LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Gabrielė Budrevičiūtė
Ožkų anemijos diagnozavimas taikant mikroskopinį ir
morfologinį kraujo tyrimo metodus
Diagnosis of goat anemia using microscopic and morphological
methods of blood testing
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: vet. gydytoja Jurgita Autukaitė
2
DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Ožkų anemijos diagnozavimas taikant mikroskopinį ir morfologinį kraujo tyrimo metodus“:
1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1)
2)
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5 SANTRAUKA... 6 SUMMARY... 7 1 LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 1.1 Anemijų klasifikacija ... 9 1.2 Anemijos diagnozavimas ... 9 1.2.1 Klinikiniai požymiai ... 91.2.2 Morfologinis kraujo tyrimas... 10
1.2.3 Kraujo tepinėlio metodas ... 10
1.2.4 Ožkų kraujo ypatumai ... 10
1.3 Anemijos rūšys, kurioms diagnozuoti reikalingas kraujo tepinėlio metodas ... 12
1.3.1 Geležies trūkumo sukelta anemija... 12
1.3.2 Vario trūkumo sukelta anemija ... 12
1.3.3 Oksidacinė anemija ... 13
1.3.4 Anemija dėl kraujo praradimo... 14
1.3.5 Anaplazmų sukelta anemija ... 15
1.3.5 Babezijų sukelta anemija ... 16
1.3.6 Teilerijų sukelta anemija ... 17
1.3.7 Mikoplazmų sukelta anemija ... 18
2 TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 20
2.1 Tyrimo atlikimo vieta, objektai ir schema ... 20
2.2 Mikroskopinis ir morfologinis kraujo tyrimo metodai ... 21
2.3 Statistinių duomenų analizė ... 22
3 TYRIMO REZULTATAI... 23
4
3.2 Tiriamųjų grupių sudarymas ir analizė pagal morfologinio tyrimo rezultatus ... 24
4 REZULTATŲ APTARIMAS... 28
IŠVADOS ... 31
PASIŪLYMAI IR REKOMENDACIJOS ... 32
PADĖKA ... 33
5
SANTRUMPOS
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas.m.- metai. s.- sekundė. tūkst.- tūkstančiai. proc.- procentai. t. y.- tai yra.
RBC- raudonieji kraujo kūneliai (red blood cells).
MCV- vidutinis eritrocito tūris (mean corpuscular volume).
MCHC- vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite (mean corpuscular hemoglobin concentration). HCT- hematokritas. Hb- hemoglobinas. µl- mikrolitrai. µm- mikrometrai. fL- uncijos. g/dl- gramas decilitre.
aps./min.- apsisukimai per minutę. EDTA- etilendiamintetraacto rūgštis. mkr- mikronai.
6
SANTRAUKA
Ožkų anemijos diagnozavimas taikant mikroskopinį ir morfologinį kraujo tyrimo metodus
Gabrielė Budrevičiūtė Magistro baigiamasis darbas
Anemija yra patologinė būklė, kuriai būdingi žemi hematokrito, raudonųjų kraujo kūnelių ir/ar hemoglobino rodikliai (1). Anemija diagnozuojama atliekant morfologinį kraujo tyrimą, bet norint nustatyti jos priežastį, informatyvus būdas yra kraujo tepinėlio metodas.
Tyrimas atliktas 2018 m. Gegužės- Birželio mėnesiais. Ištirti 24 Lietuvos vietinių ožkų kraujo mėginiai iš keturių ūkių. Mėginiai buvo imami atsitiktine tvarka iš fiziologiškai subrendusių patelių. Mikroskopu ištirti 24 tepinėliai ir suskirstyti į tiriamąsias grupespagal nustatytus pakitimus. Mėginiai kuriuose buvo dydžio pakitimų (mikrocitozė 17 proc., anizocitozė 13 proc.), spalvos pakitimų (hipochrominiai eritrocitai 25 proc.) ir formos pakitimų (poikilocitozė 29 proc.) priskirti Ⅲ tiriamajai grupei. Dalis mėginių buvo be ryškių morfologijos pakitimų, bet pastebėti pavieniai makrocitai ir retikuliocitai (25 proc.)- jie priskirti Ⅱ tiriamajai grupei. 37 proc. tepinėlių nenustatyta jokių eritrocitų morfologijos pakitimų, jie priskirti Ⅰ tiriamajai grupei. Pagal grupių morfologinio tyrimo rezultatus atlikta statistinė analizė. Ⅲ tiriamoji grupė turėjo žemiausią hematokritą (12,53 proc.), hemoglobiną (45,0 g/dl), bendrą eritrocitų skaičių (9,41×106/µl), suspaustų ląstelių tūrį (13,40 fL) ir statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo Ⅰ ir Ⅱ grupių.
Ištyrus kraujo mėginius abiem metodais nustatyta, kad kraujo tepinėlis turėjo papildomos informacijos ligos diagnozavimui. Atmesta hemolizinės anemijos galimybė- nustatyta, kad eritrocituose nėra pirmuonių, mikoplazmų, Heinzo kūnelių ir ekcentrocitų. Mikroskopavimo metu mėginiuose pastebėti pakitimai, kurie gali būti nustatomi tik atlikus kraujo tepinėlio tyrimą.
Raktažodžiai: ožkos, anemija, mikroskopinis, morfologinis, tepinėlis, hemolizė, pirmuonys, mikoplazmos, kraujo praradimas, neregeneruojanti.
7
SUMMARY
Diagnosis of goat anemia using microscopic and morphological methods of blood testing
Gabrielė Budrevičiūtė Master‘s Thesis
Anemia in ruminants is an abnormal condition characterized by the decrease of the hematocrit, the mass of erythrocytes and/or hemoglobin. It‘s important to diagnose anemia on time to prevent financial loss and damage. It‘s usually diagnosed by morphological method, but blood smear microscopy is also used to diagnose anemia.
Our research was done from May to June, in 2018. 24 blood samples of goats were examined in 4 farms of Lithuania. Blood samples were taken from physiologically mature female goat. The microscopy of 24 blood samples was done and according to changes the samples were classified into three intervention groups. Samples which had changes of erythrocytes size (macrocytosis 17 %, anisocytosis 13%), color (hypochromia 25 %) and shape (poikilocytosis 29 %) were classified as III intervention group. Part of the samples did not have any morphological changes, but couple of macrocytes and reticulocytes were found (hypochromic erythrocytes 25 %)– these samples were classified as II intervention group. 37 % of samples did not have any morphological changes in erythrocytes – these samples were classified as I intervention group. Statistical analysis was made based on these three groups morphological blood test results. Ⅲ intervention group had the lowest hematocrit (12,53 %), hemoglobin (45,0 g/dl), red blood cell count (9,41×106/µl), medium cell volume (13,40 fL) and it was statistically significant difference from Ⅰ and Ⅱ intervention groups.
It was found that blood smear microscopy had additional information for diagnosis of disease. Hemolytic anemia diagnosis was rejected – no protozoa, mycoplasma, Heinz bodies and eccenthrocytes were found in erythrocytes. Changes which can only be found during blood smear microscopy was noticed.
Keywords: goats, anemy, microscopic, morphological, blood smear, hemolytic, protozoa, mycoplasma, blood loss, non- regenerative.
8
ĮŽANGA
Ištisus amžius žmonės augino ožkas odos, vilnos, mėsos, pieno produkcijai gauti. Pastaruoju metu šie smulkūs atrajotojai populiarėja kaip gyvūnai- augintiniai. Yra vis dar galiojantis stereotipas, kad ožka yra skurdžių kraštų gyvūnas, turintis mažą ūkinę vertę. Nors jos auginamos visame pasaulyje, bet šis sektorius yra mažiau išvystytas ekonomiškai ir ištirtas mokslininkų lyginant su galvijininkyste, paukštininkyste, kiaulininkyste bei arklininkyste. Šiuo metu ožkininkystė yra niša, kuria pasinaudoję ūkininkai galėtų teikti į rinką savo produkciją (pvz. pieno ir mėsos produktus) be didelės konkurencijos, tuo pačiu mažindami šalies priklausomybę nuo kainų svyravimo globaliu mastu.
