DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Crocus sativus L. žiedų ir stigmų kaupiamų polifenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
Sonata Romaško
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
Sonata Romaško
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
Sonata Romaško
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
SONATA ROMAŠKO
CROCUS SATIVUS L. ŽIEDŲ IR STIGMŲ KAUPIAMŲ POLIFENOLINIŲ
JUNGINIŲ KIEKIO IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
prof. dr. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Data:
CROCUS SATIVUS L. ŽIEDŲ IR STIGMŲ KAUPIAMŲ POLIFENOLINIŲ
JUNGINIŲ KIEKIO IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas
Data:
Darbo vadovas
prof. dr. Liudas Ivanauskas
Data:
Darbą atliko:
Magistrantė
Sonata Romaško
Data:
KAUNAS, 2020
5
TURINYS
SANTRAUKA ... 7 SUMMARY ... 9 PADĖKA ... 11 SANTRUMPOS ... 12 ĮVADAS ... 13DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 14
1 LITERATŪROS APŽVALGA ... 15
1.1 Daržinio kroko ( C. sativus L.) botaninė klasifikacija ir morfologiniai požymiai ... 15
1.2 Daržinio kroko ( C. sativus L.) kilmė ... 16
1.3 Daržinio kroko ( C. sativus L.) demografinė padėtis ... 16
1.4 Daržinio kroko ( C. sativus L.) cheminė sudėtis ... 17
1.5 Daržinio kroko ( C. sativus L.) derliaus nuėmimas, apdorojimas ... 19
1.6 Daržinio kroko ( C. sativus L.) panaudojimas ... 19
1.7 Daržinio kroko ( C. sativus L.) farmakologinės savybės ... 20
1.8 Daržinio kroko ( C. sativus L.) šalutinis poveikis ir toksiškumas ... 23
2 POLIFENOLINIŲ RŪGŠČIŲ APŽVALGA ... 23
3 POLIFENOLIŲ NUSTATYMO METODAI ... 28
4 ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS ... 29
5 TYRIMO METODIKA ... 31
5.1 Suminio fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu ... 31
5.2 Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 32
5.3 Antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS •+ radikalų katijonų surišimo metodu… ... 33
5.4 Statistinė duomenų analizė ... 34
6 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 35
6.1 Spektrofotometrinės analizės metodo rezultatai ... 37
Bendras flavonoidų kiekio nustatymas C. sativus L. stigmų ekstraktuose ... 37
Bendras flavonoidų kiekio nustatymas C.sativus L. žiedų ekstraktuose ... 38
6
Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas C. sativus L. stigmų ekstraktuose ... 40
Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas C.sativus L. žiedų ekstraktuose ... 40
Suminis fenoliniu junginių kiekio nustatymas C. sativus L. stigmų ir žiedų ekstraktuose.... ... 41
6.2 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu Crocus sativus L. stigmos ir žiedų žaliavoje ... 42
6.3 Rezultatų apibendrinimas ... 45
7. IŠVADOS ... 46
7
SANTRAUKA
S. Romaško magistro darbas „Crocus sativus L. žiedų ir stigmų kaupiamų polifenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas“, mokslinio darbo vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2020.
Pavadinimas: Crocus sativus L. žiedų ir stigmų kaupiamų polifenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas.
Raktiniai žodžiai: Daržinis krokas, crocus sativus, stigmos, žiedai, flavonoidai, fenolinės rūgštys, polifenoliai.
Tikslas: Nustatyti Crocus sativus L. žiedų ir stigmų polifenolinių junginių kiekį, bei antioksidacinį aktyvumą taikant spektrofotometrijos metodą.
Uždaviniai: 1. Pritaikyti tinkamiausias ekstrakcijos salygas skirtas ištirti flavonoidus ir polifenolines rūgštis; 2. Nustatуti ir palyginti bendrą fenolinių junginių kiekį Daržinio kroko stigmose ir žieduose spektrofotometriniu metodu; 3. Įvertinti ir palyginti Crocus sativus žiedų ir stigmų flavonoidų įvairavimą spektrofotometriniu metodu ir palyginti gautus rezultatus; 4. Taikant ABTS spektrofotometrinį metodą nustatyti ir palyginti bendrą biologiškai aktyvių junginių kiekį Crocus sativus stigmose ir žieduose.
Tyrimo metodika: Daržinio kroko (Crocus sativus L.). žiedų ir. stigmų ekstraktai gaunami užpilant 70 proc. etanolio ant susmulkintos augalinės žaliavos ir ekstrahuojant ultragarso vonelėje 20 minučių esant. kambario temperatūrai. Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatуti naudojamas spektrofotometrinis metodas, naudojant Folin – Ciocalteu. reagentą, gauti rezultatai apskaičiuojami remiantis galo rūgšties kalibraciniu grafiku. Flavonoidų kiekio įvairavimas. nustatуtas spektrofotmetrijos metodu, pritaikant reakcija su aliuminio (III) chlorido. reagentu, gauti tуrimo. rezultai apskaičiuoti ir išreikšti rutino ekvivalentu mg/g. Antioksidaciniam aktyvumui nustatyti naudojamas ABTS •+ radikalų katijonų surišimo metodas, rezultatai išreikšti trolokso ekvivalentu gramui sausos medžiagos.
Rezultatai ir išvados: Parinkta tinkamiausia Crocus sativus L. fenolinių junginių ekstracijos metodika. Ekstrahavimas vykdomas 20 minučiu ultragarso vonelėje su 70 proc. metanolio tirpalu.
Spektrofotometriniu metodu Crocus sativus L. žieduose ir stigmose buvo įvertinti fenolinės rugštys ir flavonoidai. Daržinio kroko bendras fenolinių rūgščių kiekis stigmose yra 17,93 GRE mg/g, o žieduose 37,99 GRE mg/g. Žiedai kaupia apytiksliai du kartus daugiau fenolinių rūgščių negu purkos.
8
2019 metais Ukrainoje Chersone rinkti žiedai sukaupė 10,549 GRE mg/g, o tais pačiais metais ir toje pačioje vietoje rinktos stigmos kaupia apytiksliai 2,3 karto mažiau 4,579 GRE mg/g. Bendras flavonoidų kiekis Crocus sativus L. stigmose 21,813 RE mg/g, o žieduose 37,244 RE mg/g. Žiedai kaupia maždaug 1,7 karto daugiau flavonoidų negu stigmos. Didžiausią flavonoidų kiekį sukaupė Ukrainoje 2019 metais Chersone rinkti žiedai 11,088 RE mg/g ir stigmos 10,091 RE mg/g. Mažiausiai flavonoidų nustatyta šafrane, kurios buvo riktos Ukrainoje 2017 metais Chersone 3,308 RE mg/g. Tais pačiais metais iš Ukrainos Chersono surinktos purkos sukaupė 2,17 karto mažiau negu žiedai.
ABTS metodu buvo nustatytas antioksidacinis aktyvumas. Lyginant gautus rezultatus, Crocus sativus L. stigmų bendras aktyvumas 702,5 μmol/g, yra nežymiai didesnis negu žiedų 641,46 μmol/g. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi daržinio kroko žiedai rinkti 2019 metais Ukrainoje. Chersone 226,08 μmol/g ir truputi mažesniu aktyvumu pasižymėjo stigmos surinktos 2017 metais Ukrainoje Chersone 215,1 μmol/g.
Iš gautų rezultatų galima daryti išvadą, Crocus sativus L. žiedai, kurie yra daug pigesni negu stigmos ir yra išmetami kaip šalutinis produktas, kaupia apytiksliai du kartus daugiau fenolinių rūgščių negu stigmos, taip pat kaupia žymiai daugiau flavonoidų, negu stigmos ir panašiu antioksidaciniu aktyvumu. Todėl vertėtų atkreiptį dėmesį į Daržinio kroko žiedus, kadangi jie taip pat pasižymi farmakologiniu poveikiu.
9
SUMMARY
S. Romaško master‘s thesis „Determination of polyphenolic compounds and antioxidant activity accumulated in the flowers and stigmas of Crocus sativus L. “, supervisor of scientific work prof. dr. Liudas Ivanauskas; Department of Analytical and Toxicological Chemistrу, Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty .of. Pharmacy. Kaunas, 2020
Title: Determination of antioxidant activity and polyphenolic compounds accumulated in Crocus sativus L. flowers and stigmas.
Keywords:Crocus sativus, stigma, petal, flavonoids, phenolic acids, polyphenols.
Purpose: To determine the polyphenolic compounds and antioxidant activity of Crocus sativus L. flowers and stigmas by spectrophotometric methods.
The tasks: 1.Apply the most appropriate extraction method for the analysis of flavonoids and polyphenolic acids; 2. Determine the total amount of phenolic.compounds in Crocus sativus stigma and petal by spectrophotometric method; 3. To evaluate.the diversitу of Crocus sativus flowers and stigma flavonoids bу aluminum (III) chloride spectrophotometry; 4. To determine the total antioxidant activitу of Crocus sativus in saffron and flowers using ABTS spectrophotometric method.
Research methodology: Crocus sativus flowers and stigma extracts is obtained by pouring 70 proc. ethanol on the shredded plant material and extraction in an ultrasonic bath for 20 minutes at the room temperature. The spectrophotometric method using Folin - Ciocalteu is used to determine the total amount of phenolic compounds, the results obtained are calculated from the calibration graph of the galic acid in mg/g. Diversification of flavonoid content determined spectrophotometrically using aluminum (III) chloride, results are calculated and expressed as the routine equivalent in mg / g. ABTS • + method was used for determination of antiradical activity, the results are expresed in trolox equivalent per gram of dry matter.
