KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Danielius Serapinas
ALFA-1 ANTITRIPSINO
POVEIKIS MONOCITŲ
AKTYVUMUI IN VITRO BEI
GENOTIPO ĮTAKA
LĖTINĖS OBSTRUKCINĖS
PLAUČIŲ LIGOS
YPATUMAMS
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, medicina (07 B)
Disertacija rengta 2005–2009 metais Kauno medicinos universiteto Pulmo-nologijos ir imuPulmo-nologijos klinikoje.
Mokslinis vadovas
Prof. dr. Raimundas Sakalauskas (Kauno medicinos universitetas, biome-dicinos mokslai, medicina – 07 B)
Konsultantė
Prof. dr. Sabina Jančiauskienė (Kauno medicinos universitetas, biomedi-cinos mokslai, medicina – 07 B)
TURINYS
SANTRAUPOS... 6
ĮVADAS ... 7
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS ... 10
3. LITERATŪROS APŽVALGA... 11
3.1 Monocitų funkciniai ypatumai ... 11
3.1.1 Monocitų funkcijos bei įtaka uždegimui... 11
3.1.2 Monocitų aktyvumo reguliacija: CD14 žymens ekspresija ir sekrecija ... 16
3.2 Alfa-1 antitripsino svarba antiproteazinėje apsaugoje bei uždegiminiame procese ... 19
3.2.1 Proteazinė – antiproteazinė sistema ir jos fiziologinė reikšmė... 19
3.2.2 Alfa-1 antitripsino struktūra... 22
3.2.3 Alfa-1 antitripsino uždegimą moduliuojančios savybės ... 24
3.2.4 Alfa-1 antitripsino deficitą lemiantys genotipai ... 26
3.3 Lėtinės obstrukcinės plaučių ligos etiopatogenezė ... 29
3.3.1 Lėtinės obstrukcinės plaučių ligos rizikos veiksniai... 29
3.3.2 Genetinį polinkį LOPL sąlygojantys veiksniai ... 31
3.3.3 Uždegimas LOPL patogenezėje... 35
4. TYRIMO METODIKA... 46
4.1 Alfa-1 antitripsino poveikio bakteriniu endotoksinu stimuliuotiems monocitams tyrimas ... 46
4.1.1 Monocitų išskyrimas ir kultivavimas... 47
4.1.2 sCD14 ir TNFα koncentracijos matavimas monocitų terpėje... 47
4.1.3 Membraninio monocitų diferenciacijos žymens CD14 mRNR ekspresijos analizė... 49
4.1.4 Western blot analizė ir tėkmės citometrija tiriant membraninio monocitų diferencijacijos žymens
CD14 ekpresiją... 49
4.2 Sergančiųjų LOPL alfa-1 antitripsino genotipų ir AAT, CD14, CRB, TNFα, TNFR-1, TNFR-2 koncentacijos serume tyrimas ... 50
4.2.1 Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga ... 50
4.2.2 Tyrimo metodai ... 52
4.2.2.1 Spirometrija... 52
4.2.2.2 Pacientų kraujo bandinių surinkimas ... 53
4.2.2.3 Serumo alfa-1 antitripsino, CRB, CD14, TNFα, TNFR-1 ir TNFR-2 koncentracijos nustatymas... 53
4.2.2.4 Kokybinis alfa-1 antitripsino PI*Z alelio nustatymas... 53
4.2.2.5 Alfa-1 antitripsino fenotipo nustatymas izoelektriniu fokusavimu... 55
4.3 Duomenų analizė... 58
5. REZULTATAI ... 60
5.1 Alfa-1 antitripsino poveikis bakteriniu endotoksinu stimuliuotiems monocitams... 60
5.1.1 Alfa-1 antitripsino poveikis monocitų diferenciacijos žymens CD14 sekrecijai ir ekspresijai ... 60
5.1.2 Alfa-1 antitripsino poveikis bakteriniu endotoksinu stimuliuotų monocitų TNFα sekrecijai ... 64
5.2 Sergančiųjų lėtine obstrukcine plaučių liga alfa-1 antitripsino genotipai ir alfa-1 antitripsino, CRB, CD14, TNFα, TNFR-1, TNFR-2 koncentracija serume ... 67
5.2.1 Sergančiųjų lėtine obstrukcine plaučių liga alfa-1 antitripsino genotipai ir PI*S ir PI*Z alelių dažnis... 67
5.2.2 Lėtinės obstrukcinės plaučių ligos ypatumai, esant skirtingiems alfa-1 antitripsino genotipams... 71
5.2.3 Sergančiųjų lėtine obstrukcine plaučių liga alfa-1 antitripsino, CRB, CD14, TNFα, TNFR-1 ir TNFR-2 koncentracija esant skirtingiems alfa-1 antitripsino genotipams ... 72
6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 80
6.1 Alfa-1 antitripsino poveikis bakteriniu endotoksinu stimuliuotiems monocitams ... 80
6.2 Sergančiųjų lėtine obstrukcine plaučių liga alfa-1 antitripsino genotipai bei alfa-1 antitripsino, CD14, CRB, TNFα, TNFR-1 ir TNFR-2 koncentracija serume ... 85
6.2.1 Sergančiųjų lėtine obstrukcine plaučių liga alfa-1 antitripsino genotipai bei PI*Z ir PI*S alelių dažnis ... 85
6.2.2 Sergančiųjų lėtine obstrukcine plaučių liga alfa-1 antitripsino, CD14, CRB, TNFα, TNFR-1 ir TNFR-2 koncentracija serume, esant skirtingiems alfa-1 antitripsino genotipams... 88
IŠVADOS... 93
DARBO PRAKTINĖ REIKŠMĖ ... 94
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 95
PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA ... 112
SANTRAUPOS
AAT – alfa-1 antitripsinas
BAL – bronchoalveolinis lavažas
CD – leukocitų diferenciacijos antigenai (angl. cluster of differentiation)
CRB – C reaktyvusis baltymas
ELISA – imunofermentinė analizė (angl. enzyme-linked immunosorbent assay)
ERS – Europos respiratologų sąjunga (angl. European Respiratory Society)
FVC – forsuota gyvybinė plaučių talpa (angl. forced vital capasity) FEV1 – forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę (angl. forced
expiratory volume in 1sec.)
GOLD – Pasaulinė lėtinės obstrukcinės plaučių ligos iniciatyva (angl. Global Initiative for Chronic obstructive Lung Disease) IL – interleukinas
LOPL – lėtinė obstrukcinė plaučių liga LPS – lipopolisacharidas
MMP – matrikso metaloproteazė
µg – mikrogramai pg – pikogramai
PI – pasikliautinasis intervalas PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija
SEM – standartinė vidurkio paklaida (angl. standart error mean) SD – standartinis nuokrypis (angl. standart deviation)
ŠS – šansų santykis
TGF – transformuojantis augimo faktorius (angl. transforming growth factor)
TNFα – naviko nekrozės faktorius-α (angl. tumour necrosis factor-α) TNFR – naviko nekrozės faktoriaus-α receptorius (angl. tumour
ĮVADAS
Pirminė alfa-1 antitripsino funkcija yra blokuoti neutrofilų elastazę bei kitas proteazes, tačiau naujausi moksliniai tyrimai rodo, kad alfa-1 antitrip-sinas turi poveikį imuniniam atsakui, uždegimo moduliavimui, navikiniam procesui bei apoptozei [22, 142]. Iki šiol nežinomi mechanizmai, kuriais alfa-1 antitripsinas veikia uždegime ir imuniniame atsake dalyvaujančias ląsteles. Nors jau įrodyta, kad įgimtas alfa-1 antitripsino deficitas yra vienas geriausiai žinomų genetinių rizikos veiksnių sirgti lėtine obstrukcine plaučių liga (LOPL) [5, 126], tačiau LOPL patogenezė nėra pilnai ištirta. Pasta-raisiais metais mokslinėje literatūroje pateikiami duomenys, kad alfa-1 antitripsino deficitą lemiantys genotipai gali paskatinti LOPL atsiradimą ne tik dėl jo antiproteazinės funkcijos netekimo, bet ir dėl uždegimą skatinan–
čių savybių [83, 84]. Minėtas alfa-1 antitripsino savybes, nesusijusias su
antiproteaziniu veikimu tiksliausiai padeda išaiškinti eksperimentiniai tyrimai su ląstelėmis, ypač monocitais.
Monocitai ypač svarbūs organizmo apsaugoje nuo infekcijų bei yra pir-minė uždegime dalyvaujanti ląstelė, iš kurios diferencijuojasi makrofagai ir dendritinės ląstelės [14]. Monocitų membranoje esantis diferenciacijos žymuo CD14 yra būtinas bakterinių endotoksinų atpažinimui ir nukenksmi-nimui [91, 96, 161, 187]. Mokslinių tyrimų rezultatai rodo, kad CD14 ypač svarbus plaučių audinyje neutralizuojant bakterinius endotoksinus (lipopo-lisacharidus) [160]. Bakterijų sienelės komponentams jungiantis prie mo-nocitų CD14 žymens, plaučiuose vyksta bakterijų nukenksminimas nesant uždegimo [136]. Jei organizmo imuninė sistema nesugeba neutralizuoti pa-tekusio mikroorganizmo, gali prasidėti lėtinis uždegimas [109]. Jam būdingas monocitų-makrofagų ir kitų uždegime dalyvaujančių ląstelių bei jų išskiriamų citokinų kaupimasis uždegimo židinyje [3, 171]. Tačiau mažai žinomi mechanizmai, kurie reguliuoja monocitų aktyvumą užtikrinant adekvačią CD14 ekspresiją bei sekreciją. Tyrime įvertinome alfa-1 antitrip-sino poveikį bakteriniu lipopolisacharidu stimuliuotų monocitų CD14 žymens ekspresijai ir sekrecijai.
Lietuvoje alfa-1 antitripsino genotipų paplitimas tarp sergančiųjų LOPL nežinomas. Europoje alfa-1 antitripsino deficitą lemiančio genotipo PIZZ dažnis labai įvairus ir svyruoja nuo 0,1 iki 8 proc. visų sergančiųjų LOPL [16, 17, 44]. Dauguma LOPL atvejų nėra nulemti genetinių defektų, nes LOPL genezėje dalyvauja ne vienas veiksnys, bet tarpusavyje sąveikauja daugelis tiek aplinkos, tiek endogeninių – genetinių veiksnių [39, 70].