Ožkų populiacija Lietuvoje nuolat didėja: 2018 m. įregistruotų ožkų skaičius buvo 14,422 tūkst. (t. y. 4,27 proc. didesnis nei buvo 2017 m.) (2). Nors vyrauja smulkūs ūkiai (63,72proc.), atsiranda vis daugiau didelių ūkių, kuriuose laikoma 100 ir daugiau ožkų (3). Dėl šių aplinkybių, iš esmės keičiasi požiūris į ožkų auginimo technologijas, sveikatingumą ir produktyvumą. M. Yilmaz ir kt. nustatė priklausomybę tarp ožkos įmitimo ir kraujo parametrų- esant 3,5 įmitimo balui, nustatyti optimalūs RBC, HCT, Hb, MCV, MCHC rodikliai, o žemiausi kraujo rodikliai nustatyti esant ≤2,5 balui (4). Norint išvengti finansinių nuostolių ir išlaikyti gyvūnų sveikatingumą, svarbu laiku diagnozuoti anemijas ir jų atsiradimo priežastis. Ši liga diagnozuojama atliekant morfologinį kraujo tyrimą, bet norint nustatyti jos priežastį, informatyvus yra kraujo tepinėlio metodas. Pastarasis metodas reikalauja mažų laiko ir medžiagų sąnaudų bei yra prieinamas visiems veterinarijos gydytojams.
Tikslas: Nustatyti ožkų anemijos atvejus taikant morfologinį ir mikroskopinį kraujo tepinėlio metodą. Uždaviniai:
1. Išanalizuoti ir apibendrinti mokslinę literatūrą apie ožkų anemijas ir jų diagnozavimo metodus. 2. Ištirti ožkų kraujo mėginius morfologiniu bei kraujo tepinėlio metodais.
3. Nustatyti sergamumą anemija ir hematologinius pakitimus būdingus šiai ligai. 4. Nustatyti, ar mikroskopavimas suteikia papildomos informacijos ligos diagnozavimui.
9
1
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Anemij
ų klasifikacija
Ožkų, kaip ir kitų gyvūnų rūšių anemija skirstoma į tris grupes: kraujo netekimo, RBC lizės ir sumažėjusios RBC produkcijos (5). Pagal ligos eigą anemija gali būti ūmi ir lėtinė (chroniška). Ūmi anemija dažniausiai pasireiškia dėl:
a) Hemoragijos, kai netenkama didelio kiekio kraujo per trumpą laiką. Jas gali sukelti traumos, neoplazijos. b) Hemolizės, kurią sukelia infekcijos arba toksinai. Būdinga hemoglobinurija, žemas HCT su laisvu
hemoglobinu ir/arba netiesioginiu (nekonjuguotu) bilirubinu kraujo plazmoje. Lėtinė anemija pasireiškia dėl:
a) Hemoragijos, kurią dažniausiai sukelia endo ir ekto parazitai.
b) Hemolizės, kuri gali pasireikšti dėl infekcijų, toksinų, oksidacinio streso. Būdingi regeneruojančios anemijos požymiai.
c) Hipoplazijos/ aplazijos. Būdingi neregeneruojančios anemijos požymiai, dažnai matomi hipochromiški mikrocitai, leptocitai. Šią anemiją gali sukelti nesubalansuotas šėrimas, sutrikęs maisto medžiagų pasisavinimas ir kaulų čiulpų veiklos sutrikimas dėl įvairių priežasčių (matomas ne tik RBC, bet ir trombocitų bei granuliocitų trūkumas) (6,5).
1.2 Anemijos diagnozavimas
1.2.1 Klinikiniai požymiai
Anemija yra dažnai ožkoms pasitaikantis susirgimas. Svarbiausias klinikinis požymis yra šviesios- anemiškos gleivinės. Jam nustatyti pasaulyje plačiai naudojamas FAMACHA metodas- apatinio akies voko spalva tikrinama pagal penkių skalių lentelę. Ištirta, kad ožkoms šis tyrimo metodas yra mažiau jautrus nei avims, be to junginės spalva priklauso ir nuo ožkų veislės (1).
Dažni anemijos klinikiniai požymiai yra tachikardija (galimi sistoliniai ūžesiai), tachipnėja, vangumas. Ožkoms sergančiomis ūmia anemijos forma, galima melena ir hematurija (1,7). Dažnai anemija pasireiškia kartu su hipoproteinemija, jos požymiai yra pažandinė edema, ascitas, svorio netekimas (8). Tiriant ir gydant tokius gyvūnus reikia vengti papildomo streso- tai gali pabloginti jų būklę ar būti staigaus gaišimo priežastimi (5).
10
1.2.2 Morfologinis kraujo tyrimas
Anemija gali būti pastebima klinikinio tyrimo metu, bet tiksliau diagnozuojama laboratoriniais tyrimais. Pagrindiniai duomenys gaunami ištyrus kraujo mėginį morfologijos analizatoriumi. Nustatomas hematokritas (HCT norma 22-36 proc.) ir hemoglobinokoncentacija (Hb norma 8-12 g/dl), bendras eritrocitų skaičius (RBC norma 8-12 ×106/µl). Suspaustų ląstelių tūris (yra iš esmės tas pats kas hematokritas, tiesiog skiriasi matavimo būdas) (6,8). Kuo labiau sumažėja RBC skaičius, Hb koncentracija ir HCT, tuo didesnio laipsnio anemija serga gyvūnas (7).
Kiti svarbūs hematologiniai rodikliai yra vidutinis eritrocito tūris (MCV norma 15-26 fL) ir vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite (MCHC norma 29-35 g/dl) (8). Raudonųjų kraujo kūnelių dydis taip pat gali būti matomas mikroskopuojant kraujo tepinėlį: jie lyginami su baltaisiais kraujo kūneliais, nes jų dydis kinta labai mažai (6).
1.2.3 Kraujo tepinėlio metodas
Kraujo tepinėlio mikroskopavimas yra svarbus diagnostikos metodas klasifikuojant anemiją (ypač hemolizinę) ir nustatant regeneracinį atsaką. Regeneruojančios anemijos atveju kraujo tepinėlyje matomi retikuliocitai (sveikų ožkų kraujo tepinėlyje jų neaptinkama) (1,8). Retikuliocitai avims ir ožkoms yra nesunkiai aptinkami mikroskopuojant kraujo (su EDTA) tepinėlius, dažytus Wright- Giemsa metodu. Taip pat regeneruojančią anemiją rodo makrocitozė ir polichromazija, o anizocitozė dažnai pasitaiko ir sveikiems atrajotojams (1).
Lėtinės, neregeneruojančios anemijos atveju matoma hipochromija ir mikrocitozė- ji sutampa su žemais vidutinės hemoglobino koncentracijos eritrocite ir vidutinio eritrocito tūrio rodikliais (1,9,10).
Ūmios anemijos atveju raudonuosiuose kraujo kūneliuose gali būti aptinkami branduolių fragmentai Howell- Jolly kūneliai. Kai eritrocitus pažeidžia pirmuonys ar mikoplazmos, galima juos pastebėti kaip įvairių formų intarpus eritrocitų viduje arba išsidėsčiusius ant membranos. Jie pažeidžia raudonuosius kraujo kūnelius, dėl to yra didelė tikimybė kraujo tepinėlyje matyti eritrocitų fragmentus- šistocitus. Oksidacinio streso atveju yra tikimybė aptikti Heinzo kūnelius eritrocitų citoplazmoje, ekcentrocitus ir rudą methemoglobino spalvą (1,7,11).
1.2.4 Ožkų kraujo ypatumai
Ožkos turi mažiausius eritrocitus lyginant su kitais naminiais gyvūnais (skersmuo 3,2- 4,2 mikronai). Todėl standartiniai metodai nustatant HCT gali būti netikslūs- rodmenys didesni 10-15 proc. dėl
11
neadekvataus centrifugavimo laiko. Tam, kad būtų gauti tikslūs rezultatai, centrifuguoti reikėtų mažiausiai 10 min. (14,000 aps./min.) (8,9).
Jaunesnėms nei 6 mėn. ožkoms būdingas mažesnis HCT, RBC skaičius ir Hb, o ką tik gimusiems jaunikliams dažniausiai randamas aukštas hematokritas, kuris sumažėja gavus krekenų. Laktuojančių ožkų HCT, RBC skaičius ir Hb koncentracija būna mažesni (8).