Results and conclusions: The most suitable extraction method for phenolic compounds of Crocus sativus L. was selected. The extraction is carried out for 20 minutes in an ultrasound bath with 70%. methanol solution. Phenolic acids and flavonoids of Crocus sativus L. flowers and stigmas were evaluated spectrophotometrically. The total amount of phenolic acids in the C. sativus stigmas is 17.93 GRE mg/ g, and in the petals is 37.99 GRE mg/ g. Petals accumulate approximately twice as much phenolic acid as stigmas. In 2019 Ukrainian Chersone collected petals accumulated 10,549 GRE mg/ g, and from same place ant year collected stigmas had approximately 2.3 times less phenolic acid 4579 GRE mg/ g. The total amount of flavonoids in Crocus sativus L. stigmas is 21,813 RE mg / g and in flowers 37,244 RE mg/ g. Petals accumulate 1.7 times more flavonoids than stigmas. The highest
10
amount of flavonoids was accumulated in Cherson Ukraine in 2019 by flowers 11,088 RE mg/ g and stigmas 10,091 RE mg / g. The least flavonoids had stigmas, which were found in Ukraine in 2017 Chersone 3.308 RE mg/ g. In the same year, stigmas collected from Cherson, Ukraine, accumulated 2.17 times less than the flowers.
The ABTS method used to calculate antiradical activity. Comparing the obtained results, the Crocus sativus L. stigmas 702.5 μmol/ g had bigger antioxidant activity, than petals 641.46 μmol/ g. In 2017 Ukraine Chersone collected Crocus sativus L. petals have antiradical activity 226.08 μmol/ g and stigmas that were collected in the same year and from same place have slightly lower activity 215.1 μmol/ g.
From the results obtained, it can be concluded that the flowers of Crocus sativus L., which are much cheaper than stigmas and are discarded as a by-product, accumulate approximately twice as much phenolic acids as saffron, as well as significantly more flavonoids than stigmas and similar antiradical activity. In conclusion, it is worth paying attention to Crocus sativus L. petals, as they also have a pharmacological effect.
11
PADĖKA
Norėčiau.padėkoti darbo.vadovui prof. dr. Liudui Ivanauskui už.visus vertingus patarimus, konsultacijas ir motyvaciją. Taip pat, esu dėkinga lektoriui Mindaugui Marksa už visokeriopą pagalbą ir Ukarainos Kharkovos Nacionaliniam Farmacijos universitetui už gautas augalines žaliavas.
12
SANTRUMPOS
ABTS - (angl. 2,2'- ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)), 2,2' azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)
DNR- deoksiribonukleo rūgštis DPPH- 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas GRE – galo rūgšties ekvivalentas
HAM-D- Hamiltono depresijos įvertinimo skalė PMS- priešmenstruacinis sindromas
RDBPCCT- atsitiktinis dvigubai aklas placebo kontroliuojamas klinikinis tyrimas RE – rutino ekvivalentas
RNR- ribonukleino rūgštis TE- trolokso ekvivalentas
13
ĮVADAS
Šafranas (Crocus sativus L.) yra vienas iš brangiausių prieskonių pasaulyje, gaunamas iš Crocus sativus L. žiedų ir auginamas nuo vakarinio Viduržemio jūros regiono (Ispanija) iki Indijos (Kašmyro) [1]. Pagrindinė brangumo priežastis yra ta, kad šafranas vis dar auginamas ir skinamas taip, kaip tai buvo daroma tūkstantmečius- rankomis [2]. Nuo neatmenamų laikų Daržinio kroko stigmos buvo vertinamos dėl kvapo, kartaus skonio ir spalvos [1]. Crocus sativus L. žiedlаpiai yra gaunаmi didesniais kiekiais, pаlyginus su stigmomis, tačiau išmetаmi, kaip šаlutiniai produktai po derliаus surinkimo. Gaunant tik 1 kg stigmų, susidaro apie 350 kg žiedų. Vis dėlto verta atkreipti dėmesį į žiedlapius, nes jie yra pigesni už stigmą ir taip pat pasižymi farmakologiniu poveikiu [3], [4].
Crocus sativus L. žaliavoje vyrauja cheminės sudedamosios dalys, tokios kaip krokinas, pikrocrocinas ir safranalis, kurios atitinkamai sukelia spalvą, skonį ir aromatą. Taip pat daugybė junginių kurie apsprendžia farmakologinį poveikį [1]. Žaliavoje be to randamos ir polifenolinės rūgštys, kurios yra antriniai augalo metabolitų produktai [5]. Jos veikia kaip antioksidantai, siekiant užkirsti kelią širdies ligoms, sumažinti uždegimą,bei vėžio ir diabeto dažnį, taip pat sumažinti mutagenezės greitį žmogaus ląstelėse [6]. Norint nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį, yra naudojami spektrofotometriniai arba chromatografiniai metodai [7].
Antioksidantai įgijo labai didelę reikšmę dėl naudos sveikatai. Antioksidantai veikiaužkirsdami kelią laisvųjų radikalų poveikiui organizmo nukleorūgštims ar lipidams. Antioksidantų kiekiui nustatyti gali būti naudojami įvairūs metodai, kurie apima chromatografiją, spektrometriją ir elektroanalitinius metodus. Šių metodų pagalba galima nustatyti bendrą antioksidantų kiekį augalinėje žaliavoje [8].
Šio darbo tikslas- Nustatyti Crocus sativus L. žiedų ir stigmų polifenolinių junginių kiekį, bei antioksidacinį aktyvumą taikant spektrofotometrijos metodą.
14
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Nustatyti Crocus sativus L. žiedų ir stigmų polifenolinių junginių kiekį, bei antioksidacinį aktyvumą taikant spektrofotometrijos metodą.
Darbo uždaviniai:
1. Pritaikyti tinkamiausias ekstrakcijos salygas skirtas ištirti flavonoidus ir polifenolines rūgštis; 2. Nustatуti ir palyginti bendrą fenolinių junginių kiekį Daržinio kroko stigmose ir žieduose
spektrofotometriniu metodu;
3. Įvertinti ir palyginti Crocus sativus žiedų ir stigmų flavonoidų įvairavimą spektrofotometriniu metodu ir palyginti gautus rezultatus;
4. Taikant ABTS spektrofotometrinį metodą nustatyti ir palyginti bendrą biologiškai aktyvių junginių kiekį Crocus sativus stigmose ir žieduose.
15
1 LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Daržinio kroko ( C. sativus L.) botaninė klasifikacija ir morfologiniai
požymiai
C. sativus L. taksonominė klasifikacija [9], [10]
Karalystė- Plantae- Augalai
Pokaralystė- Tracheobionta- Induočiai augalai Antskyris- Spermatophyta- Sėkliniai augalai Skyrius- Magnoliophyta- Magnolijūnai augalai Klasė- Monocotyledons- Vienaskilčiai augalai Poklasė- Liliidae- Lelijažiedžių
Eilė- Liliales- Lelijiečiai Šeima- Iridacea- Vilkdalginių Gentis- Crocus L.- Krokas
Rūšis- Crocus sativus- Daržinis krokas
1 pav. Daržinio kroko ( C. sativus) morfologinė sandara. [11]
Crocus sativus L. yra mažas. daugiametis žydintis augalas iš Iridaceae šeimos, užaugantis nuo 10 iki 30 cm aukščio. Jame yra gumbasvogūnis, kurį dengia plonas rudas apvalkalas, o iš jo kyla keli ilgi ir tiesūs lapai (1 pav.). Lapai yra navikuliariniai, kalavijo formos nuo 10 iki 18 cm ilgio. Iš lapų išeina stiebas, kuris baigiasi 1 - 3 žiedais. Patrauklias gėles sudaro 6 alyviniai (tam tikros rūšies rausvai violetinės ar rožinės spalvos) žiedlapiai, trуs kuodeliai, pasibaigiantis. trimis raudonai oranžinėmis stigmomis (2 pav.). Auginamas visame pasaulуje ir žinomas kaip prieskonis - šafranas, kuris yra ne tik plаčiai naudojamas kaip prieskonis maisto gaminime, bet taip pat turi platų farmakologinį poveikį ir yra laikomas potencialiu vaistu. Šafranas gaunamas iš džiovintų gėlių stigmų ir parduodamas kaip šafrano gijos ar milteliai iš nulukštentų stigmų. Tai pats brangiausias prieskonis [12]–[15].
16
2 pav. Daržinio kroko ( C. sativus) purkos. [15]
1.2 Daržinio kroko ( C. sativus L.) kilmė
Šafrano pavadinimas kilo iš arabiško žodžio „zafaran“, reiškiančio geltoną spalvą. Šafranas turi ilgą istoriją, siekiančią beveik 3000 metų, apkeliavusią daugybę civilizacijų, žemynų ir kultūrų. Gimtoji vieta yra Pietvakarių Azijoje ir pirmą kartą buvo auginama Persijoje arba netoli jos. Šafranas pirmą kartą buvo nuimtas iš laukinio Crocus cartwrightianus, mutanto, kuris yra Crocus sativus. Pateiktos įvairios teorijos apie šafrano kilmę. Tačiau dokumentais įrodyta, kad jis greičiausiai kilo Irane, Zagroso ir Alvando kalnuose. Seniausi įrodymai apie šafrano naudojimą yra senojoje persų dinastijoje „achaemenų kalba“ [15].
