LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETO VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARINĖS MAISTO SAUGOS PROGRAMA ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDRA
RAIMONDA AURYLĖ
SKIRTINGŲ LAKTOBACILŲ RŪŠIŲ PIENO
FERMENTACIJOS TYRIMAS
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Skirtingų laktobacilų rūšių pieno fermentacijos tyrimas“
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2013 m. gegužės 1 d. Raimonda Aurylė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2013 m. gegužės 1 d. Raimonda Aurylė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
2013 m. gegužės 1 d. Prof. Dr. Vaidas Oberauskas
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
Turinys SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Karvės ir ožkos pieno reikšmė mityboje ... 11
1.2. Rauginti pieno produktai... 13
1.3. Probiotikai ... 15 1.3.1. Probiotikų savybės ... 16 1.4. Lactobacillus ... 17 1.4.1. Lactobacillus acidophilus ... 18 1.4.2. Lactobacillus bulgaricus ... 19 1.4.3. Lactobacillus rhamnosus ... 20 1.4.4. Lactobacillus plantarum ... 20 1.4.5. Lactobacillus fermentum ... 22
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 24
2.1. Tyrimų atlikimo vieta, laikas ir sąlygos ... 24
2.2. Laktobacilų išskyrimo metodika ... 25
2.3. Laktobacilų padermių rūgščių gamybos aktyvumo nustatymo metodika... 25
2.4. Lactobacillus padermėmis rauginto pieno klampumo nustatymo metodika ... 26
2.5. Lactobacillus padermių riebalų rūgščių gamybos aktyvumo nustatymo metodika ... 26
2.5. Lactobacillus padermių gyvybingumo nustatymo metodika ... 27
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1. Laktobacilų padermių rūgščių gamybos aktyvumo nustatymas rauginant karvės ir ožkos pieną ... 29
3.2. Lactobacillus padermėmis rauginto pieno klampumo nustatymas ... 35
3.3. Lactobacillus padermių riebalų rūgščių gamybos aktyvumas ... 37
3.4. Lactobacillus padermių gyvybingumo nustatymas ... 45
IŠVADOS ... 47
PADĖKA ... 48
SANTRAUKA
Skirtingų laktobacilų rūšių pieno fermentacijos tyrimas
Magistro baigiamąjį darbą paruošė: Raimonda Aurylė. Darbo vadovas: Prof. Dr. Vaidas Oberauskas.
Magistro baigiamasis darbas atliktas 2011 – 2013 metais, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos fakulteto Anatomijos ir fiziologijos katedroje.
Darbas susideda iš: 56 puslapių, 3 lentelės, 19 paveikslų.
Tyrimo metu naudotos laktobacilų išskyrimo, lactobacilų padermių rūgščių gamybos aktyvumo nustatymo, rauginto pieno klampumo nustatymo, bei riebalų rūgščių gamybos aktyvumo nustatymo metodikos.
Darbo tikslas: Nustatyti skirtingų laktobacilų rūšių karvės ir ožkos pieno fermentacijos
aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum ir L.
fermentumrūgščių gamybos aktyvumą rauginant karvės ir ožkos pieną. 2. Nustatyti ir įvertinti surauginto karvės ir ožkos pieno klampą; 3. Nustatyti skirtingų laktobacilų riebalų rūgščių gamybos aktyvumą.
4. Nustatyti Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum ir L.
fermentumgyvybingumą rauginant pieną dvi paras.
Išvados:
Skirtingos laktobacilų rūšys karvės ir ožkos piene rūgštis gamino aktyviai. Didžiausiu rūgščių gamybos aktyvumu raugintame karvės piene pasižymėjo L. acidophilus, šios kultūros titruojamasis rūgštingumas 6 - ąją para buvo 220 oT, ožkos piene – L. planarum, 6 – ąją parą buvo 228 oT.
Didžiausias rauginto karvės ir ožkos pieno klampumas nustatytas pieną rauginant 24 val. L.
bulgaricus kultūra (atitinkamai 344,797 mPa.s ir 167,313 mPa.s).
Didžiausias sočiųjų riebalų rūgščių (RR) kiekis, nuo bendro riebalų rūgščių kiekio, nustatytas
karvės piene raugintame su L. bulgaricus (66,7 proc) ir L. acidophilus (62,6 proc). Didžiausias polinesočiųjų RR kiekis nustatytas pieną rauginant su L. plantarum (71,1 proc). Didžiausias sočiųjų RR kiekis nustatytas ožkos piene, raugintame su L. acidophilus, L. bulgaricus ir L. plantarum kultūromis (atitinkamai 69,6 proc., 68,7 proc. ir 66,0 proc. nuo bendro riebalų rūgščių kiekio). Didžiausias omega – 3 RR kiekis nustatytas karvės piene, raugintame su L. plantarum kultūra (71,1
proc.). Ožkos piene omega – 3 RR daugiausia (14,4 proc.) nustatyta rauginimui panaudojus L.
rhamnosus.
Atskirų laktobacilų rūšių gyvybingumas, po dviejų parų, raugintame karvės ir ožkos piene buvo aktyvus ir tarpusavyje skyrėsi nežymiai. Vidutinis visų laktobacilų rūšių gyvybingumas karvės piene buvo 8,57 KSV (log)/ml, ožkos piene – 8,55 KSV (log)/ml.
SUMMARY
Milk fermentation research of different Lactobacillus
Final Master‘s work prepared by: Raimonda Aurylė. Work tutor: Prof. Dr. Vaidas Oberauskas.
The final Master‘s work carried out in 2011 – 2013, Lithuanian University of Health Sciences. Academy of Veterinary Science.
Work consists of: 56 pages, 3 tables, 19 illustrations.
During the research the following methods had been used: extraction of lactobacillus, identification of production activeness in lactobacillus tribe acids, tests of acidified milk tenacity and establishments in production activeness of fatty acids.
Work aim: Determine fermentation activeness of different lactbacillus tribes in cow‘s and
goat‘s milk.
Work goals:
1. Determine activeness of production of Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L.
rhamnosus, L. plantarum and L. fermentumin cow‘s and goat‘s milk. 2. Identyfy and evaluate cow‘s and goat‘s acidified milk of viscosity. 3. Determine production activeness of different lactobacillus fatty acids.
4. Identify Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum and L.
fermentum viability fermentation milk for two days. Conclusions:
Different types of lactobacillus in cow‘s and goat‘s milk produced acids actively. The biggest production of acids in acidified milk was performed by L. acidophilus, titrated acidity of this culture after 6 days was 220 oT, in goat‘s milk – L. planarum, after 6 days - 228 oT.
The biggest cow‘s and goat‘s actified milk tenacity was found when milk was fermented for 24 h with the help of L. bulgaricus culture (accordingly 344,797 mPa.s and 167,313 mPa.s).
The biggest ammount of fatty acids, from the overall fatty acid ammount, found in cow‘s
milk which was fermented with L. bulgaricus (66,7 %) and L. acidophilus (62,6 %). The biggest ammount of polyunsaturates was found when fermenting milk with L. plantarum (71,1%). The biggest ammount of fatty acids was found in goat‘s milk which was fermented with L. acidophilus,
L. bulgaricus and L. plantarum cultures (accordingly 69,6 %, 68,7 % and 66,0 % ). From the overall ammount of fatty acids). The highest omega-3 fatty acid ammount was identified in cow‘s milk,
fermented with the help of L. plantarum culture (71,1 %). The biggest ammount of omega-3 fatty acids was found in goat‘s milk (14,4 %) the resulsts were received when using L. rhamnosus.
Separate lactobacillus species viability, two days later, fermented cow‘s and goat‘s milk, was active and had little interdependent differences. The average activeness of all types of lactobacillus in cow‘s milk was 8,57 KSV (log)/ml, in goat‘s milk – 8,55 KSV (log)/ml.
SANTRUMPOS
CO2 – anglies dvideginis; g – gramas;
Gram - - gram neigiamas; Gram + - gram teigiamas; ml – mililitras;
mg – miligramas;
mPa.s – mega Paskalis per sekundę; MRS - De Man, Rogosa and Sharpe; oC – temperatūra Celsijaus laipsniais; oT – rūgštingumas Ternerio laipsniais; pH – aktyvusis rūgštingumas;
proc. – procentai; RR – riebalų rūgštys; μm – mikrometras;
ĮVADAS
Rauginimas pieno rūgšties bakterijomis yra vienas seniausių maisto gamybos ir konservavimo būdų (Metchnikoff, 2004). Rauginti pieno produktai – tai produktai, pagaminti naudojant raugus. Rauginti pieno produktai skiriasi nuo pieno chemine sudėtimi ir mikrobiota. Rūgimo metu smažėja laktozės, padidėja biologiškai aktyvių medžiagų. Rauginti pieno produktai turi didelį kiekį gyvų bakterinių ląstelių. Šių produktų gamybai naudojami įvairių kompozicijų pieno rūgšties bakterijų raugai. Kartu su pieno rūgšties bakterijomis gamintojai gali naudoti ir įvairias probiotines kultūras Fuller, 1992; Anderson, Gilliland 1999; Mital, Garg 1992; Masteikienė, 2007).
Pienarūgštės bakterijos yra sporų nesudarančios anaerobinės bakterijos ir gali būti rutulinės ar lazdelinės formos. Fermentuodamos produkte esančius angliavandenius, jos kaip pagrindinį galutinį produktą gamina pieno rūgštį (Jay et. al., 2005).
Kai kurios iš šių bakterijų yra homofermentinės – pagamina daugiau kaip 85 proc. pieno rūgšties, o kitos heterofermentinės - tik apie 50 proc. pieno rūgšties, gana didelį kiekį etanolio, šiek tiek acto rūgšties ir CO2. Pienarūgštės bakterijos turi fermentus β-galaktozidazę, glikolazes ir laktodehidrogenazę (LDH), kurios iš laktozės gamina pieno rūgštį. Pieno rūgštis žmogaus organizme pagerina pieno baltymų virškinamumą, gerina kalcio, geležies ir fosforo pasisavinimą, stimuliuoja skrandžio sulčių sekreciją (http://www.fao.org. Prieiga per internetą 2013 01 02).