Nors alfa-1 antitripsino deficitas yra įrodytas genetinis rizikos faktorius susirgti LOPL, tačiau nepriklausomai nuo predisponuojančių veiksnių
LOPL patogenezėje svarbus lėtinis uždegimas [4, 61, 72, 79]. Rūkymo pasėkoje vyksta uždegiminių ląstelių (monocitų, makrofagų, limfocitų, neutrofilų, o ligai paūmėjus – ir eozinofilų) migracija į kvėpavimo takus ir plaučius [149, 198]. Įrodyta, kad LOPL progresavimo intensyvumui turi
įtakos bakterinių paūmėjimų skaičius bei trukmė [28, 131]. Manoma, kad
infekcinių susirgimų metu skatinamas lėtinio kvėpavimo takų uždegimo paūmėjimas, kurio pasėkoje išsiskiriančios medžiagos skatina kvėpavimo takų fibrozę ir remodeliavimą [6, 30]. Naujausi literatūros duomenys rodo, kad LOPL patogenezei yra svarbus ne tik uždegiminių ląstelių kiekio padidėjimas kvėpavimo takuose, bet ir jų aktyvumas bei funkcinės savybės [109]. Nustatyta, kad sergančiųjų LOPL imuninis atsakas gali būti silpnesnis dėl monocitų aktyvumo sumažėjimo [109, 137]. Tačiau bet kuriuo atveju uždegimą plaučiuose palaiko oksidacinis stresas, proteazių poveikis bei uždegimo mediatoriai [1, 25, 114]. Sergančiųjų LOPL uždegimo mediatorių sąlygojami pokyčiai gali lemti skirtingus LOPL fenotipus, jautrumą ar atsparumą vaistams ir prognostines charakteristikas [71, 198], tačiau nėra žinoma kaip tarpusavyje sąveikauja uždegimo mediatoriai sergantiesiems LOPL, turintiems įgimtą alfa-1 antitripsino deficitą.
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Ištirti alfa-1 antitripsino poveikį monocitų aktyvumui in vitro bei nusta-tyti sergančiųjų lėtine obstrukcine plaučių liga alfa-1 antitripsino deficitą lemiančius genotipus ir jų įtaką ligos ypatumams.
Darbo uždaviniai
1. Ištirti alfa-1 antitripsino poveikį monocitų aktyvumui, įvertinant monocitų diferenciacijos žymens CD14 ekspresiją ir sekreciją. 2. Ištirti alfa-1 antitripsino poveikį bakteriniu endotoksinu stimuliuotų
monocitų TNFα sekrecijai.
3. Nustatyti alfa-1 antitripsino deficitą lemiančius genotipus bei PI*Z ir PI*S alelių dažnį sergantiesiems lėtine obstrukcine plaučių liga. 4. Įvertinti sergančiųjų lėtine obstrukcine plaučių liga ventiliacinę
plaučių funkciją, esant skirtingiems alfa-1 antitripsino genotipams. 5. Įvertinti ir palyginti uždegimo mediatorių koncentraciją
sergantiesiems lėtine obstrukcine plaučių liga, turintiems ir neturintiems alfa-1 antitripsino deficitą, priklausomai nuo rūkymo
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS
Naujausių mokslinių tyrimų duomenys parodė, kad dalis alfa-1 antitrip-sino savybių pasireiškia nepriklausomai nuo jo antiproteazinio veikimo. Šio tyrimo metu tirtos alfa-1 antitripsino uždegimą moduliuojančios savybės ir nustatyti iki šiol nežinomi mechanizmai, kuriais alfa-1 antitripsinas reguliuoja monocitų aktyvumą bei atsaką į bakterinį endotoksiną. Monocitai ir jų kilmės ląstelės (makrofagai, dendritinės ląstelės) yra svarbios organiz-mo apsaugoje nuo patogeninių mikrobų bei uždegiminiam procesui. Mono-citų funkcijų ir aktyvumo analizė yra svarbi LOPL ir kitų lėtinių uždegi-minių ligų geresniam genezės supratimui bei naujų gydymo metodų kūri-mui. Mūsų tyrimo rezultatai įrodė, kad, dalyvaujant monocitų diferencia-cijos žymeniui CD14, staigus alfa-1 antitripsino koncentradiferencia-cijos padidėjimas
įvairių uždegiminių ir infekcinių būklių metu pradžioje gali sustiprinti
monocitų atsaką į bakterinę infekciją, o vėliau pagreitinti uždegiminių reakcijų nuslopinimą apsaugant monocitus nuo hiperstimuliacijos.
Moksliniame darbe įvertintas iki šiol Lietuvoje netirtas alfa-1 antitripsino deficitą lemiančių genotipų bei PI*Z ir PI*S alelių dažnis sergantiesiems LOPL. Taip pat įvertintos nustatytų alfa-1 antitripsino genotipų sąsajos su sergančiųjų LOPL plaučių funkcija. Gauti rezultatai papildo duomenis apie LOPL fenotipų raiškos ypatumus turintiems ir neturintiems įgimto alfa-1 antitripsino deficito.
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1 Monocitų funkciniai ypatumai 3.1.1 Monocitų funkcijos bei įtaka uždegimui
Monocitai ir jų kilmės ląstelės (makrofagai, dendritinės ląstelės) daly-vauja svarbiuose uždegimo ir imuninio atsako procesuose: fagocitozėje, gaminant citokinus (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNFα), pateikiant anti-geną T limfocitams [14, 171].
Monocitai formuojasi iš kaulų čiulpų mieloidinės kilmės ląstelių [14]. Subrendę monocitai iš kaulų čiulpų patenka į sisteminę kraujotaką, kur cirkuliuoja apie 3–4 dienas. Vėliau jie per kraujagyslių sieneles migruoja į audinius, kur transformuojasi į didesnes fagocituojančias ląsteles – makro-fagus arba dendritines ląsteles [3]. Vykstant infekciniam ar neinfekciniam uždegimui, monocitų gamyba bei migracija į audinius ypač suaktyvėja [173]. Makrofagai priklausomai nuo audinio tipo, kuriame jie randasi, yra skirstomi į plaučių alveolinius makrofagus, kaulų osteoklastus, odos histiocitus bei smegenų mikroglijos ląsteles [14]. Monocitų paviršiuje esantys diferenciacijos žymenys CD (angl. cluster of diferentiation) nulemia monocitų tipą. Visi monocitai turi žymenį CD14 (CD14++ monocitai), tačiau tik 10 proc. visų monocitų ekspresuoja žymenį CD16 (CD14+CD16+ monocitai) [171]. CD14+CD16+ monocitų ypač padaugėja infekcinių susirgimų metu. Palyginus su klasikiniais monocitais, CD14+CD16+ monocitai pasižymi stipriu uždegimą skatinančiu poveikiu: gamina didesnį kiekį uždegimą skatinančio citokino TNFα, o uždegimą slopinančio IL-10 gamina mažai arba visai negamina [14, 171].
Jau pirmosiomis ūmaus uždegimo valandomis monocitai išeina už kraujagyslių sienelės ribų ir pradeda migruoti į uždegimo židinį [173]. Kai monocitus suaktyvina chemoatraktantai, jų paviršiaus molekulės LFA-1 (angl. lymphocyte function-associated antigen-1) tampa artimesnės krauja-gyslių sienelės ligandui ICAM-1 (angl. Inter-Cellular Adhesion Molecule1) ir jie tvirtai prilimpa prie endotelio [3]. Po adhezijos prie endotelio monocitas pereina pro kraujagyslės sienelę tarp endotelio ląstelių, veikiant adhezijos molekulėms CD31, kurių yra endotelio ląstelių plyšiuose. Ši sąveika sąlygoja monocito „išspaudimą“ tarp endotelio ląstelių. Kapiliaro bazinę membraną jis perskrodžia veikiant lizosominiams fermentams ir katijoniniams baltymams. Išėję iš kraujagyslės, monocitai juda į uždegimo židinį veikiant chemotaksį sukeliančių medžiagų [3, 45]. Chemokinai yra citokinų grupė, kuri skatina uždegimo ląstelių (monocitų/makrofagų, neutro-filų, limfocitų) chemotaksį. Chemotaksiniu poveikiu pasižymi egzogeninės
ir endogeninės medžiagos. Egzogeninėms chemotaksinėms medžiagoms priskiriamos įvairios mikroorganizmų medžiagos – tai peptidai, turintieji galinę aminorūgštį N-formil-metioniną. Endogeniniams chemoatraktantams priklauso komplemento sistemos komponentai, lipoksigenazinio arachidono rūgšties metabolito medžiagos, ypač leukotrienas B4 (LTB4), citokinai, ypač IL-8 ir monocitų chemotaksio faktorius-1 (MCP-1). MCP-1 yra ypač svarbus kryptingai monocitų/makrofagų migracijai į uždegimo židinį [45]. IL-8 sintezuojams aktyvintų makrofagų, endotelio ląstelių ar fibroblastų ir neutrofilų yra stiprus neutrofilų chemoatraktantas [3].
Audiniuose iš monocitų diferencijuojasi makrofagai ir dendritinės ląste-lės, kurie reaguodami į kitų uždegimo tarpininkų siunčiamus aktyvinančius signalus sekretuoja biologiškai aktyvias medžiagas – citokinus, proteinazes, sąlygojančius ne tik atskirų ląstelių, bet ir audinių pažeidimus, irimą ir kitus uždegimui būdingus pokyčius [3, 150]. Šios ląstelės sudaro mononuklearų makrofaginę sistemą, kuriai priskiriami kaulų čiulpų monocitų pirmtakai, kraujo monocitai, audinių makrofagai bei dendritinės ląstelės. Makrofagai fagocituoja didesnes nei 6 nm daleles, ne tik mikroorganizmus, bet ir savo funkciją atlikusias bei žuvusias ląsteles (pvz. eritrocitus, fagocitavusius neutrofilus) [47]. Skirtingai nei neutrofilai, makrofagai – ilgaamžės ląstelės. Fiziologinėmis sąlygomis jų gyvavimo periodas gali trukti iki 0,5 - 2 metų [3]. Skirtingai nei makrofagai, iš monocitų diferencijavusios dendritinės ląstelės turi silpną proteolitinę funkciją, tačiau efektyviai geba fagocituoti pakitusias, infekuotas ar žuvusias ląsteles [173].