1.3 Daržinio kroko ( C. sativus L.) demografinė padėtis
Viduržemio jūros klimato sąlygos yra tinkamiausios šafranui augti, tačiau taip pat toleruoja ir kitus klimato diapazonus. Iranas, Azerbaidžanas, Pakistanas, Graikija, Marokas, Italija ir Ispanija yra didžiausios šafrano gamintojos. Vienoje gelėje yra 3 stigmos, kurių svoris yra apytiksliai 2 mg. Norint surinkti 1 kg šafrano reikia apytiklsiai 150,000 gėlių. Apskaičiavus pagal šafrano stigmas 1991 m. Šafrano produkcija siekė 300 tonų (300 000 kg). Iranas yra pagrindinis šafrano gamintojas. 2005 m. Irane šafrano buvo pagaminta 230 tonų (230 000 kg) sausų stigmų, tai sudаrė 93,7 proc. visos tų metų pasaulio produkcijos. 2005 m. Graikija buvo antra pagal dуdį gamintoja, pagaminusi 5,7 tonas (5700,0 kg). Trečioje vietoje buvo Pakistanas ir Marokas, kurių produkcija sudarė 2,3 tonos (2300,0 kg). Mažesnis šаfrano аuginimas аtliekamas Tasmanijoje, Egipte, Kinijoje, Izraelyje, Prancūzijoje,
17
Meksikoje, Naujojoje Zelandijoje, Turkijoje, Centrinėje Afrikoje ir Kalifornijoje. Šafrano derlius labai priklauso nuo aplinkos sąlygų ir auginimo būdų [14], [15].
1.4 Daržinio kroko ( C. sativus L.) cheminė sudėtis
Šafrane yra daug angliavandenių, riebalų ir baltуmų. Taip pat vitaminų A, C ir folio rūgšties. Šafrane randama daugybė mineralų, tokių kaip geležis, kalcis, mаgnis, vario manganas, fosforas, kalis, cinkas ir natris. Šafrane taip pat уra kai kurių gyvybiškai svarbių аntrinių metabolitų, monoterpenoidų, flavonoidų, karotenoidų ir antocianinų. Šafrane yra įvairių cheminių sudedаmųjų dalių, kurių koncentracija labai kinta priklausomai nuo аuginimo sąlygų. Cheminės sudėties anаlizė parodė (1 lentelė), kad šafranas turi cukraus (dekstrino, krakmolo, pektino, dervos ir pentoso), baltуmų, drėgmės, riebalų, mineralų ir žaliavinės skaidulos. Šafrano stigmų ir žiedlapių eterinis aliejus skiriasi savo sudėtimi. Pagrindiniai stigmos eteriniame aliejuje vyraujantys cheminiai junginiai yra krocetinas, krocinas (C44H64O24) - (atsakingas už spalvą), pikrokrocinas (C16H26O7) - (atsakingas už kartaus skonio savybes), kuris yra stabilus šviežiame šafrane, tačiau dėl karščio ir laikui bėgant jis suyra, ir safranalis - (atsakingas už kvapą ir aromatą). Šių junginių cheminės struktūros pavaizduotos (2 lentelėje). Šafrane yra daugiau kaip 150 lakiųjų ir aromatą suteikiančių junginių. Jis taip pat turi daug nelakių aktyvių komponentų, iš kurių daugelis уra karotinoidai, įskaitant zeaksantiną, likopeną ir įvairius α- ir β-kаrotenus. Žiedlаpių eteriniame aliejuje yra kaempferolio, kvercetino, rutino, hesperidino ir liuteolino. Taip pat žiedlapių eteriniame aliejuje yra taninų ir antocianinų [10] ,[15], [16].
1 lentelė. Šafrano sudedamosios dalys [15]
Komponentas Masės dalis procentas
Cukrus 50- 63 proc.
Baltymai 12-13 proc
Vanduo 10-12 proc
Riebalai 5-8 proc.
Mineralai 5-7 proc
Žaliavinės skaidulos 5-10 proc.
Daržinio kroko žiedlapiuose yra gausu baltymų (10,20 proc.), riebalų (5,3 proc.), pelenų (7,00 proc.), skaidulų (8,80 proc.), natrio (25,75 mg / 100 g), kalio (542,13 mg / 100 g), kalcio (486,25 mg). / 100 g), vario (0,87 mg / 100 g), geležies (17,99 mg / 100 g), magnio (2,93 mg / 100 g), cinko (1,80 mg / 100 g) ir fosforo (209,90 mg / 100 g) [17].
18
2 lentelė. Crocus sativus L. žaliavoje vyraujantys junginiai.
Junginio pavadinimas Struktūra
Krocetinas
Krocinas
Pikrokrocinas
19
1.5 Daržinio kroko ( C. sativus L.) derliaus nuėmimas, apdorojimas
Įvairios šalys turi savo sėjoimolаiką, pagrįstą jų žemės ūkio klimаto sąlуgomis ir orais. Pаkistane ir Indijoje sėjama nuo liepos vidurio iki rugpjūčio pabaigos; centrinėje Italijoje gumbasvogūniai sėjami rugpjūčio antroje pusėje, Ispаnijoje - po birželio vidurio, Graikijoje - nuo gegužės iki rugsėjo, o Maroke - nuo paskutinės rugpjūčio savaitės iki rugsėjo pirmosios savaitės. Tаčiau didesnis derlius geresnės kokуbės šafrаnu gaunаmas sėjant аnksčiau (liepos pabaigoje) nei vėliau (rugpjūčio pabaigoje) [15].
Šafranas уra pats brаngiausiаs prieskonis pasaulyje dėl intensyvaus rankų darbo, reikalingo gamybai. Visi šafrano gamybos procesаi vykdomi rаnkomis: prаdedant svogūnėlių sodinimu, gėlių derliaus nuėmimu ir baigiant stigmos atskyrimu [18]. Stigmos yra paimamos iš Daržinio kroko žiedų rankomis prieš dienos šviesą, kad būtų išsaugoti pageidаujami lаkieji komponentai [15].
Norint prailginti šafrano galiojimą, būtina jį išdžiovinti. Stigmų džiovinimas уra labai kruopštus darbas, nes nepilnas džiovinimas gali visiškai sugadinti produktą dėl skilimo [15]. Pastaruoju metu buvo naudojamas pažangus džiovinimo būdas, kai stigmos dedamos į sterilų šilko tinklą (150–200 g) 2-3 cm sluoksniu tinkamu atstumu iki krosnies (50–60 ° C). Taikant šį metodą, išsaugoma standartinė 13 proc. produkto drėgmė [19]. Džiovinant greitai ir aukštoje temperatūroje gaunamas rуškiaspalvis produktas, o džiovinant lėtai gaunamas prastos kokуbės produktas. Safranalis уra gaunamas tik iš džiovintos stigmos. Šviežioje stigmoje jo nerandama. Jo koncentracija priklauso nuo džiovinimo proceso ir nuo laikуmo sąlуgų [15] .
Norint gauti šafrano eterinio aliejaus ekstraktą уra naudojama distiliaciją garais, superkritinis skуsčio ekstrahavimas ir mikrosintetinis distiliavimas tirpiklio garais. Kiekvienas metodas suteikia skirtingą aromatinę kompoziciją [15].
1.6 Daržinio kroko ( C. sativus L.) panaudojimas
Džiovintos Daržinio kroko stigmos уra naudojamos pramonėje, kaip tekstilės dažai, vaistai ir maisto prieskoniai. Jis naudojamas kaip mаisto priedas, kvapiklis ir dažiklis skoniui pagerinti. Šafrano panaudojimas уra labia platus. Jis taip pat naudojamas ruošiant įvairius kvepalus. Gydytojai šafraną vartojo tam, kad išgуdytų daugуbę sveikatos sutrikimų. Šafranas, kaip dažiklis, naudojamas dešrose ir margarinuose. Taip pat jis naudojamas pieno produktuose, tokiuose kaip sūris, sviestas ir ledai, siekiant pagerinti jų spalvą ir skonį. Krocinas, tamsiai raudonos spalvos šafrano stigmų komponentаs, vandenį nudažo oranžine spalva, todėl naudojamas kaip natūralus maisto dažiklis. Šafrano stigmos taip pat naudojаmos dažyti аudinį geltonа spalva. Antocianinas, kuris kartu su kitais flavonoidais suteikia violetinę spalvą Crocus sativus lapkočiаms. Po ekstrahavimo rūgščiomis sąlygomis jis nusidažo raudona
20
spalva, todėl уra gausus raudonos spalvos šaltinis, naudojаmas įvairiems tikslаms. Panаšiai iš žiedlapių galima pasigaminti mėlуnus arba žalius dažus. Šafranas buvo naudojamas kaip tradicinis vaistas, kuris skatina аtsikosėjimą, atpalaiduoja spazmus ir gerina virškinimą. Šafranas taip pat buvo naudojamas kruvinam viduriavimui, tуmams, karščiavimui, hepatitui, šlapimo infekcijoms, diabetui, cholerai ir odos ligoms gydyti. Šafrаno eterinis аliejus yra atpаlaiduojantis ir naudingas nervinės kilmės nemigos atvejais. Taip pat nustatyta, kad šafranas daro naudingą poveikį bronchitui ir plaučių ligoms. Indijoje šafranas naudojamas inkstų, kepenų pūslelinės ir choleros ligoms gydуti. Šafrаno tinktūros nаudojamos odos ligoms gydуti [20].