Lactobacillus yra gramteigiamų bakterijų grupė, tarpusavyje susijusių morfologinėmis,
medžiagų apykaitos, fiziologinėmis savybėmis (Coeuret et al., 2003). Laktobacilos yra vienos iš svarbiausių pieno rūgšties bakterijų, naudojamų maisto gamybai bei probiotinių preparatų gamyboje (Ortua et al. 2007). Šios bakterijos yra laikomos ypač naudingomis, nes skaldo baltymus, angliavandenius ir riebalus ir padeda įsisavinti reikalingas maistines medžiagas (Piard, Desmazeaud, 1991). Laktobacilos sintetina ir biologiškai aktyvias medžiagas – vitaminus, fermentus, aminorūgštis (Fuller, 1993; Sanders, 1993; Lee, Salminen, 1995; Tannock, 1995). Šios medžiagos reguliuoja virškinimo trakto biologinius procesus, aktyvina naudingos mikrofloros veiklą, skatina virškinimo procesą ir maisto medžiagų įsisavinimą Kadangi bakterinės ląstelės stabilumas kinta priklausomai nuo aplinkos sąlygų, augimo sąlygos gali turėti didelės įtakos lipidų ir riebalų rūgščių sudėčiai ir bakterijų hidrofobiškumui (Шевелева, 1999).
Parenkant kultūras pieno rauginimui, svarbūs yra šie kriterijai: pieno rauginimo aktyvumas, gyvybingų ląstelių kiekis rauge, tarpusavio antagonizmo nebuvimas bei antagonistinis aktyvumas sąlygiškai patogeninei ir techniškai žalingai mikrofolorai. Probiotinių kultūrų ir pieno rūgšties
bakterijų rūšių ir padermių parinkimo principai skiriasi priklausomai nuo gaminamo produkto rūšies (Sekmokienė ir kt., 2004).
Darbo tikslas: Nustatyti skirtingų laktobacilų rūšių karvės ir ožkos pieno fermentacijos
aktyvumą.
Darbo tikslui įgyvendinti buvo iškelti šie uždaviniai: Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum ir L.
fermentumrūgščių gamybos aktyvumą rauginant karvės ir ožkos pieną. 2. Nustatyti ir įvertinti surauginto įvairių rūšių pieno klampą;
3. Nustatyti skirtingų laktobacilų riebalų rūgščių gamybos aktyvumą.
4. Nustatyti Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum ir L.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Karvės ir ožkos pieno reikšmė mityboje
Pienas ir jo produktai labai svarbūs žmonių mitybai. Nustatyta, jog piene yra daugiau kaip 200 įvairių medžiagų, naudingų žmogaus organizmui: baltymų, angliavandenių, riebalų, mineralinių medžiagų, vitaminų, organinių rūgščių, fermentų, imuninių medžiagų (Petereit ir kt., 2009).
Pienas – tai daugiakomponentė nepastovios sudėties ir sudėtinga sistema, kurios dispersinėje terpėje, t.y. vandenyje, yra ištirpusi ir nevienodai pasiskirsčiusi dispersinė fazė - sausosios pieno medžiagos. Technologiniu aspektu pienas – žaliava, iš kurios gaminami įvairūs produktai (Gudonis, 2002).
Pasaulyje labiausiai paplitęs karvių pienas. Jo gryno suvartojimas bei iš jo pagaminti produktai sudaro apie 91 proc. viso suvartojamo pieno kiekio.
Karvės pienas turi visų maisto medžiagų, kurių reikia organizmui augti, vystytis ir funkcionuoti, todėl šviežias pienas ir iš jo pagaminti produktai turi didelę reikšmę žmonių mitybai (Liutkevičius, Lazdauskienė, 2005).
Ožkų pienas – vertingas maisto produktas, jam priskiriamos ypatingos savybės yra vertinamos daugelyje pasaulio šalių. Iš jo gaminamas kefyras, sviestas, varškė, ledai (Zapasnikienė, 2002). Jis pagal cheminę sudėtį daug maistingesnis nei karvės. Ožkos piene didžiąją dalį sudaro vanduo, taip pat daug yra riebalų, baltymų, laktozės, mineralinių druskų, bei mikroelementų, A, D, E, C, P, K ir B grupės vitaminų, albuminų, folio rūgšties, omega-3 rūgščių. (Zapasnikienė, 2003). Ožkų pienas rekomenduojamas vaikams sergantiems rachitu, distrofija bei sveikimo laikotarpiu po sunkių ligų, naudingas sergant skrandžio ir dvylikapirštės žarnos opalige, egzema, bronchų astma, migrena, kolitu, enteritu, esant kepenų ir tulžies pūslės ligoms. Didesnis kalcio kiekis naudingas ligoniams sergantiems artritu, osteoporoze.
Skirtingų ožkų pieno sudėtis (sausųjų medžiagų kiekis piene) labai skiriasi. Ji priklauso nuo metų laiko, aplinkos temperatūros, ožkų veislės, amžiaus, laktacijos laikotarpio, produktyvumo ir mitybos (Japertienė, Japertas, 2004).
Ožkos pieno baltymai yra lengviau virškinami ir labiau toleruojami organizmo (Lopez – Aliaga et. al., 2003). Taip pat ožkos pieno riebalai yra geriau virškinami (Alferez et. al., 2001), šis
pienas gali būti laikomas geru energijos šaltiniu įvairiems medžiagų apykaitos procesams (Bosa et.
al., 1997; Sanz Ceballos 2007).
Nustatyta, kad beveik visi suaugę ir vaikai alergiški karvės pienui, gerai toleruoja ožkų pieną. Jo sudėtyje yra daug aminorūgščių, o cholesterolio penkis kartus mažiau nei karvės piene.
Būdingiausios ožkos pieno savybės yra gaunamos iš lipidų dalies. Riebumas yra panašus kaip ir kitų atrajojančių gyvulių, šiek tiek ožkos pienas yra riebesnis nei karvės. Rūgštingumas priklauso nuo trigliceridų, kuriuos turi atrajojantys gyvūnai. Didžiausias skirtumas tarp karvės ir ožkos pieno riebumo yra trumpos pieno rūgščių grandinės. Ožkos turi daug daugiau kaprio, kapricilo ir kaprono rūgščių. Nuo šių rūgščių priklauso ožkos pieno skonis ir kvapas. Taip pat karvės pienas nuo ožkos pieno skiriasi dėl cholesterolio kiekio. Karvės pienas dažniausiai turi apie 14-17 mg/100 g cholesterolio, o ožkos piene dažniausiai yra 11-25 mg/100 g (http://www.goatworld.com. Prieiga per internetą 2013 02 15).
Lipidais vadinami įvairios cheminės struktūros vandenyje netirpstantys organiniai junginiai. Pagal sudėtį ir struktūrą jie skirstomi į paprastuosius ir sudėtinius lipidus. Paprastiesiems lipidams priklauso acilgliceroliai (triacilgliceroliai, diacilgliceroliai ir monoacilgliceroliai), acilsteroliai ir vaškai, o sudėtiniams – fosfolipidai ir glikolipidai.
Pieno lipidų savybės priklauso nuo riebalų rūgščių sudėties ir nuo jų vietos acilglicerolių molekulėse. Kai pieno acilgliceroliuose yra skirtingų riebalų rūgščių, šie acilgliceroliai vadinami mišriais. Mišrūs acilgliceroliai sudaro pagrindinę natūralaus pieno lipidų masę. Kai pieno lipidų triacilgliceroliuose yra tos pačios rūgšties trijų molekulių likučiai, šie triacilgliceroliai vadinami paprastaisiais. Pieno lipiduose randama apie 140 skirtingų riebalų rūgščių.
Riebalų rūgščių kiekis pieno lipidų triacilgliceroliuose yra unikalus. Pieno lipiduose, palyginti su kitais augaliniais ir gyvuliniais lipidais, daugiau miristino ir žemos molekulinės masės riebalų rūgščių (sviesto, kaprono, kaprilo ir kt.), kurių kiekis svyruoja nuo 7,4 iki 9,5 proc. Tačiau pieno lipiduose mažiau (3-5 proc.) biologiškai vertingų polinesočiųjų riebalų rūgščių (linolio, linoleno, arachido ir kt.) (Gudonis, 2007).
Riebalai – tai ne tik geras energijos šaltinis, riebaluose tirpių vitaminų pernešėjas, bet ir šaltinis esminių RR (riebiųjų rūgščių), kurių žmogaus organizmas nesugeba pasigaminti ir jas būtinai turi gauti su maistu. Pieno riebaluose yra apie 60 proc. sočiųjų riebalų rūgščių ir apie 40 proc. nesočiųjų riebalų rūgščių. Iš sterolių piene būna cholesterolio (0,01 proc.) ir ergosterolio, kuris, veikiamas ultravioletinių spindulių, virsta ergokalciferoliu – vitaminu D. Pieno riebaluose ištirpusios pigmentinės medžiagos suteikia riebalams gelsvą spalvą. Riebiosios rūgštys skirstomos į
dvi grupes: sočiosios ir nesočiosios. Prie pirmųjų priskiriama oleino rūgštis, o prie antrųjų – linolio, linoleno, arachido rūgštys. Pastarosios turi didelės reikšmės madžiagų apykaitos procesuose (Skimundris, 1993).
Omega-3 riebalų rūgštys (RR) - tai polinesočiosios riebalų rūgštys, kurių molekulėje pirma nesočioji dviguba jungtis yra prie trečiojo anglies atomo skaičiuojant nuo metilo grupės (Erkkila et
al. 2003). Omega-3 RR yra būtinos tinkamam smegenų, nervų, regėjimo sistemų išsivystymui ir
funkcionavimui. Iš šios grupės rūgščių pagrindinė yra linoleno RR.
Riebalai viena iš svarbiausių pieno sudėtinių dalių. Šviežame, šiltame ar pašiltintame piene jie yra skysti, pieno plazmoje pasiskirstę mažais lašeliais ir sudaro emulsiją. Šaltame piene riebalai kieti, pieno plazmoje pasiskirstę riebalų rutulėlių pavidalu ir sudaro suspensiją. Pieno riebalų žmogaus organizmas pasisavina 97 – 99 proc., nes jų lydymosi temperatūra žema – 28 – 33 0C, o riebalų rutulėlių skermuo 2 – 6 mikrometro (Skimundris, 2004) .
