – 5 lašus) lašinama ant švaraus objektinio stiklelio, palenkto 20 – 300 kampu iš 60 – 80 cm aukščio. Preparatai džiovinami termostate arba ant spiritin÷s lemput÷s liepsnel÷s. Išdžiovinti preparatai dažomi.Chromosomų preparatai dažomi Gimzos dažais 20 – 30 min. Po to preparatai plaunami po tekančiu vandeniu, tepin÷liai išdžiovinami ir pažymimi.
2.4. Preparatų vertinimas
Kariotipas vertinamas apžiūrint chromosomų rinkinį optiniu mikroskopu (objektyvas 20x, 40x), vertinimuinaudojamas objektyvas (100x). Vertinant chromosomas matomas 100 kartų padidintas vaizdas. Kiekviename preparate surandamas plotas, kuriame yra apie 100 metafazių. Kiekviena metafaz÷ yra vertinama atskirai, duomenis surašant į lentelę, kurią sudaro 100 kvadrat÷lių. Vertinamos tik kokybiškos, vienodai išsibarstę (neturi dengti viena kitos ar kitaip persikryžiuoti) chromosomos. Į lentelę surašomi visi duomenys apie tiriamą metafazę (chromosomų skaičius irsandaros pakitimus).
Kiekviename rinkinyje buvo stebimi ir registruojami šie kokybiniai ir kiekybiniai chromosomų pokyčiai:
1. Poliploidija (3n, 4n..) 2. Aneuploidija (2n ± 1, 2..)
3. Chromosomin÷s aberacijos: chromatidžių trūkiai (delecija D1), chromosomų trūkiai (delecija D2), fragmentai (F), žiedin÷s chromosomos (Ž), dicentrikai (Dic), spragos (S1, S2).
2.5. Statistin÷ duomenų analiz÷
Iš lentel÷s duomenų buvo skaičiuojami šie rodikliai:
1. Bendras procentas ląstelių su esančiais pakitimais – suskaičiuota kiek ląstelių turi chromosomines aberacijas ir apskaičiuotas procentais. Jei vienoje ląstel÷je yra du ar daugiau pakitimų, ji skaičiuota kaip viena ląstel÷.
2. Chromatidžių trūkiai (delecija D1) proc. – suskaičiuota kiek yra D1 (t.y. vienos chromatid÷s trūkių) ir apskaičiuotas proc. Jei vienoje ląstel÷je yra du ar daugiau pakitimų, ji skaičiuota kaip viena ląstel÷.
3. Chromosomų trūkiai (delecija D2) proc. – suskaičiuota kiek yra D2 (t.y. dviejų chromatidžių trūkių) ir apskaičiuotas proc. Jei vienoje ląstel÷je yra du ar daugiau pakitimų, ji skaičiuota kaip viena ląstel÷.
4. Fragmentų (F) proc. – suskaičiuota kiek yra fragmentų ir apskaičiuotas proc. Jei vienoje ląstel÷je yra du ar daugiau pakitimų, ji skaičiuota kaip viena ląstel÷.
5. Žiedinių chromosomų (Ž) ir dicentrikų (Dic) proc. – suskaičiuotas žiedinių chromosomų ir dicentrikų kiekis ląstel÷se ir apskaičiuotas proc.
6. Spragų (S1 ir S2) proc. – suskaičiuota kiek yra spragų (S1 – kai spraga matoma vienoje chromatid÷je ir S2 – kai spraga matoma abiejose chromatid÷se, skaičiuojant S kaip dvi spragas) ir apskaičiuotas proc.
7. Aberacijų skaičius tenkantis vienai ląstelei – suskaičiuota kiek yra iš viso rasta aberacijų pas tiriamą individą. Gautas bendras skaičius dalintas iš analizuotų ląstelių skaičiaus.