Daugumai gyvūnų būdingi disko formos eritrocitai (diskocitai). Tačiau, ožkoms yra fiziologiška eritrocitų formų įvairovė vadinama poikilocitoze (1 pav.). Ji dažniausia jaunikliams iki 3 mėnesių, bet
būna ir suaugusioms ožkoms (ypač būdinga Angoros veislei). RBC gali būti įvairių formų: trikampio, verpstės, grybo, kriaušės, lazdelės, elipsės (7). Ožkos eritrocitas turi mažą išlinkimą- mikroskopuojant kraujo tepinėlį ne taip gerai matomas balkšvumas ląstelės centre (lyginant su kitų gyvūnų eritrocitais). Šių gyvūnų RBC nesukimba į grandinėles, panašus vaizdas matomas nebent tepinėlio krašte. Jauniklių (iki 6 sav. amžiaus) tepinėliuose galima aptikti raudonųjų kraujo kūnelių su branduoliais, bet tai pasitaiko gana retai. Retikuliocitų sveikoms ožkoms beveik neaptinkama (8).
Nesergančioms ožkoms yra būdingas HbA ir HbB, o sergančioms ūmia anemija formuojasi HbC, kuris yra glaudžiai susijęs su poikilocitoze (4).
1 pav. 3 mėn. ožkos kraujo tepinėlis, dažytas Wright-
12
1.3
Anemijos rūšys, kurioms diagnozuoti reikalingas kraujo tepinėlio
metodas
1.3.1 Geležies trūkumo sukelta anemija
Geležis yra reikalinga hemoglobino sintezei. Sumažėjus geležies koncentracijai produkuojamos pakitę, nepilnavertės ląstelės: mikrocitai(mažesni eritrocitai) ir leptocitai (jų centrinė zona padidėjusi, o hemoglobino apvadas suplonėjęs). Dažnai pasitaikantis spalvos pakitimas- hipochromija. MCV ir MCHC būna sumažėję dėl geležies trūkumo anemijos, bet yra atvejų kai MCHC atitinka fiziologines normas, o MCV vidutiniškai sumažėjęs. Šią anemijos rūšį sukelia sumažėjusi geležies absorbcija iš virškinamojo trakto arba chroniškas kraujavimas (7). Geležies trūkumas dėl sumažėjusios absorbcijos
rečiau pasireiškia ganyklose ganomoms ožkoms nei laikomoms tvartuose. Geležies kiekis žoliniuose augaluose priklauso nuo ganyklos dirvožemio, augalų rūšių ir užterštumo laipsnio. Dažniau geležies trūksta kai ožkos laikomos tvarte visus metus ir šeriamos koncentratais (grūdų mišiniais) (12). Taip pat geležies gali trūkti jaunikliams girdomiems pienu ar pieno pakaitalais, jų kraujo tyrimuose užfiksuojamas sumažėjęs Hb ir HCT (8).
1.3.2 Vario trūkumo sukelta anemija
Šią anemijos rūšį gali sukelti vario trūkumas pašaruose (13) ir sumažėjęs įsisavinimas dėl didelio kiekio molibdeno arba sulfato. Dėl šių priežasčių sumažėja proteinų, savo sudėtyje turinčių vario (ceruloplazminas, citochromas oksidazė ir hepaestinas), kurie reikalingi geležies transportavimui. Hepaestinas dalyvauja geležies įsiurbime per žarnų enterocitus į kraują. Ceruloplazminas palengvina geležies mobilizaciją iš kepenų ir kitų audinių. Citochromo oksidazė dalyvauja trivalentės geležies redukcijoje iki dvivalentės geležies mitochondrijose. Dėl šių proteinų trūkumo sumažėja funkcinės geležies kiekis kraujyje ir gyvūnams pasireiškia mikrocitinė hipochrominė anemija (7). Tyrimo Centriniame Trinidade metu nustatyta, kad ožkoms su mažu vario kiekiu pašaruose ir kraujo serume pasireikė didžiausias procentas neregeneracinės anemijos, o sezoniškumas vario koncentracijai serume įtakos neturėjo- kiek mažesnė koncentracija rasta laktuojančioms ožkoms lietingu sezonu (10).
13
1.3.3 Oksidacinė anemija
Raudonieji kraujo kūneliai (RBC) yra nuolat veikiami oksidacinio streso, kuris gali būti tiek fiziologinis, tiek patologinis. RBC negali nuolat sintetinti naujų proteinų ar pakeisti ląstelės komponentų, dėl to jų rezistentiškumas oksidaciniam stresui yra ribotas ir ilgainiui jie negrįžtamai pažeidžiami. Eritrocitų pakitimus sukelia apsinuodijimas variu arba tam tikromis augalų rūšimis (13). Dažniausiai dėl oksidacinio streso susiformuoja Heinco kūneliai (2 pav.) ir ekcentrocitai (3 pav.). Heinco kūneliai yra methemoglobino gumulėliai matomi vidiniame RBC pavirčiuje. Methemoglobinas susidaro oksiduojantis dvivalentei geležiai (Fe2+) į trivalentę (Fe3+). Ekcentrocitai yra eritrocitai, kuriuose hemoglobinas yra pasiskirstęs nevienodai- susitelkęs vienoje pusėje, o kitoje jo nėra, matoma tik membrana. Tepinėlyje gali būti aptinkama tiek Heinzo kūnelių, tiek ekcentrocitų (7).
Ožkos yra kur kas mažiau jautrios apsinuodijimui variu nei avys, bet yra užregistruotų ligos atvejų ir veterinarijos gydytojui pravartu žinoti, kad tokia galimybė yra. Hemolizinė anemija ir kiti apsinuodijimo požymiai gali atsirasti dėl per didelio vario kiekio pašaruose, papilduose, ganyklos augaluose (14). Molibdeno, cinko, kalcio ir sulfato trūkumas pašaruose gali turėti įtakos per dideliam vario įsisavinimui ir kaupimuisi organizme, nors jo kiekis pašaruose atitinka fiziologinius ožkų poreikius (10).
Taip pat oksidacinę anemiją ožkoms gali sukelti bastutinių šeimos augalai (pvz. kopūstai, rapsai), svogūnai, česnakai, ropės, įvairios ąžuolo dalys (gilės, lapai ir kt.) (7). Eksperimentinio tyrimo metu, 60 dienų ožkos buvo šertos pašaru, kuriame yra 30% ir 60% svogūnų. Buvo pastebėtas hematokrito ir hemoglobino koncentracijų sumažėjimas, bet ne toks žymus, kad sukeltų anemiją.
2 pav. Tepinėlis dažytas modifikuotu Wright-
Giemsa metodu. Heinco kūneliai yra matomi kaip iškilimai ant RBC paviršiaus (500x padidinimas) (7)
3 pav. Tepinėlis dažytas modifikuotu Wright-
Giemsa metodu. Centre matomas ekcentrocitas, kurio hemoglobinas susikoncenravęs vienoje eritrocito pusėje, o kitoje pusėje bakšva zona (500x padidinimas) (7)
14
Klinikiniai požymiai apsinuodijus augalais nėra toki ūmūs kaip apsinuodijimo variu, būdinga lėtinės anemijos forma. Šių žalingų veiksnių sukelta anemija diagnozuojama taikant mikroskopinio tepinėlio metodą, svarbi anamnezė (7,11).
1.3.4 Anemija dėl kraujo praradimo
Kraujo praradimo sukelta anemija yra regeneruojanti, jai būdingas padidėjęs retikuliocitų ir makrocitų skaičius. Netekus kraujo sumažėja hematokritas, kraujo plazmoje padidėja eritropoetino koncentracija ir į kraujo apytaką patenka daugiau nesubrendusių eritrocitų- retikuliocitų (jei kaulų čiulpų veikla nesutrikusi) (9). 1-2 dieną nuo kraujo praradimo retikuliocitozė dar nebūna matoma, jos pikas stebimas 4-8 dieną. Retikuliocitų kiekis mažėja dviejų savaičių bėgyje, o makrocitiniai hipochrominiai eritrocitai gali būti randami kraujyje dar keturias savaites. Šie pakitimai leidžia manyti, kad anksčiau intensyviai vyko eritrocitų regeneracija (5).
Beveik prieš 40 metų (1980 m.) vykdytas eksperimentas įrodė, kad kraujo praradimo požymiai gali būti ne tik retikuliocitozė, anizocitozė ir polichromazija, bet ir poikilocitozė. Vykdant tyrimą buvo sukelta hemoraginė anemija sveikoms Angoros veislės ožkoms. Mikroskopuojant kraujo tepinėlius pastebėta poikilocitozė, kuri buvo stipriausia 8-13 sav. po kraujo praradimo. Toks eritrocitų morfologijos pasikeitimas susietas su HbC naujai subrendusiuose eritrocituose (8).
