TRISKIAUČIO LAKIŠIAUS (BIDENS TRIPARTITA L.) VAISTINĖS AUGALINĖS ŽALIAVOS FLAVONOIDŲ SUDĖTIES IR ANTIRADIKALINIO AKTYVUMO TYRIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

AGNĖ RADZEVIČIŪTĖ

TRISKIAUČIO LAKIŠIAUS (BIDENS TRIPARTITA L.)

VAISTINĖS AUGALINĖS ŽALIAVOS FLAVONOIDŲ SUDĖTIES IR

ANTIRADIKALINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Dr. Deividas Burdulis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas ___________________________________ (Vardas, pavardė, parašas) ________________________ Data (metai, mėnuo, diena)

TRISKIAUČIO LAKIŠIAUS (BIDENS TRIPARTITA L.) VAISTINĖS AUGALINĖS ŽALIAVOS FLAVONOIDŲ SUDĖTIES IR ANTIRADIKALINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Dr. Deividas Burdulis

(Vardas, pavardė, parašas) ___________________

Data (metai, mėnuo, diena)

Recenzentas Darbą atliko

_______________________ Magistrantė

(Vardas, pavardė, parašas) Agnė Radzevičiūtė (Vardas, pavardė, parašas) ____________________________ _______________________ Data (metai, mėnuo, diena) Data (metai, mėnuo, diena)

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

1. SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

2.1 Triskiaučių lakišių (Bidens tripartita L.) apibūdinimas ir cheminė sudėtis ... 10

2.1.1 Augalo apibūdinimas ... 10

2.1.2 Augalo paplitimas ir dauginimasis ... 10

2.1.3 Triskiaučių lakišių vaistinė augalinė žaliava ... 11

2.1.4 Triskiaučių lakišių žolės cheminė sudėtis ... 11

2.2 Triskiaučių lakišių vaistinės augalinės žaliavos naudojimas medicinoje ... 12

2.3 Vaistinės augalinės žaliavos dozavimas, toksiškumas, nepageidaujamos reakcijos, kontraindikacijos ir sąveikos su kitais vaistais ... 14

2.4 Svarbiausios aktyvių junginių grupės, nustatytos B. tripartita L. vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 14

2.4.1 Flavonoidų apžvalga ir struktūra ... 14

2.4.1.2 Flavonoidų nustatymo metodai ... 16

2.4.1.3 Flavonoidų reikšmė augalams ir panaudojimas medicinos praktikoje ... 16

2.5.2 Rauginės medžiagos ... 17

2.5.2.1 Rauginių medžiagų apžvalga ir struktūra ... 17

2.5.2.2 Rauginių medžiagų poveikis žmogaus organizmui ... 19

2.6 Laisvieji radikalai, antioksidantai, antioksidantinis aktyvumas ... 20

3. TYRIMO METODIKA ... 22

3.1 Tyrimo objektas ... 22

3.2 Naudoti reagentai ir medžiagos ... 23

3.4 Tyrimų metodai ... 23

3.4.1 Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 23

3.4.2 Ekstraktų ruošimo metodika ... 24

3.4.3 Suminio flavonoidų kiekio nustatymas B. tripartita L. vaistinėje augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu metodu ... 24

3.4.4 Titrimetrinis raugų kiekio nustatymas triskiaučių lakišių vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 25

3.4.5 Askorbo rūgšties kiekio nustatymas B. tripartita L. vaistinėje augalinėje žaliavoje titrimetriniu metodu ... 26

3.4.6 Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas triskiaučių lakišių vaistinėje augalinėje žaliavoje DPPH metodu ... 27

3.4.7 Statistinis duomenų įvertinimas ... 28

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29

4.1 B. tripartita L. vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvio nustatymas ... 29

4.2 Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 30

4.3 Suminio flavonoidų kiekio nustatymas B. tripartita L. vaistinėje augalinėje žaliavoje 33 4.3.1 Flavonoidų kiekinės sudėties kitimo dinamika augalo vegetacijos tarpsniais ... 33

4.3.2 Flavonoidų kiekinės sudėties kitimo dinamika skirtinguose Lietuvos regionuose ... 34

4.4 Raugų kiekio nustatymas titrimetriniu metodu triskiaučių lakišių vaistinėje ... 35

augalinėje žaliavoje ... 35

4.4.1 Raugų kiekio kitimo dinamika augalo vegetacijos tarpsniais ... 35

4.4.2 Raugų kiekio kitimo dinamika skirtingose augimvietėse ... 36

4.5 Askorbo rūgšties kiekio įvertinimas Bidens tripartita L. žolėje ... 37

4.5.1 Askorbo rūgšties kiekio kitimo dinamika augalo vegetacijos metu. ... 37

4.5.2 Askorbo rūgšties kiekio kitimo dinamika skirtingose augimvietėse ... 38

4.6 Triskiaučių lakišių ekstraktų antiradikalinio aktyvumo vertinimas ... 39

IŠVADOS ... 42

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43

SANTRAUKA

A. Radzevičiūtės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. Deividas Burdulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas

Pavadinimas: Triskiaučio lakišiaus (Bidens tripartita L.) vaistinės augalinės žaliavos flavonoidų sudėties ir antiradikalinio aktyvumo tyrimas.

Raktiniai žodžiai: Bidens tripartita L., lakišius, flavonoidai, antiradikalinis aktyvumas, spektrofotometrija.

Tyrimo tikslas: Ištirti natūraliose Lietuvos Respublikos augimvietėse surinktos triskiaučių lakišių vaistinės augalinės žaliavos flavonoidų kiekybinę sudėtį bei įvertinti antiradikalinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai: Optimizuoti flavonoidų ekstrakcijos metodiką triskiaučių lakišių vaistinei augalinei žaliavai. Įvertinti flavonoidų, askorbo rūgšties, raugų kiekinės sudėties kitimo dinamiką augalo vegetacijos tarpsniais. Įvertinti flvonoidų, askorbo rūgšties, raugų kiekinės sudėties įvairavimą skirtingose augimvietėse rinktuose ėminiuose. Įvertinti triskiaučių lakišių vaistinės augalinės žaliavos ekstraktų antiradikalinį aktyvumą ir galimą priklausomybę nuo žaliavoje esančių biologiškai aktyvių junginių kiekių.

Tyrimo objektas ir metodai: Natūraliai augančios B. tripartita L. žolės žaliavų mėginiai iš skirtingų Lietuvos regionų. Triskiaučių lakišių kiekybinės flavonoidų sudėties, raugų ir antiradikalinio aktyvumo tyrimas. Antiradikalinis aktyvumas nustatytas DPPH spektrofotometriniu metodu.

Tyrimo rezultatai ir išvados: Ekstrakcijai pasirinkta maceracija ultragarsinėje vonelėje, kaip ekstrahentą naudojant 70 proc. V/V etanolį. Nustatyta, kad biolgiškai aktyvių junginių kiekis B.

tripartita L. žolėje įvairavo vegetacijos metu: flavonoidų kiekis žolėje įvairavo nuo 0,3±0,06 mg/g iki

SUMMARY

A.Radzevičiūtės master‘s thesis. Supervisor Dr. Deividas Burdulis; Lithuanian University of Health Sciences, Medical academy, Faculty of pharmacy, Departament of Pharmacognosy. – Kaunas.

Title: Determination of flavonoid content and antiradical activity in Bur Marigold (Bidens

tripartita L.) herbal raw material.

Keywords: Bidens tripartita L., bur marigold, flavonoids, antiradical activity, spectrophotometry.

The aim: To investigate qualitative composition of flavonoids and to estimate antiradical activity in bur marigold herb.

The objectives of the Study: To determine the most suitable extraction method and the optimum extraction conditions; evaluation of quantitative composition dynamics of flavonoids, tannins and ascorbic acid during the phenological phases and in different growing places; to evaluate antiradical activity in extract of plant raw material and its possible dependence on the amounts of biologically active compounds.

Object and methods: Natural growing Bidens tripartita L. herb. The quantitative composition of flavonoids, tannins and ascorbic acid and the study of antiradical activity. Antiradical acitivty of raw materials identified by spectrofotometric DPPH method.

1. SANTRUMPOS

ABTS – 2,2’-azino-bis-3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties diamino druska ABTS● + – ABTS katijoninis radikalas

CD – cukrinis diabetas

CUPRAC – vario redukcijos antioksidantinė galia DNR – deoksiribonukleorūgštis

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo hidratas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija FRAP – trivalentės geležies jonų redukcijos jėga LD50 – vidutinė mirtina (letali) dozė

LR – laisvieji radikalai

MSK – minimali slopinamoji koncentracija RNR - ribonukleorūgštis

RNS – reaktyviosios azoto formos (angl. reactive nitrogen species) ROS – reaktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen species)

TEAC – troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity)

ĮVADAS

Visame pasaulyje populiarėja vaistinių augalinių preparatų ir vaistinių augalinių žaliavų naudojimas. Augaliniai vaistiniai preparatai pasižymi farmakologinio poveikio įvairove, yra geriau toleruojami ir rečiau sukelia nepageidaujamą poveikį nei cheminiai vaistai. Vaistinės augalinės žaliavos gali būti naudojamos nosies paburkimo mažinimui, smegenų veiklos stimuliavimui, virškinimo gerinimui ir kitiems gydymo bei profilaktikos tikslams. Vietiškai vaistinės augalinės žaliavos gydo įvairias odos ligas, žaizdas, sumažina raumenų skausmą. Vaistinės augalinės žaliavos pasižymi dideliu universalumu gydant įvairius sveikatos susirgimus. Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, apie 35 – 40 proc. vaistinių preparatų gaminama iš augalinių vaistinių žaliavų.

Triskiautis lakišius (B. tripartita L.) – tai vienmetis, astrinių (Asteraceae) šeimos augalas. Šis augalas plačiai paplitęs visoje Europoje, Lietuvoje aptinkamas visuose regionuose. Auga vandens telkinių pakrantėse, grioviuose, šlapiuose dirbamuose laukuose, durpynuose.