Statistin÷ duomenų analiz÷ atlikta skaičiuokle – Microsoft Office Ecxel 2010. Skirtumų tarp grupių vidutinių aberacijų dažnių statistinis reikšmingumas įvertintas Stjudento kriterijumi. Duomenys laikomi patikimais pagal Stjudentą, kai p<0,05 (Juozaitien÷, Kerzien÷, 2001). Aberacijų paplitimo dažniai skirtingose grup÷se palyginti naudojantc2 (chi–kvadrat)
3. TYRIMŲ REZULTATAI
Taikant chromosomų citogenetinę analizę buvo tiriamos 20 Lietuvos juodmargių karvių LSMU VA praktinio mokymo ir bandymo centro Girait÷s galvijų fermos.
Iš viso buvo ištirtos 1525 ląstel÷s: 815 ląstelių aukšto produktyvumo karvių grup÷je ir 710 ląstelių žemo produktyvumo karvių grup÷je. Kiekvienai karvei ištirta iki 100 chromosominių metafazių plokštelių. Jei chromosomų skaičiaus ar struktūros pokyčiai randami visuose 100 ląstelių, tai toks chromosomų pakitimas yra paveldimas (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007). Nei vienai tirtai karvei nebuvo rasti chromosomų skaičiaus ar struktūros pakitimai visose tirtose to gyvulio ląstel÷se (100 ląstelių).
Atlikus tyrimą paaišk÷jo, kad aukšto produktyvumo karvių grup÷je ląstelių su pakitimais pasitaiko 2,8 karto rečiau (p<0,001), nei žemo produktyvumo karvių grup÷je, atitinkamai 3,2 proc. ir 9 proc. (2 lentel÷).
2 lentel÷. Pakitimų dalis ląstel÷se
Diagramoje (13 pav.) matyti, kad žemo produktyvumo karvių grup÷je didžiąją dalį t.y. 100 proc. sudar÷ spragos vienoje chromatid÷je (S1), lyginant su aukšto produktyvumo karv÷mis, t.y. 20 proc. daugiau. Taip pat žemo produktyvumo grup÷s karv÷s 90 proc. tur÷jo spragas abiejose chromatid÷se (S2). O aukšto produktyvumo karvių grup÷je spragos (S2) sudar÷ 30 proc., fragmentai (F) – 20 proc. Kitų chromosomų skaičiaus pakitimų nustatyta žemo produktyvumo karvių grup÷je: dicentrikių (dic) rasta 60 proc., poliploidijų (P) – 60 proc., trisomijų (Tr) – 20 proc. Lyginant abi grupes, chromosominių aberacijų (CA) aptikta daugiau žemo produktyvumo karvių grup÷je.
Ištirta
Nustatytas ląstelių su chromosomin÷mis aberacijomiskiekis Karvių grup÷
karvių, sk. ląstelių sk. karvių, proc. Bendras ląstelių sk. su pakitimais, proc. Vidutinis ląstelių su pakitimais skaičius vienam tirtam gyvuliui Aukšto produktyvumo karvių grup÷ 10 815 100 3,2 2,6 Žemo produktyvumo karvių grup÷ 10 710 100 9,0 6,4
0,0 10,0 0,0 0,0 30,0 40,0 30,0 30,0 80,0 0,0 20,0 20,0 20,0 60,0 60,0 80,0 90,0 100,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 D2 F Ž Tr P Dic D1 S2 S1 % produktyvios neproduktyvios
13 pav. Karvių, kurioms nustatytos chromosomin÷s aberacijos, (%)
Vidutiniai chromosomų aberacijų dažniai tarp tirtų karvių įvairavo: aukšto produktyvumo karvių grup÷je nuo 0 iki 0,0116 (p<0,01) ir nuo 0 iki 0,0347 (p<0,01) žemo produktyvumo karvių grup÷je. Vidutinis chromosomų aberacijų dažnis vienai ląstelei – 0,0326 aber./ląst. (p<0,001) aukšto produktyvumo karvių grup÷je ir 0,0910 (p<0,001) aber./ląst. žemo produktyvumo karvių grup÷je (3 lentel÷).
