PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ Pluoštinių kanapių ( Cannabis sativa L.) bendras polifenolių ir flavonoidų nustatymas“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020.05.20 Silvija Beinarytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS
TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020.05.20 Silvija Beinarytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
SILVIJA BEINARYTĖ
PLUOŠTINIŲ KANAPIŲ (CANNABIS SATIVA L.) BENDRAS
POLIFENOLIŲ IR FLAVONOIDŲ NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1 Pluoštinių kanapių charakteristika ... 12
1.2 Pluoštinių kanapių (Cannabis Sativa L.) cheminė sudėtis bei jose esančios aktyvios medžiagos ... 14
1 .2. 1 Fenoliniai junginiai ... 15
1. 2. 2 Fenolinės rūgštys ir polifenoliai ... 16
1. 2. 3 Flavonoidai pluoštinėse kanapėse. ... 17
1. 3 Kanapėse esančių flavonoidų gydomasis poveikis ... 20
1. 4 Ekstrakcijos sąlygos fenolinių junginių kiekiui pluoštinėse kanapėse nustatyti ... 21
1. 5 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 22
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1.Tyrimo objektas ... 23
2.2. Tyrimo medžiagos ir reagentai ... 23
2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra ... 24
2.4. Pluoštinių kanapių paruošimas analizei ... 24
2.5. Pluoštinių kanapių ekstraktų paruošimas ... 25
2.6. Spektrofotometriniai metodai ... 26
2.6.1. Pluoštinių kanapių ekstraktų, bendras fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin – Ciocalteu metodu ... 26
2.6.2. Pluoštinių kanapių ekstraktų bendras flavonoidų kiekis išreikštas rutino ekvivalentu ... 26
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 28
3.2 Fenolinių junginių kiekio įvairavimo nustatymas ... 29
3.3. Flavonoidų kiekio įvairavimo nustatymas ... 32
4.IŠVADOS ... 36
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38
SANTRAUKA
S. Beinarytės magistro baigiamasis darbas ,,Pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) bendras polifenolių ir flavonoidų nustatymas“, darbo vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas, 2020.
Raktiniai žodžiai: pluoštinės kanapės, polifenoliai, fenoliniai junginiai, flavonoidai, spektrofotometrija.
Tikslas: Nustatyti pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) bendrą polifenolių ir flavonoidų kiekį, taikant spektrofotometrijos metodą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių kiekio nustatymui pluoštinėse kanapėse.
2. Nustatyti skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavoje bendrą fenolinių junginių (polifenolių) kiekį spektrofotometriniu metodu, pagal galo rūgšties ekvivalentą.
3. Nustatyti skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavoje bendrą flavonoidų kiekį spektrofotometriniu metodu, pagal rutina.
4. Palyginti tarpusavyje skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) žaliavoje esantį bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį.
Tyrimo metodas: tyrimui buvo naudota skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavos ekstraktai. Ekstraktai buvo gaunami pluoštinių kanapių žaliavą užpylus 70 proc. V/V etanolio ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje, 30 minučių kambario temperatūroje. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant Folin – Ciocalteu reagentą, rezultatus apskaičiuojant remiantis galo rūgšties ekvivalentu (apie 0,1g augalinės žaliavos ) mg/g. Bendras flavonoidų kiekis buvo nustatytas tuo pačiu metodu, tik rezultatus apskaičiuojant remiantis rutino ekvivalentu (apie 0,1g augalinės žaliavos ) mg/g.
Rezultatai ir išvados:
Įvairūs tyrimai įrodė, jog pluoštinių kanapių ekstraktų gamybai naudojama ultragarso vonelė. Šis metodas pagreitina antrinių metabolitų išeiga, nes jo metu pažeidžiama augalinės žaliavos ląstelės sienelė ir palaipsniui tirpiklis patenka į žaliavą. Mokslininkai nustatė, jog bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį parodo 70% (V/V) ekstrakcija, todėl pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavai ekstrahuoti buvo naudotas 70 % etanolis (V/V).
Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas pagal rūgšties ekvivalentą: 2017 m. rinktoje ,,Futura“ veislės antžeminės dalies žaliavoje buvo nustatytas didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (110,88 GRE mg/g). Mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas ,,Wojako“ veislės antžeminės dalies žaliavoje – 17,39 GRE mg/g.
Bendras flavonoidų kiekis apskaičiuotas pagal rutino ekvivalentą: didžiausias bendras flavonoidų kiekis buvo rastas ,,Futura“ veislės antžemines dalies žaliavoje, rinktoje 2017 m. (64,07 RE mg/g), mažiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas ,,Wojako“ veislės antžeminės dalies žaliavoje (6,85 RE mg/g).
Palyginus 4 ,, Savitika“ pluoštinių kanapių veisles, rinktas skirtingais metais, paaiškėjo, jo didžiausias bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis rastas 2017 m. rinktoje žaliavoje – 92,81 GRE mg/g ir 52,56 RE mg/g. Mažiausias - 28,38 GRE mg/g ir 7,81 RE mg/g – 2018 metais rinktoje žaliavoje.
SUMMARY
S. Beinarytės master's thesis ,, Fiber hemp (Cannabis sativa L.) common determination of polyphenols and flavonoids“, work manager Professor Dr. Liudas Ivanauskas. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry - Kaunas, 2020.
Keywords: fibrous hemp, polyphenols, phenolic compounds, flavonoids, spectrophotometry.
Objective: To determine the total polyphenols and flavonoids of fibrous hemp (Cannabis sativa L.) by spectrophotometry.
Work tasks:
1. To select the optimal extraction conditions for the determination of phenolic compounds in fibrous hemp.
2. To determine the total content of phenolic compounds (polyphenols) in the material of different varieties of fibrous hemp (Cannabis sativa L.) by spectrophotometric method, according to the gallic acid equivalent.
3. To determine the total amount of flavonoids in the material of different varieties of fibrous hemp (Cannabis sativa L.) by spectrophotometric method, according to routine.
4. To compare the total content of phenolic compounds and flavonoids in the material of various fibrous hemp (Cannabis sativa L.).
Test method: in the study were used extracts from different varieties of aboveground hemp (Cannabis sativa L.). The extracts were obtained by adding 70% v/v ethanol to the fibrous hemp material and extracting in an ultrasonic bath for 30 minutes at room temperature. The total content of phenolic compounds was determined spectrophotometrically using Folin - Ciocalteu reagent, the results being calculated on the basis of the gallic acid equivalent (about 0,1g of vegetable material)
in mg/g. The total amount of flavonoids was determined by the same method, only the results were calculated on the basis of the rutin equivalent (about 0.1g of plant material) in mg/g.
Results and conclusions:
Various studies have shown that an ultrasonic bath is used to produce fibrous hemp extracts. This method accelerates the yield of secondary metabolites because it damages the cell wall of the plant feedstock and gradually introduces the solvent into the feedstock. The researchers found that 70% (v/v) extraction indicated the total content of phenolic compounds and flavonoids, so 70% ethanol (V/V) was used to extract the aboveground material of hemp (Cannabis sativa L.).
The total amount of phenolic compounds is calculated on the basis of the acid equivalent: in 2017 The highest total content of phenolic compounds (110.88 GRE mg/g) was determined in the collected above-ground material of the Futura variety. The lowest total content of phenolic compounds was found in the above-ground material of the Wojako variety - 17.39 GRE mg/g.
Total flavonoids are calculated as rutin equivalent: the highest total amount of flavonoids was found in the above-ground raw material of Futura variety collected in 2017 (64.07 RE mg/g), the lowest total amount of flavonoids was found in the above-ground material of Wojako variety (6.85 RE mg/g) .
A comparison of 4 varieties of Savitika fibrous hemp collected in different years revealed that its highest total content of phenolic compounds and flavonoids was found in the material collected in 2017 - 92.81 GRE mg/g and 52.56 RE mg/g. The lowest - 28.38 GRE mg/g and 7.81 RE mg/g - in the material collected in 2018.
SANTRUMPOS
THC tetrahidrokanabinolis CBG kanabigerolis
CBD kanabidiolis CBC kanabichrominas
GAE galo rūgšties ekvivalentas RE rutino ekvivalentas
ĮVADAS
Pastaruoju metu ypač išaugo susidomėjimas pluoštinėmis kanapėmis, kurį skatina mokslo naujovės, rinkos pasiūla, augantys vartotojų poreikiai, aplinkos pokyčiai. Kanapė yra augalas, žinomas žmonijai jau apie dešimt tūkstančių metų. Dėl savo psichotropinių savybių ne vieną dešimtmetį kanapes buvo uždrausta ne tik vartoti, bet ir auginti. Tačiau šiuo metu šis augalas išgyvena ,,renesansą“, susidomėjimas pluoštinėmis kanapėmis auga ne tik visame pasaulyje, bet ir Lietuvoje. Didžiausi pluoštinių kanapių plotai Lietuvoje sutelkti Klaipėdoje, Šiaulių bei Vilniaus apskrityse. Tai tikriausiai vienintelis augalas, kuris gamina tiek daug specifinių junginių – fitokanabinoidų [38].
