LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Laura Uogė
Paviršių mikrobiologinės taršos įvertinimas ir
palyginimas, naudojant skirtingus tyrimo metodus
Surface microbiological target evaluation and
comparison by different test methods
Veterinarinės maisto saugos ištęstinių studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: doc. dr.Violeta Baliukonienė
2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Paviršių mikrobiologinės taršos įvertinimas ir palyginimas, naudojant skirtingus tyrimo metodus“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (INSTITUTE)
(aprobacijos data) (katedros (instito) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 91.1. Maisto saugos programos užtikrinimas ... 9
1.2. Sanitarijos veiksniai ir efektyvumas ... 9
1.3. Bioplėvelių susidarymas ... 11
1.4. Mikroorganizmų paplitimas ant kontaktinių gamybinių paviršių maisto tvarkymo įmonėse 12 1.5. Mikroorganizmų atsparumas dezinfekcinėm medžiagom ... 14
1.6. ATP matavimas ... 15
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 17
2.1. Tyrimo atlikimo vieta ... 17
2.2. Įrangos paviršių plovimas ir dezinfekcija ... 17
2.3. Mėginių ėmimas ... 18
2.4. Greitasis higienos įvertinimas, ATP tyrimas ... 19
2.5. Tyrimų eiga ... 19
2.6. Duomenų apdorojimas ir statistinė analizė ... 20
3. TYRIMO REZULTATAI... 21
3.1. Mėginių atrinkimas ... 21
3.2. Plovimo efektyvumo vertinimas ... 22
3.3. ATP greitojo higienos įvertinimo metodo rezultatų efektyvumas ... 26
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 28
IŠVADOS ... 30
PASIŪLYMAI ... 31
4
SANTRAUKA
Paviršių mikrobiologinės taršos įvertinimas ir palyginimas, naudojant skirtingus tyrimo metodus
Laura Uogė
Magistro baigiamasis darbas
Darbo atlikimo vieta: Magistro baigiamasis darbas atliktas 2015 – 2018 metais X maisto perdirbimo įmonėje. Rezultatai vertinami ir literatūros analizė atlikta LSMU VA Maisto saugos ir kokybės katedroje. Darbo apimtis 34 puslapiai, jame pateiktos 4 lentelės ir 7 paveikslai. Rengiant darbą panaudoti 38 literatūros šaltiniai.
Tikslas. Įvertinti įvairių gamybinių paviršių X maisto perdirbimo įmonėje mikrobiologinį užterštumą, panaudojant skirtingus mėginio paėmimo bei tyrimo metodus.
Tyrimo medžiaga ir metodai. Ištirta 250 mėginių. Ištirta pasirinktos X maisto perdirbimo įmonės kontaktiniai gamybiniai paviršiai, besiliečiantys su maistu. Mėginiams imti naudojami medvilniniai tamponai, gauti iš Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto. Kiekvienas tamponas dedamas į atskirą mėgintuvėlį su transportine terpe. Per 12 valandų mėginiai pristatomi į akredituotą laboratoriją mikroorganizmų identifikavimui (Nr. B1-338). Tiriami mikroorganizmai – Salmonella spp., Enterobacteriaceae, koliforminės bakterijos ir aerobiniai mikroorganizmai. Lygiagrečiai įrengimų paviršių švarumui įvertinti naudojami greitieji higienos įvertinimo testai – ATP bioliuminescencijos metodas.
Rezultatai ir išvados. Gauti rezultatai, vertinant mikroorganizmų kiekį prieš ir po gamybinės linijos plovimo, parodė statistiškai reikšmingus skirtumus. Atlikto tyrimo rezultatai, vertinant ATP ir tiriamųjų mikroorganizmų priklausomybę, parodė teigiamą ryšį tarp ATP ir aerobinių mikroorganizmų, enterobakterijų ir koliforminių bakterijų.
5
SUMMARY
Surface microbiological target evaluation and comparison by different test methods Laura Uogė
Master‘sThesis
Place of execution: Master's thesis made in 2015 - 2018 at the X food processing enterprise. The results are evaluated and the literature analysis is carried out at the Department of Food Safety and Quality of the Lithuanian University of Health Sciences Veterinary Academy. Thesis consists of 34 pages, it includes 4 tables, 7 figures. 38 references were used while preparing the work.
Purpose: To evaluate the microbiological contamination of various production surfaces in the X food processing enterprise using different sampling and testing methods.
Materials and methods: 250 samples were tested. The contact surfaces of the selected X food processing enterprise in contact with food were investigated. Cotton swabs obtained from the National food and veterinary risk assessment institute of Lithuania are used for sampling. Each swab is placed in a separate tube with transport matrix. Within 12 hours, samples are delivered to an accredited laboratory for the identification of microorganisms (No. B1-338). Microorganisms are studied – Salmonella spp., Enterobacteriaceae, coliform bacteria and aerobic microorganisms. Rapid hygiene assessment tests - the ATP bioluminescence method - are used to evaluate the cleanliness of the surface of the equipment in parallel.
Results and conclusions: The results obtained by evaluating the amount of microbacterial organisms before and after the washing of the production line showed statistically significant differences. The results of the study showed that there is a positive correlation between ATP and aerobic microorganisms, enterobacteria and coliform bacteria in assessing the ATP and the dependent microorganisms.
6
SANTRUMPOS
ATP - adenozintrifosfatas
BRC – Didžiosios Britanijos mažmeninės prekybos konsorciumo visuotinis maisto saugos standartas
GGP – Geros gamybos praktika GHP – Geros higienos praktika IFS – tarptautinis maisto standartas KSV – kolonijas sudarantys vienetai
p – statistinis patikimumas (reikšmingumo lygmuo) proc. – procentai
r – koreliacijos koeficientas
RLU – (angl. relative light units) – santykinis šviesos vienetas RVASVT - Rizikos veiksnių analizė svarbiuose valdymo taškuose spp. – rūšys
7
ĮVADAS
Maisto produktų kokybė ir jų sauga yra svarbiausias šiuolaikinės maisto pramonės uždavinys. Reaguojant į vis didėjantį su maistu susijusių ligų skaičių, atsakingos institucijos visame pasaulyje vis intensyviau stengiasi gerinti maisto saugą. Šiuolaikiniai prekybos standartai ir įstatymai nustato, kad su maistu susijęs verslas būtų vykdomas pagal tinkamą maisto saugos valdymo programą siekiant kontroliuoti su maistu plintančių ligų protrūkius. Šios kontrolės tikslas išlaikyti produktų ir proceso sąlygas iki priimtinų ribų, užtikrinant maisto saugą [1].
Nepaisant didelių visų suinteresuotų šalių pastangų, vis dar yra didžiulė su maistu susijusių ligų problema, kurioje mikroorganizmai atlieka svarbų vaidmenį. Į maisto grandinę mikroorganizmai patenka skirtingais etapais. Jie yra labai universalūs ir gali prisitaikti prie aplinkos, leidžiančios jiems išgyventi, augti ir gaminti toksiškus junginius. Todėl mikrobiologinės rizikos valdymui svarbu gerai suprasti visą maisto produktų gamybos grandinę. Galutinių produktų mikrobiologinė kontrolė yra neveiksmingas požiūris rizikai kontroliuoti, nes neįmanoma ištirti pakankamai maisto produktų, kad būtų galima įvertinti rizika vartotojų sveikatai [2].
Mikrobiologinės rizikos valdymui dažniausiai naudojamos rizikos veiksnių analizės svarbių valdymo taškų sistemos (RVASVT) ir geros gamybos praktikos (GGP) programos. Nors šios sistemos pasirodė esančios labai veiksmingos siekiant kontroliuoti maisto saugą, tačiau reikia suprasti, kad jos yra sukurtos remiantis žinomais rizikos veiksniais, neatsižvelgiant į galimai būsimus rizikos veiksnius [2].
Paviršių mikrobiologinė kontrolė yra svarbi tinkamos valymo ir dezinfekavimo savikontrolės programos priemonė pagal RVASVT sistemą, kuri reikalauja greitos stebėsenos, kuri pateiktų informaciją prieš išleidžiant produktą į rinką. Kontroliuojant gamybinių paviršių higieną, išvengiama mikroorganizmų keliamos rizikos pagamintam produktui, siekiant apsaugoti vartotoją [3].