3 lentel÷.Vidutiniai chromosominių aberacijų dažniai tirtose karvių grup÷se Aukšto produktyvumo
karvių grup÷
Žemo produktyvumo karvių grup÷ Aberacijos Vidutinis aberacijų dažnis Pasikliautinis 95% intervalas Vidutinis aberacijų dažnis Pasikliautinis 95% intervalas p S1 0,0116 0,007 - 0,016 0,0347 0,024 - 0,045 <0,01 S2 0,0038 0 - 0,008 0,0144 0,008 - 0,021 <0,05 D1 0,0060 0 - 0,013 0,0151 0,011 - 0,019 D2 0,0011 0 - 0,003 0,0028 0 - 0,007 F 0,0054 0 - 0,011 0,0087 0,004 - 0,013 P 0,0048 0,001 - 0,009 0,0097 0,004 - 0,015 Tr 0 0 0 0 Ž 0 0 0,0029 0 - 0,007 Dic 0 0 0,0027 0 - 0,006 Aber. /ląst. 0,0326 0,022 - 0,043 0,0910 0,081 - 0,101 <0,001
Palyginus abiejų karvių grupių chromosomų aberacijų dažnius (14 pav.), nustatyta, kad chromosomų struktūros pakitimų dažniai žymiai didesni žemo produktyvumo karvių
grup÷je, lyginant su aukšto produktyvumo karv÷mis. O chromosomų skaičiaus pakitimų dažnis nežymiai didesnis aukšto produktyvumo karvių grup÷je.
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035 0,040 S1 S2 D1 D2 F P Tr Ž Dic produktyvios neproduktyvios
14 pav. Chromosominių aberacijų dažnių palyginimas
Ištyrus žemo produktyvumo karvių grup÷s chromosominių aberacijų spektrą (15 pav.) nustatyta ir chromosomų struktūros ir chromosomų skaičiaus pakitimų. Daugiausiai chromosomų struktūros pakitimų, t.y. 37,5 proc., sudaro spragos vienoje chromatid÷je (S1), 15,6 proc – spragos abiejose chromatid÷se (S2). Spragos gali išsivystyti į chromosomines ir chromatidines delecijas (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007). 17,2 proc. – chromatidžių trūkiai (D1), 9,4 proc. sudar÷ fragmentai (F). Mažiausią dalį chromosomų struktūros pakitimų, t. y. 3,1 proc., sudaro chromosomų trūkiai (D2), žiedin÷s chromosomos (Ž) ir dicentrikiai (dic). Šioje grup÷je aptikta chromosomų skaičiaus pakitimų – poliploidijų (P), jų rasta – 10,9 proc.
Ištyrus aukšto produktyvumo karvių chromosomų aberacijų spektrą (16 pav.) nustatyta ir chromosomų struktūros ir chromosomų skaičiaus pakitimų. Spragos vienoje chromatid÷je (S1) sudaro 34,6 proc., 11,5 proc. – spragos abiejose chromatid÷se (S2), 19,2 proc. – sudaro chromosomų trūkiai (D1), 15,4 proc. fragmentai (F). Mažiausią dalį sudaro chromosomų trūkių (D2) – 3,8 proc. Taip pat rasta poliploidijų (P) – 15,4 proc. Šioje grup÷je neaptikau žiedinių chromosomų, dicentrikių ir trisomijų.
S1 37,5% S2 15,6% D1 17,2% D2 3,1% F 9,4% P 10,9% Tr 0% Ž 3,1% Di c 3,1% 15 pav. Žemo produktyvumo karvių chromosominių aberacijų spektras
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Klinikin÷ gyvūnų citogenetikos pl÷tra prasid÷jo 1960 m., beveik tuo pat metu kaip ir žmogaus. Per pastaruosius 40 metų buvo paskelbti šimtai mokslinių publikacijų apie chromosomų anomalijas. Tačiau nuo 1980 m. labai sumaž÷jo mokslininkų, dalyvaujančių klinikiniuose gyvūnų citogenetiniuose tyrimuose. Kiekvienais metais visame pasaulyje yra atliekama nuo 8000 iki 10 000 chromosomų analiz÷s tyrimų, daugiausia galvijų, kiaulių ir arklių (Ducos, 2008). Daugiausiai citogenetinių tyrimų atliekama Prancūzijoje, kur ištirta apie 5000 galvijų (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007; Ducos, 2008).
