LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Urtė Simonavičiūtė
SEZONIŠKUMO ĮTAKA ŽEMAITUKŲ VEISLĖS ERŽILŲ REPRODUKCIJAI
INFLUENCE OF SEASONALITY FOR REPRODUCTION OF ŽEMAITUKAI BREED STALLIONS
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr. Vytuolis Žilaitis
Kaunas, 2019
DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas ,,Sezoniškumo įtaka Žemaitukų veislės eržilų reprodukcijai”
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) PATVIRTINIMAS APIE LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
_____________________________________________________________________________
(vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas)
TURINYS
SANTRUMPOS ... 4
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
1 LITERATŪROS APŽVALGA ... 8
Patinų neurohumoralinė reguliacija ... 8
Eržilų eksploatacija ... 10
Sezono įtaka arklių reprodukcijai ... 12
Amžiaus įtaka arklių reprodukcijai ... 14
Veislės įtaka arklių reprodukcijai ... 15
Eržilų spermos kokybė ... 16
Spermos ėmimo būdai ... 17
Testosterono nustatymo būdai ... 18
2 TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 20
Trumpa ūkio charakteristika ... 20
Tyrimo metodika ir eiga ... 22
Statistinė duomenų analizė ... 24
3 TYRIMŲ REZULTATAI ... 25
4 REZULTATŲ APTARIMAS ... 28
5 IŠVADOS ... 30
6 PADĖKA ... 31
7 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 32
SANTRUMPOS
GnRH – gonadotropiną atpalaiduojantis hormonas LH – liuteinizuojantis hormonas
FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas ABP – androgenus jungiantis baltymas IGF – į insuliną panašus augimo faktorius E2 - estradiol-17β
DHT - dihidrotestosteronas TGF - beta – augimo faktorius
PmodS - tarpkanalinių ląstelių nemitogeninis parakrininis faktorius, reguliuojantis Sertoli ląstelių funkciją
EGR – ekstragonodalinės spermos atsargos DSO – spermos paros išeiga
SER – lygusis endoplazminis tinklas PUFA – nesočiosios riebalų rūgštys DPA - dokozapentaeno rūgštis
IMM – vidinis mitochondrijų membrane potencialas PGR – polimerazės grandininė reakcija
HOST – hiposmotinio išsipūtimo testas hCG – žmonių chorioninis gonadotropinas
CLEIA - chemoliuminescencinio fermento imunologinis tyrimas FIA - fluoroimuninis tyrimas
SANTRAUKA
Sezoniškumo įtaka žemaitukų veislės eržilų reprodukcijai Urtė Simonavičiūtė
Magistro baigiamasis darbas
Tikslas nustatyti žemaitukų veislės eržilų amžiaus ir sezono įtaką testosterono koncentracijai ir ejakuliato tūriui bei spermatozoidų judrumui.
Tyrimas atliktas ūkyje „X“, esančiame Radviliško rajone. Pagal genetinius duomenis tyrimui atrinkti 12 žemaitukų veislės eržilų. Suskirstyti į grupes po 6 tiriamuosius eržilus: pagal amžių – iki 8 metų amžiaus ir virš 8 metų amžiaus; ir po 6 pagal sezoną. Nekergimo sezonas – vasario mėnuo ir kergimo sezonas – kovo bei balandžio mėnesiai. Atrinktiesiems eržilams buvo imamas kraujas, ejakuliatas kas 10 dienų, tiriama testosterono koncentracija, ejakuliato tūris ir spermatozoidų judrumas.
Nekergimo sezono metu testosterono koncentracija didėjo, o antrojo kergimo sezono mėnesio metu – mažėjo. Kergimo sezono antrojo mėnesio pradžioje testosterono koncentracija buvo 88,3 proc didesnė lyginant su tyrimo pradžia, o mėnesio pabaigoje 25,5 proc sumažėjo (p<0,05). Nekergimo sezono pradžioje ejakuliato tūris buvo 22 ml ir kergimo sezono metu išaugo iki 109 ml. Nekergimo sezono metu spermatozoidų judrumas didėjo, bet kergimo sezono pirmojo mėnesio pradžioje judrumas buvo didesnis 51,4 proc nei kergimo sezono antrojo mėnesio pabaigoje. (p<0,05). Virš 8 metų amžiaus eržilų testosterono koncentracija iki nekergimo sezono vidurio didėjo, vėliau stabilizavosi ir nekito iki pirmojo kergimo sezono mėnesio vidurio. Pirmojo kergimo sezono mėnesio pabaigoje neženkliai sumažėjo, iki kergimo sezono antrojo mėnesio vidurio pakilo 24, 0 proc ir tyrimo pabaigoje vėl sumažėjo 36, 0 proc lyginant su antrojo kergimo mėnesio viduriu (p<0,05).
Ejakuliato tūris iki 8 metų eržilų tyrimo pabaigoje buvo didesnis lyginant su pradžia 55,9 proc.
didesnis (p<0,05). Vyresnių nei 8 metai – 72,4 proc (p<0,05). Iki 8 metų amžiaus eržilų spermatozoidų judrumas tyrimo eigoje didėjo ir buvo didesnis 19,6 proc (p>0,05), o vyresnių nei 8 metų sumažėjo 37,0 proc tyrimo pabaigoje (p>0,05).
Testosterono koncentracijai turėjo įtakos sezonas, eržilo amžius. Sezonas turėjo įtakos ejakuliato tūriui ir spermatozoidų judrumui. Daugiau įtakos testosterono koncentracijai turėjo sezonas nei eržilų amžius. Taip pat sezonas turėjo didesnės įtakos spermos kokybei.
Raktažodžiai: testosteronas, ejakuliato tūris, spermatozoidų judrumas
SUMMARY
Influence of seasonality for reproduction of žemaitukai breed stallions Urtė Simonavičiūtė
Master’s Thesis
The study was carried out at a farm “X” in Radviliškis district. According to a genetic data, 12 stallions of žemaitukai breed were selected for the present study. Subjects to the study have been divided into different groups, consisting of 6 stallions, based on the following criteria: (i) by age, i.e.
stallions up to 8 years and over 8 years; and (ii) by season, i.e. non-breeding season and breeding season. The following features of the stallions of žemaitukai have been examined during the present study: testosterone levels, ejaculate volume and sperm motility. The before-mentioned features were examined in the intervals of 10 days.
The testosterone levels were increasing during the non-breeding season or during the breeding season, but began to decline at the beginning of the second month of the breeding season. Further, at the beginning of the second month of the breeding season, testosterone levels were 88.3% higher than at the beginning of the present study, however, it decreased by 25.5% at the end of the present study (p <0.05). The volume of ejaculate at the end of the present study was 22 ml and increased to 109 ml.
Furthermore, we found that, until the beginning of the first month of the breeding season, sperm motility has increased, then it has decreased by 51.4%. Testosterone levels of stallions which had more than 8 years old were increasing until the middle of the non-breeding season, then they stabilized and remained stable until the middle of the first month of the breeding season. At the end of the first month of the breeding season, testosterone levels slightly decreased, and increased again by 24.0%
by the middle of the second month of the breeding season, and decreased again by 36.0% at the end of the present study compared to the middle of the second breeding month. In the group of stallions which had less than 8-year-old, ejaculate levels at the end of the breeding season were 55.9 percent higher than at the beginning of the non-breeding season. Finally, sperm motility of stallions which had less than 8-year-old increased throughout the study period, while sperm motility of stallions which had more than 8 years was increasing only until the beginning of the second breeding season, and then decreased by 37.0 percent.
In conclusion, testosterone level was influenced by the season and stallion age. The season influenced ejaculate volume and spermatozoa motility. Testosterone level was more influenced by season than age. The season also had a greater impact on sperm quality.
Keywords: testosterone, ejaculate volume, spermatozoa motility
ĮVADAS
Daugumai gyvūnų rūšių reprodukcinį ciklą apriboja metų laikas (sezonas). Kumelėms lytinį ciklą apsprendžia dienos ilgis – tai sezoninė ruja. Eržilų vaisingumas ne kergimosi sezono metu gali būti sumažėjęs, bet visiškai neišnyksta, priešingai nei kumelių lytinis ciklas. Jie netampa azoospermiški nepaisant sumažėjusio spermatozoidų kiekio. Reprodukcinis ciklas reguliuojamas endogeninio ritmo. Šis ritmas sinchronizuojamas aplinkos dirgiklių, iš kurių svarbiausias yra fotoperiodas - šviesos valandų kiekis paroje [1].
