LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Agnė Gropienė
Veiksniai įtakojantys kampilobakterijų išgyvenimą paukštynų
aplinkoje
Factors affecting survival of Campylobacter spp. in
surroundings of broiler farm
Veterinarinės maisto saugos ištęstinių studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr.Mindaugas Malakauskas
2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Veiksniai turinys įtakos kampilobakterijų išgyvenimui paukštynų aplinkoje“.
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE (aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas, (parašas)
pavardė) Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3 TURINYS SANTRAUKA ...4 SUMMARY...4 SANTRUPOS ...5 ĮVADAS ...6 1.LITERATŪROS APŽVALGA...8 1.1 Kampilobakterijos ir jų klasifikacija...8 1.2 Kampilobakterijų epidemiologija ...10 1.3 Žmonių kampilobakteriozė ...15
1.4 Kampilobakterijų aptikimas ir identifikavimas...18
2. MEDŽIAGOS IR METODAI...20
2.1 Mėginių rinkimas naudojant antbačių metodiką...20
2.2 Kloakų mėginių ėmimas ...20
2.3 Kampilobakterijų išskyrimas ...21
2.4 Bendro bakterijų skaičiaus nustatymas mėginiuose ir išskyrimas...21
2.5 DNR išskyrimas ...22
2.6 Kampilobakterijų identifikavimas PGR metodu...22
2.7 PGR produkto elektroforezė ...24
2.8 Bakterijų rūšių identifikavimas pagal 16sRNR geną...25
2.9. Amplifikuotų produktų aptikimas agarozės gelyje ...25
2.10. PGR produkto elektroforezė ...26
2.11. Amplifikuotų produktų valymas prieš sekvenavimą ...27
2.12. Paruošimas sekvenavimui ...27
2.13. Duomenų analizė...27
2.14. Kampilobakterijų genotipavimas ...28
2.15. Bakterijų kultūrų paruošimas išgyvenimo tyrimui...28
2.16. Kampilobakterijų skaičiaus nustatymas...29
3.TYRIMO REZULTATAI ...30
3.1. Kampilobakterijų rūšių įvairovė broilerių pulke ir paukštidės aplinkoje ...30
3.2. Kampilobakterijų genotipavimas ...31
3.3. Kampilobakterijos paukštyno aplinkoje...33
3.4 Bendras bakterijų skaičius aplinkos mėginiuose ...34
3.5 Bakterijų rūšių nustatymas...34
3.6 Kampilobakterijų išgyvenimo tyrimas...36
4. REZULTATŲ APTARIMAS ...38
IŠVADOS ...41
REKOMENDACIJOS ...42
4 SUMMARY
Agnė Gropienė
FACTORS WHICH INFLUENCE SURVIVAL OF CAMPYLOBACTER SPP. IN SURROUNDINGS OF BROILER FARM
Master thesis
Work instructor: dr. M. Malakauskas Lithuanian
Veterinary Academy
Faculty of Veterinary Medicine Department of Infectious Diseases Kaunas, 2015
The coverage of the work 51 pages, 8 tables and 7 pictures.
The present study was designed to estimate the factors which influence survival of Campylobacter spp. in surroundings of broiler farm. There were chosen one broiler farm in Lithuania and investigated samples around one broiler house during all flock breeding period. Broiler cloacae samples were collected too to establish the significance of campylobacters from surroundins to broilers colonization.
A total of 47 broiler house and 30 surroundings samples were collected and tested for
Campylobacter spp. contamination. Thermophilic Campylobacter spp. were isolated by both direct
inoculation on mCCDA selective medium and by selective enrichment in Bolton enrichment broth. Multiplex-PCR method was used for detection and identification of thermophilic Campylobacter species.
Our findings showed that overall 55,84 % (43 out of 77) of the collected samples were contaminated with campylobacters, there were 13 surroundings samples (30,23 %) and 30 broilers samples (69,77 %).C. jejuni has been found in 74,42 % of the tested samples C. coli in 20,93 % and
both species together in 4,65 % respectively.
Genus Staphylococcus and Pseudomonas dominated in Camplybacter-positive samples. The maximum total number of bacteria was established in samples where genus Pseudomonas were established too.
C. jejuni genotype Nr. 2 was detected both in broilers faeces samples and in broiler house
surroundings samples. The highest prevalence of C. jejuni (40 %) was established in zone Nr. 1, which is nearest to the broiler house.
5 SANTRUPOS
µl – mikrolitrai
DNR - deoksiribonukleorūgštis
EFSA – Europos maisto saugos tarnyba
ULSVIS - Užkrečiamųjų ligų ir jų sukėlėjų valstybės informacinė sistema ksv – kolonijas sudarantys vienetai
6 ĮVADAS
Per maistą plintančių patogeninių bakterijų sukeliamos infekcijos ir keliamas pavojus žmonių sveikatai turi būti eliminuojamas arba sumažintas iki minimumo. Termotolerantinės bakterijos, priklausančios Campylobacter genčiai (ypač C. jejuni, C. coli, C. lari ir retais atvejais C.
upsaliensis) yra dominuojantys per maistą plintantys patogenai, sukeliantys žmonėms virškinamojo
trakto sutrikimą, vadinamą kampilobakterioze.
Kampilobakterijų sukeltos infekcijos daugelyje pasaulio šalių yra dažnesnės nei salmoneliozė ar šigeliozė. Ekonomiškai besivystančiose šalyse šių sukėlėjų sukelti viduriavimai yra dažniausi tarp mažų vaikų. Pastaraisiais metais ir ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse Campylobacter bakterijų sukeliamų susirgimų skaičius turi didėjimo tendenciją, kurios priežastys nėra gerai žinomos.
Europos maisto saugos tarnybos duomenimis, 2011 metais užfiksuota 220209 kampilobakteriozės atvejų, tai yra 2,2% daugiau nei 2010 metais. Kampilobakteriozė daugeliu atvejų pasireiškia kaip sporadinis susirgimas, protrūkiai nustatomi retai. Sporadinius atvejus dažniausiai sukelia kamplobakterijomis užkrėsta mėsa ir kiti maisto produktai. Protrūkius sukelia nepasterizuoto pieno ir kampilobakterijomis užteršto geriamojo vandens vartojimas (Heuvelink et al., 2009).
Mėsai auginamų naminių gyvūnų ypač paukščių, kiaulių, karvių ir avių bei šiltakraujų laukinių gyvūnų virškinamasis traktas yra termotolerantinių kampilobakterijų rezervuaras, tačiau esama ir kitų šaltinių: kampilobakterijomis užterštas geriamasis vanduo, užkrėsti vandens telkiniai, nepasterizuotas pienas, įvairios jūros gėrybių rūšys, naminiai gyvūnėliai, vabzdžiai ir kita. Iš šių šaltinių patekę į maisto gamybos grandinę kampilobakterijos išplinta ir galutiniame etape pasiekia vartotoją, sukeldamos susirgimą (Allos et al., 2001; Humprey et al., 2007; Moore et al., 2005).
Kampilobakteriozės tipiniai klinikiniai simptomai yra ūmūs pilvo skausmai, gausus, dažnai su krauju viduriavimas, karščiavimas, pykinimas, tačiau galimos ir poinfekcinės komplikacijos: artritas, dilgėlinė arba eritema, mazginė. Sunkiausia komplikacija yra Guillan-Barre sindromas, kurį lydi neurologiniai sutrikimai, periferinės nervų sistemos sutrikimas ir paralyžius. C. jejuni sukelta infekcija sudaro 30% Guillan-Barre sindromo atvejų (Allos et al., 2001; Humprey et al., 2007; Drenthen et al., 2011). C. jejuni sukelia didžiąją dalį (>83%) simptomatinių žmonių kampilobakteriozės infekcijų (Snelling et al., 2005).
7 (Jorgensen et al., 2002) greičiausiai dėl pakankamai aukštos jų kūno temperatūros, nes šioms bakterijoms palankiausia temperatūra yra 37-42 °C. Kampilobakterijomis užsikrėtusiems broileriams nepasireiškia jokie ligos simptomai, jie dideliais kiekiais išskiria šias bakterijas į aplinką (10 ksv grame išmatų). 8
Didžioji dalis pasaulio paukštienos produkcijos yra užkrečiama kampilobakterijomis skerdykloje. Paukštienos apdorojimo metu broilerių virškinamasis traktas gali būti pažeistas, tuomet skerdenėlės užteršiamos kampilobakterijomis. Tokiu būdu atsiranda galimybė, kad tokia užkrėsta paukštiena pasieks vartotojus ir tai yra rimta visuomenės sveikatos problema (Lee and Newell, 2006).
Kampilobakterijos sėkmingai išgyvena maisto grandinėje ir tampa rizikos veiksniu virtuvėje, kur galutinai paruošiamas maistas, nebent griežtai laikomasi higienos reikalavimų (Mazick et al., 2006).
Kampilobakterijų paplitimą broilerių pulkuose įtakoja skirtingi aplinkos veiksniai (Hald et al., 2007; McDowell et al., 2008; Ogden et al., 2007). Potencialūs horizontalaus užkrėtimo taršos kampilobakterijomis veiksniai gali būti siejami ir su kitų gyvūnų šėrimu paukštyne (Bull et al., 2006; Cardinale et al., 2004), graužikų buvimu (McDowell et al., 2008), darbuotojais, kurie dėvi savo asmeninius darbužius vietoj darbo aprangos paukštidėje, necementuotas paukštidės grindinys, kartono iš peryklos naudojimas lesinimui (Cardinalle et al., 2004). Geriamasis vanduo ir musės taip pat gali būti siejami su broilerių užsikrėtimu kampilobakterijomis (Hald et al., 2007; Ogden et al., 2007).
Darbo tikslas – įvertinti aplinkos aplink paukštidę galimą įtaką broilerių užsikrėtimui kampilobakterijomis ir veiksnius, turinčius įtakos kampilobakterijų išgyvenimui paukštynų aplinkoje.
Darbo uždaviniai:
1. Išskirti kampilobakterijas iš pasirinkto broilerių pulko ir iš paukštidės aplinkos. 2. Nustatyti bakterijų rūšių įvairovę pasirinktame broilerių pulke ir paukštidės aplinkoje. 3. Nustatyti ryšį tarp tam tikrų kampilobakterijų rūšių ir broilerių bei aplinkos
8 1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Kampilobakterijos ir jų klasifikacija
1963 metais kampilobakterijos buvo nustatytos pirmą kartą, o 1973 metais atliktas Butzler et al. tyrimas atskleidė kampilobakterijų ryšį su žmonių diarėja (On, 2001). Kampilobakterijų gebėjimas sukelti gyvūnų ligas žinomas nuo 1909 metų, o kaip žmonių ligų sukėlėjas jos pripažintos maždaug nuo 1980 metų. Yra nustatyta 16 kampilobakterijų rūšių (On, 2001; Foster et al., 2004).