Literatūros duomenimis Šveicarijoje ir Vengrijoje ištirta po 3000 gyvulių, JAV – 2000 galvijų. Australijoje ištirti 1100 galvijai, o Afrikoje ištirti tik 500 galvijų. Lietuvoje ištirta apie 2000 galvijų (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007).
Serbijoje buvo atliktas citogenetinis tyrimas, kuris užtruko penkerius metus. Buvo tiriami 371 galvijai (215 buliai ir 156 karv÷s), iš jų 267 Holšteinų fryzai, 62 Simentaliai, 42 pilkosios step÷s veislių galvijai. Tiriant galvijus buvo taikoma limfocitų kultivavimo ir kariotipavimo analiz÷ pagal tarptautinius gyvulių citogenetinių tyrimų standartus. Šio tyrimo tikslas įvertinti veisiamų galvijų genetinius duomenis. Rastos tokios chromosomų anomalijos: 6 Holšteino fryzai tur÷jo chimeras 2n = 60, XX/XY, Simentaliai tur÷jo vieną Robertsono translokaciją. Pilkosios step÷s veisl÷s galvijai tur÷jo nepakitusį kariotipą. Rastos delecijos ir žiedin÷s chromosomos Holšteinų fryzų ir Simentalių galvijams. 9 galvijams buvo rasti įvairūs chromosomų pakitimai, tai sudaro 2,42 proc., 362 kariotipai normalūs (97,57 proc.). Atlikę tyrimus tyr÷jai padar÷ išvadą, kad norint išsaugoti veisiamų galvijų genofondą, citogenetiniai tyrimai yra būtini (Košačic et al., 2005).
2007 m. Bosnijoje buvo ištirta 40 vietin÷s Buša veisl÷s bulių. Tyrimo metu nustatyta ir chromatidžių ir chromosomų aberacijų. Spragos (S1) sudar÷ 15 proc., delecijos (D1) sudar÷12 proc., fragmentai (F) sudar÷ 7 proc., dicentrikių (dic) 4 proc., poliploidijų (P) rasta 16 proc. Šio tyrimo metu nustatytas vidutinis pakitusių ląstelių kiekis 1,35 proc. Įvertinę gautus rezultatus mokslininkai padar÷ išvadą, kad chromosomų aberacijos veikia galvijų vaisingumą ir produktyvumą (Hasabanšič et al, 2007).
Mūsų atlikto tyrimo duomenys yra panašūs su kitų mokslininkų gautais rezultatais. Lyginant aukščiau aprašytus rezultatus mes gavome panašų skaičių: spragų (S2) – 15,6 proc., fragmentai (F) sudar÷ 9,4 proc., dicentrikų (dic) radome 3,1 proc., taip pat radome poliploidijų (P) – 10,9 proc. žemo produktyvumo karvių grup÷je.
Didelis chromosominių aberacijų dažnis nerodo gyvulio sveikatingumo būkl÷s tiesiogiai, bet nusako organizmo genomo nestabilumą (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007).
2007 m. Lietuvoje, Panev÷žio veislininkyst÷s įmon÷je, buvo tiriami 77 veisliniai buliukai. Tyrimai atlikti Lietuvos veterinarijos akademijoje, K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje. Ištyrus Panev÷žio veislininkyst÷s buliukus, paveldimų chromosomų skaičiaus ar struktūros pakitimų nerasta. Rastas vidutinis chromosominių aberacijų dažnis 0,04 aber./ląst., vidutinis pakitusių ląstelių kiekis – 13,04 proc. Dažniausiai nustatyta chromosomin÷ aberacija buvo chromatidžių trūkiai, jie sudar÷ 16 proc., fragmentai 8 proc. (F). Didžiąją dalį chromosomų pakitimų sudar÷ spragos – 72 proc. Taip pat pas du bulius buvo rasta 1/29 Robertsono translokacija, du buliai mozaikiški (XY/XXY ir 1 XY/XYY) ir dviem atvejais rastas ląstelių su XX/XY lytinių chromosomų deriniais chimerizmas (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007).