Kadangi riebalai lengvesni už pieno plazmą, todėl jie iškyla į paviršių, sudarydami grietinės sluoksnį (Liutkevičius, Lazdauskienė, 2005).
Pieno rūgšties pokyčiai - paprastai laktatai paverčiami acetatais ir kitais karbonilo junginiais juos oksidinant (NADH oksidaze) arba juos gali veikti Lactobacillus ar Pediococcus bakterijos. (Pukalskas, 2007). Pagrindiniai pieno riebalų pradmenys yra acetatai, propionatai irbutiratai, kurie
iš kraujo pereina į tešmens liaukinio audinio epitelio ląsteles. Daugiausia pienoriebiųjų rūgščių (iki 75 proc.) susidaro iš acetato (Skimundris, 1993).
1.2. Rauginti pieno produktai
Raugintas pienas – gaminys, gaunamas pieną rauginant tinkamais mikroorganizmais, dėl to sumažėja pH ir susidaro arba nesusidaro sutrauka (izoelektrinis nusodinimas). Raugo mikroorganizmai gaminyje turi būti gyvybingi, aktyvūs ir gausūs visą minimalų gaminio tinkamumo vartoti laiką (Gudonis, 2002).
Pieno rūgštinis rauginimas – tai sudėtingo pieno baltymo kazeino agregatinio būvio pasikeitimas, pereinant jam iš zolio į gelį. Nuo laktozės rūgimo susidarant terpėje įvairioms organinėms rūgštims, kylant terpės vandenilio jonų koncentracijai ir artėjant prie kazeino izoelektrinio taško, tarpusavyje susidurdamos kazeino micelės pradeda disperguotis ir sudaryti vandenyje netirpius, panašius į siūlus agregatus. Toliau artėjant prie kazeino izoelektrinio taško
agregavimosi procesai vyksta sparčiau, ir pieno masėje susiformuoja erdvinis pieno baltymų tinklas. Rūgštinės kazeino sutraukos reologinės ir sinerezinės savybės (klampumas) priklauso nuo raugų sudėties ir savybių, taip pat nuo pieno sudėties ir savybių, jo šiluminio ir mechaninio apdorojimo rėžimo, baltymų koaguliacijos būdo ir trukmės bei kitų veiksnių (Gudonis, 2002).
Rauginto pieno gėrimai yra žinomi jau tūkstančius metų ir apibūdinami gaivinančiu rūgščiu skoniu. Dauguma iš jų gaminami naudojant pienarūgščio rūgimo bakterijas, tačiau gali būti skatinamas ir alkoholinis rūgimas, siekiant išvengti bakterijų ir pelėsių augimo ir prailginti produkto tinkamumo vartoti laiką.
Rauginti pieno gėrimai – skysti, klampūs pieno produktai, gauti rauginant termiškai apdorotą pieną ar liesą pieno žaliavą raugais. Jie skirti vartoti daugiau neapdorojus (Gudonis, 2002).
Tam tikriems raugintiems pieno gaminiams gaminti naudojamos specifinės raugo kultūros: • jogurtui – simbiotinės Streptococcus thermophillus ir Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus;
• kitokios raugo kultūrų sudėties jogurtui - Streptococcus thermophillus ir Lactobacillus genties rūšys;
• acidofiliniam pienui – grynų acidofilinių lazdelių, Lactobacillus acidophilus, raugu
raugintas pienas.
• kefyrui – kefyro grybelių kultūros (Lactobacillus kefiri, Leuconostoc, Lactococcus ir Acetobacter); kefyro grybeliuose yra tiek laktozę skaidančių mielių (Kluyveromyces marxianus), tiek laktozės neskaidančių mielių (Saccharomyces unisporus, Saccharomyces cerevisiae ir Saccharomyces exiguus);
• kumysui – Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ir Kluyveromyces marxianus;
• rūgpieniui – Lactococcus lactis subsp. lactis ir kitospieno rūgšties laktokokų kultūros;
• raugintiems pieno gėrimams – grynos pieno rūgšties bakterijų kultūros.
Be išvardintų specifinių raugo kultūrų gali būti pridedama ir kitų mikroorganizmų (Gudonis, 2002; Gudonis, 2009).
Rauginto pieno produktai ne tik ilgiau išsilaiko, bet ir gerina sveikatą. Dėl sveikatą gerinančio poveikio kai kurios pienarūgščių bakterijų rūšys buvo pavadintos probiotikais.
1.3. Probiotikai
Probiotikai - gyvi mikroorganizmai, mikrobiniai maisto papildai, pasižymintys teigiamu ir natūraliu poveikiu į virškinamojo trakto mikroflorą (Abe et al. 1995; Fuller, 1989).
Terminas „probiotikai" pirmą kartą buvo pavartotas 1965 m. Lilly ir Stillwel aprašant vienų mikroorganizmų veikimo prieš kitus efektą. Po to šis terminas buvo pritaikytas gyviems mikrobiniams priedams, pagerinantiems virškinamojo trakto mikrofloros sudėtį (Kačerauskis ir kt., 2003). Probiotikai išvertus pažodžiui reiškia „dėl gyvybės". Dabar šiuo terminu vadinami gyvieji mikroorganizmai arba su jais fermentuoti produktai, kurie teikia naudą žmogaus ar gyvulio organizmui, palaikydami ar gerindami žarnyno mikrofloros balansą. Dauguma specialistų probiotinėms bakterijoms dažniausiai priskiria eubiotikus (žarnyno ir kitų organizmo ertmių normalios mikrofloros atstovus, paprastai bifidobakterijas ir Lactobacillus genties pienarūgštę mikroflorą) vadinamus klasikiniais probiotikais (Kačerauskis ir kt., 2003).
Dažniausiai pasitaikančios probiotikų padermės yra šios: Lactobacillus - Lactobacillus
acidophilus, L. casei, L. rhamnosus ir Bifidobacterium, Enterococcus, Pediococcus, ir Streptococcus genčių bakterijų kamienai. Lactobacillus natūraliai randamos piene, grūduose ir
kituose augaluose (Quillien, 2001; Michalík et al., 1999; Fuller, 1989).
Apie 400 - 500 žarnyno bakterijų genčių yra identifikuotos. Didžioji dauguma žarnyno bakterijų yra naudingos. Viename grame storųjų žarnų turinio gyvena 10 –
1000 milijardų bakterijų. Sudėtingoje įvairių rūšių sąveikoje kiekviena bakterijų rūšis atlieka tam tikrą vaidmenį, o jų santykis turi įtakos sveikatai. Priklausomai nuo to, kokios rūšys dominuoja, priklauso ir mūsų sveikata. Storojoje žarnoje dominuoja šios gentys: Bacteroides, Bifidobacterium,
Eubacterium ir Peptostreptococcus. Mažesniais kiekiais, bet taip pat svarbios yra Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus ir Clostridium gentys bei Enterobacteriaceae šeima. Žarnyne yra
bakterijų, kurios dideliais kiekiais tampa žalingos, t.y. Veillonellae, Clostridium, Staphylococcus,
Proteus ir Pseudomonas. Jos sąlygoja galutinių metabolinių produktų: amonio, vandenilio sulfido,
aminų, fenolių, indolo ir antrinių tulžies rūgščių susidarymą. Šios medžiagos neigiamai veikia absorbuotos į kraują ir tiesiogiai, į žarnų gleivinę. Naudingųjų bakterijų yra daug daugiau nei žalingųjų. Mikrobiotos pusiausvyra gali būti pažeista vartojant antibiotikus, pakeitus mitybos įpročius ar sergant virškinimo trakto ligomis. (www.valio.lt. Prieiga per internetą 2012 12 10)
Šie mikroorganizmai, kaip maisto papildai, dedami į jogurtus, varškę, kefyrus, arba vartojami liofilizuotų miltelių (kapsulių, mikrokapsulių), tablečių ir skystųjų suspensijų forma (Reid et al., 2003).
1.3.1. Probiotikų savybės
Žmogaus organizme yra milijardai bakterijų, jos sudaro žmogaus mikrobiotą. Gerosios bakterijos svarbios virškinimui bei imuniteto stiprumui. Taip pat įvairių ligų profilaktikai ir gydymui (Isolauri et. al., 2002; Levy, 2000).
Probiotikai turi pasižymėti šiomis savybėmis:
• Gebėti kolonizuoti tam tikras organizmo ertmes, prisitvirtindami prie žarnyno gleivinių ar kitų ertmių gleivinių epitelio ląstelių receptorių;
• Būti nepatogeniškais, genetiškai stabiliais, netoksiškais;
• Gaminti antimikrobines medžiagas ir būti antagonistais kitų mikroorganizmų atžvilgiu; • Būti atspariais rūgštims ir tulžies rūgščiai bei virškinimo fermentų poveikiui, kad galėtų
pereiti reikiamas virškinamojo trakto dalis;
• Gebėti daugintis organizme ir atstatyti normaliąją mikrobiotą; • Gebėti aktyvinti organizmo imuninę sistemą;
• Eliminuoti patogenus arba sumažinti jų įsitvirtinimo galimybes;
• Gebėti išlaikyti gyvybingumą ir stabilumą technologinių procesų metu, gaminant tam tikras jų preparatų formas bei išlikti stabiliais tam tikrą laiką pagamintuose preparatuose;
• Atitikti būtinus įprastai maisto gamybai reikalavimus, pvz., juslines savybes, stabilumą, gyvybingumą ir nebūtinai turi dalyvauti produkto fermentacijoje (Toit et al., 1998; Maragkoudakis et al., 2006; Masteikienė, 2006);
• Gaminti organines rūgštis, vandenilio peroksidą ir bakteriocinus, antagonistiškai veikiančius patogenų dauginimąsi (Reid et al.,2003; Kaur et. al.,2002; Ouwehand et.al., 2004);
• Probiotikai taip pat gali paskatinti bei pagreitinti virškinamajame trakte metabolinius procesus, kurie teigiamai veikia organizmo sveikatingumą (Conway, 2001).