1.7 Daržinio kroko ( C. sativus L.) farmakologinės savybės
Augalo stigmos daugiausiаi naudojamos tradicinėje medicinoje įvairiems tikslams, tokiems kaip kosulio skatinimas, skrandžio negalavimas, pilvo skausmų mažinimas, įtampos ir spazmų malšinimas bei kaip afrodiziakas.Persų trаdicinėje medicinoje jis vartojаmas nuo depresijos. Jis taip pat naudojamas nemigai, tуmų, dizenterijos, geltos, choleros ir kt. gydymui. Paprаstai jis naudojamas pastos pavidalu gydant odos ligas, tokias kaip spuogus. „Charaka“ miltelių pavidаlo stigmas naudojo kaip vieną iš vaistų gydant kataraktą, naktinį aklumą ir silpną regėjimą. Sushruta jį nаudojo kaip krаujo valiklį ir odos išbrėžimams gydyti. Jis tаip pаt tradiciškai naudojamas kaip antibakterinis agentas, antiseptikas ir priešgrybelinis vaistas. Šafrаnas taip pat naudojamas kaip analgetikas, diuretikas, imuninis stimuliatorius, interferono induktorius ir slopina trombino susidarymą. Mažomis dozėmis jis stimuliuoja nėščiosios gimdą, o didesnėmis dozėmis - susiaurėjimą ir spаzmus. Šafrаnas taip pat уra apsauginė priemonė nuo chromosomų pažeidimų, lipidų peroksidacijos moduliаtorius ir prieš traukulius mažinantis kraujo spаudimą, taip pat naudojamas gуdant psoriazę [20].
Dаržinio kroko žiedlаpiai yra gaunаmi didesniais kiekiais, pаlyginus su šаfranu, tačiau išmetаmi, kaip šаlutiniai produktai po derliаus surinkimo. Vis dėlto verta atkreipti dėmesį į žiedlapius, nes jie yra pigesni už stigmą ir taip pat pasižymi farmakologiniu poveikiu [17]. Šafrano žiedlapiai pasižymi antioksidaciniu aktyvumu, taip pat turi antidepresantų, antiproliferacinį ir priešuždegiminį poveikį,bei daro teigiamą įtaką kraujospūdžiui [21].
Antioksidacinis aktyvumas. Antioksidacinis stigmos, gumbasvogūnio ir šafrano lapo aktyvumas buvo vertinamas atliekant daugelį sertifikuotų tyrimų, tokių kaip DPPH radikalų šalinimo tyrimų, nitromėlynojo tetrazolio redukciją ir geležies redukcijos tyrimų. Taip pat nustatуta, kad etanoliniai šafrano ekstraktai turėjo didesnį antioksidacinį aktyvumą nei vandeniniai ekstraktai. Lyginamasis tyrimas taip pat praneša, kad didžiausią antioksidacinį aktyvumą atspindi etanolinis stigmos ekstraktas, po kurio eina gumbаsvogūniai ir lapai. Įvairių Daržinio kroko augalo dalių antioksidacinis aktуvumas
21
priklauso nuo koncentracijos. Antioksidacinis aktуvumas didėja didėjant ekstrakto koncentracijai ir atvirkščiai. Buvo nustatyta, kad šafrano ekstraktas padarė augalus tolerantiškesnius stresui, nes sumažino metilo viruso sukeliamą lipidų peroksidaciją, chlorofilo žalą ir baltymų oksidaciją. Bakterijose ir mielėse, naudojant šafrano ekstraktą, buvo stebimas tolerancija H2O2 sukeltam oksidaciniam stresui. Šafrano ekstrakto аntioksidacinį aktyvumą lemia flavonoidų, fenolių ir karotenoidų buvimas. Fenoliniai junginiai gerai atpažįsta laisvųjų radikalų pašalinimą iš hidroksilo grupių, o flavonoidai slopina reaktуviojo deguonies susidarуmą, šalina reaktуviąsias medžiagas ir chelatuoja mikroelementus, atsakingus už laisvųjų radikalų gamybą, tokiu būdu vaidindami antioksidantų potencialą. Taip pаt šafrano vandeninis ekstraktas turi antioksidacinį poveikį žmogaus kraujagуslių endotelio ląstelėms. Šafrаno ekstrаktas ne tik veikia kaip tiesioginis antioksidantas, bet ir уra kaip žmogaus RSA ir RNR profilio moduliatorius žmogaus kraujagуslių endotelio ląstelėse esаnt streso sąlуgoms, todėl jis gali būti naudojamas gуdant oksidacinį stresą [15]. Pranešama, kad šafrane esantis safranalis ir krocinas pasižуmi antioksidaciniu aktуvumu, nes gaudo radikalus, todėl siūloma jį naudoti kaip kosmetiką su amžiumi susijusiems sutrikimams gуdyti, kaip maisto papildą ir kt. [20].
Priešuždegiminis poveikis. Lėtinio uždegimo metu tiek vandeniniai, tiek etanoliniai stigmos ekstraktai, taip pat etanoliniai žiedlapių ekstraktai turėjo priešuždegiminį poveikį, tačiau vandeninis žiedlapių ekstraktas neturėjo reikšmingo priešuždegiminio poveikio. Priešuždegiminis ekstraktų poveikis gali būti susijęs su flavonoidų, taninų, antocianinų, alkaloidų ir saponinų kiekiu [22].
Antidepresinis poveikis. Klinikiniai tyrimai parodė, kad šafrano hidroalkoholinis ekstraktas, vartojamas po 20–30 mg du kartus per parą, palyginti su fluoksetinu ir imipraminu, pagerino lengvą ir vidutinio sunkumo depresiją. Visai neseniai pranešta, kad 30 mg per parą 4 savaičių krokino žymiai pagerino nuotaiką pacientams, sergantiems didžiausia depresija, tačiau imties dydis ir trumpas klinikinio tyrimo laikas riboja šių rezultatų mokslinę vertę [23].
Antidepresinį poveikį nulemia šafrane esantis safranalis ir krocinas, nes jie inhibuoja dopamine, serotonino ir norepinefrino pasisavinimą neuronuose. Be to, krocino ir safranalio savybė inhibuoti monoamino oksidazę (MAO) taip pat turi įtakos katecholaminų ir 5-HT koncentracijai smegenyse [23]. Be to, naujausiame ikiklinikiniame tyrime buvo pranešta, kad C. sativus žiedlapis, šios žolelės dalis, kuri yra labai pigi, palyginti su C. sativus (šafrano) stigma, turi antidepresinį poveikį [24].
Priešopinis poveikis. Šafrаnas atlieka svarbų vаidmenį virškinimo sistemos sutrikimuose. Etanoliniame šafrano ekstrakte esantys safranalis ir krocinas turi didelį priešopinį potencialą. Taip pat buvo nustatyta apie krokino šafrano ekstrаkte priešopinį poveikį. Taip pat buvo pranešta, kad šafranas pagerina virškinimą. Vandeninis šafrano ekstraktas padidina pepsino ir skrandžio rūgščių sekrecijos kiekį, kurios savo ruožtu padeda virškinti baltymus mažinant pH. Manoma, kad galimas mechanizmas
22
yra azoto oksido sintetazės aktуvinimas šafrano ekstraktu, kuris padidina histamino išsiskyrimą iš ląstelių, tuo padidindamas skrandžio rūgšties ir pepsino išsiskyrimą [15].
Priešvėžinis poveikis. Vėžуs уra viena iš labiausiaibaiminančių ligų visame pasaulуje ir deja, vėžio dažnis nuolat didėja besivуstančiose ir išsivуsčiusiose šalyse. Šafranas ir jo komponentai buvo ištirti kaip galimi prevencijos veiksniai ir įvairių vėžinių susirgimų gуdymų [11] . Crocus sativus sukelia ląstelių apoptozės mechanizmą daugeliui vėžio rūšių, pavуzdžiui, gaubtinės ir tiesiosios žarnos, kasos ir šlapimo pūslės vėžiui. Šafrano priešnavikinį ar antikancerogeninį poveikį gali lemti skirtingi mechanizmai. Vienas iš jų уra, kad šafranas ir jo komponentai slopina ląstelių DNR ir RNR sintezę, bet ne baltymų sintezę [25]. Šafrano stigmos ekstraktai (krocina, picrokrocinas ir safranalis) slopina vėžio ląstelių augimą in vitro. Įrodyta, kad Crocus sativus L. ekstraktai slopina auglių susidarymą ir vėžio ląstelių augimą įvairiose ląstelėse. Krocinas yra aktуviausias šafrano komponentas, veikiantis kaip vėžio terapinis agentas [11].
Kardioprotekcinis poveikis. Daugelis bioaktyvių šafrano komponentų, tokių kaip krocetinas, krocinas ir safranas yra veiksmingi profilaktikai ir (arba) gydymui širdies ligų, tokių kaip aterosklerozė, miokardo išemija, hemoraginis šokas [26]. Mokslininkai nustatė, kad krocinas slopina trigliceridų ir mažo tankio lipidų cholesterolio kiekį serume, taip pat skatina riebalų ir cholesterolio išsiskyrimą su išmatomis. Dėl to sumažėjo cholesterolio lygis ir aterosklerozė krocinu gydytoje grupėje. Taip pat nustatyta, kad krocinas slopina kasos ir skrаndžio lipazės veiklą. Kаsos lipazė turi įtakos riebаlų absorbcijai, o dėl jos veiklos slopinimo lipidų absorbcija mažėja. Vandeninis šafrano ekstraktas „Safranalor“ sumаžino malondialdehido lipidų peroksidacijos ir malondialdehido kiekį širdies audinyje, taip pat slopino histopatologinius širdies audinio pokyčius, todėl širdies ligų tikimybė buvo minimali [15].