Mūsų atliktame tyrime taip pat dažniausiai pasitaikęs chromosomų pakitimas – spragos, jas nustat÷me žemo produktyvumo karvių grup÷je, (S1) ir ( S2) kartu sudar÷ net 53,1 proc., taip pat radome panašų kiekį fragmentų (F) – 9,4 proc. Mūsų tyrimų duomenimis Robertsono translokacijų (rob) nenustatyta. Tai dažniausiai pasitaikantis chromosomų pakitimas tarp m÷sinių galvijų. Šis chromosomų pakitimas didžiausią reikšmę turi galvijų vaisingumui (Qu et al., 2012).
Aukštas chromosominių aberacijų dažnis kai kuriuose gyvuliuose rodo potencialią problemą, kuri gali būti susijusi su pablog÷jusiomis reprodukcin÷mis savyb÷mis ir spermos kokybe. Be to, nustatyta, kad karv÷s, kurioms itin dažnos chromosomų aberacijos, yra nevaisingos (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007).
Kuo gyvuliai vyresni, tuo chromosominių aberacijų dažnis didesnis, nes ląstel÷s su amžiumi praranda chromosomų pažaidų reparacines savybes (Krasnopiorova, Miceikien÷, 2007). Mūsų tyrime šio rodiklio įvertinti negal÷jome, nes visos tirtos karv÷s buvo vieno amžiaus.
Daugiausiai galvijų citogenetiniai tyrimai atliekami norint įvertinti reprodukcines savybes, genetines ligas, bet rečiau įvertinti kitas savybes, tokias kaip produktyvumas. Tod÷l mūsų atliktas citogenetinis galvijų tyrimas, norint įvertinti ryšį genomo nestabilumo ir karvių produktyvumą n÷ra dažnas.
IŠVADOS
1. Chromosomų aberacijų dažnis aukšto produktyvumo karvių grup÷je įvairavo nuo 0 iki 0,0116 (p<0,01). Vidutinis pakitusių ląstelių kiekis sudar÷ 3,2 proc.
2. Chromosomų aberacijų dažnis žemo produktyvumo karvių grup÷je įvairavo nuo 0 iki 0,0347 (p<0,01). Vidutinis pakitusių ląstelių kiekis sudar÷ 9,0 proc.
3. Aukšto produktyvumo karvių grup÷je nustatyti šie chromosomų pakitimai: spragos vienoje chromatid÷je (S1) – 34,6 proc., spragos abiejose chromatid÷se (S2) – 11,5 proc., chromatidžių trūkiai (D1) – 19,2 proc., chromosomų trūkiai (D2) – 3,8 proc., fragmentai (F) – 15,4 proc., poliploidija (P) – 15,4 proc.
4. Žemo produktyvumo karvių grup÷je nustatyti šie chromosomų pakitimai: spragos vienoje chromatid÷je (S1) – 37,5 proc., spragos abiejose chromatid÷se (S2) – 15,6 proc., chromatidžių trūkiai (D1) – 17,2 proc., chromosomų trūkiai (D2) – 3,1 proc., fragmentai (F) – 9,4 proc., žiedin÷s chromosomos (Ž) – 3,1 proc., dicentrik÷s (dic) – 3,1 proc., poliploidija (P) – 10,9 proc.
5. Aukšto produktyvumo karvių grup÷je ląstelių su pakitimais nustatyta 2,8 kartų rečiau nei žemo produktyvumo karvių grup÷je (p<0,01).