Sanitarijos efektyvumo vertinimui tradiciškai iki šiol naudojamas vizualinis patikrinimas, tepinėliai, kontaktinės plokštelės. Vizualinis švaros patikrinimo metodas vis dar plačiai naudojamas, nors kai kurie duomenys rodo, kad tai prastas švaros rodiklis. Mikrobiologinių metodų trūkumas, tai kad jie gali užtrukti 48 valandas ir ilgiau. Per šį laiką pagamintas nesaugus produktas gali patekti į rinką. Kai kurios maisto tvarkymo įmonės naudoja greituosius paviršių švaros kontrolės metodus, tokius kaip ATP bioliuminescencijos metodas, kuris teikia realaus laiko duomenis apie paviršių mikrobiologinę ir organinių likučių taršą. Šis metodas ypač naudingas didelėse gamybos įmonėse, kuriose nuolatinė ir dažna stebėsena gali suteikti higienos lygio tendencijas. Nors šis metodas nenustato mikroorganizmų ar kitų teršalų rūšies, jis gali būti naudojamas kaip priemonė higienos stebėsenai ir švaros tikrinimui [3].
8 Nagrinėjama tema yra aktuali ir svarbi kiekvienai maisto tvarkymo ir perdirbimo įmonei. Gauti tyrimų rezultatai padės atidžiau kontroliuoti gamybinių paviršių higieninę būklę.
Darbo tikslas: įvertinti įvairių gamybinių paviršių X maisto perdirbimo įmonėje mikrobiologinį užterštumą, panaudojant skirtingus mėginio paėmimo bei tyrimo metodus.
Darbo uždaviniai:
1. Atrinkti ATP ir nuoplovų metodais paimtus mėginius prieš ir po gamybinės linijos plovimo;
2. Palyginti mikrobiologinių tyrimų rezultatus prieš ir po gamybinės linijos plovimo; 3. Įvertinti greitojo ATP metodo rezultatų efektyvumą.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Maisto saugos programos užtikrinimas
Maisto produktų kokybė ir jų sauga yra svarbiausias šiuolaikinės maisto pramonės uždavinys. Reaguojant į vis didėjantį su maistu susijusių ligų skaičių, atsakingos institucijos visame pasaulyje vis intensyviau stengiasi gerinti maisto saugą. Šiuolaikiniai prekybos standartai ir įstatymai nustato, kad su maistu susijęs verslas būtų vykdomas pagal tinkamą maisto saugos valdymo programą siekiant kontroliuoti su maistu plintančių ligų protrūkius. Šios kontrolės tikslas išlaikyti produktų ir proceso sąlygas iki priimtinų ribų, užtikrinant maisto saugą. Parengtos Maisto saugos programos praktinė sėkmė priklausys nuo tinkamo tam skirtų metodų ir priemonių panaudojimo. Maisto saugumui užtikrinti yra taikoma Geros higienos praktika (GHP), Geros gamybos praktika (GGP) ir Rizikos veiksnių analizės svarbių valdymo taškų sistema (RVASVT) [1,4]. RVASVT yra sistemingas požiūris į pavojų identifikavimą, vertinimą ir maisto produktų gamybos etapų kontrolę, kurie yra svarbūs maisto saugai [5]. RVASVT tikslas – maisto produktų užteršimo prevencija, identifikuojant rizikos veiksnius, užkertant kelią ar pašalinant pavojų maisto saugai arba pašalinant jį iki priimtino lygio. Tokie rizikos veiksniai vadinami kritiniais valdymo taškais [6].
Maisto produktų keliamas mikrobiologinis pavojus yra vienas pagrindinių per maistą plintančių ligų šaltinis, kuriomis užkrečiami žmonės [1]. Djuretic su kolegomis (1995 m.) nustatė, kad kryžminė tarša sudaro 36,3 proc. visų su maistu susijusių ligų protrūkių. Nors tiesioginis užteršimas gali atsirasti dėl tinkamai neapdoroto produkto, bakterijos taip pat gali būti pernešamos per rankas, nešvarius darbo rūbus ar įrangą [7].
Mikrobiologiniais kriterijais remiamasi sprendžiant, ar maisto produktai ir tų produktų gamybos, perdirbimo ir paskirstymo proceso etapai yra priimtini. Įgyvendinant RVASVT ir kitas higienos kontrolės priemones vadovaujamasi mikrobiologiniais kriterijais [1].
Saugių maisto produktų gamybai užtikrinti yra nustatyti bendrieji GGP higienos reikalavimai: 1. higieniškas maisto gamybos patalpų projektavimas ir statyba;
2. įrenginių higieniškas projektavimas, konstrukcija ir eksploatacija; 3. valymo ir dezinfekcijos procedūros;
4. bendrosios maisto gamybos higienos ir saugumo taisyklės (mikrobiologinę žaliavų kontrolė, higieniškos kiekvienos proceso pakopos operacijos, personalo higiena bei saugaus maisto gamybos mokymas) [1].
1.2. Sanitarijos veiksniai ir efektyvumas
Kad būtų išvengta bet kokio fizinio, cheminio ar biologinio produkto užteršimo, visi su maistu kontaktuojantys paviršiai turi būti švarūs. Tinkamai parinkta valymo programa užtikrina
10 produkto kokybę [8]. Pagrindiniai sanitarijos reikalavimai maisto perdirbimo įmonėse yra veiksmingumas, nedideli ekonominiai poreikiai ir saugumas. Veiksmingas ir saugus sanitarijos valdymas pasiekia ekonominį efektyvumą jei vykdomos šios trys sąlygos:
1) parinktas veiksmingas ploviklis, t. y. ploviklis, kurio didžiausias efektyvumas yra naudojant mažiausią galimą koncentraciją ir minimalus atliekamo valymo laikas, nepaliekant pavojingų likučių;
2) reikalauja nedaug energijos sąnaudų;
3) mažiausia padaroma žala aplinkai ir veikiamiems paviršiams.
Sanitarijos valdymas, kuris atitinka pagrindinius reikalavimus, turi būti pagrįstas žiniomis apie konkrečias aplinkos sąlygas:
1) aptinkami patogenai, kolonizuojantys valomus paviršius; 2) žinios apie pasirinktų valymo priemonių poveikį patogenams; 3) paviršių cheminės ir fizinės savybės;
4) higieninis technologinių sistemų projektavimas [9].
Valymo efektyvumą sąlygoja keturi pagrindiniai veiksniai: cheminė medžiaga, mechaninis poveikis, temperatūra ir sąlyčio laikas, kurie kartu sudaro Sinner‘io ciklą [10]. Sinner‘io ciklas apibūdina ekonomiškai idealų valymo procesą paremtą šių pagrindinių veiksnių sąveikomis. Vieno iš jų sumažinimas ar panaikinimas turi būti kompensuojamas sustiprinant kitus veiksnius. Tačiau vieno iš veiksnių panaikinimas ar sumažinimas gali lemti bioplėvelių formavimąsi [9]. Cheminė medžiaga yra svarbi valymo ir dezinfekavimo etapams. Valymo etape cheminė medžiaga pašalina nešvarumus. Dezinfekcijos metu mažinamas po valymo likusių mikroorganizmų gyvybingumas. Naudojama mechaninė energija, skirta fiziškai pašalinti nešvarumus apimant valymą šepečiais, automatinį šveitimą, skalbimą slėgio srove ar skysčių cirkuliaciją uždarose sistemose. Temperatūra valymą ir dezinfekavimą veikia keliais būdais. Pirmiausia, cheminis poveikis tiesiogiai didėja nuo temperatūros. Antra, aukštesnė temperatūra nei riebalų ir aliejų lydymosi temperatūros, palengvina jų pašalinimą, tačiau gali padidinti baltymų patvarumą, dėl jų denatūravimo. Sąlyčio laikas tarp cheminės medžiagos ir paviršiaus gali būti prailginamas naudojant chemines medžiagas putų ar gelio pavidalu [11].
Valymo ir dezinfekavimo efektyvumą taip pat lemia vandens kietumas, užteršimo pobūdis, paviršių mikrotopografija, paviršių ir naudojamų ploviklių suderinanumas, ploviklio panaudojimo būdas, naudojimo trukmė ir atitinkamas svarbumo greitis į bioplėvelių struktūrą [9].
Valymo priemonių veiksmingumas yra pagrindinis rūpestis maisto pramonei, nes šios priemonės pašalina bioplėveles [11]. Valymo metu gali būti pašalinta iki 99,8 proc. bakterijų, esančių ant nerūdijančio plieno paviršių [8]. Be vandeninių tirpalų, uždarų sistemų valymui taip pat
11 gali būti naudojamos priemonės putų ar gelio pavidalo [38]. Tačiau kiekviena medžiaga turi būti lengvai nuskalaujama ir nedaryti neigiamos įtakos technologinių sistemų paviršiams [10].
Valymo ir dezinfekavimo procedūros susideda iš plovimo, ploviklių ir dezinfekavimo priemonių naudojamų skirtinguose temperatūriniuose rėžimuose ir koncentracijos užtikrinant geriausią poveikį. Sistemos vėdinimas yra svarbus valymo proceso užbaigimo etapas, nes tai leidžia tinkamai išdžiūti paviršiams proceso pabaigoje. Bioplėvelių susidarymas maisto perdirbimo pramonėje yra susijęs su drėgnais paviršiais. Sumažėjus vandens aktyvumui aplinkoje, slopinamas mikroorganizmų augimas ir gyvybingumas [9].