Išaugus susidomėjimui pluoštinių kanapių farmakologinėmis savybėmis yra siekiama ištirti šiuose augaluose besikaupiančias biologines medžiagas, nustatyti jų išgavimo būdus ir pritaikyti jas medicininių preparatų gamyboje. Mokslininkai intensyviai tiria šiuos augalus, pasižyminčius fenolinių junginių gausa. Šiuo metu šalyje auginamos 22 pluoštinių kanapių rūšys. KTU prof. dr. Petro Rimanto Venskutonio teigimu, kanapių sėklos yra sveikatai naudingų polinesočiųjų riebalų rūgščių, baltymų ir kitų maistinių medžiagų šaltinis, lapai ir žiedynai pasižymi dideliu bioaktyviųjų junginių kiekiu [38]. Iš kanapių sėklų spaudžiamas aliejus, kuris vis dažniau naudojamas kosmetikoje [24]. Kitos veislės auginamos pluoštui, automobilių ar tekstilės pramonei skirtų medžiagų gamybai. Kai kurios kanapių veislės auginamos dėl lapijos ir dažniausiai naudojama biomasei, arbatų gamybai [3].
Šio darbo tyrimo objektas – Lietuvoje augančių skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies augalinė žaliava. Mokslininkai pasitelkę selekciją išvedė tokias kanapių veisles, kurios pasižymi dideliu kanabidiolio (CBD) kiekiu ir beveik neturi tetrahidrokanabinolio (THC) . Šios CBD turinčios kanapių veislės turi didelį pranašumą gaminant vaistinius preparatus, nes beveik neturi šalutinio poveikio.
Darbo naujumas ir aktualumas – pluoštinių kanapių augalinė žaliava yra plačiai tiriama, bet vis dar trūksta tyrimų nustatančių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L. )antžeminėje augalo žaliavoje. Atliekami standartiniai kanabinoidų ir kanapių ekstraktų tyrimai suteikia žinių apie kanabinoidų sąveikas, tačiau gauti rezultatai gali būti nulemti ir kitų kanapių komponentų, kaip flavonoidų, riebalų rūgščių ir kt.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
.
Tikslas: Nustatyti pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) bendrą polifenolių ir flovonoidų kiekį, taikant spektrofotometrijos metodą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių kiekio nustatymui pluoštinėse kanapėse.
2. Nustatyti skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) žaliavoje bendrą fenolinių junginių (polifenolių) kiekį spektrofotometriniu metodu, pagal galo rūgšties ekvivalentą.
3. Nustatyti skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) žaliavoje bendrą flavonoidų kiekį spektrofotometriniu metodu, pagal rutina.
4. Palyginti tarpusavyje skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) žaliavoje esantį bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Pluoštinių kanapių charakteristika
Augalas kanapė įvairiuose šaltiniuose apibrėžiamas panašiai, teigiant, jog kanapė (lot. Cannabis) – tai vienas seniausių kultūrinių augalų, kilusių iš Vidurio Azijos, priklausančių magnolijų (Magnoliophyta) genčiai, kanapinių (Cannabaceae) šeimai. Taip pat pabrėžiant, jog tai vienmetis žolinis augalas, galintis augti įvairiomis klimatinėmis sąlygomis [20][35][38].
Pagal morfologinius požymius kanapės skirstomos į 3 rūšis [23][45]: Cannabis sativa – sėjamoji kanapė;
Cannabis indica – indinė kanapė – marichuaninė, narkotinė kanapė, kuri savyje kaupia daug psichiką veikiančios medžiagos THC.
Cannabis ruderalis – šiukšlyninė kanapė, dažnai priskiriama pluoštinių kanapių porūšiui, nes joje nėra daug THC kiekio, tačiau lyginant ją su sėjamąja kanape, ji yra kur kas mažesnė ir retai naudojama pluošto gamyboje.
Pagal Lietuvoje galiojantį Pluoštinių kanapių įstatymą, nuo 2013 metų mūsų šalyje leidžiama auginti tik sėjamosios kanapės (Cannabis sativa L.) rūšies veislių augalus, atkreipiant dėmesį į tai, jog išdžiovintoje medžiagoje THC turėtų būti ne daugiau kaip 0,2 proc. Auginimas leidžiamas tik pramoniniams tikslams (pluoštui, sėkloms) ir sodininkystei [38].
Šiuo metu pluoštinės kanapės auginamos visoje šalyje, ypač vidurio ir šiaurės vakarų Lietuvoje. Kanapes auginti labiausiai tinka derlingi, mineraliniai dirvožemiai, kurių pH 7,1 – 7,6. Kanapės sėjamos, kai dirvos paviršius įšyla iki 8 – 10 laipsnių temperatūros. Gavusios pakankamai, drėgmės kanapės sudygsta per 8 – 10 dienų [50].
Kanapių stiebai yra žalios spalvos, gali užaugti iki 0,9 – 4,5 m. aukščio. Jie būna paprasti arba šakoti, tuščiaviduriai, briaunoti, padengti gana trumpais plaukeliais. Viršutinė stiebo dalis išsišakoja ir yra gausiai lapuota. Kanapės atpažįstamos, dėl joms būdingų dygliuotų lapų [16][54]. Jie yra 2,5 – 15 cm ilgio ir 0,35 – 2 cm pločio sudėtiniai, plaukuoti, dantytais kraštais. Pluoštinės kanapės ant atskirų augalų (rečiau ant to paties augalo) gali subrandinti vyriškus ir moteriškus žiedus. Tai dvinamis augalas. Vyriškieji augalai vadinami pleiskėmis, o moteriškieji – grūdėmis. Pradžioje augalai auga vienodai, tačiau prieš žydėjimą pleiskės pradeda augti žymiai greičiau, o žydėjimo metu grūdės vėl praauga pleiskes [22]. Pluoštinės kanapės vaisius pilkšvai rusvos spalvos riešutėlis
su dviem sėklaskiltėm [13][21]. Kanapių sėklos gali būti pilkos, tamsiai rudos, margos, padengtos plonu, kietu lukštu. Jos turi apie 30 – 35 proc. riebalų ir apie 20 proc. baltymų [50] (žiūrėti 1 pav.):
1 pav. Pluoštinės kanapės augalas
Pluoštinių kanapių augintojai nustatė, jog kanapės yra itin svarbūs augalai sėjomainai, nes palieka daug organinių medžiagų dirvoje, gerina ir neišsekina dirvožemio. Buvo pastebėta, kad šie augalai yra itin atsparūs daugeliui kenkėjų. Dėl šios priežasties kanapes imta auginti greta kitų kultūrų ir jos tapo kenkėjus atbaidančia priemone. Kanapės vienas iš ekologiškiausių ir universaliausių augalų. Jų auginimui nereikalingi jokie cheminiai preparatai. Jos puikiai auga be trąšų ir pesticidų, lengvai prisitaiko prie bet kokių augimo sąlygų [5].
Autoriai tiriantys kanapes pabrėžia, jog šiuo metu Europoje ir Lietuvoje dominuoja produktų iš kanapių pluošto gamyba, vystomas sėklų perdirbimas į aliejų, baltymus, miltus. Jų teigimu, kalbant apie pluoštinių kanapių produktus/gaminius, labai svarbu juos atskirti nuo kitų kanapių (ne pluoštinių) produktų, nes pluoštinių kanapių produktai gaminami iš pluoštinės kanapės, kuri yra teisėtai auginama visose ES šalyse. Apibendrinant įvairių šaltinių informaciją, galima teigti, jog tai yra tokia kanapių rūšis, kurioje yra sumažintas psichoaktyvios medžiagos (THC) kiekis, todėl ji
nėra tinkama rekreacijai, o pati žaliava išsiskiria tuo, jog geba sukurti didelės pridėtinės vertės galutinį produktą [38].
1.2 Pluoštinių kanapių (Cannabis Sativa L.) cheminė sudėtis bei jose esančios
aktyvios medžiagos
Sėjamose pluoštinėse kanapėse yra nustatyta daugiau nei 500 junginių. Viena iš
pagrindinių junginių grupių yra kanabinoidai. Kanabinoidai – tai junginių grupė, kurių struktūroje yra C 21 terpefenolinis karkasas. Moksliniais tyrimais įrodyta, jog tai plačiai ištyrinėta, labai specifiška junginių grupė, daranti poveikį žmogaus nervų sistemai [9].
Įvairių autorių darbuose yra teigiama, jog augaluose randami kanabinoidai vadinami fitokanabinoidais, kurie dar skirstomi į dvi pagrindines rūšis. Pirmajai rūšiai priklauso tetrahidrokanabinolinė rūgštis (THC), randama specialiai marichuanos gamybai naudojamuose augaluose. Antroji rūšis yra pluoštinių kanapių augaluose randamas kanabidiolis arba CBD, kuris pasižymi priešuždegiminėmis, nerimo ar traukulių malšinimo savybėmis. Mokslininkų teigimu, priešingai nei THC, CBD neturi jokių psichoaktyvių savybių [6]. Todėl kanapės pasižyminčios dideliu CBD ir mažesniu THC kiekiu yra vadinamos pluoštinėmis kanapėmis [9].