LITERATŪRA
1. Abdullah M.H., Idris I., Hilmi M.Karyotype of malayan gaur (Bos gaurus hubbacki), sahiwal – friesian cattle and gaur x cattle hybrid backcrosses. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2009.12. P. 896–901.
2. Ashari M., Busono W., Nuryadi N. A. Analysis of Chromosome and Karyotype in Bali Cattle and Simmental–bali (Simbal) Crossbreed Cattle. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2012. 15. P. 736–741.
3. Bayomi K. M., Araby I. E., Zaglool A. W. Cytogenetic Analysis Related to Some Infertility Problems in Cattle. Global Veterinaria. 2011. 7 (4). P. 323–329.
4. Beraradino D. D., Hayes H., Fries R., Long S. International system for cytogenetic nomenclature of domestic animals. Cytogenetic Cell Genet. 1990. 53. P. 65–79.
5. Ducos A., Revay T., Kovacs A., Hidas A. Cytogenetic screening of livestock populations in Europe: an overview. Basel. Cytogenet genome Journal. 2008. 120. P. 1–2.
6. Eldridge F. E. Banding of Chromosomes and Karyotyping. In: Cytogenetics of Livestock, Eldridge, F.E. (Ed.). The AVI Publ. Co., Inc., Westport. CT. 1985. P. 45–55.
7. Gallagher D. S., Davis S. K., Donato M. D., Burzlaff J. D., Womack J. E., Kumamoto A. T., Taylor J. F. Applications of chromosomal fish in the bovidae with emphases on physical mapping in domestic cattle and comparative cytogenetic analyses of the tribe bovini. Animal Biotechnology. 1999. 10 (3). P. 105–108.
8. Gardner R. J. M., Sutherland G. R. Chromosome Abnormalities and Genetic Counseling. New York: Oxford University Press. 2004. 117p.
9. Griffits J. A., Wesller S. R., Carrol B., Doebly J. Introduction to genetic analysis. 10 edition. New York. 2012. P.235–279.
10. Hartwell H., Goldberg M.L., Reynolds A.E. Genetics. 4th edition. McGrow Hill. New York. 2012. 725 p.
11. Hasabanšič D., Rukavina D., Hodzic. Research on spontaneously emerged chromosomal aberrations in the periphery blood lymphocytes in cattle.Bosnian journal of basics medical sciences. Bosnia. 2007. 7(4). P.301–306.
12. Iannuzzi L., Di Meo G.P., Perucatti A., Eggen A. A pericentric inversion in the cattle Y chromosome. Cytogenet cell genet journal. 2001. 94. P. 3–4.
13. Janušauskas K., Jakutis V., Miceikien÷ I. Veislinių bulių citogenetiniai tyrimai. Lietuvos veterinarijos akademijos mokslo darbai. 1991. (20). P. 44 - 49.
14. Javed Ahmad K., Sattaras A. Screening of breeding Bulls of different breeds through karyotyping. Pakistan.Veterinary Journal. 2004.24(4).P.5.
15. Jukna Č. Galvijininkyst÷. Vilnius. Elada. 1998. P. 5–6.
16. Juozaitien÷ V., Kerzien÷ S. Biometrija ir kompiuterin÷ duomenų analiz÷. Kaunas. 2001. 114 p.
17. Khatun M.R., Arifuzzaman M., Ashraf A. Karyotype for Identification of Genetic Abnormalities in Cattle. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances. 2011. 6. P. 117– 125.
18. Košarčic S. Chromosome changes in cattle on the farms in Serbia. Scientific Veterinary Institute. Serbia. 2005. P. 121–128.
19. Krasnopiorova N., Miceikien÷ I. Citogenetiniai galvijų tyrimai.Veterinarija ir Zootechnika.T. 38 (60). 2007. P. 33–37.