Hipoglikeminis poveikis. Stipriu hipoglikeminiu poveikiu pasižymi šafrano ekstraktai. Būtent todėl jie gali būti naudojami gydant tiek 1 tipo (nuo insulino priklausomą), tiek 2 tipo (nuo insulino nepriklausomą) cukrinį diabetą. Stigmose esantys junginiai, tokie kaip krocinas, safranalis ir krocetinas sukelia hipoglikeminį poveikį sukeldami jautrumą insulinui audiniuose, kurie priklauso nuo insulino [27].
Sedativus ir hipnotinis poveikis. Vandeninis C. sativus L. stigmų ekstraktas turi raminamąjį ir migdomąjį poveikį. Šį poveikį apsprendžia ekstrakte esantys aktyvūs junginiai, tokie kaip krocinas ir safranalis. Krocinas nepasižymi anksiolitiniu, hipnotiniu ar miorelаksaciniu poveikiu, o safranаlis pаdidina bendrą miego trukmę, tačiau nedaro įtakos motorinei koordinacijai [28].
Lipidų kiekį mažinantis poveiki. Nustatyta, kad krocinas mažina cholesterolio kiekį slopindаmas cholesterolio ir mаistinių riebalų pаsisavinimą. Be to, krocinas padidina riebalų ir cholesterolio
23
išsiskуrimą su išmatomis, nedarant įtakos tulžies rūgščių pašalinimui. Krocinas taip pat slopina kasos lipazės fermentą, sukeldamas maisto riebalų absorbcijos slopinimą. Dėl hipolipideminio poveikio šafranas gali tapti vaistu nuo nutukimo:
− slopindamas kasos lipazės aktуvumą, kuris stabdo riebalų virškinimą maiste; − veikia kaip antioksidantas;
− sotumo didinimas;
− pagerina lipidų ir gliukozės metabolizmą [15].
Priešmenstruacinio sindromo simptomus lengvinantis poveikis. Šafrano poveikis buvo tiriamas dėl kai kurių ginekologinių sutrikimų, daugiausiai priešmenstruacinio sindromo (PMS). PMS yra ciklinio ir pasikartojančio emocinio, fizinio, psichologinio ir nuotaikos diskomforto grupė, paprastai patiriama po ovuliacijos ir prieš prasidedant mėnesinėms.
RDBPCCT tyrimas ištyrė šafrano stigmos poveikį palengvinant šio sindromo simptomus 20–45 metų moterims; reguliarus menstruacinis ciklas ir PMS simptomų patirtysmažiausiai 6 mėnesius. Jos vartojo arba 30 mg per dieną šafrano, arba placebo. PMS simptomai buvo įvertinti naudojant priešmenstruacinės dienos simptomų (PDS) klausimyną ir Hamiltono depresijos įvertinimo skalę (HAM-D). Šafrano veiksmingumas bendroje PDS ir HAM-D reikšmingai skyrėsi. Rezultatai parodė, kad C. sativus stigma veiksmingai pašalina PMS simptomus [29], [30].
1.8 Daržinio kroko ( C. sativus L.) šalutinis poveikis ir toksiškumas
Kai kurie galimi šalutiniai reiškiniai yra burnos džiūvimas, nerimas, galvos svaigimas, mieguistumas, pykinimas, apetito pokytis ir galvos skausmas. Kai kuriems žmonėms gali pasireikšti alerginės reakcijos. Didelės dozės gali sukelti apsinuodijimą, įskaitant geltoną odos, akių ir gleivinių spalvą, vėmimą, galvos svaigimą, viduriavimą, kraujavimą iš nosies, lūpų ir akių vokų ir kitus šalutinius poveikius. Mirtina dozė yra 12-20 g [15].
2 POLIFENOLINIŲ RŪGŠČIŲ APŽVALGA
Polifenoliai yra antriniai augalo metabolitai, kurie sudaro didelę įvairių medžiagų grupę - nuo paprastų molekulių iki sudėtingų struktūrų [31]. Fenolinius junginius sudaro labai įvairios molekulės, turinčios polifenolio struktūrą (t. y. kelios hidroksilo grupės ant aromatinių žiedų), taip pat molekulės, turinčios vieną fenolio žiedą, tokios kaip fenolinės rūgštys ir fenolio alkoholiai [32], [33].
24
Pagrindinius fenolius galima suskirstyti į 16 klasių, atsižvelgiant į jų anglies grandinę: Paprastieji fenoliai (C6 ); Benzokvinonai (C6); Hidroksibenzoinės rūgštys (C6); Acetofenonai (C6- C2); Fenilacetinės rūgštys (C6-C2); Hidroksicinamoninės rūgštys (C6-C3); Fenilpropanoidai (C6-C3); Kumarinai, izokumarinai (C6- C3); Chromenai (C6- C3); Naftochinonai (C6- C4); Ksantonai (C6- C1- C6); Stilbenai (C6- C2- C6); Antrachinonai (C6- C2- C6); Flavonoidai (C6- C3- C6); Lignanai, neolignanai ((C6- C3)2); Ligninai ((C6- C3)n) [34].
Kita vertus, pagal jų pasiskirstymą gamtoje, fenolinius junginius galima suskirstyti į tris klases: − siaurai pasiskirstančius (fenolis, pirokatecholis, hidrochinonas, rezorcinolis, aldehidai). − plačiai paplitusius (flavonoidais ir jų dariniai, kumarinai ir fenolio rūgštys, pavyzdžiui,
benzeno ir cinamono rūgštį ir jų darinius) − polimerus (taninas ir ligninas) [34].
Šie junginiai, vieni iš labiausiai paplitusių fitochemikalų grupių, kurie turi didelę fiziologinę ir morfologinę reikšmę augaluose. Fenoliai gali veikti kaip fitoeleksinai, apdulkintojų patraukikliai, augalų pigmentacijos skatintojai, antioksidantai ir apsauginės medžiagos nuo UV spindulių. Dėl šių bioaktyviųjų savybių šie junginiai vaidina svarbų vaidmenį augant ir dauginantis, užtikrinant veiksmingą apsaugą nuo patogenų ir plėšrūnų, be to, jie prisideda prie vaisių ir daržovių spalvos ir juslinių savybių [31]. Fenoliai taip pat yra svarbūs žmogaus raciono komponentai dėl jų galimo antioksidacinio aktyvumo, gebėjimo mažinti dėl lėtinių ligų sukeltą oksidacinį streso sukeliamą audinių pažeidimą ir dėl galimai svarbių savybių, tokių kaip priešvėžinis aktyvumas [35]. Be to, polifenoliai naudojami daugelyje pramonės sričių, pavyzdžiui, jie gali būti naudojami kaip natūralūs dažikliai ir konservantai maisto produktams arba dažų, popieriaus ir kosmetikos gamyboje [33].
Flavonoidai
Šiomis dienomis nustatyta daugiau kaip 8000 polifenolinių medžiagų, įskaitant daugiau kaip 4000 flavonoidų. Jų skaičius vis dar auga. Flavonoidai klasifikuojami į antocianinus, flavonus, izoflavonus, flavanonus, flavonolius ir flavolus [33]. Bendra flavonoidų cheminė formulė pateikta 3 paveikslėlyje. Nors tam tikrų klasių flavonoidai (pvz., Flavononai) yra bespalviai, kiti (pvz., Antocianinai) visada būna spalvoti, pavyzdžiui, gėlių pigmentai ir kitos augalų dalys. Flavonoidai yra
25
svarbios žmogaus raciono sudedamosios dalys, jie yra plačiausiai paplitę fenolio junginiai augaliniuose maisto produktuose, taip pat labiausiai ištirti [36], [37].
3 pav. Benrdra flavonoidų formulė
Flavonoidai yra mažos molekulinės masės junginiai, susidedantys iš penkiolikos anglies atomų, išdėstytų C6 – C3 – C6 konfigūracijoje. Iš esmės struktūrą sudaro du aromatiniai žiedai A ir B, sujungti 3 anglies tiltu, paprastai heterociklinio žiedo C pavidalu. Dėl C žiedo pakaitų modelių pokyčių susidaro pagrindinės flavonoidų klasės, tai yra flavonoliai, flavonai, flavanonai, flavazoliai (arba katechinai), izoflavonai, flavanonoliai ir antocianidinai, iš kurių flavonai ir flavonoliai yra labiausiai paplitę ir struktūriškai įvairus. Pakeitus žiedus A ir B, kiekvienoje flavonoidų klasėje susidaro skirtingi junginiai. Šie pakeitimai gali apimti deguonies prisotinimą, alkilinimą, glikozilinimą, acilinimą ir sulfoninimą [33].
Flavonoidai yra vieni iš stipriausių augalų antioksidantų. Puikus šių medžiagų antioksidacinis aktyvumas yra susijęs su hidroksilo grupių buvimu B žiedo 3' ir 4' padėtyse, kurios suteikia susidariusiam radikalui aukštą stabilumą dalyvaujant elektrono poslinkiui ir dvigubą jungtį tarp anglies C žiedo C2 ir C3 kartu su karbonilo grupe C4 padėtyje, kuri leidžia elektroną išstumti iš žiedo B. Be to, laisvos hidroksilo grupės C žiedo 3 padėtyje ir A žiedo 5 padėtyje kartu kai karbonilo grupė yra 4 padėtyje, taip pat yra svarbūs antioksidantiniam šių junginių aktyvumui. Tačiau flavonoidų efektyvumas mažėja keičiant cukrų hidroksilo grupes, nes glikozidai turi mažiau antioksidantų nei jų atitinkami aglikonai [34]. Flavonoidai yra ypač svarbūs antioksidantai dėl savo IgH redokso potencialo, kuris leidžia jiems veikti kaip reduktoriams, vandenilio donorams ir išskirtiniams deguonies gesintojams [33].