Kanabinoidai – tai kanapių augaluose randamos medžiagos. Pagal cheminę sudėtį jas galima suskirstyti į dešimt pagrindinių pogrūpių. Iš jų plačiausiai žinomi šie kanabinoidai [48]:
THC – tetrahidrokanabinolis (9 tipai),
CBG – kanabigerolis – pirmasis rastas kanabinoidas – (6 tipai), CBD – kanabidiolis (7 tipai),
CBC – kanabichrominas (5 tipai).
Kai kalbama apie pluoštines kanapes, ypatingas dėmesys skiriamas CBD (kanabidioliui), nes jis natūraliai randamas kanapėse ir šis junginys jau nebėra mažai žinoma molekulė. Kadangi pluoštinėse kanapėse CBD yra pakankamai daug, jo ištraukimas iš kanapių augalo yra gana lengvas. Tyrimais jau įrodyta, jog CBD yra antipsichozinis junginys, kuris užkerta kelią cheminei medžiagai, kuri įtakoja nuotaiką, skausmą, protinę funkciją smegenyse, taip pat panaikina psichoaktyvų THC poveikį, tačiau vis dar lieka neaišku, kaip konkrečiai veikia CBD [48].
Pagal THC ir CBD kiekį knapių genties augalai klasifikuojami į penkis chemotipus - pluoštinės kanapės priklauso trečiajam chemotipui [26][44]:
II chemotipas – vidutinio tipo kanapės. Jos pasižymi tiek narkotinio, tiek pluoštinio tipo augalų savybėmis (0,05 – 5 proc. THC ir 0,9 – 7,3 proc. CBD),
III chemotipas – pluoštinio tipo kanapės, kuriose gausu CBD (0,05 – 0,7 proc. THC ir 1,0 – 13,6 proc. CBD),
IV chemotipas – kanabiogerolį kaupiančios kanapės, V chemotipas – nekanabinoidinio tipo kanapės.
Cannabis sativa L. žaliavoje yra nustatyta nekanabinoidinio tipo fenolinių junginių iš kurių 20 yra flavonoidai, daugiausia flavono ir flavonolio tipo anglikonų: apigenino, luleonino, kvercetino, kaempferolio, C – glikozidai ir O – gliukozidai [3].
1 .2. 1 Fenoliniai junginiai
Fenolinių junginių klasę sudaro 500 junginių, šie junginiai dar skirstomi į 12 poklasių. Fenoliniai junginiai yra antriniai augalų metabolitai. Tai įvairios biocheminės sudėties junginiai – alelochemikalai, galintys paveikti sėklų daigumą, augalų augimą ir produktyvumą [49]. Pramoniniu požiūriu jie yra svarbūs biocheminių medžiagų šaltiniai, padedantys augalams prisitaikyti prie aplinkos, įveikti stresines sąlygas. Tokie veiksniai kaip temperatūra, drėgmė, šviesa įtakoja augalų ir antrinių metabolitų gamybą [18][46].
Fenoliniai junginiai augaluose atlieka labai svarbias funkcijas, kaip: baltymų sintezė, maistinių medžiagų įsisavinimas, fermentų aktyvavimas [8].
Fenoliniai junginiai, kaip cheminiai signalai dalyvauja ląsteliniuose ir tarpląsteliniuose procesuose. Nuo jų priklauso augalo spalva, skonis, kvapas, struktūra, sėklų daigumo procesas, vystymasis, atsparumas kenkėjams [34].
Fenoliniai junginiai klasifikuojami įvairiai. Kartais atsižvelgiama į anglies atomų skaičių molekulėse, kartais – į hidroksilo grupių skaičių, nors dažniausiai klasifikuojami į paprastus fenolinius junginius ir į polifenolius [53]. Vieni autoriai išskiria dvi, kiti keturias fenolinių junginių grupes [2]:
1. BENZENDIOLIAI – tai paprasčiausios struktūros fenoliniai junginiai, kurių pagrindas yra hidroksifenolis;
2. FENOLINĖS RŪGŠTYS – tai rūgštys gaunamos iš benzoinės (C6 – C1) arba cinamono (C6 – C3) rūgščių ir susijungiančios į ilgus polimerus;
4. FLAVONOIDAI – jų struktūros pagrindą sudaro 2 – fenilbenzo – y – pirino žiedas (C6 – C3 – C6).
Aromatinis žiedas yra pagrindinis visų fenolinių junginių struktūros bruožas, galintis turėti vieną ar kelias hidroksilo grupes [41]. Dar viena išskirtinė fenolinių junginių savybė yra ta, kad jie dažnai būna sujungti su kitomis molekulėmis (cukraus arba baltymo). Egzistuoja ir laisva fenolinių junginių forma, bet šie junginiai yra toksiški [26].
1. 2. 2 Fenolinės rūgštys ir polifenoliai
Jau buvo minėta, jog fenoliniai junginiai skirstomi į fenolines rūgštis ir polifenolius. Mokslinių tyrimų pagalba nustatyta, jog fenolinės rūgštys turi dvi klases: hidroksibenzenkarboksi rūgštys ir hidroksicinamono rūgštys. Įrodyta, kad individualius rūgščių skirtumus lemia aromatinio žiedo hidroksilo ir metoksi grupių pakaitai. Hidroksibenzenkarboksi rūgštims yra būdinga C6 – C1 struktūra, o hidroksicinamono rūgštims charakteringa C6 – C3 struktūra, kuri sujungta trijų anglies atomų šonine grandine [32].
Polifenoliai – natūralios fitocheminės medžiagos, randamos augaluose, atliekančios svarbų vaidmenį išlaikant sveikatą ir bendrą organizmo gerovę. Tai medžiagos aptinkamos daugelyje augalinės kilmės maisto produktų. Jų yra apie 8 tūkstančiai rūšių [28]. Vieni autoriai nagrinėja, kaip polifenoliai veikia augalus, kiti – kaip polifenoliai veikia žmogaus organizmą. Tokiu būdu mokslinėje literatūroje aptinkama įvairių polifenolių apibūdinimų. Galima rasti teiginių, jog polifenoliai saugo augalus nuo ultravioletinių saulės spindulių, protogenų, oksidacinės žalos ir atšiaurių klimato sąlygų arba, kad polifenoliai yra nemaistiniai bioaktyvūs mitybos komponentai, kurie pasižymi priešuždegiminiu, antialerginiu, priešvirusiniu, priešvėžiniu poveikiu [30]. Pabrėžiama, kad žmogaus organizmas galėtų įsisavinti polifenolius yra reikalingi riebalai, nes polifenoliai turi įdomią savybę – jie tirpsta riebaluose. Mityba, kurioje yra daug nesočiųjų riebalų rūgščių, optimatizuoja polifenolio kiekį. Tyrimais įrodyta neabejotina polifenolių svarba žmogaus sveikatai, ypač tiems žmonėms, kurie serga II tipo cukriniu diabetu, širdies ir kraujagyslių ligomis, Alsheimerio liga, osteoporoze ar vėžiu [7][31].
Skiriamos keturios pagrindinės polifenolių kategorijos, kurios dar skaidomos į papildomus pogrūpius, atsižvelgiant į jų sudėtyje esančių fenolio žiedų skaičių ir struktūrinius elemantus, jungiančius šiuos žiedus [33][49]:
1. Flavonoidai – pasižymintys antioksidacinėmis ir prišuždegiminėmis savybėmis. Flavonai: flavonoliai, flavononai, izoflavonai, antocianinai, halogenai, katechinai.
2. Stilbenai, labiausiai žinomas – resveratrolis. 3. Lignanai.
4. Fenolio rūgštys: hidroksibenzoninės rūgštys, elago rūgštis.
Labiausiai ištirta ir žinoma polifenolių grupė yra flavonoidai. Manoma, jog flavonoidai (lot.fovus – geltonas) yra labiausiai ištirta ir žinoma polifenolių grupė [37]. Tai heterocikliniai, geltoni organiniai junginiai, augalų pigmentai, kurie randami augalų žieduose, lapuose, vaisiuose. Jie suteikia augalui spalvą, kvapą, skonį [11].
1. 2. 3 Flavonoidai pluoštinėse kanapėse.
Flavonoidai – tai pagrindiniai kanapių sintetinami, biologiškai aktyvūs antriniai metabolitai. Antriniai metabolitai yra organiniai junginiai, kurie susidaro augalų ląstelėse, audiniuose ir organuose vykstant medžiagų apykaitai [25]. Flavonoidai yra tarpiniai ir galutiniai medžiagos apykaitos produktai. Augalai kaupia ne tik flavonoidus, bet ir kitus antrinius metabolitus, kaip: eterinius aliejus, alkaloidus, glikozidus ir kt. [43]. Visi flavonoidai turi bendrinę struktūrą, kuri susideda iš pagrindinės grandies – 15 anglies atomų skeleto, kurį sudaro du benzeno žiedai ( A ir B žiedai), kurie sujungti per heterociklinį pirano žiedą (C) ir ši struktūra vaizduojama C6 – C3 – C6 [8][41](žiūrėti 2 pav.).