Bioplėvelių susidarymo laikas priklauso nuo valymo režimo dažnumo. Paviršiai, kurie kontaktuoja su maistu dažniausiai valomi keletą kartų per dieną, tačiau aplinkos paviršiai (pvz., sienos) gali būti valomi kartą per savaitę, ko pasekoje bioplėvelių susidarymui ant aplinkos paviršių atsiranda daugiau laiko. Gibson ir kt. (1995 m.) nustatė, kad nors maisto perdirbimo aplinkoje bakterijoms lengva prisitvirtinti prie įvairių paviršių, tačiau dažniausiai bakterijos kolonizuojasi ir bioplėveles formuoja ne ant tiesiogiai su maistu kontaktuojančių paviršių, bet ant aplinkoje esančių paviršių. Aplinkos paviršiai, tokie kaip grindys, sienos, yra netiesioginiai mikrobinio užteršimo šaltiniai, kai produktas gali būti užterštas per orą, personalą ar valymo sistemas [11].
Maisto perdirbimo įmonės aplinkoje atliktame tyrime prieš valymą, valymo metu ir po dezinfekcijos, rezultatai parodė, kad valymo etapas sumažina 1 log bakterijų kiekį ant paviršių, kai tuo tarpu Dunsmore ir kt. [8] nustatė, kad valymo metu pašalinama iki 99,8 proc. mikroorganizmų. Valymo etapas yra svarbus veiksmingam dezinfekavimo procesui. Tinkamai nepašalinus nešvarumų, produkto likučiai gali inaktyvuoti dezinfekavimo priemonę arba apsaugoti mikroorganizmus nuo dezinfekavimo poveikio. Šie rezultatai rodo, kad nors valymas sumažina mikroorganizmų koncentraciją ant paviršių, tačiau po valymo lieka daug mikroorganizmų, todėl dezinfekavimo etapas vis dar reikalingas [11].
Jei įrengimai yra higieniškai suprojektuoti, veiksminga valymo ir dezinfekavimo programa yra pagrindinis kontrolės būdas paviršių užterštumui mažinti. Jei sanitarijos programa nėra veiksminga, mikroorganizmai ir produktų liekanos išliks tokios koncentracijos, kuri gali turėti įtakos produkto kokybei ir saugai [11].
1.3. Bioplėvelių susidarymas
Mikroorganizmų formuojamos biologinės plėvelės sutinkamos ant visų rūšių technologinių gamybinių pavišių. Bioplėvelių buvimas ant paviršių kontaktuojančių su maistu neigiamai veikia galutinio produkto kokybę ir saugą, dėl to kad šalia sveikatai nepavojingų bakterijų gali būti ir patogeninių mikroorganizmų. Tiesioginis sąlytis su žaliavomis ar maisto produktu gali sukelti antrinį užteršimą, dėl kurio galutinis produktas tampa nesaugus [9].
12 Bioplėvelė tai mikroorganizmų ląstelių, sujungtų su polimerinėmis medžiagomis, kurios greitai plečiasi ir auga ant skirtingų medžiagų paviršių, agregacija. Bioplėvelių formavimasis atvirose ir uždarose vamzdynų sistemose, ant grindų, sienų, lubų gamybinėse patalpose yra pagrindinė problema atrenkant veiksmingas valymo ir dezinfekavimo priemones [9].
Bioplėvelių formavimasis priklauso nuo trijų pagrindinių komponentų sąveikos: bakterijų ląstelių, prisitvirtinimo prie paviršiaus ir aplinkos [12]. Bioplėvelę formuoja įvairios mikroorganizmų rūšys, kurios viena kitą apsaugo nuo antibakterinių medžiagų poveikio ir tuo pačiu metu yra atsparios šioms medžiagoms. Bioplėvelę gali sudaryti viena rūšis, tačiau paprastai iš jų išskiriama daugiau mikroorganizmų rūšių. Vieno mikroorganizmo išskirta egzopolimerinė medžiaga gali sukurti palankią aplinką kito mikroorganizmo prisitvirtinimui ir augimui. Atlikti tyrimai parodė, kad Listeria monocytogenes prisitvirtinta prie Pseudomonas fragi išskirtos egzopolimerinės medžiagos [9].
1.4. Mikroorganizmų paplitimas ant kontaktinių gamybinių paviršių maisto
tvarkymo įmonėse
Bakterijų paplitimas maisto tvarkymo aplinkoje yra pagrindinis maisto produktų užteršimo šaltinis sukeliantis maisto produktų gedimą ir patogenų pernešimą [13]. Maisto higienos įstatymų pakeitimai ir didesnis visuomenės suvokimas apie produktų kokybę daro teigiamą įtaką maisto gamybos pramonei. Įrangos ir kitų su maistu kontaktuojančių paviršių higieninė būklė kontroliuojama taikant valymo ir dezinfekavimo sistemas, kuriuos padeda pašalinti ir neleidžia daugintis mikroorganizmams. Tokie sanitariniai procesai yra parengti taip, kad pirmiausia vykdant valymą naudojant chemines medžiagas, sumažinti mikroorganizmų populiaciją, o vėliau naudojant dezinfekcines priemones sumažinti likusių mikroorganizmų gyvybingumą. Taigi bendras sanitarijos programos tikslas – užkirsti kelią mikroorganizmų augimui [14].
Natūraliose ekosistemose ir laboratorinėmis sąlygomis dažniausiai pastebimas reiškinys yra bakterijų gebėjimas prisitvirtinti prie paviršių. Šis reiškinys yra svarbus kaip galimo užteršimo šaltinis bet kokiai medžiagai, kuri liečiasi su užterštu paviršiumi. Maisto tvarkymo pramonėje paviršiams, kurie liečiasi su maistu plačiai naudojamas stiklas, polipropilenas, guma. Nerūdijantis plienas dažniausiai naudojama medžiaga įvairiose aplinkose, kur užterštumas bakterijomis gali turėti didelį poveikį sveikatai [15,16].
Dėl nehigieniško įrengimų dizaino negalima jų tinkamai išvalyti, todėl atsiranda higienos problemos, kai mikroorganizmai prisitvirtina prie paviršių ir išgyvena ant jų, dauginasi ir užteršia maisto gaminius bei išlieka gyvybingi net po valymo ir dezinfekavimo [17]. Nerūdijantis plienas dažnai pasirenkamas kaip tinkamiausias paviršius dėl prastų sukibimo savybių ir lengvai valomo paviršiaus kaip stiklas bei lengviau valomo lyginant su polimeriniais, aliuminio ar variniais
13 paviršiais. Taip pat nerūdijančio plieno paviršiai atsparūs cheminiam poveikiui, kurį sukelia oksiduojantys ir kiti dezinfekuojantys plovikliai naudojami maisto pramonėje, tokie kaip hipochloritai, peracto rūgštis ar jodoforai. Tačiau ir nerūdijančio plieno paviršiai per ilgą laiką gali būti pažeisti ir turėti plika akimi nematomų įtrūkimų, kuriuose sėkmingai išgyvena ir dauginasi patogeninės bakterijos, kurios sukelia per maistą plintančias infekcijas [16,18].
Veikiant darbinius paviršius acto rūgšties ir natrio hipochlorito tirpalais, Staphylococcus
aureus bakterijos po 3 dienų ir toliau formavo bioplėveles tiek ant nerūdijančio plieno, tiek ant
polipropileno paviršių 7°C ir 28°C temperatūroje. Didžiausias bioplėvelę sudarančių ląstelių skaičius buvo nustatytas po šešių dienų, išskyrus ant polipropileno paviršių 7°C temperatūroje. Intensyviausiai bioplėvelės formavimas vyko ant nerūdijančio plieno paviršių 28°C temperatūroje [19]. Zobell (1943 m.) atlikti tyrimai parodė, kad bakterijų prisitvirtinimas prie paviršių užtrunka 6-12 valandų. Prisitvirtinimo greičiui įtakos turi organizmo rūšis, augimo fazė, organizmų skaičius, pH ir elektrolitų koncentracija [8].
Wilks su kolegomis [16] nustatė, kad Escherichia coli O157 gali išgyventi daugiau kaip 28 dienas ant nerūdijančio plieno sausų paviršių tiek kambario temperatūroje, tiek prie -4°C temperatūros. Tyrimo metu per pirmąsias dvi dienas gyvybingų bakterijų sumažėjo 5 log, tačiau populiacijos tankis liko pastovus 1x104 KSV/ml.