Daugiausia tyrimų duomenų sukaupta apie probiotikų naudą gydant žarnyno infekcijas. Ištirta, kad vartojant probiotikus viduriavimo laikas sutrumpėja. Probiotinės bakterijos taip pat gali padėti apsisaugoti nuo diarėjos ar kitų ūmių virškinimo trakto sutrikimų (Sullivan, Nord, 2002).
Yra publikacijų apie probiotikų naudingumą Helicobacter polory sukeltų infekcijų gydymui ir prevencijai. H. pylori sukelia B tipo gastritą ir peptines opas ir yra rizikos veiksnys skrandžio onkologiniams susirgimams atsirasti. Tyrimuose nustatyta, kad laktobakterijos slopina H. pylori augimą ir jos ureazinį aktyvumą, kurio jai reikia išgyventi rūgščioje skrandžio terpėje. Kiti tyrimai įrodo, kad probiotikai žmogaus organizme slopina H. pylori infekciją ir mažina recidyvų riziką. Eksperimentais su pelėmis įrodyta, kad Lactobacillus salivarius apsaugo skrandį nuo H. pylori infekcijos ir ją slopina. Tyrimais nustatyta, kad probiotikai yra labai efektyvūs esant laktozės netoleravimui (Pavilionis ir kt., 2005).
1.4. Lactobacillus
Lactobacillus yra gramteigiamos, lazdelės formos, sporų negaminančios ir katalazei
neigiamos probiotinės bakterijos. Jos yra vienos iš svarbiausių pieno rūgšties bakterijų naudojamų maisto produktų gamybai ir kaip probiotikai (Ortua et. al. 2007).
Šiuolaikinė pienarūgščių probiotinių bakterijų sistematika apima laktobacilas, bifidobakterijas ir enterokokus. Probiotinėms bakterijoms priskiriamos 176 padermės. Joms keliami kai kurie reikalavimai: bakterijos turi sugebėti prisitvirtinti prie žarnyno sienelės, būti genetiškai stabilios, atsparios aplinkai, gerai daugintis in vitro ir in vivo sąlygomis (Klein et. al., 1998).
Per pastarąjį dešimtmetį funkcinių produktų rinka, kurių sudėtyje yra probiotikų, buvo sparčiausiai auganti naujų maisto produktų kūrimo sritis. Funkcinių maisto produktų gamyboje reikia naujų probiotinių kultūrų turinčių naudingų fiziologinių savybių (Sieladie et. al., 2011).
Pienas ir jo produktai laktobaciloms sudaro vieną iš augimo terpių. Pieno rūgšties bakterijų padermė nustatoma identifikuojant morfologinius ir biocheminius rodiklius, tai dažymas pagal Gramą ir katalazės testas (Sujaya, 2008). Laktobaciloms yra svarbus išlikimas įvairiose temperatūrose, pH, sūrioje aplinkoje.
Geriausiai šiuo metu ištirti mikroorganizmai yra pieno rūgštį gaminančios bakterijos, ypatingai Lactobacillus spp. ir Bifidobacterium spp. (Rolfe, 2000).
Laktobacilos yra viena didžiausių pieno rūgšties bakterijų grupės padermė, pavadinta taip, nes šios bakterijos laktozę ir kitus cukrus paverčia į pieno rūgštį ir yra labai atsparios virškinimo trakto aplinkai – skrandžio ir tulžies rūgštims (Rayid et. al., 2007; Khali et. al., 2007; Abdelbasset
Lactobacillus tai – 1,0 – 10 x 0,5 – 1,2 μm dydžio lazdelinės bakterijos, kurių forma – nuo
ištemptos lazdelės iki kokobacilos. Šios bakterijos sudaro trumpas grandinėles, ypač vėlesnėje logaritminės fazės augimo stadijoje. Dauguma laktobacilų yra nejudrios, nesudaro sporų, Gram +, padidėjus terpės pH, senos kultūros tampa Gram -. Tai fakultatyvūs anaerobai (kai kurie mikroaerofilai), neigiamos katalazei ir citochromoksidazei. Greitesnis laktobacilų augimas pastebimas aplinkoje esant 5 -10 proc. CO2 koncentracijai. Geriau auga esant tam tikrų medžiagų - aminorūgščių, peptidų, riebalų rūgščių, vitaminų, angliavandenių, nukleininių rūgščių priedui. Optimali pH koncentracija yra 5,5 – 5,8, o augimo temperatūra 30 – 40 0C, tačiau auga esant temperatūrai nuo +5 iki +53 0C (Axelsson, 1998).
Probiotinės pieno rūgšties bakterijos randamos įvairiose ekologinėse nišose, tokiose, kaip augalai, gyvūnų bei žmonių virškinimo traktas, burnos ertmė, makštis, žalias pienas. Jos taip pat aptikamos vandenyje, nutekamuosiuose vandenyse, dirvoje, mėšle, silose. (Hammes, Vogel, 1995). Dažniausiai randamos tokiuose maisto produktuose – pienas, grūdų ir mėsos produktai, daržovės, vaisiai, sultys, vynas, alus (Jaymanne et. al., 2006).
Laktobacilų gentis apima 133 rūšis ir 18 porūšių (Liu, 2011). Pagal susidariusius fermentacijos produktus laktobacilos skirstomos į griežtas homofermentines (L. planarum, L.
acidophilus, L. casei. L. salivarium), griežtas heterofermentines ir fakultatyvines heterofermentines.
Homofermentinės laktobacilos skaldo gliukozę, fruktozę, galaktozę, maltozę, sorbitą ir fermentacijos eigoje susidaro apie 85 proc. pieno rūgšties.
Heteroferentinės laktobacilos skaldo gliukozę, ksilozę, arabinozę, ramnozę ir tuomet susidaro mažesnis kiekis pieno rūgšties (50 proc.).
Fakultatyvinės heterofermentinės laktobacilos užima tarpinę padėtį. Jos skaldo pentozes (arabinozę, ksilozę ir kt.) ir heksozes (gliukozę, fruktozę, maltozę ir kt.), susidaro pieno rūgštis, o kai tūksta gliukozės, skaldo ją iki acto rūgšties ir spirito (Wood, Holzapfel, 1998).
Laktobacilos pramoniniu būdu naudojamos jogurto, vyno, sidro, raugintų kopūstų, raugintų agurkų, sūrio, šokolado ir kitų fermentuotų maisto produktų gamyboje (Bixquert, 2009).
1.4.1. Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus yra Gram teigiamos, sporų neformuojančios homofermentinės,
katalazei neigiamos lazdelės. Auga terpėje, kurioje gana žemas pH (mažiau nei pH 5,0), optimali augimo temperatūra 37 0C. (Bâati et. al. 2000). Šios bakterijos natūraliai gyvena žmonių
virškinamąjame trakte, burnoje, makštyje taip pat randamos kai kuriuose fermentuotuose maisto produktuose (pvz. kefyras, jogurtas ir kt.), taip pat naudojama probiotinių maisto produktų bei maisto papildų gamyboje.
Kaip ir dauguma laktobacilų, L. acidophilus fermentuoja laktozę į pieno rūgštį. L.
acidophilus žarnyne ir makštyje sudaro nepalankias sąlygas daugintis patogeninėms ir sąlyginai
patogeninėms bakterijoms. Šios probiotinės bakterijos reikšmingos virškinimui, jos atskiria aminorūgštis iš tulžies, taip sudaro geresnes sąlygas organizmui vėl panaudoti aminorūgštis. Moksliniais tyrimais įrodyta, jog L. acidophilus mažina cholesterolio kiekį kraujyje, stiprina natūralų imunitetą, palengvina viduriavimą, didina atsparumą grybelinėms infekcijoms. Probiotikų turinčių sudėtyje L. acidophilus naudinga vartoti žarnyno mikroflorai balansuoti įvariais virškinimo trakto veiklos sutrikimų atvejais - viduriuojant, užkietėjus viduriams, sergant rotavirusine infekcija, skrandžio ar dvylikapirštės žarnos opalige, opiniu kolitu, Krono liga, dirgliosios žarnos sindromu, kandidoze.
Labai retais atvejais šios bakterijos būna susijusios su infekcijomis (Anderson, Gilliland 1999; Aguirre, Collins, 1993; Gasser, 1994; Salminen et. al. 1998; Borriello et. al. 2003).
In vitro tyrimais nustatyta, jog L. acidophilus yra labai atspari žemam pH ir gali išgyventi dvylikapirštėje žarnoje esant tulžies rūgštims. Sąveika su žarnyno gleivine yra svarbi, nes susijungimas su žarnyno gleivine leidžia probiotikams ilgiau išgyventi žarnyne. Taip pat gali apsaugoti nuo žarnyno patogenų. Nustatyta, jog L. acidophilus labai gerai prisitvirtina prie žmogaus virškinamojo trakto epitelio.
Daugiau nei 90 proc. L. acidophilus išlieka gyvybingos apie 1 val. druskos rūgšties ir pepsino (1 proc.) tirpale, kai temperatūra 37 0C ir pH 3.
Daugiau nei 90 proc. L. acidophilus išgyvena terpėje turinčioje 0,3 proc. tulžies rūgšties. Daugiau nei 60 proc. L. acidophilus išgyvena 1 val. terpėje, turinčioje 0,3 proc. pepsino, kai pH 2.
Daugiau nei 60 proc. laktobacilų išlieka gyvybingos, terpėje 2 val. esant 0,1 proc. pankreatino koncentracijai, kai pH 8. (http://ss1.spletnik.si/4_4/000/000/19f/152/La-14%20TM.pdf. Prieiga per internetą 2013 01 21).
1.4.2. Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus delbrueckii subsp. (porūšis) bulgaricus (nuo 1984 m. žinoma kaip Lactobacillus bulgaricus). Tai viena iš kelių jogurto ir kitų fermentuotų produktų gamybai naudojamų bakterijų.