Sunkiau regeneracija vyksta kai kraujo netenkama chroniškai, prarandant proteinus ir geležį. Tuomet anemija dėl kraujo netekimo kartu tampa ir geležies trūkumo sukelta anemija ( 4 pav.), kurios metu regeneraciniai procesai vyksta lėčiau (7).
4 pav. Poikilocitozė ir hipochromija ožkos kraujo tepinėlyje,
modifikuotas Wright- Giemsa dažymas. Mikrocitinė- hipochrominė geležies trūkumo anemija sukelta kraujo netekimo dėl Haemonchus contortus invazijos (9)
15
Kraujo netekimo anemiją ožkoms sukelia įvairūs veiksniai. Smulkius atrajotojus gali sužeisti vilkai ar šunys ir palikti kraujuojančias žaizdas. Dažniau kraujo praradimą sukelia parazitai. Ektoparazitai (utėlės, erkės, blusos) alina ožkas, bet nesukelia ūmios anemijos. Kur kas labiau pavojingi endoparazitai, tokie kaip kepeninė siurbikė Fasciola hepatica ir šliuže parazituojantys nematodai
Haemonchus contortus (8). Pastarasis sukėlėjas yra labiausiai paplitęs ir sukelia daugiausiai ekonominių
nuostolių. Helmintozė pasireiškia svorio ir pieno produkcijos sumažėjimu, įvairaus laipsnio anemija ir net gaišimu (15). Ligos protrūkiai pasireiškia vasarą, vyraujant lietingiems orams. Gausaus užsikrėtimo atveju, L4 ir suaugę nematodai siurbia kraują pažeisdami šliužo gleivinę ir gali sukelti anemiją bei hipoproteinemiją anksčiau nei kiaušinėliai atsiranda išmatose, dėl to kraujo tepinėlio metodas informatyvus diagnozuojant šį susirgimą (16).
1.3.5 Anaplazmų sukelta anemija
Anaplazmozę ožkoms sukelia Anaplasma ovis, rečiau A. masaeterum. Plačiai paplitusi Viduržemio jūros šalyse yraA. ovis. Remiantis S. Stuen (Norvegijos Gamtos Mokslų Universitetas)
duomenimis, A. ovis, kaip ir B. ovis yra labiausiai paplitę kraujo pirmuonys Europoje, ypač šiaurinėje dalyje (17). Infekcijos vektorius yra plačiai paplitę kraujasiurbės erkės: Haemaphysalis, Rhiphicephalus ir Dermatocentor spp. (18). Jas gali pernešti migruojantys paukščiai ir ženkliai prisidėti prie infekcijos platinimo (17).
A. ovis apibūdinama kaip mažo patogeniškumo riketsija, nesukelianti karščiavimo ir kitų
klinikinių požymių. Tačiau yra atvejų, kai anaplazmozė pasireiškia ūmia ligos forma, sukeldama hemolizinę anemiją avims ir ožkoms (18). Taip pat, anaplazmoze sergantys gyvūnai yra jautresni kitoms ligoms. Užkratas gali būti perduodamas vaisiui per placentą ir sukelti abortą. Ožkoms A. ovis labiau patogeniškos nei avims, bet veislė taip pat gali turėti tam įtakos (17).
Morfoligiškai A. ovis panašios į A. marginale, kurios yra labiau paplitę galvijų tarpe (4). Mikroskopu matomi apvalūs, 0,5-1 μm, bazofiliniai kūneliai įvairiose RBC vietose (5 pav.). Jie yra panašūs į HoWell- Jolly kūnelius, todėl svarbu gebėti juos atskirti (4). Jos gali būti diagnozuojamos naudojant PGR ir ELISA metodus, DNR sekvenavimą, mikroskopuojant dažytą periferinio kraujo tepinėlį (iš karto po klinikinių požymių pasireiškimo) (16).
16
1.3.5 Babezijų sukelta anemija
Afrikoje, Azijoje ir Europoje babeziozė yra plačiai paplitusi ir sukelia žymius ekonominius nuostolius avių ir ožkų augintojams. Babesia ovis, Babesia motasi ir Babesia crassa gali sukelti babeziozę ožkoms, bet ryškius klinikinius požymius dažniausiai sukelia B. ovis (19). Ją perneša
Rhipicepfalus genties erkutės (17).
Ligos eiga ožkoms gali būti ūmi, poūmė ir lėtinė (20). Klinikiniai požymiai būna labai įvairūs: karščiavimas, progresuojanti anemija, hemoglobinurija ir inkstų nepakankamumas (21). Tiriant smulkiųjų atrajotojų užkrėstumą B. ovis Irake, buvo atliekamas kraujo morfologinis tyrimas, PGR reakcijos tyrimas ir kraujo tepinėlis, dažomas Gimzos būdu. Norint nustatyti parazitemijos lygį buvo skaičiuojama kiek eritrocitų iš 100 yra infekuoti. Gauti rezultatai sutapo su kitų mokslininkų (Sevinc ir kt. (22), Ramsi ir kt. (23), Aktas ir kt. (24)) atliktais tyrimais- RBC, HCT ir Hb rodikliai buvo žymiai prastesni nei neužkrėstų B. ovis gyvūnų (20).
5 pav. Anaplasma ovis eritrocitų centre ir
17
Diagnozuoti babeziozę galima serologiškai (ELISA), PGR, RBL hibridizacijos ir kraujo tepinėlio (ūmios eigos atveju) metodais (17). Mikroskopu stebima (6 pav.) maža, 1-1,5 µm skersmens, apvalios, ovalios arba kriaušės formos piroplazma, matoma eritrocituose (B. motasi yra kiek didesnė, ovali ir dažniausiai matoma sukibusi poromis). Citoplazmos spalva mėlyna, o viduje matomas raudonas chromatinas (7).
1.3.6 Teilerijų sukelta anemija
Teilerijos paplitę Afrikoje, Europoje, Australijoje ir Azijoje (7), jas perneša Hyalomma spp. erkutės ir B. ovis vektorius Rhipicephalus bursa (18). Theileria hirici (dar žinoma kaip T. lestoquardi) sukelia ūmią infekciją avims ir ožkoms (gaištamumas 46-100%). T. separata ir T. ovis yra mažiau patogeniškos (17). Neseniai atrasta nauja teilerijų rūšis (būdinga avims ir ožkoms) vadinama Teileria sp. China. Tyrimo Italijoje metu gauti užkrėstumo rezultatai: T. ovis 1,6 proc., T. hirici 0,0 proc., Theileria sp. China 11,4 proc. (18).
Dažniausiai diagnozuojama ūmi teileriozės forma, bet gali pasitaikyti poūmė ir lėtinė. Ūmios infekcijos metu būdingi klinikiniai požymiai yra pakilusi kūno temperatūra, prakaitavimas, neatrajojimas, sutinę limfiniai mazgai, gelta, diarėja, kraujosrūvos poodyje ir pogleivinėje (17).
6 pav. Babesia ovis eritrocituose. Trofozoittai maži (1-2
μm) ir apvalūs, dažniausiai randami eritrocito kraštuose. Wright- Giemsa dažymas (36)
18
Šie pirmuonys dauginasi leukocituose šizogonijos būdu, o jiems plyšus merozoitai skverbiasi į eritrocitus ir juose parazituoja (7). Ūmios klinikos pasireiškimo metu teileriozė diagnozuojama mikroskopuojant periferinio kraujo tepinėlį arba limfinio mazgo aspiratą- jie dažomi Gimzos metodu (7 pav.). Taip pat galimi serologiniai (ELISA), PGR, DNR sekvenacijos, RBL hibridizacijos tyrimo metodai.
1.3.7 Mikoplazmų sukelta anemija
Hemotropinės mikoplazmos (hemoplazmos) yra paplitę visame pasaulyje. Pagrindiniai hemoplazmų vektoriai yra musės kandikės (Stomoxys calcitrans) ir avių melofagai ( Melophagus ovinus) (17). Ožkoms dažniausiai diagnozuojama M. ovis, kuria užsikrečiama kontakto su infekuotu krauju metu arba įkandus kraujasiurbiams vabzdžiams (25).