Fotoperiodiniai dirgikliai neuroendokrininiais keliais verčiami į hormoninius signalus ir stimuliuoja lytinių liaukų veiklą. Reprodukcinė veikla nėra tiesioginis atsakas į dienos ilgį, bet yra veikiama gyvūno fotoperiodo istorijos evoliucijos eigoje [1]. Ilgėjant dienai – didėja testosterono, LH ir FSH išsiskyrimas. Taip pat padidėja sėklidžių dydis, spermos gamyba ir lytinis potraukis kergimosi sezono metu. Kiti parametrai, tokie kaip ejakuliato tūris, ejakuliato koncentracija, spermatozoidų judrumas, ph ir normalios morfologijos spermatozoidų procentas taip pat didėja [2].
Eržilo amžius taip pat turi nemenką įtaką reprodukciniam aktyvumui. Labai jauni eržilai nėra tokie vaisingi kaip suaugusieji, dėl to jų panaudojimas veisime ribotas. Tačiau jaunų eržilų ejakuliato tūris didesnis nei senų (senų jis svyruoja nuo 45ml iki 58ml). Nustatyta, kad eržilų reprodukcinis efektyvumas mažėja senstant [3].
Šiomis dienomis šaltakraujų eržilų, tarp jų ir žemaitukų veislės, reprodukcinės savybės mažiau tyrinėtos nei šiltakraujų eržilų. Žemaitukų veislės arkliai Lietuvoje laikomi svarbia lietuvių etninio kultūros paveldo dalimi. Jie yra ties išnykimo riba, auginami tik Lietuvoje. 2007 m. populiaciją sudarė 293 žemaitukai, iš jų 34 veisliniai eržilai, 108 veislinės kumelės ir prieauglis [4]. Siekiant juos išsaugoti, aktualu nustatyti faktorius, turinčius įtakos žemaitukų veislės eržilų reprodukcijai.
Darbo tikslas: nustatyti žemaitukų veislės eržilų amžiaus ir sezono įtaką testosterono koncentracijai ir ejakuliato tūriui bei spermatozoidų judrumui.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti sezono įtaką eržilų testosterono dinamikai
2. Nustatyti sezono įtaką ejakuliato tūriui ir spermatozoidų judrumui 3. Nustatyti eržilų amžiaus įtaką testosterono dinamikai
4. Nustatyti eržilų amžiaus įtaką ejakuliato tūriui ir spermatozoidų judrumui
1 LITERATŪROS APŽVALGA Patinų neurohumoralinė reguliacija
Konkorežinė liauka, pagumburys, hipofizė ir sėklidės yra svarbiausios anatominės struktūros, atsakingos už eržilų reprodukcinę neurohumoralinę reguliaciją, teigia Chenier T. (2000).
Pasak Amann RP. (1993), konkorežinė liauka gamina hormoną melatoniną, reaguodama į šviesos signalus, kuriuos gauna iš tinklainės. Ilgėjant dienai - melatonino gamyba silpsta, todėl didžiausi jo kiekiai pagaminami tamsiuoju paros metu. Gerlach T. (2000) teigia, jog dideli jo kiekiai mažina gonadotropiną atpalaiduojančių hormonų kiekį (GnRH), dėl grįžtamojo ryšio mechanizmo reguliuoja organizmo bioritmus; reguliuoja ir adaptuoja endokrininės sistemos aktyvumą ir organizmo metabolizmą, kintant dienos ir nakties ritmui; stabdo ankstyvą lytinį brendimą ir lytinių liaukų funkciją; sąlygoja gyvūnų lytinio aktyvumo sezoniškumą, veikia kaip „biologinis laikrodis”.
Smegenų pamate esantis pagumburys, veikiamas įvairių dirgiklių, tokių kaip skonis, lytėjimas, klausa ir rega, produkuoja GnRH, kuris vartų kraujagyslėmis nunešamas į priekinę - adeno - hipofizės dalį.
Gonatotropiną atpalaiduojančio hormono sekrecija stimuliuoja liuteinizuojančio hormono (LH) ir folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) gamybą ir išskyrimą hipofizėje. Išskiriamas LH susijungia su Leidigo ląstelių, esančių sėklidėse, receptoriais, skatindamas estrogenų ir testosterono gamybą ląstelėse. FSH stimuliuoja įvairių faktorių produkciją, įskaitant inhibiną, aktiviną, androgenus jungiantį baltymą (ABP) ir į insuliną panašų augimo faktorių (IGF). Šie sėklidžių sekretuojami hormonai ir baltymai per teigiamąjį atgalinį ryšį reguliuoja lytinių hormonų išskyrimą. Estrogenai, ypač estradiol-17β (E2), reguliuoja LH išskyrimą, keisdami GnRH kiekio amplitudę ir dažnį, arba tiesiogiai veikdami adenohipofizę, teigia Muyan M. (1993). Testosteronas taip pat veikia neigiamu grįžtamuoju ryšiu GnRH gamybą, todėl labai svarbu, kad šie sudėtingi neurohumoraliniai mechanizmai veiktų tinkamai, norint išsaugoti nepakitusią spermatogenezę. Roser F. (2000) sako, kad androgenai, sintezuojami Leidigo ląstelių ir veikiami LH, difunduoja į kraujotaką ir limfą, apjuosdami sėklinius kanalėlius, yra surišami su ABP. Norint, kad vyktų normali spermatogenezė, didelė androgenų koncentracija, ypač dihidrotestosterono (DHT), turi praskalauti kanalėlius.
Parakrininiai faktoriai, keičiantys augimo faktorių (TGF-beta) ir PmodS gaminami mioidinių ląstelių, kurios yra testosterono įtakoje, gali reguliuoti Leidigo ląsteles per ABP veiklą ir moduliuoti Sertoli ląstelių funkcionalumą.
Parakrininiai faktoriai - tai ląstelių produktas, kuris veikia šalia esančias ląsteles, moduliuodamas jų funkcijas. Autokrininiai faktoriai - tai ląstelės produktas, kuris tiesiogiai veikia jį pagaminusią ląstelę. Testosteronas, TGF-beta, IGF, inhibinas ir aktivinas yra parakrininiai faktoriai, išskiriami Sertoli ląstelių ir žinomi kaip hormonai, kurie reguliuoja spermatogenezę kitų rūšių gyvūnams, tačiau daugybė įrodymu rodo, kad parakrininiai-autokrininiai faktoriai eržilams taip pat turi didelę reikšmę, sako Jegou B. (1995). Buvo įrodyta, kad inhibinas, glikoproteininis hormonas yra gaminamas abiejose - ir Sertoli, ir Leidigo - eržilų ląstelėse. Nors atrodo, kad inhibinas veikia kartu su testosteronu, reguliuodamas FSH išskyrimą, Taya K. (1998) atlikti tyrimai parodė, kad subfertiliems ir infertiliems eržilams jie vaidina svarbią autokrininę rolę.
1 pav. Žirgų pagumburio-hipofizės-sėklidžių neurohumoralinės reguliacijos schema. Pagumburio gonadotropiną atpalaiduojantis hormonas (GnRH) reguliuoja liuteinizuojančio hormono (LH) ir folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) produkavimą adenohipofizėje. Pagrindinis Leidigo ląstelių reguliatorius yra LH. Pas suaugusius eržilus testosteronas (T) ir estrogenai (E) yra pagrindiniai Leidigo ląstelių produktai. FSH atsakingas už Sertoli ląstelių produktyvumą, kurios išskiria andorgenus sujungiantį baltymą (ABP), inhibiną (INH), aktiviną (ACT) ir į insuliną panašų augimo faktorių (IGF). Hipofizės išskiriamo prolaktino (PRL) vaidmuo sėklidėms nėra žinomas.
Testosteronas grįžtamuoju ryšiu veikia pagumburį ir taip slopina GnRH sekreciją. Estrogenai moduliuoja GnRH sukeltą LH produkavimą. Nėra žinoma, kaip testosteronas ir estrogenai įtakoja FSH išsiskyrimą hipofizėje. (From Roser JF: Reproductive endocrinology of the stallion. In Samper J (ed): Equine breeding management and artificial insemination. Philadelphia: WB Saunders, 2000.) Versta Urtės Simonavičiūtės.
Eržilų eksploatacija
Spermatogenezė tai padalijimo ir diferenciavimo procesas, kurio dėka spermatozoidai gaminami sėkliniuose kanalėliuose. Jie sudaryti iš somatinių (mioidinių ir Sertoli) bei lytinių (spermatogonijų, spermatocitų ir spermatidų) ląstelių. Šios trys germinatyvinių ląstelių rūšys padalina spermatogenezę į spermatocitogenezę, mejozę ir spermiogenezę eilės tvarka. Spermatocitogenezė apima mitozinių ląstelių dalijimąsi, po kurio sudaroma geresnė aplinka vykti spermatogenezei bei kamieninių ląstelių ir pirminių spermatocitų gamybai. Mejozės metu vyksta genetinės medžiagos dubliavimasis ir mainai bei du ląstelių padalijimai, kurie sumažina chromosomų skaičių iki haploidinio. Jos metu gaunami keturi spermatidai. Spermiogenezė - diferenciacija be sferinių spermatozoidų padalijimo į subrendusius spermatozoidus, kurie išsiskiria kaip spermatozoidai.