2 pav. Flavonoidų pagrindinė struktūra
Flavonoidai yra polifenoliniai, hidrofobiniai, organiniai junginiai, pasižymintys silpnomis rūgštinėmis savybėmis [47]. Flavonoidai atlieka svarbią gynybinę funkciją, prisideda prie tokių fiziologinių veiksnių, kaip sėklos brendimas. Jų randama beveik visuose žaliuose augaluose, bet
gausiausiai jų kiekis aptinkamas žiedynuose ir lapuose. Flavonoidai augaluose yra svarbūs, nes [10][52]:
pagerina augalų toleranciją tiek biotiniams, tiek abiotiniams stresams;
atlieka pirmines antioksidacines funkcijas, atsakydami į įvairius abiotinius stresus augaluose;
yra veiksmingi endogeninio auksino judėjimo reguliatoriai, todėl atlieka augalų vystymosi reguliatorių vaidmenį;
padeda kontroliuoti atskirų augalo organų ir viso augalo vystymąsi; padeda kontroliuoti vystymosi procesus eukariotinėse ląstelėse.
Flavonoidai klasifikuojami pagal: cheminės struktūros pagrindą, biosintezės kilmę, hetero ciklo dydį, šoninių radikalų padėtį, cukrų. Jų molekulinė masė yra maža [39]. Skiriamos trys didelės flavonoidų klasės: chalkonų, auronų ir flavonoidų. Tai reiškia, jog šių grupių atstovai turi du benzeno žiedus, sujungtus trijų anglies atomų grupe, o C3 grupės išdėstymas lemia šių junginių klasifikaciją [29]. Pagal bendrinės struktūros principus flavonoidai skirstomi į pagrindines grupes ir poklases. Flavonoidų poklasių junginius sudaro du aromatiniai žiedai (A ir B), sujungti anglies atomais, kurie dažnai sudaro deguonimi prisotintą heterociklą C (pirano arba pirono darinys)[14]. C žiedo 4 padėtyje žiūrima, ar yra ketono grupė; ar yra dvigubas ryšys tarp 2 ir 3 anglies atomų; ar 3 padėtyje yra hidroksi grupė. Būtent nuo hidroksi grupių išdėstymo ir jų skaičiaus B žiede, flavonoidai skirstomi į atskirus poklasius [7] (žiūrėti 1 lentelėje):
1 lentelė. Kanapėse randamų flavonoidų klasių ir poklasių pavadinimai ir jiems būdinga cheminė struktūra Flavonoidų klasės pavadinimas Junginio pavadinimas Struktūra Flavonas Apigeninas
Flavonas Luteolinas
Flavonas Viteksinas
Flavonas Izoviteksinas
Flavonolis Kemferolis
Flavonas Orientinas Prenilo flavonoidai Kanflavinas A Prenilo flavonoidai Kanflavinas B
Cannabis sativa L. žaliavoje jau yra nustatyta apie 20 flavonoidų, priklausančių flavonų ir flavonolių poklasiams, taip pat nustatyti unikalūs pluoštinių kanapių flavonai – kanflavinas A ir kanflavinas B [4]. Tai mokslininkų 1985 metais identifikuotos dvi svarbios molekulės, kurios kanapėms suteikia skausmą malšinančias savybes. Iš visų 20 kanapėse randamų antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių flavonoidų, tik šios dvi molekulės neaptinkamos jokiuose kituose augaluose [12].
1. 3 Kanapėse esančių flavonoidų gydomasis poveikis
Pluoštinės kanapės sudėtyje esantys flavonoidai (flavonai ir flavonoliai) veikia, kaip antioksidantai ir turi platų poveikio spektrą – veikia priešuždegimiškai, veiksmingi prieš vėžį, neurodegeneracines ligas [17][20].
Kvercetinas, komferolis, luteolinas – vartojant dideliais kiekiais, žymiai sumažina bendrą vėžio riziką [27].
Kvercetinas – turi priešuždegimines, neuroprotekcines, baktericidines savybes, apsaugo nuo širdies ir kraujagyslių ligų [15].
Kamferolis – sumažina gastrito ir pankretito uždegiminius pažeidimus [27]. Apegininas – pasireiškia estrogeninėmis ir priešvėžinėmis savybėmis [12].
Epikatechinas – gerina kraujagyslių ir širdies būklę, tinka diabetui, kepenų ligų atveju, kaip ir dauguma fenolinių junginių veikia priešuždegimiškai [16].
Flavonoidai žmogaus organizmą veikia kaip antioksidantai, neutralizuoja žmogaus organizme medžiagų apykaitos metu susidariusių laisvųjų radikalų perteklių, kuris žaloja kūno ląsteles, sukelia širdies ir kraujagyslių bei vėžio ligas, skatina jų vystymąsi [54]. Šie antioksidantai sujungia svarbiausius metalus, reguliuoja medžiagų apykaitą, lėtina oksidaciją ir turi priešuždegiminį poveikį. Kai kurie flavonoidai mažina radioktyvių medžiagų poveikį organizmui, sureguliuoja kraujagyslių elastingumą [51].
1. 4 Ekstrakcijos sąlygos fenolinių junginių kiekiui pluoštinėse
kanapėse nustatyti
Atlikus mokslinės literatūros analizę paaiškėjo, jog nustatyti bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį pluoštinėse kanapėse, galima naudojant įvairius chromotografinius ir spektrofotometrinius tyrimo metodus.
Fenolinius junginius galima išskirti, ekstrachuoti tiek iš šviežios, tiek iš džiovintos pluoštinių kanapių antžeminės dalies žaliavos. Paaiškėjo, jog labiausiai paplitęs yra ekstrakcijos tirpikliais metodas. Fenolinių junginių ekstrakcijai mokslininkai dažniausiai pataria naudoti šiuos tirpiklius: metanolio, etanolio, acetono, jų mišinius, ar įvairias šių mišinių proporcijas su vandeniu. Būtent nuo tirpiklio tipo priklauso ekstrahuotų junginių kiekis, kuriuos įtakoja ekstrakcijos laikas, temperatūra, mėginio – tirpiklio santykis ar jo fizikocheminės savybės.
Ekstrakcijai galima naudoti mikrobangas, ultragarsą, subkritinį vandenį ar kitus subkritinius skysčius, suslėgtus skysčius [16]. Dėl savo veiksmingumo dažniausiai naudojama ekstrakcija ultragarsu ir šis metodas ypač taikomas farmacijos pramonėje.
1. 5 Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Pluoštinės kanapės - tai vienas iš ekologiškiausių ir universaliausių augalų, kurių auginimui nereikalingi jokie cheminiai preparatai. Kanapės puikiai auga be trąšų ir pesticidų, lengvai prisitaiko prie bet kokių augimo sąlygų.
Kanapės pasižyminčios dideliu CBD ir mažesniu THC kiekiu yra vadinamos pluoštinėmis kanapėmis, būtent apie jas ir kalbama literatūros apžvalgoje. Pagal chemotipą pluoštinės kanapės priklauso trečiąjam, nes jose gausu CBD (0,05 – 0,7 proc. THC ir 1,0 – 13,6 proc. CBD). Ypatingas dėmesys skiriamas CBD (kanabidioliui), nes jis natūraliai randamas kanapėse ir šis junginys jau nebėra mažai žinoma molekulė. Kadangi pluoštinėse kanapėse CBD yra pakankamai daug, jo gavimas iš kanapių augalo yra gana lengvas.
Literatūros apžvalgoje atkreipiamas dėmesys į pluoštinės kanapės Cannabis Sativa L. žaliavoje atrandamus fenolinius junginius ir ypatingas dėmesys skiriamas flavonoidams, nes tai yra viena didžiausių fenolinių junginių ir antrinių metabolitų grupių, kurie randami beveik visose augalo dalyse. Jau atliktuose kanapių sudėties tyrimuose yra nustatyti 22 fenoliniai junginiai: konflavinas A ir B (specifiniai kanapių flavonoidai), kvercetino – 3 – glukozidas, katechinas ir epihatechinas, kananflavinas A, B ir C, luteolin 7 – 0 – glukozidas, apeginin – 7 – glukozidas, kampferolis, apigininas, kvercetinas, luteolinas ir kt.
Fenoliniai junginiai klasifikuojami įvairiai, atsižvelgiant į anglies atomų skaičių molekulėse, į hidroksilo grupių skaičių, arba dažniausiai klasifikuojami į paprastus fenolinius junginius ir į polifenolius.
Flavonoidai augaluose gerina augalų toleranciją biotiniams, bei abiotiniams stresams; atlieka pirmines antioksidacines funkcijas, atsakydami į įvairius abiotinius stresus augaluose; yra veiksmingi endogeninio auksino judėjimo reguliatoriai, kurie atlieka augalų vystymosi reguliatorių vaidmenį, padeda kontroliuoti atskirų augalo organų ir viso augalo vystymąsi, bei atsako už procesus eukariotinėse ląstelėse.