Tai ilgos siūlinės formos Gram teigiama lazdelė. Nejudri, nesudaro sporų, auga esant žemam pH (apie 5,4 – 4,6). L. delbrueckii spp. bulgaricus jogurto gamybai dažniausiai naudojama kartu su
Streptococcus thermophilus (Courtin et. al., 2003). Dvi Lactobaclillus rūšys veikia sinergiškai. Abi
rūšys gamina pieno rūgštį, kuri jogurtui suteikia rūgštų skonį ir veikia kaip konservantas (Zourari et
al.,1992). L. bulgaricus yra homofermentinė pieno rūgšties bakterija, fermentuojanti gliukozę,
laktozę, fruktozę ir kartais galaktozę arba manozę. Augimo temperatūra iki 48-50 0C. (Kandler, Weiss, 1986). L. bulgaricus probiotinis aktyvumas siejasi su jų gebėjimu gaminti antimikrobines medžiagas – bakteriocinus, organines rūgštis bei vandenilio peroksidą (Stamatova, 2010).
1.4.3. Lactobacillus rhamnosus
Gerai žinoma probiotinė bakterija Lactobacillus GG apsaugo ir atstato maisto antigenų (Isolauri et al. 1993; Malin et al. 1997) ar medikamentų (Gotteland et al. 2001) padidintą gleivinės laidumą. Ši bakterija skatina žarnų gleivinių sekreciją (Mack et al. 2003) ir apsaugo epitelinių ląstelių tvirtas jungtis nuo pažeidimų esant E. coli infekcijai (Khaled et al. 2003).
Pieno rūgšties bakterija Lactobacillus GG (L. rhamnosus ATCC 53103) - labiausiai žinomas ir geriausiai ištirtas probiotikas. Ji išlieka gyvybinga virškinimo trakto aplinkoje, kolonizuoja žarnų gleivinę ir epitelines ląsteles, stiprina imuninę apsaugą prieš žalingas bakterijas ir virusus. Vartojama reguliariai Lactobacillus GG adaptuojasi normalioje bakterijų floroje. Ji didina ne tik pieno rūgšties, bet ir bifidobakterijų kiekį. Lactobacillus GG teigiamai veikia virškinimo trakto metabolinius procesus, slopindama žalingų medžiagų susidarymą storojoje žarnoje, taip pat suriša toksinus. Slopina potencialiai žalingų bakterijų augimą ir adheziją.
Lactobacillus rhamnosus geba išgyventi žmogaus virškinamąjame trakte (Doron et. al.,
2005).
1.4.4. Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum - ne patogeninės, 2-4 μm ilgio, Gram teigiamos, aerobinės lazdelės,
natūraliai egzistuojančios žmogaus virškinimo trakte. Smulkios, linkusios sudaryti grandinėles, dažnai kvadratiniais galais, mezofilai. Optimali vystymosi temperatūra 30 oC – 35 oC, minimali – 10 oC – 15 oC, maksimali – 45 oC – 50 oC. Neatsparios temperatūros poveikiui: 60 oC temperatūroje žūva per 10 minučių, bet ištveria trumpalaikį kaitinimą 72 oC temperatūroje. Raugina sacharozę,
maltozę, iš laktozės gamina pieno rūgštį. L. plantarum atsparios tulžies ir NaCl poveikiui, gali
vystytis esant 6 proc. NaCl (Masteikienė, 2002; Bixquert 2009). Jos randamos įvairiuose fermentuotuose maisto produktuose – piene, mėsoje, žuvyje, augaluose; fermentuotuose pašaruose; žmonių bei gyvūnų virškinamajame trakte.
L. plantarum taip pat randama daugelyje sūrių rūšių (Vanderhoof, 2001). Vanderhufas pabrėžė L. plantarum gebėjimą sudaryti tinkamas sąlygas, kad išvengti enterokolito žiurkėms, veiksmingai gydyti vaikus, kurių žarnyne trūksta gerųjų bakterijų. Buvo įrodyta, kad be virškinimo gerinimo L. plantarum panaudojimas yra efektyvus, gydant dirgliosios žarnos sindromą, kolitą bei Krono ligą (Vriesa et. al., 2006). Niedzielin et. al. nustatė, jog asmenis, sergančius dirgliosios žarnos sindromu gydant L. plantarum, žymiai sumažėjo pilvo skausmai (Niedzelin et. al., 1998). L.
plantarum geba sunaikinti patogenus ir išsaugoti svarbias maistines medžiagas, vitaminus ir
antioksidantus, turi gebėjimą gaminti L liziną, naudingą aminorūgštį. Naujausi L. plantarum tyrimai parodė, kad šios bakterijos gali būti efektyvia sojų sukeltų alergijų prevencijos priemone. Mokslininkai Ilinojaus universitete 2008 m. atliko du tyrimus. Jie fermentavo sojų sėklas, miltus ir maistą panaudodami mikroorganizmus. Fermentuoti ir nefermentuoti sojų produktai buvo įvesti į žmonių, kurie alergiški sojai, kraujo plazmą. L. plantarum sukėlė didžiausią imuninės reakcijos atsako sumažėjimą į sojos produktus. E. Hauschildt alikdamas tyrimus su laboratoriniais gyvūnais nustatė, jog šis probiotikas pagerina kepenų veiklą, sumažina skrandžio uždegimo riziką, pilvo pūtimą pacientams, sergantiems dirgliosios žarnos sindromu, padidina karboksirūgščių kiekį fekalijose ir sumažina fibrinogeno koncentraciją kraujyje (Hauschildt, 2001). L. plantarum kolonija gyvendama žarnyne, neleidžia patogenams prisitvirtinti prie gleivinės sienelės, konkuruoja dėl maisto, žalingosios bakterijos, nepadariusios žalos organizmui, pašalinamos iš jo. Taip pat šios bakterijos yra atsparios daugeliui antibiotikų (Vriesa et. al., 2006).
Lactobacillus plantarum gamina šiuos bakteriocinus: plantariciną A (PlnA), PlnE, PlnF, PlnJ,
PlnKit PlnN (Anderssen et. al., 1998). L. plantarum gamina plantariciną C, kuris nužudo jauriąsias ląsteles, veikiant per citoplazminę membraną, jis yra baktericidiškas jautrioms kultūroms ir kai kuriais atvejais sukelia ląstelių lizę. Bakteriocinai dažnai turi siaurą inhibitorinį spektrą, tačiau laktobacilos tai kompensuoja gamindamos keletą bakteriocinų, kurie priskiriami skirtingoms klasėms ir turi skirtingą inhibitorinį spektrą (Klaenhammer, 1988; Eijsink et. al., 2002).
Kai kurių Lactobacillus padermių gaminamos antibakterinės medžiagos – bakteriocinai, pasižymi skirtingu aktyvumu atskiroms Yersinia enterocolitica, Salmonella, E. coli O157:H7 ir E.
coli K88 padermėms. Šios padermės buvo žymiai jautresnės L. plantarum sintetinamiems
bakteriocinams. L. plantarum gamina ir antigrybines medžiagas (Laniewska – Moroz et. al., 2001). Be to pasižymi unikalia savybe prisitvirtinti prie žarnų gleivinės per manozės receptorius, kas nebūdinga Gram + baterijoms, bet būdinga Gram -. Ši savybė įgalina L. plantarum varžytis su patogeninėmis bakterijomis (pvz.: salmonelėmis) (Adlerberth et. al., 1996). O patogeninių bakterijų adhezija yra svarbiausias mechanizmas, leidžiantis joms įsitvirtinti žarnyne (Patti, Höök, 1994).
Nissen et.al. in vitro nustatė, kad L. plantarum gal pagerinti žarnyno vientisumą, žarnyno ląstelių metabolinį aktyvumą ir stimuliuoti imuninį atsaką (Nissen et al. 2009).
Įrodyta, kad vartojamų antibiotikų poveikį virškinamajam traktui sumažina L. plantarum vartojimas (Lonnermark et al. 2009). Taip pat nustatyta, kad L. plantarum gali apsaugoti žarnyno epitelio ląsteles, kurias pažeidė E. coli (Qin et al. 2009).
L. plantarum plačiai naudojama maisto pramonėje ir probiotikas medicinoje ( http://www.ipm-int.org/boxmode/pdf/lactobacillus_plantarum.pdf. Prieiga per internetą 2012 10 02).
1.4.5. Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum tai mezofilinės, vidutinio didumo nuo 0,5 – 0,7 μm storio iki 5 μm
ilgio pavienės arba susijungusios į grandinėles lazdelinės bakterijos. Optimali jų vystymosi temperatūra 18-30 oC, minimali – 10 0C, maksimali – 45 0C. Jos raugina įvairius cukrus – gliukozę, laktozę, rafinozę, maltozę, gamina iki 1,2 proc. pieno rūgšties, acto rūgštį, etilo alkoholį, anglies dioksidą. Plačiai paplitę ant augalų, naudojamos rauginant vaisius, daržoves, silosuojant pašarus (Masteikienė, 2002; Songisepp et al., 2005 ).
L. fermentum yra obligatinė heterofermentinė pieno rūgšties bakterija (Canchaya et al., 2003)
Dauguma padermių produkuoja bakteriocinus ir skaldo sunkia virškinamus cukrus – rafinozę ir stachiozę (Songisepp et al., 2005).
Gerai išgyvena sudėtingas salygas gyvūnų ir žmonių skraddyje ir žarnyne. Gamina lizocimą, dujas iš gliukozės ir NH3 iš arginino. Katalazei neigiama, sporų neformuoja, nejudrios, fermentuoja ribozę, galaktozę, D-gliukozę, D-tagatozę ir gliukonatą (http://enologyaccess.org. Prieiga per internetą 2013 12 19).
Lactobacillus fermentum didina sekrecinio IgA prieš salmoneles gamybą, aktyvina fagocitus
Eksperimentuose in vitro nustatyta, kad L. fermentum inaktyvina net 1010 adenovirusų ir vezikulino stomatito virionų per 10 min., o efektas buvo panašus į rūgščių veikimą (Candieux et.
al., 2002).
Iš žmogaus mikrofloros laktobacilų tik L. fermentum gali produkuoti lizocimą, priklausantį faktoriams, kurie turi nemažą įtaką, apsaugant žmogaus mechanizmus nuo infekcinių agentų. Juk sekretoriniai antikūnai suriša komplementą ir tampa bakteriocidiniai tik dalyvaujant lizocimui, be to lizocimas dalyvauja mikrofloros reguliacijoje (Jankauskienė, 1996). L. fermentum gaminamas lizocimas pagerina laktobacilų adhezines savybes, paryškina imunomoduliuojančias, antianemines, regeneraciją stimuliuojančias bei kitas biologines savybes (Шендеров, 1996)
Nustatyta, kad vienos L. fermentum padermės sugeba prisitvirtinti prie skrandžio gleivinės epitelio in vitro, tačiau neprisitvirtina prie plonosios ir storosios žarnų epitelio, o kitos padermės sugeba prisitvirtinti prie plonosios ir storosios žarnų epitelio. Taigi laktobacilų adhezinės savybės priklauso nuo mikroorganizmo padermės ir audinio specifiškumo (Дей и Лисанский, 1990).