Atlikti tyrimai parodė, kad Staphylococcus aureus, esant dideliam ar vidutiniam užterštumui galima aptikti ant sausų paviršių praėjus 96 valandoms, tačiau esant mažam užterštumo lygiui per 48 valandas po pradinio užteršimo, ląstelių sumažėja žemiau nustatytos ribos. Staphylococcus
enteritidis atveju esant dideliam užteršimo lygiui gyvybingos ląstelės vis dar gali būti nustatytos
praėjus 96 valandoms, tačiau esant vidutiniam pradiniam ląstelių kiekiui, išgyvenusių ląstelių sumažėja per 24 valandas žemiau nustatytos ribos [20].
Cox ir kiti [21] ištyrė, kad Listeria monocytogenes galima rasti visų rūšių maisto gamybos aplinkoje. Dažniausiai sutinkama drenažuose, iš kurių L. monocytogenes gali būti pernešta per grindis ir galiausiai patekti ant su maistu kontaktuojančių paviršių.
Joseph su kolegomis nustatė, kad salmonelių suformuotos bioplėvelės ant nerūdijančio plieno paviršių yra jautresnės nei suformuotos ant plastikinių paviršių [22].
Atlikti tyrimai rodo, kad Salmonella ir Campylobacter viena iš infekcijos protrūkio priežaščių yra kryžminė tarša, kuri perduodama per užterštus paviršius, rankas, valymo įrankius ar indus [20]. Aarnisalo su kolegomis atliko apklausą 106 maisto tvarkymo įmonėse, siekiant įvertinti maisto tvarkytojų higienos reikalavimų laikymąsi. Gauti tyrimų rezultatai parodė, kad 55,9 proc. apklaustųjų dirbančių sąlytyje su maistu kontaktuojančiais paviršiais darbo metu dėvi vienkartines pirštines ir tik 23,7 proc. nusiplauna rankas prieš užsidėdami pirštines. Taip pat tyrimo metu buvo nustatyta kad tik 13,6 proc. apklaustųjų po rūkymo nusiplauna rankas bei tik 42,4 proc. plauna
14 rankas prieš patekdami į gamybines patalpas [17]. Atlikti tyrimai rodo, kad įvairios bakterijos, tame tarpe Escherichia coli, Staphylococcus aureus ir Salmonella spp. išlieka gyvybingos ant rankų, kempinių, šluoščių ar indų nuo kelių valandų iki keletos dienų po pradinio užteršimo [20].
1.5. Mikroorganizmų atsparumas dezinfekcinėm medžiagom
Naujos maisto gamybos ir vartojimo tendencijos didina poreikį veiksmingai taikyti sanitarinę praktiką maisto perdirbimo pramonėje. Dėmesys saugesniems maisto produktams ir ilgesnis jų galiojimo laikas paskatino naudoti cheminę dezinfekciją. Dezinfekcijos tikslas – pašalinti mikroorganizmus nuo paviršių kontaktuojančių su maistu taip išvengiant žaliavos užteršimo patogenais. Dezinfekcijos proceso neefektyvumas gali būti paaiškintas netinkamai parinktais parametrais (dezinfekcinės medžiagos koncentracija, temperatūra ar ekspozicijos laikas) ar, kai valymo procesas atliekamas netinkamai paliekant nešvarumus, kurie vėliau dezinfekuojami. Dauguma dezinfekantų naudojamų maisto pramonėje nepanaikina bakterijų sporų. Kai kuriais atvejais bakterijos išgyvena po veiksmingai atliktos valymo ir dezinfekavimo programos dėl bakterijų sumažėjusio jautrumo ar dėl jų atsparumo. Maisto perdirbimo pramonėje vyrauja plataus spektro mikroorganizmai, tačiau naudojamų dezinfekavimo priemonių bakterijų veikimo diapazonas pernelyg ribotas, o rekomenduojama dezinfekcinių tirpalų koncentracija dažniausiai ištirta tik laboratorinėmis sąlygomis. Esant nepakankamam dezinfekcinės priemonės nuskalavimui, gali atsirasti atsparių genų tarp mikroorganizmų arba prisitaikyti jautrios bakterijos. Naujausi tyrimai parodė, kad tam tikrų dezinfekavimo priemonių naudojimas sukelia selektyvų spaudimą ir prisideda prie mikroorganizmų atsparumo dezinfekcinėm medžiagom [23]. Mikroorganizmai prisitvirtinę prie paviršių yra atsparesni dezinfekcinėms priemonėm nei jų suspensijos bei gali geriau atsispirti dezinfekcijai esant žemai temperatūrai. McDonnell ir Russell (1999) bakterijų atsparumą apibūdina kaip natūralią organizmo savybę arba jo augimo būdą ar įgytą mutaciją [24].
Maisto tvarkymo pramonėje naudojami įvairūs alkoholio pagrindu pagaminti dezinfekantai, natrio hipochlorito, peracto rūgšties pagrindo tirpalai, ketvirtinių amonio junginių turintys tirpalai. Dezinfekcijos efektyvumą lemia pH, temperatūra, koncentracija, sąlyčio laikas ir organinės dalelės (nešvarumai, maisto likučiai), todėl plovikliai dažnai kartu derinami su dezinfekavimo priemonėmis, siekiant padidinti dezinfekavimo efektyvumą [25].
Dėl mažo toksiškumo, maisto perdirbimo pramonėje plačiai naudojami ketvirtiniai amonio junginiai savo sudėtyje turintys benzalkonio chlorido [25,26]. Atlikti tyrimai su benzalkonio chlorido tirpalu parodė stiprų antibakterinį aktyvumą. Tyrimo metu Listeria monocytogenes ir
Bacillus cereus buvo jautriausios ir atspariausios tyrinėjamos bakterijos. Gram teigiamosios
bakterijos (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus) parodė didesnį jautrumą nei gramneigiamosios bakterijos (Staphylococcus typhimurium, Escherichia coli,
15
Pseudomonas aeruginosa), išskyrus Bacillus cereus dėl savo sugebėjimo formuoti sporas. Tyrimo
rezultatai taip pat parodė, kad Staphylococcus aureus ir Escherichia coli pasireiškė panašus jautrumas benzalkonio chloridui, tai galėjo nulemti S. aureus gebėjimas formuoti bioplėvelę ir atsparumas [25]. Lopes (1986) atlikti tyrimai su šešiomis skirtingų tipų dezinfekavimo priemonėmis prieš L. monocytogenes ir Salmonella nustatė, kad ketvirtiniai amonio junginiai yra veiksmingesni prieš L. monocytogenes nei Salmonella [27].
J. Šalomskienės su kolegomis atliktas tyrimas parodė, kad iš visų tirtų plovimo ir dezinfekavimo medžiagų efektyviausiai L. monocytogenes augimą slopino preparatai, kurių veikliosios medžiagos yra peroksidai, peroksiacto rūgštis arba ketvirtiniai amonio junginiai. Mažiausią antibakterinį poveikį listerijoms turėjo dezinfekavimo preparatai, kurių veikliosios medžiagos – alkoholiai [28].
Rossini ir Gaylarde atlikti tyrimai parodė, kad natrio hipochloritas yra efektyvesnis dezinfekuojantis tirpalas lyginant su peracto rūgštimi E. coli, S. aureus ir Pseudomonas fluorescens atžvilgiu [18].
Joseph su kolegomis atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad salmonelių suformuota bioplėvelė yra daug atsparesnė prieš dezinfekcines medžiagas turinčias chloro ir jodo [22], taip pat trinatrio fosfato nei pavienės salmonelių ląstelės [25].
Ar mikroorganizmai išgyvens dezinfekciją, ar ne, priklauso nuo daugelio faktorių. Elementarių higienos reikalavimų laikymasis, tokių kaip veiksmingas valymas prieš dezinfekciją, rekomenduojamos koncentracijos, temperatūros ir sąlyčio laiko išlaikymas, paviršių nuskalavimas ir nusausinimas, padeda išvengti bakterijų atsparumo [23].
1.6. ATP matavimas
ATP bioliuminescencijos matavimo metodai yra plačiai naudojami maisto perdirbimo įmonėse, kaip greitas paviršių švarumo vertinimo metodas. Greitieji metodai suteikia galimybę lengviau laiku atlikti korekcinius veiksmus, jei nustatomos sanitarinės sąlygos [29]. Šis metodas realiu laiku pateikia švarumo įvertinimo rezultatus aptinkant mikrobinį užterštumą bei organines daleles ir produkto likučius, kurie gali rodyti netinkamai atliktą valymą ir būti maisto medžiagų šaltiniu mikroorganizmų augimui [30,31]. Mėginio rezultatai pateikiami santykinės šviesios vienetais (angl. relative light units – RLU) [32]. Pagrindinis šio metodo privalumas tai, kad jis greitas ir santykinai paprastas ir lengvai atkartojamas [31].