Užsikrėtimo hemoplazmomis požymiai dažniausiai chroniški (anemija, išliesėjimas, letargija, pieno produkcijos sumažėjimas), bet galima ir ūmi ligos eiga. Klinikiniai požymiai paūmėja dėl gyvūno imunosupresijos, nesubalansuoto šėrimo, vaikingumo, vietos pakeitimo, užsikrėtimo kitais, labiau virulentiškais patogenais (27).
7 pav. Teilerijos piroplazmos parazituojančios
19
Diagnozuoti mikoplazmozę galima DNR ekstrakcijos ir PGR metodu (26), bet dėl savo paprastumo ir pigumo dažnai yra pasirenkamas kraujo tepinėlio metodas. Jis yra mažiau jautrus ir reikalauja mikroskopavimo įgūdžių. Kraujo tepinėlis dažomas Gimzos metodu ir tiriamas mikroskopu (27). Mikoplazmos yra mažos, sienelės neturinčios bakterijos randamos eritrocito paviršiuje (8 pav.) arba plazmoje, melsvos/ rausvai melsvos spalvos, 04-2,5 µm skersmens (25,27).
8 pav. Mycoplasma ovis matomos ant eritrocitų membranos. Wright-
20
2 TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1 Tyrimo atlikimo vieta, objektai ir schema
Tyrimas atliktas 2018 m. gegužės- rugsėjo mėnesiais. Per visą tyrimo laikotarpį surinkti 24 Lietuvos vietinių ožkų kraujo mėginiai ir ištirti tam tikru eiliškumu (9 pav.). Keturiuose X ožkų ūkiuose buvo paimta po 6 kraujo mėginius atsitiktine tvarka. Mėginiai kraujo tyrimams rinkti iš 1,5 metų amžiaus ir vyresnių ožkų.
9 pav. Tyrimo schema
Kraujo ėmimas iš
V. jugularis Morfologinis kraujo tyrimas Ⅰ, Ⅱ ir Ⅲ grupių statistinė analizė Tiriamųjų grupių sudarymas Kraujo tepinėlio mikroskopija Ⅱ grupė- tepinėliai su retikuliocitais ir makrocitais. Ⅰ grupė- tepinėliai be morfologijos pakitimų. Ⅲ grupė- tepinėliai su eritrocitų dydžio, spalvos ir formos pakitimais.
21
2.2 Mikroskopinis ir morfologinis kraujo tyrimo metodai
Kraujas tyrimams imtas iš Vena jugularis, prieš tai antiseptiku (spiritu) nuvalius odą. Vena užspausta pirštu, tokiu būdu sulaikant į širdį grįžtantį kraują. Vakutainerio sistema laikyta taip, kad adatos ertmė būtų nukreipta į viršų. Adata įdurta 30 laipsnių kampu, 1-1,5 cm gilyn. Įstatytas vakuuminis mėgintuvėlis ir leista pritekėti kraujui, tuomet mėgintuvėlis atskirtas nuo adatos. Pirštai, kurie laikė įspaudę jungo veną atpalaiduoti prieš ištraukiant adatą, taip sumažinant kraujavimą iš dūrio vietos. Ištraukus adatą, dūrio vieta užspausta sausu vatos tamponėliu. Naudotas mėgintuvėlis violetiniu kamšteliu, kuriame yra EDTA (etilendiaminotetraacto rūgšties koaguliantas), medžiaga neleidžianti kraujui sukrešėti mėgintuvėlyje. Mėgintuvėlis švelniai pavartytas, kad stabilizatorius susimaišytų su krauju.
Ant sauso ir gerai nuriebalinto objektinio stiklelio buvo daromas kraujo tepinėlis, stiklelį fiksuojant tarp nykščio ir rodomojo bei didžiojo piršto. Kraujo lašas paimtas stikline lazdele iš mėgintuvėlio (prieš tai išmaišius kraują). Kitos rankos nykščiu ir rodomuoju pirštu suimtas kitas objektinis stiklelis ir 30–40 ° kampu per kraujo lašą jo kraštinė priglausta prie objektinio stiklelio. Palaukus, kol kraujas pasiskleis po visą objektinio stiklelio kraštinę, braukta išilgai objektinio stiklelio (kraujo tepinėlis turėtų sudaryti 2/3 ar daugiau objektinio stiklelio ilgio). Paruoštas tepinėlis išdžiovintas ore, o ant matinės objektinio stiklelio dalies užrašytas ožkos įsago numeris.
Kraujo tepinėlis fiksuotas ir dažytas pagal Pappenheim metodiką, naudojant Hemacolor® (Merck KGaA, Vokietija) dažymo rinkinį. Sausas natyvinis kraujo tepinėlis fiksuotas fiksavimo tirpalu įmerkiant kraujo tepinėlį į tirpalą 5 kartus po 1 s., tuomet dažytas raudonos spalvos reagentu įmerkiant į jį kraujo tepinėlį 5 kartus po 1 s. Paskui kraujo tepinėlis dažytas mėlynos spalvos reagentu įmerkiant į jį kraujo tepinėlį 5 kartus po 1 s. Tepinėlis plautas buferio tirpale (pH 7,2) įmerkiant į tirpalą kraujo tepinėlį 2 kartus po 10 s. Nudažytas kraujo tepinėlis išdžiovintas kambario temperatūroje.
Paruošto kraujo tepinėlio vertinimas atliktas šviesiniu mikroskopu. Pirmiausia kraujo tepinėlis apžiūrėtas mažuoju (100×) ir didžiuoju (400×) mikroskopo didinimu, įvertinta tepinėlio nusidažymo kokybė, kraujo ląstelių išsidėstymas ir tinkamiausia mikroskopinei analizei vieta. Tuomet užlašinta imersinio aliejaus ir imersine sistema (1000× didinimu) tirti ožkų eritrocitai (spalva, dydis, forma, intarpai), nustatyta ar citoplazmoje ir leukocituose nėra pakitimų.
22
Kraujo morfologinė sudėtis tirta ,,Abacus Junior Vet“ analizatoriumi. Registruoti anemijos diagnozavimui svarbūs rodikliai: hematokritas (HCT), hemoglobinas (Hb), bendras eritrocitų skaičius (RBC), vidutinis eritrocito tūris (MCV) ir vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite (MCHC).
2.3 Statistinių duomenų analizė
Duomenys surašyti į programą ,,Excel 2010“, paruošta statistinė duomenų analizė. Skirtumams tarp lyginamų grupių (Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ) įvertinti apskaičiuoti kraujo rodiklių vidurkiai ir vidurkių aritmetinės paklaidos. Tarpgupinių skirtumų statistiniam reikšmingumui įvertinti buvo apskaičiuotas Stjudento kriterijus. Rezultatai laikomi statistiškai patikimais, kai p<0,05.
Tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijos, Veterinarijos fakultete, Stambiųjų gyvūnų klinikoje.
23
3 TYRIMO REZULTATAI
3.1
Rezultatų, gautų mikroskopiniu tyrimo metodu, analizė
Mikroskopu ištirti 24 ožkų kraujo tepinėliai ir nustatyti eritrocitų pakitimai (10 pav.).10 pav. Eritrocitų dydžio, spalvos ir formos pakitimai (proc.)
71 proc. (n=17) tepinėlių nepastebėta eritrocitų dydžio pakitimų. 3 mėginiuose nustatyti skirtingų dydžių eritrocitai, šis pakitimas vadinamas anizocitoze. 4 mėginiuose nustatyti mažesni, nei 3,2 mkr eritrocitai- mikrocitozė.
75 proc. (n=18) tepinėlių nepastebėta eritrocitų spalvos pakitimų. 6 tepinėliuose nustatyti šviesūs- hipochrominiai eritrocitai.
71 proc. (n=17) tepinėlių nepastebėta eritrocitų formos pakitimų. 7 tepinėliuose nustatyta ryški poikilocitozė- įvairių formų eritrocitai (trikampio, verpstės, grybo, kriaušės, lazdelės). Atsižvelgus į tirtų gyvūnų rūšį, tik ryškūs eritrocito formos pakitimai buvo traktuojami kaip poikilocitozė.
5 tirtuose mėginiuose nustatyti pavieniai makrocitai ir retikuliocitai. 38 proc. mėginių (n=9) buvo be jokių eritrocitų morfologijos pakitimų.