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
2.1. Tyrimų atlikimo vieta, laikas ir sąlygos
Tyrimai atlikti 2012 – 2013 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos akademijos Anatomijos ir fiziologijos katedroje.
Tyrimai buvo atlikti 5 etapais, kurie pateikti 1 lentelėje. 1 lentelė. Tyrimų etapai
Etapo Nr. Tikslas Atlikti tyrimai
I. Išskirti Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus iš jogurtų be priedų.
Laktobacilų išskyrimas. II. Ištirti Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L.
rhamnosus, L. plantarum ir L. fermentum rūgščių
gamybos aktyvumą.
Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum ir L. fermentum
rūgčių gamybos aktyvumo įvertinimas.
III. Ištirti surauginto karvės ir ožkos pieno klampą. Rauginto karvės ir ožkos pieno klampumo įvertinimas.
IV. Ištirti skirtingų Lactobacillus rūšių riebalų rūgščių gamybos aktyvumą.
Riebalų rūgščių gamybos
aktyvumo įvertinimas. V. Ištirti skirtingų Lactobacillus rūšių gyvybingumą,
rauginant pieną 2 paras.
Laktobacilų gyvybingumo įvertinimas.
Tyrimui naudotos liofilizuotos L. plantarum, L. fermentum padermės, kurios gautos iš Virškinimo, fiziologijos ir patologijos mokslinio centro, bei L. acidophilus, L. bulgaricus ir L.
2.2. Laktobacilų išskyrimo metodika
Imant po 1 ml tiriamo jogurto buvo atlikti dešimtkartiniai skiedimai iki 10 -6. Iš kiekvieno praskiedimo ant MRS agaro užsėjama po 0,05 ml jogurto kultūros. Laktobacilos kultivuojamos termostate 37oC laipsnių temperatūroje 48 val mikroaerofilinėmis sąlygomis (5-10 proc. CO2 ). Ant agaro išaugusios laktobacilų kolonijos persėjamos į 3 ml MRS sultinio. Kas dvi paras buvo atliekamas bakterijų pagausinimas.
Sėjimas ant MRS agaro atliekamas lenkta lazdele (špateliu) Drigalskio būdu. Bandinio pasėlis daromas į 3 Petri lėkšteles, turinčias standžią mitybinę terpę. Į pirmąją lėkštelę mikropipete ant agaro paviršiaus užlašinama 0,05 ml tiriamosios medžiagos, kuri lazdele išsklaidoma po visą agaro paviršių.
2.3. Laktobacilų padermių rūgščių gamybos aktyvumo nustatymo metodika
L. acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum ir L. fermentum padermių rūgščių
gamybos aktyvumas buvo nustatomas titravimo metodu ir potenciometriniu metodu (pH – metru). Naudojant titravimo metodą, rūgštingumas išreiškiamas Ternerio laipsniais (oT). Naudojant pH – metrą nustatomas aktyvusis pieno rūgštingumas (Urbienė, 2001).
Į vieną Erlenmejerio kolbutę buvo įpilta 100 ml sterilaus neriebaus pieno ir įlašinta 3 ml tiriamos L. acidophilus kultūros, išaugintos MRS sultinyje. Analogiškos kolbutės buvo paruoštos su
L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum ir L. fermentum kultūromis. Kontrolei buvo paimti 3
mėgintuvėliai su steriliu neriebiu pienu. Paruoštos suspensijos kultivuotos 37oC temperatūroje 6 paras. Kiekvieną dieną į kolbutę buvo įpilama 5 ml suspensijos, 10 ml distiliuoto vandens ir 3 lašai indikatoriaus (1 proc. spiritinis fenolftaleinas) ir titruota su 0,1n NaOH iki pastovios silpnai rožinės spalvos. Apskaičiuota Ternerio laipsniais pagal formulę:
oT = A˟20 kur:
A – sunaudoto 0,1n NaOH kiekis titravimui; Vidurkis vedamas iš 3 bandinių.
Rauginto pieno pH buvo nustatomas kiekvieną rauginimo dieną pH – metru „PP - 15“, vadovaujantis prietaiso naudojimo instrukcija.
2.4. Lactobacillus padermėmis rauginto pieno klampumo nustatymo metodika
Prieš rauginant Lactobacillus padermėmis riebalai iš pieno buvo pašalinti jį centrifuguojant. Pienas supilamas į kolbutes ir kaitinamas vandens vonelėje 70 oC temperatūroje 30 min. Po to pienas atvėsinamas, išpilstomas į kolbutes ir užsėjamas laktobacilų kultūromis (100 ml pieno užsėti naudojama 3 ml kultūros). Kultivuota 37 oC., klampumas nustatytas po 24 ir 48 val. rauginimo.
Rauginto pieno klampa nustatyta Heplerioviskozimetru, modelis BH 2.
Metodo esmė: veikimo principas pagrįstas kamuoliuko slydimu matavimo vamzdeliu, kuris yra pripildytas tiriamojo skysčio, laiko matavimu. Klampumas yra susijęs su laiku, reikalingu kamuoliukui įveikti tiksliai nustatytą atstumą. Kamuoliuko nusileidimo greitis priklauso nuo skysčio klampumo. Apverčiant matuoklį po matavimo gali būti atliktas dar vienas papildomas matavimas. Šiuo būdu apskaičiuojamas dinaminis klampumas, mPa.s.
Viskozimetras pastatoms priešais apšviestą foną. Laikas matuojamas sekundometru. Atliekami 3 matavimai.
2.5. Lactobacillus padermių riebalų rūgščių gamybos aktyvumo nustatymo metodika
Riebalų rūgštys raugintame piene buvo nustatytos dujų chromatografijos metodu, naudojant liepsnos jonizacijos detektorių. Riebalų rūgščių analizei tiriamieji mėginiai buvo paruošti pagal LST ISO 661:1989 standartą. Riebalų, išskirtų iš jogurto, mėginiuose riebalų rūgštys buvo sumetilintos KOH metanoliniu tirpalu, paruošiant metilo esterius pagal EN ISO 5509-2000 standartą. Ruošiant riebalų rūgščių metilo esterius, 1 ml (1±0,001 ml) rauginto pieno buvo užpilta 4 ml heksano ir homogenizavus palikta 30 min, kad išsisluoksniuotų. Iš paruošto tirpalo viršutinio sluoksnio, chromatografinei analizei atlikti, paimta 4 µl mėginio. Riebalų rūgščių metilesterių chromatografinė analizė atlikta dujų chromatografu Shimadzu GC - 17A, naudojant BPX – 70, 120 m kolonėlę, pagal LST EN ISO 15304:2003/AC:2005 „Gyvūniniai ir augaliniai riebalai ir aliejus. Riebalų rūgščių trans-izomerų kiekio nustatymas augaliniuose riebaluose ir aliejuje“. Dujų chromatografijos metodas (ISO 15304:2002/Cor.1:2003)“.
Chromatografinės analizės sąlygos:
• Kolonėlės temperatūra: 60 ºC 2 min, 20 ºC/min iki 230 ºC, išlaikant 65 min. • Garintuvo temperatūra 250 ºC,
• Liepsnos jonizacijos detektoriaus temperatūra 270 ºC, • Dujų nešėjas - azotas.
Riebalų rūgščių identifikavimui naudotas pieno riebalų rūgščių rinkinys “Supelco 37 Component FAME Mix”.
Buvo ištirtas karvės ir ožkos pienas raugintas penkiomis skirtingomis Lactobacillus padermėmis: L. acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L.plantarum ir L. fermentum. Pienas buvo raugintas 48 val.
2.5. Lactobacillus padermių gyvybingumo nustatymo metodika
Laktobacilų padermių gyvybingumas raugintame piene buvo nustatytas po 2 parų. Atskirų L.
acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum ir L. fermentum rūšių kiekis nustatytas
lėkštelių metodu. Po 2 parų buvo imtas 1 ml rauginto pieno ir atlikti dešimtkarčiai skiediniai iki 10 -6. Iš kiekvieno skiedimo po 0,05 ml buvo užsėta ant MRS agaro (Liofilchem, Italija). Tiriamoji medžiaga paviršiniu metodu buvo paskleista ant standžios, pieno rūgšties bakterijoms selektyvios, parūgštintos MRS (Oxoid, UK) (ang. De Man, Rogosa and Sharpe, MRS) terpės, Petri lėkštelės paviršiuje.
Gyvybingų laktobacilų kiekis apskaičiuotas po 2 parų auginimo pagal formulę (LST ISO 7218:2000):
kur:
N – mikroorganizmų skaičius (KSV);
- suma kolonijų, suskaičiuotų visose lėkštelėse su mitybine terpe, kai bent vienoje iš jų yra 30 kolonijų;
V – kiekvienai Petri lėkštelei naudotas tiriamosios medžiagos kiekis mililitrais;
- pirmojo skiedimo rinktų Petri lėkštelių skaičius; - antrojo skiedimo rinktų Petri lėkštelių skaičius; - pirmąjį rinktą skiedimą atitinkantis skiedimo laipsnis.
Statistinė analizė
Tyrimų duomenys apdoroti WinExcel programa. Apskaičiuoti požymių aritmetiniai vidurkiai (X), vidutiniai kvadratiniai nuokrypiai (σ). Aritmetinių vidurkių skirtumo patikimumas (P) nutatytas
pagal Stjudentą. Rezultatai laikomi patikimais,kai P<0,001, P<0,01, P<0,05, rezultatai nepatikimi, kai P>0,05. Tyrimams buvo ruošti trys paraleliniai mėginiai.