Atlikti tyrimai, kuriuose buvo lyginami gautų mikrobiologinių tyrimų rezultatai su ATP bioliuminescencijos metodu gautais rezultatais, siekiant įvertinti paviršių švarą. Kai kurie tyrimai atlikti in situ parodė teigiamą ATP ir mikrobiologinių metodų rezultatų koreliaciją, kiti – neigiamą. Nustatyta ATP metodo minimali aptikimo riba yra vienoda tiek sausiems, tiek drėgniems
16 paviršiams bei abiem bandomiesiems mikroorganizmams (S. aureus ir E. coli). Davidson su kolegomis nustatyta minimali ATP metodo aptikimo riba 104 ksv/100 cm2 tiek sausiems, tiek drėgniems paviršiams [30]. Tiriant ATP ir aerobinių mikroorganizmų tarpusio sąveiką, nustatyta tiesinė priklausomybė, kai aerobinių mikroorganizmų koncentracija yra 103
-107 ksv/25 cm2, tačiau esant mikroorganizmų koncentracijai 109
ksv/25 cm2 tiesioginės priklausomybės nėra. Tokius tyrimo rezultatus galėjo sąlygoti tai, kad mikroorganizmų koncentracija 107
ksv/25 cm2 yra didžiausia ATP bioliuminescencijos metodo jautrumo riba
[33]. Tebbutt su kolegomis atliktas tyrimas parodė statistiškai reikšmingą ryšį tarp ATP ir aerobinių mikroorganizmų skaičiaus tiriant pjaustymo lentų ir plastikinių konteinerių paviršius, tačiau neparodė statistiškai reikšmingo ryšio tiriant durų rankenų paviršius [34].
Lyginant ATP bioliuminescencijos metodą su mikrobiologiniais tepinėlių metodais, gauti statistiškai reikšmingi skirtumai. Aycicek su kolegomis atliktame tyrime abiem metodais buvo nustatyta daugiau švarių nei nešvarių paviršių. 37,1 proc. rezultatų, kurie buvo vertinami kaip „švarūs“ mikrobiologiniu metodu, nesutapo su ATP taikomu metodu gautais rezultatais [35]. Poulis nenustatė statistiškai reikšmingo ryšio tarp ATP bioliuminescencijos ir mikrobiologinių metodų [36].
Bendros rekomendacijos dėl paviršių sanitarinių sąlygų monitoringo ribinių verčių laikomos „geromis“, kai mikroorganizmų vertė yra mažesnė nei 10 KSV arba mažiau kaip 200 RLU, ir „blogomis“, kai 11-50 KSV, arba 1001-5000 RLU [33].
17
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Tyrimo atlikimo vieta
Mokslinis tiriamasis darbas buvo atliekamas 2015 – 2018 metais X maisto perdirbimo įmonės gamybinėse patalpose. Rezultatai vertinami ir literatūros analizė atlikta LSMU VA Maisto saugos ir kokybės katedroje.
Mėginiai imti X maisto perdirbimo įmonėje nuo tos pačios gamybinės linijos penkių skirtingų su maistu besiliečiančių nerūdijančio plieno kontaktinių paviršių. Įmonėje įdiegta RVASVT sistema, BRC ir IFS standartai. Pasirinkti gamybiniai paviršiai, kurie tiesiogiai liečiasi su produktu.
Siekiant įvertinti gamybinių paviršių mikrobiologinį užterštumą, viso buvo paimta 250 mėginių.
2.2. Įrangos paviršių plovimas ir dezinfekcija
Gamybinės linijos paviršiai plaunami kiekvieną kartą pasibaigus gamybos procesui. Plovimas turi būti atliekamas per 2 val. Paviršių plovimą atlieka 1-2 apmokyti įmonės darbuotojai.
Gamybinės linijos paviršiai plaunami etapais, kurie pateikti 1 lentelėje. Pirminis skalavimas sudaro 70-80 proc. viso plovimo. Jo metu svarbu kruopščiai pašalinti visus produkto likučius, nešvarumus. Tik tinkamai atlikus pirminį skalavimą vandeniu, galima pradėti šarminio plovimo etapą.
Šarminiam plovimui naudojama šarminė plovimo ir dezinfekavimo priemonė putų pavidalu, kurios veiklioji medžiaga natrio hipochloritas. Plovimo priemonė naudojama 2-3 proc. koncentracijos. Putomis padengiami visi gamybinės linijos paviršiai, dengiant nuo apačios į viršų. Ekspozicijos laikas 15-20 min.
Dezinfekcijai naudojama rūgštinė dezinfekavimo priemonė peracto rūgšties pagrindu. Naudojama 0,3-0,5 proc. koncentracijos tirpalas. Ekspozicijos laikas 15-20 min.
Viso tyrimo metu palaikoma vienoda tiek šarminės, tiek dezinfekcinės priemonės koncentracija. Kiekvieną kartą prieš atliekant įrangos plovimą ir dezinfekciją matuojama tirpalų koncentracija. Šarminio tirpalo koncentracija matuojama su laidumo matuokliu. Dezinfektanto koncentracija matuojama naudojantis „Merckoquant“ eterperoksidinio testo juosteles.
18
1 lentelė. Gamybinės linijos plovimo eiga.
Etapas Plovimo procedūra Plovimo priemonė Koncentracija, % Temperatūra, °C Ekspozicijos laikas, min.
1 Pirminis skalavimas Vanduo - 40 -
2 Šarminis plovimas Topax 66 2-3 40 15-20
3 Mechaninis valymas - - - - 4 Skalavimas Vanduo - 40 - 5 Dezinfekcija P3-oxonia active 0,3-0,5 40 15-20 6 Skalavimas Vanduo - 40 - 7 Nusausinimas - - - -
2.3. Mėginių ėmimas
Nuoplovų mėginiai imti vadovaujantis Lietuvos Respublikos Valstybinės Maisto ir Veterinarijos tarnybos direktoriaus įsakymu 2006 m. gegužės 17 d. Nr. B1-338 „Dėl nuoplovų paėmimo laboratoriniam tyrimui metodinių nurodymo patvirtinimo“. Mėginiams imti naudojami medvilniniai tamponai, gauti iš Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto. Tiriamasis paviršius tamponais braukiamas 10 kartų iš viršaus į apačią stipriai prispaudžiant tamponą prie tiriamojo paviršiaus. Imant nuoplovas nuo įrengimų dalių, steriliais tamponais braukiama per 25 cm2 plotą. Nuoplovos nuo didelių įrengimų paviršių imamos braukiant steriliu tamponu per ne mažesnį kaip 100 cm2
plotą (37). Kiekvienas tamponas dedamas į atskirą mėgintuvėlį su transportine terpe. Per 12 valandų mėginiai pristatomi į akredituotą laboratoriją mikroorganizmų identifikavimui (Nr. B1-338). Tiriami mikroorganizmai – Salmonella spp.,
Enterobacteriaceae, koliforminės bakterijos ir aerobiniai mikroorganizmai.
Salmonella spp. aptikimui taikytas akredituotas standartas LST EN ISO 6579-1:2017 Maisto
grandinės mikrobiologija. Bendrasis salmonelių aptikimo, skaičiavimo ir serotipavimo metodas. 1 dalis. Salmonelių (Salmonella spp.) aptikimas (angl. Microbiology of the food chain - Horizontal
method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella - Part 1: Detection of Salmonella spp.).
Enterobacteriaceae kolonijų skaičiavimui taikytas akredituotas standartas LST EN ISO
21528-2:2017 Maisto grandinės mikrobiologija. Bendrasis enterobakterijų (Enterobacteriaceae) aptikimo ir skaičiavimo metodas. 2 dalis. Kolonijų skaičiavimo būdas (angl. Microbiology of the
food chain - Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae – Part 2: Colony-count technique).
19 Koliforminių bakterijų skaičiaus nustatymui taikytas akredituotas standartas LST ISO 4832:2006 Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis koliforminių bakterijų skaičiavimo metodas. Kolonijų skaičiavimo metodas (angl. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal
method for the enumeration of coliforms – Colony-count technique).
Aerobinių mikroorganizmų skaičiaus nustatymui taikytas akredituotas standartas LST EN ISO 4833-1:2013 Maisto grandinės mikrobiologija. Bendrasis mikroorganizmų skaičiavimo metodas. 1 dalis. Kolonijų skaičiavimas 30°C temperatūroje, taikant lėkštelių užpylimo būdą (angl.
Microbiology of the food chain - Horizontal method for the enumeration of microorganisms – Part 1: Colony count at 30 degrees C by the pour plate technique).
