LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

Vigrė Buliauskaitė

Citologinio tyrimo efektyvumas vertinant blužnies patologijas

Evaluation of accuracy of the cytological examination in the evaluation of

spleen pathologies

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovė: doc. dr. Nomeda Juodžiukynienė

Kaunas, 2021

2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Citologinio tyrimo efektyvumas vertinant blužnies patologijas”

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVRITINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO ... (data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentai

1)____________________________________________________________________________. 2)____________________________________________________________________________. (vardas, pavardė) (parašai)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

1.1 Šunų blužnies morfologija, fiziologija bei histologija ... 8

1.1.1 Morfologija ... 8

1.1.2. Histologija ... 9

1.1.3. Fiziologija ... 11

1.2. Šunų splenektomija ... 12

1.3. Blužnies citologinis tyrimas ... 13

1.5. Pagrindinės šunų blužnies patologijos ... 14

1.5.1 Nenavikiniai pažeidimai ... 14

1.5.2. Neoplazijos ... 16

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 18

2.1. Informacija apie tyrimą ... 18

2.2. Patologinės medžiagos paruošimas citologiniam tyrimui ... 18

2.3. Blužnies citologinių preparatų tyrimas... 19

2.4. Patologinės medžiagos paruošimas histologiniam tyrimui ... 20

2.5. Blužnies histologinių preparatų tyrimas ... 22

2.6. Statistinės analizės metodai ... 22

3. TYRIMO REZULTATAI ... 23

IŠVADOS ... 41

LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 42

4 CITOLOGINIO TYRIMO EFEKTYVUMAS VERTINANT BLUŽNIES PATOLOGIJAS

Vigrė Buliauskaitė Magistro baigiamasis darbas

SANTRAUKA

Tyrimas atliktas Lietuvoje, privačiose smulkių gyvūnų klinikose ir universiteto laboratorijoje. Mokslinis tiriamasis darbas susideda iš 45 puslapių, kuriuos sudaro 5 lentelės, 26 paveikslėliai bei 44

literatūros šaltiniai. Tyrimo tikslas: Nustatyti citologinio tyrimo tikslumą vertinant blužnies patologijas. Iš kelių privačių smulkiųjų gyvūnų klinikų surinkti 24 blužnies mėginiai. Visiems mėginiams atliktas

citologinis tyrimas: mėginiai tyrimui paimti taikant antspaudo bei plonosios adatos aspiracijos, biopsijos metodus. Mėginiai nudažyti „dip quick“ dažais. Paimti mėginiai histologiniam tyrimui patalpinti vienkartiniuose sandariuose indeliuose su 10 proc. formalino tirpalu, su atitinkamu lydraščiu siunčiamas į laboratoriją tyrimo paruošimui. Paruošti histologiniai preparatai nudažyti HE dažais. Abu tyrimai ištirti mikroskopu, nustatytos diagnozės. Vertinamas citologinio tyrimo efektyvumas, navikinėms ir nenavikinėms patologijoms diagnozuoti. Nustatomas citologinio tyrimo veiksmingumas įtraukiant makroskopinį blužnies vaizdą.

Buvo nustatyti 8 navikinės kilmės patologijos ir 16 nenavikinės kilmės pakitimų. Palyginus citologinio ir histologinio mėginių diagnozes, nustatėme, jog iš 8 navikinės kilmės patologijų tikslingai diagnozuotos tik 4. Nenavikinės patologijos diagnozuotos teisingai abejais tyrimo metodais. Gautas citologinio tyrimo jautrumas – 50 proc., specifiškumas 100 proc., bendras tyrimo tikslumas 83 proc. Pagal maknemaro chi kriterijaus formulę (χ2 = 4.3, p < 0,05).

Susiejus makroskopinį blužnies vaizdą su histologinio tyrimo atsakymu, nustatyta, jog histologinį tyrimą naudinga atlikti siekiant išvengti neteisingai neigiamos citologinio tyrimo metu gautos diagnozės, kuomet makroskopiškai stebimas mazgas. Taip pat tikslinga histologinį tyrimą atlikti įsitikinti dėl

neteisingai teigiamos diagnozės, kuomet makroskopiškai matoma hiperplazija ar kitas nemazginės struktūros pakitimas. Pagal Stjudento t testą (p < 0.05) ir mėginių rezultatus, toks algoritmas būtų lygiai toks pat efektyvus kaip visų mėginių histologinis tyrimas, tačiau šiuo būdu būtų sumažintas histologinio tyrimo reikalingumas, ekonomines išlaidos bei, kiek įmanoma, pagerintas citologinio tyrimo

efektyvumas diagnozuojant šunų blužnies patologijas.

5 EVALUATION OF ACCURACY OF CYTOLOGICAL EXAMINATION IN THE EVALUATION

OF SPLEEN PATHOLOGIES Vigrė Buliauskaitė

Master’s Thesis

SUMMARY

The research was performed in Lithuania, several private small animal clinics as well as the university’s laboratory. This thesis is structured into 45 pages and contains 5 tables, 26 pictures, as well as 44 references. The aim of the thesis: To evaluate the accuracy of cytological examination in the evaluation of spleen pathologies.

24 spleen samples were collected from several small animal clinics. All samples were examined cytologically: the samples were collected using a fine needle aspiration biopsy and stamping methods. The samples were dyed with „Dip quick” dye. The samples for the histological examination were placed in disposable containers with 10% formalin solution and were sent to the laboratory for the preparations for the analysis. The prepared samples were dyed with HE dye. The diagnoses of both cytological and histological samples were determined using a microscope. The efficacy of the cytological examination for the cancerous and non-cancerous pathologies was evaluated. The effectiveness of the cytological examination is determined by including a macroscopic view of the spleen.