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Laktobacilų padermių rūgščių gamybos aktyvumo nustatymas rauginant karvės ir ožkos pieną
L. acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum ir L. fermentum kultūrų rūgščių
gamybos aktyvumas karvės ir ožkos piene, kultivuojant 6 paras +37oC temperatūroje, pateiktas 1, 2, 3 ir 4 paveiksluose.
1 pav. L. acidophilus, L. bulgaricus ir L. rhamnosus rūgščių gamybos aktyvumas (karvės
pienas)
Nustatyta, kad L. acidophilus bendras rūgštingumas, kultivuojant 6 paras iš eilės, pasiekė 220 oT. Pirmąją parą šios kultūros rūgščių gamybos aktyvumas buvo 42 oT, antrą – 122 oT, trečią – 174 oT, ketvirtą – 196 oT, penktą – 204 oT, šeštą – 220 oT. Aktyviausiai rūgščių gamyba vyko per pirmas tris paras. Pirmąją, antrąją parą rūgštingumas padidėjo 80 oT, trečiąją parą rūgštingumas padidėjo 52 oT. Ketvirtąją, penktąją ir šeštąją parą rūgščių gamyba vyko lėčiau: ketvirtąją parą rūgščių gamyba padidėjo 22 oT, penktąją – 8 oT, o šeštąją – 16 oT.
L. bulgaricus bendras rūgštingumas, kultivuojant 6 paras iš eilės, pasiekė 140 oT. Pirmąją parą šios kultūros rūgščių gamybos aktyvumas buvo 106 oT, antrą – 118 oT, trečią – 134 oT, ketvirtą
– 136 oT, penktą –138oT, šeštą – 140 oT. Aktyviausiai rūgščių gamyba vyko pirmąją parą. Pirmąją, antrąją parą rūgštingumas padidėjo 12 oT, trečiąją, ketvirtąją, penktąją ir šeštąją parą rūgščių gamyba vyko lėčiau: kiekvieną parą rūgštingumas padidėjo po 2 oT.
Nustatyta, kad L. rhamnosus bendras rūgštingumas, kultivuojant 6 paras iš eilės, pasiekė 150 oT. Pirmąją parą šios kultūros rūgščių gamybos aktyvumas buvo 32 oT, antrą – 70 oT, trečią – 100 oT, ketvirtą – 124 oT, penktą – 140 oT, šeštą – 150 oT. Aktyviausiai rūgščių gamyba vyko per pirmas tris paras. Pirmąją, antrąją parą rūgštingumas padidėjo 38 oT, trečiąją parą rūgštingumas padidėjo 30 oT. Ketvirtąją, penktąją ir šeštąją parą rūgščių gamyba vyko lėčiau: ketvirtąją parą rūgščių gamyba padidėjo 24 oT, penktąją – 16 oT, o šeštąją – 10 oT.
Lyginant iš jogurtų išskirtų kultūrų tarpusavio rūgščių gamybos intensyvumą, L. acidophilus pagamino daugiau rūgščių nei L. bulgaricus ir L. rhamnosus. Tai matyti pirmame paveiksle. Visų trijų laktobacilų rūšių rūgštingumo aktyvumas, kultivuojant šešias dienas iš eilės, palaipsniui didėjo. Po 6 parų kultivavimo nustatyta, kad bendras L. acidophilus rūgštingumas buvo 80 oT didesnis (p<0,01) nei L. bulgaricus ir 70 oT didesnis (p<0.001) nei L. rhamnosus.
Pirmą parą L. bulgaricus rūgščių gamybos aktyvumas buvo žymiai didesnis nei L. acidophilus ir L. rhamnosus, net 106 oT, t.y. 2,5 karto daugiau (p<0,001) nei L. acidophilus, ir 3,3 karto daugiau (p<0,001) nei L. rhamnosus. Antrą, trečią, ketvirtą, penktą ir šeštą dienomis L. bulgaricus rūgščių gamybos aktyvumas didėjo nežymiai.
Nustatyta, kad L. plantarum bendras rūgštingumas (2 pav.), kultivuojant 6 paras iš eilės, pasiekė 162 oT. Pirmąją parą šios kultūros rūgščių gamybos aktyvumas buvo 36 oT, antrą – 70 oT, trečią –124 oT, ketvirtą – 138 oT, penktą – 162 oT, šeštą – 162 oT. Aktyviausiai rūgščių gamyba vyko per pirmas tris paras. Pirmąją, antrąją parą rūgštingumas padidėjo 34 oT, trečiąją parą rūgštingumas padidėjo 54 oT. Ketvirtąją, penktąją ir šeštąją parą rūgščių gamyba vyko lėčiau: ketvirtąją parą rūgščių gamyba padidėjo 14 oT, penktąją – 24 oT, o šeštąją – nekito.
L. fermentum bendras rūgštingumas (2 pav.), kultivuojant 6 paras iš eilės, pasiekė 160 oT. Pirmąją parą šios kultūros rūgščių gamybos aktyvumas buvo 36 oT, antrą – 74 oT, trečią –110 oT, ketvirtą – 128 oT, penktą – 150 oT, šeštą – 160 oT. Aktyviausiai rūgščių gamyba vyko per pirmas tris paras. Pirmąją, antrąją parą rūgštingumas padidėjo 38 oT, trečiąją parą rūgštingumas padidėjo 36 oT. Ketvirtąją, penktąją ir šeštąją parą rūgščių gamyba vyko lėčiau: ketvirtąją parą rūgščių gamyba padidėjo 18 oT, penktąją – 22 oT, o šeštąją – 10 oT.
2 lentelė. pH kitimas pirmąją ir šeštąją karvės pieno fermentacijos parą
1 para 6 para L. acidophilus 5,98 3,67 L. bulgaricus 4,34 4,04 L. rhamnosus 6,40 4,33 L. plantarum 6,09 3,95 L. fermentum 6,10 3,90
Iš 2 lentelės ir 1 - 2 paveikslų. duomenų matyti, jog po vienos paros didžiausias titruojamas rūgštingumas (106 oT) ir mažiausias pH (4,34) nustatytas karvės pieną fermentuojant su L.
bulgaricus kultūra. Mažiausias titruojamas rūgštingumas (32 oT) ir didžiausias pH (6,40) po vienos paros, buvo fermentuojant su L. rhamnosus rūšimi. Lyginant rūgščių gamybos kitimą nuo pirmosios iki šeštosios paros, intenstyviausiai karvės piene rūgštis gamino L. acidophilus, L. plantarum ir L.
fermentum kultūros. Su L. acidophilus kultūra rauginto pieno aktyvusis rūgštingumas šeštąją parą
buvo 2,31 mažesnis (p>0,05) nei pirmąją. Fermentuojant su L. plantarum, šeštąją parą lyginant su pirmąją, pH sumažėjo (p<0,001) 2,14, su L. fermentum pH sumažėjo (p<0,001) 2,2.
3 pav. L. acidophilus, L. bulgaricus ir L. rhamnosus rūgščių gamybos aktyvumas
(ožkos pienas)
Nustatyta, kad L. acidophilus bendras rūgštingumas, kultivuojant 6 paras iš eilės, pasiekė 170 oT. Pirmąją parą šios kultūros rūgščių gamybos aktyvumas buvo 84 oT, antrą – 114 oT, trečią – 134 oT, ketvirtą – 146 oT, penktą – 164 oT, šeštą – 170 oT. Aktyviausiai rūgščių gamyba vyko per pirmas tris paras. Pirmąją, antrąją parą rūgštingumas padidėjo 30 oT, trečiąją parą rūgštingumas padidėjo 20 oT. Ketvirtąją, penktąją ir šeštąją parą rūgščių gamyba vyko lėčiau: ketvirtąją parą rūgščių gamyba padidėjo 12 oT, penktąją – 18 oT, o šeštąją – 6 oT.
L. bulgaricus bendras rūgštingumas, kultivuojant 6 paras iš eilės, pasiekė 134 oT. Pirmąją parą šios kultūros rūgščių gamybos aktyvumas buvo 106 oT, antrą – 122 oT, trečią – 126 oT, ketvirtą – 128 oT, penktą – 130oT, šeštą – 134 oT. Aktyviausiai rūgščių gamyba vyko pirmąją parą. Pirmąją, antrąją parą rūgštingumas padidėjo 16 oT, trečiąją, ketvirtąją, penktąją ir šeštąją parą rūgščių gamyba vyko lėčiau: kiekvieną parą rūgštingumas padidėjo apie 2 oT.
Nustatyta, kad L. rhamnosus bendras rūgštingumas, kultivuojant 6 paras iš eilės, pasiekė 176 oT. Pirmąją parą šios kultūros rūgščių gamybos aktyvumas buvo 46 oT, antrą – 118 oT, trečią – 144 oT, ketvirtą – 150 oT, penktą – 162 oT, šeštą –176 oT. Aktyviausiai rūgščių gamyba vyko per pirmas tris paras. Pirmąją, antrąją parą rūgštingumas padidėjo 72 oT, trečiąją parą rūgštingumas padidėjo 26 oT. Ketvirtąją, penktąją ir šeštąją parą rūgščių gamyba vyko lėčiau: ketvirtąją parą rūgščių gamyba padidėjo 6 oT, penktąją – 12 oT, o šeštąją – 14 oT.
Lyginant iš jogurtų išskirtų kultūrų tarpusavio rūgščių gamybos intensyvumą ožkos piene, L.
acidophilus ir L. rhamnosus pagamino daugiau rūgščių nei L. bulgaricus. Tai matyti trečiame
paveiksle. Visų trijų laktobacilų rūšių rūgštingumo aktyvumas, kultivuojant šešias dienas iš eilės, palaipsniui didėjo. Po 6 parų kultivavimo nustatyta, kad bendras L. rhamnosus rūgštingumas buvo 42 oT didesnis (p<0,001) nei L. bulgaricus, o L. acidophilus 36 oT didesnis (p<0,001) nei L.
bulgaricus.
Pirmą parą L. bulgaricus rūgščių gamybos aktyvumas buvo 60 oT didesnis (p<0,001) nei L.
rhamnosus. Antrą, trečią, ketvirtą, penktą ir šeštą dienomis L. bulgaricus rūgščių gamybos
aktyvumas didėjo nežymiai.