Campylobacter gentis, kartu su Arcobacter ir Sulfurospirillum priklauso Campylobacteriaceae
šeimai ir dažniausiai yra žmonių ir naminių gyvūnų komensaliniai mikroorganizmai (Vandamme, 2000). Campylobacteraceae šeima priskiriama Epsilonproteobacteria klasei, kuriai priskiriamos
spiralinės bakterijos, iš kurių Helicobacteraceae šeima, apimanti Helicibacter ir Wolinella gentis yra artimiausia Campylobacteraceae šeimai (Garrity et al., 2005). Šiandien Campylobacter genčiai priskiriama 30 kampilobakterijų rūšių ir 13 porūšių (Euzeby, 2010). Iš visų kampilobakterijų rūšių
C. jejuni ir rečiau C. coli dažniausiai įtakoja žmonių susirgimus. Kitos 12 kampilobakterijų rūšių
taip pat išskiriamos iš klinikinių užsikrėtimo požymių turėjusių ir neturėjusių pacientų mėginių. Tai:
C. concisus, C. curvus, C. fetus, C. hominis, C. hyointestinalis, C. lanienae, C. lari, C. mucosalis, C. rectus, C. showae, C. sputorum ir C. upsaliensis. Vis tik šios rūšys sudaro tik vieną procentą nuo
bendro kampilobakterijų sukeltų susirgimų skaičiaus (Lastovica, 2006).
Kampilobakterijos yra nedidelės, gramneigiamos, lenktos spiralės formos apie 0,2 – 0,9 μm pločio ir apie 0,5 – 5 μm ilgio bakterijos. Jos yra judrios, nes turi vieną arba du žiuželius ląstelių galuose. Vienintelės išimtys yra Campylobacter gracilis, kuri yra nejudri ir Campylobacter showae, kuri turi kelis žiuželius (Debruyne et al., 2005). Visos kampilobakterijos, išskyrus C.gracilis, vykdo oksidazę. Nei viena iš jų nefermentuoja ir neoksiduoja angliavandenių. Energija gaunama iš aminorūgščių ar trikarboksirūgšties ciklo tarpinių junginių (Vandamme, 2000). Campylobacter
jejuni hidrolizuoja hipuratą, indoksilo acetatą ir mažina nitratus. Daugelis padermių atsparios
cefalotinui, antibiotikams fluorochinolonams, kuriais gydomi žmonių ir gyvūnų susirgimai (Koenraad et al., 1995).
Esant nepalankioms augimo sąlygoms, kampilobakterijos turi galimybę persiformuoti iš gyvybingų į neveiksnias ląsteles (Portner et al., 2007).
9 55 °C). De Cesare et al (2003) tyrimo metu C. jejuni išgyveno ilgiau nei 4 valandas 27 °C temperatūroje, esant 60-62% santykinei drėgmei ant kai kurių su maistu besilietusių paviršių. Kampilobakterijos neauga aplinkoje, kurios vandens akyvumas mažesnis kaip 0,987. Optimalus augimas, kuomet vandens aktyvumas aw=0,997. Kampilobakterijos jautrios natrio chlorido koncentracijai (kai koncentracija didesnė kaip 2% w/v – neauga, esant apytiksliai 0,5% w/v NaCl koncentracijai - optimalu). Užšaldymas ir atšildymas taip pat neigiamai veikia Campylobacter spp. (Stern ir Kazmi, 1989). Grynos Campylobacter spp. kultūros paprastai inaktyvuojamos užšaldžius -15 °C vos per 3 dienas (Stern ir Kotula, 1982). Tačiau užšaldymas nepašalina patogenų iš užterštų maisto produktų (Lee et al., 1998). Hazeleger et al. (1995) ištyrė, kad seniausios C. jejuni ląstelės ilgiausiai išgyveno, esant 4 °C temp. Campylobacter spp. neišgyvena, kuomet pH yra mažesnis nei 4,9 ir didesnis nei 9,0. Optimalios augimo sąlygos, kuomet pH yra 6,5-7,5. Ši sporų neformuojanti ir ganėtinai jautri nepalankioms aplinkos sąlygoms bakterija yra mikroaerofilinė, geriausiai auga atmosferoje su nedaug deguonies (5% O ,2 10% CO2 ir 85% N2; Garénaux et al., 2008).
Specifiniai kampilobakterijų virulentiškumo mechanizmai yra žiuželių įtakojamas judrumas, adhezija prie žarnų gleivinės, invazinis gebėjimas gaminti toksinus (van Vliet and Ketley, 2001; Asakura et al., 2007; Dastia et al., 2010). Invazija, kuri sukelia ląstelių uždegimą, greičiausiai yra citotoksinų produkavimo rezultatas, po kurio seka žarnyno absorbcinių galimybių mažėjimas (Van Deun et al., 2007). Manoma, kad patogeno gebėjimą pasiekti žarnyną iš dalies įtakoja atsparumas skrandžio rūgščiai bei tulžies druskoms (Van Deun et al., 2007), o ligos sunkumas priklauso nuo padermės virulentiškumo ir organizmo imuninės būklės (Zilbauer et al., 2008).
Žiuželių vaidmuo yra labai svarbus, esant skirtingoms chemotaksio sąlygoms, bakterijų išlikimui skirtingose ekologinėse virškinamojo trakto nišose (Jagannathan and Penn, 2005). C. coli žiuželis yra sudarytas iš dviejų homologiškų flagelinų, flaA, sudarančio didesnę dalį ir flaB, sudarančio mažesnę dalį (Guerry, 2007). flaA genas atsakingas už adheziją, virškinamojo trakto kolonizaciją ir invaziją į organizmo ląsteles (Jain et al., 2008), stabdant imuninį atsaką.
Kampilobakterijų atsparumas antibiotikams tampa svarbia visuomenės sveikatos problema viso pasaulio mąstu (Greig, 2003,. Takkinen et al, 2003; McDermott et al, 2005; Moore et al ., 2006). Dauguma kampilobakterioze užsikrėtusių žmonių pasveiksta be specialių gydymo priemonių, atstačius prarastą skysčių ir elektrolitų balansą. Sunkesniais atvejais naudojami antibiotikai, paprastai makrolidai, tetraciklinas ir (fluoro) chinolonai. Tačiau didėjantis C. coli ir C.
jejuni padermių atsparumas (fluoro) chinolonams, tetraciklinams ir eritromicinui apsunkina šios
10 makrolidams, sisteminėms Campylobacter spp. sukeltoms infekcijoms gydyti (Aarestrup ir Engberg, 2001).
Antibiotikai dešimtmečiais buvo beatodairiškai naudojami gyvulininkystėje, siekiant kontroliuoti, išvengti ir gydyti infekcijas bei pagerinti gyvūnų augimą (Rožynek et al 2007,;. EFSA, 2008; Igimi et al., 2008). Esama svarių įrodymų, jog nereguliuojamas antimikrobinių medžiagų naudojimas maisto gyvūnams įgalino atsirasti ir plisti atsparioms antibiotikams Campylobacter spp. Tose šalyse, kur auginant broilerius, antibiotikai nebuvo naudojami, atsparių padermių paplitimas yra labai mažas (Norström et al, 2007). Kampilobakterijos, išskirtos iš broilerių, augintų įprastuose ūkiuose, yra žymiai atsparesnės antibiotikams, nei izoliuotos iš augintų ekologiniuose ūkiuose, kur antibiotikų vartojimas broilerių auginimui yra draudžiamas (Luangtongkum et al., 2006).
Campylobacter spp. yra komensaliniai galvijų, avių, kiaulių ir paukščių rūšių
mikroorganizmai. Dažniausi Campylobacter spp. šeimininkai yra įvairių rūšių paukščiai, greičiausiai dėl aukštesnės jų kūno temperatūros (Skirrow, 1977). Nors Campylobacter spp. gali veistis įvairių rūšių paukščių organizme, didžiausią riziką kelia vištiena dėl didelio jos suvartojami kiekio (Humphrey et al., 2007).
Kampilobakterijos jautrios džiovinimui, mažai drėgmei, šaldymui ir sušaldymui-atšildymui, deguonies kiekiui, todėl į tai reikia orientuotis, kuriant kontrolės strategijas.
1.2 Kampilobakterijų epidemiologija
Kampilobakterizė yra dažniausia zoonozė pagal užregistruotų atvejų skaičių Europos Sąjungoje nuo 2005 m. Europos maisto saugos tarnybos duomenimis, 2010 metais Europos Sąjungoje termotolerantinių kampilobakterijų sukeltų susirgimų atvejų skaičius padidėjo 6,7%, lyginant su 2009 metais. Broilerių mėsos tvarkymas, paruošimas ir vartojimas sudaro 20-30 % žmonių susirgimų kampilobakterioze, o 50-80% atvejų užsikrečiama nuo paukštienos kaip nuo bakterijų šaltinio (EMST, 2010a). Atsižvelgiant į EMST (2010b) duomenis, galima teigti, kad kai kurios skerdyklos geriau kontroliuoja kampilobakterijų paplitimą broilerių skerdenose, nei kitos. Kiti veiksniai, įtakojantys kampilobakterijų paplitimą yra skerdžiamų broilerių amžius, sezonas ir skerdimo paros laikas.
11 pranešimų užfiksuota Latvijoje, Rumunijoje, Lenkijoje ir Bulgarijoje (< 2,00 atvejų 100 000 žmonių).
Daugelyje šalių > 95% kampilobakteriozės atvejų siejama su naminiais gyvūnais, pavyzdžiui, Suomijoje, Latvijoje, Maltoje, Lenkjoje, Slovakijoje, Čekijoje, Estijoje, Olandijoje. Didžiausias užkrėstumas kelionių metu (> 50% atvejų) buvo Švedijoje, Norvegijoje ir Suomijoje.