2.4. Greitasis higienos įvertinimas, ATP tyrimas
Įrengimų paviršių švarumui po plovimo ir valymo įvertinti naudojami greitieji higienos įvertinimo testai. ATP tyrimu nustatomas valymo efektyvumas:
Aptinkame visų rūšių nešvarumus;
Tyrimas labai jautrus, greitas ir paprastas.
Kiekybine ATP (adenozinotri-fosfato) analize nustatomas valymo efektyvumas. ATP matavimas aptinka ne tik mikroorganizmus, bet ir produktų likučius.
ATP išmatuojamas dviejų fermentų (luciferazės ir luciferino) pagalba, ATP paverčiamas šviesa, kurią išmatuoja prietaisas – luminometras. Prietaisas parodo matavima RLU (angl. Relative
Light Units) – santykinis šviesos vienetas.
Tyrimo atlikimo eiga:
1) ištraukti tamponą iš mėgintuvėlio,
2) perbraukti per tiriamą drėgną paviršių (jei paviršius sausas, suvilgykite tamponą distiliuotu vandeniu),
3) tamponas įterpiamas atgal į mėgintuvėlį su terpe, 4) mėginys švelniai supurtomas,
5) mėginys įstatomas į 3MTM Clean-traceTM NG luminometrą, 6) vykdomas matavimas.
2.5. Tyrimų eiga
Tyrimo metu nuoplovų mėginiai buvo imami nuo tos pačios gamybinės linijos penkių skirtingų su maistu besiliečiančių kontaktinių paviršių po 4 mėginius Salmonella spp.,
Enterobakteriaceae, koliforminių bakterijų ir aerobinių mikroorganizmų nustatymui. Lygiagrečiai
20 pasibaigus gamybos procesui prieš pradedant gamybinės linijos plovimą ir po šarminio plovimo bei atliktos dezinfekcijos. Tyrimas kartojamas 5 kartus. Tyrimo eiga pateikta 2 lentelėje.
2 lentelė. Tyrimo eiga.
Mėginių skaičius, vnt.
Viso mėginių skaičius, vnt. I etapas ATP greitasis higienos įvertinimo testas 5
25
Nuoplovų mėginiai Salmonella 5
Enterobacteriaceae 5
Koliforminės bakterijos 5 Aerobiniai mikroorganizmai 5 Įrangos plovimas ir dezinfekcija
II etapas ATP greitasis higienos įvertinimo testas 5
25
Nuoplovų mėginiai Salmonella 5
Enterobacteriaceae 5
Koliforminės bakterijos 5 Aerobiniai mikroorganizmai 5
2.6. Duomenų apdorojimas ir statistinė analizė
Tyrimo duomenų statistinei analizei atlikti buvo naudojama SPSS (angl. Statistical Package
for Social Science) programos 17.0 versija. Diagramoms atvaizduoti buvo naudojama MS Excel
2010. Prieš atliekant detalią statistinę analizę duomenys buvo pakartotinai patikrinti. Gautų kintamųjų įvertinimui buvo naudojami aprašomosios statistikos metodai (vidurkis ± standartinis nuokrypis). Tolydaus kintamojo normalumo prielaida tikrinta naudojant Kolmogorovo – Smirnovo testą. Kiekybiniams priklausomiems kintamiesiems neparametrinis Wilcoxon testas arba McNemar testas binariniams kintamiesiems. Ryšiams nustatyti buvo naudojamas Spearman koreliacijos koeficientas. Statistiškai reikšminga laikoma, kai p<0,05. Grafikuose statistiškai patikimai besiskiriantys rezultatai pažymėti žvaigždute (*).
21
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Mėginių atrinkimas
Tyrimo metu viso atrinkta 250 mėginių: 50 ATP mėginių bei po 50 nuoplovų mėginių aerobinių mikroorganizmų, koliforminių bakterijų, enterobakterijų skaičiaus bei Salmonella spp. aptikimo nustatymui. Gautų rezultatų vidurkiai su standartiniais nuokrypiais pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Gautų tyrimo rezultatų vidurkiai ± standartinis nuokrypis.
N
Vidurkis ± standartinis nuokrypis
ATP, RLU (prieš plovimą) 25 539,64 ± 648,03
ATP, RLU (po plovimo) 25 30,04 ± 27,63
Aerobiniai mikroorganizmai (prieš plovimą) 25 384,48 ± 521,93 Aerobiniai mikroorganizmai (po plovimo) 25 4,60 ± 6,76 Koliforminės bakterijos (prieš plovimą) 25 371,56 ± 1045,57 Koliforminės bakterijos (po plovimo) 25 0,60 ± 2,20 Enterobakterijos (prieš plovimą) 25 263,32 ± 368,20 Enterobakterijos (po plovimo) 25 5,40 ± 15,13
Salmonella (prieš plovimą) 25 0,16 ± 0,37
Salmonella (po plovimo) 25 0,00 ± 0,00
Tyrimo rezultatai gauti naudojantis akreduotais metodais rodo, kad iš visų paimtų mėginių, dažniausiai ant gamybinių paviršių buvo aptinkami aerobiniai mikroorganizmai (60 proc.), 56 proc. teigiamų tyrimų rezultatų sudarė enterobakterijos, koliforminės bakterijos ant kontaktinių paviršių aptikimo dažnis sudaro 38 proc. iš visų ištirtų mėginių, Salmonella spp. – 8 proc.
22
1 pav. Aptiktų mikroorganizmų dažnio procentinė išraiška.
3.2. Plovimo efektyvumo vertinimas
Vertinant plovimo efektyvumą, tyrimo rezultatai parodė, kad aerobinių mikroorganizmų po atlikto gamybinės linijos plovimo sumažėjo 48 proc., koliforminių bakterijų sumažėjo 60 proc., enterobakterijų – 56 proc., salmonelių sumažėjo 16 proc., lyginant su gautais rezultatais prieš atliktą gamybinės linijos plovimą.
2 pav. Mikroorganizmų aptikimo procentinis palyginimas po plovimo.
Prieš plovimą aerobinių mikroorganizmų vidurkis buvo 384,48±521,93 (mažiausia reikšmė – 0; didžiausia – 1900), po plovimo 4,60±6,76 (mažiausia reikšmė – 0; didžiausia – 20). Iš viso
23 aerobinių mikroorganizmų vidurkis sumažėjo 379,88±522,15 ir tai statistiškai reikšmingas skirtumas, nes p<0,05 (Z=-4,015; p=0,000).
3 pav. Aerobinių mikroorganizmų vidurkių palyginimas prieš ir po plovimo, * - p<0,05, lyginant prieš ir po.
Prieš plovimą koliforminių bakterijų vidurkis buvo 371,56±1045,57 (mažiausia reikšmė – 0; didžiausia – 4200), po plovimo 0,60±2,20 (mažiausia reikšmė – 0; didžiausia – 10). Iš viso koliforminių bakterijų vidurkis sumažėjo 370,96±1045,71 ir tai statistiškai reikšmingas skirtumas, nes p<0,05 (Z=-3,622; p=0,000).
24
4 pav. Koliforminių bakterijų vidurkių palyginimas prieš ir po plovimo, * - p<0,05, lyginant prieš ir po.
Prieš plovimą enterobakterijų vidurkis buvo 263,32±368,20 (mažiausia reikšmė – 0; didžiausia – 1100), po plovimo 5,40±15,13 (mažiausia reikšmė – 0; didžiausia – 75). Iš viso enterobakterijų vidurkis sumažėjo 257,92±369,74 ksv ir tai statistiškai reikšmingas skirtumas, nes p<0,05 (Z=-3,841; p=0,000).
5 pav. Enterobakterijų vidurkių palyginimas prieš ir po plovimo, * - p<0,05, lyginant prieš ir po.
25 Prieš plovimą Salmonella spp. buvo aptikta 4 iš 25 mėginių (16 proc.), o po plovimo nebuvo aptikta nei vienam mėginyje, tačiau tai nėra statistiškai reikšmingas skirtumas, nes p>0,05 ( p=0,125).
6 pav. Salmonella spp. aptikimo procentinis palyginimas prieš ir po plovimo.
Prieš plovimą ATP vidurkis buvo 539,64±648,03 (mažiausia reikšmė – 24; didžiausia – 2400), po plovimo - 30,04±27,63 (mažiausia reikšmė – 6; didžiausia – 83). Iš viso ATP vidurkis sumažėjo 509,60±641,47 ir tai statistiškai reikšmingas skirtumas, nes p<0,05 (Z=-4,373; p=0,000).