Kaip vaistinė augalinė žaliava naudojama triskiaučių lakišių žolė. Triskiaučių lakičių vaistinės augalinės žaliavos cheminėje sudėtyje nustatyta flavonoidų, eterinių aliejų, vitamino C, raugų, kartumynų, β karoteno, gleivių, mineralinių medžiagų (geležies, mangano, chromo, vario, cinko, seleno, kalcio, kalio ir kt.). Triskiaučių lakišių vaistinė augalinė žaliava nuo seno vartojama liaudies medicinoje, kaip bėrimus, neurodermatitą, karščiavimą gydanti priemonė. Triskiaučių lakišių žolė pasižymi priešuždegiminiu, antipiretiniu, antimikrobiniu, priešgrybeliniu, antikoaguliaciniu, priešvėžiniu poveikiu. Šiais laikais triskiaučių lakišių augalinė žaliava populiari dėl poveikio odos ligoms gydyti. Iš triksiaučių lakišių vaistinės augalinės žaliavos ruošiami užpilai, nuovirai, antpilai, aliejiniai tepalai ir vaistažolių mišiniai. Farmakologinį aktyvumą lemia sudėtyje esantys biologiškai aktyvūs junginiai – flavonoidai, raugai, eteriniai aliejai, askorbo rūgštis, kumarinai, mikroelementai.

B. tripartita L. žolės fitocheminės sudėties kiekybinio įvairavimo ir jį įtakojančių veiksnių

nustatymas turi didelę įtaką užtikrinant triskiaučių lakišių vaistinės augalinės žaliavos kokybę. Tikslinga ne tik nustatyti fitocheminės sudėties kiekybinį įvairavimą, bet ir įvertinti antiradikalinį aktyvumą, kuris yra siejamas su triskiaučių lakišių sudėtyje esančiais flavonoidais.

Darbo naujumas. B. tripartita L. vaistinė augalinė žaliava tirta labai mažai palyginus su B.

pilosa L., todėl tyrimo duomenys papildo trūkstamas mokslines žinias. Nedaug tyrinėta triskiaučių

lakišių biologiškai aktyvių junginių, atsakingų už farmakologinį poveikį, kiekybinė sudėtis. Plačiau ištirti tik eteriniai aliejai. Šiame darbe pirmą kartą atliktas kiekybinis biologiškai aktyvių junginių sudėties ir antiradikalinio aktyvumo tyrimas Lietuvos teritorijoje (Panevėžio raj. sav., Rokiškio raj. sav., Radviliškio raj. sav., Vilniaus m. sav.) rinktų triskiaučių lakišių žolės mėginiuose.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti natūraliose Lietuvos Respublikos augimvietėse surinktos triskiaučių lakišių vaistinės augalinės žaliavos flavonoidų kiekybinę sudėtį bei įvertinti antiradikalinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Optimizuoti flavonoidų ekstrakcijos metodiką triskiaučių lakišių vaistinei augalinei žaliavai.

2. Įvertinti flavonoidų, askorbo rūgšties, raugų kiekinės sudėties kitimo dinamiką augalo vegetacijos tarpsniais.

3. Įvertinti flavonoidų, askorbo rūgšties, raugų kiekinės sudėties įvairavimą skirtingose augimvietėse rinktuose mėginiuose.

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1 Triskiaučių lakišių (Bidens tripartita L.) apibūdinimas ir cheminė sudėtis

2.1.1 Augalo apibūdinimas

Triskiautis lakišius (Bidens tripartita L.) priklauso astrinių (Asteraceae) šeimos augalams. Liaudiški lakišių pavadinimai susiję su jų vaisių kibimu: arkliažolė, dvidantis, kibelė, lakešis, ubago utėlės, šuniukai, ubagažolės, lakišas, tirškė. [1, 2]

Tai vienmetis 20 – 70 cm. aukščio žolinis augalas. Šaknis trumpa, šakota. Stiebas status, sultingas, rausvai rudas, šakotas, plikas arba apaugęs retais plaukeliais. [1] Lapai priešiniai, lancetiški, tamsiai žali, kotuoti, kartais bekočiai, triskiaučiai, pakraščiai stambiai nelygiai dantyti. Lapai užauga iki 8 cm. pločio ir 2 cm. skersmens. [3] Žiedai sukrauti stiebų ir šakelių viršūnėse į pavienius (kartais 2 – 3) graižus. Graižai plokšti iki 1,5 cm skersmens. Kiekvienas graižas apgaubtas skraiste, kurios lapeliai ilgesni už graižą. Žiedai smulkūs, dvilyčiai. Vainikėlis nešvariai geltonas, vamzdiškas. [2] Žydi birželio – spalio mėnesį. Vaisius – kibus su 2 – 3 akuotus primenančiomis išaugomis viršūnėje, geltonai rudas lukštavaisis. Išaugos pasidengusios žemyn palinkusiais dygliukais. [2, 4] Lukštavaisiai 5 – 6 mm. ilgio. [5] Vaisiai subręsta rugsėjo – spalio mėnesį. Vienas augalas gali užauginti iki 250 lukštavaisių, kuriuos išnešioja gyvuliai, žvėrys, paukščiai ir žmonės. [1]

2.1.2 Augalo paplitimas ir dauginimasis

Triskiautis lakišius (Bidens tripartita L.) paplitęs Europoje (išskyrus arktinę juostą), Vakarų ir Rytų Sibire, Vidurinėje ir Mažojoje Azijoje, Irane, Indijoje, Kinijoje, Šiaurės Afrikoje, Šiaurės Amerikoje ir Australijoje, bei kai kuriose Ramiojo vandenyno salose.

Lietuvoje aptinkamas visuose regionuose, dažnai auga dirvose, kaip piktžolė. Aptinkami vandens telkinių pakrantėse, grioviuose, šlapiuose dirbamuose laukuose, durpynuose. Auga įvairių tipų dirvožemiuose, tačiau svarbu, kad jis būtų nuolat drėgnas ar šlapias, mėgsta saulės apšviestas vietas. [6]

Dauginasi sėklomis, kurias išnešioja gyvūnai, dirvoje sėklos dygios išlieka 5 – 7 metus. Nupjovus žolę, jei yra pakankamas drėgmės kiekis, augalai atželia ir gaunamas antras žolės derlius. [1, 6]

2.1.3 Triskiaučių lakišių vaistinė augalinė žaliava

Kaip vaistinė augalinė žaliava naudojama triskiaučio lakišiaus (Bidens tripartita L.) žolė. Žaliavai tinka stiebų viršūnės ir stambūs lapai. Žaliava ruošiama prieš pat žydėjimą. Žolė pjaunama 15 – 25 cm nuo žemės paviršiaus, paliekant plikus stiebus. [1] Triskiaučių lakišių žolė džiovinama paskleidus plonu sluoksniu gerai vėdinamoje patalpoje arba džiovykloje, ne aukštesnėje nei 40 o

C temperatūroje. Džiovinimas baigtas, kai lenkiami stiebai lūžta. Gerai išdžiovintos žaliavos lapai yra žali ar rusvi, stiebai žalsvi ar žalsvai violetiniai, savotiško kvapo, sutraukiančio kartoko skonio. [1, 6]

Paruošta vaistinė augalinė žaliava pakuojama į popierinius maišelius ir laikoma sausoje, vėdinamoje patalpoje. Sudžiovinta žaliava gydymui tinkama dvejus metus. [1]

2.1.4 Triskiaučių lakišių žolės cheminė sudėtis

Triskiaučių lakišių vaistinėje augalinėje žaliavoje nustatyti flavonoidai, eteriniai aliejai, vitaminas C, raugai, kartumynai, β karotenas, gleivės, mineralinės medžiagos (geležis, manganas, chromas, varis, cinkas, selenas, kalcis, kalis ir kt.). [6, 7, 8]

Plačiausiai ištirti Bidens tripartita L. kaupiami eteriniai aliejai. Daugiausiai aptinkami monoterpeniniai ir seskviterpeniniai angliavandeniliai. 2011 metais, atliktame tyrime buvo išskirti 26 triskiaučių lakišių eterinio aliejaus komponentai, iš kurių didžiausią dalį sudarė: α – pinenas (4,7 proc. – 21,9 proc.), p – cimenas (2,8 proc. – 19,0 proc.), trans – β – ocimenas (12,2 proc .– 51,9 proc.) ir β – elemenas (7,4 proc. -32,8 proc). [9]

B. tripartita L. žolėje aptinkama kumarinų (skopoletinas, umbeliferonas), karotenoidų (0,05

proc.), vitamino C (iki 0,9 proc.), raugų (7 proc.), 15 mikroelementų, iš kurių didžiąją dalį sudaro kalis (873,60 mg/100ml), kalcis (116,2 mg/100ml), magnis (87,5 mg/100ml), natris (58,1 mg/100ml). Aptikti sunkieji metalai (kadmis, cinkas, švinas, gyvsidabris, varis) neviršija leistinų normų. [1, 11, 12]

2.2 Triskiaučių lakišių vaistinės augalinės žaliavos naudojimas medicinoje

Panaudojimas liaudies medicinoje. Triskiautis lakišius seniai vartojamas augalas. XVII amžiuje Anglijoje išleistoje vaistažolių knygoje, triskiautis lakišius buvo rekomenduojamas nuo „jėgų netekimo“ ir „kietos blužnies“. [13] Tibetiečiai šiuo augalu gydė mažakraujystę, aterosklerozę, o kiniečiai - tuberkuliozę ir mažino karščiavimą. [14] Liaudies medicinoje lakišiais buvo gydomos odos ligos, ypač alerginės kilmės – diatezės, neurodermatitai, odos išbėrimai, galvos seborėja. Odos ligoms gydyti dažniausiai buvo naudojami triskiaučių lakišių mišiniai su kitomis vaistažolėmis: didžiųjų debesylų ir varnalėšų šaknimis, paprastųjų jonažolių, trispalvių našlaičių žole, putinų, šaltalankių, juodųjų serbentų lapais. [1]