20. Kučinskas V. Genetika. Kaunas. Šviesa. 2001. P. 94–108. 21. Kučinskas V. Tu ir tavo genai.Kaunas. 1998. P. 70–73.
22. Kučinskien÷ J., Miceikien÷ I. Genetikos laboratoriniai darbai. Citogenetika. Kaunas. 2002. P. 19 – 30.
23. Maria I.N., King W.A. Genetic Factors that Affect Normal Reproduction and Fertility in Domestic Cattle. Veterinary Bulletin. 2004. 74 (11). P. 147.
24. Miceikien÷ I., Janušauskas K. K÷dainių chemijos gamyklos ir Lietuvos elektrin÷s teršalų genotoksinis poveikis gyvuliams. Veterinarija ir zootechnika. 1996. T. 2. P. 24.
25. Nicholas F.W. Introduction to veterinary genetics.University of Sydney. Australia. 2010. P. 103–118.
26. Patel D. J., Patel A. J., Patel R. K., Parekh P. R. Chromosomal analysis of Breeding bulls using lymphocyte Culture.. The Bangladesh Veterinarian. 2012. 29(1). P. 17– 21.
27. Patel V.A., Rajesh K. Patel, Parth B. Shah, Priti R. Parekh. Cytogenetic studies of the dairy bulls. Wayamba Journal of Animal Science. 2011. P. 190–P194.
28. Paulauskas A., Slapšyt÷ G., Morkūnas V. Bendrosios genetikos tyrimų metodai ir pratybos. Vilnius. 2003. P. 140–145.
29. Philips A. Genetic effects on the productivity of beef cattle. NT Australia. Agnote Journal. 2001 .P. 6.
30. Pierce A.B. Genetics. Canada. 2012. 400 p.
31. Qu K.X., He Z.X., Nie W.H., Zhang J.C., Jin X.D., Yang G.R., Yuan X.P., Huang B.Z., Zhang Y.P., Zan L.S. Karyotype analysis of mithun (Bos frontalis) and mithun bull x Brahman cow hybrids. Genetics and Molecular Research. 2012. 11 (1). P. 131–140.
33. Rooney E., Czepulkowski B.H. Human analysis: constitutional analysis. USA IRL press. 1992. P. 296.
34. Stankūnien÷ V., Tacas J., Mišeikien÷ R. Pieno ūkio savininkui. LVA. 2008. P.24– 25.
35. http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/mutationtypes?show=duplication. Prieiga per internetą 2013–04–12.
36. http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/mutationtypes?show=insertion. Prieiga per internetą. 2013–04–12.
37. http://php.med.unsw.edu.au/embryology/index.php?title=File:Chromosome-_ring_chromosome.jpg. Prieiga per internetą 2013–05–10.
38. http://uvmgg.wikia.com/wiki/Deletion. Prieiga per internetą 2013–05–10. 39.http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0534. Prieiga per internetą 2013–10–12.
40. http://www.tutorhelpdesk.com/homeworkhelp/Biology-/. Prieiga per internetą 2013–10–12.
41. http://www.Chromosome-Structure-Assignment-Help.html. Prieiga per internetą 2014–03–02.
PRIEDAI
1 priedas.
5 lentel÷. Karvių duomenys.Eil. Nr.
Karv÷s Nr. ir vardas Primilžis kg, per laktaciją (305d.) 1. 03737831 Figa 11040 2. 02985513 Džilda 7982 3. 03737803 Virvut÷ 8368 4. 03737835 Liūt÷ 7622 5. 03737870 Dugn÷ 7824 6. 04203469 L÷kšt÷ 7636 7. 04368915 Lepš÷ 7353 8. 04368940 Tinta 7406 9. 04584829 Liūn÷ 7651 10. 04584900 Mišk÷ 7121 11. 03737929 Saus÷ 5618 12. 04203526 Arktis 5247 13. 04584859 Susk÷ 4047 14. 04584897 Balk÷ 5362 15. 04584919 Tašk÷ 5183 16. 04928181 Kuosa 3261 17. 05371094 M÷ta 3176 18. 05530982 Taika 5288 19. 04928165 Pūk÷ 6104 20. 05530955 Lukšt÷ 5403