Kasdieninė spermatozoidų gamyba yra labai susijusi su lytinių ląstelių degeneracija, lytiniu subrendimu, metų laiku ir amžiumi. L. Johnson (1997) teigia, kad spermatogeninis ciklas, kuris skirstomas į tris divizijas, pas eržilus trunka 57 dienas [5].
Kopuliacijos metu vykstančių emisijų skaičius yra būdingas kiekvienai gyvūnų rūšiai ir atspindi intravaginalinius susitraukimus. Pas eržilus jų tipiškai būna 7-9 ir tai sukelia emisijos refleksą.
Emisija tai caudea epididymides (antsėklidžio uodegėlės) lygiųjų raumenų, sėklinio virželio, ampulės, vezikulinių liaukų, prostatos ir, tikėtina, bulbouretralinių liaukų susitraukimas. Tuo pačiu metu susitraukia ir šlapimo pūslės kaklelis, uždarydamas angą iš šlapimo pūslės. Emisija ir šlapimo pūslės kaklelio uždarymas įvyksta per alfa adrenoreceptorius, rašo McDonnell (1992) [6]. Emisijos reflekso eferentinis aspektas, įtraukiantis preganglines simpatines skaidulas, išeinančias iš nugaros smegenų lumbosakralinio segmento, tiesiogiai jungiasi per kaudalinį mezenterinį rezginį su lytiniais organais.
Ejakuliacija - tai priverstinis spermos išstūmimas pro šlaplę, kurį sąlygoja m. ischiocavernosus, m. bulbospongiosus, m. urethralis ir kiti skersaruožiai dubens raumenys. Ejakuliacijos reflekso kelias - per poodinį nervą ir sakralinį segmentą ties nugaros smegenimis. Manoma, kad emisija įvyksta anksčiau ir yra svarbi sužadinant šį refleksą. Eržilas kopuliacijos metu periodiškai išskiria spermą - nuo 5 iki 10 kartų. Pasak Tischner M (1974), kiekvieno vėlesnio ejakuliato išmetimo metu esti mažesnis slėgis, tūris ir spermos koncentracija [6].
Išėję iš sėklidės, spermatozoidai dar negali apvaisinti patelės, todėl migruoja pro vingiuotuosius kanalėlius į antsėklidį ir ten subręsta. Laikas, per kurį spermatozoidai tampa vaisingi, yra labai svarbus ejakuliacijos dažniui. Spermatozoidai eržilo antsėklidyje subręsta per 4-9 dienas. Antsėklidis ir sėklinis virželis paprastai būna kelių dienų spermos rezervuaru ir sudaro ekstragonodalines spermos
Erekcija
Varpa nukritusi dėl corpora cavernosa ir atitraukiamojo varpos raumens sakralinio-parasimpatinio atsipalaidavimo. Erekcija įvyksta dėl
parasimpatinio tarpininkavimo tarp corpora cavernosa ir corpus spongiosus.
Pre-ejakuliacinė sekrecija
Išskiriamas nedidelis kiekis pridėtinių lytinių liaukų sekreto, daugiausia iš prostatos, dėl sakralinio reflekso sukelto pridėtinių liaukų susitraukimo.
Emisija
Spermatozoidų ir pridėtinių lytinių liaukų sekreto išsiskyrimas,
torakolumbarinio reflekso sukeltas sėklinio virželio, ampulės, vezikulinės liaukos, prostatos ir bulbouretralinės liaukos susitraukimas.
Šlapimo pūslės kaklelio užsidarymas
Stiprus šlapimo pūslės kaklelio užsidarymas dėl torakolumbarinio reflekso sukelto šlapimo pūslės kaklelio lygiųjų raumenų susitraukimo.
Ejakuliacija
Priverstinis spermos pašalinimas iš šlaplės dėl sakralinio reflekso sukelto m. bulbocavernosus, m. ischiocavernosus ir m. urethralis raumenų susitraukimo.
Detumescencija
Erekcijos praradimas ir varpos įtraukimas dėl padidėjusio sakralinio- simpatinio lygiųjų raumenų tonuso corpus cavernosum ir corpus spongiosum bei atitraukiamojo varpos raumens susitraukimo.
2 pav. Arklio nervų ir kraujagyslių seksualinė reakcija. Versta Urtės Simonavičiūtės
atsargas (EGR). Iš jų, ypač iš antsėklidžio uodegėlės, ir yra ejakuliacijos metu išmetama sperma.
Poilsio tarp kopuliacijų metu sperma kaupiasi ir pasiekia maksimalų kiekį. Eržilų EGR siekia 89 bilijonus, rašo Amann et. al. (1979). Bendras spermatozoidų skaičius, kurį eržilas gali ejakuliuoti per dieną iš ekstragonodalinių atsargų rezervo, vadinamas spermos paros išeiga (DSO). Tai atskaitos taškas, leidžiantis įvertinti kumelių skaičių, kurias eržilas gali sukergti per dieną kergimo laikotarpio metu. DSO galima nustatyti ejakuliavus eržilą (dirbtine makštimi) vieną ar du kartus per dieną 5-7 dienas. Pirmąsias penkias dienas eržilas gali kergti kumeles, tačiau 5-7 dieną turėtų būti imamas ejakuliatas, kad būtų galima įvertinti ir nustatyti DSO. Paprastai eržilai DSO pasiekia apie 3-4 dieną, o tai parodo optimalų eržilo kergimo dažnio galimybių interval [7].
Sezono įtaka arklių reprodukcijai
Išsamūs tyrimai su eržilais parodė, kad sezonas turi įtakos spermatozoidinėms, sėklinėms ir libido ypatybėms [8]. Sezoninę reprodukcinę veiklą reguliuoja endogeninis ritmas. Šis ritmas sinchronizuojamas aplinkos dirgikliais, iš kurių svarbiausias yra fotoperiodas (šviesusis periodas).
Skirtingai nuo temperatūros, maisto, kritulių ar kitų aplinkos faktorių, fotoperiodas informuoja apie sezoną ir išlieka pastovus kiekvienais metais. Jo metu atsirandantys dirgikliai neuroendokrininiais keliais paverčiami į hormoninius signalus, kurie veikia lytinių liaukų veiklą [1].
Pagrindinę rolę sezoninei reprodukcijai vaidina konkorežinės liaukos hormonas melatoninas.
Šviesa slopina melatonino sintezę, moduliuodama jo biosintetinių fermentų aktyvumą. Melatonino paros sekrecijos trukmė neigiamai koreliuoja su laiku, kai gyvūnas yra veikiamas dienos šviesos.
Arklio kraujo plazmoje esančio melatonino koncentracija nepadidėja prieš saulėlydį, o po saulėtekio netrukus mažėja. Jo išsiskyrimui užtenka nedidelio šviesos intensyvumo auštant ir temstant. Spėjama, kad arkliams melatoninas veikia hipofizės pars tuberalis ir distalis srityse.
Įtaką GnRH sekrecijai atspindi cirkuliaciniai LH išsiskyrimo pokyčiai fotoperiodo metu. Eržilų LH išskyrimas tiesiogiai susijęs su dienos ilgiu. Šio hormono koncentracija kraujo plazmoje didėja prasidėjus veisimosi sezonui. Bazinė LH koncentracija vasarą yra dvigubai didesnė nei artėjant žiemai.
FSH pokyčiai nustatyti priešingi. Vidutinė FSH koncentracija eržilų plazmoje gana pastovi visus metus ir tik nedideli padidėjimai pastebėti kergimosi sezono metu.
Inhibino koncentracija plazmoje kinta priklausomai nuo sezoninės reprodukcinės būklės ir koreliuoja su sėklidžių dydžiu ir testosterono sekrecija [1].
Normalus žirgų veisimosi sezonas prasideda pavasarį ir tęsiasi iki vasaros vidurio. Šiam laikotarpiui būdingas ryškus spermos išskyrimo ir tūrio padidėjimas, taip pat elgesio pokyčiai [9].
Testosterono, liuteinizuojančio hormono ir prolaktino didžiausia koncentracija taip pat yra veisimosi sezono metu [1]. Ištirta, kad prolaktino koncentracija kraujo serume buvo didesnė (P<0,01)
veisimosi sezono metu, o intratestikulinio testosterono koncentracija taip pat buvo didesnė, bet ryškių skirtumų tarp sezonų nepastebėta. Vienos sėklidės Leidigo ląstelių skaičius didesnis kergimosi sezono metu nei kitu metų laiku, taip pat svyruoja ir Leidigo ląstelių dydis metiniame eržilo reprodukcijos cikle [9]. Nustatyta, kad vienoje sėklidėje esančių Leidigo ląstelių skaičius reikšmingai koreliuoja su jų tūriu. Žinoma, kad atskirų Leidigo ląstelių dydis tarp sezonų atitinka lygaus endoplazminio tinklo (SER) kiekį ir bet kuri kita ląstelė, esanti Leidigo ląstelėje, įtakojama sezono.