Lakišių užpilu, nuoviru, aliejiniu tepalu arba vaistažolių mišiniu gydomos odos ligos, podagra, galvos seborėja, valomas kraujas. Žolės tepalu gydoma egzema ir neurodermatitas, žolės sultimis arba nuoviru – žvynelinė, peršalimo ir urologinės ligos. [2] Šviežios arba džiovintos žolės antpilas su kitais augalais, saugančiais nuo vidurių pūtimo, buvo naudojamas virškinimo sutrikimams gydyti. Vaistinės augalinės žaliavos užpilu prausiamas veidas, mažėja spuogų ir inkštirų. [1, 6]

Triskiaučių lakišių šaknys buvo naudojamos skorpiono įkandimams gydyti, susmulkinti švieži lapai dedami ant gyvatės įgeltos vietos, nes turi dezinfekuojančių ir sausinamųjų savybių. [2, 15] Vaistinės augalinės žaliavos nuoviru dažydavo šilką bei vilną gelsva, ruda ir kitomis spalvomis. [16] Džiovinti graižai naudojami smilkalams, nes degdami skleidžia kvapą, primenantį šviežius sakus arba kedrų medieną. Smilkalai atbaido įvairius vabzdžius, ypač muses. [6] Augalas naudojamas kosmetikoje: užpilu plaunamas kūnas – jis minkština, švelnina odą. [1, 4]

O. N. Pozharitskaya ir kt. 2010 metais įrodė nuo triskiaučių lakišių ekstrakto dozės priklausomą antipiretinį poveikį. Nustatyta, kad B. tripartita L. infuzinis tirpalas neutralizuoja žiurkių kūno temperatūrą praėjus valandai po karagenino injekcijos. Vandeninė B. tripartita L. infuzija 20 mg/kg, veikia greičiau nei indometacinas 5 mg/kg. [18]

Antimikrobinis ir priešgrybelinis poveikis. B. tripartita L. vaistinė augalinė žaliava pasižymi antimikrobiniu poveikiu prieš gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas, bei priešgrybeliniu aktyvumu. [20] Vaistinės augalinės žaliavos antimikrobinis ir priešgrybelinis aktyvumas priklauso nuo eterinių aliejų cheminės sudėties, jį lemia pagrindinio junginio – α – pineno kiekis. [21, 22] Atsparumą gramteigiamoms ir gramneigiamoms bakterijoms sąlygoja ląstelinių membranų skirtumai. Gramneigiamų bakterijų lipopolisacharidų sluoksnis yra lengviau prieinamas lipofiliniams monoterpeniniams angliavandeniliams (α - pinenui). Priešgrybelinis aktyvumas siejamas su sąveika tarp eterinio aliejaus komponentų ir grybelių membranos baltymų. [23, 24] M. Tomczykowa ir kt. (2011) nustatė, kad B.tripartita L. šaknų eterinis aliejus stipriausiai veikia gramneigiamų bakterijų padermes: N. gonorrhoeae (MSK = 3,1 mg/ml) ir M. catarrhalis (MSK = 3,12 ± 2,1 mg/ml). Silpniausias antimikrobinis aktyvumas nustatytas prieš P. aeruginosa ir P. aeruginosa ATCC 27853. Stipriausias priešgrybelinis aktyvumas nustatytas prieš C. albicans ATCC 10231 (MSK = 3,1 mg/ml), mažiausias – C. krusei (MSK = 100 mg/ml). [20]

2008 metais, T. Tomczykowa ir kt. ištyrė triskiaučių lakišių vaistinės augalinės žaliavos ekstraktų, subekstraktų ir eterinių aliejų antimikrobinį ir priešgrybelinį aktyvumą. Didžiausią antimikrobinį aktyvumą prieš gramteigiamus mikroorganizmus parodė B. tripartita L. žolės dietileterio subekstraktai (MKS = 1,5:3,1 mg/ml). Nustatyta, kad visi tirti ekstraktai aktyvūs prieš gramteigiamas bakterijas, tačiau rodo mažą aktyvumą prieš gramneigiamas bakterijas. Visi tirti ekstraktai neparodė jokio priešgrybelinio aktyvumo, tik eteriniai aliejai slopino Candida albicans ir Candida parapsilosis. Antimikrobinis ir priešgrybelinis triskiaučių lakišių poveikis, paaiškina jų naudojimą gydant odos ir gleivinės kandidomikozę, taip pat odos ligas ir uždegimus, kuriuos sukelia grybeliai ir bakterijos. [23]

Priešvėžinis poveikis. Rizika susirgti tam tikrų formų vėžiu, kardiovaskulinėmis ligomis ir kitomis degeneracinėmis ligomis, kurias sukelia oksidacinis stresas, koreliuoja su antioksidantų, kaip flavonoidų ar raugų sumažėjimu. [25]

2.3 Vaistinės augalinės žaliavos dozavimas, toksiškumas, nepageidaujamos

reakcijos, kontraindikacijos ir sąveikos su kitais vaistais

Tinkama vartoti lakišių dozė priklauso nuo keleto veiksnių, tokių kaip paciento amžiaus, sveikatos būklės ir kt. Šiuo metu nėra pakankamai mokslinių tyrimų, kurie įrodytų, tinkamą triskiaučių lakišių vaistinės augalinės žaliavos dozę.

 Šviežios žolės nuoviras – 200 g;

 Džiovintos žolės nuoviras – 100 g; [27]

 Užpilas: 3 valgomieji šaukštai vaistinės augalinės žaliavos į 250 ml verdančio vandens, palaikius 25 – 30 min., geriama 1/3 -1/2 stiklinės 2 – 3 kartus per dieną. [6]

R. B. Sandu ir kt. (2012) tyrimo metu įvertintas triskiaučių lakišių alkoholinio ekstrakto toksiškumas in vivo. Nustatyta, kad saugi triskiaučių lakišių žolės alkoholino ekstrakto dozė LD50 =

201,9 mg/kg kūno svorio. Tačiau šie rezultatai reikalauja tolimesnių tyrimų. [28] Yra mažai duomenų apie triskiaučių lakišių sukeliamą nepageidaujamą poveikį. Gali atsirasti alerginės reakcijos pacientams, kurie alergiški astrinių šeimos augalams. Teoriškai įmanomas astmos būklės pasunkėjimas, astma sergantiems pacientams. [29] Nėra duomenų apie kancerogeniškumą, mutogeniškumą ir genotoksiškumą. Nėra patvirtintų duomenų apie galimas sąveikas su vaistais. Egzistuoja teorinės sąveikos su kalcio antagonistais, β – blokatoriais ir širdies glikozidais. [30, 31, 32]

2.4 Svarbiausios aktyvių junginių grupės, nustatytos B. tripartita L. vaistinėje

augalinėje žaliavoje

2.4.1 Flavonoidų apžvalga ir struktūra

Flavonoidai tai didžiausia fenolinių junginių grupė. Flavonoidus sudaro didelė grupė polifenolinių junginių, turinčių benzo – γ – pirono žiedą. [33, 34] Lig šiol identifikuota daugiau kaip 9000 įvairios cheminės struktūros flavonoidų. [35] Flavonoidai natūraliai aptinkami įvairiuose augalo dalyse (žieduose, lapuose, vaisiuose, stiebuose), bei vaisiuose, daržovėse, gėrimuose, sėklose. [36, 37]

Flavonoidų struktūrai būdinga 15 anglies atomų grandinėlė ir charakteringos C6 – C3 – C6

1 Pav. Pagrindinė flavonoidų struktūra [33]

Flavonoidai paprastai egzistuoja aglikonų arba glikozidų pavidale. Augaluose dažniausiai aptinkami flavonoidų glikozidai. Priklausomai nuo cukraus molekulių, prisijungusių prie anglies atomo 3, 4, 7 padėtyse (rečiau 5, 6, 8 padėtyse), skaičiaus gali būti skirstomi į monosacharidus, disacharidus ir trisacharidus. Glikozidai gali būti skirstomi į O – glikozidus, C – glikozidus, O – C- glikozidus. [41] Pagal hidroksilinimo laipsnį bei C2 – C3 dvigubos jungties buvimą pirono žiede flavonoidai skirstomi į šešias pagrindines klases (2 Pav.). [39, 42]

2 Pav. Flavonoidų klasifikacija [43]

2.4.1.2 Flavonoidų nustatymo metodai

Flavonoidų kiekybiniam ir kokybiniam nustatymui taikomi šie metodai: plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, UV spektrofotometrija. [39, 45] Plačiausiai flavonoidų nustatymui taikomi chromatografiniai analizės metodai. [46]

Chromatografiniai metodai. ESC metodu, ypač atvirkštinių fazių, nustatomi visi komponentai su kitomis junginių formomis ar degradacijos produktais. [39] Atvirkštinių fazių chromatografijai naudojamos C8 ir C18 silicio kolonėlės. [45] Fenolinių junginių struktūrai nustatyti

dažniausiai naudojamas efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodas. [47] Spektrofotometrinis metodas paremtas reakcija su AlCl3. Christ – Müler‘s metodas naudojamas flavonų ir flavonolių nustatymui. [46] Reakcija pagrįsta AlCl3 stabilių kompleksų su

flavonų ir flavonolių C – 4 keto grupe ir C – 3 ar C – 5 hidroksilo grupe. Taip pat reakcijos metu, rūgščioje aplinkoje, susiformuoja nestabilūs AlCl3 kompleksai su orto – hidroksilo grupėmis

flavonoidų A ir B žieduose. [48] Absorbcija matuojama po 30 min. 425 nm bangos ilgyje. [49] Bendras flavonoidų kiekis gali būti išreikštas pagal kvercetino, hiperozido, rutino, apigenino, katechino, galangino ekvivalentą. [46]