26
3.3. ATP greitojo higienos įvertinimo metodo rezultatų efektyvumas
Norint nustatyti ar ATP rezultatai turi ryšį su nurodytais mikroorganizmais (aerobiniais mikroorganizmais, koliformais ir enterobakterijomis) buvo atlikta Spearman koreliacinė analizė. Kaip matome iš 4 lentelės, visi rezultatai yra glaudžiai susiję stipriais teigiamais statistiškai reikšmingais ryšiais. Galime teigti, kad didėjant ATP rezultatams, gausėja ir mikroorganizmų kiekis. Stipriausias nustatytas ATP rezultatų ryšys yra su aerobiniais mikroorganizmais (r=0.793; p=0.000).
4 lentelė. ATP rezultatų koreliacinė analizė.
Sąsajos ATP, RLU Aerobiniai mikroorganizmai, ksv Koliforminės bakterijos, ksv Enterobakterijos, ksv ATP, RLU r 0,793 ** 0,679** 0,667** p 0,000 0,000 0,000 Aerobiniai mikroorganizmai, ksv r 0,691** 0,682** p 0,000 0,000 Koliforminės bakterijos, ksv r 0,678** p 0,000 Enterobakterijos, ksv r p
Norėdami nustatyti, kaip ATP siejasi su mikroorganizmų kiekiu, atlikta daugialypė regresinė analizė. Sudarant regresijos modelį, priklausomu kintamuoju pasirinktas ATP rezultatai, nepriklausomais – nurodyti mikroorganizmai. Apskaičiuotas determinacijos koeficientas R2=0,994, F kriterijaus statistika F=9927,372, p<0,05. Reiškia, regresijos modelis, prognozuojant ATP vertinimą, yra statistiškai reikšmingai patikimas ir paaiškina 99,4 proc. sklaidos. Tyrimo rezultatai atskleidžia, kad ATP prognozei statistiškai reikšmingą vertę turi mikroorganizmų kiekis. Iš 5 lentelės matome, kad didžiausią įtaką ATP turi aerobiniai mikroorganizmai (β=1,054). Galime teigti, kad aukšta mikroorganizmų koncentracija 99,4 proc. lemia ATP rezultatą.
27
5 lentelė. Regresinės tiesės koeficientų reikšmės (priklausomas kintamasis – ATP), *p<0,05.
Veiksniai Nestandartizuoti koeficientai Standartizuoti koeficientai t reikšmė p reikšmė B Standartinė paklaida Beta (β) (Konstanta) 125,566 103,323 1,215 0,226 Aerobiniai mikroorganizmai, ksv 1,033 0,007 1,054 143,832 0,000 Koliforminės bakterijos, ksv -0,440 0,050 -0,054 -8,814 0,000 Enterobakterijos, ksv -0,680 0,066 -0,075 -10,291 0,000
28
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Maisto perdirbimo pramonėje daug diskusijų kelia patikimos valymo ir dezinfekavimo procedūros parinkimas ir validacija [36]. Bakterijų paplitimas maisto tvarkymo aplinkoje yra pagrindinis maisto produktų užteršimo šaltinis sukeliantis maisto produktų gedimą ir patogenų pernešimą [13], ko pasekoje maisto produktų keliamas mikrobiologinis pavojus yra vienas pagrindinių per maistą plintančių ligų šaltinis, kuriomis užkrečiami žmonės [1]. Nustatyta, kad kryžminė tarša sudaro 36,3 proc. visų su maistu susijusių ligų protrūkių [7].
Gauti atlikto tyrimo rezultatai, vertinant mikroorganizmų kiekį prieš ir po gamybinės linijos plovimo, parodė statistiškai reikšmingus skirtumus (p<0,05). Poulis taip pat nustatė statistiškai reikšmingus tirtų mikroorganizmų ir ATP reikšmių sumažėjimus po plovimo ir dezinfekavimo [36]. Vertinant plovimo efektyvumą, tyrimo rezultatai parodė, kad aerobinių mikroorganizmų po atlikto gamybinės linijos plovimo sumažėjo 48 proc., koliforminių bakterijų sumažėjo 60 proc., enterobakterijų – 56 proc., lyginant su gautais rezultatais prieš atliktą gamybinės linijos plovimą. Gibson su kolegomis [11] atliktame tyrime prieš valymą, valymo metu ir po dezinfekcijos, rezultatai parodė, kad valymo etapas sumažina 1 log bakterijų kiekį ant paviršių, kai tuo tarpu Dunsmore ir kt. [8] nustatė, kad valymo metu pašalinama iki 99,8 proc. mikroorganizmų. Prastesnius tyrimo rezultatus lyginant su Dunsmore gautais rezultatais [8] galėjo lemti daugelis faktorių, t. y. netinkamai atliktas pirminis skalavimas, tinkamai nepašalinus nešvarumų, ploviklių sąlyčio laiko su paviršiais sutrumpinimas, temperatūros nuokrypiai. Valymo etapas yra svarbus veiksmingam dezinfekavimo procesui. Tinkamai nepašalinus nešvarumų, produkto likučiai gali inaktyvuoti dezinfekavimo priemonę arba apsaugoti mikroorganizmus nuo dezinfekavimo poveikio. Šie rezultatai rodo, kad nors valymas sumažina mikroorganizmų koncentraciją ant paviršių, tačiau po valymo lieka daug mikroorganizmų, todėl dezinfekavimo etapas vis dar reikalingas [11].
Atlikto tyrimo rezultatai, vertinant ATP ir tiriamųjų mikroorganizmų priklausomybę, parodė teigiamą ryšį tarp ATP ir aerobinių mikroorganizmų, enterobakterijų ir koliforminių bakterijų. Nustatytas teigiamas ryšys tarp ATP ir aerobinių mikroorganizmų sutampa su Leon ir Albrecht (2007 m.) gautais tyrimo rezultatais. ATP bioliuminescencijos metodas vis dažniau naudojamas, kaip greitas higienos įvertinimo metodas maisto gamybos aplinkoje, kurioje dauguma paviršių yra pagaminti iš nerūdijančio plieno. Šis ATP bioliuminescencijos metodas gali būti sėkmingai naudojamas maisto pramonėje paviršių higieninei būklei įvertinti bei užkirsti kelią kryžminiam produktų užteršimui. ATP greitas higienos įvertinimo metodas yra paprastas, greitas ir ekonomiškas metodas, kuris suteikia galimybę nustatyti švaros lygį bet kurio gamybos technologinio proceso metu. Reguliarus ir dažnas kontrolinių taškų testavimas leis sanitarijos lygio tendencijas. Tačiau ATP bioliuminescencijos metodas nenurodo, kokios rūšies mikroorganizmais užteršti su maistu
29 kontaktuojantys paviršiai. Standartiniai mikrobiologiniai tyrimai yra svarbūs ir naudingi nustatant atsinaujinančių bakterijų rūšis, padedant parinkti tinkamas sanitarijos programas [33].
X maisto tvarkymo įmonėje, kurioje atliktas tyrimas, parengta plovimo ir dezinfekcijos procedūra atsižvelgiant į gaminamo produkto, naudojamos žaliavos specifiką. Naudojamos plovimo ir dezinfekavimo priemonės pasižyminčios puikiomis riebalų ir baltymų likučių pašalinimo savybėmis, efektyviai veikiančios prieš įvairių tipų mikroorganizmus.
30
IŠVADOS
1. Aerobinių mikroorganizmų, enterobakterijų ir koliforminių bakterijų tyrimų rezultatai prieš ir po plovimo statitistiškai reikšmingai skiriasi (p<0,005). Tai rodo, kad atliekamas plovimas yra efektyvus. Tačiau Salmonella spp. tyrimo rezultatai statistiškai reikšmingo skirtumo prieš ir po plovimo neparodė.
2. ATP vidurkių sumažėjimas lyginant rezultatus prieš ir po plovimo statitistiškai reikšmingai skiriasi (p<0,005).
3. Didėjant ATP reikšmei, gausėja ir mikroorganizmų kiekis. Nustatytas statistiškai reikšmingas ryšys tarp ATP ir aerobinių mikroorganizmų, enterobakterijų ir koliforminių bakterijų. Stipriausias nustatytas ATP rezultatų ryšys yra su aerobiniais mikroorganizmais (r=0.793; p=0.000).
31
PASIŪLYMAI
Rekomenduojama maisto įmonėse periodiškai atlikti gamybinių patalpų aplinkos ir su maistu kontaktuojančių paviršių plovimo efektyvumo vertinimo analizę. Analizė padėtų įvertinti naudojamų cheminių medžiagų efektyvumą, bei validuoti plovimo programą.
Rekomenduojama naudoti ATP bioliuminescencijos metodą švaros lygiui įvertinti greta atliekant mikrobiologinius tyrimus. Dažna ir reguliari ATP stebėsena padėtų lengviau suprasti vertinimo rezultatus ir tai būtų greitesnis rezultatų gavimas. ATP testų panaudojimas maisto įmonėse leidžia įvertinti paviršių, besiliečiančių su maistu, taršą mikroorganizmais bet kuriuo gamybos technologinio proceso etapo metu.