SER tūris sėklidėje reikšmingai susijęs su hormonų koncentracija, o ypač su Leidigo ląstelių skaičiumi. Kergimosi sezono laiku nustatytas 53% didesnis Leidigo ląstelių skaičius grame sėklidžių parenchimos.
Spermos membranoje yra ilgos grandinės nesočiųjų riebalų rūgščių (PUFA), kurios prisideda prie skysčių, reikalingų membranos susiliejimo, susijusio su apvaisinimu, sklandumo. Daugumos žinduolių spermatozoiduose yra nemažas kiekis omega - 3 nesočiųjų riebalų rūgščių. Omega - 3 PUFA, tokios kaip linoleno, eikozapentaeno ir dokozaheksaeno rūgštys, yra ypač svarbios spermos membranos vientisumui ir atsparumui šalčiui. Eržilų spermatozoiduose taip pat yra daug dokozapentaeno rūgšties (DPA), omega - 6 PUFA. Tačiau PUFA taip pat yra jautrios reaktyvioms deguonies rūšims, todėl peroksidaciniai pažeidimai gali sutrikdyti spermos membranų fusogeniškumą, slopinti prie membranų surištus fermentus ir pakeisti signalo perdavimo modulių, svarbių spermos funkcijai, aktyvavimą. Spermos membranos riebalų rūgščių sudėtis patiria sezoninius pokyčius, o PUFA kiekis didėja artėjant kergimosi sezonui. Nors eržilai išlieka pajėgūs apvaisinti kumeles ištisus metus, žiemą sėklidžių funkcijos endokrininė stimuliacija sumažėja. Be sumažėjusių reprodukcinių funkcijų, šaltakraujų veislėms priskiriami eržilai, išgyvena hipometabolizmo fazę. Kaip ir daugeliui šiaurinėse platumose esančių laukinių žinduolių, taip ir šaltakraujų veislės eržilams sumažėja širdies ritmas ir poodinė bei kūno temperatūra. Naujausi tyrimai rodo, kad panašūs metabolizmo pokyčiai vyksta ir šiltakraujų veislės eržilų organizmuose [11].
Buvo atliekamas ejakuliato lyginamasis tyrimas kergimosi sezono metu ir ne kergimosi sezonu.
Kergimosi sezono viduryje spermos mėginiai parodė geresnes ejakuliato savybes. Nuo kovo pabaigos iki gegužės vidurio ejakuliato mėginiams būdingos geresnės akrosomų vientisumo vertės, daugiau ejakuliato, turinčio didesnį mitochondrijų membranos potencialą ir mažesnis merocianinu dažytų ląstelių procentas. Buvo nagrinėtas spermatozoidų judrumas ir merocianino žymėjimas, nustatyta, kad spermatozoidai turėjo didesnį membranos sutrikimą, susijusį su ejakuliato nejudrumu žiemą, tuo tarpu veisimosi sezono metu daugumai spermatozoidų buvo nustatyta lipidų tvarka, susijusi su judrumu. Kalbant apie progresyviai judriųjų spermatozoidų mitochondrijų aktyvumą, žiemą judrių spermatozoidų, kuriu IMM yra didelis, procentinės vertės buvo panašios į judrių spermatozoidų, kurių IMM yra žemas, procentines vertes. Apskritai, spermatozoidų judrumas ir akrosominis vientisumas koreliuoja su judriaisiais spermatozoidais, turinčiais ir didelį mitochondrijų membranos potencialą,
ir su judriųjų spermos membranų stabilumu; judrūs spermatozoidai, turintys aukštą mitochondrijų membranos potencialą, koreliuojami su judriais spermatozoidais, turinčiais stabilias membranas.
[12]. Tačiau atlikus tyrimus kergimosi sezono metu ir ne kergimosi sezono metu, nustatyta, kad abiejais sezonais eržilo išskiriamo ejakuliato kiekis buvo toks pat [13]. Taigi, galime daryti išvadą, kad dienos ilgis turi didelę įtaką arklių reprodukcinei sistemai.
Amžiaus įtaka arklių reprodukcijai
Carlos Vladimir Herrera - Luna (2015) atliko tyrimą, kurio tikslas buvo apibūdinti LH ir FSH receptorius ir aromatazę įvairaus amžiaus (priešpubertalinių, jaunų, subrendusių ir senų) eržilų antsėklidžio ir sėklidžių audiniuose. Genų ir baltymų ekspresija buvo įvertinta realaus laiko kiekybine polimerazės grandinine reakcija (realaus laiko PGR), imunohistochemija ir daugybiniu imunofluorescencijos žymėjimu. Skirtingo amžiaus eržilų LH mRNR raiškos skirtumų antsėklidžio ir sėklidžių parenchimoje nebuvo. Priešingai, FSH ir CYP19A1 antsėklidžio galvutėje, kūne ir uodegoje bei sėklidžių parenchimoje su amžiumi (P<0,001) padidėjo. LH, FSH ir aromatazės imuniniam žymėjimui įtakos turėjo brendimas. Pas jaunus, subrendusius ir senus eržilus buvo nustatytas teigiamas LH ir aromatazės dažymas Leidigo ląstelėse, tuo tarpu FSH baltymų ekspresija buvo Sertoli ląstelėse ir pirminiuose spermatocituose. Prepubertaliniu laikotarpiu tirtų arklių sėklidžių kanalėliuose aptikas LH, FSH ir aromatazės nusidažymas. Antsėklidžio audinyje aromatazės buvo tik uodegėlėje, nepriklausomai nuo amžiaus. Rezultatai pabrėžia gonadotropino veikimo ir estrogeno gamybos reikšmę eržilo reprodukcinio audinio brendimui. FSH buvimas sėkliniuose kanalėliuose rodo FSH poveikį šios rūšies spermatogenezei [14].
Iš literatūros žinoma, kad endogeninei steroidų gamybai įtaką daro eržilo amžius. Kuo brandesnis eržilas, tuo didesnė lytinių liaukų steroidų koncentracija šlapime ir sėklidžių audiniuose.
[32]. Vienas iš steroidinių hormonų – testosteronas. Jis atsakingas už subrendusio eržilo libido.
Domestikuoti eržilai subręsta maždaug 16 mėnesių amžiaus. Buvo įrodyta, kad nesubrendusių eržilų testosterono koncentracija mažesnė nei subrendusių eržilų [31]. Tyrimais įrodyta, kad 1-2 metų amžiaus eržilų testosterono koncentracija buvo labai žema lyginant su 3, 4 ir 6 metų amžiaus eržilais.
Testosterono koncentracija stabiliai didėja eržilui bręstant (nuo 4 iki 6 metų), o tai rodo ryšį tarp testosterono koncentracijos ir eržilo amžiaus. [30]
Jaunų eržilų, kurių amžius 1-3 metai, spermatogeninis aktyvumas nesieka normos, kuri laikoma normalia suaugusiems eržilams, tai yra DSP/g 14-18 mln. Bendras sėklidžių tūris žirgams, kurių kiekviena sėklidė sveria 70-80 g, turėtų būti 133-152 ml. Norint nustatyti, ar 3 metų eržilai, kurių apskaičiuotas bendras sėklidžių tūris, pasiekia suaugusiųjų spermatogeninio efektyvumo lygį ir ar spermatogeninio efektyvumo laipsnis yra susijęs su jaunų arklių spermos kokybe, reikia papildomų tyrimų. 1-3 metų eržilų grupės spermatogeninio efektyvumo kitimas 45% ir 28% buvo paaiškintas
lytinio ląstelių veiksmingumo sumažėjimu mejozės ir spermiogenezės metu. Lytiškai subrendę (4 metų amžiaus) eržilai, kurių spermatozoidų kiekis yra žemas, spermatogenezės metu, ypač mejozės, taip pat kenčia nuo mažo lytinių ląstelių veiksmingumo. Lytinių ląstelių gebėjimas apvaisinti spermatogenezės metu dar turi būti išaiškintas, todėl šių mažėjimų panašumai mejozės ir spermiogenezės metu tarp lytiškai subrendusių ir nesubrendusių eržilų išlieka spekuliatyvus. Vis dėlto buvo pastebėtas ir lytiškai nesubrendusių eržilų toks pat spermatogeninio efektyvumo kitimas kaip ir pas subrendusius eržilus [3].