Aktyvuoti monocitai ir makrofagai išskiria citokinus (1, 6, 8, IL-10, IL-12, TNFα) [14]. Citokinų sintezę skatina mikrobų endotoksinai, imuniniai kompleksai, fizinis pažeidimas, kiti uždegimo mediatoriai. Citoki-nai gali veikti tas pačias ląsteles- monocitus (autokrininis poveikis), šalia esančias ląsteles (parakrininis poveikis) arba sistemiškai (endokrininis povei-kis) [3]. Pastebėta, kad bakteriemijos metu, prieš padidėjant CD14+CD16+ monocitų kiekiui ryškai padidėja serumo uždegiminių citokinų koncentracija [203]. Tai rodo, kad kraujo CD14+CD16+ monocitozę skatina citokinai. Monocitų baktericidines funkcijas ypač aktyvina γIFN, IL-1 ir TNFα. TNFα yra vienas svarbiausių uždegiminių citokinų, kuris daugiausia gaminamas aktyvuotųjų monocitų, makrofagų ir T limfocitų [3]. TNFα ne visada aptinkamas sveikų žmonių serume ir audiniuose, tačiau didesnis kiekis aptinkamas uždegiminių ir infekcinių būklių metu [190]. TNFα veikia per du receptorius, esančius ant įvairių organizmo audinių ląstelių paviršiaus (membraniniai TNF receptoriai mTNFR-1 ir mTNFR-2) [2]. Abu receptoriai gali būti atskelti nuo membranos paviršiaus ir tapti tirpia TNF receptoriaus forma (sTNFR-1 ir sTNFR-2), kurie gali tapti TNFα ligandu ir konkuruoti, prisijungdami prie mTNFR, kartu slopindami TNFα poveikį audiniams [103,
181]. Todėl tirpios receptorių formos gali būti laikomos natūraliais TNFα antagonistais. Esant mažoms sTNFR koncentracijoms, yra didinamas TNFα aktyvumas, stabilizuojant TNFα molekules bei sudarant geresnes TNFα prisijungimo prie mTNFR sąlygas [2]. Suintensyvėjusi sTNFR gamyba yra būtina slopinant TNFα aktyvumą.
IL-1, IL-6, TNFα sukelia sisteminį ūminės fazės atsaką veikiant įvai-riems mechanizmams. IL-1 ir IL-6 skatina neutrofilų išėjimą iš kaulų čiulpų ir patekimą į cirkuliaciją. Monocitų sekretuojami IL-1, IL-6 ir TNFα skatina
ūminės fazės baltymų sintezę hepatocituose [3, 166]. Alfa-1 antitripsinas ir
afa-1 antichimotripsinas būdami proteazių inhibitoriais, inaktyvina neutro-filų ir makrofagų lizosomų fermentus – proteazes, kurios sukelia audinių alteraciją uždegimo ir audinių pažeidimo metu. C-reaktyvusis baltymas – jungiasi prie mikrobo membranos fosforilcholino, jį opsonizuoja ir makrofagams padeda įsiurbti opsonizuotas daleles, be to aktyvina komplemento sistemą klasikiniu būdu [3].
Aktyvuoti monocitai bei makrofagai veikiant TNFα uždegimo židinyje sintezuoja azoto oksidą (NO) bei aktyvius deguonies radikalus, kuriuos patys naudoja kaip citotoksinį metabolitą mikrobams bei naviko ląstelėms ardyti [3, 113]. NO taip pat atpalaiduoja kraujagyslių lygiuosius raumenis, slopina trombocitų agregaciją bei degranuliaciją. Laisvieji deguonies radi-kalai yra sintetinami, dalyvaujant fermentui NADF.H oksidazei, ir išsiskiria iš neutrofilų, monocitų ir makrofagų, juos suaktyvinus chemotaktinėms medžiagoms bei vykstant mikrobų fagocitozei. Superoksido anijonas (O2)
vėliau gali virsti H2O2, OH, NO2. Šie trumpai veikiantys mediatoriai padeda
suardyti monocitų/makrofagų fagocituotus mikrobus, aktyvina proteazes, pažeidžia kraujagyslių endotelio ląsteles, didina jų pralaidumą, tromboge-nezę [113].
Vykstant uždegimui makrofagai pašalina ir žuvusius neutrofilus, kurie žūdami savo paviršiuje pradeda sintetinti fosfatidilserino liekanas [113]. Neutrofilų plazminės membranos paviršiuje atsirandančios fosfatidilserino liekanos – signalas makrofagams fagocituoti apoptozės būdu žūvančius neutrofilus [47]. Literatūroje daugėja duomenų, jog neutrofilai, išskirdami savo granulėse esančius baltymus įtakoja kitų ląstelių, ypatingai monocitų bei makrofagų, funkcines savybes [113]. Teigiama, jog apoptozės būdu žūdami neutrofilai netgi geba perduoti kai kurias savo funkcines savybes juos fagocituojantiems makrofagams [176] ir toliau tęsti uždegiminius procesus bei skatinti aktyvintų uždegimui tarpininkaujančių ląstelių (neutrofilų, monocitų bei makrofagų) chemotaksį į užsitęsusio uždegimo zoną. Vykstant fiziologinei ląstelių mirčiai – apoptozei, ląstelės yra pašali-namos fagocitozės būdu nevykstant uždegiminiam procesui [113]. Nusta-tyta, kad membraninis monocitų ir makrofagų paviršiuje esantis žymuo
CD14 yra svarbus apoptotinių ląstelių atpažinimui ir pašalinimui [47]. CD14 taip pat yra receptorius prisijungiant bakteriniam LPS ir sukeliant uždegiminę reakciją. Tačiau, prisijungusios prie CD14 žymens, apoptotinės ląstelės, skirtingai nei LPS, neskatina monocitų ir makrofagų gaminti uždegiminių citokinų. Tai rodo, kad apoptotinių ląstelų pašalinimas susijęs su receptoriumi, kurio sąveika su „svetimais“ komponentais (LPS) ir „nuosavais“ (apoptotinėmis ląstelėmis), sąlygoja skirtingą monocitų bei makrofagų atsaką [47].
Įgimto imuniteto reakcijos dalyvaujant monocitams ir makrofagams ypač
svarbios gleivinių apsaugoje nuo mikroorganizmų. Bronchų ir alveolių paviršius yra svarbūs patogeninių mikroorganizmų patekimo vartai. Būtent monocitų kilmės ląstelės - makrofagai, mažiau dendritinės ląstelės sudaro gynybinį barjerą apsaugantį kvėpavimo takus nuo su oru įkvepiamų infekcinių, toksinių ar alerginių dalelių [150]. Alveoliniai ir plaučių makrofagai bei dendritinės ląstelės esančios kvėpavimo takuose turi savitą fenotipą ir skiriasi nuo kitų audinių analogiškų ląstelių [65, 150]. Alveolinių makrofagų gyvenimo trukmė pakankamai ilga. Tik metų eigoje 40–60 proc. jų pasikeičia naujais. Esant infekcijai ar lėtiniam uždegimui makrofagų gyvybinis ciklas suintensyvėja bei padidėja jų kiekis kvėpavimo takų paviršiuje [128]. Pasaulyje atliktų mokslinių ir klinikinių tyrimų metu nustatyta, jog sergant LOPL, makrofagai didesniais kiekiais kaupiasi alveolėse, bronchiolėse ir smulkiuosiuose kvėpavimo takuose [150, 109]. Sergantiesiems LOPL šios ląstelės yra pagrindinės kvėpavimo takų sekreto uždegiminės ląstelės, sudarančios 80–90 proc. visų bronchoalveolinio lavažo (BAL) skystyje esančių ląstelių [109].
Yra duomenų rodančių, kad LOPL progresavimo greitis tiesiogiai koreliuoja su bakterinių paūmėjimų skaičiumi [28]. Manoma, kad infekcinių susirgimų metu skatinamas lėtinio kvėpavimo takų uždegimo paūmėjimas, kurio pasėkoje išsiskiriančios medžiagos skatina kvėpavimo takų fibrozę ir remodeliavimą. Naujausi literatūros duomenys rodo, kad LOPL patogenezei yra svarbus ne tik uždegiminių ląstelių kiekio padidėjimas kvėpavimo takuose, bet ir jų aktyvumas bei funkcinės savybės [109]. Aptikta, kad LOPL sergančiųjų alveoliniai makrofagai ekspresuoja mažesnį kiekį CD86 ir CD11a žymenų, kurie atsakingi už makrofagų antigeną pateikiančią funkciją [109]. To pasėkoje sudaromos geresnės sąlygos infekcijos persista-vimui LOPL segančiųjų kvėpavimo takuose. Dalis skirtumų makrofagų struktūroje buvo aptikta palyginus rūkančiuosius ir nerūkančiuosius [109, 175]. Tai rodo, kad rūkymas per se gali būti susijęs su makrofagų fenotipu. Tačiau galimas ir atvirkštinis mechanizmas kai nuo pradžių esantis imuno-kompetentinių ląstelių funkcijų nepakankamumas sudaro sąlygas LOPL atsiradimui. Įrodyta, kad TLR receptorių ekspresija monocitų paviršiuje yra
svarbi mikroorganizmų atpažinime ir nukenksminime. Svarbi studija, kurios rezultatai parodė, kad netgi stabilia LOPL sergančiųjų monocitai savo pavir-šiuje ekspresavo mažesnį kiekį TLR2 ir TLR4 [137]. Be to šių receptorių ekspresijos intensyvumas teigiamai koreliavo su plaučių funkcijos rodmenimis (FEV1 ir FVC) [137]. Tai rodo, kad LOPL sergančiųjų imuninis
atsakas gali būti silpnesnis. Taigi monocitų, makrofagų bei dendritinių ląstelių vaidmuo organizmo apsaugoje yra svarbus ne tik apsaugant nuo
ūmios infekcijos, bet ir daugelio lėtinių uždegiminių ligų, kurių
progre-savimą skatina bakterinės infekcijos, prevencijoje [14].
Dalyvaudami imuninių reakcijų reguliacijoje monocitai, makrofagai bei dendritinės ląstelės sąveikauja ir su kitomis ląstelėmis. Aktyvuoti mono-nuklearai pateikia antigeną T limfocitams ir natūralioms ląstelėms žudikėms (NK), aktyvina bei palaiko limfocitų subpopuliacijų pusiausvyrą [171]. Stipriausiai minėta funkcija pasižymi dendritinės ląstelės [173]. T limfocitai taipogi turi įtakos monocitų-makrofagų sistemos aktyvumui: T limfocitams helperiams (TH1) per adhezijos molekules prisitvirtinus prie makrofago
membranoje ekspresuojamo peptido MHC II, TH1 aktyvinami ir pradeda
sintetinti efektorines molekules. Šių medžiagų poveikis monocitams ir makrofagus įvairus: gama-interferonas (IFNγ) stiprus monocitų, makrofagų bei neutrofilų aktyvintojas, skatina laisvųjų deguonies radikalų gamybą ir padeda fagocituotus mikrobus suardyti sparčiau; IL-3 ir GM-CSF (granuliocitų–monocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius) skatina monoci-tų diferenciaciją kaulų čiulpuose; TNFα ir TNFβ didina adhezijos molekulių sintezę endotelio membranoje, skatina jų ekstravazaciją [160]. O TH2 turi
atvirkštinį poveikį monocitų - makrofagų aktyvumui: gamindami IL-4, IL-10, IL-13 jie inaktyvina monocitus bei makrofagus, tuo pačiu slopindami uždegimą [3].