Pluoštinėse kanapėse atrandami fenoliniai komponentai turi labai platų poveikio spektrą, o jų gydomoji vertė pasireiškia, veikiant įvairiems jos komponentams.
2. TYRIMO METODIKA
2.1.Tyrimo objektas
Tyrimo objektas buvo Lietuvoje, Aukštaitijos krašte augančios pluoštinės kanapės
(Cannabis sativa L.). Tyrimui naudotos skirtingų Lietuvoje augančių pluoštinių kanapių veislių antžeminės dalys rinktos skirtingais metais (2 lentelė).2 lentelė. Tyrimui naudotos pluoštinių kanapių veislės
Mėginio numeris Veislė
Nr.1 Uso Nr.2 Segužvn Nr.3 Wojako Nr.4 Carmagnola Nr.5 Fedora Nr.6 Finola Nr.7 Felina Nr.8 Fepina Nr.9 Savitika (2019) Nr.10 Savitika (2018) Nr.11 Savitaka ( CBG-2018) Nr.12 Savitika (2017) Nr.13 Futura (2017) Nr.14 Futura (2019) Nr.15 Felix Vanda
Lentelėjė matome visas tyrimui naudotas pluoštinių kanapių veisles. Nr.9, Nr.10, Nr.11 ir Nr.12 yra ta pati „Savitika“ pluoštinių kanapių veislė, tačiau skiriasi žaliavos surinkimo metai (2019, 2018, CBG 2018, 2017 ). Taip pat skiriasi ir „Futura“ veislės pluoštinių kanapių surinkimo metai (2017, 2019).
2.2. Tyrimo medžiagos ir reagentai
Etanolis 96 proc. (Vilniaus degtinė);
Tirpalų gamybai naudojamas išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV);
Folin-Ciocalteu reagentas (Merk, Vokietija); Galo rūgštis 98 proc. ( ,,ACROS ORGANICS”);
Ledinė acto rūgštis 99,5 proc. (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Aliuminio chloridas 99,99proc. (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Heksametilentetraminas ≥ 99,9 proc. (Roth, Vokietija);
Metanolis 99,8proc. (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Rutino reagentas 97,11proc.( ,,HWI ANALYTIK GMBH”).
2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra
Analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija).
Pluoštinės kanapės augalinės žaliavos ekstraktai buvo gaminami naudojant ultragarso vonelę (WiseClean).
Bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą (Dynamica, HALO DB-20).
Mėginiams tirti buvo naudojamos 1cm skersmens kiuvetės.
Žaliavos drėgmei nustatyti buvo naudojamas drėgmės analizatorius.
2.4. Pluoštinių kanapių paruošimas analizei
Prieš atliekant tyrimą, reikėjo įvertinti kiekvienos pluoštinės kanapės veislės antžeminės dalies žaliavos drėgmės kiekį. Drėgmės kiekis augalinėje žaliavoje buvo įvertinta naudojant drėgmės analizatorių. Pluoštinių kanapių drėgmės kiekis buvo matuojamas pasvėrus apie 1 g antžeminės dalies žaliavos ir suberta ant analizatoriuje esančios lėkštutės. Matuojama 1030C
3 lentelė. Pluoštinių kanapių veislių antžeminės žaliavos dalies drėgmės kiekis
Pluoštinių kanapių veislės
Antžeminės žaliavos dalies drėgmės kiekis (procentais) Uso 7,44 Sequžvn 7,24 Wojako 8,77 Carmagn 9,08 Fedora 8 Finola 8,75 Felina 6,96 Fepina 13,16 Savitika 7,12 Savitika 8,15 Savitika 8,89 Savitika 7,60 Futura 7,25 Futura 14,83 Felix Vanda 9,05
Iš lentelėje pateiktų duomenų matoma, jog skiriasi pluoštinių kanapių veislių antžeminės dalies (stiebų, lapų, žiedų ir sėklų) žaliavos drėgmės kiekis. Tos pačios veislės pluoštinių kanapių rinktų skirtingais metais drėgmės kiekis skiriasi.
2.5. Pluoštinių kanapių ekstraktų paruošimas
Augalinių pluoštinių kanapių ekstraktai buvo gaminami iš antžeminės dalies žaliavos, kuriai priklauso stiebas, lapai, žiedai, sėklos. Ekstraktui pagaminti buvo atsverta apie 0,1 g smulkintos pluoštinių kanapių antžeminės dalies žaliavos, kuri buvo supilta į 10 ml tūrio kolbutę ir į ją įpilta 8 ml 70% V.V etanolio. Kolbutė užkemšama ir dedama ekstrakcijai į ultragarso vonelę (Wise Clean) 30 minučių. Gautas ekstraktas filtruojamas per 25mm skersmens ir 0,22 mikrometrų porų dydžio švirkštų filtrus (Frisenette). Toliau ekstraktai buvo laikomi stikliniuose buteliukuose ir paliekami tolimesnei analizei.
2.6. Spektrofotometriniai metodai
2.6.1. Pluoštinių kanapių ekstraktų, bendras fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin – Ciocalteu metodu
Bendram fenolinių junginių kiekiui pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) ekstraktuose nustatyti buvo naudojamas spektrofotometrijos metodas. Norint atlikti tyrimą šiuo metodu, pirmiausiai reikėjo pasiruošti darbinį reagentą, lyginamąjį tirpalą, bei etanolinius galą rūgšties tirpalus.
Darbinis reagentas – 7%. natrio karbonato tirpalas, kuris reikalingas atlikti analizei gaminamas taip: atsveriama 17,5 g natrio karbonato medžiagos, dedama į 250 ml kolbą, užpilama išgrynintu vandeniu ir gerai išmaišoma. Taip pat analizei imama 1 ml pluoštinės kanapės ekstrakto, kuris sumaišomas su 1 ml Folin-Ciocalteu reagentu ir 9 ml išgryninto vandens. Po 5 minučių įpilamas 10 ml 7%. natrio karbonato tirpalas, taip jis praskiedžiamas. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir 90 minučių laikomas visiškoje tamsoje, apsaugant jį nuo tiesioginių saulės spindulių. Po 90 min. spektrofotometru esant, 750 nm šviesos bangos ilgio matuojama tirpalo absorbcija. Matavimai kartojami tris kartus.
Lyginamieji ir etanoliniai galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat, tik ruošiant lyginamąjį tirpalą vietoj pluoštinės kanapės ekstrakto pilame 1 ml išgryninto vandens, o ruošiant etanolinius galo rūgšties tirpalus, vietoj pluoštinės kanapės ekstrakto pilame 1 ml žinomos koncentracijos galo rūgšties tirpalo. Tokiu būdu buvo paruošti penkių koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,5 mg/ml; 1,0 mg/ml; 1,5 mg/ml; 2,0 mg/ml ir 2,5 mg/ml.
Spektrofotometrijos metodas vienas iš paprastesnių analizės metodų naudojamų fenolinių junginių kiekiui įvertinti. Naudojant kartu Folin-Ciocalteu regentą, dėl cheminės redukcijos fenoliniai junginiai įgauna mėlyną spalvą ir matuojama prie 760 nm šviesos bangos ilgio [21]. Naudojant spektrofotometrijos tyrimą, buvo siekiama paruoštuose pluoštinių kanapių ekstraktuose nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį, apskaičiuotą pagal galo rūgšties ekvivalentą ir nustatant jį Folin-Ciocalteu metodu.
2.6.2. Pluoštinių kanapių ekstraktų bendras flavonoidų kiekis išreikštas rutino ekvivalentu
Pluoštinių kanapių ekstraktų bendras flavonoidų kiekis buvo nustatytas naudojant spektrofotometrinį metodą ir apskaičiuojamas pagal rutino ekvivalentą. Kaip ir fenoliniams
junginiams taip ir flavonoidams reikėjo pasiruošti darbinį reagentą, lyginamąjį tirpalą, bei etanolinius rutino tirpalus.
Tyrimui buvo gaminamas reagentas taip: 4 ml 96%. etanolio, 0,2 ml 33%. ledinės acto rūgšties. 0,8 ml 5%. heksametilentetramino, kuriam pasigaminti reikia 5 g heksametilentetramino medžiagos tirpinama 100 ml kolbutėje distiliuotame vandenyje iki žymės. 0.6 ml 10%. aliuminio chlorido, kuriam pasigaminti reikėjo 10 g aliuminio chlorido miltelių, tirpinama 100 ml kolbutėje išgrynintame vandenyje iki žymės. Išgryninto vandens ir 0,2 ml pluoštinės kanapės ekstrakto. Gautas mišinys sumaišomas ir paliekamas tamsoje, kambario temperatūroje 30 minučių.
Lyginamąjį tirpalą gaminame tuo pačiu būdu, tik vietoje pluoštinės kanapės ekstrakto naudojame 70 %. (V/V) etanolį. Taip pat pasiruošiame skirtingos koncentracijos rutino tirpalus: 0,2 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,8 mg/ml; 1,0 mg/ml.
Po trisdešimties minučių spektrofotometru matuojamas tiriamųjų tirpalų absorbcijo dydis, naudojant palyginamąjį tirpalą, esant 407 nm šviesos bangos ilgiui.