32
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Danilčenko H. Maisto žaliavų kokybės ir saugos valdymas. :160.
2. Havelaar AH, Brul S, de Jong A, de Jonge R, Zwietering MH, ter Kuile BH. Future challenges to microbial food safety. Int J Food Microbiol. 2010 May;139:S79–94.
3. Carrascosa C, Saavedra P, Millán R, Jaber JR, Pérez E, Grau R, et al. Monitoring of cleanliness and disinfection in dairies: Comparison of traditional microbiological and ATP bioluminescence methods. Food Control. 2012 Dec;28(2):368–73.
4. Jacxsens L, Kussaga J, Luning PA, Van der Spiegel M, Devlieghere F, Uyttendaele M. A Microbial Assessment Scheme to measure microbial performance of Food Safety Management Systems. Int J Food Microbiol. 2009 Aug 31;134(1–2):113–25.
5. Kim J-H, Nam K-C, Jo C, Lim D-G. Perception of the HACCP system operators on livestock product manufacturers. J Anim Sci Technol. 2014;56(1):19.
6. Shama G, Malik DJ. The uses and abuses of rapid bioluminescence-based ATP assays. Int J Hyg Environ Health. 2013 Mar;216(2):115–25.
7. Tebbutt GM. Comparison of traditional and rapid methods for assessing the risk of bacterial cross-contamination from cutting boards. Int J Environ Health Res. 1999 Mar;9(1):67–74. 8. Dunsmore DG, Twomey A, Whittlestone WG, Morgan HW. Design and Performance of
Systems for Cleaning Product-Contact Surfaces of Food Equipment: A Review. J Food Prot. 1981 Mar;44(3):220–40.
9. Vlková H, Babák V, Seydlová R, Pavlik I, Schlegelova J. Biofilms and hygiene on dairy farms and in the dairy industry: sanitation chemical products and their effectiveness on biofilms-a review. Czech J Food Sci. 2008;26(5):309–323.
10. Wirtanen G, Salo S. Disinfection in Food Processing – Efficacy Testing of Disinfectants. Rev Environ Sci Biotechnol. 2003;2(2–4):293–306.
11. Gibson H, Taylor JH, Hall KE, Holah JT. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J Appl Microbiol. 1999
Jul;87(1):41–8.
12. Van Houdt R, Michiels CW. Biofilm formation and the food industry, a focus on the bacterial outer surface: Biofilm formation and the bacterial outer surface. J Appl Microbiol. 2010 Oct;109(4):1117–31.
13. Hood SK, Zottola EA. Growth Media and Surface Conditioning Influence the Adherence of Pseudomonas fragi, Salmonella typhimurium, and Listeria monocytogenes Cells to Stainless Steel. J Food Prot. 1997 Sep;60(9):1034–7.
14. Eginton PJ, Holah J, Allison DG, Handley PS, Gilbert P. Changes in the strength of attachment of micro‐organisms to surfaces following treatment with disinfectants and cleansing agents. Lett Appl Microbiol. 1998 Aug 27;27(2):101–5.
33 15. Mafu AA, Roy D, Goulet J, Magny P. Attachment of Listeria monocytogenes to Stainless
Steel, Glass, Polypropylene, and Rubber Surfaces After Short Contact Times. J Food Prot. 1990 Sep;53(9):742–6.
16. Wilks SA, Michels H, Keevil CW. The survival of Escherichia coli O157 on a range of metal surfaces. Int J Food Microbiol. 2005 Dec;105(3):445–54.
17. Aarnisalo K, Tallavaara K, Wirtanen G, Maijala R, Raaska L. The hygienic working practices of maintenance personnel and equipment hygiene in the Finnish food industry. Food Control. 2006 Dec;17(12):1001–11.
18. Rossoni EM., Gaylarde C. Comparison of sodium hypochlorite and peracetic acid as sanitising agents for stainless steel food processing surfaces using epifluorescence microscopy. Int J Food Microbiol. 2000 Oct;61(1):81–5.
19. da Silva Meira QG, de Medeiros Barbosa I, Alves Aguiar Athayde AJ, de Siqueira-Júnior JP, de Souza EL. Influence of temperature and surface kind on biofilm formation by
Staphylococcus aureus from food-contact surfaces and sensitivity to sanitizers. Food Control. 2012 Jun;25(2):469–75.
20. Kusumaningrum H. Survival of foodborne pathogens on stainless steel surfaces and cross-contamination to foods. Int J Food Microbiol. 2003 Aug 25;85(3):227–36.
21. Cox LJ, Kleiss T, Cordier JL, Cordellana C, Konkel P, Pedrazzini C, et al. Listeria spp. in food processing, non-food and domestic environments. Food Microbiol. 1989 Mar;6(1):49–61. 22. Joseph B, Otta SK, Karunasagar I, Karunasagar I. Biofilm formation by Salmonella spp. on
food contact surfaces and their sensitivity to sanitizers. Int J Food Microbiol. 2001 Mar;64(3):367–72.
23. Langsrud S, Sidhu MS, Heir E, Holck AL. Bacterial disinfectant resistance—a challenge for the food industry. Int Biodeterior Biodegrad. 2003 Jun;51(4):283–90.
24. Holah JT, Taylor JH, Dawson DJ, Hall KE. Biocide use in the food industry and the
disinfectant resistance of persistent strains of Listeria monocytogenes and Escherichia coli. J Appl Microbiol. 2002 May;92(s1):111S-120S.
25. Fazlara A, Ekhtelat M. The Disinfectant Effects of Benzalkonium Chloride on Some Important. Env Sci. 2012;7.
26. Gerba CP. Quaternary Ammonium Biocides: Efficacy in Application. Müller V, editor. Appl Environ Microbiol. 2015 Jan 15;81(2):464–9.
27. Mustapha A, Liewen MB. Destruction of Listeria monocytogenes by Sodium Hypochlorite and Quaternary Ammonium Sanitizers. J Food Prot. 1989 May;52(5):306–11.
28. Šalomskien J, Ma I. Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų poveikis Listeria monocytogenes augimui. :6.
29. Velazquez M, Feirtag JM. Quenching and Enhancement Effects of ATP Extractants,
Cleansers, and Sanitizers on the Detection of the ATP Bioluminescence Signal. J Food Prot. 1997 Jul;60(7):799–803.
34 30. Davidson CA, Griffith CJ, Peters AC, Fielding LM. Evaluation of two methods for monitoring
surface cleanliness—ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing. Luminescence. 1999 Jan;14(1):33–8.
31. Vilar MJ, Rodríguez-Otero JL, Diéguez FJ, Sanjuán ML, Yus E. Application of ATP bioluminescence for evaluation of surface cleanliness of milking equipment. Int J Food Microbiol. 2008 Jul;125(3):357–61.
32. Whitehead K, Smith L, Verran J. The detection of food soils and cells on stainless steel using industrial methods: UV illumination and ATP bioluminescence. Int J Food Microbiol. 2008 Sep 30;127(1–2):121–8.
33. Leon MB, Albrecht JA. Comparison of adenosine triphosphate (ATP) bioluminescence and aerobic plate counts (APC) on plastic cutting boards*: Sanitation of plastic cutting boards. J Foodserv. 2007 Sep 24;18(4):145–52.
34. Tebbutt G, Bell V, Aislabie J. Verification of cleaning efficiency and its possible role in programmed hygiene inspections of food businesses undertaken by local authority officers. J Appl Microbiol. 2006 Sep 19;0(0):061120055200059-???
35. Aycicek H, Oguz U, Karci K. Comparison of results of ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing methods for the determination of surface cleanliness at a hospital kitchen. Int J Hyg Environ Health. 2006 Mar;209(2):203–6.
36. Poulis JA, de Pijper M, Mossel DAA, Dekkers PPA. Assessment of cleaning and disinfection in the food industry with the rapid ATP-bioluminescence technique combined with the tissue fluid contamination test and a conventional microbiological method. Int J Food Microbiol. 1993 Nov;20(2):109–16.
37. Lietuvos Respublikos valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus įsakymas 2006 m. gegužės 17 d. Nr. B1-338. „Dėl nuoplovų paėmimo laboratoriniam tyrimui metodinių nurodymo patvirtinimo“, Vilnius, 2006. (Žin. 2006, Nr.57 – 2056).
38. Wirtanen G., Saarela M., Mattila-Sandholm T. (2000): Biofilms – Impact on hygiene in food industries. In: Bryers J. (ed.): Biofilms II: Process Analysis and Aplication. John Wiley – Liss, New York: 327–372.