1 lentelė Nustatyti kampilobakteriozės atvejai ir sergamumo rodiklis 100 000 gyventojų Europos šalyse 2009-2013 metais (EFSA, 2015)
Užfiksuoti atvejai
2013 m. Užfiksuoti atvejai 2012 m. Užfiksuoti atvejai 2011 m. Užfiksuoti atvejai 2010 m. Užfiksuoti atvejai 2009 m. Atvejai Laipsnis Atvejai Laipsnis Atvejai Laipsnis Atvejai Laipsnis Atvejai Laipsnis
Austrija 5726 67,7 4710 56,0 5129 61,0 4404 52,6 4502 53,9 Belgija 8148 - 6607 - 7716 - 6047 - 5697 - Bulgarija 124 1,7 97 1,3 73 1,0 6 0,1 26 0,3 Kipras 56 6,5 68 7,9 62 7,4 55 6,7 37 4,6 Čekija 18367 173,7 18287 174,1 18743 178,7 21075 201,5 20259 194,3 Danija 3772 67,3 3720 66,7 4060 73,0 4037 72,9 3353 60,8 Estija 382 28,9 268 20,2 214 16,1 97 14,8 170 12,7 Suomija 7247 73,5 6367 64,4 6121 62,4 7180 72,9 6579 66,6 Prancūzija 5196 39,6 5079 38,9 5538 42,6 4324 33,5 3956 30,7 Vokietija 63271 77,3 62504 76,5 70812 86,8 65110 79,8 62787 76,7 Suomija 7247 73,5 6367 64,4 6121 62,4 7180 72,9 6579 66,6 Airija 2286 49,8 2391 52,2 2433 53,2 1660 36,5 1810 40,0 Italija 1781 - 774 - 468 - 457 - 531 - Latvija 9 0,4 8 0,4 7 0,3 1 0 0 0 Lietuva 1139 38,3 917 30,5 1124 36,8 1095 34,9 812 25,5 Liuksemburgas 675 125,7 581 110,7 704 137,5 600 119,5 523 106 Malta 246 58,4 220 52,7 220 53,0 204 49,3 132 32,1 Olandija 3702 42,4 4248 48,8 4406 50,9 4322 50,1 3782 44,1 Lenkija 552 1,4 431 1,1 354 0,9 367 1,0 359 0,9 Rumunija 218 1,1 92 0,5 149 0,7 175 0,9 254 1,3 Slovakija 5845 108,0 5704 105,5 4565 84,7 4476 83,0 3813 70,8 Slovėnija 1027 49,9 983 47,8 998 48,7 1022 49,4 952 46,8 Ispanija 7064 50,4 5548 47,4 5469 46,9 6340 54,6 5106 44,2 Švedija 8114 84,9 7901 83,3 8214 87,2 8001 85,7 7178 77,5 Jungtinė Karalystė 66456 104,0 72560 114,3 72150 115,3 70269 113,2 65043 105,5 Viso: 214779 64,8 214316 65,9 223998 69,0 215397 67,0 201711 62,8
EMST duomenimis Campylobacter spp. paplitimas broilerių pulkuose skirtingose šalyse svyruoja nuo 6,5% Suomijoje iki 79,0% Lenkijoje (EFSA, 2010). Kampilobakterijų paplitimas broilerių pulkuose daugiausiai priklauso nuo zootechninių ir higieninių sąlygų paukštynuose (Newell and Fearnley, 2003).
Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centro duomenimis, 2013 metais Užkrečiamųjų ligų ir jų sukėlėjų valstybės informacinėje sistemoje iš visų žarnyno infekcinių ligų sukėlėjų daugiausia užregistruota
Campylobacter spp. sukėlėjų (1439). Palyginus trylikos metų (2001 – 2013 m.) duomenis,
pastebimas didesnis kampilobakterijų išauginimas iš klinikinių mėginių. 2013 m. Campylobacter
kampilobakteriozės tirti 1 439 asmenys, 31,4% (452) kampilobakterijų išskirta vaikams iki 1 metų amžiaus, 26,7% (385) – 2-5 m. vaikams, 13,3% (191) – 6-14 m. vaikams, 3,5% (50) – 15-17 m. asmenims, 20,1% (289) kampilobakterijų išskirta 18-64 m. asmenims, 5% (72) asmenims, vyresniems nei 65 m. Daugiausia asmenų buvo gydyti stacionare – 67,2% (967), ambulatoriškai – 32,2 % (463) ir 0,6% (9) dėl kitų priežasčių.
Žarnyno infekcijų sukėlėjų grupėje Campylobacter spp. sudarė 48,9% (1439). Iš visų išaugintų Campylobacter spp. tik 69,6% (1002) buvo nustatyta rūšis, vyravo Campylobacter jejuni – 67% (964). 30,3% (437) kampilobakterijų rūšis nenustatyta.
2 lentelė Rūšinis Campylobacter spp. pasiskirstymas Lietuvoje 2013 m. (ULAC, 2013) Campylobacter spp. Iš viso išskirta Procentai
C. coli 37 2,6
C. jejuni 964 67
C. lari 1 0,1
Nenustatyta rūšis 437 30,3
Iš viso: 1439 100
Lyginant pastarųjų vienuolikos metų (2002–2013 m.) duomenis, kampilobakterijų rūšinė įvairovė nepasikeitė, daugiausia identifikuojama C. jejuni, taip pat išliko didelis procentas nenustatytų kampilobakterijų rūšių (1 pav.).
C. jejuni Kt. rūšys Nenustatyta rūšis Iš viso
1 pav. Kampilobakterijos, užregistruotos Lietuvoje 2002-2013 m
13 Didesnis kampilobakterijų paplitimas registruojamas besivystančiose bei šiltesnio klimato šalyse, tuo tarpu Skandinavijos ir kitose šalyse, kur klimatas šaltesnis, kampilobakterijų paplitimas mažesnis (EFSA, 2010; van der Giesen et al., 2006).
Kadangi daugiausiai kampilobakteriozės atvejų siejama su užterštos kampilobakterijomis broilerių mėsos vartojimu, siekiant sumažinti susirgimų riziką, didelis dėmesys skiriamas šių bakterijų kontrolei paukštynuose, pradedant nuo broilerių auginimo iki galutinio produkto patekimo į rinką (Hansson et al., 2007, Hofshagen and Kruse, 2005, Rosenquist et al., 2009).
Didesnė užterštumo kampilobakterijomis rizika yra tuose paukštynuose, kur broileriai auginami natūraliomis sąlygomis (Vandeplas et al., 2010, Hendrixson ir DiRita, 2004), kadangi yra lengvesnis sąlytis su galimais šių patogenų rizikos šaltiniais, kas yra neleistina, auginant broilerius pagal tradicines auginimo sistemas. Ekologiškai auginamų ir laisvai laikomų viščiukų broilerių pulkai gali būti kolonizuoti keleto Campylobacter spp. genotipų (Newell ir Wagenaar, 2000). Užkrėstumo Campylobacter spp. mažinimui ūkiuose itin svarbi gera žemės ūkio praktika (GAP) ir geros gamybos praktika (GGP) (Tauxe, 1992; Allos, 2001). Prieš pritaikant tinkamus prevencijos būdus, svarbu nustatyti užkėtimo šaltinius ir kryptis.
Broilerių pulkai gali būti užteršti kampilobakterijomis horizontaliu arba vertikaliu būdu. Horizontalus kampilobakterijų perdavimas broileriams iš aplinkos yra labiausiai tikėtinas užkrato šaltinis (Humprey et al., 2007). Vertikalus užkrėtimo būdas vis dar diskutuotinas. Clark ir Bueschkens (1985) atliko tyrimą, kurio metu nustatė, kad iš kampilobakterijomis užkrėstų broilerių padėtų kiaušinių 11% išsiritusių viščiukų organizme buvo sukėlėjas. Lindblom et al. (1986) atlikto tyrimo metu laboratorinėmis sąlygomis išsiritusių viščiukų organizme kolonizavosi C. jejuni. Kazwala et al. (1990) ir Van de Giessen et al. (1992) teigė, kad kadangi kampilobakterijos gali būti izoliuotos iš 1-2 dienų amžiaus viščiukų, bakterijos gali būti perduotos vertikaliu būdu.
Tyrimais įrodyta, jog broileriai užsikrečia C. jejuni, kuomet šias bakterijas perneša žemės ūkio gyvūnai, naminiai gyvūnai (Bull et al., 2006), musės (Hald et al., 2007), juodvabaliai (Jacobs-Reitsma et al., 1994), graužikai (Berndtson et al., 1996), laukiniai gyvūnai, galimas plitimas per vandenį bei užterštus darbuotojų rūbus, batus ir rankas, kuomet nesilaikoma asmens higienos reikalavimų (Gregory et al., 1997). Pulko dydis, vandens tiekimo įranga, kraikas, vabzdžiai, laukiniai paukščiai, kiti gyvūnai, graužikai, darbuotojai gali padidinti kampilobakterijų kolonizaciją ir sklaidą (Aarts et al., 1995; Line et al., 2001; Adkin et al., 2006; Horrocks et al., 2009).
14 periodo metu, gali būti tiek kampilobakterijomis užkrėstų, tiek neužkrėstų pulkų (Smitherman et al., 1984; Refregier-Petton J et al., 2001; Berndston et al., 1996), galima teigti, jog įmanoma išvengti kampilobakterijų perdavimo iš vienos paukštidės į kitą. Taigi, galimas pulko užkrėtimas kampilobakterijomis priklauso nuo tam tikrų paukštidės charakteristikų ir zootechninių bei higieninių sąlygų laikymosi. Su padidinta kampilobakterijų kolonizavimo rizika susiję veiksniai: betoninis paukštidės grindinys, lyginant su mediniu grindiniu, pašarų dalytuvas, laikomas prieškambaryje, lyginant su laikomu paukštidėje, pelės (Berndston et al., 1996), nepakankamas higienos reikalavimų laikymasis (Berndston et al.; 1996, Evans et al., 2000; Gibbens et al., 2001; Kapperud et al., 1993, van de Giessen et al., 1996; Hald et al., 2000), stogo ventiliacija, lyginant su šonine ventiliacija (Gibbens et al., 2001; Barrios et al., 2006), statinė vėdinimo sistema, lyginant su dinamine sistema, du ar daugiau darbuotojų, prižiūrinčių paukštidę (Refregier-Petton et al., 2001), netinkama paukštidės priežiūra (Cardinale et al., 2004). Ūkiai, kuriuose yra dvi ir daugiau paukštidžių (Refregier-Petton et al., 2001), kiti paukštidėje šeriami gyvūnai, kartono, naudoto viščiukų perykloje naudojimas kaip broilerių lesinimo talpa (Cardinale et al, 2004) taip pat buvo identifikuoti kaip rizikos faktoriai, įtakojantys C. jejuni paplitimą iš užkrėstų pulkų į neužkrėstus.
Tyrimais įrodyta, jog broileriai užsikrečia C.jejuni būdami dviejų savaičių amžiaus. Periodas nuo pirmos iki keturioliktos dienos vadinamas lag faze ir priklauso nuo broilerių imunoglobulinų kiekio. Jei pulkas užkrečiamas C. jejuni, paplitimas tarp tos pačios paukštidės broilerių pasiekia 100 proc., o tai savo ruožtu įtakoja didelę taršą kampilobakterijomis prieš skerdimą.
Viščiukų broilerių virškinamajame trakte, ypač aklojoje ir storojoje žarnoje, gali kolonizuotis didelis skaičius Campylobacter spp. Apdorojimo metu, skrandis ir žarnynas gali būti pažeistas, o turinys gali patekti ant skerdenos odos (Berrang et al., 2001), taip atsiranda kryžminės taršos pavojus (McMeekin et al., 1984). Broilerių transportavimo į skerdyklą metu, net neužsikrėtę broileriai užsikrečia C. jejuni per fekalijas arba nepakankamai išdezinfekuotas transportavimo dėžes. Skerdenėlės užteršiamos kampilobakterijomis plikinimo, darinėjimo ir vėsinimo procedūrų metu arba nuo.
Termotolerantinės kampilobakterijos yra plačiai paplitusios gamtoje. Pagrindinis šaltinis yra laukinių ir naminių paukščių bei žinduolių virškinamasis traktas. Kampilobakterijų šaltinis yra ne tik vištiena, jos veisiasi galvijų, kiaulių, melžiamų karvių, kalakutų, ančių ir avių organizme (Humphrey et al., 2007). Galvijų organizme kampilobakterijų paplitimas 0-80% (Atabay and Corry, 1998), avių organizme – apie 20% (Zweifel and Stephan, 2004).