CD14+CD16+ monocitai (kaip ir neutrofilai, NK ląstelės) savo paviršiuje ekspresuoja FcγRIII receptorių (CD16 žymenį), kuris atpažįsta sujungtus su antigenu IgG Fc fragmentus [14, 171]. Per jį prisijungę prie ląstelės taikinio, monocitai aktyvinami. Jų išskiriami granulių baltymai ir sekretuojamas TNFα yra toksiški ląstelėms taikiniams. Pagal šį nuo antikūnų priklausomą ląstelių citotoksiškumo mechanizmą gali būti sunaikinami kai kurie antikūnais padengti patogenai (pvz., helmintai), taip pat virusais infekuotos ir auglių ląstelės [160]. Dalis monocitų ekspresuoja CD64 žymenį kuris yra FcγRI – tai didelio afiniškumo receptorius imunoglobulinui G (IgG), aktyvinantis fagocitozę [160].
Ūminio uždegimo metu, kai pakitusi ląstelė ar mikrobas yra suardytas,
makrofagas arba žūva arba patenka į limfinę sistemą. Tuo tarpu lėtiniam uždegimui būdingas jų kaupimasis uždegimo židinyje [3]. Prie to prisideda
ir limfocitų išskiriamos medžiagos, slopinančios makrofagų migraciją [173]. Lėtinio uždegimo metu aktyvinti makrofagai išskiria didelius kiekius IL-1 ir TNFα, aktyvius deguonies radikalus, NO, rūgščias proteazes, komplemento komponentus, eukozanoidus – prostaglandinus ir leukotrienus [160]. To pasėkoje audinių pažeidimo vietoje vyksta fibroblastų ir lygiųjų raumenų ląstelių proliferacija, kuri yra svarbi daugelio lėtinių uždegiminių ligų patogenezei (astmos, lėtinės obstrukcinės plaučių ligos, reumatoidinio artrito, glomerulonefrito ir kt.) [138, 150, 168].
3.1.2 Monocitų aktyvumo reguliacija: CD14 žymens ekspresija ir sekrecija
Monocitų diferenciacijos žymuo CD14 yra 55 kD svorio glikoproteinas, kuris yra ekspresuojamas brandžių monocitų membranos paviršiuje (mCD14) [96]. Egzistuoja ir tirpi CD14 forma (sCD14), kurią monocitai sekretuoja už ląstelės ribų [187]. CD14 ypač svarbus įgimto imuniteto reakcijose ir yra būtinas nuo lipopolisacharido (LPS) priklausomam monocitų aktyvumui. Monocitų aktyvumą skatina adhezijos molekulių, chemotaktinių veiksnių siunčiami signalai bei stimuliacija bakterinės kilmės produktais: LPS, peptidoglikanu arba S-(2,3–bis(palmytoyloxy)-(2-RS)-propyl)-N-palmitoyl-(R)-Cys-(S)-LysOH,trihidrochloride (Pam3Cys) [14].
LPS yra daugumos Gram neigiamų bakterijų išoriniame ląstelės sluoks-nyje [3]. Šis LPS vadinamas endotoksinu, nes yra susietas su bakterija ir išsiskiria tik tada, kai mikroorganizmas žūva. Uždegiminė reakcija į LPS yra svarbi apsaugant organizmą nuo patogeninių bakterijų, tačiau perteklinė citokinų gamyba gali būti žalinga [135, 148]. Tiek LPS, tiek Pam3Cys jungiasi prie monocitų bei makrofagų paviršiaus dalyvaujant CD14 žymenims, kurie atlieka minėtiems ligandams receptorių funkciją [121]. LPS signalas į monocitų vidų perduodamas per vidinėje ląstelės membranos dalyje esantį TLR4 (taurinis ląstelių receptorius, angl. toll-like receptor), o Pam3Cys signalas per analogišką TLR2 receptorių [14]. LPS afinitetą prisijungimui prie CD14 reguliuoja LPS-sujungiantis baltymas, kuris yra
ūmios fazės baltymas, gaminamas kepenyse uždegiminių būklių metu [102].
TLR yra grupė receptorių, kurie atpažįsta bakterijų sienelės ir DNR komponentus. Netgi eksperimentai su pelėmis parodė, kad TLR4 yra susijęs su reakcija į LPS. Pakitusi TLR4 struktūra sąlygoja susilpnintą reakciją į LPS. Analogiškus rezultatus pateikia studijos, rodančios, kad pas žmogų TLR4 receptoriaus mutacija sąlygoja nepakankamą organizmo atsaką į LPS [7].
CD14 atlieka TLR4 koreceptoriaus vaidmenį ir moduliuoja monocitų bei makrofagų jautrumą LPS. Reakcijos metu CD14 suformuoja junginį su LPS
ir LPS sujungiančiu baltymu [91, 136]. Egzistuoja du CD14 susijungimo reakcijos su LPS būdai. Viena vertus LPS jungiasi prie membraninės formos monocitų mCD14 žymenų (3.1.2.1 pav.). Kita vertus tirpus CD14 žymuo susijungia su LPS, esančiu sisteminėje kraujotakoje arba audiniuose. LPS dalyvaujant CD14 žymeniui per TLR4 receptorių sąlygoja su NF-κB (branduolio transkripcijos faktorius-κB, angl. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) sistema susijusį imuninį atsaką [141]. NF-κB yra baltymų kompleksas, kuris veikia kaip transkripcijos faktorius. NF-κB dalyvauja ląstelių atsake į stresą, bakterinę ar virusinę infekciją bei citokinų poveikį [141]. NF-κB ypač svarbus vykstant imuniniam atsakui į infekciją ir atlieka svarbų vaidmenį lėtinių uždegiminių ar autoimuninių ligų metu, nes jo aktyvacija skatina monocitų bei makrofagų uždegimą sąlygojančių citokinų (TNFα, IL-1 IL-6 ir IL-8) genų ekspresiją [9]. Kuo didesnė mCD14 žymens ekspresija, tuo stipriau monocitai sureaguoja į bakterinį endotoksiną. Viena vertus, esant mažai mCD14 ekspresijai, monocitai gali būti nepakankamai aktyvūs, kad apsaugotų organizmą nuo bakterinės infekcijos. Kita vertus, gausi mCD14 ekspresija, vykstant stipriai monocitų stimuliacijai, esant masyviai bakteriemijai, gali sąlygoti stiprų uždegiminį atsaką su gausiu citokinų išsiskyrimu. Ši monocitų hiperstimuliacija bakteriniu LPS gali baigtis netgi septiniu šoku [135, 141].
Tirpios sCD14 formos funkcijos organizme nėra gerai ištirtos, o literatū-ros duomenys gana prieštaringi. sCD14 priklausomai nuo koncentracijos, lokalizacijos organizme gali netgi slopinti monocitų atsaką į bakterinį LPS [161]. Ūmaus uždegimo ar infekcijos metu sCD14 koncentracija plazmoje ir tarpląsteliniame audinyje padidėja. Tai sąlygoja serino proteazės (ypač neutrofilų elastazė), kurios nuskelia membraninius mCD14 žymenis nuo monocitų membranos ir paverčia juos tirpiais sCD14 [136, 155]. Taigi sCD14 slopina monocitų aktyvumą inhibuojant ryškų LPS poveikį membra-niniams mCD14 receptoriams. Pastebėta, kad sCD14 turi ir tiesioginį LPS neutralizuojantį poveikį, nepriklausomą nuo membraninio mCD14 žymens [161].
3.1.2.1 pav. Monocitų diferenciacijos žymens CD14 lokalizacija. A – membraninis CD14 susijungęs su TLR4 bei formuojantis kompleksą
su LPS bei LSB; B – tirpus sCD14, formuojantis kompleksą su LPS bei LSB
TLR4 – toll ląstelių receptorius, MD2 – mieloidinis diferenciacijos faktorius, LPS – lipopolisacharidas, LSB – lopopolischaridą sujungiantis baltymas,
NF-κB – branduolio transkripcijos faktorius.
In vitro studija parodė, kad sCD14 slopino LPS sąlygotą aktyvaciją, netgi mCD14 neturinčiuose monocituose, išskirtuose iš sergančiųjų paroksizmine naktine hemoglobinurija. Tai rodo, kad sCD14 turi tiesioginį LPS slopinantį poveikį [161]. Manoma, kad sCD14 padidėjimas serume yra svarbus mecha-nizmas apsaugantis nuo septinio šoko, sąlygojamo sisteminio išskiriamų mediatorių poveikio. Tačiau manoma, kad esant specifinėms sąlygoms sCD14 gali netgi padidinti fagocituojančių ląstelių jautrumą bakteriniams produktams [96]. Pateikiama studija, kurios rezultatai rodo, kad tirpūs sCD14 žymenys padeda monocitams sureaguoti į mažas endotoksino (LPS) dozes [96]. Studija tyrusi monocitų aktyvių deguonies radikalų (O2-) sekreciją, aptiko, kad terpėje esant sCD14 neutralizuojančių antikūnų, LPS stimuliacijos pasėkoje monocitai nebegamino O2 [96]. Tirpus sCD14 žymuo taip pat yra svarbus ne monocitų kilmės ląstelių - endotelinių ir epitelinių ląstelių atsake į bakterinį LPS [141]. Tai rodo, kad tirpūs sCD14, priklausomai nuo koncentracijos ir lokalizacijos organizme, turi gebą moduliuoti ląstelių atsaką į bakterinę infekciją.
In vivo studijos patvirtina hipotezę, kad sCD14 žymenys turi sisteminį priešuždegiminį poveikį, tačiau veikiant vietiškai audiniuose jie pasižymi uždegimą skatinančiu poveikiu, kas didina apsaugą nuo bakterijų [91]. Toks dvigubas stimuliuojantis ir inhibuojantis sCD14 poveikis yra svarbus infek-cinių susirgimų metu, nes sąlygoja uždegimą mikrobo patekimo vietoje, tačiau apsaugo nuo sisteminės organizmo reakcijos, kuri gali baigtis netgi septiniu šoku [91, 141]. Dalis tyrėjų įrodė, kad tirpus sCD14 žymuo yra
ūmios fazė baltymas, kurio koncentracija serume ryškiai padidėja esant
infekcijai ar uždegimui [12]. sCD14 sekretuoja ne tik monocitai bet ir kepe-nų ląstelės, o didžioji dalis ūmaus atsako baltymų yra gaminama kepenyse. Nustatyta, kad lėtinių uždegiminių ligų metu sCD14 koncentracija serume koreliavosi su gerai žinomų uždegimo mediatorių koncentracija (IL-6 ir C-reaktyviojo baltymo) [12].