4 pav. L. plantarum ir L. fermentum rūgščių gamybos aktyvumas (ožkos pienas)
Nustatyta, kad L. plantarum bendras rūgštingumas, kultivuojant 6 paras iš eilės, pasiekė 228 oT. Pirmąją parą šios kultūros rūgščių gamybos aktyvumas buvo 102 oT, antrą – 180 oT, trečią –196 oT, ketvirtą – 208 oT, penktą – 222 oT, šeštą – 228 oT. Aktyviausiai rūgščių gamyba vyko per pirmas tris paras. Pirmąją, antrąją parą rūgštingumas padidėjo 78 oT, trečiąją parą rūgštingumas padidėjo 16 oT. Ketvirtąją, penktąją ir šeštąją parą rūgščių gamyba vyko lėčiau: ketvirtąją parą rūgščių gamyba padidėjo 14 oT, penktąją – 12 oT, o šeštąją – 6 oT.
L. fermentum bendras rūgštingumas, kultivuojant 6 paras iš eilės, pasiekė 172 oT. Pirmąją parą šios kultūros rūgščių gamybos aktyvumas buvo 86 oT, antrą – 114 oT, trečią –132 oT, ketvirtą – 148 oT, penktą – 168 oT, šeštą – 172 oT. Aktyviausiai rūgščių gamyba vyko per pirmas dvi paras.
Pirmąją, antrąją parą rūgštingumas padidėjo 28 oT, trečiąją parą rūgštingumas padidėjo 18 oT. Ketvirtąją, penktąją ir šeštąją parą rūgščių gamyba vyko lėčiau: ketvirtąją parą rūgščių gamyba padidėjo 16 oT, penktąją – 14 oT, o šeštąją – 10 oT.
Lyginant visas kultūras, naudotas ožkos pieno rauginimui, didžiausias rūgštingumas nustatytas su L. plantarum kultūra rauginame piene, 94 oT daugiau (p<0,001) nei L. bulgaricus, 58 oT daugiau (p<0,001) nei L. acidophilus, 56 oT daugiau (p<0,001) nei L. fermentum ir 52 oT daugiau (p<0,001) nei L. rhamnosus.
3 lentelė. pH kitimas pirmąją ir šeštąją ožkos pieno fermentacijos parą
1 para 6 para L. acidophilus 4,72 3,57 L. bulgaricus 4,19 3,98 L. rhamnosus 5,76 3,81 L. plantarum 4,37 3,66 L. fermentum 4,85 3,74
Iš 2 lentelėje, 3 bei 4 paveiksluose pateiktų duomenų matyti, jog po vienos paros ožkos pieno fermentacijos didžiausias titruojamasis rūgštingumas (106 oT) ir mažiausias pH (4,19) nustatytas ožkos pieną fermentuojant su L. bulgaricus kultūra. Mažiausias titruojamasis rūgštingumas (46 oT) ir didžiausias pH (5,76) po vienos paros, buvo fermentuojant ožkos pieną, kaip ir karvės, su L.
rhamnosus rūšimi. Lyginant rūgščių gamybos kitimą pirmąją ir šeštąją paromis, didžiausias kitimas
nustatytas ožkos pieną fermentuojant su L. bulgaricus, šeštąją parą pH padidėjo (p<0,05) 1,95, lyginant su pirmąją.
Pieno cukraus fermentacija pieno rūgimo metu mažina pH, gaminamos organinės rūgštys, kurios yra svarbios dėl nepageidaujamų mikroorganizmų augimo slopinimo (Cintas et. al., 2001). A. Hassan ir I. Amjad (2010) teigia, jog rauginto pieno pH mažėjimas priklauso nuo laktozės skaidymo į pieno rūgštį. Vidutinė pH vertė pieną rauginant L. bulgaricus 4,18, o rauginant su L.
acidophilus - 4,29. Pieno rauginimui naudojant kitas Lactobacillus rūšis, pH taip pat svyruoja nuo
4,6 iki 4,0 Atlikti turimai nurodo, jog jog pieną rauginat su L. acidophilus kultūra, galutinio produkto titruojamasis rūgštingumas siekia apie 90 - 110 oT (Walstra et. al. 2005). Piwat et. al. (2012) tyrimų metu nustatė, jog skirtingos Lactobacillus kultūros skirtingai geba gaminti rūgštis.
3.2. Lactobacillus padermėmis rauginto pieno klampumo nustatymas
Laktobacilomis rauginto pieno klampumo, karvės ir ožkos piene, rezultatai pateikti penktame ir šeštame paveiksluose. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 mP a. s
L. acidophilus L. bulgaricus L. rhamnosus L. plantarum L. fermentum
po 24 val. po 48 val.
5 pav. Rauginto karvės pieno klampumas po 24 ir 48 val. rauginimo
Didžiausias pieno klampumas nustatytas karvės pieną rauginant L. bulgaricus paderme. Po 24 valandų pieno rauginimo šia kultūra, pieno klampa siekė 167,313 mPa.s. Po 48 val. klampumas sumažėjo 18,852 mPa.s., iki 148,460 mPa.s. Gana gera klampa nustatyta pieną rauginant su L.
acidophilus – po 24 val. nustatyta 92,641 mPa.s., po 48 val. klampa sumažėjo 25,65 mPa.s., iki
66,991 mPa.s. Mažiausias klampumas nustatytas karvės pieną rauginant su L. rhamnosus – po 24 val. - 2,617 mPa.s., po 48 val. klampa padidėjo 7,965 mPa.s., iki 10,582 mPa.s.
Taigi, didžiausias rauginto abiejų rūšių pieno klampumas pasiektas pieną rauginant su L.
bulgaricus paderme. Po 24 val. karvės pieno rauginimo, su L. bulgaricus kultūra, klampa buvo
74,671 mPa.s. didesnė (p<0,001) nei rauginant su L. acidophilus, bei 122,596 mPa.s. didesnė (p<0,001) nei rauginant su L. fermentum.
0 50 100 150 200 250 300 350 mP a. s
L. acidophilus L. bulgaricus L. rhamnosus L. plantarum L. fermentum
po 24 val. po 48 val.
6 pav. Rauginto ožkos pieno klampumas po 24 ir 48 val. rauginimo
Didžiausias klampumas nustatytas ožkos pieną rauginant L. bulgaricus paderme. Po 24 val. rauginimo šia paderme, klampumas buvo 344,797 mPa.s., po 48 val. sumažėjimas buvo nežymus – 8,155 mPa.s. Su L. acidophilus rauginto pieno klampumas po 24 val. rauginimo buvo 17,748 mPa.s., po 48 val. – 21,279 mPa.s. Su L. rhamnosus rauginto pieno klampa po 24 val. rauginimo – 6,236 mPa.s., po 48 val. klampumas padidėjo tik 0,92 mPa.s., iki 7,156 mPa.s. Su L. plantarum 24 val. rauginto pieno klampa siekė 1,150 mPa.s., po 48 val. klampa padidėjo 18,616 mPa.s., iki 19,766 mPa.s. Su L. fermentum rauginto pieno klampa po 24 val. buvo 1,932 mPa.s., po 48 val. – 15,003 mPa.s., t.y. padidėjo 13,071 mPa.s.
Rauginant karvės ir ožkos pieną su L. acidophilus ir L. fermentum padermėmis, didesnė klampa nustatyta raugintame karvės piene.
Taigi, didžiausias rauginto abiejų rūšių pieno klampumas pasiektas pieną rauginant su L.
bulgaricus paderme. Po 24 val. karvės pieno rauginimo, su L. bulgaricus kultūra, klampa buvo
74,671 mPa.s. didesnė (p<0,001) nei rauginant su L. acidophilus, bei 122,596 mPa.s. didesnė (p<0,001) nei rauginant su L. fermentum.
Su L. bulgaricus kultūra rauginant ožkos pieną 24 val., klampa buvo 347,647 mPa.s. didesnė (p<0,001) nei rauginant su L. plantarum ir nuo 327,049 – 342,865 mPa.s. didesnė (p<0,001) už kitomis kultūromis rauginto pieno klampą.
Išanalizavus tyrimų rezultatus, galima teigti, jog skirtingos laktobacilų kultūros pasižymi skirtingu karvės ir ožkos pieno rauginimo greičiu, esant vienodai rauginimo temperatūrai ir
nevienodu sugbėjimu formuoti įvairaus klampumo produktus. Kaip teigia P. F. Fox ir P. L. H. McSweeney (1998), pieno klampumas priklauso nuo jo sudėties, rūgštingumo.
3.3. Lactobacillus padermių riebalų rūgščių gamybos aktyvumas
L. acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. plantarum ir L. fermentum kultūrų riebalų
rūgščių gamybos aktyvumas karvės ir ožkos piene pateiktas 7 – 16 paveiksluose.
7 pav. Riebalų rūgščių vidutiniai kiekiai karvės pieną rauginant su L. acidophilus
paderme, proc. nuo bendro riebalų rūgščių kiekio
Nustatytas bendras riebalų rūgščių kiekis raugintame karvės piene su L. acidophilus buvo 98,9 proc., iš kurių sočiosios riebalų rūgštys sudarė 62,6 proc., mononesočiosios RR – 34,0 proc., polinesočiosios RR 1,73 proc. ir trans RR sudarė 1,0 proc.
8 pav. Riebalų rūgščių vidutiniai kiekiai karvės pieną rauginant su L. bulgaricus
paderme, proc. nuo bendro riebalų rūgščių kiekio
Bendras riebalų rūgščių kiekis raugintame karvės piene su L. bulgaricus (8 pav.) buvo 99,3 proc., iš kurių sočiosios riebalų rūgštys sudarė 66,7 proc., mononesočiosios RR – 30,8 proc., polinesočiosios RR 0,6 proc. ir trans RR sudarė 1,2 proc.
9 pav. Riebalų rūgščių vidutiniai kiekiai karvės pieną rauginant su L. rhamnosus
paderme, proc. nuo bendro riebalų rūgščių kiekio
Bendras riebalų rūgščių kiekis raugintame karvės piene su L. rhamnosus buvo 96,8 proc., iš kurių sočiosios riebalų rūgštys sudarė 36,8 proc., mononesočiosios RR – 54,7 proc., polinesočiosios RR 3,6 proc. ir trans RR sudarė 1,7 proc.