15 Neapdoroto (Schorr et al., 1994) arba lietaus vandens (Eberhart-Phillips et al., 1997) vartojimas taip pat laikomi kampilobakteriozės rizikos veiksniu.
Žalias pienas buvo identifikuotas kaip žmogaus gastroenterito, kurį sukelia Campylobacter
spp., veiksnys. (Blaser et al, 1979; Robinson et al, 1979; Porter ir Reid, 1980; Potter et al, 1983). C. jejuni gali būti piene dėl kryžminės taršos melžimo metu nuo išmatų arba kaip tešmens infekcijos
rezultatas (Doyle M. P., Roman D. J., 1982; Orr et al., 1995).
Žmonės gali užsikrėsti kampilobakterioze ir kontakto su naminiais bei ūkio gyvūnais metu (Kapperud 1992 et al;. Saeed et al 1993,. Schorr et al ., 1994; Studahl ir Andersson 2000). Tiek geriamasis vanduo (Duke et al., 1996; Frost et al., 2002; Said et al., 2003), tiek vandens telkiniai, kuriuose maudomasi (Adak et al., 1995) gali būti užteršti kampilobakterijomis per gyvūnų išmatas. Pagrindinis taršos šaltinis yra gyvūnų išmatos, todėl būtina užtikrinti aukštus naminių paukšių, kiaulių ir galvijų vežimo standartus (Kramer et al., 2000).
Kampilobakterijų paplitimas broilerių pulkuose svyruoja nuo 5% iki 90% (Newell et al., 2003).
1.3 Žmonių kampilobakteriozė
Pirmasis kampilobakteriozės protrūkis, sukėlęs plonosios žarnos uždegimą ir diarėją užfiksuotas 1946 metais. Nuo 1970 metų, kuomet buvo nustatytos kampilobakterijų augimo sąlygos, susirgimų kampilobakterioze skaičius sparčiai auga (Zilbauer, 2008).
Šiandien kampilobakteriozė yra dažniausia per maistą plintanti liga pasaulyje (EFSA, 2010). 2008 metais susirgimų kampilobakterioze skaičius svyravo nuo didžiausių Čekijoje (193,30 atvejų 100000 gyventojų) ir Šveicarijoje (102,30 atvejų 100000 gyventojų) iki mažiausių Latvijoje (0,00 atvejų 100000 gyventojų), Bulgarijoje (0,20 atvejų 100000 gyventojų) ir Rumunijoje (<0,10 atvejų 100000 gyventojų) (EFSA, 2010).
Kampilobakterioze užsikrečia įvairaus amžiaus asmenys. Susirgimų priklausomybė nuo amžiaus ir lyties yra skirtinga išsivysčiusiose ir besivystančiose šalyse. Atlikti tyrimai atskleidė didelį jaunesnių nei 1 metai kūdikių ir 15-29 metų amžiaus asmenų sergamumą kampilobakterioze išsivysčiusiose šalyse (Ailes et al., 2008).
16 3 lentelė Amžiaus ir lyties įtaka žmonių užsikrėtimui kampilobakterijomis 2013 m. (ULAC, 2013)
C. jejuni
Vyrai Moterys Iš viso
Amžiaus grupės
Iš viso: % Iš viso: % Iš viso: %
0-1m. 183 58,5 130 41,5 313 100 2-5m. 140 54,9 115 45,1 255 100 6-14m. 65 50,0 65 50,0 130 100 15-17m. 11 40,7 16 59,3 27 100 18-64m. 111 55,8 88 44,2 199 100 65+ 16 40,0 24 60,0 40 100 amžius nežinomas 0 0,00 0 0,0 0 0 Iš viso: 526 54,6 438 45,4 964 100 C. coli
Vyrai Moterys Iš viso
Amžiaus grupės
Iš viso: % Iš viso: % Iš viso: %
0-1m. 11 68,8 5 31,3 16 100 2-5m. 4 66,7 2 33,3 6 100 6-14m. 2 40,0 3 60,0 5 100 15-17m. 1 100,0 0 0,0 1 100 18-64m. 3 42,9 4 57,1 7 100 65+ 0 0,0 2 100,0 2 100 amžius nežinomas 0 0,0 0 0,0 0 0 Iš viso: 21 56,8 16 43,2 37 100 Kitos kampilobakterijos
Vyrai Moterys Iš viso
Amžiaus grupės
Iš viso: % Iš viso: % Iš viso: %
0-1m. 0 0,0 0 0,0 0 0 2-5m. 0 0,0 0 0,0 0 0 6-14m. 0 0,0 1 100,0 1 100 15-17m. 0 0,0 0 0,0 0 0 18-64m. 0 0,0 0 0,0 0 0 65+ 0 0,0 0 0,0 0 0 amžius nežinomas 0 0,0 0 0,0 0 0 Iš viso: 0 0,0 1 0,0 1 0
Nenustatyta kampilobakterijų rūšis
Vyrai Moterys Iš viso
Amžiaus grupės
Iš viso: % Iš viso: % Iš viso: %
Kampilobakterijos perduodamos fekaliniu-oraliniu būdu, žmogaus žmogui, seksualinio kontakto metu, užsikrečiama nuo gyvūnų, vartojant nepasterizuotą pieną, užterštą geriamąjį vandenį, vištieną. Nepakankamai termiškai apdorotos paukštienos vartojimas susijęs su 50-70% žmonių kampilobakteriozės atvejų. Infekcinė dozė gali būti nedidelė - iki 500 ksv/g, tačiau tai priklauso nuo individualių savybių - amžiaus, bendros fizinės būklės, vaikams ši dozė gali būti žymiai mažesnė (Kothary, Buba, 2001).
17 2 pav. Kampilobakteriozė (ULAC, 2013)
Žmonėms kampilobakteriozę dažniausiai sukelia C. jejuni, rečiau – C. coli ir C. lari bei kitos kampilobakterijų rūšys. Inkubacinis periodas vidutiniškai trunka 2-5 dienas. Simptomai gali būti tiek lengvi, tiek sunkūs, įskaitant vandeningą viuriavimą (kartais su krauju), pilvo skausmus, karščiavimą, galvos skausmą ir pykinimą. Paprastai infekcija praeina savaime ir trunka nuo kelių dienų iki dviejų savaičių. Vis tik šis patogenas gali sukelti ir rimtus sisteminius sutrikimus, pasitaiko infekcijos komplikacijų – žarnyno infekcijų ir neurologinių sutrikimų. C. jejuni pripažinta dažniausių pirminių Guillain-Barre sindromo ir poliomielito priežasčių, gali sukelti paralyžių, kvėpavimo nepakankamumą, sunkią neurologinę disfunkciją ir net mirtį.
Vištienos ir vištienos produktų vartojimas susijęs su daugeliu pastarųjų kelerių metų kampilobakteriozės protrūkių išsivysčiusiose ir besivystančiose šalyse, ypač vaikų, vyresnio amžiaus žmonių ir susilpnėjusio imuniteto pacientų tarpe (Tauxe, 1992; Skirrow, 1998; Corry and Atabay, 2001). Dauguma atvejų yra susiję su žalios naminių paukščių mėsos apdorojimu, žalios
Kampilobakteriozė (kampliobakterijų sukeltas enteritas)
18 arba nepakankamai termiškai apdorotos paukštienos valgymu arba su tarša nuo žalios mėsos ant paruošto maisto (Butzler and Oosterom, 1991; Tauxe et al., 1997; Corry and Atabay, 2001; Nadeau et al., 2002).
1.4 Kampilobakterijų aptikimas ir identifikavimas
Kampilobakterijos maiste, pašaruose ir aplinkos mėginiuose nustatomos pagal šiuos standartus:
• LST EN ISO 10272-1:2006 Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis kampilobakterijų aptikimo ir skaičiavimo metodas. 1 dalis. Aptikimo metodas (ISO 10272-1:2006)
• LST ISO/TS 10272-2:2009 Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis kampilobakterijų aptikimo ir skaičiavimo metodas. 2 dalis. Kolonijų skaičiavimo būdas (tapatus ISO/TS 10272-2:2006)
• LST CEN ISO/TS 10272-3:2010 Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis kampilobakterijų aptikimo ir skaičiavimo metodas. 3 dalis. Pusiau kiekybinis aptikimas (ISO/TS 10272-3:2010)
• 10272-4 (ruošiama) Kampilobakterijų aptikimas pirminių gamybos etapų mėginiuose.
Kampilobakterijų išskyrimas yra dvejopas: tiesioginis sėjimas iš broilerių ir žmonių išmatų bei pagausinimas iš maisto produktų ir aplinkos mėginių. Patvirtinimui ir identifikavimui pasitelkiamas biocheminis tyrimas ir PGR paremti metodai.
Standarte LST EN ISO 10272-1:2006 pateiktos standartizuotos kampilobakterijų mėginių ėmimo iš įvairių šaltinių ir transportavimo procedūros. Mėginiai gabenami specialiuose konteineriuose ir turi būti atvežti į laboratoriją per valandas po paėmimo.
Dvi svarbiausios C.jejuni išskyrimo iš mėginių procedūros yra sėjimas į lėkšteles, naudojant selektyvias priemones bei sėjimas į selektyvias terpes lėkštelėse, po pagausinimo skystoje terpėje.
19 Acke et al. (2009) paskelbė, jog mCCDA terpė su cefoperazono, amfotericino ir teikoplanino priedu (CAT) yra metodas, tinkamas dažniausiai aptinkamų kampilobakterijų išskyrimui iš naminių gyvūnų ir žmonių mėginių.
Boltono sultinys pripažintas tinkamiausiu C. jejuni išskyrinui iš maisto ir aplinkos mėginių. Exeter ir Preston sultiniai naudojami rečiau dėl žemo jautrumo laipsnio (Corry et al., 1995). Terpė su buferiniu Peptono vandeniu pasirodė esanti tokia pat efektyvi, kaip ir Boltono sultinys, išskiriant
C. jejuni iš paukštienos mėginių (Oyarzabal et al., 2007).
Atliekant epidemiologinius tyrimus (pavyzdžiui, tiriant protrūkius), naudojami molekuliniai tyrimo metodai, tokie kaip polimerinė grandininė reakcija PGR, atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR (RAPD) ir pulsuojančio lauko elektroforezės gelyje metodas (PFGE).
20 2. MEDŽIAGOS IR METODAI
Tyrimai atlikti LSMU VA Maisto saugos ir kokybės katedros APC Gyvūninių maisto žaliavų saugos ir kokybės tyrimų laboraotrijoje. Siekiant nustatyti kampilobakterijų išgyvenimą aplinkoje įtakojančius veiksnius keturių mėnesių laikotarpyje, buvo tiriami žolės ir grunto mėginiai aplink vieno broilerių pulko paukštidę visą pulko auginimo laikotarpį. Siekiant nustatyti aplinkoje išskiriamų kampilobakterijų reikšmę broilerių kolonizacijai taip pat buvo tiriami broilerių kloakų mėginiai.