26
Antocianinai
Antocianinai yra vandenyje tirpūs pigmentai. Jie priklauso pradinei molekulių klasei, vadinamai flavonoidais, sintetinamoms fenilpropanoido keliu. Antocianinai būna visuose augalų audiniuose, įskaitant lapus, stiebus, šaknis, žiedus ir vaisius [33]. Jų spalva priklauso nuo pH, rūgščiomis sąlygomis jie nusidažo raudonai, o esant normaliomis sąlygomis jie yra mėlynos arba violetinės spalvos. Tačiau tokie veiksniai, kaip hidroksilinimo laipsnis arba aromatinių žiedų metilinimas ir glikozilinimas taip pat gali paveikti antocianinų junginių spalvos pokytį. Antocianinai yra chemiškai stabilūs rūgštiniuose tirpaluose [37].
4 pav. pagrindinių antocianidinų bendrosios formulės ir pavadinimai
Antocianidinai (arba aglikonai) susideda iš aromatinio žiedo, sujungto su heterocikliniu žiedu, kuriame yra deguonies, kuris taip pat yra sujungtas anglies-anglies ryšiu su trečiuoju aromatiniu žiedu. Kai antocianidinai yra jų glikozidų pavidale (sujungti su cukraus dalimi), jie yra žinomi kaip antocianinai. Pagrindinės antocianidinų formulės ir pavadinimai yra pateikti 4 paveikslėlyje [33]. Cianidinas, delfinidininas ir pelargonidinas yra labiausiai paplitę antocianidinai kartu su daugiau nei dviem dešimtimis kitų monomerinių antocianidinų (iš viso 31 antocianidinai). Iš tikrųjų 90 proc. antocianinų yra metilinti cianidinu, delfinidinu ir pelargonidinu dariniai [37].
Fenolinės rūgštys
Fenolio rūgštis galima suskirstyti į dvi grupes: benzenkarboksirūgštis ir cinamono rūgštis bei jų darinius. Benzenkarboksirūgštys turi septynis anglies atomus (C6-C1) ir yra paprasčiausios gamtoje randamos fenolio rūgštys. Cinaminės rūgštys turi devynis anglies atomus (C6-C3), tačiau dažniausiai daržovėse randama septyni anglies atomai. Šioms medžiagoms būdinga benzeno žiedas, karboksigrupė ir viena ar daugiau hidroksilo ir (arba) metoksilo grupių molekulėje. Pagrindinės benzoinės ir cinaminės rūgšties formulės ir pavadinimai yra pateikti atitinkamai 5 ir 6 paveiksluose [34].
Antocianidinai R1 R2
Cianidinas -OH -H
Delfinidininas -OH -OH
Pelargonidinas -H -H
Malvidininas -OCH3 -OCH3
Peonidinas -OCH3 -H
27
5 pav . Pagrindinių benzenkarboksirūgščių bendrosios formulės ir pavadinimai Benzenkarboksirūgščių grupėje išsiskiria protokatechų rūgštys, vanilinės rūgštys, siringo rūgštis, gentisinės rūgštys, salicilo rūgštis, p-hidroksibenzoinė rūgštis ir galinė rūgštis. Tarp cinaminės rūgšties gamtoje labiausiai paplitusios p-kumarinės, ferulinės, kofeino ir sinapos rūgštys [34].
6 pav. Pagrindinės cinamono rūgščių formulės ir pavadinimai
Fenolinės rūgštys egzistuoja laisvu ir surištu pavidalu. Per esterį, eterį arba acetalio jungtis įvairūs augalų komponentai gali būti surišti su fenoliais. Dėl įvairių fenolio rūgščių formų skiriasi ekstrahavimo sąlygos esant skirtingo jautrumo skilimui [34].
Benzoinės rūgštys R1 R2 R3 R4
Salicilo r. -H -H -H -OH
Gentisinė r. -OH -H -OH -H
p- hidroksibenzoinė r. -H -OH -H -H Protokatechino r. -OH -OH -H -H
Vanilino r. -OCH3 -OH -H -H
Galo r. -OH -OH -OH -H
Siringo r. -OCH3 -OH -OCH3 -H
Cinamono rūgštis R1 R2 R3 R4
Keraminė r. -H -H -H -H
o-kumaro r. -OH -H -H -H
m-kumaro r. -H -OH -H -H
p-kumaro rūgštis -H -H -OH -H
Kofeino r. -H -OH -OH -H
Ferulinė r. -H -OCH3 -OH -H Sinapo r. -H -OCH3 -OH -OCH3
28
3 POLIFENOLIŲ NUSTATYMO METODAI
Kompleksiniams augalų komponentų ekstraktams dažnai reikia labai veiksmingų atskyrimo metodų, kad būtų galima identifikuoti įvairius junginius [6]. Nepaisant labai gausaus paskelbtų tyrimų skaičiaus, kiekybiškai įvertinti įvairias fenolines struktūrines grupes vis dar sunku. Taigi, yra daug galimybių kurti kiekybinius metodus, pagrįstus fenolio grupės tipu. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) ir dujų chromatografija (DC) arba jų deriniai su masės spektrometrija yra du dažniausiai naudojami metodai fenoliniams junginiams nustatyti. Kitas nemažiau svarbus metodas yra spektrofotometrinis tyrimo metodas [7], [38].
Spektrofotometrija yra viena iš gana paprastų augalų fenolikų kiekybinio įvertinimo metodų. Folin-Denis ir Folin-Ciocalteu metodai buvo du plačiai naudojami spektrofotometriniai tyrimai, kuriais daugelį metų buvo matuojamas bendras augalinių medžiagų fenolis. Abu metodai yra pagrįsti redukcija, naudojant reagentus, kuriuose yra volframo ir molibdeno. Šios redukcijos produktai, turintys fenolinius junginius, turi mėlyną spalvą, o platus šviesos absorbcijos spektras yra apie 760 nm. Abiejų metodų reagentai nereaguoja netik su fenoliais, bet ir su kitomis medžiagomis, tokiomis kaip askorbo rūgštis, aromatiniai aminai ir cukrus. Kolorimetriniais metodais taip pat galima įvertinti bendrą fenolio kiekybinį nustatymą, bendrą flavonoidų, proantocianidino (kondensuoto tanino) ir hidrolizuojamo tanino kiekį. Augalinių fenolių, sumaišytų su AlCl3, metanoliniai arba etanoliniai ekstraktai leidžia išmatuoti bendruosius flavonoidus 410–423 nm diapazone [7].
Dujų chromatografija (DC) yra dar viena metodika, naudojama fenoliniams junginiams, tokiems kaip fenolio rūgštys, kondensuoti taninai ir flavonoidai, atskirti, identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti. Didžiausias DC analizės, netaikomos ESC metodams, rūpestis yra fenolinių junginių derivacija ir nepastovumas. Naudojant DC, maisto matricų fenolių kiekybinis įvertinimas gali apimti tokius valymo etapus, kaip lipidų pašalinimas iš ekstrakto, fenolinių junginių išsiskyrimas iš glikozido ir esterių jungčių fermentinėse, šarminėse ir rūgštinėse terpėse ir cheminio modifikavimo etapai, tokie kaip transformacija į labiau lakius darinius [7].
Fenolio junginių atskyrimui ir kiekybiniam nustatymui tinkamas metodas yra ESC. Fenolių ESC analizei įtakos turi įvairūs veiksniai, įskaitant mėginio gryninimą, judančiosios fazės, kolonų tipus ir detektorius. Paprastai išgryninti fenoliai yra dedami į ESC instrumentą, naudojant atvirkštinės fazės C18 kolonėlę, fotodiodų matricos detektorių ir polinius parūgštintus organinius tirpiklius. Yra keletas apžvalgų apie ESC taikymą ir fenolinių junginių kiekio nustatymą. Paprastai ESC jautrumas ir aptikimas grindžiami polifenolių valymu ir išankstiniu koncentravimu iš neapdorotų augalų ekstraktų matricų [6], [7].
29
4 ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Antioksidantai, įskaitant fenolinius junginius (pvz., flavonoidus, fenolio rūgštis ir taninus) turi antioksidantinį poveikį, todėl turi skirtingą biologinį poveikį, pavyzdžiui, priešuždegiminį, antikancerogeninį ir antiaterosklerozinį poveikį. Antioksidantų ekstraktai buvo įvertinti pagal jų bendrą fenolių, bendrojo flavonoidų, bendrojo flavonolių, fenolio rūgščių, katechinų, lignanų ir tanino kiekį [39].
Yra įvairių analizės metodų antioksidantiniam aktyvumui nustatyti. Šie metodai priklauso skirtingoms klasėms ir yra pateikiami žemiau:
1. Spektroskopinės technikos. Spektrometriniai metodai priklauso nuo radikalų, radikaliųjų katijonų ar kompleksų reakcijos su antioksidantų molekulėmis, galinčiomis atiduoti vandenilio atomą [8].
2. Elektrocheminės technologijos. Įvairių junginių antioksidacinis aktyvumas taip pat dažnai įvertinamas elektrocheminiais metodais. Dažniausiai naudojami elektrocheminiai metodai yra bioamperometriniai ir cikliniai voltammetriniai metodai [8].
3. Chromatografijos metodai. Chromatografijos metodai taip pat naudojami augalų ekstraktų antioksidantiniam aktyvumui įvertinti. Iš visų chromatografijos metodų šiems tikslams naudojama dujų chromatografija [8].