2.4.1.3 Flavonoidų reikšmė augalams ir panaudojimas medicinos praktikoje

Flavonoidų reikšmė augalams. Flavonoidai veikia kaip katalizatoriai fotosintezės šviesos fazėje ir kaip jonų kanalų reguliatoriai fosforilinimo reakcijose. Taip pat apsaugo augalų ląsteles nuo reaktyvių deguonies formų, sukeliamo streso, dėl UV spindulius sugeriančių savybių apsaugo augalus nuo UV saulės spindulių ir nuo UV generuojamų reaktyvių deguonies formų. Antocianinai, flavonai, ir flavonoliai augalams suteikia spalvas, tai padeda privilioti augalus apdulkinančius vabzdžius bei sėklas išnešiojančius gyvūnus. Katechinai ir kiti flavonoidai, pasižymintys sutraukiančiu poveikiu, saugo augalus nuo kenkėjų. [33, 39]

Flavonoidų panaudojimas medicinos praktikoje. Flavonoidai pasižymi antioksidaciniu, antimikrobiniu, priešvirusiniu, priešuždegiminiu, kardioprotekciniu, hepatoprotekciniu ir priešvėžiniu poveikiu. [33]

Hepatoprotekcinis poveikis. Tokie flavonoidai, kaip kvercetinas, rutinas, katechinas, apigeninas, naregininas pasižymi hepatoprotekciniu poveikiu. [50]

flavonoidų struktūroje esantis B žiedas, kuris sudaro vandenilinius ryšius su nukleino bazėmis, inhibuodamas DNR ir RNR sintezę bakterijose, yra svarbus antibakteriniam poveikiui. [33]

Priešuždegiminis poveikis. Uždegimas yra normalus organizmo atsakas į audinių pažeidimą, infekcijas, cheminį dirginimą. Paprastai uždegimas praeina greitai ir savaime, tačiau užsitęsęs uždegimas gali sąlygoti lėtinius susirgimus. [52] Nustatyta, kad hesperidinas, apigeninas, luteolinas ir kvercetinas pasižymi priešuždegiminiu ir skausmą malšinančiu poveikiu. [53] Fenoliniai junginiai – kemferolis, kvercetinas, mircetinas ir fisetinas slopina ciklooksigenazę, lipooksigenazę ir fosfodiesterazę. Flavonoidas rutinas veiksmingas esant lėtiniam uždegimui, kuris sukeltas adjuvantinio artrito. [33, 50]

Antioksidacinis poveikis. Plačiausiai ištirtas flavonoidų antioksidacinis poveikis. Antioksidacinis flavonoidų poveikis priklauso nuo funkcinių grupių išsidėstymo struktūroje. Konfigūracija, pakaitai ir hidroksilo grupių skaičius turi įtakos antioksidaciniam aktyvumui, pavyzdžiui laisvųjų radikalų ir sunkiųjų metalų surišimui. [54, 55]

Priešvėžinis poveikis. Tyrimų duomenys parodė, kad in vitro flavonoidai keičia fermentinių sistemų aktyvumą, o in vivo slopina vėžinių ląstelių dalijimąsi ir navikų progresavimą. Nustatyta, kad flavonoidai reguliuoja procesus, vykstančius organizme esant navikui: vaskuliarizaciją, ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją, apoptozę. [56, 57]

Priešvirusinis poveikis. Priešvirusinį poveikį lemia junginio neglikozilinta forma ir hidroksi grupė C3 padėtyje. Nustatyta, kad kemferolis ir luteolinas pasižymi sinergistiniu efektu prieš Herpex

simplex virusą. Katechinai stipriau slopina ŽIV infekciją negu flavonai ir flavononai, o flavonoliai

aktyviau slopina Herpex simplex virusą nei flavonai. [33, 51]

Kardioprotekcinis poveikis. Nustatyta, kad flavonoidų kardioprotekcinis poveikis susijęs su jų antioksidacinėmis, priešuždegiminėmis, lipidų peroksidaciją ir trombocitų agregaciją mažinančiomis savybėmis. [58, 59] In vivo tyrimais įrodyta, kad flavonoidai, turintys 5 – hidroksi grupę, gali apsaugoti nuo miokardo infarkto sukelto drastiškomis sąlygomis, lyginant su flavonoidais, kurie neturi 5 – hidroksi grupės. [59] Flavonoidai pagerina adheziją aortos endotelio ląstelėse, sutrikdo aterosklerozinių plokštelių susidarymą. [58]

2.5.2 Rauginės medžiagos

2.5.2.1 Rauginių medžiagų apžvalga ir struktūra

išskirtinės savybės, kaip gebėjimas jungtis su baltymais, pigmentais, baziniais junginiais, didelės molekulinės masės junginiais ir metalo jonais, leidžia juos atskirti nuo kitų polifenolinių junginių. [62] Raugų struktūros pagrindą sudaro daug atomų turintys įvairios cheminės sudėties fenoliai, nuo paprasčiausių polifenolių iki sudėtingų daugiamolekulių darinių – flobafenų. Daugiausiai raugų molekulėse aptinkami fenoliai pavaizduoti 3 paveikslėlyje. [63]

3 Pav. Dažniausiai raugų molekulėse pasitaikantys fenoliai [63]

Aukštesniuosiuose augaluose aptinkami raugai, atsižvelgiant į jų hidrolizės produktus skirstomi į dvi grupes – hidrolizuoti ir kondensuoti raugai. [63, 64]

Hidrolizuoti raugai. Tai esteriai, sudaryti iš angliavandenilio (dažniausiai D – gliukozės) ir galo rūgšties (galotaninai) arba elago rūgšties (elagotaninai). Silpnų rūgščių ir šarmų poveikyje lengvai hidrolizuojasi į paprastesnes molekules – D gliukozę ir aciklinius junginius (galo arba elago rūgštį). [65]

Kondensuoti raugai. Tai pirokatecholio dariniai, kuriuose aromatiniai ciklai yra susijungę anglies atomo jungtimis (C – C) tarp C8 ir C4. Dar kitaip jie yra žinomi, kaip proantocianidinai. Kondensuoti raugai savo struktūroje neturi cukrų. Suskaidyti į paprastesnius junginius juos galima tik lydant su šarmais. Ši grupė daug didesnė, nei hidrolizuojamų raugų, tačiau, palyginus, mažai ištirta. [63, 65]

4 Pav. Raugų klasifikacija pagal jų struktūrines savybes [60]

Galotaninai. Tai raugai, kurių galo rūgšties vienetai arba depsidai yra prisijungę iki 5 gliukozės molekulių ar kitokių struktūrinių vienetų.

Elagotaninai. Tai raugai, kuriuose yra ne mažiau kaip dvi galo rūgšties molekulės, tarpusavyje sujungtos C-C ryšiu ir nėra glikozidiškai susijusios su katechino vienetais.

Raugų kompleksas. Tai raugai, kuriuose katechino vienetas glikozidiniu ryšiu sujungtas su galotanino arba elagotanino vienetu.

Kondensuoti raugai. Tai oligomeriniai ir polimeriniai proantocianidinai, kurie sujungti vieno katechino C – 4 galu su C – 8 ar C – 6 kito monomerinio katechino galu. [60]

2.5.2.2 Rauginių medžiagų poveikis žmogaus organizmui

pagreitinti kraujo krešėjimą, mažinti kraujo spaudimą ir serumo lipidų kiekį, turėti teigiamą poveikį gydant CD. [66, 69] Taip pat raugai vartojami gerklės skausmo, odos ligų, nuovargio gydymui. [65] Nustatyta, kad kondensuotus raugus vartojant kartu su raudonųjų vynuogių sultimis arba raudonuoju vynu, jie inaktyvuoja žarnyno virusus, Herpes simplex virusą, poliomielito virusą. [70]

2.6 Laisvieji radikalai, antioksidantai, antioksidantinis aktyvumas

Laisvieji radikalai (LR) - tai bet kuri atomų ar molekulių rūšis, kurios valentiniame sluoksnyje yra vienas ar daugiau neusporuotų elektronų. Tokiems dariniams būdingas ypatingai didelis cheminis reaktyvumas. LR pažeidžia biologiškai svarbias molekules tokias kaip DNR, angliavandenius, baltymus ir lipidus. [71]

Antioksidantai - tai medžiaga, kuri efektyviai redukuoja prooksidantą, sudarydama netoksiškus arba mažai toksiškus junginius. Taip sumažinama arba išvengiama biologinių taikinių oksidacinių pažeidimų. [72] Antioksidantai įvairiais veikimo mechanizmais geba neutralizuoti žalingas reaktyvias deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formas. Jų vartojimas sustiprina ląstelės antioksidantinės apsaugos sistemas bei padeda atkurti pažeistas struktūras. [73] Prie antioksidantų priskiriami vitaminai E, C, karotenoidai, tokie fermentai, kaip superoksido dismutazė, kofermentai: ubichinono dariniai (koenzimas Q10). Taip pat prie antioksidantų priskiriami kiti biologiškai aktyvūs junginiai, kaip flavonoidai.