Bendras flavonoidų kiekis išreikštas rutino ekvivalentu įvertinamas pagal rutino kalibracinio grafiko tiesės regresijos lygtį:
X ( mg/g) = mR x A x V/ mR x AR x VR x 1000
mR – rutino masė g, sunaudota etanoliniam rutino tirpalui ruošti; AR – etanolinio rutino tirpalo absorbcijos dydis;
VR – etanolinio rutino tirpalo tūris, ml;
A – augalinio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; V – augalinio ekstrakto tūris, ml;
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Šio tyrimo metu buvo išanalizuota 15 skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa
L.) rinktų skirtingais metais antžeminės dalies žaliava. antžeminės dalies žaliavą sudarė stiebai, lapai, žiedai, sėklos. Iš 15 skirtingų veislių pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L) rinktų skirtingais metais antžeminės dalies žaliavos 4 sudarė ,,Savitika“ veislės ir 2 mėginius sudarė ,,Futura“ veislės pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavos. Taip pat buvo išanalizuota po vieną mėginį šių pluoštinių kanapių veislių, kaip ,,Wojako“, ,,Carmagn“, ,,Fedora“, ,,Finola“, ,,Felina“, ,,Fepina“, Felix Vanda“ antžeminės dalies žaliavos. Dviems mėginiams pasigaminti buvo naudojama pluoštinių kanapių ,,Uso“ ir ,,Sequžvn“ veislių žiedai.
Atliekant spektrofotometrinius tyrimus, pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) ekstraktuose buvo nustatytas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis antžeminėse augalo žaliavose spektrofotometrijos metodu. Bendras fenolinių junginių kiekis buvo apskaičiuotas pagal galo rūgšties ekvivalentą GRE mg/g, o bendras flavonoidų kiekis buvo apskaičiuotas pagal rutino ekvivalentą RE mg/g
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Pluoštinių kanapių ekstraktų gamybai buvo naudojama ultragarso vonelė. Tai yra procedūra, kurios metu naudojamos ultra garso bangos. Jos pagreitina antrinių metabolitų išeigą ir ji vadinama - Ekstrahavimas ultragarso vonelėje [19]. Šio proceso metu pažeidžiama ląstelės sienelė ir palaipsniui tirpiklis prasiskverbia į augalinę žaliavą. Tokiu būdu tirpios medžiagos tirpiklyje migruoja į tirpalą. Ekstrahavimo procesą įtakoja ir tokie veiksniai, kaip augalinės žaliavos drėgmė, dalelių dydis, tirpiklio tipas, slėgis, temperatūra, dažnis ir ultragarso trukmė [1]. Ekstrahavimo tirpiklio efektyvumas priklauso nuo jo sugebėjimo tirpinti specifines fenolinių junginių grupes, taip pat chemiškai ar biologiškai paveikti augalinės žaliavos ląstelių pralaidumą pvz.:etanolis padidina ląstelių pralaidumą veikdamas fosfolipidų membranos sluoksnį.
Mokslininkai nustatė, jog bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį parodo 70% (V/V) ekstrakcija, todėl pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavai ekstrahuoti buvo naudotas 70 % etanolis (V/V) [36]. Ekstrakcijos laikas – 30 min. kambario temperatūroje.
3.2 Fenolinių junginių kiekio įvairavimo nustatymas
Fenolonių junginių kiekio įvairavimas pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies ekstraktuose. Jau buvo minėta, jog bendras fenolinių junginių kiekis buvo apskaičiuotas pagal galo rūgšties ekvivalentą. ,,Savitika“ pluoštinių kanapių, surinktų Lietuvoje skirtingais metais (2017, 2018, 2019) tyrimo rezultatai pateikti 3 pav.:
3 pav. Fenolinių junginių kiekio nustatymas ,,Savitika“ pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies ekstarktuose
Didžiausias fenolinių junginių kiekis ,,Savitika“ pluoštinių kanapių antžeminės dalies ekstraktuose buvo nustatytas 2017 metais surinktoje žaliavoje, tai yra 92, 81 GRE mg/g. Mažiausias kiekis buvo 28,38 GRE mg/g 2018 (CBG) metais surinktoje ,,Savitika“ žaliavoje. Kitoje 2018 metais tos pačios pluoštinių kanapių veislės žaliavoje buvo nustatytas 68,54 GRE mg/g, o 2019 metais rinktoje žaliavoje buvo nustatytas 49,62 GRE mg/g fenolinių junginių kiekis.
Žemiau pateiktoje diagramoje yra tarpusavyje lyginamos 2 ,,Futura“ pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) veislės, antžeminės dalies mėginiai, kurių žaliava buvo rinkta skirtingais metais. Didžiausias kiekis buvo nustatytas 2017 metais surinktoje ,,Futura“ veislės žaliavoje. Joje nustatyta fenolinių junginių kiekis buvo 110,88 GRE mg/g, o ,,Futura“ veislėje rinktoje 2019 metais nustatytas mažesnis fenolinių junginių kiekis. Jis buvo 42,84 GRE mg/g antžeminėje žaliavos dalyje ( žiūrėti 4 pavekslas):
4 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas ,,Futura“ veislės pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies ekstraktuose
Gauti ,,Fedora“, Finola“, ,,Felina“, ,,Fepina“ pluoštinių kanapių veislių ( Cannabis sativa L.), antžeminės dalies ekstraktų rezultatai, pavaizduoti 5 pav. Diagramoje matoma, jog didžiausiais fenolinių junginių kiekis nustatytas ,,Felina“ veislės antžeminės dalies žaliavoje rinktoje 2017 metais, tai yra 103,74 GRE mg/g, mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas 2015 metais rinktoje ,,Finola“ veislės žaliavoje, tai yra 40,47 GRE mg/g. ,,Fepina“ veislės žaliavoje rinktoje 2019 nustatytas fenolinių junginių kiekis yra 61,35 GRE mg/g, o ,,Fedora“ - 68,79 GRE mg/g.
5pav. Fenolinių junginių kiekis nustatytas ,,Fedora“, ,,Finola“, ,,Felina“, ,,Fepina“ pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies ekstraktuose
Gauti ,,Felix“, ,,Vanda“, ,,Wojako“, ,,Carmagn“ pluoštinių kanapių veislių (Cannabis sativa L.), antžeminės dalies ekstraktų rezultatai, pavaizduoti 6 pav. Sudarytoje diagramoje matoma, jog didžiausiais fenolinių junginių kiekis nustatytas ,,Felix Vanda“ veislės antžeminės dalies žaliavoje, kuris yra 69,81 GRE mg/g, mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas ,,Wojako“ veislės žaliavoje, kurioje nustatyta 17,39 GRE mg/g. ,,Carmagn“ veislės žaliavoje nustatytas fenolinių junginių kiekis yra 29,83 GREmg/g.
6 pav. Fenolinių junginių kiekis nustatytas ,,Felix Vanda“, ,,Wojako“, ,,Carmagn“ pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies ekstraktuose
7 pav. Fenolinių junginių kiekis nustatytas ,,Uso“, ,,Sequžvn“ pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) žiedų ekstraktuose
Gauti ,,Uso“, Sequžvn“, pluoštinių kanapių veislių (Cannabis sativa L.), žiedų ekstraktų rezultatai (žiūrėti 7 pav.). Sudarytoje diagramoje matoma, jog didžiausiais fenolinių junginių kiekis nustatytas ,,Uso“ veislės žiedų žaliavos ekstrakte, kuris yra 57,77 GRE mg/g. Panašus fenolinių junių kiekis nustatytas „Sequžvn“ žiedų žaliavos ekstrakte, kuris yra 53,43 GRE mg/g.
3.3. Flavonoidų kiekio įvairavimo nustatymas
Bendras flavonoidų kiekio nustatymas pluoštinėse kanapėse (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies ekstraktuose, buvo apskaičiuotas pagal rutiną. Tirtas skirtingais metais surinktų ,,Savitika“ veislės pluoštinių kanapių, antžeminės dalies ekstraktų flavonoidų kiekis (žiūrėti 8 pav.) Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas 2017 metais rinktoje ,,Savitika“ žaliavoje, tai yra 52,56 RE mg/g, o mažiausias flavonoidų kiekis nustatytas 2018 (CBG) metais rinktoje ,,Savitika“ žaliavoje. Tai yra 7,81 RE mg/g. 2019 metais rinktoje ,,Savitika“ žaliavoje buvo nustatytas 36, 92 RE mg/g (R, o 2018 metų rinktoje ,,Savitika“ žaliavoje buvo nustatytas 37,48 RE mg/g flovonoidų kiekis.
8 pav. Bendras flavonoidų kiekis ,, Savitika“ pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavoje
Žemiau pateiktoje diagramoje yra tarpusavyje lyginamos 2 ,,Futura“ pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) veislės, antžeminės dalies mėginiai, kurių žaliava buvo rinkta skirtingais metais (žiūrėti 9 pav.). Didžiausias flavonoidų kiekis buvo nustatytas 2017 metais surinktoje ,,Futura“ veislės žaliavoje. Joje nustatyta flavonoidų kiekis buvo 64,047RE mg/g , o ,,Futura“ veislėje rinktoje 2019 metais nustatytas mažesnis flavonoidų kiekis. Jis buvo 15 RE mg/g pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) veislės, antžeminėje žaliavos dalyje.