2.1 Mėginių rinkimas naudojant antbačių metodiką
Mėginiai buvo renkami, siekiant išskirti iš aplinkos kampilobakterijas bei kitas bakterijas. Pasirinkta antbačių metodika. Antbačiai („kojinės“) – tai specialūs vienkartiniai avalynės apdangalai, greitai ir patogai užmaunami ant avalynės. Išėmus antbačius iš sterilaus plastikinio maišelio, jie suvilgomi skiedikliu MRB (Liofilchem, Italija), tuomet maunami ant avalynės ir pavaikštoma po tiriamąjį plotą. Tuomet antbačiai atsargiai nuimami ir dedami į sterilų plastikinį maišelį. Bendrą mėginį sudaro ant poros antbačių prilipusios medžiagos. Vienas mėginys paukštidėje buvo imamas prieškambaryje, kitas – pačioje paukštidėje. Aplinkoje mėginiai buvo imami kas 20 metrų. Viso surinkta 47 mėginiai paukštidėje ir 30 mėginių aplinkoje. Surinkti mėginiai paruošiami bendro bakterijų skaičiaus nustatymui bei kampilobakterijų išskyrimui.
Bendro bakterijų skaičiaus nustatymui antbačiai užpilami 200 ml MRB (Liofilchem, Italija). Po 10 minučių pipete paimamas 1 ml nuo viršaus ir pekeliama į mėgintuvėlį. Toliau atliekami dešimtkarčiai sėjimai.
2.2 Kloakų mėginių ėmimas
21 Paimti kloakų mėginiai buvo paruošiami tyrimui, tai yra, užsėtos lėkštelės su mCCDA agaru (610130, Liofilchem, Italija) su priedu (81037, Liofilchem, Italija)) ir mėgintuvėliai su Exeter sultiniu (Exeter Bolton CM985, Oxoid, Anglija + Campylobacter spp. growth (CV61 Mast Diagnostics Merseyside, JAV) ir Exeter (CV59 Mast Diagnostics Merseyside, JK) 1% arklio kraujo)) inkubuojami mikroaerofilinėmis sąlygomis 48±2 val. 37 ºC temperatūroje. Vėliau atliekamas persėjimas ant mCCDA agaro (610130, Liofilchem, Italija su priedu (81037, Liofilchem, Italija)) ir inkubuojama tokiomis pačiomis sąlygomis.
2.3 Kampilobakterijų išskyrimas
Kampilobakterijų išskyrimas atliktas taikant tiesioginį sėjimą naudojant mCCDA agarą (610130, Liofilchem, Italija su priedu (81037, Liofilchem, Italija)) bei pagausinant Exeter sultinyje (Exeter Bolton CM985, Oxoid, Anglija + Campylobacter spp. Growth (CV61 Mast Diagnostics Merseyside, JAV) ir Exeter (CV59 Mast Diagnostics Merseyside, JK) 1% arklio kraujo)).
Paruošti aplinkos ir kloakų mėginiai buvo inkubuojami Exeter sultinyje (Exeter Bolton CM985, Oxoid, Anglija + Campylobacter spp. Growth (CV61 Mast Diagnostics Merseyside, JAV) ir Exeter (CV59 Mast Diagnostics Merseyside, JK) 1% arklio kraujo) 48 val. 37° temperatūroje, mikroaerofilinėmis sąlygomis. Po to 10 µl tūris arba su kilpele (priklausomai nuo mėginio rūšies) persėjama ant mCCDA agaro (610130, Liofilchem, Italija su priedu (81037, Liofilchem, Italija)). Išaugusios ant mCCDA agaro kolonijos identifikuojamos morfologiškai ir mikroskopuojant. Kampilobakterijos yra švelniai rausvos spalvos, apvalios, išgaubtos ir blizgios. Mikroskopuojant matomos nedidelės spiralės arba S formos bakterijos. Atrinktos kolonijos persėjamos ant Blood agar base Nr. 2 (610188, Liofilchem, Italy + 5% arklio kraujo (HBL 100 E&O Laboratories, Škotija)), inkubuojama 48 val. 37° temperatūroje, mikroaerofilinėmis sąlygomis.
Išaugusios kolonijos arba užšaldomos smegenų širdies sultinyje (610008, Liofilchem, Italija + 30% glicerolis (Reachem, Slovakija)) arba naudojamos tolimesniam tyrimui, t.y., atliekamas DNR išskyrimas virimo metodu ir identifikavimas iki rūšies, naudojant PGR metodiką.
2.4 Bendro bakterijų skaičiaus nustatymas mėginiuose ir išskyrimas
100 mikrolitrų mėginio ir išsklaidant jį, naudojant skaidraus stiklo karoliukus. Lėkštelės buvo inkubuojamos 37° C temp. 48±2 val. Išaugusios kolonijos suskaičiuojamos pagal formulę:
N = Σ С
(n +0,1*n ) * d 1 2
Σ С – kolonijų skaičius ant visų matomų lėkštelių n1 – pirmojo skiedimo neatmestų lėkštelių skaičius n2 – antrojo skiedimo neatmestų lėkštelių skaičius d – skiedimo laipsnis, atitinkantis pirmąjį skiedimą
Apskaičiuojamas bendras mikrooganizmų skaičius mėginyje. Toliau atrenkamos visos matomos skirtingos kolonijos ir persėjamos ant Brain Heart Infusion agaro buljone (610008, Liofilchem, Italija + 30% glicerolis (Reachem, Slovakija)) ir inkubuojamos 37 °C temp. 48 val. Dalis išaugusių kolonijų buvo užšaldytos Brain heart infusion buljone (610008, Liofilchem, Italija) su 30% glicerolio (Reachem, Slovakija), -80 ºC temperatūroje, o kita dalis panaudota DNR išskyrimui virimo metodu. DNR kiekis ir kokybė išmatuota spektrofotometru (Nanodrop 2000 Spectrophotometer, Thermo Scientific). Išskirta DNR naudojama bakterijų rūšių identifikavimui pagal 16sRNR geną.
2.5 DNR išskyrimas
Bakterijų DNR išskirta, naudojant virimo metodą. Bakterijų kultūra auginama 24-48 val. 37°C temp. 48 val. mikroaerofiliškai ant Blood agar base Nr. 2 (610188, Liofilchem, Italy + 5% arklio kraujo (HBL 100 E&O Laboratories, Škotija)). Nuo lėkštelės surenkama ½ 10 µl kilpelės grynos bakterijų kultūros ir perkeliama į 500 µl sterilaus distiliuoto vandens. Gerai išmaišoma kilpele. Suspensija kaitinama 100°C temp., 10 min. Centrifuguojama 5 min, prie 14 000 rpm centrifugoje (5418 eppendorf, Vokietija).
DNR kiekis ir kokybė išmatuota spektrofotometru NanoDrop (Nanodrop 2000 Spectrophotometer, Thermo Scientific ). DNR kokybė svyravo nuo 0,024 iki 0,094.
2.6 Kampilobakterijų identifikavimas PGR metodu
Kampilobakterijos buvo identifikuojamas iki rūšies naudojant šiek tiek pakeistą Wang ir kt. (2002) aprašytą metodą ir pradmenis. Naudojant pradmenis 23SF ir 23SR susidarė 650 bp fragmentai, kurie pasireiškia visose kampilobakterijose. C. jejuni amplifikuoto fragmento ilgis 323
23 bp, o C. coli – 126 bp,tyrimams buvo naudojamas pradmenų oligonukleotidų mišinys hibridizuojantis su C. jejuni hipO genu (pradmenys CJF ir CJR) ir su C. coli glyA genu (pradmenys CCF ir CCR).
4 lentelė. Pradmenų sekos, naudojamos daugkartinei PGR reakcijai pagal Wang ir kt. (2002) Pradmuo Seka 5‘ – 3‘ CJF 5‘ –ACTTCTTTATTGCTTGCTGC – 3‘ CJR 5‘ – GCCACAACAAGTAAAGAAGC – 3‘ CCF 5‘ – GTAAAACCAAAGCTTATCGTG – 3‘ CCR 5‘ – TCCAGCAATGTGTGCAATG – 3‘ 23SF 5‘ – TATACCGGTAAGGAGTGCTGGAG – 3‘ 23SR 5‘ – ATCAATTAACCTTCGAGCACCG – 3‘
Kiekvieną PGR mišinį, reikalingą atlikti vienai reakcijai (24 µl) sudaro: 2,5 µl 10XPCR buferio (Thermo Scientific, Lietuva), 2,5 µl MgCl2 (Thermo Scientific, Lietuva), 2,0 µl dNTP’s (Thermo Scientific, Lietuva), 1,0 µl pradmenų mišinio (Thermo Scientific, Lietuva), 0,25 µl Hot Start polimerazės (Thermo Scientific, Lietuva), 15,75 µl sterilaus bidistiliuoto vandens. Reagentai (išskyrus Taq polimerazę) prieš reakciją atšildomi. Mišinys gaminamas ant ledo arba šaltį palaikančio stovo. Gaminant miksą pirmiausiai pilami tie reagentai, kurių tūris yra didžiausias. Hot Start polimerazė (Thermo Scientific, Lietuva) pilama paskutinė (iš -20 oC temperatūros išimama tik prieš pat naudojimą ir vėl patalpinama atgal). Pasigaminto mišinio 24 µl išpilstomi į sužymėtus 1,5 ml talpos PGR mėgintuvėlius, sudėtus ant ledo ar šaltį palaikančio stovo. Į kiekvieną PGR mėgintuvėlį maišant antgaliu pridedama 1,0 µl atšildytos DNR. PGR mėgintuvėliai patalpinami į termociklerį (PTC-100TM, Programmable Thermal Controller, Peltier-Effect Cycling, MJ Reasearch, Inc.) ir nustatoma EGLE- MUL programa, kurios sąlygos yra:
1. 95oC – 6 min 2. 95oC- 0.5 min 3. 53oC- 0.5 min 4. 72oC- 0.5 min
2-4 žingsniai kartojami 30 kartus 5. 72 oC- 7 min
6. 4 oC- ∞ 7. End
24 bidistiliuoto vandens. Toliau gaminamas Ethidium bromide tirpalas: 20 mg ethidium bromide miltelių + 1 ml 1 × TAE buferio. Po pagaminimo laikomas šaldytuve.