Antioksidantinis aktyvumas – tai medžiagos gebėjimas sustabdyti kitų junginių oksidacinės degradacijos procesus. Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodus santykinai galima skirstyti į tris grupes:

1) biologinius ir klinikinius, kurie dažniausiai atliekami in vivo, siekiant įvertinti antioksidantų įtaką patogenezės mechanizmams, oksidaciniams pažeidimams nustatyti, antioksidantų dozėms įvertinti;

2) biocheminius, kurie įvertina antioksidantų įtaką fermentinėms ir metabolinėms sistemoms

in vitro;

3) cheminius, kur tiesiogiai įvertinamas antioksidantinis aktyvumas naudojant specifinius reagentus, kurių oksidacinės savybės analogiškos kaip laisvųjų radikalų. [74]

reaktyvųjį junginį, antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas atitinkamo standarto ekvivalentais. [75, 76 77]

DPPH laisvųjų radikalų surišimo metodas. Metodas pagrįstas antioksidanto gebėjimu surišti DPPH radikalus. [78] DPPH - tamsiai violetinės spalvos kristalai tirpstantys organiniuose tirpikliuose. DPPH radikalų prieš naudojimą nereikia aktyvuoti, pakanka ištirpinti reikiamą jų kiekį. Violetinės spalvos DPPH radikalai yra redukuojami antiradikaliniu aktyvumu pasižyminčių junginių į blankiai geltoną hidraziną. DPPH radikalų surišimo galia organinėje terpėje vertinama matuojant absorbcijos sumažėjimą prie fiksuoto bangos ilgio (515 – 528 nm intervale), kai absorbcija tampa stabili, arba fiksuojant elektronų sukinio rezonansą. [79]

ABTS radikalų - katijonų surišimo metodas. Metodas pagrįstas antioksidanto gebėjimu surišti ABTS radikalus – katijonus. Vykstant reakcijai bespalvis ABTS reagentas atiduodamas elektroną oksiduojasi į stabilų mėlynai žalios spalvos ABTS● +, kuris absorbuojamas esant 600 – 750 nm bangos ilgio intervale. [80] ABTS radikalų-katijonų surišimo aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentu (TEAC) – tai trolokso tirpalo koncentracija (mM), turinti ekvivalentišką antiradikalinį aktyvumą, kaip ir 1 mM tiriamas bandinys. [81]

FRAP redukcinio aktyvumo nustatymo metodas. Šiuo nustatymo metodu įvertinamas antioksidantų gebėjimas rūgštinėje terpėje redukuoti geležies 2,4,6-tripiridil-s-triazino [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ kompleksą į intensyviai mėlynos spalvos [Fe(II)-(TPTZ)2]2+ kompleksą. [82] Su elektronų

3. TYRIMO METODIKA

3.1 Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – natūraliai augančio triskiaučio lakišiaus (Bidens tripartita L.) žolės mėginiai, surinkti 2014 m. vasarą (birželio – rugpjūčio mėnesiais). Vaistinė augalinė žaliava rinkta skirtingose augimvietėse įvairiuose Lietuvos regionuose (Panevėžio raj. sav., Vilniaus m. sav., Radviliškio raj. sav., Rokiškio raj.sav.). Iš kiekvienos augimvietės surinkta po tris mėginius kas savaitę.

Surinkta augalinė žaliava buvo džiovinama gerai vėdinamoje, sausoje patalpoje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių. Kiekvienas mėginys supakuotas į popierių ir laikytas sausoje bei tamsioje vietoje. Vaistinės augalinės žaliavos mėginių duomenys pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Triskiaučių lakišių žaliavos rinkimo duomenys.

Eilės numeris Rinkimo vieta Rinkimo data

1 Jotainių k., Panevėžio raj. sav. 2014-07-30

2 Jotainių k., Panevėžio raj. sav. 2014-08-03

3 Jotainių k., Panevėžio raj. sav. 2014-08-11

4 Vadoklių k., Panevėžio raj. sav. 2014-07-14

5 Vadoklių k., Panevėžio raj. sav. 2014-08-09

6 Vadoklių k., Panevėžio raj. sav. 2014-08-16

7 Obelių sen., Rokiškio raj. sav. 2014-07-11

8 Obelių sen., Rokiškio raj. sav. 2014-07-21

9 Obelių sen., Rokiškio raj. sav. 2014-08-03

10 Pakalniškių sen., Radviliškio raj. sav. 2014-07-07 11 Pakalniškių sen., Radviliškio raj. sav. 2014-07-19 12 Pakalniškių sen., Radviliškio raj. sav. 2014-07-29

13 Lazdynai, Vilniaus m. sav. 2014-06-29

14 Lazdynai, Vilniaus m. sav. 2014-07-06

15 Lazdynai, Vilniaus m. sav. 2014-07-29

3.2 Naudoti reagentai ir medžiagos

Aliuminio chloridas („Mezobenzon“, Danija); heksametilentetraminas („Sigma – Aldrich“, Vokietija); ledinė acto rūgštis („ЗАО Купавнареактив”, Rusija); kvercetinas („Sigma – Aldrich“, Vokietija); praskiesta vandenilio chlorido rūgštis („Sigma-Aldrich”, Kanada); rektifikuotas etilo alkoholis 96,3 proc. V/V („Stumbras”, Lietuva); DPPH reagentas („Sigma – Aldrich“, Vokietija); indigosulfonrūgšties tirpalas ( „Fluka“, Šveicarija); kalio permanganato 0,02 M tirpalas; ( „Fluka“, Šveicarija).

3.3 Naudota aparatūra

Elektroninės svarstyklės („Sartorius CP6M-0CE”, Vokietija); mechaninė purtyklė („Laboratory shaker 358S”, Lenkija); ultragarso vonelė („Elmasonic P“, Vilnius); spektrofotometras („Beckman DU-70”, JAV); spektrofotometras („Spectronic Comspec M550“, Didžioji Britanija); elektrinis malūnėlis (Coffee grinder, “First”, Austrija); mikropipetės („Eppendorf Research”, JAV); popieriniai filtrai („ODR – 9303”, Vokietija).

3.4 Tyrimų metodai

3.4.1 Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje

Vaistinės augalinės žaliavos mėginys, skirtas analizei, susmulkinamas elektriniu malūnėliu. Džiovinimo spintoje iki pastovios masės išdžiovinami ir pasveriami biuksai. Juose sveriame po tris augalinės žaliavos svėrinius po 2 g (± 0,01 g tikslumu). Augalinė vaistinė žaliava džiovinama džiovinimo spintoje 100 – 105 o_{C temperatūroje iki pastovios (daugiau nekintančios) masės.}

Džiovinimo pradžia – laikas, kai temperatūra džiovinimo spintoje siekia 100 – 105 o_{C. Pirmą kartą}

vaistinės augalinės žaliavos mėginiai sveriami po 2 val. pastovioji masė nustatoma tada, kai du paskutinieji svėrimai, praėjus 30 min. po džiovinimo ir dar 30 min. po vėsinimo eksikatoriuje, skiriasi ne daugiau kaip ± 0,001g.

Nuodžiūvis (proc.) apskaičiuojamas, taikant šią formulę:

čia: m – žaliavos masė (g) prieš džiovinimą;

m1 – žaliavos masė (g) po džiovinimo.

Galutinis rezultatas apskaičiuojamas išvedus trijų svėrimų aritmetinį vidurkį, kuris skaičiuojamas dešimtųjų procento dalių tikslumu. Leidžiamas nuokrypis tarp vienu metu atliekamų bandinių turi būti ne didesnis kaip ± 0,5%. [63]

3.4.2 Ekstraktų ruošimo metodika

Gaminami etanoliniai ekstraktai iš kiekvieno vaistinės augalinės žaliavos mėginio santykiu 1:20. Atsveriama po 1 g (±0,01) kiekvieno, elektriniu malūnėliu susmulkintos vaistinės augalinės žaliavos, mėginio ir užpilama 20 ml (±0,01) 70 proc. V/V etanoliu. Pamaišoma, kad ekstrahentas pasiskirstytų tarp vaistinės augalinės žaliavos. Ekstrahuojama ultragarsu 15 min. kambario temperatūroje, ultragarsinės vonelės galia – 37x100 proc.

Gauti ekstraktai nufitruojami per distiliuotu vandeniu sudrėkintą popierinį filtrą ir išpilstomi į švarius tamsaus stiklo buteliukus, sandariai užkemšami, laikomi tamsioje vietoje kambario temperatūroje.

Gaminama po tris kiekvieno vaistinės augalinės žaliavos mėginio etanolinius ekstraktus tokiomis pačiomis sąlygomis, siekiant atlikti tris pakartojimus ir gauti didesnį rezultatų patikimumą.

3.4.3 Suminio flavonoidų kiekio nustatymas B. tripartita L. vaistinėje augalinėje

žaliavoje spektrofotometriniu metodu

Bendras flavonoidų kiekis nustatomas ekstraktą veikiant aliuminio chlorido tirpalu rūgščioje aplinkoje, jį parūgštinus acto rūgštimi. Bendras flavonoidų kiekis vertinamas lyginant tiriamojo tirpalo absorbcijos koeficientą su kvercetino etaloninio tirpalo absorbcijos koeficientu.

Tiriamojo tirpalo paruošimas: į 25 ml matavimo kolbutę, naudojant mikropipetes, įpilama 0,2 ml paruošto triskiaučių lakišių vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto, 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Po 30 minučių į kolbutę įpilame 0,4 ml 5 proc. heksametiltetramino tirpalo ir skiedžiame išgrynintu vandeniu iki 25 ml žymės, išmaišome. Gauto tirpalo absorbcijos dydis matuojamas esant 407 nm bangos ilgiui ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu.

etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo. Kolbutėje esantis turinys praskiedžiamas išgrynintuoju vandeniu iki 25 ml žymės.

Suminis flavonoidų kiekis vaistinėje augalinėje žaliavoje išreiškiamas kvercetino ekvivalentais (QE) gramui absoliučiai sausai žaliavai, pagal kvercetino kalibracinę kreivę. Apskaičiuojama pagal formulę:

QE = c ×

𝑚

(mg/g)

čia: c – kvercetino koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės;

V – ekstrakto tūris (ml);

m - tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g). [11, 63]

Kvercetino kalibracinei kreivei gauti buvo ruošiami etaloniniai kvercetino tirpalai. Jie buvo ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip tiriamieji tirpalai, tačiau vietoje 0,2 ml tiriamo ekstrakto, pilami 0,2 ml šešių žinomų koncentracijų (0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,03125 mg/ml, 0,015625 mg/ml) kvercetino tirpalai.

Kalibracinė kreivė pavaizduota 5 paveiksle.

5 Pav. Kvercetino kalibracinė kreivė

3.4.4 Titrimetrinis raugų kiekio nustatymas triskiaučių lakišių vaistinėje

augalinėje žaliavoje

Suminiam raugų kiekiui nustatyti taikomas titrimetrinis metodas.