Naujausi moksliniai tyrimai parodo, kad CD14 žymuo yra svarbus plaučių audinyje neutralizuojant bakterinį LPS. In vivo tyrimai su pelėmis parodė, kad pelėms, neturinčioms CD14 žymens ekspresiją sąlygojančio geno, lėtinės LPS inhaliacijos sąlygoja požymius, būdingus lėtinei obstruk-cinei plaučių ligai (LOPL): kvėpavimo takų hiperjautrumą, neutrofilų infil-traciją, citokinų gamybą plaučių audinyje, smulkiųjų kvėpavimo takų remodeliavimą [20]. Pastebėta, kad membraninis monocitų CD14 žymuo reaguoja ir į kitus gram-neigiamų bakterijų ligandus: peptidolikaną ir lipoteichoninę rūgštį [14]. Imuninės reakcijos plaučiuose dalyvaujant CD14 žymeniui į minėtus ligandus yra svarbus mechanizmas, kuriuo plaučiai saugomi nuo bakterinės infekcijos kolonizavimo. Peptidoglikanui jungiantis prie CD14 ir TLR receptorių, plaučiuose vyksta bakterijų nukenksminimas
įsijungiant tik minimaliam uždegimui arba jam visai nevykstant [136].
Tačiau literatūroje nėra pateikiama išsamių duomenų kaip LPS stimuliuotus monocitus veikia alfa-1 antitripsinas. Mūsų tyrime įvertinome alfa-1 anti-tripsino įtaką LPS stimuliuotų monocitų CD14 žymens ekspresijai ir sekre-cijai.
3.2 Alfa-1 antitripsino svarba antiproteazinėje apsaugoje bei uždegiminiame procese
3.2.1 Proteazinė – antiproteazinė sistema ir jos fiziologinė reikšmė
Proteazinė sistema
Svarbus vaidmuo fiziologinio proceso – homeostazės palaikyme tenka proteazinei – antiproteazinei sistemai. Homeostazės palaikyme dalyvauja keletas proteazinių sistemų. Jos svarbios tokiuose procesuose, kaip kraujo krešėjimas, imuniniai procesai, uždegimas, virškinimas. Yra šešios proteazių
grupės: serino, treonino, cisteino, aspartato, glutamino rūgšties protezės ir metaloproteazės [77]. Viena didžiausia grupė yra serino proteazės. Serino proteazių struktūrai būdinga serino liekana fermentiškai aktyvioje molekulės srityje [68].
Pagrindiniai serinoproteazių atstovai: chimotripsinas, elastazė, komele-mento faktorius C1s, trombinas, plazminas, tripsinas, kalikreinas III, PSA (prostatos specifinis antigenas). Proteazės tyrimas naudojamas įvairių ligų ir būklių diagnostikoje: krešėjimo faktorių įvertinimas svarbus nustatant trombofilines arba hemoragines būkles, išmatų elastazės nustatymas reika-lingas diagnozuojant tokias ligas, kaip lėtinis pantreatitas arba cistinė fibro-zė, prostatos specifinio antigeno tyrimas būtinas prostatos vėžio rizikai įver-tinti [77].
Antiproteazinė sistema
Viena svarbiausių sistemų, palaikanti pusiausvyrą ir reguliuojamąjį pro-tezių aktyvumą, yra antiproteazinė (proteazių inhibitorių) sistema. Proteazių inhibitoriai – įprastinės kraujo sudedamosios dalys, kurių spe-cifinė funkcija – neutralizuoti atitinkamų fermentų proteolitinį aktyvumą [179]. Serino proteazės yra slopinamos inhibitorių, įskaitant ir sintetinius medikamentinius inhibitorius, ir natūralius inhibitorius. Viena natūralių serino proteazių inhibitorių šeimų yra serpinai (serino proteazių
inhibitoriai). Serpinai sudaryti iš 350 – 500 aminorūgščių. Jie sudaryti iš
trijų beta vijų (A, B, C) ir 8–9 alfa – spiralių, kurios supa beta juostų karkasą [201]. Ypač savitas serpinų struktūros elementas yra lanksti reak-tyviojo centro kilpa, kurioje yra P1–P1 jungtis, o ši ir lemia inhibitorines serpinų savybes. Serpinai formuoja kovalentines jungtis su serino proteaze ir taip inhibuoja jos funkciją. Serpinai inhibuoja atitinkamos serino proteazės veikimą, „imituodami“ trimatę normalaus proteazės substrato struktūrą. Proteazė vietoje įprasto savo substrato jungiasi su serpinu P1–P1 srityje – tai užblokuoja bet kokį tolesnį proteazės veikimą. Tačiau serpinai po susijungimo bei įvykusios reakcijos ir toliau išlaiko savo aktyvumą. Proteazė sąlygoja serpino įskilimą, dėl to vyksta kovalentinės jungties formavimasis tarp proteazės ir serpino (pvz., AAT), masyvūs alosteriniai pokyčiai ketvirtinėje serpino struktūroje, permetant prisijungusią proteazę
į priešingą AAT molekulės polių. Dėl šio proceso proteazė netenka savo
proteolitinio aktyvumo ir yra suardoma.
Serpinų šeimai priklauso per 500 atstovų, kurie reguliuoja ne tik pro-teazių aktyvumą, bet ir daugelį fiziologinių procesų, įskaitant koaguliacinę sistemą, fibrinolizę, uždegimą, komplemento sistemą, apoptozę, navikinį procesą ir angiogenezę. Iš visų serpinų tik 34 serpinų funkcijos yra žinomos. Kitų serpinų nei fiziologinės funkcijos, nei veikimo taikiniai nežinomi.
Pagrindiniai serpinų atstovai, kurių funkcija geriausiai ištirta, yra alfa-1 antitripsinas, antitrombinas, alfa-1 antichimotripsinas, C1 inhibitorius, kasos tripsino inhibitorius. Dauguma minėtų antiproteazių inhibuoja keletą skirtin-gų proteazių, tačiau stipriausiu poveikiu pasižymi prieš konkrečią proteazę. Pavyzdžiui AAT poveikis nukreiptas prieš neutrofilų išskiriamą elastazę, antitrombino III – prieš trombiną, C1 inhibitoriaus – prieš komplemento faktorių C1s, kasos tripsino inhibitorius – prieš tripsiną, alfa-1 antichimo-tripsinas – prieš chimotripsiną. Esant antiproteazės trūkumui, kuris dažniau-siai yra įgimtas, sukeltas konkrečios genų mutacijos, suaktyvėja atitinkama fermentinė sistema. Šis mechanizmas yra dalies patofiziologinių būklių pamatas. Genetinės kilmės antitrombino III trūkumas sąlygoja krešėjimo sutrikimus, sąlygojančius hiperkoaguliacinę būklę, C1 inhibitoriaus deficitas lemia retą alerginę ligą – paveldimą angioneurozinę edemą, AAT deficitas sąlygoja plaučių emfizemos bei LOPL pasireiškimą bei kepenų ligas [139] (3.2.1.1 lentelė).
3.2.1.1 lentelė. Serpinopatijos
Antiproteazė Molekulinis defektas Liga
Alfa-1 antitripsinas Kaupimasis, inhibitorinės funkcijos nepakankamumas
LOPL ir kepenų ligos
Antitrombinas Struktūros pokyčiai, inhibitorinės funkcijos nepakankamumas
Trombozė
Alfa-1 antichimotripsinas Kaupimasis, inhibitorinės funkcijos nepakankamumas
LOPL ir kepenų ligos
C1 inhibitorius Struktūros pokyčiai, inhibitorinės funkcijos nepakankamumas
Paveldima
angioneurotinė edema Plazminogeno
aktyvato-riaus inhibitorius-1
Stuktūros pokyčiai, inhibitorinės funkcijos nepakankamumas
Kapiliarų diatezė
Neuroserpinai Kaupimasis Demencija ir epilepsija
Angiotenzinogenas Hormono prekursoriaus stoka Hipotenzija
Be geriausiai įrodyto LOPL rizikos veiksnio, t.y. AAT įgimto deficito,
įrodyta, kad ir kitų klasių proteazių (cisteino ir metaloproteazių (MMP)
perteklius gali skatinti LOPL pasireiškimą. Nors AAT deficitas lemia apie 1–2 proc. visų LOPL atvejų, protezinė – antiproteazinė sistema yra svarbi LOPL patogenezei [1, 52, 158] (3.2.1.2 lentelė).
3.2.1.2 lentelė. Proteazės ir antiproteazės lėtinės obstrukcinės plaučių ligos
patogenezėje
Proteazės klasė Proteazė Proteazės taikiniai Endogeniniai proteazės inhibitoriai
Neutrofilų elastazė
Elastinas, kiti BM* komponentai
AAT, sekrecinis leukocitų proteazės inhibitorius (SLPI), alfa-2 makroglobulinas (α2M)
Proteinazė-3 Elastinas, kiti BM* komponentai
alfa-1 antichimotripsinas (ACT), SLPI
Serino proteazės
Katepsinas-G Elastinas, kiti BM* komponentai AAT, elafinas, α2M Cisteino proteazės Katepsinai B, L, S
Elastinas Cisteino proteinazių inhibitoriai (Cistatinai) MMP-1,
kolagenazė-1
BM komponentai α2M, audinių metaloproteazių
inhibitorius (AMPI-1) MMP-3, Stromelizinas-1 BM komponentai α2M, AMPI -1,2 MMP-7, matrilizinas BM komponentai, AAT AMPI -1 MMP-9, Gelatinazė-B Elastinas, kiti BM komponentai AMI -1,2 Matrikso metaloproteazės (MMP) MMP-12, makrofagų metaloelastazė Elastinas, kiti BM komponentai AAT, α2M, AMI -1
BM* – basemetomembrana, į kurios sudėtį įeina IV tipo kolagenas, lamininas, fibronekti-nas, vitronektinas.
3.2.2 Alfa-1 antitripsino struktūra
Alfa-1 antitripsinas (AAT) yra vienas seniausiai atrastų serpinų šeimos narių [5,179]. Tai 52 kDa alfa-1-glikoproteinas, kuris daugiausia sintezuo-jamas hepatocituose, tačiau mažesniais kiekiais sintezuosintezuo-jamas ir kitose ląstelėse: žarnyno, kvėpavimo takų epitelinėse ląstelėse, monocituose ir makrofaguose [5]. Esant normalioms fiziologinėms sąlygoms, monocitai ga-mina 1 proc., o plaučių alveolių epitelinės ląstelės 1,4 proc. viso AAT kie-kio [84]. Per dieną pagaminama 34 mg/kg AAT, o fiziologinė koncentracija serume suaugusio žmogaus svyruoja nuo 0,9 iki 2,5 g/L. Serumo kiekiai mažesni nei 35 proc. normos (0,5 g/L) yra susiję su ypač didele rizika sirgti plaučių emfizema ir LOPL [5].