Likus maždaug 30 min prieš baigiantis PGR reakcijai, ruošiamas rėmelis geliui ir 1,3% agarozė. Rėmelis geliui ruošiamas taip: laisvi rėmelio kraštai apklijuojami lipnia plėvele, užlenkiant jos kraštus ant rėmelio. Įstatomos pasirinktos šukos. 1.3% agarozės paruošimas: 1,3 g agarozės (Thermo Scientific, Lietuva) + 140 ml + 1 × TAE buferio. Pirmiausia į 350 ml kolbą dedama agarozė, po to įpilamas buferis. Šiek tiek pamaišoma, uždengiama aliuminio folija ir tirpinama 3 min, 610V mikrobangų krosnelėje, prižiūrint kad neišbėgtų kai užverda. Stipriai nemaišyti, kad nesusidarytų burbulai. Vėsinama 60oC vandens vonelėje arba naudojant tokios pat temperatūros vandens srovę, tačiau atsargiai sukant per riešą, kad gelis vėstų tolygiai. Atvėsus iki 60oC pridedama 6,5 µl Ethidium bromide tirpalo ir išmaišoma. Gelis kuo greičiau supilamas į paruoštą rėmelį, susidarę burbulai kuo greičiau t.y. kol gelis nepradėjo stingti, nustumiami į kraštus naudojant antgalį. Geliui leidžiama sustingti 20 min. Atsargiai nuimamos šukos. Nuo kraštų nuimama lipni plėvelė ir gelis atsargiai išstumiamas į vonelę arba jei tą pačią dieną nenaudojamas jį galima suvynioti į maistinę plėvelę ir naudoti kitą dieną. Patikrinama ar gelis pilnai apsemtas ir jei reikia į vonelę pripilama 1xTAE buferio užsemiant gelį bent 2 mm.
2.7 PGR produkto elektroforezė
Dar stingstant geliui pasiruošiama 6xLoading Dye kiekvienam PGR produktui. Naudojamas Petri lėkštelės dugnas arba dangtelis. 1,5 cm atstumu vienas nuo kito dėliojama tiek 2,5 µl 6xLoading Dye lašų, kiek yra mėginių + 2 markeriui, jei reikia.
Kai gelis jau patalpintas į vonelę, su antgaliu pritraukus 11 µl PGR produkto maišoma su 6xLoading Dye Petri lėkštelėje taip kad nesusidarytų burbulai ir iš karto perkeliama į 2-priešpaskutinį šulinėlius gelyje.
Į pirmą ir paskutinį šulinėlius dedama 3 µl markerio jei jis paruoštas su Loading dye. Jei ne – tuomet iš pradžių 3 µl markerio sumaišoma su 2,5 µl 6xLoading Dye Petri lėkštelėje ir tik tuomet perkeliama į šulinėlius.
Uždengiamas dangtis, prijungiami laidai. Elektroforezės sąlygos: 50 min, 105V. Po elektroforezės gelis analizuojamas gelių dokumentavimo sistema.
Susidarę produktai:
- 323 bp (C. jejuni) - 126 bp (C. coli)
25 2.8 Bakterijų rūšių identifikavimas pagal 16sRNR geną
Bakterijų rūšių identifikavimas pagal 16sRNR geną buvo atliktas pagal Muscatello and Browning, 2004 metodą. Identifikavimui pasirinkta 18 izoliatų. Vienai reakcijai (50 µl) rekalingi reagentai: 5 µl 10XPCR buferio (Thermo Scientific, Lietuva), 3 µl MgCl2 (Thermo Scientific, Lietuva), 5 µl dNTP’s (Thermo Scientific, Lietuva), 0,5 µl pradmens A1 (Thermo Scientific, Lietuva), 0,5 µl pradmens A2 (Thermo Scientific, Lietuva), 0,25 µl 5 U/µl Taq polimerazės (Thermo Scientific, Lietuva), 33,25 µl sterilaus bidistiliuoto vandens. Reagentai, išskyrus Taq polimerazę, atšildomi. Reagentų mišinys gaminamas ant šaltį palaikančio stovo. Gaminant mišinį, pirmiausia pilami tie reagentai kurių tūris yra didžiausias. Taq polimerazė (Thermo Scientific, Lietuva) pilama paskutinė (iš -20 oC temperatūros išimama tik prieš pat naudojimą ir vėl patalpinama atgal). Pasigaminto mix’o po 47,5 µl išpilstomi į sužymėtus 0,2 ml talpos PGR mėgintuvėlius sudėtus ant šaltį palaikančio stovo. Į kiekvieną PGR mėgintuvėlį maišant antgaliu pridedama 2,5 µl atšildytos DNR. PGR mėgintuvėliai patalpinami į termociklerį ir nustatoma programa, kurios sąlygos yra:
1. 94oC – 60 s 2. 94oC- 15 s 3. 45oC- 45 s 4. 72oC- 105 s
2-4 žingsniai kartojami 35 kartus 5. 72 oC- 300 s
6. 4 oC- ∞ 7. End
2.9. Amplifikuotų produktų aptikimas agarozės gelyje
Amplifikuotų produktų aptikimas agarozės gelyje atliekamas pagal protokolą Nr.7-2. Atlikus elektoroforezę, matomas 481 bp produktas. Amplifikacijos produktai atskiriami agarozės gelyje ir ryškinami etidžio bromidu. Naudojant šį metodą galima nustatyti genetinę įvairovę ar įvertinti giminingumą, net neturint jokios informacijos apie tiriamų objektų genominės DNR nukleotidų sekas. Tai nustatoma pagal amplifikacijos spektrų panašumo laipsnį.
26 20 mg ethidium bromide miltelių sumaišoma su 1 ml 1 × TBE buferio. Po pagaminimo laikomas šaldytuve. Maždaug 30 min prieš baigiantis PGR reakcijai, ruošiamas rėmelis geliui ir 2% agarozė.
Rėmelio geliui paruošimas: laisvi rėmelio kraštai apklijuojami lipnia plėvele, užlenkiant jos kraštus ant rėmelio. Įstatomos pasirinktos šukos.
2% agarozės paruošimas: 2,21 g agarozės (Thermo Scientific, Lietuva) sumaišoma su 140 ml 1 × TBE buferio. Pirmiausia į 350 ml kolbą dedama agarozė, po to įpilamas buferis. Šiek tiek pamaišoma, uždengiama aliuminio folija ir tirpinama 3 min, 610V mikrobangų krosnelėje, prižiūrint kad neišbėgtų kai užverda. Stipriai nemaišyti, kad nesusidarytų burbulai. Vėsinama 60oC vandens vonelėje arba naudojant tokios pat temperatūros vandens srovę, tačiau atsargiai sukant per riešą, kad gelis vėstų tolygiai. Atvėsus iki 60oC pridedama 6,5 µl Ethidium bromide tirpalo ir išmaišoma. Gelis kuo greičiau supilamas į paruoštą rėmelį, susidarę burbulai kuo greičiau t.y. kol gelis nepradėjo stingti, nustumiami į kraštus naudojant antgalį. Geliui leidžiama sustingti 20 min. Atsargiai nuimamos šukos. Nuo kraštų nuimama lipni plėvelė ir gelis atsargiai išstumiamas į vonelę arba jei tą pačią dieną nenaudojamas jį galima suvynioti į maistinę plėvelę ir naudoti kitą dieną. Patikrinama, ar gelis pilnai apsemtas, ir, jei reikia, į vonelę pripilama 1xTBE buferio užsemiant gelį bent 2 mm.
2.10. PGR produkto elektroforezė
27 2.11. Amplifikuotų produktų valymas prieš sekvenavimą
Valymas atliekamas naudojant GeneJet PCR Purification rinkinį (#K0701;#K0702) pagal gamintojo aprašytą procedūrą: 35µl PGR produkto sumaišoma su 35µl Binding Buferiu 0,2 ml mėgintuvėlyje. Viskas perkeliama į GeneJET kolonėlę (tiesiai per vidurį, neliečiant dugno). Centrifuguojama 1 min 14 000 rpm greičiu. Mėgintuvėlyje susidaręs skystis išpilamas. Į kolonėlę pilama 700µl Washing Buferio. Centrifuguojama 1 min 14 000 rpm greičiu. Mėgintuvėlyje susidaręs skystis išpilamas. Centrifuguojama dar 1 min, kad pasišalintų visi skysčio likučiai iš kolonėlės. GeneJET kolonėlė perkeliama į 1,5 ml mėgintuvėlį. Į kolonėlę įpilama 30µl sterilaus vandens. Centrifuguojama 1 min 14 000 rpm greičiu. Mėgintuvėlyje susidaręs skystis perkeliamas į 0,2 ml mėgintuvėlį. Pamatuojamas išvalyto PGR produkto kiekis su spektrofotometru NanoDrop (Thermo Scientific). Išvalytas PGR produktas gali būti iš karto ruošiamas sekvenavimui arba saugojamas -20°C temperatūroje.
2.12. Paruošimas sekvenavimui
Sekvenavimui mėginiai buvo siunčiami į GATC Biotech AG (Vokietija) paruošus pagal šiuos reikalavimus (Light Run sequencing):
PGR produkto koncentracija (išvalyta) 20-80 ng/µl;
Pradmens ProF (CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG) koncentracija 5µM (5pmol/µl).
5 µl PGR produkto buvo sumaišoma su 5 µl pradmens, 1,5 ml mėgintuvėlyje. Atitinkami barkodai užklijuojami ant mėgintuvėlio ir mėgintuvėliai siunčiami sekvenavimui. Jei buvo reikalinga, iki siuntimo paruoštas produktas laikomas -20 °C temperatūroje.
2.13. Duomenų analizė
Gauta geno seka išsaugojama .ab1 formate. Sekos atidarymui naudojama ChromasPro programa (http://technelysium.com.au/?page_id=27). Atidarius, gauta seka nukopijuojama tiesiai į sekų paieškos/palyginimo puslapyje
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PROG_DEF=blastn&BL
AST_PROG_DEF=megaBlast&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST_SPEC=MicrobialGenomes)
28 2.14. Kampilobakterijų genotipavimas
Kampilobakterijų genotipavimas atliktas pagal flaA-RFLP metodą, Harrington, 2003. Vienai reakcijai (50 µl) reikalingi reagentai: 5 µl 10XPCR buferio (Thermo Scientific, Lietuva), 3 µl MgCl2, 5 µl dNTP’s (Thermo Scientific, Lietuva), 0,5 µl pradmens A1 (Thermo Scientific, Lietuva), 0,5 µl pradmens A2 (Thermo Scientific, Lietuva), 0,25 µl 5 U/µl Taq polimerazės (Thermo Scientific, Lietuva), 33,25 µl sterilaus bidistiliuoto vandens. Reagentai, išskyrus Taq polimerazę, atšildomi. Reagentų mišinys gaminamas ant šaltį palaikančio stovo. Gaminant mišinį, pirmiausia pilami tie reagentai kurių tūris yra didžiausias. Taq polimerazė (Thermo Scientific, Lietuva) pilama paskutinė (iš -20 oC temperatūros išimama tik prieš pat naudojimą ir vėl patalpinama atgal). Pasigaminto mix’o po 47,5 µl išpilstomi į sužymėtus 0,2 ml talpos PGR mėgintuvėlius sudėtus ant šaltį palaikančio stovo. Į kiekvieną PGR mėgintuvėlį maišant antgaliu pridedama 2,5 µl atšildytos DNR. PGR mėgintuvėliai patalpinami į termociklerį ir nustatoma programa, kurios sąlygos yra:
8. 94oC – 60 s 9. 94oC- 15 s 10. 45oC- 45 s 11. 72oC- 105 s
2-4 žingsniai kartojami 35 kartus 12. 72 oC- 300 s
13. 4 oC- ∞ 14. End
2.15. Bakterijų kultūrų paruošimas išgyvenimo tyrimui
kolbutėse. Į kiekvieną kolbutę buvo įpilta 5 ml žinomo tankio bakterijų kultūros. Šios kolbutės atitinkamai inkubuojamos 5 °C, 15 °C ir 25 °C temperatūroje 7 dienas. Siekiant patikrinti, ar visose kolbelėse esanti bakterijų kultūra prieš inkubavimą yra gryna, su kilpele 10 mikrolitrų kultūros užsėjama ant Blood Agar Base Nr. 2 (610188, Liofilchem, Italy + 5% arklio kraujo (HBL 100 E&O Laboratories, Škotija)). Lėkštelės inkubuojamos 37 °C temperatūroje 48 valandas mikroaerofilinėmis sąlygomis.