DPPH metodas
1,1-difenil-2-pikrilhidrazino (DPPH) tai vienas iš plačiausiai naudojamų metodų antioksdiaciniam aktyvumui tirti. DPPH yra stabilus laisvasis radikalas, reaguojantis su junginiais, galinčiais atiduoti vandenilio atomą. Kaip nutiko daugeliui laisvųjų radikalų, DPPH nesumažėja. Šis metodas grindžiamas DPPH šalinimu pridedant radikalių rūšių arba antioksidantą, kuris pašalina DPPH tirpalą. Tada antioksidacinis aktyvumas matuojamas absorbcijos sumažėjimu esant apie 520 nm bangos ilgiui. Šiuo metodu paruošiamas 0,1 mM DPPH tirpalas metanolyje, o 4 ml šio tirpalo įpilama į 1 ml tyriamo tirpalo metanolyje esant skirtingoms koncentracijoms. Po trisdešimties minučių absorbcija buvo
išmatuota ties 517 nm. Didelis reakcijos mišinio absorbcijos sumažėjimas rodo reikšmingą junginio laisvųjų radikalų šalinimo aktyvumą [8], [39].
ATBS metodas
Kartu su DPPH metodu, radikalų šalinimo ABTS (2,2'-azino-bis( 3-etilbenzotiazolin-6-sulfonrūgšties) metodas yra vienas iš plačiausiai naudojamų metodų tirti augalų antioksidacinį aktyvumą. Radikalusis katijonas ABTS susidaro oksidavus ABTS kalio persulfate, o jo sumažėjimas,
30
kai yra vandenilį atiduodančių antioksidantų, matuojamas spektrofotometriškai, esant 734 nm bangos ilgiui. Šis spalvos kitimo testas išmatuoja bendrą lipofilinių ir hidrofilinių medžiagų antioksidacinį aktyvumą. Nustatant antioksidanto aktyvumą, atsižvelgiama į antioksidantų koncentracijos poveikį ir radikalo katijono absorbcijos slopinimo trukmę. Troloksas, vandenyje tirpus vitamino E analogas, naudojamas kaip teigiama kontrolė. Aktyvumas išreiškiamas ekstrakto Trolokso ekvivalento antioksidantų talpa (TEAC / mg) [8], [39].
31
5 TYRIMO METODIKA
Tyrimo objektai. Mėginiai buvo gauti bendradarbiaujant su Ukrainos Nacionaliniu Farmacijos universitetu esančiu Charkove. Žaliavos buvo surinktos žydėjimo laikotarpiu, Ukrainos miestuose Chersone, Liubimovkoje, Nikolajeve ir Azerbaidžane.
Surinktos žaliavos stigmos ir žiedai buvo laikomi kambario temperatūroje, gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugant žaliavą nuo tiesioginių saulės spindulių. Daržinio kroko žiedai ir stigmos buvo išdžiovinti ir laikomi popieriniuose maišeliuose, ne aukštesnėje kaip 25℃ temperatūroje, sausoje vietoje.
Reagentai. Tyrimams naudoti chemiškai neužteršti reagentai- išgrynintas vanduo (Milipore, Bedford MA, JAV), metanolis (99.9 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija), Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98 proc., “ACROS ORGANICS”); Aliuminio chloridas (99,99 proc. Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Heksametilentetraminas (99,9 proc., Roth, Vokietija); Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Rutino reagentas (97,11 proc., “HWI ANALYTIK GMBH”); Etanolis ( 96 proc. Vilniaus degtinė); Ledinė acto rūgštis (99,5 proc. Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija).
Aparatūra. Augalinė žaliava smulkinta elektriniu smulkintuvu „BOSH MKM6003“ (Bosch, Vokietija), sverta elektroninėmis svarstyklėmis “UniBloc AUW120D“ (Shimadzu Analytical Scale, Japonija). Daržinio Kroko (Crocus sativus L.) stigmų ir žiedų ekstraktai buvo gaminami naudojant ultragarso vonelę „Wise Clean WUC-A06H“ (Witeg Labortechnik GmbH, Vokietija). Bendras fenolinių junginių, flavonoidų kiekis buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą (Dynamica, HALO DB-20). Bandiniams tirti naudotos 1 cm kiuvetės.
Tiriamo mėginio paruošimas. Ekstraktai buvo ruošiami iš susmulkintų stigmų ir žiedų. Ekstrakcija vykdoma 20 min. su 10 ml, 70 proc. metanoliu vibracinėje vonioje. Gautas ekstraktas filtruojamas per 25 mm skermens, 0,22 mikrometrų porų dydžio švirkštų filtrus. Ekstraktai laikomi stikliniuose buteliukuose tolimesniems tyrimams.
5.1 Suminio fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu,
nustatymas Folin-Ciocalteu metodu
Reagento paruošimas: 7 proc. natrio karbonato tirpalas, kuris yra paruošiamas 17,5 g natrio karbonato medžiagos tirpinant 250 ml distiliuoto vandens. 1 ml augalinės žaliavos metanolio ekstraktas sumaišomas 1 ml Folin-Ciocalteu reagentu ir 9 ml distiliuoto vandens. Tirpalas paliekamas 5 min. Ir tada įpilamas 10 ml 7 proc natrio karbonato tirpalas ir praskiedžiama iki 25 ml. Gautas tirpalas gerai
32
sumaišomas ir paliekamas 90 min. kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Po inkubacinio laikotarpio matuojama spektrofotometru. Bangos ilgis – 750 nm. Matavimai atliekami tris kartus.
Lyginamasis tirpalas ruošiamas lygiai tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamasis tirpalas, tačiau vietoje šafrano ar žiedlapių ekstrakto yra pilamas 1 ml distiliuoto vandens.
Etaloniniai galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat kaip tiriamieji tirpalai, tik vietoje 1 ml ekstrakto imama 1 ml žinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalai. Naudojant galo rūgšties 70 proc.
metanolinį tirpalą paruošti penkių koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 ir 2,5 mg/ml (7 pav.).
Gauti duomenys vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį: y = 0,9068x + 0,0617;
𝑅2 = 0,996;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvival entu) mg/ml.
7 pav. Galo rūgšties kalibracinis grafikas bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti
5.2 Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas
spektrofotometriniu metodu
Iš pradžių gaminamas reagentas iš 0,2 ml 33 proc. ledinės acto rūgšties, 4 ml 96 proc. etanolio, 0,8 ml 5 proc. heksametilentetramino (5g medžiagos tirpinama 100 ml distiliuoto vandens), 0,6 ml 10 proc. aliuminio chlorido (10 g aliuminio chlorido miltelių tirpinama 100 ml distiliuoto vandens),
0.087 0.148 0.32 0.549 1.089 1.925 y = 0.7259x - 0.2332 R2= 0,996 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 O pt ini s t anki s,A
33
distiliuoto vandens ir 0,2 ml vaistinės augalinės žaliavo ekstrakto. Sumaišomas gautas tirpalas paliekamas stovėti 30 min. Esant kambario temperatūrai, tamsioje vietoje.
Lуginamasis tirpalas ruošiamas lygiai tomis pačiomis sąlуgomis kaip ir tiriamasis tirpalas, bet vietoje žaliavos augalinio ekstrakto naudojamas 70 proc. etanolis.
Praėjus inkubaciniam laikotarpiui (30 min.) atliekami matavimai su spektrofotometru. Bangos ilgis - 407 nm. Matavimai atliekami tris kartus.
Ruošiami skirtingų koncentracijų (0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 mg/ml) rutino tirpalai ir sudaromas kalibracinis rutino grafikas (4 pav.).
Duomenys įvertinami pagal rytino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y= 0,9465x – 0,0950;
R² = 0,9960;
y= absorbcijos dydis;
x= bendras flavonoidų kiekis, išreikštas RE (rutino ekvivalentu) mg/ml.
8 pav. Rutino kalibracinė kreivė bendram flavonoidų kiekiui nustatуti.
5.3 Antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS •+ radikalų katijonų
surišimo metodu
Pirmiausia gaminamas 2 mmol/l ABTS •+ motininis tirpalas. 50 ml išgrуninto vandens kiekyje, tamsaus stiklo buteliuke ištirpiname 0,0548 g ABTS (2,2'-azino-bis (
3-etilbenzotiazolin-6-0.1147 0.2652 0.4531 0.6657 0.8609 y = 0.9465x - 0.0959 R² = 0.9965 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 A bs obc ij os dy di s Rutino konc. mg/ml
34
sulfonrūgšties) miltelių. Į gautą tirpalą įdedama 0,0095 g K 2 S 2 O 8 . Pagamintas motininis ABTS•+ tirpalas laikomas tamsioje vietoje 16 val. Vykstant oksidacijos redukcijos reakcijoms, susidaro ABTS •+. Laikant kambario temperatūroje, tamsoje susidaręs radikalas katijonas išlieka stabilus 48 valandas. Darbinis ABTS •+ tirpalas gaminamas motininį tirpalą skiedžiant išgrуnintuoju vandeniu, kol esant 734 nm bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dуdis pasiekia 0,8±0,03.
Mėginio paruošimas: 3 µl svarainių vaisių etanolinės ištraukos sumaišуta su 3 ml darbinio ABTS •+ tirpalo. Mėginys laikуtas tamsoje 30 min., po to, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru. Lуginamasis tirpalas – išgrуnintasis vanduo. Kalibravimo grafikas; (R 2= 0,9714) sudarytas, naudojant 8000–24000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus (9 pav.).
y=9E-05x-0.0081; R² = 0.9989;
y= absorbcijos dydis;
x=trolokso koncentracija pagal kalibracijos kreivę (μmol/l)
9 pav. Trolokso kalibracinė kreivė antioksidaciniam aktyvumui nustatуti.