25% 13% 17% 29% 25% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%
Hipochromija Anizocitozė Mikrocitzė Ryški
poikilocitozė makrocitai irPavieniai retikuliocitai O žkų ska ič ius proc .
24
3.2 T
iriamųjų grupių sudarymas ir analizė pagal morfologinio tyrimo
rezultatus
Tiriant kraujo mėginius tepinėlio metodu 37 proc. (n=9) nenustatyta jokių pakitimų. 42 proc. (n=10) mėginių pastebėti nežymūs pakitimai (pavieniai retikuliocitai ir hipochrominiai makrocitai). 21 proc. (n=5) mėginių pastebėti ryškūs eritrocitų dydžio, spalvos ir formos pakitimai. Pagal gautus rezultatus, sudarytos trys tiriamosios grupės (11 pav.):
Ⅰ grupė- tepinėliai be morfologijos pakitimų.
Ⅱ grupė- tepinėliai su pavieniais retikuliocitais ir hipochrominiais makrocitais. Ⅲ grupė- ryškūs dydžio, spalvos ir formos pakitimai.
Tiriamosios grupės analizuotos pagal morfologinių tyrimų rezultatus. Nustatytas RBC vidurkių skirtumas tiriamosiose grupėse (12 pav).
11 pav. Tiriamosios grupės sudarytos pagal kraujo tepinėlio mikroskopavimo
rezultatus
Ⅰ grupė
37%
Ⅱ grupė
42%
Ⅲ grupė
21%
25
Didžiausias raudonųjų kraujo kūnelių vidurkis nustatytas Ⅰ grupėje- 15,74×106/µl (±0,68). Ⅱ grupėje RBC vidurkis buvo nežymiai mažesnis- 15,00×106/µl (±0,75), o Ⅲ grupėje vidurkis buvo mažiausias- 9,41×106/µl (±1,46). Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad Ⅰ grupės raudonųjų kūnelių vidurkis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo Ⅱ grupės (p>0,05), tačiau buvo statistiškai reikšmingai didesnis už Ⅲ grupės vidurkį (p=0,0007). Ⅱ grupės RBC vidurkis buvo statistiškai reikšmingai (p= 0,002) didesnis už Ⅲ grupės vidurkį.
Nustatytas hemoglobino vidurkių skirtumas tiriamosiose grupėse (13 pav.). Didžiausias Hb koncentracijos vidurkis buvo Ⅰ grupėje- 100,56 g/dl (±5,18). Ⅱ grupėje hemoglobino vidurkis buvo mažesnis- 89,8 g/dl (±5,29), o Ⅲ grupėje vidurkis buvo mažiausias- 45 g/dl (±8,32).
12 pav. Raudonųjų kraujo kūnelių vidurkiai tiriamosiose grupėse
13 pav. Hemoglobino vidurkiai tiriamosiose grupėse g/dl
15,74 15,00 9,41 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 Ⅰ Ⅱ Ⅲ RB C × 10 6 /µ l 100,56 89,80 45,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 Ⅰ Ⅱ Ⅲ H B g/ d l
26
Išanalizavus duomenis nustatyta, kad Ⅰ grupės hemoglobino vidurkis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo Ⅱ grupės (p>0,05), tačiau buvo statistiškai reikšmingai didesnis už Ⅲ grupės vidurkį (p=0,00006). Ⅱ grupės Hb vidurkis buvo statistiškai reikšmingai (p=0,0004) didesnis už Ⅲ grupės.
Nustatytas hematokrito vidurkių skirtumas tiriamosiose grupėse (14 pav.). Didžiausias HCT vidurkis nustatytas Ⅰ grupėje- 27,13 proc. (±1,07). Ⅱ grupėje vidurkis buvo mažesnis- 24,55 proc. (±1,31), o Ⅲ grupėje vidurkis buvo mažiausias- 12,53 proc.(±2,46).
Išanalizavus duomenis nustatyta, kad Ⅰ grupės hematokrito vidurkis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo Ⅱ grupės (p>0,05), tačiau buvo statistiškai reikšmingai didesnis už Ⅲ grupės vidurkį (p= 0,00004). Ⅱ grupės HCT vidurkis buvo statistiškai reikšmingai (p= 0,0004) didesnis už Ⅲ grupės vidurkį.
Vidutinio eritrocitų tūrio vidurkiai tiriamosiose grupėse buvo skirtingi (15 pav).
14 pav. Hematokrito vidurkiai tiriamosiose grupėse (proc.)
27,13 24,55 12,53 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 Ⅰ Ⅱ Ⅲ H CT proc . 17,33 16,40 13,40 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 Ⅰ Ⅱ Ⅲ M CV fL
27
Didžiausias vidutinis eritrocito tūris buvo Ⅰ grupėje- 17,3 fL (±0,75). Ⅱ grupėje nustatytas truputį mažesnis MCV vidurkis- 16,4 fL (±0,58), o Ⅲ grupėje vidurkis buvo mažiausias- 13,4 fL (±1,44).
Išanalizavus duomenis nustatyta, kad Ⅰ grupės MCV vidurkis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo Ⅱ grupės (p>0,05), tačiau buvo statistiškai reikšmingai didesnis už Ⅲ grupės vidurkį (p=0,02). Ⅱ grupės vidurkis buvostatistiškai reikšmingai (p=0,04) didesnis už Ⅲ grupės vidutinio eritrocito tūrio vidurkį.
Nustatytas MCHC vidurkių skirtumas tiriamosiose grupėse (16 pav.). Didžiausias vidutinės hemoglobino koncentracijos eritrocite vidurkis buvo Ⅰ grupėje- 369,7±0,68 g/dl. Kiek mažesnis nustatytas Ⅲ grupėje- 367,2 g/dl, o Ⅱ grupėje MCHC vidurkis buvo mažiausias- 357,1 g/dl.
Išanalizavus duomenis nustatyta, kad Ⅰ, Ⅱ ir Ⅲ grupės MCHC vidurkiai statistiškai reikšmingai nesiskyrė tarpusavyje (p>0,05).
16 pav. Vidutinės hemoglobino koncentracijos eritrocite vidurkiai
tiriamosiose grupėse (g/dl) 369,7 357,1 367,2 330,0 340,0 350,0 360,0 370,0 380,0 390,0 M C HC Ⅰ Ⅱ Ⅲ
28
4 R
EZULTATŲ APTARIMAS
Tyrimo metu 5 ožkoms (21 proc.) nustatyti ryškūs pakitimai kraujo tepinėlio ir morfologinio tyrimo metodu. Šios ožkos sudarė Ⅲ tiriamąją grupę. Tepinėlio metodu pastebėti eritrocitų formos, spalvos ir dydžio pakitimai. Dažniausiai pastebėta poikilocitozė (29 proc.). Nors poikilocitozė ožkoms
yra fiziologiška, bet dažniausiai stebima jaunikliams iki 3 mėnesių ir Angoros veislei (8,28). Tyrimo metu imti mėginiai iš suaugusių Lietuvos vietinių veislės ožkų- daryta prielaida, kad gerai išreikšta poikilocitozė susijusi su anemija dėl vyraujančio HbC (4,7). Garrick nustatytė, kad ožkoms, iki 4 mėnesių amžiaus, HbC pasikeičia į HbA ir HbB- eritrocitai įgauna taisyklingą formą. 5-10 proc. suaugusių ožkų gali turėti HbC, bet dažniausiai HbC yra intensyvios eritropoezės indikatorius (matomas kaip įvairių formų eritrocitai) (29).
Spalvos pakitimai, t. y. hipochromija taip pat pasitaikė dažnai (25 proc.) ir buvo matoma kartu su dydžio pakitimais (mikrocitais, anizocitoze) ir poikilocitoze. Šiuos pakitimus galima interpretuoti kaip lėtinės neregeneruojančios anemijos požymius- ožkos galėjo susirgti dėl vario, geležies trūkumo arba lėtinio kraujo praradimo (užsikrėtimo gastrointestinaliniais parazitais) (10). Centriniame Trinidade buvo ištirtos 153 ožkos ir nustatyta priklausomybė tarp mažos vario koncentracijos kraujyje ir žemų Hb ir PCV rodiklių. 75 proc. ožkų, kurioms nustatytas vario trūkumas kraujo serume (<0.5 mg/L), pasireiškė neregeneruojanti anemija (10).