Atsveriama 2 g (± 0,01 g tikslumu) susmulkintos vaistinės augalinės žaliavos ir 500 ml talpos kūginėje kolboje užpilama 250 ml distiliuoto verdančio vandens. Toks mišinys periodiškai pamaišant virinamas 30 min vandens vonelėje, prijungus grįžtamąjį šaldytuvą tam, kad nesumažėtų vandens kiekis ekstrakte. Po 30 min. virinimo vandens vonelėje ekstraktas paliekamas nusistovėti ir atvėsinamas iki kambario temperatūros. Apie 100 ml gautos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos nukošiama per vatą į 200 ml talpos kūginę kolbą atidžiai saugant, kad į nukoštą ekstraktą nepatektų vaistinės augalinės žaliavos dalelių. 25 ml ištraukos pipete įlašinama į 750 ml talpos kolbą, į kurią įpilama 500 ml vandens ir 25 ml indigosulfo rūgšties. Indigosulfo rūgšties tirpalas pagaminamas laboratorijoje prieš suminio raugų kiekio tyrimą: 1,0 g indigokarmino ištirpinama 25 ml sulfato rūgšties, ištirpinus įpilama dar 25 ml sulfato rūgšties ir praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki 110 ml.

Mišinys titruojamas šviežiai laboratorijoje pagamintu kalio permanganato 0,02 M tirpalu nuolat maišant iki tol, kol atsiranda geltona spalva. Ji palyginama su kontrolinio tirpalo, atliekamo kartu, tirpalo spalva.

1 ml 0,02 M kalio permanganato tirpalo atitinka 0,004157 g raugų (perskaičiuotų į taniną). Visiškai sausos vaistinės augalinės žaliavos raugų kiekis procentais apskaičiuojamas naudojant formulę:

𝑋 =

(𝑉 − 𝑉

) × 0,004157 × 250 × 100 × 100

𝑚 × 25(100 − 𝑊)

čia: V – tiriamosios žaliavos ištraukai titruoti sunaudotas kalio permanganato 0,02 M tirpalo

tūris ml;

V1 – tuščiajam mėginiui titruoti sunaudotas kalio permanganato 0,02 M tirpalo tūris ml; m – žaliavos masė g;

W – žaliavos drėgmė proc. [63]

3.4.5 Askorbo rūgšties kiekio nustatymas B. tripartita L. vaistinėje augalinėje

žaliavoje titrimetriniu metodu

natrio 2,6 – dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalu iki blyškios rožinės spalvos, kuri turi neišnykti bent 10 sekundžių.

1 ml natrio 2,6 – dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalo atitinka 0,000088 g askorbo rūgšties.

Askorbo rūgšties kiekis procentais (X) absoliučiai sausai vaistinei augalinei žaliavai apskaičiuotas naudojantis formule:

𝑋 =

𝑉 × 0,000088 × 𝑉

× 100 × 100

𝑚 × 𝑉

× (100 − 𝑊)

čia: V – titravimui sunaudotas natrio 2,6 – dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalo kiekis

ml,

V1 – ištraukos tūris ml, m – VAŽ masė g,

V2 – ištraukos, paimtos titravimui, tūris ml. W – žaliavos drėgmės kiekis proc. [63]

3.4.6 Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas triskiaučių lakišių vaistinėje

augalinėje žaliavoje DPPH metodu

DPPH metodu įvertinamas antioksidantų gebėjimas redukuoti violetinės spalvos DPPH radikalus į blankiai geltonos spalvos hidraziną. Ekstraktų antioksidantinis poveikis įvertinant jų gebą neutralizuoti 2,2–difenil–1– pikrilhidrazilo (DPPH) radikalus.

Darbinio DPPH tirpalo paruošimas: tikslus DPPH reagento svėrinys 0,0017 g ištirpinama 96,3 proc. V/V etanolyje, 100 ml kolbutėje.

Tiriamojo tirpalo paruošimas: į mėgintuvėlį įpilama10 μl tiriamojo ekstrakto ir 3 ml darbinio DPPH tirpalo. Gerai sumaišoma ir laikoma tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 30 min. Po 30 min. laikymo tamsoje, spektrofotometru matuojamas tiriamųjų tirpalų absorbcijos sumažėjimas esant 515 nm bangos ilgiui. Kaip lyginamas tirpalas naudojamas 96,3 proc. V/V etanolis. [85]

Antiradikalinis triskiaučių lakišių ekstraktų aktyvumas nustatomas pagal trolokso kalibracinės kreivės lygtį ir išreiškiamas TE (mg/g). Apskaičiuojama pagal formulę:

čia: C – trolokso koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės;

V – ekstrakto tūris (ml);

m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).

Pirminis trolokso tirpalas ruošiamas 0,025 g trolokso ištirpinant 25 ml kolbutėje 96,3 proc. V/V etanolyje. Iš gauto motininio trolokso tirpalo ruošiami 0,0625 mg/ml, 0,125mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1 mg/ml koncentracijos darbiniai tirpalai. Trolokso kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas ir tiesinė regresijos lygtis pavaizduoti 6 paveiksle.

6 Pav. Trolokso kalibracinė kreivė DPPH metodu

3.4.7 Statistinis duomenų įvertinimas

Šių tyrimų rezultatams apdoroti naudota Excel (versija 14) programa, įtraukta į Office 2010. Jos pagalba susisteminti duomenys, nubraižyti grafikai, apskaičiuoti vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, paklaidos, įvertintas statistinis duomenų reikšmingumas.

y = 0,4461x + 0,1628 R² = 0,9986 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Abs o rbcij a

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

4.1 B. tripartita L. vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvio nustatymas

Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis nustatytas remiantis metodika aprašyta 3.4.1 skyriuje.

B. tripartita L. surinkimo vieta, data ir nuodžiūvis pavaizduotas 2 lentelėje.

2 lentelė. B. tripartita L. nuodžiūvis tirtuose mėginiuose (n=3)

Rinkimo vieta Rinkimo data Nuodžiūvis (proc.) ir VSN

Jotainių k., Panevėžio raj. sav. 2014-07-30 8,07±0,4

Jotainių k., Panevėžio raj. sav. 2014-08-03 7,77±0,3

Jotainių k., Panevėžio raj. sav. 2014-08-11 7,42±0,3

Vadoklių k., Panevėžio raj. sav. 2014-07-14 6,98±0,2

Vadoklių k., Panevėžio raj. sav. 2014-08-09 7,45±0,3

Vadoklių k., Panevėžio raj. sav. 2014-08-16 8,06±0,4

Obelių sen., Rokiškio raj. sav. 2014-07-11 7,58±0,3

Obelių sen., Rokiškio raj. sav. 2014-07-21 8,47±0,4

Obelių sen., Rokiškio raj. sav. 2014-08-03 7,6±0,3

Pakalniškių sen., Radviliškio raj. sav. 2014-07-07 7,54±0,3 Pakalniškių sen., Radviliškio raj. sav. 2014-07-19 7,69±0,2 Pakalniškių sen., Radviliškio raj. sav. 2014-07-29 8,05±0,2

Lazdynai, Vilniaus m. sav. 2014-06-29 7,1±0,2

Lazdynai, Vilniaus m. sav. 2014-07-06 6,97±0,2

Lazdynai, Vilniaus m. sav. 2014-07-29 7,35±0,3

4.2 Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas

Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas yra svarbus žingsnis siekiant užtikrinti ekstrakcijos efektyvumą. Ekstrakcijos sąlygos optimizuotos pagal šiuos parametrus: tinkamiausio poliškumo tirpiklio parinkimas, optimalus ekstrakcijos laiko nustatymas, atliekant maceraciją purtyklėje ir ekstrakciją ultragarsinėje vonelėje.

Ekstrakcijos sąlygų optimizavimui ir tirpiklio parinkimui buvo naudoti mėginiai surinkti Jotainių k., Panevėžio raj. sav, 2014-08-03.

Ekstrakcijos tirpiklio ir jo koncentracijos nustatymas. Literatūroje rasta duomenų, kad B.

tripartita L. ekstrakcijai, kaip ekstrahentas dažniausiai naudojamas metanolio ir vandens mišinys. [86]

Dėl didelio metanolio toksiškumo buvo ruošiami triskiaučių lakišių ekstraktai naudojant skirtingos koncentracijos etanolio tirpalą (30, 50, 70, 96 proc. (V/V)) ir distiliuotą vandenį. Triskiaučių lakišių vaistinė augalinė žaliava susmulkinama elektriniu malūnėliu ir pasvėrus 1 g (±0,01 g tikslumu), užpilama 20 ml ekstrahento kūginėse kolbutėse. Šios kolbutės kratomos specialioje laboratorinėje purtyklėje 1 valandą kambario temperatūroje. Optimalus tirpiklio parinkimas nustatomas spektrofotometriškai ir vertinamas pagal bendrą flavonoidų kiekį. Rezultatai, gauti atlikus tris pakartojimus. Rezultatai pateikti 7 paveiksle.

7 Pav. Suminis flavonoidų kiekis (mg/g) triskiaučių lakišių žolėje naudojant skirtingo poliškumo tirpiklius (n=3)

Tyrimo rezultatai parodė, kad didžiausia flavonoidų išeiga gauta naudojant 70 proc. etanolio tirpalą (3,0±0,4 mg/g), mažiausia flavonoidų išeiga gaunama naudojant 96 proc. etanolio tirpalą (0,4±0,3 mg/g). Remiantis tyrimo duomenimis tolimesniems tyrimams pasirinktas 70 proc. etanolio tirpalas (p<0,05). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Vanduo 30 proc. 50 proc. 70 proc. 96 proc.

F la vo no idų k iek is ,m g/g .

Ekstrakcijos metodo ir trukmės parinkimas. Veikliųjų medžiagų ekstrakcijai pasirinkti du metodai – maceracija purtyklėje ir ekstrakcija ultragarsinėje vonelėje. Siekiant palyginti, kuris metodas tinkamesnis: ekstrakcijos efektyvumas įvertinamas pagal suminį flavonoidų kiekį, nustatytą spektrofotometriniu suminio flavonoidų kiekio įvertinimo metodu.