2.16. Kampilobakterijų skaičiaus nustatymas
Atlikau tyrimą pagal Kudirkiene ir kt., 2012 aprašytą metodiką. Kampilobakterijų skaičius 250 ml kolbutėse buvo tiriamas du kartus t.y. prieš jas inkubuojant tam tikroje temperatūroje ir po 7 dienų.
Pirmiausia prieš tyrimą pasiruošiami 5 mėgintuvėliai kiekvienai bakterijų kultūrai. Į kiekvieną mėgintuvėlį pilama po 900 µl PBS tirpalo. Toliau atliekami pakartotiniai dešimtkarčiai skiedimai iki -7 naudojant 100 µl kultūros. Atlikti skiedimai sėjami į mCCDA agarą (610130, Liofilchem, Italija su priedu (81037, Liofilchem, Italija)) Petri lėkštelėje, suskirstytoje į 8 lygias dalis (kiekviena dalis skirta skirtingam skiedimui). Į kiekvieną dalį iš kiekvieno mėgintuvėlio 3 kartus perkeliama po 10 µl (viso 30 µl) bakterijų kultūros iš mėgintuvėlių. Lėkštelės uždengiamos ir šiek tiek padžiovinamos traukos spintoje. Lėkštelės inkubuojamos 37 °C temperatūroje 48 valandas.
Praėjus 48 valandoms, apžiūrimos lėkštelės su kraujo agaru. Jei jose pastebimos tik kampilobakterijos, tuomet tyrimas atliekamas toliau ir atliekamas kolonijų skaičiavimas mCCDA agare (610130, Liofilchem, Italija su priedu (81037, Liofilchem, Italija)). Jei lėkštelėse pastebimos kitų rūšių kultūros, tyrimas atliekamas iš naujo. Suskirstytose lėkštelėse su mCCDA agaru (610130, Liofilchem, Italija su priedu (81037, Liofilchem, Italija)) atliekamas kampilobakterijų kolonijų paskaičiavimas. Skaičiuojamas kolonijų skaičius visuose trijuose taškuose tame trikampyje, kuriame matomos atskiros kolonijos. Skaičiavimas atliekamas pagal šią formulę:
29 Σ С = n +n +n3 1 2
3
N = Σ С x 102 x 106 = Σ С x 108 ksv/ml-1
Σ С – vieno trikampio kolonijų skaičiaus vidurkis n1 – kolonijų skaičius pirmame taške
3.TYRIMO REZULTATAI
3.1. Kampilobakterijų rūšių įvairovė broilerių pulke ir paukštidės aplinkoje
Tyrimų laikotarpiu buvo ištirtas vienas broilerių pulkas ir aplinka aplink paukštidę kampilobakterijų atžvilgiu. Iš viso surinkti ir PGR metodu (3 pav.) buvo ištirti 77 aplinkos ir broilerių išmatų mėginiai: 47 broilerių išmatų mėginių (61,04 proc.) ir 30 aplinkos mėginiai (38,96 proc.).
Tyrimai parodė, kad kampilobakterijomis iš viso buvo užkrėsti 43 tirti mėginiai (55,84 proc.), iš kurių buvo 13 aplinkos mėginių (43,33 proc.) ir 30 broilerių išmatų mėginių (63,83 proc.)
650 bp
30 3 pav. Kampilobakterijų identifikavimas PGR metodu (1 - DNR ilgio standartas nuo 100 bp iki 1000 bp (MBI, Fermentas); 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18 ir 19 - C. jejuni; 11 ir 13 - C. coli).
Campylobacter jejuni rūšies bakterijos aptiktos 33 mėginiuose (74,42 proc.) o 8 mėginiuose
kitos kampilobakterijų genčiai priklausančios rūšys (20,93 proc.) (5 lentelė). Tyrimai taip pat atskleidė, kad 2 mėginiuose buvo rasta ir Campylobacter jejuni, ir Campylobacter spp. (4,65 proc.) bakterijos.
31 Iš 13 aplinkos mėginių aptikti 8 mėginiai užkrėsti Campylobacter spp. bakterijomis (61,54 proc.), 3 mėginiai - Campylobacter jejuni (23,08 proc.) ir 2 mėginiai, kuriuose buvo aptiktos tiek
Campylobacter spp., tiek Campylobacter jejuni (15,38).
Visuose 30 broilerių išmatų mėginių buvo aptikta Campylobacter jejuni (100 proc.).
Iš kiekvieno mėginio tolimesniems tyrimams buvo atrinkti 1-3 izoliatai (iš viso 126 izoliatai: 39 aplinkos ir 87 broilerių išmatų mėginiai).
3.2. Kampilobakterijų genotipavimas
Siekiant įvertinti kampilobakterijų genotipų įvairovę ir jų paplitimą, buvo atliktas genotipavimo tyrimas, kuriam kampilobakterijų izoliatai atrinkti atsitiktine tvarka. Iš viso FlaA-RFLP metodu genotipuoti 68 C. jejuni izoliatai, iš jų 51 išskirti iš broilerių išmatų mėginių ir 17 iš aplinkos mėginių. Tyrimai parodė, kad aplinkoje nustatyti C.jejuni flaA genotipai buvo nustatyti ir broilerių kloakų mėginiuose, paimtuose tiriamojoje paukštidėje.
Broilerių pulke, kuris buvo tiriamas, rasti 5 skirtingi kampilobakterijų genotipai, t.y., 1, 2, 3, 4, 5. Tik 2 genotipas buvo nustatytas ir aplinkoje ir pas broilerius, todėl toliau tiriama po izoliatą iš abiejų šaltinių (Nr. 232 iš kloakos ir Nr. 182 iš 1 zonos) (6 lentelė). Genotipai Nr. 1 ir 5 buvo nustatyti tik broilerių kloakos mėginiuose, todėl iš jų tiriamas vienas – 5 genotipas (Nr. 397). Genotipai Nr. 3 ir Nr. 4 buvo nustatyti tik aplinkoje, todėl iš jų taip pat tiriamas vienas – 4 genotipas (Nr. 41 iš 5 zonos).
6 lentelė Broileriuose ir paukštyno aplinkoje nustatyti genotipai Paplitimas
Aplinkos mėginiai Broilerių išmatų mėginiai Genotipo Nr. Izoliatų sk. % Izoliatų sk. % 1 - - 8 100 2 4 6,12 50 93,88 3 4 100 - - 4 1 100 - - 5 - - 1 100
32 4 pav. Kampilobakterijų išskirtų iš broilerių išmatų ir paukštyno aplinkos
3.3. Kampilobakterijos paukštyno aplinkoje
Siekiant ištirti kampilobakterijų paplitimą paukštidės aplinkoje, kuri buvo suskirstyta į penkias zonas, nustatyta, jog aplinkoje daugiausiai kampilobakterijų (3 atvejai iš 8) aptikta 1 zonoje (arčiausiai pastato) – 37,50 proc. paplitimas (5 pav.).
5 pav. Kampilobakterijų paplitimas skirtingose zonose aplink paukštidę
Antrojoje ir trečiojoje zonose C.jejuni genotipų paplitimas vienodas - 25 proc. (po 2 atvejus iš 8). Penktojoje zonoje C.jejuni genotipų paplitimas sudaro 12,50 proc.
6 pav. C.jejuni flaA genotipų pasiskirstymas aplinkos ir broilerių išmatų mėginiuose
34 Kampilobakterijų genotipavimo tyrimas atskleidė, jog iš visų genotipuotų kampilobakterijų padermių dominavo antrasis genotipas: net 54 padermės iš 68 buvo priskirtos šiam genotipui (79,41 proc. visų izoliatų). Antrajam genotipui priskirtos padermės buvo išskirtos iš broilerių išmatų (50 vnt.; 93,88 proc.) ir iš aplinkos (4 vnt.; 6,12 proc.).
Antrasis genotipas dominavo tiek broileriuose (84,75 proc. visų genotipuotų broilerių išmatų mėginių), tiek pirmojoje zonoje (37,50 proc. visų genotipuotų aplinkos mėginių ir 75 proc. trečiojo genotipo aplinkos mėginių).
3.4 Bendras bakterijų skaičius aplinkos mėginiuose
Siekiant nustatyti aplinkos užkrėstumą bakterijomis, buvo ištirta 30 aplinkos mėginių, paimtų aplink tiriamąjį pukštidės pastatą ir jos viduje. Bendras bakterijų skaičius tirtuose mėginiuose svyravo nuo 300 ksv/g iki 7,75*106 ksv/g. Didžiausias bendras bakterijų skaičius nustatytas mėginiuose, kuriuose aptiktos Staphylococcus ir Pseudomonas genčių bakterijos bei C. jejuni ir
Campylobacter spp. bakterijos.
6 lentelė. Bendras bakterijų skaičius paukštidės aplinkoje
Bendras bakterijų skaičius, ksv/g Zonos aplink paukštidę
Nuo Iki Tiriamojo pastato kraikas 300 9,05*105
Pirmoji zona 3,18 *105 5,75*106
Antroji zona 2,8*104 7,75*106
Trečioji zona 2,07*105 2,8*106
Ketvirtoji zona 6,3*104 6,75*106
Penktoji zona 2,5*104 7,25*106
3.5 Bakterijų rūšių nustatymas
Siekiant ištirti bakterijų rūšių įvairovę mėginiuose, buvo ištirta 30 paukštidės aplinkos mėginių ir skaičiuojamos skirtingos kolonijos. Bakterijų rūšių skaičius skirtingose aplinkos zonose ir pačioje paukštidėje svyravo nuo 1 iki 13 skirtingų bakterijų rūšių.
Suskaičiavus bakterijų rūšis ir išvedus vidurkį, daugiausiai skirtingų bakterijų rūšių nustatyta pirmojoje zonoje, t.y., arčiausiai paukštidės (vidurkis - 8), tolstant nuo paukštidės, buvo aptinkama vis mažiau skirtingų bakterijų rūšių (mažiausiai – ketvirtojoje zonoje).
35
Staphylococcus pseudointermedius, Pseudomonas fluorescens, Pantoae vagans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus carnosus, Flavobacteraceae bacterium, Beutenbergia cavernae, Rhodococcus erythropolis, Brachybacterium faecium, Brachybacterium faecium, Staphylococcus lugdunensis.