A. Naijjar (2010) nustatė, kad nufiltruotos spermos tūris didesnis jaunų eržilų nei senų. Senų eržilų spermos tūris mažesnis už Tibary et. al. (2005) nurodytą mažiausią vertę. Jis svyruoja nuo 45ml iki 58ml.
Labai jauni eržilai nėra tokie vaisingi kaip suaugusieji, dėl to jų panaudojimas veisime ribotas.
Nors eržilams senatvės požymiai pradeda reikštis maždaug nuo 15 metų amžiaus, akivaizdesnis poveikis vaisingumui pastebimas arkliui sulaukus 20-25 metus. Lyginant su kumelėmis, kurioms pagrindinis veiksnys, darantis įtaką reprodukciniam efektyvumui, yra amžius, eržilai išlaiko savo vaisingumo pajėgumą iki 20 metų, o kartais ir ilgiau. Tačiau eržilų reprodukcinis efektyvumas mažėja senstant [15].
Veislės įtaka arklių reprodukcijai
Veislė ar veisimo kryptis gali būti reikšmingi spermos kokybei. Devynių skirtingų veislių spermos kokybės tyrimas parodė reikšmingą veislės poveikį. Arabų veislės eržilų sperma yra žymiai didesnės koncentracijos ir tūrio, kai tuo tarpu Apalūzų ir Amerikos ristūnų veislių eržilų tie patys spermos rodikliai yra ženkliai mažesni. Ponių, Šetlando ponių bei Amerikos miniatiūrinių arklių spermos tūris buvo ženkliai mažesnis lyginant su didelių veislių arkliais [16]. Sunkiasvorių arklių spermos kokybės tyrimai atliekami retai, nors jų sperma vis dažniau pradedama naudoti kumelių sėklinimui. Nustatyta, kad sunkiasvorių arklių sperma išskiriama su gausesniu kiekiu sekreto nei šiltakraujų ar lengvųjų arklių. Iš 189 Noriko veislės eržilų Aurich et al. (2003) nustatė, kad bendras spermos kiekis yra didesnis lyginant su šiltakraujais ar lengvųjų veislių eržilų bendru spermos kiekiu, bet tuo tarpu Noriko veislės eržilų spermos judrumas buvo mažesnis. Torres - Boggino et al. (1995) tyrime Peršeronų ir Bretono veislės eržilų judrių spermatozoidų procentai buvo dideli palyginus su Kvorterio, Arabų, Apalūzų bei Amerikos paintų veislės eržilų judrių spermatozoidų procentais, taip pat ir su Grynakraujų jojamųjų bei Amerikos ristūnų. Stoutas ir Colenbranderis (2011) palygino spermos kokybę tarp Olandų šiltakraujų, Fryzų ir Sunkiųjų grimzlės arklių ir nustatė, kad Sunkiųjų grimzlės arklių ejakuliatuose spermatozoidų judrumas yra žymiai mažesnis lyginant su kitomis veislėmis. Tyrimai su 15 Freibergerių veislės ir Šveicarų lengvųjų, kurie priskiriami šaltakraujams
eržilams, kaip ir Žemaitukų veislės eržilai, parodė, kad šių veislių eržilų spermos kokybė mažai skiriasi nuo šiltakraujų [17].
Eržilų spermos kokybė
Eržilų spermos vertinimas atliekamas dėl įvairių priežasčių - atliekant vaisingumo nustatymą prieš parduodant kaip reproduktorius veisimo sezono pradžioje ar pabaigoje, įtariant nevaisingumą atsižvelgus į kumelių apsivaisinimo procentą.
Spermos išvaizdą lemia spermatozoidų koncentracija. Šviežia eržilo sperma turi būti beveik balta, nepermatoma, su gausiu kiekiu sekreto. Baltos ar raudonos spalvos priemaišos rodo šlapimo ar kraujo buvimą spermoje, o tai nėra normalu.
Vezikulinės liaukos gamina medžiagą, panašią į gelį. Gelis turi būti pašalintas kuo greičiau (geriausia ejakuliacijos metu), kad nesimaišytų su likusia sperma. Gelio frakcija dažnai pašalinama naudojant dirbtinę makštį arba filtruojant per filtrą po spermos surinkimo. Tai atliekama tam, kad būtų lengviau nustatyti spermatozoidų koncentraciją.
Spermos tūris nufiltravus gelio frakciją yra padauginamas iš spermos koncentracijos siekiant nustatyti bendrą kokybiškos spermos kiekį, nes daug spermos prarandama surinkimo metu naudojant dirbtinę makštį [18].
Taip pat vertinamas ir spermatozoidų judrumas. Vertinimo tikslas - nustatyti judrių spermatozoidų procentą ejakuliate. Labai svarbu įvertinti progresyviai judančių spermatozoidų procentą, nes jis parodo spermos pajėgumą apvaisinti. Progresyviai judantys spermatozoidai yra įvardijami kaip „judantys tiesia linija, „santykinai judantys tiesia linija“ bei „besisukantys 360 laipsnių“. Spermatozoidų judrumą vertinant ant per mažų stiklelių, spermatozoido vidurinė dalis prisitvirtina prie spermatozoido galvutės ir sukelia spermatozoido rotaciją 360 laipsnių normaliuose spermatozoiduose. Ejakuliate progresyviai judantys spermatozoidai naudojami kaip kriterijus vertinant eržilo vaisingumą ir nustatant optimalią sėklinimo dozę, siekiant maksimaliai padidinti eržilų, naudojamų sėklinimo programose, reprodukcinį efektyvumą. [19].
Antsėklidžio gaminamas skystis yra rūgštinis, o lytinių liaukų - bazinis. Jų santykis lemia spermos pH. Normalus eržilo spermos pH yra nuo 7,2 iki 7,6. Bet koks spermos užteršimas iš vidaus (pūliais ar šlapimu) ar iš išorės (šiukšlėmis, purvu) padidina spermos pH ir neigiamai veikia spermatozoidų išgyvenamumą.
Sperma turėtų būti klasifikuojama pagal šiuos morfologinius požymius: 1) normalūs spermatozoidai; 2) pakitusios galvutės; 3) nutrūkusios galvutės; 4) proksimaliniai lašeliai; 5) distaliniai lašeliai; 6) pakitusios spermatozoido dalys 7) pakitusios uodegėlės. Kai kurie autoriai naudoja papildomą morfologinę klasifikaciją. Spermos morfologijos įvertinimui turėtų būti tiriama
ne mažiau 200 ląstelių iš kiekvieno ejakuliato, nepriklausomai nuo naudojamos klasifikavimo sistemos [20].
Spermos kokybei įvertinti yra atliekami ir specialieji testai, tokie kaip Spermos chromatino struktūros tyrimas (SCSA), Spermos plazmos šarminės fosfatazės aktyvumas (SPAP), Elektronų mikroskopija, Spermos gyvybingumo tyrimas, Mitochondrijų funkcionalumo tyrimas, Hiposmotinio išsipūtimo testas (HOST). Atliekami ir spermos kapacitacijos testai - akrosomų vientisumo ir funkcionalumo, fluorescencinių žymeklių derinių bei įsiskverbimo į kiaušialąstę ir ląstelių susiliejimo [21].
Spermos ėmimo būdai
H. Lindeberg (1999) rašo, kad prieš prasidedant ejakuliacijai, dėl sakralinio reflekso sukeltų pridėtinių lytinių liaukų susitraukimų, išmetamas skaidrus skystis - priešejakuliacinis sekretas. Pats ejakuliatas susideda iš kelių viena po kitos einančių frakcijų. Pirmosiose frakcijose būna daug spermatozoidų ir antsėklidžio sekreto. Po to išmetamos frakcijos, kuriose yra mažesnis spermatozoidų, bet didesnis sekreto kiekis. Spermoje esantis gelis, kuris yra gaminamas vezikulinių liaukų, pas kai kuriuos eržilus yra išskiriamas ejakuliacijos gale kartu su mažu spermatozoidų skaičiumi.
Eržilų ejakuliatas gali būti renkamas 5 būdais: 1) naudojant „prezervatyvą“, 2) farmakologiškai sukeliant ejakuliaciją, 3) naudojant dirbtinę makštį; 4) ranka manipuliuojant varpą, 5) “atviruoju būdu” - naudojant Equidame fantomą.
„Prezervatyvo metodas” – šiuo metodu surinktas ejakuliatas būna labai užterštas bakterijomis ir įvairiomis šiukšlėmis. Šio metodo metu reikalinga rujojanti kumelė, kurią eržilui kergiant natūraliu būdu, atsiranda didelė rizika varpą užteršti kumelės šlapimu ar išmatomis, ją vedant jai į makštį. Taip pat dauguma eržilų nenori kergti kumelių, kai ant jų varpos uždėtas „prezervatyvas“. Žinoma, atsiranda ir ejakuliato kiekio praradimo tikimybė. Šis metodas yra kaip pagalbinė priemonė eržilui, kuris įpratęs kergti kumeles natūraliu būdu ir neleidžia surinkti ejakuliato naudojant dirbtinę makštį, nes nėra tinkamai to išmokytas.