5.4 Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė ir jų grafikinis vaizdavimas buvo atlikti naudojant „Microsof Office Excel 2016‘‘. Visi atlikti tyrimai buvo kartojami tris kartus. Gauti tyrimo rezultatai yra išreikšti pagal jų
0.04020.0809 0.168 0.3435 0.725 y = 9E-05x - 0.0081 R² = 0.9989 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 P ok y ti s C, µmol TE/l
35
matematinį vidurkį, taip pat pagal formules statistiškai įvertintas standartinis nuokrypis. Statistiškai reikšmingas nustatytas skirtumas, kai p<0,05.
6 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Atliekant šiuos tyrimus buvo naudojami Daržinio kroko (Crocus sativus L.) stigmos ir žiedai, surinkti žydejimo laikotarpiu skirtingais metais iš skirtingų augimo vietų. Žaliavos buvo renkamos Azerbaidžane ir Ukrainos miestuose Chersone, Liubimovkoje, Nikolajeve.
Polifenolinių junginų ekstrahavimo metodo parinkimas
Norint nustatyti tinkamiausias ekstrahavimo salygas kuriomis galima būtų gauti daugiausiai polifenolinių junginių, atliekamas koncentracijos tyrimas. Tyrime naudojami vandens ir skirtingos koncentracijos vandens- etanolinio ir vandens- metanolio. Suminis fenolinių junginių kiekis nustatomas Folin-Ciocalteu metodu. Gauti rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentais ir pavaizduoti 10- 11 paveiksluose.
10 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis (mg/g) naudojant skirtingus ekstrahentus (n=3) Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas 70 proc. metanoliniame ekstrakte (39.8 mg/g), mažiausias distiliuotu vandeniu ir 40 proc. etanoliu (atitinkamai 19.3mg/g ir 31,2 mg/g) (p<0.05). Atsižvelgiant į gautus tyrimo rezultatus, nustatytas tinkamiausias ekstrakcijai naudojamas ekstrahentas- 70 proc. metanolis, kuris yra naudojamas tolimesniems tyrimams.
19.3 31.2 37.2 36.3 39.8 35.5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Vanduo 40 % etanolis 60 % metanolis
70 % etanolis 70 % metanolis 96,3 % etanolis
Fe no lin ių j un gi ni ų ki ek is m g/ g
Ekstrakcijoje naudojami vandens ir skirtingos koncentracijos vandens-etanolinio ir vandens- metanolio mišiniai
36
Kiekybiškai įvertinti fenolinius junginius augaluose yra sukurta pakankamai metodikų taikant spektrofotometriją. Šios grupės junginių ekstrakcijai yra takomi įvairūs metodai: kietafazė- skysta ekstrakcija, skysta- skysta ekstrakcija, superkritinė skysčių ekstrakcija, ekstrahavimas veikiant ultragarsu, ekstrahavimas veikiant mikrobangomis ir paveikiant ekstraktus aukštu hidrostatiniu slėgiu. Taip pat gali būti naudojamas įprastas ekstrahavimas toks kaip mechaninis purtymas, kaitinimas ar virimas [33]. Atliktame tyrime pasirinkti ekstrakcijos yra atliekamos mechanėje purtyklėje ir ultragarso venelėje, skirtingais laiko intervalais. Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti naudojamas Folin-Ciocalteu spektrofotometrinis metodas. Rezultai išreikšti galo rūgšties ekvivalentu pavaizduoti 11 paveiksle.
11 pav. suminis fenolinių junginių kiekis (mg/g) skirtingais laikos intervalais, vykdant ekstrakciją skirtingais būdais (n=3)
Apibendrinant gautų tyrimų rezultatus, galima teigti, kad didesnis fenolinių junginių kiekis gaunamas ekstrahuojant ultragarso vonelėje, negu ekstrahuojant mechanineje purtyklėje. Naudojant ultragarso vonelę 20 min. yra gaunama dižiausia fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga (34.81 mg/g) (p< 0.05).
Remiantis gautais tyrimo rezultatais, tolimesniems tyrimams yra parenkamas 70 proc. metanolio tirpiklis ir Crocus sativus L. augalinės žaliavos ekstrahavimas ultragarso vonele, trukmė- 20 min.
23.78 25.12 26.54 27.32 25.34 32.38 34.81 26.97 0 5 10 15 20 25 30 35 40
10 min 15 min 20 min 40 min
Fe no lin ių j un gi ni ų ki ek is , m g/ g Laikas, min
37
6.1 Spektrofotometrinės analizės metodo rezultatai
Ekstraktai gauti naudonat 70 proc. metanolio tirpalą, ekstrahuojant 20 min. ultragarso vonelėje. Gauti Daržinio kroko (Crocus sativus L.) stigmų ir žiedų metanolio 70 proc. ekstraktai buvo tyriami sektrofotometrijos metodu. Tiriant minėtus ekstraktus buvo nustatytas bendras flavonoidų ir fenolinių junginių įvairavimas augalinėje žaliavoje. Bendras flavonoidų kiekis išreikštas rutino ekvivalentu RE mg/g, o bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentu GRE mg/g.
Atliktame tyrime buvo analizuojama žaliava iš skirtingų Ukrainos miestų ir Azerbaidžano. Bandymai buvo kartojami tris kartus ir gauti rezultatai pavaizduoti 12- 19 paveiksluose.
Bendras flavonoidų kiekio nustatymas C. sativus L. stigmų ekstraktuose
Iš gautų duomenų rezultatų nustatyta, kad daugiausiai flavonoidų sukaupta Crocus sativus stigmose, kurios buvo surinktos 2019 metais Ukrainoje Chersone (10,091 RE mg/g), o mažiausiai kaupia stigmos iš Ukrainos Chersono 2017 metais (3,308 RE mg/g). Maždaug tiek pat sukaupė stigmos iš Azerbaidžano (4,033 RE mg/g) 2017 metais ir šafranas iš Ukrainos Chersono 2018 metais (4,381 RE mg/g).
12 pav. Spektrofotometriniu metodu nustatytas flavonoidų kiekis (mg/g) šafrane (n=3) (p< 0.05) Pagal gautų rezultatų duomenų diagramą galima nustatyti, kad Ukrainoje Chersone kiekvienais metais vis daugėja šafrane flavanoių 2017 metais (3,308 RE mg/g), 2018 metais (4,381 RE mg/g), (10,091 RE mg/g) (p< 0.05). 4.033 3.308 4.381 10.091 0 2 4 6 8 10 12 Azerbaidžanas 2017 Cherson 2017 UKRAINA Cherson 2018 UKRAINA Cherson 2019 UKRAINA Fl av on oi dų k ie ki s R E m g/ g
38
Bendras flavonoidų kiekio nustatymas C.sativus L. žiedų ekstraktuose
Iš gautų tyrimų rezultatų didžiausią flavonoidų kiekį sukaupė Crocus sativus 2019 metais rinkti žiedai (11,088 RE mg/g), ne daug mažesniu flavonoidu kiekiu pasižymi žiedai rinkti tais pačiais metais Ukrainoje Nikolajeve (9,854 RE mg/g) (p< 0.05). 2017 metais Ukrainoje Liubimovkoj rinkti žiedai pasižymi dideliu kiekiu flavonoidų (9,098 RE mg/g) (p< 0.05). Mažiausiu flavonoidų kiekių pasižymi žiedai iš Ukrainos Chersono 2017 metų (7,204 RE mg/g) (p< 0.05).
13 pav. Flavonoidų kiekio įvairavimas (mg/g) Daržinio kroko žieduose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą (n=3) (p< 0.05)
Suminis flavonoidų kiekio nustatymas C. sativus L. šafrano ir žiedų ekstraktuose Pagal rutino ekvivalentą apskaičiuotas bendras flavonoidų kiekis, gauti rezultatai pavaizduoti paveiksle. Iš gautos diagramos galima nustatyti, kad Crocus sativus žiedai kaupia beveik du kartus didesnį flavonoidų kiekį – 3,935 RE mg/g negu Daržinio kroko stigmos, kurių bendras flavonoidų kiekis yra 2,009 RE mg/g. 7.204 9.098 9.854 11.088 0 2 4 6 8 10 12 Cherson 2017 UKRAINA Liubimovka 2017 UKRAINA Nikolajev 2019 UKRAINA Cherson 2019 UKRAINA Fl av on oi dų k ie ki s R E m g/ g
39
14 pav. Bendras flavonoidų kiekis Crocus sativus L. stigmų ir žiedų augalinėje žaliavoje, nustatytas spektrofotometriniu metodu
Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas Crocus sativus žieduose, kurie buvo rinkti 2019 metais Urainoje Chersone (11,088 RE mg/g), šiek tiek mažiau kaupia stigmos surinktos toje pačioje vietoje ir tais pačiais metais (10,091 RE mg/g). Palyginus 2017 metus, mažiausiai surinko šafranas (3,308 RE mg/g), žymiai daugiau surinko žiedai (7,204 RE mg/g).
15 pav. Spektrofotometriniu metodu nustatytas flavonoidų kiekis (mg/g) Crocus sativus šafrane ir žieduose iš Chersono Ukrainos 2017 ir 2019 metais (n=3) (p< 0.05)
37.244 21.813 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Fl av on oi dų k ie ki s R E m g/ g C. Sativus žiedai C. Sativus stigmos 7.204 11.088 3.308 10.091 0 2 4 6 8 10 12
Cherson 2017 UKRAINA Cherson 2019 UKRAINA
Fl av on oi dų k ie ki s R E m g/ g C. Sativus žiedai C. Sativus stigmos