Pats paprasčiausias ekstrahavimo metodas – mechaninis mėginio ir tirpiklio purtymas. Buvo paruoštas ekstraktas iš 1 g (±0,01 g tikslumu) susmulkintos triskiaučių lakišių augalinės žaliavos ir 20 ml 70 proc. (V/V) etanolio. Ekstrahavimas atliekamas purtyklėje, nustačius 150 apsisukimų per minutę ir atitinkamai ekstraktai maceruojami pirmasis - 30 min, antrasis - 60 min, trečiasis - 90 min, ketvirtasis - 3 val, penktasis ir šeštasis - 3 val, bet dar paliekami stovėti laboratorijoje 24 val. ir 48 val. atitinkamai kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Rezultatai, gauti atlikus tris pakartojimus, pateikiami 8 paveikslėlyje.

8 Pav. Maceracijos trukmės įtaka suminiam flavonoidų kiekiui triskiaučių lakišių ekstraktuose (n=3)

Suminis flavonoidų kiekis tiesiogiai didėja priklausomai nuo ekspozicijos laiko, tačiau po tam tikro laiko pradeda mažėti. Didžiausia flavonoidų koncentracija nustatyta po 24 val. trukusios maceracijos (0,27±0,01 mg/g). Praėjus 48 val. suminis flavonoidų kiekis pradeda mažėti (0,21±0,02 mg/g ) ekstrakte vyksta veikliųjų medžiagų kiekybiniai ir kokybiniai pokyčiai.

Siekiant pagerinti ekstrahavimo efektyvumą ir sutrumpinti laiką, reikalinga maksimaliai išekstrahuoti flavonoidų frakciją, gali būti naudojamas ekstrahavimas ultragarsinėje vonelėje. Ekstrakcijai ultragarso vonelėje atsveriama po 1 g (±0,01) pasirinktos vaistinės augalinės žaliavos, užpilama 20 ml 70 proc. V/V etanoliu, sandariai uždaroma. Ektrakcija ultragarsinėje vonelėje atliekama kambario temperatūroje (25 o

C), 37x100 proc. galia skirtingais laiko intervalais: 5 min, 10 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

30 min. 60 min. 90 min. 3 val. 24 val. 48 val.

F la vo no idų k iek is , m g/g .

min, 15 min, 20 min, 25 min. Po ekstrakcijos ultragarsinėje vonelėje suminis flavonoidų kiekis nustatomas spektrofotometriniu metodu. Gauti rezultatai pateikiami 9 paveiksle.

9 Pav. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės įtaka suminiam flavonoidų kiekiui(n=3)

Didžiausias ekstrakcijos efektyvumas ultragarsinėje vonelėje pasiekiamas po 15 min (0,28±0,003 mg/g). Ekstrahuojant ilgiau nei 15 min ekstrakcijos efektyvumas mažėja ir gaunamas mažesnis bendras flavonoidų kiekis (0,13 ±0,03 mg/g) dėl galimo biologiškai aktyvių medžiagų skilimo. Nustatyta, kad ekstrahavimas ultragarsinėje vonelėje (20-100 kHz) yra produktyvesnis, mažiau tirpiklio ir energijos sąnaudų reikalaujantis procesas. [87] Flavonoidų stabilumas priklauso nuo jų struktūros ir ekstrakcijos sąlygų. Pavyzdžiui, po ilgai trunkančios ekstrakcijos ultragarsu, greičiau skyla tokie flavonoidai, kurie turi daugiau fenolinių grupių, o stabilūs išlieka tokie, kurie turi cukrų fragmentų ir metoksilo funkcinių grupių. [88]

Palyginus rezultatus atliekant maceraciją purtyklėje ir ekstrahuojant ultragarsinėje vonelėje, buvo pasirinktas ektrakcijos ultragarsu 15 min. metodas. Nors suminis flavonoidų kiekis atliekant maceraciją purtyklėje (0,27±0,01 mg/g) ir ekstrakciją ultragarsu (0,28 ±0,003 mg/g) ganėtinai panašūs, ekstrakcija ultragarsu pasirinkta dėl trumpesnės ektrakcijos trukmės.

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

5 min. 10 min. 15 min. 20 min. 25 min.

F la vo no idų k iek is , m g/g .

4.3 Suminio flavonoidų kiekio nustatymas B. tripartita L. vaistinėje augalinėje

žaliavoje

4.3.1 Flavonoidų kiekinės sudėties kitimo dinamika augalo vegetacijos tarpsniais

Flavonoidų kiekybinės sudėties pokyčiai B. tripartita L. žolės vegetacijos periodu nustatyti spektrofotometriškai (metodika aprašyta 3.4.3 skyriuje), naudojant spektrofotometrą „Beckman DU-70”. Tiriamiesiems ekstraktams ruošti buvo pasirinkti B. tripartita L. žolės mėginiai, surinkti iš skirtingų Lietuvos regionų natūralių augimviečių. Ekstraktai pagaminti pagal ekstrakcijos sąlygų nustatymo metu pasirinktą didžiausią flavonoidų suminį kiekį ekstrahuojančią metodiką.

Nustatyta, kad suminis flavonoidų kiekis augalinėje vaistinėje žaliavoje reikšmingai priklauso nuo augalo vegetacijos tarpsnių. Manoma, kad vaistinė augalinė žaliava, turėtų būti surenkama augalo žydėjimo metu, nes didžiausias suminis flavonoidų kiekis nustatomas augalo butonizacijos ir žydėjimo fazėse. [89] Didžiausias flavonoidų kiekis B. tripartita L. žaliavoje nustatytas augalo butonizacijos metu (0,28±0,04 mg/g), mažiausias – sėklų brandinimo metu (0,16±0,05 mg/g). Apskaičiavus statistinį duomenų reikšmingumą, nustatyta, kad flavonoidų kiekis yra statistiškai reikšmingas visose augalo vegetacijos fazėse (p<0,05). Gauti tyrimo rezultatai pavaizduoti 10 paveikslėlyje.

10 Pav. Bendro B. tripartita L. flavonoidų kiekio kitimo dinamika augalo vegetacijos metu (n=3).

Nepavyko rasti literatūros duomenų apie triskiaučių lakišių žolės flavonoidų kiekinės sudėties kitimo dinamiką augalo vegetacijos fazėmis, todėl atlikti tyrimai yra aktualūs ruošiant kokybišką vaistinę augalinę žaliavą, kurioje būtų sukaupiani didžiausi flavonoidų kiekiai. Apibendrinant gautus tyrimo rezultatus, galima teigti, kad flavonoidų kiekis triskiaučių lakišių žolėje reikšmingai pradeda

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

Butonizacija 06.29 Žydėjimo pradžia 07.06 Masinis žydėjimas 07.29 Žydėjimo pabaiga 08.03 Sėklų brandinimas 08.11 F la vo no idų k iek is , m g/g

mažėti augalo žydėjimo pradžioje, todėl patartina triskiaučių lakišių žolę, kaip vaistinę augalinę žaliavą rinkti augalo butonizacijos metu, prieš pat žydėjimą.

4.3.2 Flavonoidų kiekinės sudėties kitimo dinamika skirtinguose Lietuvos

regionuose

Siekiant nustatyti bendro flavonoidų kiekio įvairavimą mėginiai surinkti iš skirtingų natūralių augimviečių Lietuvoje. Analizuojant triskiaučių lakišių žolės mėginius iš skirtingų Lietuvos regionų augimviečių nustatytas bendras flavonoidų kiekio vidurkis mėginiuose buvo 0,21±0,02 mg/g. Rezultatai pateikiami 11 paveiksle.

11 Pav. Suminis flavonoidų kiekis triskiaučių lakišių žolėje, skirtinguose Lietuvos regionuose (n=3)

Didžiausias suminis flavonoidų kiekis (0,23±0,04 mg/g) nustatytas B. tripartita L. žolės mėginiuose, Lazdynuose, Vilniaus miesto savivaldybėje. Nežymiai skyrėsi flavonoidų kiekis nustatytas Vadoklių kaime, Panevėžio rajono savivaldybėje (0,22±0,06 mg/g). Mažiausias flavonoidų kiekis nustatytas triskiaučių lakišių mėginiuose rinktuose Pakalniškių seniūnijoje, Radviliškio rajono savivaldybėje (0,16±0,01 mg/g). Tačiau trūksta išsamesnių duomenų apie vakarinius ir pietinius regionus, todėl reikėtų atlikti daugiau tyrimų, norint tiksliau įvertinti flavonoidų kiekio įvairavimą skirtingose Lietuvos regionuose.

Gauti tyrimų rezultatai buvo palyginti su literatūroje pateiktais kitų tyrimų duomenimis. Kadangi apie Lietuvos mokslininkų tyrimus vykdytus su triskiaučių lakišių vaistine augaline žaliava duomenų nepavyko rasti, rezultatai lyginti su užsienio mokslininkų atliktais tyrimais. M. Wolniak ir kt.