Farmakologiškai sukeltos erekcijos metodas – atlikta daug tyrimų, kai ejakuliacijai pasiekti buvo naudojamas ksilazinas, imipraminas, ksilazinas kartu su imipraminu, prostaglandinai. Tokiu būdu paimtas ejakuliatas būna mažo tūrio, bet labai koncentruotas. Svarbu, kad eržilas būtų tylioje aplinkoje ir niekieno netrukdomas. Viena iš sėkmingų schemų – skirti 2,0 mg/kg imipramino hidrochlorido į veną. Pasitaiko, kad po ketvirtos imipromino injekcijos, eržilui atsiranda haliucinacijos. Jeigu erekcija nepasiekiama per 10-15 min, į veną leidžiama ksilazino 0,2-0,3 mg/kg.
Naudojant šiuos du preparatus derinyje, ejakuliacija vyksta kartu su erekcija ir masturbacija. Jei
naudojamas tik ksilazinas ejakuliacijai sukelti – erekcija ir masturbacija nevyksta. Ji dažniausiai įvyksta, kai eržilas atsigauna po sedacijos [6].
Metodas naudojant dirbtinę makštį – šis metodas yra labiausiai paplitęs iš visų spermos surinkimo būdų. Dirbtinė makštis pripildoma vandens (48-52oC) ir palaiko pastovią temperatūrą.
Dirbtinės makšties skersmuo gali būti reguliuojamas nuleidžiant vandenį ar jo pripilant. Dirbtinės makšties viduje įklota plėvelė lubrikuojama, siekiant sumažinti trintį. Lubrikantai, kurių sudėtyje yra bakteriostatinių ar spermicidinių medžiagų, neturėtų būti naudojami, nes jie kenkia spermatozoidų judrumui. Vazelinas ar metilceliuliozė gali būti saugiai naudojami. Dirbtinė makštis ilgą laiką išlaiko pastovią vandens temperatūrą viduje, ejakuliatas patenka tiesiai į ejakuliato surinkimo buteliuką ir yra nesunki, ja lengva manipuliuoti [22].
Varpa manipuliuojant varpą – ejakuliatas, surinktas varpą manipuliuojant ranką, panašus į ejakuliatą, surinktą dirbtine makštimi. Pagrindinis šio metodo privalumas – ejakuliatui surinkti reikia tik vieno ar dviejų asmenų. Naudojantis šiuo metodu rujojančios kumelės nebūna. Taip pat ir specialūs prietaisai ar įrankiai nėra būtini. Varpa manipuliuojama ranka, įvyksta erekcija, eržilas lieka stovėti ant žemės arba šoka ant fantomo. Varpa apiplaunama šiltu vandeniu, nes tai irgi stimuliuoja eržilą. Kai varpa pilnai sukietėja, uždedama plastikinė „rankovė“ ar sterilus maišelis ir rankomis stimuliuojama eržilo varpą. Norint padidinti stimuliaciją, prie varpos pagrindo dedamas labai šiltas rankšluostis.
Surenkant spermą reikia laikytis higienos. Surinkimo metu sperma gali būti užteršta bakterijomis iš varpos raukšlių arba apyvarpės. Teigiama, kad naudojant dirbtinę makštį, labiau išlaikomos higienos sąlygos, nes sperma surenkama tiesiai iš šlaplės. Naudojant Equidame fantomą ir laikantis higienos sąlygų, iš sveikų eržilų taip pat galima surinkti spermą, kurioje beveik nėra bakterijų [24].
Testosterono nustatymo būdai
Testosteronas, androgeninis hormonas, turi didelę reikšmę patinų reprodukcijai, įskaitant seksualinį elgesį, spermatogenezę ir kraujo-sėklidžių barjerą. Taigi, testosterono koncentracija gali būti naudojama kaip rodiklis normaliai ar nenormaliai patinų reprodukcinei būklei nustatyti [25].
Dažniausiai vaisingumui nustatyti naudojama atsako į GnRH ar žmonių chorioninį gonadotropiną (hCG) testas [26]. Nors GnRH testas leidžia įvertinti tik hipofizės reakciją, o matuojant LH ar testosterono koncentraciją ir atliekant hCG testą, galima įvertinti tik sėklidžių funkciją. Siekiant įvertinti sėklidžių funkciją pagal testosterono koncentraciją, geresnis pasirinkimas yra hCG testas. Jį galima atlikti ir kergimo, ir ne kergimo sezono metu [27]. Šis testas gali būti naudojamas norint nustatyti, ar eržilas yra kriptorchas, ar buvo iškastruotas, kol sėklidės dar nebuvo nusileidusios į kapšelį [28]. Testosterono koncentracijos nustatymui naudojami radioimuniniai (RIA) tyrimai, kurių
metu laipsniškai formuojami imuniniai kompleksai, naudojant radioaktyviąsias molekules. Vienas iš jų yra chemoliuminescencinio fermento imunologinis tyrimas (CLEIA), kuris paremtas vieno žingsnio konkurencinio imunologinio tyrimo metodu bei fluoroimuninis tyrimas (FIA), pagrįstas fluorescencijos stiprinimo ir slopinimo principu, kad fluorescenciniu atigenu pažymėtos antigeno fluorescencinės savybės pasikeičia, kai susijungia su antikūnu [29].
2 TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Trumpa ūkio charakteristika
Duomenys tyrimui pradėti rinkti 2019 metų vasario, kovo ir balandžio mėnesiais. Tyrimas atliktas ūkyje X.
Ūkyje laikomi ir veisiami žemaitukų veislės arkliai. Kumelės su kumeliukais ir eržilai laikomi atskiruose arklidžių pastatuose. Kiekvienas eržilas yra laikomas atskirame garde, kuris neriboja jo judesių ir laisvės. Kumelės su kumeliukais laikomos kartu viename garde, kumelės, kurios neturi kumeliukų, kiekviena turi po atskirą gardą. Arkliai šeriami geros kokybės šienu, koncentruotais pašarais, kiekviename garde yra įrengta girdykla.
Prasidėjus ganykliniam periodui, veisimui skirtos kumelės išginamos į ganyklas visam sezonui, o rudens pabaigoje, prasidėjus pirmosioms šalnoms, parginamos atgal.
Aplink arklides yra aikštelės, į kurias arkliai išleidžiami dienos metu mocionui.
Ūkyje įrengta laboratorija, kurioje yra atskira patalpa eržilų spermos ėmimui.
Tyrimo grupės. Tyrimo bazėje iš viso yra 20 eržilų, iš jų pagal genetinius duomenis tyrimui buvo pasirinkti 12 žemaitukų veislės eržilų. Tiriamieji eržilai buvo vyresni nei 4 metų amžiaus ir sugrupuoti į 2 grupes – iki 8 metų amžiaus ir virš 8 metų amžiaus.
Tiriamieji eržilai nebuvo veikiami jokiais hormoniniais preparatais ar kitaip stimuliuojama jų neurohumoralinė veikla, neturėjo lytinių organų pakitimų ir išliko kliniškai sveiki visą tiriamąjį laikotarpį.
Kergimo sezonas prasideda kovo mėnesį ir baigiasi liepos viduryje.
Žemaitukų veislės eržilai (n=20)
Žemaitukų veislės eržilai atrinkti pagal genetinius
duomenis (n=12)
Sezonas (n=6) Amžius (n=6)
Nekergimo sezonas – II mėn. (n=3)
Kergimo sezonas –
III, IV mėn. (n=3) Iki 8 metų (n=3) Virš 8 metų (n=3)
Testosterono koncentracijos tyrimas
Spermos ėmimas ir ejakuliato vertinimas
Tūris Judrumas
3 pav. Darbo metodikos schema. Parengta Urtės Simonavičiūtės
Tyrimo metodika ir eiga
Sperma ir kraujas buvo imta 3 mėnesius – vasarį (ne kergimo sezonu), kovą ir balandį (kergimo sezonu) – kas 10 dienų po kartą. Kraujas imtas iš v. jugularis į BD Vacutainer 10ml mėgintuvėlius be priedų, raudonu kamšteliu, serumo biocheminiam tyrimui. Naudotos adatos kraujo ėmimui – BD Eclipse.
Mėgintuvėliai su krauju buvo transportuoti į Gyvulininkystės institute esančią laboratoriją, kur buvo centrifuguojami kraujo kūneliams nuo kraujo plazmos atskirti. Nucentrifuguota plazma mikropipetės pagalba buvo patalpinama į Bio Plas Skirted Screw Cap (Bio Basic Inc., Canada) mėgintuvėlį, surūšiuojama pagal datą ir eržilo vardą, dedama į šaldiklį ir užšaldoma (-25˚C).