AAT koduojantis SERPINA1 genas (anksčiau vadinamas PI Proteaze inhibitor) yra 14 chromosomos ilgojo peties q31–32.1 segmente. Tai 12,2 kilobazes turintis genas, kuris turi septynis egzonus ir šešis intronus. Tame pačiame chromosomos lokuse lokalizuojasi ir kitus serpinus (antichimotrip-siną-1, antitrombiną III, proteino C inhibitorių) koduojantys genai. Žinoma apie 100 genetinių AAT variantų. Jų klasifikacija pagrįsta AAT fenotipų judrumo greičiu izoelektriniofokusavimo metu [5]. Normalus AAT variantas yra vadinamas M (medium mobility – vidutinio judrumo), atitinka-mai vyraujantis normalus genotipas yra PIMM. Svarbūs AAT patologiją lemiantys aleliai yra PI*Z, PI*S, PI*Null, PI*Pittsburgh. Kiti AAT deficitą lemiantys aleliai aptinkami ypač retai [5] (3.2.2.1 lentelė). Esant ligą lemiančiam aleliui, pakinta jo koduojamo baltymo (AAT) struktūra - įvyksta atitinkamos amino rūgšties substitucija kita, pvz. PI*Z alelis sągygoja Glu342→ Lys, PI*S - Glu264→ Val, PI*Null - Try160 iškrita, PI*Pittsburgh - Met358→ Arg.
AAT PI*Z alelio mutacija lemia baltymo pakitimą: sutrinka ryšys tarp reaktyviojo centro kilpos ir beta vijos A, dėl to vienos AAT molekulės reaktyvusis centras įsiterpia į kitos AAT molekulės beta viją A, taip suformuojamas dimeras, kuris gali formuoti polimerų grandines. Kai reaktyvusis AAT molėkulės centras yra susijungęs su kita AAT molekule, jis negali jungtis su proteaze. PI*S ir PI*Z alelinių koduojami baltymai suformuoja polimerus kepenyse, kurie yra kaupiami hepatocitų endoplazminiame tinkle. Minėti intraląsteliniai AAT polimerai sąlygoja hepatitus vaikų amžiuje bei didina kepenų vėžio riziką vyresniame amžiuje [5]. S baltymo variantas žymiai mažiau linkęs formuoti polimerus palyginus su Z variantu, tai sąlygoją mažesnį kaupimąsi endoplazminiame tinkle ir kartu mažesnį AAT trūkumą serume. 90 proc. Z ir 40–50 proc. S baltymo kiekio lieka kepenyse. Dažniausiai pasitaikantys šeši AAT genotipų variantai: PIMM, PIMS, PIMZ, PISZ, PISS ir PIZZ [5].
Daugiausia AAT deficitą sąlygojančių ligų lemia PI*Z alelis, o klinikinėje praktikoje 96 proc. pacientų, kenčiančių nuo AAT deficito, turi PIZZ genotipą. Likusius 4 proc. sudaro PISZ arba kiti reti deficito variantai [41].
3.2.2.1 lentelė. Alfa-1 antitripsino aleliai
AAT alelis Mutacijos tipas Ląstelinis defektas Pažeidžiami organai Normalūs aleliai
M (įvairūs subtipai) 1 bp (bazių porų) substitucija
nėra nėra
Xchristchurch 1 bp substitucija nėra nėra
Patologiniai aleliai
S 1 bp substitucija degradacija plaučiai Z 1 bp substitucija nepilnavertis neutrofilų
elastazės slopinimas, kaupimasis
plaučiai, kepenys
Mmalton 3 bp delecija kaupimasis plaučiai, kepenys
Siiyama 1 bp substitucija kaupimasis plaučiai
Mheerlen 1 bp substitucija degradacija plaučiai
Mprocida 1 bp substitucija degradacija plaučiai
Mmineral springs 1 bp substitucija degradacija plaučiai
MVarallo (93) 8 bp delecija kaupimasis Plaučiai
Null aleliai
QOgranite falls 1 bp delecija Stop kodonas, nėra
mRNR
plaučiai
QOludwigshafen 1 bp substitucija Nėra baltymo Plaučiai, kepenys
QOhongkong 2 bp delecija kaupimasis plaučiai
QOisola di procida 17 bp delecija Delecija koduojančio
regiono, nėra mRNR
plaučiai
Disfunkcinis alelis
Pittsburgh 1 bp substitucija Antitrombino 3 aktyvumas
kapiliarų diatezė
3.2.3 Alfa-1 antitripsino uždegimą moduliuojančios savybės
Pagrindinė fiziologinė AAT funkcija yra proteolitinių fermentų inakty-vacija plaučių audinyje [1]. Masyvus plaučių paviršius kasdien susisiekia su atmosferos oro kenksmingomis dalelėmis, sąlygojančiomis ląstelinio bei humoralinio imuniteto atsaką. Fagocitozės proceso metu išsiskiria proteazės, oksidantai, kurie veikia plaučių audinį [3]. Pagrindinė proteazė yra
neutro-filų elastazė (NE), kuri geba suardyti plaučių struktūrinius elementus [1, 5]. Kitos ardančios proteazės yra katepsinas G, plazmino aktyvatorius ir proteinazė-3. Sveikų žmonių plaučiai yra apsaugoti antiproteazių, kurios žaibiškai neutralizuoja proteazes 1:1 dažniu. Iš antiproteazių, esančių
plau-čiuose, AAT randamas didžiausios koncentracijos ir turi didžiausią afinitetą
neutrofilų elastazei: 10 7 M-1s- [84]. Kitos svarbios antiproteazės, kurios plaučių audinyje randamos mažesnėmis koncentracijomis nei AAT yra sekrecinis leokoproteazių inhibitorius (SLPI) ir elafinas [139]. Žmonėms, kurie turi PIZZ genotipą, antiproteazinis AAT poveikis yra penkis kartus mažesnis nei nesant mutacijos [129]. Sutrikus proteazių ir antiproteazių pusiausvyrai, antiproteazės išlieka aktyvios ilgesnį laiką ir pradeda ardyti plaučių alveoles, bronchų sieneles bei kraujagysles. Tai sąlygoja LOPL ir plaučių emfizemos atsiradimą. Neutrofilų elastazės proteolitinį poveikį pa-tvirtina ir eksperimentiniai modeliai su gyvūnais, nes intratrachėjinė NE injekcija gyvūnams sukelia emfizemą [1]. Rūkymas didina neutrofilų skaičių plaučiuose bei NE išsiskyrimą [200]. Kitas mechanizmas, sąlygo-jantis proteazių – antiproteazių disbalansą, esant PIZZ genotipui, yra tai, kad Z antitripsino polimerai plaučiuose atlieka chemoatraktantų funkciją, sąly-gojančią neutrofilų kaupimąsi plaučiuose [111, 129]. Bronchoalveolinis lavažas (BAL), surinktas iš pacientų, sergančių LOPL, parodė, jog kartu esant ir AAT deficitui, nustatomas žymiai didesnis skaičius neutrofilų palyginus su tais, kurie neturi AAT deficito [127]. Patogenetinė neutrofilų elastazės įtaka antitripsino deficito sukeltai emfizemai patvirtinta ir tiesio-gine koreliacija tarp padidėjusios leukocitų elastazės koncentracijos ir emfi-zemos laipsnio [23].
Esant AAT deficitui, cigarečių rūkymas dar labiau susilpnina kiekybiškai ir kokybiškai pakitusios AAT molekulės veikimą. Cigarečių dūmai turi stip-rių oksidantų, gebančių inaktyvuoti AAT molekulės aktyviam centre esantį metioniną (Met358) ir pakeičia jį į metionino sulfoksidą. Dėl to AAT savybė blokuoti neutrofilų elastazės aktyvumą sumažėja 2000 kartų [26]. Taip for-muojasi rūkymo sukeltas AAT funkcijos nepakankamumas.
Cigarečių rūkymas taip pat sukelia uždegiminių ląstelių migraciją į plaučius [200]. Žmonėms, turintiems AAT deficitą, bronchų spindyje randama daugiau neutrofilų nei žmonėms, kurių AAT koncentracija normali [127]. Neutrofilai ir makrofagai be elastazės gali išskirti ir metaloproteazių, ardančių plaučių audinio matriksą [54]. Dalis metaloproteazių (pvz., MMP-7) nėra neutralizuojamos antitripsino, netgi atvirkščiai – jos gali su-mažinti AAT aktyvumą, sukeldamos dalinę molekulės proteolizę [122].
Nors pirminė AAT funkcija yra blokuoti neutrofilų elastazę, AAT turi plataus veikimo priešuždegiminį ir jungiamąjį audinį atstatantį poveikį [84].
Manoma, kad priešuždegiminis AAT poveikis pasireiškia dėl jo antpro-teazinio aktyvumo, tačiau naujausi tyrimai rodo, kad čia dalyvauja ir kiti mechanizmai [31, 82, 92, 105, 100]. In vitro studijos parodė, kad AAT gali slopinti ląstelių apoptozę ir moduliuoti ląstelinį imunitetą [84] bei pasižymi netgi priešnavikiniu poveikiu [202]. In vivo studijos rodo, kad AAT mažina bakterijų endotoksino ir TNFα sukeltą pelių žūtį [105]. Padidėjęs TNFα kiekis aptikamas sergantiesiems LOPL ir nesant AAT deficito [86]. Todėl AAT blokuojantis TNFα poveikis yra svarbus sergant LOPL, nepriklau-somai nuo ligą sukėlusio veiksnio. Nors anti-TNFα terapija sintetiniu preparatu sergantiesiems LOPL nedavė laukiamo gydomojo poveikio, tačiau tyrimai rodo, kad kai kurie TNFα geno polimorfizmai yra susiję su sunkesniu LOPL pasireiškimu [197].
Nustatyta, kad AAT atlieka svarbų vaidmenį apsaugant audinius nuo pažeidimo bei neutralizuojant mikrobų aktyvumą [84]. Pastebėta, kad AAT labai sustiprina LPS stimuliacijos sukeltą priešuždegiminio interleukino IL-10 gamybą [83]. Šie tyrimai rodo, kad AAT dalyvauja uždegime. AAT yra vienas iš ūminio atsako baltymų, kurio koncentracija labai padidėja
įvairių uždegiminių reakcijų metu [84], tačiau mechanizmai, kuriais
reali-zuojamas AAT poveikis į uždegimines ląsteles, nėra ištirti.