9 pav. Bendras flavonoidų kiekis ,, Savitika“ pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavoje
Gauti ,,Fedora“, Finola“, ,,Felina“, ,,Fepina“ pluoštinių kanapių veislių ( Cannabis sativa L.), antžeminės dalies ekstraktų rezultatai, pavaizduoti 10 pav. Diagramoje matomas didžiausiais nustatytas flavonoidų kiekis, kuris yra 58,97 RE mg/g. Jis rastas ,,Felina“ veislės antžeminės dalies žaliavoje, rinktoje 2017 m. Mažiausias nustatytas flavonoidų kiekis yra 15RE mg/g ,,Finola“ veislės žaliavoje, rinktoje 2015 m. Panašus flavonoidų kiekis nustatytas ,,Fedora“ veislės žaliavoje – 35,05 RE mg/g, ,,Fepina“ veislės žaliavoje rinktoje 2019 m. nustatyta 25,89 RE mg/g.
10 pav. Flavonoidų kiekis nustatytas ,,Fedora“, ,,Finola“, ,,Felina“, ,,Fepina“ pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies ekstraktuose
11 pav. Flavonoidų kiekis nustatytas ,,Felix Vanda“, ,,Wojako“, ,,Carmagn“, pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies ekstraktuose
11 diagramoje pavaizduoti gauti ,,Felix Vanda“, Wojako“, ,,Carmagn“ pluoštinių kanapių veislių (Cannabis sativa L.), antžeminės dalies ekstraktų rezultatai. Matoma, jog didžiausiais flavonoidų kiekis yra 36,5 REmg/g „Felix Vanda“ veislės ekstrakte. Mažiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Wojako‘ veislės ekstrakte, kuris atitinka 6,85 RE mg/g. Taip pat ne mažas kiekis flavonoidų nustatytas „Carmagn“ veislės ekstrakte, kuriame yra 20,83 RE mg/g.
Gauti ,,Uso“, Sequžvn“, pluoštinių kanapių veislių (Cannabis sativa L.), žiedų ekstraktų rezultatai, pavaizduoti 12 pav. Sudarytoje diagramoje matoma, jog didžiausiais flavonoidų kiekis nustatytas ,,Uso“ veislės žiedų žaliavos ekstrakte, kuris yra 28,97 RE mg/g. Panašus flavonoidų kiekis nustatytas „Sequžvn“ žiedų žaliavos ekstrakte, kuris yra 19,62 RE mg/g.
12 pav. Flavonoidų kiekis nustatytas ,,Uso“, ,,Sequžvn“ pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) žiedų ekstraktuose
4.IŠVADOS
1. Įvairūs tyrimai įrodė, jog pluoštinių kanapių ekstraktų gamybai naudojama ultragarso vonelė. Šis metodas pagreitina antrinių metabolitų išeiga, nes jo metu pažeidžiama augalinės žaliavos ląstelės sienelė ir palaipsniui tirpiklis patenka į žaliavą. Mokslininkai nustatė, jog bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį parodo 70% (V/V) ekstrakcija, todėl pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavai ekstrahuoti buvo naudotas 70 % etanolis (V/V)
2. Bendras fenolinių junginių kiekis buvo apskaičiuotas pagal galo rūgšties ekvivalentą. Atlikus spektrofotometrinus tyrimus nustatytas didžiausiais fenolinių junginių kiekis yra ,,Futura“ veislės pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavoje, rinktoje 2017 metais. Joje nustatytas kiekis yra 110,88 mg/g. Panašus fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas ,,Felina“ veislės pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavoje, rinktoje 2017 metais, kuris yra 103,74 mg/g. Mažiausiais fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas ,,Wojako“ veislės pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavoje, kuris yra 17,39 mg/g.
3. Bendras flavonoidų kiekis buvo apskaičiuotas pagal rutino ekvivalentą. Atlikus spektrofotometrinus tyrimus nustatytas didžiausiais flavonoidų kiekis yra ,,Futura“ veislės pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavoje, rinktoje 2017 metais. Joje nustatytas kiekis yra 64,07 mg/g. Panašus flavonoidų kiekis buvo nustatytas ,,Felina“ veislės pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavoje, rinktoje 2017 metais, kuris yra 58,97 mg/g. Mažiausiais flavonoidų kiekis buvo nustatytas ,,Wojako“ veislės pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavoje, kuris yra 6,85 mg/g.
4. Palyginus tarpusavyje tos pačios ,,Savitika“ veislės pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) antžeminės dalies žaliavas rinktas skirtingais metais, nustatytas didžiausias fenolinių junginių kiekis buvo 2017 metais rinktoje žaliavoje. Joje buvo nustatytas 92,81 mg/g kiekis fenolinių junginių. Mažiausias fenolinių junginių kiekis - 28,38 mg/g, nustatytas 2018 metais rinktoje žaliavoje.
5. Tarpusavyje palyginus skirtingais metais rinktas ,,Savitika“ veislės pluoštinių kanapių antžeminių dalių žaliavas, didžiausiais flavonoidų kiekis buvo nustatytas 2017 metais
rinktoje žaliavoje, kuris atitinka 52,56 mg/g, o mažiausias - 7,81 mg/g, 2018 metais rinktoje žaliavoje.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
1. Rekomenduojama pluoštinių kanapių antžeminę dalį ekstrahuoti 70 proc. (V/V) etanoliu, nes tokiu būdu išsiskiria didžiausias bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis.
2. Tikslinga tęsti tyrimus ,naudojant kitas pluoštinių kanapių veisles, siekiant atrasti ir įvertinti biologiškai aktyvių junginių kiekį.
3. Tikslinga ir toliau atlikti tyrimus naudojant pluoštinių kanapių antžeminę dalį ir lyginti gautus rezultatus.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Agarval C. Ultrasonic extraction of bioactive compounds from Cannabis Sativa L. for the green reduction of graphene oxide on cellulose fibers. A dissertation may 2019. Prieiga per internetą: http://doktori.uni-sopron.hu/692/1/Charu_Agarwal_disszertacio.pdf
2. Andersen O.M., Markham N.R. Flavonoids Chemistry Biochemistry and Application, 2006 3. Andre C.M., Hausman J.F., Guerriero G. Cannabis sativa: the plant of the thousand and one
molecules. Frontiers in plant science. 2016
4. Arts I., CW, Hollman P., CH. Polyphenols and disease risk in epidemiologic studies.
January 2005. Preiega per internetą:
https://academic.oup.com/ajcn/article/81/1/317S/4607645
5. Balčiūnas G., Vėjeli S., Kanapių spalių fizikinių savybių tyrimas. Vilnius, 2012
6. Bernstein N., Gorelick J., Zerahia R., Koch S. Impact of N, P, K, and Humic Acid Supplementation on the Chemical Profile of Medical Cannabis (Cannabis sativa L). Front Plant Sci. 2019; 10: 736. Published online 2019 Jun 17. Prieiga per internetą:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6589925/
7. Bravo L. Polyphenols: Chemistry, dietary sources, metabolism and nutritionalsignificace. Nutrition Reviews, 1998
8. Bolarinwa A. Entwicklung einer HPLC-Methode zur Bestimmung ausgewählter Polyphenole und ihr Einsatz in Humanstudien. 05.10.2006. Prieiga per internetą:
http://mediatum.ub.tum.de/doc/603759/document.pdf
9. Brownlee N.This is Cannabis: London Sanctuary, 2002 10. Brunetti C., Di Ferdinando M., PallastiS., Tattini M., 2013
11. Cerar G., Fraga., Plant Phenolics and Human Hrealth Biochemistry, Nutrition and pharmacology.
12. Christelle M., Andre C. M., Hausman J, F., Gueriero G. Cannabis sativa: The Plant of the Thousand and one molecules, 2016.
13. Clarke R.C., Botany of the genus Cannabis. In: P. Ranalli Advances in Hemp Research. Food Productions Press, The Haworth Press Ine. 1999
14. Cook N.C., Sammans S. Flavonoids Chemistry, metabolysm cardioprotective effects and dietary sources. Nutrional Biochemistry, 1996
15. David A.V.A., Radhakrishnan A., Parasuraman S. Overviews of Biological Importance of Quercetin: A Bioactive Flavonoids. 2016
16. Drinc Z, Vidovic S, Vladic J, Koren A, Kiprovski B, Sikora V. Effect of extraction solvent on total polyphenols content and antioxidant activity of industrial hemp (Cannabis sativa L.). Published: December 25, 2018. Prieiga per internetą: https://scindeks-clanci.ceon.rs/data/pdf/0455-6224/2018/0455-62241838017D.pdf
17. Działo M, Mierziak J , Korzun U, Preisner M, Szopa J, Kulma A. The Potential of Plant Phenolics in Prevention and Therapy of Skin Disorders. 2016 Feb 18. Prieiga per internetą:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4783894/
18. El Sohly M.A., Radwan M.M., Gul W., Chandra S., Galal A. Phytochemistry of Cannabis sativa L. In Phytocannabinoids 2017 (pp. 1-36). Springer, Cham.