4 pav. BD Vacutainer mėgintuvėliai 5 pav. BD Eclipse adatos
6 pav. Bio Plas Skirted Screw Cap mėgintuvėlis
Grįžus į spermos ėmimo laboratoriją ruošiamas muliažas – „fantomas“. Laikantis biologinės saugos reikalavimų, ant jo esantis porolonas apvyniojamas plėvele ir kiekvieną kartą keičiamas dirbant su kitu eržilu.
Ejakuliato surinkimui buvo naudota French (Inra model) tipo dirbtinė makštis. Į jos vidų įklojama vienkartinė plėvelė, ji keičiama kiekvienam eržilui. Į dirtbinę makštį pripilama 3 litrai šilto (48 - 52oC) vandens, viduje esanti plėvelė prie vaginos iš išorės fiksuojama gumomis. Siauresnės vaginos dalies pabaigoje dedamas ejakuliato surinkimo buteliukas, ant jo užmaunamas šilumą izoliuojantis įdėklas spermos terminiam rėžimui palaikyti, kad spermatozoidai nepatirtų šalčio šoko.
Dirbtinėje makštyje esanti plėvelė sutepama naudojant nespermicidinį lubrikantą ir sureguliuojamas dirbtinės makšties slėgis.
Į spermos ėmimo laboratoriją atvedama rujojanti kumelė ir pastatoma į gardą. Šiltu vandeniu ir muilu apiplaunami jos lytiniai organai, ir paimamas tamponėlis nuo kumelės lytinių lūpų, kad būtų pasiektas vomeronasalinis (Jakobsono) organaas, įvykstų Flehmeno reakcija ir eržilas sujaudintų.
eržilui sujaudinti. Jis padedamas ant fantomo aukštesniosios dalies, kad eržilui ant jo užšokus, būtų jaučiami kumelės skleidžiami feromonai.
Eržilas atvedamas į spermos ėmimo patalpą. Jam susijaudinus ir sustandėjus varpai, ji nuvaloma švariu, šiltu vandeniu. Taip pat nuvaloma ir apyvarpė, siekiant dar labiau sumažinti ejakuliato užterštumą bakterijomis. Varpa nuvaloma, nusausinama švariu, minkštu rankšluosčiu.
Eržilui užšokus ant fantomo ir pradėjus jį kergti, varpą įvedama į dirbtinę makštį, suėmus už jos ventralinės dalies. Ta pačia ranka suėmus už varpos pagrindo, ji stabilizuojama vykstant varpos susitraukimams ir ejakuliacijai. Dirbtinė makštis laikoma lygiagrečiai eržilo pilvo sienai. Prasidėjus ejakuliacijai, dirbtinė makštis nukreipiama žemyn, kad ejakuliatas kuo greičiau patektų į ejakuliato surinkimo buteliuką ir būtų išvengta spermatozoidų denatūracijos dėl šilto vandens, esančio dirbtinėje makštyje. Eržilui ejakuliavus, jaučiami stiprūs šlaplės susitraukimai. Eržilas atsipalaiduoja, nurimsta, nuleidžia galvą žemyn ir lieka „gulėti“ ant fantomo kelias sekundes.
7 pav. French (Inra model) tipo dirbtinė makštis
Eržilui nulipus, ejakuliatas iškart perduodamas į laboratoriją analizavimui.
Laboratorijoje vertinamas ejakuliato tūris ir spermatozoidų judrumas. Ejakuliato tūris įvertinamas vaizdiškai ir nustatomas jo kiekis naudojant brūkšnines linijas, žyminčias mililitrus, esančias ant ejakuliato surinkimo buteliuko (eržilo ejakuliato tūrio norma – 50 - 100 ml). Spermatozoidų judrumas vertinamas iškart, nes jis laikui bėgant mažėja. Jis stebimas naudojant stiklines plokšteles, dengiamuosius stiklelius bei šviesos mikroskopą. Stiklinės plokštelės ir dengiamieji stikleliai laikomi ant 37oC temperatūros kaitlentės. Paimama 6 µl ejakuliato ir dedama ant stiklinės plokštelės, uždengiama 18mm2 dengiamuoju stikleliu ir mikroskopuojama 4x padidinimu. Spermatozoidų judrumas vertinamas nuo 0 - 100% (bendras spermatozoidų judrumas = judančių spermatozoidų procentas (Tim Mair, Equine medicine, surgery and reproduction, 2013.pdf).
Kai spermatozoidų judrumas siekia ar viršija 80%, laikoma, kad spermatozoidų judrumo atžvilgiu ejakuliatas yra geros kokybės.
Statistinė duomenų analizė
Norint sužinoti eržilų amžiaus ir sezoniškumo įtaką testosterono koncentracijos kraujyje kitimui, ejakuliato tūriui bei spermatozoidų judrumui buvo atlikta duomenų statistinė analizė.
Naudojantis kompiuterinėmis programomis „Microsoft Office Excel 2010” ir statistinių duomenų skaičiavimo programa „SPSS statistics v21” buvo gauti ir apskaičiuoti rezultatai. Grupėms palyginti buvo naudota vienfaktorinė dispersinė analizė (ANOVA testas). Skirtumai laikomi statistiškai patikimais, kai p<0,05.
3 TYRIMŲ REZULTATAI
Paveiksle 1 vaizduojama testosterono koncentracijos priklausomybė nuo sezono. Grafike matome, kad nekergimo sezono metu testosterono koncentracija didėjo, o antrojo kergimo sezono mėnesio metu – mažėjo. Kergimo sezono antrojo mėnesio pradžioje testosterono koncentracija buvo 88,3 proc didesnė lyginant su pradžia, o tyrimo pabaigoje 25,5 proc sumažėjo (p<0,05).
Paveikslas 9 vaizduoja ejakuliato tūrio kitimo priklausomybę nuo sezono. Matome, kad ejakuliato tūris tendencingai didėjo. Nekergimo sezono pradžioje ejakuliato tūris buvo 22ml ir kergimo sezono metu išaugo iki 109 ml. Vadinasi padidėjo 79,9 proc. (p<0,05).
8 pav. Testosterono koncentracijos kitimo priklausomybė nuo sezono
9 pav. Ejakuliato tūrio kitimo priklausomybė nuo sezono
Paveikslas 10 vaizduoja spermatozoidų judrumo kitimo priklausomybę nuo sezono. Matome, kad nekergimo sezono metu spermatozoidų judrumas didėjo, bet kergimo sezono pirmojo mėnesio pradžioje judrumas buvo didesnis 51,4 proc nei kergimo sezono antrojo mėnesio pabaigoje. (p<0,05).
Paveikslas 11 vaizduoja testosterono koncentracijos kitimo priklausomybę nuo amžiaus. Iki 8 metų amžiaus eržilų testosterono koncentracija didesnė nei vyresnių eržilų. Nekergimo sezono metu didėjo, pirmojo kergimo sezono mėnesį mažėjo, mėnesio pabaigoje koncentracija nekito, antrojo kergimo sezono mėnesio pradžioje vėl kilo ir tyrimo pabaigoje 44, 0 proc. sumažėjo lyginant su antrojo kergimo sezono mėnesio pradžia. Virš 8 metų amžiaus eržilų testosterono koncentracija iki nekergimo sezono vidurio didėjo, vėliau stabilizavosi ir nekito iki pirmojo kergimo sezono mėnesio vidurio. Pirmojo kergimo sezono mėnesio pabaigoje neženkliai sumažėjo, iki kergimo sezono antrojo mėnesio vidurio pakilo 24, 0 proc ir tyrimo pabaigoje vėl sumažėjo 36, 0 proc lyginant su antrojo kergimo mėnesio viduriu. (p<0,05).
10 pav. Spermatozoidų judrumo kitimo priklausomybė nuo sezono
11 pav. Testosterono koncentracijos kitimo priklausomybė nuo amžiaus
Paveikslas 12 vaizduoja ejakuliato tūrio kitimo priklausomybę nuo amžiaus. Stebimas abiejų amžiaus grupių ejakuliato tūrio didėjimas. Iki 8 metų kergimo sezono pabaigoje ejakuliato kiekis buvo 55,9 proc didesnis nei nekergimo sezono pradžioje, virš 8 metų – 72,4 proc. (p<0,05).
Paveikslas 13 vaizduoja spermatozoidų judrumo kitimo priklausomybę nuo amžiaus. Iki 8 metų amžiaus eržilų spermatozoidų judrumas tyrimo eigoje didėjo ir jo pabaigoje buvo didesnis 19,6 proc nei pradžioje, o vyresnių nei 8 metų amžiaus eržilų spermatozoidų judrumas didėjo iki antrojo kergimo sezono mėnesio pradžios ir tyrimo pabaigoje sumažėjo 37,0 proc. (p>0,05).