3.2.4 Alfa-1 antitripsino deficitą lemiantys genotipai
AAT deficitas yra viena dažniausių paveldimų ligų [126]. Ši liga paveldi-ma autosominiu – recesyviniu būdu. Tikimybė susilaukti kūdikio, turinčio homozigotinį genotipą PIZZ, yra 1 iš 4, jei abu tėvai yra PI*Z alelio nešio-tojai (PIMZ) [5] (3.2.4.1 pav.). Jei vienas iš tėvų turi PIZZ genotipą, o kitas yra heterozigotas (nešiotojas), tai vaikai yra arba nešiotojai, arba sergą AAT deficitu (PIZZ).
3.2.4.1 pav. Alfa-1 antitripsino deficito (PIZZ) paveldėjimo schema
Tyrimai rodo, kad PI*Z alelis atsirado šiaurės Europoje galimai prieš 6000 metų [13, 21]. PI*S alelis prasidėjo prieš 300–450 kartas pietvakarinėje Europos dalyje - Iberian Peninsula regione [5]. Nuo to laiko abu aleliai buvo aptinkami visose pagrindinėse rasinėse grupėse. Didžiausias PI*Z alelio dažnis užfiksuotas Šiaurės ir Vakarų Europoje [16, 44], o PI*S alelis labiau paplitęs Pietų ir Rytų Europoje [5, 16]. Sunkų AAT deficitą lemiančio PI*Z alelio dažnis išskirtinai aukštas Latvijoje, Norvegi-joje, Švedijoje. Manoma, kad tai susiję su vikingų invazija į minėtas šalis. Prieš tai atliktos studijos Lietuvos bendrojoje populiacijoje parodė panašius PI*S ir PI*Z alelių dažnius kaip ir kitose Šiaurės Europos šalyse [13, 170]. Nežymūs minėtų genų dažnio skirtumai pastebėti net tarp skirtingų Lietuvos regionų. Tarp žemaičių PI*S alelio dažnis buvo didesnis nei tarp aukštaičių. O PI*Z alelio dažnis atvirkščiai – didesnis tarp aukštaičių. PIZZ genotipo dažnis tarp Lietuvos gyventojų: 1 atvejis iš 5368 gyventojų [16]. AAT
geno-tipų dažnis ir pasiskirstymas tarp sergančiųjų LOPL Lietuvoje iki šiol netirtas.
Tyrimai parodė, kad tarp Europos gyventojų 94–96 proc. atvejų aptinka-mas normalus PIMM genotipas [5, 16]. 3.2.4.1 lentelėje pateikiaaptinka-mas daž-niausių AAT genotipų dažnis Europoje ir atitinkamas genotipui AAT kon-centracijos sumažėjimas [5, 17].
3.2.4.1 lentelė. Dažniausių alfa-1 antitripsino deficitą lemiančių genotipų
dažnis Europos šalyse
Genotipas MZ SS MS SZ ZZ Dažnis 3/100 1/2200 3,7/100 1/1500 1/2700 Alfa-1 antitripsino koncentracija proc. normos 70 60 85 40 20
Apie 2–3 proc. europiečių turi heterozigotinį AAT genotipą PIMZ. Tarp sergančiųjų LOPL PIZZ dažnis skirtingose šalyse labai įvairuoja, tačiau vidutiniškai svyruoja nuo 1 iki 4,5 proc., o PIMZ dažnis kai kuriose šalyse siekia net 17,8 proc. [44]. Daugiacentrinių studijų duomenimis, pasaulyje 3,4 mln žmonių turi vieną iš trijų AAT deficitą lemiančių genotipų: PIZZ, PISZ ar PISS [5].
Įvairiose pasaulio šalyse tyrėjai pateikia skirtingą AAT deficitą lemiančių
genų dažnį tarp sergančiųjų LOPL. Kelios atvejo – kontrolės studijos parodė, kad PI*Z heterozigotų dažnis tarp sergančiųjų LOPL buvo 1,5–5 kartus didesnis nei bendrojoje populiacijoje [35, 38, 194]. Tikslinių grupių analizės programa, išanalizavusi 2 137 sergančiuosius LOPL Ispanijoje, aptiko septynis PIZZ atvejus, tai yra nustatytas 0,37 proc. PIZZ dažnis tarp sergančiųjų LOPL [38]. Kita studija, atlikta Italijoje, nustatė žymiai didesnį PIZZ dažnį – 6,4 proc. [112]. Tokį didelį AAT deficito dažnį galėjo lemti ir tiriamųjų kontingentas, nes į tyrimą įtraukti tik sergantieji LOPL, kuriems kliniškai buvo įtariamas AAT deficitas. Visiškai kitokius duomenis pateikė studijos atliktos Vokietijoje tyrėjai: iš 1060 sergančiųjų LOPL ne vienam neaptikta PIZZ genotipo [194]. Ši studija skyrėsi tuo, kad į ją buvo įtraukia-mi ne tik sergantieji LOPL, bet ir sergantieji kitoįtraukia-mis lėtinėįtraukia-mis kvėpavimo takų ligomis. Tačiau kita, studija atlikta Vokietijoje, tyrusi 2272 LOPL ser-gančiuosius, kuriems pirminio atrankinio tyrimo metu nustatyta mažesnė AAT koncentracija, išaiškino 335 pacientus turinčius ATT deficitą [10]. Danijoje PIZZ AAT deficito dažnis tarp sergančiųjų LOPL buvo 0,8 proc. [35].
Sunkų AAT deficitą lemiančio genotipo PIZZ dažnio skirtumus įvairiose šalyse galima paaiškinti tiek genų migracijos ypatybėmis tarp šalių, tiek tiriamųjų kontingentų bei tyrimo metodika.
3.3 Lėtinės obstrukcinės plaučių ligos etiopatogenezė 3.3.1 Lėtinės obstrukcinės plaučių ligos rizikos veiksniai
Lėtinė obstrukcinė plaučių liga (LOPL) – tai patologinė būklė, pasireiš-kianti ne visiškai išnykstančia kvėpavimo takų obstrukcija, kuri dažniausiai progresuoja ir yra susijusi su neįprastu uždegiminiu plaučių atsaku į
įkvepiamas kenksmingąsias daleles ar dujas [131]. Tyrimų duomenys rodo,
kad visų LOPL stadijų paplitimas yra didesnis tarp rūkančiųjų ir metusiųjų rūkyti nei tarp niekada nerūkiusiųjų. LOPL dažniau aptinkamas vyresniems nei 40 metų vyrams [107, 184]. Naujausi mokslinės literatūros duomenys rodo, kad sulaukęs 55 metų amžiaus kas ketvirtas vyras ir kas šešta moteris per likusią gyvenimo dalį suserga LOPL [184].
LOPL yra daugiaveiksnės etiologijos liga, kurios pasireiškimą lemia
įvairūs aplinkos veiksniai bei genetiniai determinantai [40, 177]. Svarbiausi
LOPL rizikos veiksniai yra tabako rūkymas, profesinės dulkės ir oro teršalai [177].
Rūkymas
Rūkymo paplitimas Europos šalyse
Tabako rūkymas yra svarbiausias LOPL rizikos veiksnys. Rūkymo suke-liami kvėpavimo takų ir plaučių parenchimos pokyčiai tiesiogiai priklauso nuo cigarečių skaičiaus ir rūkymo trukmės [131]. LOPL riziką didina ir pasyvus pypkės ar cigarečių rūkymas. Apie 10–20 proc. rūkančiųjų suserga LOPL, o 80–90 proc. sergančiųjų LOPL yra rūkantys [184]. Rūkymas suke-lia kvėpavimo takų ir plaučių parenchimos neinfekcinį uždegimą (monocitų, makrofagų, neutrofilų ir kitų uždegimo ląstelių susikaupimą)[1, 149], oksi-dacinį stresą, kvėpavimo takų ir plaučių struktūros pokyčius (taurinių ląste-lių padaugėjimą, virpamojo epitelio metaplaziją į daugiasluoksnį plokščiąjį epitelį), slopina mukociliarinį klirensą ir imuninį atsaką, skatina mikroorga-nizmų kaupimąsi kvėpavimo takuose [177]. Netgi motinos rūkymas nėštu-mo metu gali neigiamai paveikti vaisiaus plaučių augimą ir imuninę sistemą.
Įrodyta, kad bet kuris veiksnys, lėtinantis plaučių augimą nėštumo metu ar
vaikystėje, didina LOPL riziką. Rūkymas taip pat susijęs su didesne prieš-laikinio gimdymo rizika, o mažas naujagimio svoris lemia mažesnį plaučių funkcijos rodiklį FEV1 suaugus.
Tyrimais nustatyta, kad vyrai dažniau serga LOPL nei moterys. Aiški-nantis tokį paplitimo tarp lyčių skirtumą, nustatyta, kad ir vyrų, ir moterų kvėpavimo takai vienodai jautrūs žalojančiam tabako dūmų poveikiui [186]. Manoma, kad lytis nėra LOPL rizikos veiksnys, o tyrimai parodė, kad dides-nis LOPL paplitimas tarp vyrų yra nulemtas rūkymo įpročių. Lietuvai 1994– 2004 m. dalyvaujant Finbalt Health Monitor programoje, įvertinant rūkymo paplitimą, nustatyta, kad per 10 metų rūkančių moterų skaičius išaugo nuo 6, 3 iki 14,2 proc. [64]. 1994 m. rūkė 51 proc. vyrų, o iki 2000 m. rūkymo paplitimas tarp vyrų didėjo, tačiau nuo 2000 m. ėmė mažėti. 2004 m. rūkė 39,4 proc. vyrų (3.3.1.1 pav.). Rūkymo paplitimas tarp kaimo vyrų sumažė-jo labiau negu tarp miesto. 1994 m. kaimo vyrai rūkė dažniau palyginti su miestiečiais: 54 ir 44 proc., atitinkamai, o 2004 m. rūkančių vyrų dalis buvo vienoda mieste ir kaime – 39 proc. Moterų rūkymas plito tiek mieste, tiek kaime. Pasyvus rūkymas Lietuvoje taip pat yra dažnas. 2004 m. 28,1 proc. vyrų ir 10,2 proc. moterų atsakė, kad prirūkytose patalpose dirba bent 1 valandą.