Ⅲ tiriamojoje grupėje 20 proc.mėginių pastebėtas per mažas raudonųjų kraujo kūnelių kiekis (<8×106/µl). 100 proc. tiriamųjų nustatyti žemi hemoglobino (<8 g/dl) ir hematokrito (<22 proc.) rodikliai. 80 proc. mėginių nustatytas vidutinis eritrocitų tūris žemiau normos ribų (<15 fL) (1 lentelė).
E. G. Katsogiannou ir kt. aprašė, kad sumažėjęs MCV yra tapatus mikrocitozei- šie pakitimai yra nepilnaverčio ožkų šėrimo arba lėtinių ligų indikatoriai. Jei kartu pasireiškia žemi MCV rodikliai (mikrocitozė) ir MCHC žemiau normos ribų, geležies trūkumo sukelta anemija yra labai tikėtina (1). Atliktame tyrime vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite (300-360 g/l) atitiko fiziologinę normą.
Ⅰ Ⅱ Ⅲ RBC (<8×106/µl) 0 0 1 HB (<8 g/dl) 0 1 5 HCT (<22 proc.) 2 6 5 MCV (<15 fL) 1 2 4 MCHC (<300 g/l) 0 0 0
1 lentelė. Mėginių skaičius, kuriame kraujo morfologiniai rodikliai buvo žemiau normos
29
Ⅲ tiriamosios grupės RBC, Hb, HCT, MCV rodikliai buvo statistiškai reikšmingai mažesni už Ⅰ ir Ⅱ grupių.
10 ožkų (42 proc.) tepinėliuose mikroskopavimo metu nustatyti retikuliocitai ir/ar
hipochrominiai makrocitai (atskirai nuo kitų kraujo pakitimų)- šie mėginiai priskirti Ⅱ tiriamajai
grupei. Sveikoms ožkoms retikuliocitų neaptinkama arba matomi labai maži jų kiekiai (15). Jie aptinkami, kuomet kraujo praradimas yra momentinis ir nepasikartojantis- būdingas regeneruojančios anemijos vaizdas (5). Taip pat regeneracinius procesus atspindi makroctozė ir polichromazija, o anizocitozė gana dažnai pasitaiko ir sveikiems atrajotojams. Makrocitozę galima įtarti dėl aukštų MCV rodiklių, bet pavieniai makrocitai gali būti nustatomi tik tepinėlio metodu (1).
M. C. Smith ir D. M. Sherman aprašė tyrimą, kai ožkoms buvo nuleidžiamas kraujas, kol RBC skaičius sumažėjo daugiau nei per pusę. Retikuliocitų kiekis pakilo nuo 0-0,5 proc. iki 3,2-7,7 proc. per aštuonias dienas, tuomet lėtai mažėjo. Antras retikuliocitų pikas pasireiškė 12-18 tyrimo dienomis (2,9-6,3 proc. retikuliocitų). Prieita išvados, kad regeneracinių procesų metu anizocitozė ir hipochrominiai makrocitai buvo geriau matomi nei retikuliocitai. Hb ir PCV rodikliai grįžo į fiziologinės normos ribas per penkias savaites (8).
Ⅱ tiriamojoje grupėje raudonieji kraujo kūneliai ir vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite buvo fiziologinės normos ribose. 10 proc. mėginių nustatyti per maži hemoglobino rodikliai (<8 g/dl), 60 proc. per maži hematokrito rodikliai (<22 proc.). 20 proc. tiriamųjų nustatytas žemas vidutinis eritrocitų tūris (<15 fL) (1 lentelė). Ⅱ grupės RBC, Hb, HCT, MCV rodikliai buvo statistiškai reikšmingai didesni už 3 grupės. Išanalizavus mikroskopijos metu nustatytus pokyčius ir morfologinio tyrimo metu gautus duomenis galima prieiti išvados, kad Ⅱ grupės ožkos turėjo regeneruojančios anemijos požymių ir galimai buvo praradę kraujo (pvz. dėl užsikrėtimo Haemochus contortus).
9 ožkoms (37 proc.) neaptikta jokių eritrocitų pakitimų mikroskopiniu tyrimo metodu- jos priskirtos Ⅰ tiriamajai grupei. Raudonųjų kraujo kūnelių, hemoglobino ir vidutinės hemoglobino koncentracijos eritrocite rodikliai buvo fiziologinės normos ribose, tačiau 22 proc. ožkų hematokrito kiekis buvo sumažėjęs (<22 proc.) ir 11 proc. ožkų nustatytas žemas vidutinis eritrocitų tūris (<15 fL) (1 lentelė). Ⅰ tiriamosios grupės RBC, Hb, HCT, MCV rodikliai buvo statistiškai reikšmingai didesni už 3 grupės, kurioje aptikti įvairūs eritrocitų pakitimai.
Nors kraujo tepinėlio metodu būtų įmanoma atpažinti kraujo pirmuonis (Anaplasma spp.,
Babesia spp., Theileria spp.), hemoplazmas (Mycoplasma ovis) ir oksidacinį stresą, tačiau tyrimo metu
30
1. Mažas tiriamųjų skaičius- tirtos tik 24 ožkos, imtis per maža, kad galima būtų spręsti apie sergamumą minėtomis ligomis;
2. Tirtos ožkos be ryškių ligos simptomų- esant ūmiai ligos eigai yra didžiausia tikimybė rasti kraujo parazitus, hemoplazmas ir oksidaciniam stresui būdingus pakitimus (imant periferinio kraujo tepinėlius);
3. Ožkų kraujo tepinėlius sunku tirti dėl mažo eritrocitų dydžio (skersmuo 3,2- 4,2 mikronai) (8), galima nepastebėti būdingų pakitimų;
4. Duomenų patikrinimui nebuvo naudojami serologiniai (ELISA), PGR, DNR sekvenacijos, RBL hibridizacijos tyrimo metodai (naudojami kraujo pirmuonių ir hemoplazmų atveju).
31
IŠVADOS
1. Išanalizavus ir apibendrinus mokslinę literatūrą, galima teigti, kad anemija nustatoma morfologiniu kraujo tyrimo metodu, bet norint diagnozuoti jos priežastį, pravartu atlikti kraujo tepinėlio tyrimą (atpažinti regeneruojančiai ar neregeneruojančiai anemijai būdingus eritrocitų pakitimus).
2. Tyrimo metu surinkti 24 ožkų kraujo mėginiai ir ištirti morfologiniu bei kraujo tepinėlio metodais, sudarytos tiriamosios grupės pagal tepinėlio mikroskopijos rezultatus.
3. Nustatyta, kad sergamumas anemija ožkų tarpe yra aktuali problema nes 21 proc. tepinėlių pastebėti ryškūs eritrocitų dydžio, formos ir spalvos pakitimai, bei žemi morfologinių rodiklių vidurkiai (RBC 9,41 ×106/µl, HCT 12,53 proc., HB 45,0 g/dl , MCV 13,40 fL), kurie statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kitų tiriamųjų grupių vidurkių.
4. Ištyrus kraujo mėginius abiem metodais nustatyta, kad kraujo tepinėlis turėjo papildomos informacijos ligos diagnozavimui: atmesta hemolizinės anemijos galimybė, nustatyti eritrocitų spalvos (hipochomija 25 proc.), dydžio (mikrocitozė 17 proc.,anizocitozė 13 proc.) ir formos (poikilocitozė 29 proc.) pakitimai, būdingi neregeneruojančiai anemijai. 25 proc. tepinėlių nustatyti regeneruojančiai anemijai būdingi pakitimai (retikuliocitai ir hipochrominiai makrocitai).
32
PASIŪLYMAI IR REKOMENDACIJOS
1. Reguliariai tikrinti ožkų sveikatingumą, o ypač gleivinių spalvą (rekomenduojama su FAMACHA lentele).
2. Vertinti ožkų užsikrėtimą gastrointestinaliniais parazitais ir atlikti dehelmintizaciją atsižvelgiant į gautus rezultatus.
3. Šerti ožkas visaverčiu, geros kokybės pašaru, duoti papildų su mineralais ir mikroelementais. 4. Neduoti ožkoms bastutinių šeimos augalų (pvz. kopūstų, rapsų), svogūnų, česnakų, ropių,
ąžuolo šakų.