12 pav. Ejakuliato tūrio kitimo priklausomybė nuo amžiaus
13 pav. Spermatozoidų judrumo kitimo priklausomybė nuo amžiaus
4 REZULTATŲ APTARIMAS
Išsamūs tyrimai su eržilais parodė, kad sezonas turi įtakos spermatozoidinėms, sėklinėms ir libido ypatybėms [8]. Normalus žirgų veisimosi sezonas prasideda pavasarį ir tęsiasi iki vasaros vidurio. Nustatyta, kad testosterono didžiausia koncentracija yra veisimosi sezono metu [1], bet ryškių skirtumų tarp sezonų nepastebėta. Tačiau mūsų tyrimas parodė, kad sezonas turi didelę įtaką eržilų testosterono koncentracijai. Nustatėme, kad nekergimo sezono pradžioje testosterono koncentracija buvo 0,5 proc. ir kergimosi sezono metu išaugo iki 4,3 proc. - padidėjo 88, 3 proc. Bet antrojo kergimo sezono mėnesio eigoje sumažėjo iki 3,2% (25, 5 proc.) (p<0,05).
Buvo atliktas ejakuliato lyginamasis tyrimas kergimosi sezono metu ir ne kergimosi sezonu.
Kergimosi sezono viduryje ejakuliato mėginiai buvo geresnių savybių. Tačiau nustatyta, kad abiejais sezonais eržilo išskiriamo ejakuliato kiekis buvo toks pat [13]. Mūsų atliktas tyrimas parodė, kad ejakuliato tūris nekergimo sezono metu ir kergimo sezono metu tendencingai didėja. Tyrimo metu ejakuliato tūris išaugo nuo 22ml iki 109ml. Tyrimo pabaigoje jis buvo didesnis 79,9 proc. nei tyrimo pradžioje (p<0,05). Taip pat nustatėme, kad sezonas turi įtakos ir spermatozoidų judrumui.
Nekergimo sezono metu spermatozoidų judrumas didėjo, bet kergimo sezono pirmojo mėnesio pradžioje judrumas buvo didesnis 51,4 proc nei kergimo sezono antrojo mėnesio pabaigoje. Autorių teigimu spermatozoidai turi didesnį membranos sutrikimą, susijusį su ejakuliato nejudrumu žiemą, tuo tarpu kergimo sezono metu daugumai spermatozoidų buvo nustatyta lipidų tvarka, susijusi su judrumu.[12]. Mūsų atlikto tyrimo rezultatai sutampa su literatūroje pateiktais rezultatais.
Testosteronas atsakingas už subrendusio eržilo libido. Tyrimais įrodyta, kad 1-2 metų amžiaus eržilų testosterono koncentracija buvo labai žema lyginant su 3, 4 ir 6 metų amžiaus eržilais.
Testosterono koncentracija stabiliai didėja eržilui bręstant (nuo 4 iki 6 metų), o tai rodo ryšį tarp testosterono koncentracijos ir eržilo amžiaus. [30]. Tačiau mūsų tyrimo metu pastebėjome, kad iki 8 metų amžiaus eržilų testosterono koncentracija didesnė nei vyresnių eržilų. Nekergimo sezono metu didėjo, pirmojo kergimo sezono mėnesį mažėjo, mėnesio pabaigoje koncentracija nekito, antrojo kergimo sezono mėnesio pradžioje vėl kilo ir tyrimo pabaigoje 44, 0 proc. sumažėjo lyginant su antrojo kergimo sezono mėnesio pradžia. Virš 8 metų amžiaus eržilų testosterono koncentracija iki nekergimo sezono vidurio didėjo, vėliau stabilizavosi ir nekito iki pirmojo kergimo sezono mėnesio vidurio. Pirmojo kergimo sezono mėnesio pabaigoje neženkliai sumažėjo, iki kergimo sezono antrojo mėnesio vidurio pakilo 24, 0 proc ir tyrimo pabaigoje vėl sumažėjo 36, 0 proc lyginant su antrojo kergimo mėnesio viduriu (p<0,05).
A. Naijjar (2010) nustatė, kad nufiltruoto ejakuliato tūris didesnis jaunų eržilų nei senų. Senų eržilų jis svyruoja nuo 45ml iki 58ml. Mūsų tyrime stebimas abiejų amžiaus grupių ejakuliato tūrio didėjimas. Iki 8 metų kergimo sezono pabaigoje ejakuliato kiekis buvo 55,9 proc. didesnis nei
nekergimo sezono pradžioje, virš 8 metų – 72,4 proc. (p<0,05). Taigi, mūsų tyrimo rezultatai nesutampa su literatūroje pateiktais rezultatais. Tiriant spermatozoidų judrumą, buvo pastebėtas lytiškai nesubrendusių eržilų toks pat spermatogeninio efektyvumo kitimas kaip ir pas subrendusius eržilus [3]. Mūsų tyrime iki 8 metų amžiaus eržilų spermatozoidų judrumas tyrimo eigoje didėjo ir jo pabaigoje buvo didesnis 19,6 proc nei pradžioje, o vyresnių nei 8 metų amžiaus eržilų spermatozoidų judrumas didėjo iki antrojo kergimo sezono mėnesio pradžios ir tyrimo pabaigoje sumažėjo 37,0 proc.
(p>0.05). Autoriai teigia, kad labai jauni eržilai nėra tokie vaisingi kaip suaugusieji, dėl to jų panaudojimas veisime ribotas [15], bet mūsų tyrimo rezultatai rodo, kad jaunų eržilų spermatozoidų judrumas geresnis ir neturi tendencijos sumažėti lyginant su vyresniais eržilais.
5 IŠVADOS
1. Testosterono koncentracijai turėjo įtakos sezonas. Šio hormono koncentracija eržilų kraujyje didėjo nuo nekergimo sezono (vasario mėn) iki kergimo sezono antro mėnesio pabaigos (kovo mėn.), o nuo antrojo kergimo sezono mėnesio pradžios (balandžio mėn. metu) – mažėjo. Kergimo sezono antrojo mėnesio pradžioje testosterono koncentracija buvo 88,3 proc didesnė lyginant su pradžia, o tyrimo pabaigoje 25,5 proc sumažėjo (p<0,05).
2. Sezonas turėjo įtakos ejakuliato tūriui ir spermatozoidų judrumui. Tyrimo pabaigoje ejakuliato tūris buvo didesnis 79,9 proc. lyginant su pradžia (p<0,05). Spermatozoidų judrumas didėjo iki kergimo sezono pradžios ir nuo pirmojo kergimo mėnesio iki tyrimo pabaigos mažėjo. Kergimo sezono pradžioje spermatozoidų judrumas buvo didesnis 51,4 proc nei pabaigoje (p<0,05).
3. Testosterono koncentracijai turėjo įtakos amžius. Jaunesnių eržilų šio hormono koncentracija iki antrojo kergimo sezono buvo didesnė 32, 4 proc. Antrojo kergimo mėnesio metu, didesnė testosterono koncentracija vyresnių eržilų 16, 2 proc. Testosterono koncentracijos dinamika tyrimo metu analogiška, nepriklausomai nuo eržilų amžiaus
4. Eržilų amžius turėjo įtakos ejakuliato tūriui ir spermatozoidų judrumui. Ejakuliato tūris iki 8 metų eržilų tyrimo pabaigoje buvo didesnis lyginant su pradžia 55,9 proc. (p<0,05). Vyresnių nei 8 metai – 72,4 proc (p<0,05). Iki 8 metų amžiaus eržilų spermatozoidų judrumas tyrimo eigoje didėjo ir buvo didesnis 19,6 proc (p>0,05), o vyresnių nei 8 metų sumažėjo 37,0 proc.
tyrimo pabaigoje (p>0,05).
6 PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju magistrinio darbo vadovui prof. dr. Vytuoliui Žilaičiui už supratingumą, pasitikėjimą, užjautimą, patarimus, pasiūlymus, betarpišką bendradarbiavimą, visą man skirtą laiką ir kantrybę.
Dėkoju privačiam veterinarijos gydytojui Remigijui Poškui, kuris visą šį tyrimą buvo kartu, padėjo, patarė, paaiškino, suteikė galimybę susipažinti su nuostabiais žmonėmis.
Taip pat tariu nuoširdų ačiū Lietuvos ūkinių gyvūnų genetinių išteklių apsaugos koordinavimo centro vadovei Rūtai Šveistienei bei VA Gyvulininkystės instituto direktorės pavaduotojui Artūrui Šiukščiui už šiltą priėmimą, patarimus, neišblėstantį humoro jausmą bei suteiktą finansinę pagalbą.
Ačiū visiems, kurie buvo šalia, palaikė, netrikdė ir neapsunkino šio darbo proceso.