3.3.1.1 pav. Kasdien rūkančių Lietuvos gyventojų dalis 1994 ir 2004 m.
atsižvelgiant į gyvenamają vietą ir lytį
2002 m. Nodic/Baltic Health statistics duomenys rodo, kad Vakarų Euro-pos šalyse vyrų ir moterų rūkymo paplitimas beveik pasiekė vienodą lygį. Tarptautinės studijos parodė, kad pagal rūkymo dažnį galima prognozuoti ir LOPL dažnį populiacijoje [169]. Tokie skaičiavimai jau atlikti siekiant
įvertinti LOPL dažnį Vokietijoje, Anglijoje, Ispanijoje, Italijoje ir
Profesinės dulkės ir oro teršalai
Įrodyta, kad LOPL pasireiškimą skatina kontaktas su medvilne, mediena,
augalų atliekomis, grūdų, anglies, silicio, asbesto, kadmio, geležies dulkė-mis [15, 90].
Įvairūs oro teršalai (automobilių kuro, anglies ir medienos degimo
pro-duktai ir kt.) lauke ir patalpose, biomasės (gyvulių mėšlo ar augalų liekanų) naudojimas patalpoms šildyti ir maistui gaminti didina riziką susirgti LOPL [177]. Tačiau jų poveikis žymiai mažesnis nei rūkymo.
Infekcija
Virusinė ir bakterinė respiracinė infekcija yra svarbi LOPL patogenezės dalis. Ji skatina kvėpavimo takų uždegimą ir LOPL progresavimą. Įrodyta, kad dažnos kvėpavimo takų ligos vaikystėje susijusios su didesne lėtinės bronchų obstrukcijos rizika suaugusiems [35]
Blogos socialinės sąlygos
Iki šiol tiksliai nežinoma, kuris veiksnys svarbesnis – oro teršalai, nevisavertė mityba ar prastos gyvenamosios patalpos. Nevisavertės mitybos, kaip nepriklausomo LOPL rizikos veiksnio, reikšmė neįrodyta. Pastebėta, kad dėl nevisavertės mitybos ir kūno svorio mažėjimo gali sumažėti ir kvėpavimo raumenų masė, jėga bei ištvermė. Lėtinis organizmo išsekimas gali sukelti į emfizemą panašių plaučių struktūros pokyčių [177].
3.3.2 Genetinį polinkį LOPL sąlygojantys veiksniai
Rūkymas yra pagrindinis LOPL rizikos veiksnys, tačiau yra duomenų, kad tik 10-20 proc. rūkančiųjų suserga LOPL [131]. Tai rodo, kad žmonių organizmas skirtingai reaguoja į žalojamąjį rūkymo poveikį, o tai priklauso nuo įgimto polinkio sirgti LOPL (3.3.2.1 pav.). Dauguma mokslinių tyrimų rodo, kad LOPL pasireiškia dėl genų ir išorinės aplinkos veiksnių sąveikos [122].
Be jau minėtos proteazinės – antiproteazinės sistemos, yra kelios biologi-nių determinantų grupės, kurios svarbios LOPL pasireiškimui.
3.3.2.1 pav. Genetinis polinkis bei endogeninių ir egzogeninių veiksnių
sąveika sergant lėtine obstrukcine plaučių liga. A. Oksidantai-antioksidantai
Oksidacinis stresas ir reaktyvieji deguonies radikalai atlieka svarbų vaidmenį rūkymo sukeltos LOPL patogenezėje [177]. Esant oksidantų-anti-oksidantų sistemos disbalansui, vyksta oksidacinė antiproteazių inaktyvaci-ja, alveolių epitelio pažeidimas, neutrofilų invazija į plaučių audinį bei suaktyvėjusi uždegimą sąlygojančių mediatorių genų ekspresija [70, 126].
Hemo-oksigenazė-1 (HO-1) atlieka apsauginę antioksidacinę funkciją plaučiuose. Didesnis (GT)n pasikartojimų skaičius HO-1 geno polimorfizme yra susijęs su didesne rizika sirgti LOPL. Glutation-S-transferazės (GST) geno polimorfizmai yra susiję su spartesniu rūkančiųjų plaučių funkcijos silpnėjimu [70, 126].
B. Ksenobiotiniai fermentai
Kiekvienas cigarečių dūmų įtraukimas turi 1017 laisvųjų radikalų ir apie 4000 medžiagų įskaitant kancerogeninius veiksnius ir kitus LOPL sąlygo-jančius komponentus, tokius kaip lakieji aldehidai ir vandenilio cianidas. Šių reaktyviųjų medžiagų nukenksminimo sutrikimai rūkantiesiems gali sąlygoti bronchų obstrukcijos ir emfizemos atsiradimą. Pastebėta, kad gene-tiniai citochromo P450, mikrosominės epoksido hidrolazės (mEPHX)
poli-morfizmai yra susiję su emfizemos ir LOPL rizika [42]. Taip pat glutation-S-transferazės P1 (GSTP1) 5 egzono genetinis polimorfizmas susijęs su LOPL pasireiškimu rūkantiesiems [42]. Šios ir kitos studijos patvirtina, jog egzistuoja ryšys tarp LOPL, epoksido hidrolazių ir GST, kurios detoksi-kuoja laisvuosius radikalus ir kitus tabako dūmuose esančius komponentus, polimorfizmų [73, 154].
C. Kitos biologiškai aktyvios medžiagos susijusios su polinkiu LOPL Kvėpavimo takų obstrukcijai atsirasti svarbus yra plaučių elastinių savy-bių netekimas ir uždegiminis periferiių kvėpavimo takų susiaurėjimas, todėl visi genų polimorfizmai, turintys įtakos šiems procesams, turi reikšmės ir LOPL patogenezei. Pastebėta, kad navikų nekrozės faktoriaus-α (TNFα), interleukino-13 (IL-13) geno promotoriaus, Vitaminą D sujungiančio balty-mo geno polibalty-morfizmai yra susiję su emfizebalty-mos ir LOPL pasireiškimu [153, 163, 182].
Bet kokie genetiniai pokyčiai, turintys įtakos uždegimą sąlygojančio citokino TNFα kiekio padidėjimui, turi įtakos ir proteazių aktyvumui, sąly-gojančiam LOPL pasireiškimą. Neseniai aptiktas TNFα geno polimorfizmas promotoriaus regione (G-A 308 pozicijoje) [42]. In vitro šis polimorfizmas susijęs su didesne TNFα gamyba. Šio polimorfizmo sąsajos su didesne LOPL rizika aptiktos Taivanio ir Japonijos gyventojams.
Biologinių determinantų, susijusių su didesne LOPL rizika, sąrašas [42]: 1. Alfa-1 antitripsinas
2. Matrikso metaloproteazė-1 3. Matrikso metaloproteazė-9 4. Matrikso metaloproteazė-12
5. Audinių metaloproteazės- 2 inhibitorius (TIMP-2) 6. Alfa-1 antichimotripsinas
7. Hemo-oksigenazė-1
8. Mikrosominė epoksidhidrolazė 9. Glutation-S-transferazė (M1,T1, P1) 10. TNFα
11. Cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatorius (CFTR) 12. β2 adrenoreceptorius
13. Žmogaus defensinas 14. Citochromas P 4501A1
15. Vitaminą D sujungiantis baltymas 16. HLA
Alfa-1 antitripsino deficitą lemiančių genotipų įtaka LOPL genezei Sunkų AAT deficitą lemiantis genotipas PIZZ, sąlygojantis protezių perteklių organizme, yra rizikos veiksnys susirgti LOPL [126]. Įrodyta, kad emfizema formuojasi, kai elastino skaidulų atstatomieji mechanizmai yra nustelbiami masyvios elastazių, pagamintų uždegiminio proceso metu, atakos [5, 139]. Esant AAT deficitui pakitusios struktūros AAT atlieka monocitų chemoatraktanto funkciją, didindamas monocitų migraciją bei makrofagų kaupimąsi plaučių audinyje [108]. Tačiau dalis studijų nustatė, kad ne visiems žmonėms, kurie turi AAT deficitą, pasireiškia klinikiniai ligos požymiai: 10–35 proc. žmonių turinčių PIZZ genotipą, nepasireiškia LOPL [5]. Tai rodo, jog kai kuriais atvejais vien AAT deficito nepakanka, kad atsirastų plaučių emfizema.
Naujausių tyrimų duomenis, mutavusio geno PIMZ nešiotojai turi didesnį polinkį susirgti LOPL. Hersh su bendradarbiais atliko metaanalizę pagal MEDLINE duomenų bazėje (nuo 1966 iki 2003 m.) paskelbtų studijų analizę, kuri nagrinėjo LOPL riziką PIMZ genotipą turintiems asmenims ir
įvertino šių asmenų spirometrijos rodmenį – forsuoto iškvėpimo tūrį per 1
sekudę (FEV1) [69]. 16 studijų duomenimis, LOPL dažnis PIMZ genotipą
turinčių pacientų grupėje buvo didesnis nei PIMM genotipą turinčių asmenų grupėje; santykinė rizika – 2,31 (95 proc. PI 1,60–3,35). Septynios studijos nerodo FEV1 rodiklio dydžio skirtumo tarp PIMM genotipą ir PIMZ
genotipą turinčių sergančiųjų. Manoma, kad rezultatams įtakos turėjo ir kitos charaktersitikos, pvz., rūkymas, gretutinės ligos, tyrimo metodika bei tiriamųjų kontingentas [69].
Seersholm ir bendradarbių atlikta studija parodė, kad 9 proc., paūmėjus LOPL, hospitalizacijos atvejų Danijoje užfiksuota PIMZ pacientams [157]. Palyginus su PIMM genotipą turinčiais sergančiaisiais LOPL, PIMZ geno-tipo reliatyvi hospitalizavimo rizika dė1 LOPL buvo 2,2 (95 % PI, 1,5–3,0). Dauguma šių PIMZ genotipą turinčių LOPL sergančiųjų buvo PIZZ geno-tipą turinčių pirmos eilės giminaičiai, o tai rodo šeiminę LOPL tendenciją. Ypač didelis PIMZ genotipo dažnis nustatytas tarp pacientų, kuriems diagnozuota cor pulmonale (plautinė širdis) [157]. 21 metus trukusi studija nustatė, kad asmenims, turintiems PIMZ genotipą, FEV1 mažėjimas buvo
spartesnis nei esant PIMM genotipui [35]. Tai rodo, kad PIMZ genotipą turintys asmenys gali būti labiau jautrūs rūkymo poveikiui.
Studijų, analizavusių PISZ genotipą turinčių asmenų jautrumą žalingiems aplinkos veiksniams, ypač rūkymui, atlikta nedaug, tačiau tikėtina, kad šių asmenų polinkis LOPL ir emfizemos atsiradimui yra panašus kaip PIZZ genotipo atveju [5]. Dahl M. su bendraautoriais paskelbė metaanalizės duo-menis apie LOPL riziką asmenims turintiems PISZ, PIMS ir PISS genotipus