19. Fathordoobady .F, Singh A., Kitts D. D., Pratap Singh A. Hemp (Cannabis Sativa L.)
Extract: Anti-MicrobialProperties, Methods of Extraction, and PotentialOral Delivery. April 2019. Prieiga per internetą:
https://www.researchgate.net/publication/332566538_Hemp_Cannabis_Sativa_L_Extract_A nti-Microbial_Properties_Methods_of_Extraction_and_Potential_Oral_Delivery
20. Ganora L., The Phytochemistry of Herbs. Australia University. 20. Oct.2007
21. Giada M.L.R., Food Phenolic Compounds: Main Classes, Sources and Their Antioxidant Power. May 22nd 2013. Prieiga per internetą: https://www.intechopen.com/books/oxidative- stress-and-chronic-degenerative-diseases-a-role-for-antioxidants/food-phenolic-compounds-main-classes-sources-and-their-antioxidant-power
22. Green G. The Cannabis Grow Bible. Green Candy Press. 2001
23. Gonçalves J., Rosado T., Soare S., Simão A.Y., Caramelo D., Luís A., Fernández N., Barroso M., Gallardo E., Duarte P. Cannabis and Its Secondary Metabolites: Their Use as Therapeutic Drugs, Toxicological Aspects, and Analytical Determination. Medicines (Basel). 2019 Mar; 6(1): 31. Published online 2019 Feb 23. Prieiga per internetą:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6473697/
24. Guzdevienė E., Pluoštinių augalų auginimo perspektyvos Lietuvoje. Mano ūkis 2017 -11
25. Kayser Quax W., Medicinal plant biotechnology. From basic research to industrial applications. Vol.1, 2007
26. Khoddami A., Wilkes M.A., Roberts T.H. Techniques for Analysis of Plant Phenolic Compounds. Published online 2013 Feb 19. Prieiga per internetą:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6270361/
27. Kim S.H., Park J.G., Sung G. H., Yang S. Kaempforol, a dietary flavonoid ameliorates acute inflammatory and nociceptive symptoms in gastrits, pavcreatitis and abdominal pain. 2016
28. Kumar B.R. Application of HPLC and ESI-MS techniques in the analysis of phenolic acids and flavonoids from green leafy vegetables (GLVs). J Pharm Anal. 2017 Dec; 7(6): 349– 364. Published online 2017 Jun 16. Prieiga per internetą:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5790745/
29. Kumar S., Pandey A K. Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview.
2013 Dec 29. Prieiga per internetą:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3891543/
30. Lachenmeier D. W., Bock V., Deych A., Sproll C., Rezende T. R., Walch. S.G. Hanfhaltige Lebensmittel - ein Update. Deutsche Lebensmittel-Rundschau: Zeitschrift für Lebensmittelkunde und Lebensmittelrecht 115(8):351-372 · August 2019. Prieiga per internetą: https://www.researchgate.net/publication/335571435_Hanfhaltige_Lebensmittel_-_ein_Update
31. Lattanzio V. Phenolic Compounds: Introduction. July 2013. Prieiga per internetą:
https://www.researchgate.net/publication/249970213_Phenolic_Compounds_Introduction
32. Lin D., Xiao M., Zhao J. Li. Z., Xing B. Li. X.,1, Kong M., Li L., Zhang Q., Liu Y., Chen H., Qin W., Wu H., Chen S. An Overview of Plant Phenolic Compounds and Their Importance in Human Nutrition and Management of Type 2 Diabetes. 2016 Oct 15. Prieiga per internetą: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6274266/
33. Mercola J. Polyphenols ,,What they Are, and Why Yuo Need Them“.
34. Minatel I.O., Borges C.V., Ferreira M.I., Gomez H.A.G., Chen C.Y.O., Lima G. P. Phenolic Compounds: Functional Properties, Impact of Processing and Bioavailability. March 8th 2017. Prieiga per internetą: https://www.intechopen.com/books/phenolic-compounds- biological-activity/phenolic-compounds-functional-properties-impact-of-processing-and-bioavailability
35. Mkpenie V.N., Essien E. Effect of extraction conditions on total polyphenol contents, antioxidant and antimicrobial activities of Cannabis sativa L. January 2012. Prieiga per internetą:
https://www.researchgate.net/publication/260824507_Effect_of_extraction_conditions_on_t otal_polyphenol_contents_antioxidant_and_antimicrobial_activities_of_Cannabis_sativa_L
36. Oreopoulou A., Tsimogiannis D., Oreopoulou V. Extraction of Polyphenols From Aromaticand Medicinal Plants: An Overview of theMethods and the Effect of Extraction
Parameters. January 2019. Prieiga per internerą:
https://www.researchgate.net/publication/330047876_Extraction_of_Polyphenols_From_Ar omatic_and_Medicinal_Plants_An_Overview_of_the_Methods_and_the_Effect_of_Extracti on_Parameters
37. Panche A. N., Diwan A.D., Chandra S. R. Flavonoids: An overview. December 2016.
Prieiga per internetą:
https://www.researchgate.net/publication/311972531_Flavonoids_An_overview
38. Paršeliūnas P. Lietuvos pluoštinių kanapių rinkos apžvalga ir perspektyvos. Pluoštinių kultūrų augintojų asociacija. Vilnius. 2019
39. Patil A.B., Jadhaw A.S. Flavonoids and antioxidant: a review. Intrnational Journal of Pharmacentical and Biological Sciences Research and Devlopment. 2013, 1.
40. Pavlovic R., Panseri S., Giupponi L., Leonil V, Citti C., Cattaneo C., Cavaletto M., Giorgi A. Phytochemical and Ecological Analysis of Two Varieties of Hemp (Cannabis sativa L.) Grown in a Mountain Environment of Italian Alps. Front. Plant Sci., 15 October 2019. Prieiga per internetą: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2019.01265/full
41. Pereira D.M., Valentão P., Pereira J. A., Andrade P. B. Phenolics: From Chemistry to
Biology. 2009 Jun. Prieiga per internetą:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6254163/
42. Pollastro F., Minassi A., Fresu L, G. Cannabis Phenolics and their Bioactivities. August
2017. Prieiga per internetą:
https://www.researchgate.net/publication/319086510_Cannabis_Phenolics_and_their_Bioac tivities
43. Radhakrishnan, A., Ravisharkar G.A.,2011Influence of abiotic stress signals on secondary metabolites in plants, Plants Signalig and Behavior,6
44. Salentijn E.M. J., Petit J., Trindade L. M. The Complex Interactions Between Flowering Behavior and Fiber Quality in Hemp. 2019 May 16. Prieiga per internetą:
45. Sawler. .J, Stout J.M., Gardner K.M., Hudson D., Vidmar J., Butler L., Page J.E., Myles S. The Genetic Structure of Marijuana and Hemp. Published online 2015 Aug 26.Prieiga per internetą: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4550350/
46. Skrget M., Kotnik P., Hadolin M. Phenols, proanthocyaindins, flavones and flavonols in some plant materials and their anthioxidant activitres. 2005
47. Stalikas C.D. Extraction, separation and detaction methods for phenolic acids and flavonoids. Journal of Separation Science. 2007, 30
48. Stevulova N., Cigasova J., Estokova A., Terpakova E., Geffert A., Kacik F., Singovszka E., Holub M. Properties Characterization of Chemically Modified Hemp Hurds. 2014 Dec 17. Prieiga per internetą: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5456447/
49. Su Chon. Total polyphenols and bioactyvity of seeds and sprouts in several legumes. 2013
50. Svennerstedt A. Hemp, grown, seed rate, biomass and hemp fibre yield. Potsdam – Bornim, 2002.
51. Tendero E. F., Day A., Conceptualization, Legros S., Habrant A., Hawkins S., Chabbert B. Changes in hemp secondary fiber production related to technical fiber variability revealed by light microscopy and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy. Published online 2017 Jun 22. Prieiga per internetą:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5481002/
52. Tungmunnithum D., Thongboonyou A., Pholboon A., Yangsabai A. Flavonoids and Other Phenolic Compounds from Medicinal Plants for Pharmaceutical and Medical Aspects: An
Overview. 2018 Aug 25. Prieiga per internetą:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6165118/
53. Vermerr W., Nicholson R.L. Phenolic Compound Biochemistry Springer Science and Business Media. 2007.
54. Vogel V. Hemp (Cannabis sativa L.) for Medicinal Purposes: Cultivation under German Growing Conditions. July 2017. Prieiga per internetą:
https://www.researchgate.net/publication/326772237_Hemp_Cannabis_sativa_L_for_Medic inal_Purposes_Cultivation_under_German_Growing_Conditions
55. Zhang Z., He Y., Zhang X. Flavonoids and Pectins. March 5th2019. Prieiga per internetą:
https://www.intechopen.com/books/pectins-extraction-purification-characterization-and-applications/flavonoids-and-pectins