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Jotainių k., Panevėžio raj. sav

Vadoklių k., Panevėžio raj. sav

Obelių sen., Rokiškio raj. sav

Pakalniškių sen., Radviliškio raj. sav Lazdynai, Vilniaus m. sav F la vo no idų k iek is , m g/g

(2007) atliktame tyrime su skirtinguose Lenkijos regionuose rinkta triskiaučių lakišių vaistine augaline žaliava, nustatytas suminis flavonoidų kiekis metanoliniame ekstrakte sudarė 1,23±0,01 mg/ml. [86] Skirtumus tarp rezultatų galima paaiškinti biologiškai aktyvių junginių kiekio priklausomybe nuo aplinkos sąlygų: saulės spindulių, drėgmės kiekio, taip pat rezultatus galėjo įtakoti skirtingos ekstrakcijos sąlygos, augalinės žaliavos geografinė augimvietė, skirtingas augalo genotipas. [90]

4.4 Raugų kiekio nustatymas titrimetriniu metodu triskiaučių lakišių vaistinėje

augalinėje žaliavoje

4.4.1 Raugų kiekio kitimo dinamika augalo vegetacijos tarpsniais

Įvairių autorių duomenimis augalinę žaliavą rekomenduojama rinkti žydėjimo, butonizacijos ir žydėjimo, ar butonizacijos metu. [91] Todėl tikslinga tyrimams rinkti augalinę žaliavą per visą vegetacijos laikotarpį. Viename vaistiniame augale yra aptinkami kondensuoti ir hidrolizuojami raugai, tačiau dažniausiai vyrauja tik viena iš šių grupių. [63] Nustatyta, kad triskiaučių lakišių augalinėje žaliavoje vyrauja kondensuoti raugai. Mokslinių tyrimų duomenimis įrodyta, kad raugų kokybinė sudėtis yra panaši visuose B. tripartita L. organuose: žieduose, žolėje, lapuose, stiebuose, ir nekintanti visą vegetacijos periodą. [92]

Rauginių medžiagų kiekio kitimo priklausomybė nuo vaistinio augalo vegetacijos tarpsnio pavaizduota 12 paveikslėlyje.

12 Pav. Raugų kiekio kitimo dinamika B. tripartita L. vegetacijos metu (n=3) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Butonizacija 06.29 Žydėjimo pradžia 07.06 Masinis žydėjimas 07.29 Žydėjimo pabaiga 08.03 Sėklų brandinimas 08.11 Ra ug ų k iek is , pro c.

Didžiausias raugų kiekis nustatytas augalo žydėjimo pradžioje - 35,75±0,4 proc. Statistiškai reikšmingas raugų kiekio kitimas augalo žydėjimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu (p<0,05). Mažiausias raugų kiekis nustatytas augalo butonizacijos metu (11,86±0,4 proc.). Daroma prielaida, kad biologinis raugų vaidmuo yra labai didelis: raugai reikalingi tam, kad vaistinis augalas apsisaugotų nuo gresiančių infekcijų, vabzdžių ar gyvūnų žalos. Kuo gaminama daugiau raugų, tuo apsauga didesnė. Žydėjimo metu vaistinis augalas yra pažeidžiamiausias, todėl teigiama, kad raugų produkcija prieš žydėjimą ir jo metu yra didžiausia. [60, 69]

Tyrimo metu gautus duomenis galima palyginti su M. Zagnat ir kitų atliktu tyrimu, kurio metu nustatyta, kad vidutinis raugų kiekis vaistinėje augalinėje žaliavoje yra 5,77 proc. Didžiausia raugų suma nustatoma triskiaučių lakišių lapuose (8,91 proc.), mažiausia – stiebuose (1,46 proc.). [92]

Didžiausia raugų koncentracija nustatyta augalo žydėjimo periodu, todėl atsižvelgiant į raugų kiekį, triskiaučių lakišių vaistinę augalinę žaliavą rekomenduojama rinkti žydėjimo periodu.

4.4.2 Raugų kiekio kitimo dinamika skirtingose augimvietėse

Siekiant nustatyti bendro raugų kiekio įvairavimą mėginiai surinkti iš skirtingų natūralių augimviečių Lietuvoje. Nustatytas bendras raugų kiekio vidurkis skirtinguose Lietuvos regionuose buvo 18,16±0,4 proc. Tyrimo rezultatai pateikiami 13 paveikslėlyje.

13 Pav. Raugų kiekio įvairavimas B. tripartita L. žolėje, skirtinguose Lietuvos regionuose (n=3) 0 5 10 15 20 25 30 35 Jotainių k., Panevėžio raj. sav Vadoklių k., Panevėžio raj. sav Obelių sen.,

Rokiškio raj. savPakalniškių sen.,Radviliškio raj. sav Lazdynai, Vilniaus m. sav Ra ug ų k iek is , pro c.

Didžiausias raugų kiekis nustatytas B. tripartita L. žolės mėginiuose, Vadoklių kaime, Panevėžio rajono savivaldybėje (28,67±0,6 proc.). Taip pat didelis raugų kiekis aptiktas mėginiuose rinktuose Pakalniškių seniūnijoje, Radviliškio rajono savivaldybėjė (25,78±0,6 proc.). Mažiausias raugų kiekis nustatytas triskiaučių lakišių mėginiuose rinktuose Lazdynuose, Vilniaus miesto savivaldybėje (7,02±0,4 proc.). Didelius skirtumus tarp raugų kiekio skirtinguose regionuose galėjo lemti augalo vegetacijos fazė, dirvožemio drėgmės kiekis. Nustatyta, kad daugiau raugų aptinkama augaluose, kurie surinkti iš sausesnių vietovių arba yra stipriai pigmentuoti. [92]

4.5 Askorbo rūgšties kiekio įvertinimas Bidens tripartita L. žolėje

Askorbo rūgščiai būdingos redukcinės savybės, kuriomis remiantis atliekama jos kiekybinė analizė. Literatūros duomenimis askorbo rūgšties kiekio nustatymui gali būti taikomi įvairūs metodai: titrimetrija, fluorimetrija, potenciometrija ir chromatografija su spektrofotometriniu detektoriumi. [93] Askorbo rūgšties kiekybinės analizės tyrimui pasirinkta titrimetrija. Šis metodas pagrįstas tuo, kad mėlynos spalvos indikatorius 2,6 – dichlorfenolindofenolis, veikiant askorbo rūgščiai, redukuojasi ir virsta bespalviu junginiu. [63] Tirti visi surinkti vaistinės augalinės žaliavos mėginiai. Titrimetrinis metodas modifikuotas taip, kad būtų kuo tikslesnis: vietoj mikrobiuretės naudotos mikropipetės, kad ekvivalentinis taškas būtų nustatomas kuo tiksliau (0,01 ml tikslumu).

4.5.1 Askorbo rūgšties kiekio kitimo dinamika augalo vegetacijos metu.

14 Pav. Askorbo rūgšties kiekio kitimas B. tripartita L. žolės mėginiuose, augalo vegetacijos metu (n=3)

Gauti rezultatai rodo, kad didesnis askorbo rūgšties kiekis aptinkamas augalo žydėjimo pradžioje (0,19±0,4 proc.). Todėl vaistinę augalinę žaliavą norint naudoti kaip vitamino C šaltinį, reikėtų rinkti iki augalo žydėjimo pabaigos. Literatūros šaltiniuose informacijos apie askorbo rūgšties kiekio įvairavimą triskiaučių lakišių žaliavoje rasti nepavyko, todėl tai gali būti pirmasis tokio pobūdžio tyrimas.

4.5.2 Askorbo rūgšties kiekio kitimo dinamika skirtingose augimvietėse

Rezultatai pateikiami 15 paveiksle.

15 Pav. Askorbo rūgšties kiekio įvairavimas, triskiaučių lakišių žaliavoje, rinktoje skirtingose natūraliose augimvietėse (n=3)

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Butonizacija 06.29 Žydėjimo pradžia 07.06 Masinis

žydėjimas 07.29 pabaiga 08.03Žydėjimo

Sėklų brandinimas 08.11 Ask orbo rūg št ies kiek is , pro c.

Augalo vegetacijos fazės

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 Jotainių k., Panevėžio raj. sav Vadoklių k., Panevėžio raj. sav Obelių sen., Rokiškio raj. sav

Pakalniškių sen., Radviliškio raj. sav Lazdynai, Vilniaus m. sav Ask orbo rūg št ies kiek is , pro c.

Siekiant nustatyti bendro askorbo rūgšties kiekio įvairavimą mėginiai surinkti iš skirtingų natūralių augimviečių Lietuvoje. Askorbo rūgšties kiekio vidurkis skirtinguose Lietuvos regionuose – 0,1±0,05 proc. Reikšmingų askorbo rūgšties kiekio pokyčių tirtuose regionuose nenustatyta (p>0,05). Didžiausias askorbo rūgšties kiekis nustatytas Vilniaus miesto savivaldybėje (0,12±0,08 proc.), mažiausias - Panevėžio rajono savivaldybėje, Jotainių kaime (0,08±0,03 proc.). Apie kitų mokslinikų atliktus tyrimus susijusius su askorbo rūgšties kiekio įvairavimu skirtinguose Lietuvos ar užsienio regionuose duomenų nepavyko rasti. Atsižvelgiant į askorbo rūgšties kiekį, triskiaučių lakišių vaistinę augalinę žaliavą galima rinkti įvairiuose Lietuvos regionuose, tačiau reiktų išsamesnių tyrimų.

4.6 Triskiaučių lakišių ekstraktų antiradikalinio aktyvumo vertinimas

Antiradikalinio aktyvumo įvertinimui pasirinktas spektrofotometrinis DPPH radikalų surišimo metodas, kuris aprašytas 3.4.6 skyriuje. Šis metodas paremtas antioksidanto gebėjimu redukuoti violetinės spalvos DPPH radikalus į blankiai geltonos spalvos hidraziną. Lyginant su kitais antiradikalinio aktyvumo metodais, DPPH radikalas yra stabilus, prieš naudojimą nereikia jo aktyvinti. [78]

Antiradikalinio aktyvumo vertinimas augalo vegetacijos periodu. Rezultatai pateikiami 16 paveiksle.

16 Pav. Vegetacijos tarpsnio įtaka antiradikaliniam aktyvumui B. tripatita L. ekstraktuose (n=3)

Nustatyta, kad B. tripartita L. žolės antiradikalinis aktyvumas vegetacijos metų įvairuoja nuo 2,57±0,01 mg/g iki 2,24±0,03 mg/g. Antiradikalinis aktyvumas augalo vegetacijos metu reikšmingai

2 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 Butonizacija 06.29 Žydėjimo pradžia 07.06 Masinis

žydėjimas 07.29 Žydėjimo pabaiga08.03

Sėklų brandinimas 08.11 Ant ira dik a lin is a k ty v um a s TE D P P H (μ m o l/g )