7 lentelė. Skirtingų bakterijų rūšių skaičius, aptiktas paukštidės aplinkos mėginiuose Bakterijų rūšių skaičius
Zonos
Nuo Iki Vidurkis
Tiriamojo pastato kraikas 1 8 5,14
Pirmoji zona 3 11 8,00
Antroji zona 1 13 7,67
Trečioji zona 1 11 4,80
Ketvirtoji zona 1 10 4,20
Penktoji zona 4 8 6,25
Mėginiuose, užkrėstuose kampilobakterijomis, dominavo Staphylococcus (38,89 proc.) ir
Pseudomonas (27,78) genčių bakterijos.
8 lentelė. Paukštidės aplinkos mėginiuose nustatytos bakterijų rūšys Eil. Nr. Sekos Nr. Bakterijų rūšis
1. Seq.ID 59IF86 pseudointermedius Staphylococcus 2. Seq.ID 59IF87 Pseudomonas fluorescens 3. Seq.ID 59IF84 Pantoae vagans
4. Seq.ID 59IF88 Pseudomonas aeruginosa 5. Seq.ID 59IF85 Staphylococcus carnosus 6. Seq.ID 59IF89 Staphylococcus carnosus 7. Seq.ID 59IF90 Flavobacteraceae bacterium 8. Seq.ID 59IF91 Pseudomonas aeruginosa 9. Seq.ID 59IF93 Pseudomonas poae
10. Seq.ID 59IF94 Pseudomonas poae
3.6 Kampilobakterijų išgyvenimo tyrimas
Siekiant ištirti, kokią įtaką kampilobakterijų išgyvenimui turi aplinkos temperatūra, buvo atliktas išgyvenimo tyrimas (7 pav.), kurio metu ištirti 4 izoliatai iš tiriamojo broilerių pulko: Nr. 182 izoliatas iš aplinkos (2 genotipas), Nr. 232 izoliatas iš kloakos (2 genotipas), Nr. 397 izoliatas iš kloakos (5 genotipas) ir Nr. 41 izoliatas iš aplinkos (4 genotipas).
8,11 8,75 9,29 8,08 6,20 8,94 9,12 8,75 8,63 9,01 9,41 9,32 9,01 9,25 9,44 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 Prieš tyrimą P 36 o 7 dienų aikant 50C, l P 150C P , 250C K am pi lobakt er ij ų kol on ijų sk ai čiu s, lo g10 ks v/ g Izoliatas Nr. 182 Izoliatas Nr. 232 Izoliatas Nr. 397 Izoliatas Nr. 41 o 7 dienų,
laikant o 7 dienųlaikant
Prieš tyrimą Po 7 dienų, laikant 5 Po 7 dienų, laikant 15 0 Po 7 dienų, laikant 25 0 0 C
temp. C temp. C temp.
7 pav. Kampilobakterijų išgyvenimas skirtingose temperatūrose
Kampilobakterijų padermės, išskirtos iš aplinkos ir broilerių išmatų mėginių, išgyveno panašiai esant skirtingoms temperatūroms nepaisant to, kad buvo priskirtos skirtingiems genotipams. Inkubuojant 5 °C temperatūroje 7 dienas mikroaerofilinėmis sąlygomis, pastebėtas kampilobakterijų kolonijų skaičiaus sumažėjimas. Inkubuojant aukštesnėje, 15 °C temperatūroje ir 25 °C temperatūroje, kampilobakterijų skaičius gerokai padidėjo.
Po 7 dienų, laikant 5 °C temperatūroje mikroaerofilinėmis sąlygomis, izoliato Nr. 182, kampilobakterijų kolonijų skaičius sumažėjo nuo 1,30*108 ksv/g iki 1,60*106 ksv/g. Taip pat pastebimas ir izoliato Nr. 232 kampilobakterijų kolonijų skaičiaus sumažėjimas nuo 1,20*108 ksv/g tyrimo pradžioje iki 1,60*106 ksv/g inkubavimo pabaigoje. Izoliato Nr. 397 kampilobakterijų kolonijų skaičiaus sumažėjimas nėra toks didelis – nuo 5,66*108 ksv/g iki 4,30*108 ksv/g. Izoliato Nr. 41 kampilobakterijų kolonijų skaičius sumažėjo nuo 21,0*108 ksv/g iki 10,30*108 ksv/g.
37 ksv/g iki 5,33*108 ksv/g; izoliato Nr. 232 - nuo 1,20*108 ksv/g iki 8,67*108 ksv/g; izoliato Nr. 397 – nuo 5,66*108 ksv/g iki 10,34*108 ksv/g; izoliato Nr. 41 kampilobakterijų kolonijų skaičius sumažėjo – nuo 21,0*108 ksv/g iki 17,67*108 ksv/g.
38 4. REZULTATŲ APTARIMAS
Tyrimų metu buvo atliekami mėginių, paimtų aplink vieno broilerių pulko paukštidę (grunto, žolės mėginiai) ir jos viduje (kriko, išmatų mėginiai) visą broilerių pulko auginimo laikotarpį (nuo 1 dienos iki 42 dienos. Taip pat buvo tiriami broilerių kloakų mėginiai, siekiant nustatyti sąsajas tarp paukštidės aplinkoje aptinkamų kampilobakterijų ir broilerių išmatose aptinkamų kampilobakterijų, t.y., jų reikšmę broilerių kolonizacijai. Tyrimo rezultatai parodė, kad daugiau nei pusė (55,84 proc.) aplink paukštidę iš aplinkos paimtų ir broilerių išmatų mėginių yra užkrėsti termofilinėmis kampilobakterijomis. Anksčiau atliktų kampilobakterijų paplitimo Lietuvos broilerių pulkuose tyrimų metu buvo nustatytas didelis paplitimas (80,95 proc.), kuomet mėginiai buvo imami likus 2-5 dienoms iki skerdimo (Kudirkiene ir kt., 2010), tačiau tada nebuvo tiriami mėginiai paimti aplink paukštidę. Kitų tyrimų metu buvo nustatytas panašus paplitimas kai kuriose kitose Europos šalyse: Lenkijoje (79,0 proc.) ir Čekijoje (61,1 proc.) 2008 metais (EFSA, 2010). Kur kas maženis
Campylobacter spp. paplitimas nustatytas tokiose šalyse kaip: Jungtinėje Karalystėje (užkrėsta 27%
broilerių pulkų) (Pearson et al., 1996), Vokietijoje 41.1% (Atanassova and Ring, 1999), Danijoje 47%, Švedijoje - 10–27% (Friedman et al., 2000).
Tuo tarpu vertinant vien broilerių kloakų mėginių užkrėstumą kampilobakterijomis nustatytas dar didesnis kampilobakterijų paplitimas, siekiantis 63,83 procentus, lyginant su šių bakterijų paplitimu aplink paukštidę (43,33 proc. užkrėstumas).
Kampilobakterijų rūšies identifikavimas atskleidė, kad visi šios genties bakterijomis užkrėsti mėginiai buvo užkrėsti C. jejuni bakterijomis. Ankstesnių tyrimų Lietuvoje duomenimis,
Campylobacter spp. nustatytos 92,5 % tirtų broilerių kloakos mėginių, o 86,5 % mėginių buvo
užsikrėtę C. jejuni rūšies bakterijomis (Kudirkienė ir kt., 2008). Ženkliai mažesnis 6,7-7 %
Campylobacter spp. paplitimas nustatytas paukščių pulkuose Suomijoje, Islandijoje, Norvegijoje ir
Olandijoje (Cardinale et. al., 2004; McDowell et. Al., 2008).
39 visiško broilerių užsikrėtimo kampilobakterijomis išvengimo, tačiau griežtas jų laikymasis gali padėti žymiai sumažinti kampilobakterijų paplitimą broilerių pulkuose (Van de Giessen et. al., 1998; Cardinale et. al., 2004).
Mūsų tyrimo metu kampilobakterijos buvo aptiktos paukštidės aplinkoje, suskirstytoje į 5 zonas. Daugiausiai (40 proc.) C. jejuni nustatyta arčiausiai paukštidės esančioje pirmojoje zonoje, todėl galima teigti, jog kampilobakterijos, esančios broileriuose, labiausiai paplitusios arčiausiai paukštidės eančioje aplinkoje, tuo tarpu tolimesnėse zonose (Nr. 2, 3, 5) užkrėstumas kampilobakterijomis mažėja.
Atlikus paukštidės aplinkos bakterijų identifikavimo tyrimą pagal 16 sRNR geną, nustatyta, kad mėginiuose, užkrėstuose kampilobakterijomis, dominavo Staphylococcus (38,89 proc.) ir
Pseudomonas (27,78) genčių bakterijos. Hilbert F. (2010) atlikto tyrimo metu buvo siekiama
įrodyti, jog C. jejuni gali išgyventi aerobinėmis sąlygomis, kuomet yra auginamos kartu su
Pseudomonas genties bakterijomis, kurios yra vienos pagrindinių maisto gedimą sukeliančių
bakterijų ir dažnai gausiai randamos paukštienoje. In vitro sąlygomis buvo tiriamos C. jejuni padermių sąveika su Pseudomonas spp., Proteus mirabilis, Citrobacter freundil štamų,
Micrococcus luteus ir Enterococcus faecalis. Užsėjus atskirai arba kartu su Proteus mirabilis, Citrobacter fretindii, Micrococcus luteus arba Enterococcus faecalis padermėmis,
kampilobakterijos galėjo išgyventi aerobinėje aplinkoje ne daugiau nei 18 val. Tuo tarpu kampilobakterijos, pasėtos kartu su pseudomonomis, išliko gyvybingos, esant aerobinėms sąlygoms, daugiau nei 48 val. Taigi, pastebėta, jog mikroaerofilinės C. jejuni sugeba išgyventi aplinkoje su įprasta oro deguonies koncentracija, tik esant komensalizmui su Pseudomonas spp. Ši sąveika gali įtakoti kampilobakterijų išlikimą tiek aplinkoje, tiek paukštienoje ir tokiu būdu sąlygoti žmonių užsikrėtimą (Hilbert et al., 2010).
Tiriant C. jejuni išgyvenimą skirtingose temperatūrose ir siekiant įvertinti gyvybingų bakterijų skaičių kiekvienoje temperatūroje, buvo taikomas kolonijų skaičiavimo metodas, skaičiuojant išgyvenusias bakterijas vėliasiai po 7 dienų. Auginant kampilobakterijas 25 °C temperatūroje 7 dienas mikroaerofilinėmis sąlygomis pastebimas kolonijų skaičiaus padidėjimas (izoliato Nr. 41 kampilobakterijų kolonijų skaičius padidėjo nuo 21,0*108 ksv/g iki 27,67 108 ksv/g). Inkubuojant kampilobakterijas 7 dienas 5 °C temperatūroje, mikroaerofilinėmis sąlygomis, pastebimas kolonijų skaičiaus sumažėjimas (izoliato Nr. 41 nuo 21,0*108 ksv/g iki 10,30*108 ksv/g).