5. Ganyti ožkas aptvertose ganyklose, naktį parginti į tvartą ir kitaip saugoti nuo plėšrūnų keliamo pavojaus.
33
PADĖKA
Dėkoju savo baigiamojo darbo vadovei veterinarijos gydytojai Jurgitai Autukaitei, už pagalbą atliekant tyrimą ir rašant baigiamąjį darbą. Ačiū už Jūsų kantrybę ir pozityvumą.
Taip pat noriu padėkoti Stambiujų gyvūnų klinikų veterinarijos gydytojoms Ritai Ivanauskaitei irRitai Girdvainienei už nepakeičiamą pagalbą atliekant tyrimą.
34
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Katsogiannou E, Athanasiou L, Polizopoulou Z, Christoduolopoulos. Diagnostic approach of anemia in ruminants. Journal of the Hellenic Veterinary Medical Society. 2018; 69(3): p. 1033-1046.
2. Lietuvos statistikos departamentas. Statistinių rodiklių analizė [elektroninis išteklius]. Peržiūrėta 2018 05 18. Prieiga per internetą: https://osp.stat.gov.lt/statistiniu-rodikliu-analize#/.
3. Žukauskaitė J. 2018-05-16 Lietuvoje sumažėjo įregistruotų avių skaičius, tačiau ožkų – padidėjo [elektroninis išteklius]. Peržiūrėta 2018 05 16. Prieiga per internetą:
www.vic.lt/zumpris/2018/05/16/2018-05-16-lietuvoje-sumazejo-iregistruotu-aviu-skaicius-taciau-ozku-padidejo/.
4. Murat Y, Taskin T, Loria AD, Bardakcioglu HE. Effect of body condition score on same blood parameters for anemia level in goats. Veterinary medicine and zootechnics. 2014; 67(89): p. 41-44.
5. Ermilio EM, Smith MC. Treatment of Emergency Conditions in Sheep and Goats. ELSEVIER. 2011; 27(1): p. 33-45.
6. Kerr MG. Veterinary Laboratory Medicine- Clinical Biochemistry and Haematology. 2008; 392(2): p. 28-30.
7. Weiss DJ, Wardrop KJ. Schalm's Veterinary Hematology. 2010; p. 136-138, 146-147, 152, 167, 168-170, 200-208.
8. Smith MC, Sherma DM. Goat Medicine. 2009; p. 275-310.
9. Harvey JW. Veterinary Hematology. A Diagnostic Guide and Color Atlas. 2012; p. 126, 134-135, 144-146, 152-153, 157, 167-171, 200-206.
10. Mohammeda A, Campbellb M, Pargassb I, Sieuchanda S, Bridgemohana P, Khana A, et al. The Association of Serum and Forage Copper Levels and Blood Values of Grazing Goats of Different Physiological Stages Pertaining to Location in the Dry and Wet Seasons from Central Trinidad. ResearchGate. 2016; 2(2): p. 23-29.
35
11. Heidarpour M, Fakhrieh M, Aslani MR, Mohri M, Keywanloo M. Oxidative effects of long-term onion (Allium cepa) feeding on goat erythrocytes. Springer. 2011; 22(2): p. 195-201.
12. National Research Councile. Nutrient Requirements of Small Ruminants: Sheep, Goats, Cervids, and New World Camelids. Washigton: National Academies Press; 2006. p. 221-229.
13. Suttle NF. Copper. The Mineral Nutrition of Livestock. 2010; p. 255-305.
14. Cregar LC, Wiedmeyer CE, Ringen DR, Evans TJ, Johnson GC, Kuroki K. Copper toxicosis in a Boer goat. Veterinary Clinical Pathology. 2012; 41(4): p. 202-506.
15. M. Ejlertsen. Accuracy of an anaemia scoring chart applied on goats in sub-humid Kenya and its potential for control of Heamonchus contortus infections. Veterinary Parasitology. 2006; 141(3-4): p. 291-301.
16. Gibbons L, Hermosilla C, Jacobs D, Fox M. Principles of Veterinary Parasitology, John Wiley & Sons. 2015; p. 226-232.
17. Stuen S. Haemoparasites in small ruminants in European countries: Challanges and clinikal relevance. Elsevier. 2016; 164: p. 22-27.
18. Torina Alessandra CS. Tick- borne diseases in sheep and goats: Clinical and diagnostic acpects. Elsevier. 2012; 106: p. 6-11.
19. M'ghribi Y, Ros-Garcia A, Iribar P, Rhaim A, Hurtado A, Bouattour A. A molecular study of tick- borne haemaprotozoan parasites (Theileria and Babesia) in small ruminants in Northern Tunisia. Elsevier. 2013; 198(1-2): p. 72-77.
20. Esmaeilnejad B, Tavassoli M, Rezaei SA. Investigation of hematological and biochemical parameters in small ruminants naturally infected with Babesia ovis. Veterinary Research Forum. 2012; 3(1): p. 31-36.
21. Vannier EG, Diuk-Wasser MA, Mamoun CB, Krause. PJ. Babesiosis. HHS Public Access. 2015: p. 2-6.
36
22. Sevinc F, Turgut K, Sevinc M, al. e. Therapeutic and prophylactic efficacy of imidocarb
dipropionate on experimental Babesia ovis infection of lambs. Vet Parasitology. 2007; 149(1-2): p. 65-71.
23. Razmi G, Naghibi A, Aslani M. An epidemiological study on Babesia infection in small ruminants Mashhad suburb, Khorasan province, Iran. Small Ruminant Research. 2003; 50(1-2): p. 39-44. 24. Aktas L, Altay K, Dumanli N. Determination of prevalence and risk factors for infektion with
Babesia ovis in small ruminants from Turkey by polimerase chain reaction. Parasitology Research. 2007; 100(4): p. 797-802.
25. Martina Komjáti-Nagyová BV. A molecular survey of hemotropic Mycoplasma species in domestic and wild living animals in Slovakia. Polish Parasitological Society. 2016; 2016(62): p. 152.
26. Grazziotin AL, Santos AP, Guimares AMS, Mohamed A, Cubas ZS, all. MJDOe. Mycoplasma ovis in captive cervids: Prevalence, molecular characterization and phylogeny. ELSEVIER. 2011; 152(3-4): p. 415-419.
27. Jesse FFA, Jazid NHBA, Mohammed K, Tijjani A, Chung ELT, Abba Y. Hemotropic
Mycoplasma ovis infection in goats with concurrent gastrointestinal parasitism in Malaysia. Javar. 2015; 2(4): p. 464-468.
28. Pieragostini E, Rullo R, Scaloni A, Bramante G, Luccia AD. The alpha chains of goat
hemoglobins: old and new variants in native Apulian breeds. PubMed. 2005; 142(1): p. 18-25. 29. Garrick. The Structure of Goat Hemoglobins. Research Gate. 1967; 242(May 25): p. 50-75. 30. Invasive Species Compedium. Walingford UCI. CABI. [elektroninis išteklius]. Peržiūrėta 2018 08
21. Prieiga per internetą: www.cabi.org/isc.
31. Dubeuf JP, Morand-Fehr P, Rubino R. Situation, changes and future of goat industry around the world. ELSEVIER. 2004; p. 165-173.
32. Chaudary FR, Khan MF, Qayyum M. Prevalence of Haemochus contortus in naturally infected small ruminants grazing in the Potohar area of Pakistan. Research Gate. 2007; 27(2): p. 73-74.
37
33. Yasini SP, Khaki Z, Rahbari S, Kazemi B, Amoli JS, Gharabaghi A, et al. Hematologic and Clinical Aspects of Experimental Ovine Anaplasmosis Caused by Anaplasma Ovis in Iran. Iranial Juornal of parasitology. 2012; 7(4): p. 92-96.
34. Jalali SM, Jolodar A, Rasooli A, Darabifard A. Detection of Theileria lestoquardi cross infection in cattle with clinical theileriosis in Iran. DE GRUYTER. 2016; 61(4): p. 756–760.
35. Faraj AA, Kamal MA. Clinical, hematological and diagnostic studies of Hemomycoplazma infection (Mycoplasma ovis). BASRAH JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH. 2017; 16(2): p. 285-290.
36. Hussein NM, Mohammed ES, Hassan AA, Mohamed. K. Distribution Pattern of Babesia and Theileria Species in Sheep in Qena Province, Upper Egypt. Archives of Parasitology. 2017; 1(1): p. 102.