8 cancerous and 16 non-cancerous pathologies were identified. Out of 8 cancerous pathologies only 4 were diagnosed correctly. Non-cancerous pathologies were diagnosed correctly using both examination methods. The sensitivity of the cytological examination was 50%, the specificity was 100%, and the overall accuracy was 83% according to the McNemar’s chi formula (χ2 = 4.3, p < 0,05). When the macroscopic view of the spleen was linked with the histological examination result, it was established that histological examination is a useful method to avoid a false negative result from the cytological examination when the nodule is seen via macroscopic view in the spleen. Additionally, the histological examination is useful in the detection of the false positive diagnosis when hyperplasia or other nonnodular structure changes are seen in the macroscopic view. This algorithm would have the same efficacy to that if all samples were analysed using a histological examination (Student's t-test (p < 0.05). Using this method the neccessity of the histological examination would be lessened, aditionally, the effectiveness of the cytological examination in canine spleen pathologies would be improved.

6

SANTRUMPOS

RBC – (angl. red blood cells) raudonieji kraujo kūneliai; HE – hematoksilino eozino dažai;

FNA – (angl. fine needle aspiration) smulkioji adatos aspiracija; HSA – hemangiosarkoma;

MZL – (angl. marginal zone lymphoma) marginalinės zonos limfomoje; MCL – (angl. mantle zone lymphoma) mantijos zonos limfoma;

EMH – (angl. extramedullary hematopoesis) ekstramedulinė hemopoezė; CI – (angl. confidence interval) pasikliautinis intervalas;

p – patikimumas.

7

ĮVADAS

Blužnies patologijos yra svarbi vidutinio bei vyresnio amžiaus šunų sergamumo ir mirštamumo priežastis, galinti pasireikšti lėtu chroniniu veikimu ar ūmia klinika bei greita mirtimi. Splenomegaliją nesudėtinga aptikti atliekant klinikinę apžiūrą palpacijos būdu ar specifiniais ultragarso, rentgeno tyrimais (1). Dažnai pakitimai aptikti blužnyje, atliekant specifinius tyrimo metodus (rentgeninį, ultragarsinį tyrimus), yra neteisingai priskiriami navikiniams susirgimams, ko pasekoje gyvūnas dažnai būna eutanazuojamas. Tačiau, priklausomai nuo šuns blužnies patologijos priežasties, piktybiškumo, išgyvenamumas po atliktos splenektomijos gali siekti nuo kelių savaičių iki 15 mėn ir daugiau. Todėl atliktas citologinis tyrimas gali lemti tolimesnius gydytojo veiksmus: taikyti operacinį gydymą, atlikti kitus diagnostinius tyrimus ar taikyti medikamentinį gydymą.

Smulkiosios adatos aspiraciją galima atlikti ne tik laparatomijos metu, bet ir perkutaniškai su ultragarso pagalba (2,3). Laiku atliktas citologinis tyrimas ir galimai nustatyta diagnozė gali padėti tiek veterinarijos gydytojui labiau suvokti bendrą situaciją ir įvertinti gyvūno prognozę, priimti tinkamus sprendimus, bet ir pagelbėti pačiam šeimininkui apsispręsti dėl tolimesnio gyvūno gydymo.

Darbo tikslas: nustatyti citologinio tyrimo tikslumą vertinant blužnies patologijas.

Darbo uždaviniai:

1. Surinkti splenektomijos metu pašalintų pakitusių blužnų mėginius histopatologiniam tyrimui, atlikti jų dažymą HE,

2. Atlikti citologinį tyrimą iš pašalintų blužnų aspiraciniu bei antspaudo metodais, 3. Įvertinti citologinio tyrimo tikslumą.

8

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Šunų blužnies morfologija, fiziologija bei histologija

1.1.1 Morfologija

Šunų blužnis yra pailgas plokščias organas, kurio skerspjūvis primena trikampį. Įprastai blužnis raudona, raudonai ruda ar violetinė, minkštos konsistencijos, tačiau ne tokia trapi kaip kepenys ir sudaro apie 0.2 proc šunų bei kačių kūno svorio. Anatomiškai blužnis aptinkama kairėje kranialinėje pilvo pusėje. Dorsalinė blužnies galūnė (galva) prisitvirtinusi prie didžiosios skrandžio kreivės plačiu skrandininiu blužnies raiščiu (ligamentum gastrosplenicum), ir aptinkama tarp kairio inksto, kairės diafragmos kojelės bei skrandžio dugno. Didesnė ventralinė galūnė (uodega) yra gana mobili, todėl blužnies topografija kinta priklausomai nuo skrandžio ar žarnyno prisipildymo. (4).

1 pav. Šuns blužnies topografija(41)

Blužnį iš visų pusių dengia skaidulinio jungiamojo audinio kapsulė, kuri su pertvaromis sudaro blužnies stromą. Tarp pertvarų yra blužnies parenchima, kurią sudaro tinklinio ir limfoidinio audinio telkiniai. Apie centrines arterijas esančiame limfoidiniame audinyje (baltojoje pulpoje), aptinkamas ketvirtadalis viso organizmo limfocitų, būtent todėl šiame audinyje inicijuojamas imuninis atsakas į kraujo antigenus. Kitose blužnies limfoidinio audinio srityse yra daug makrofagų. Dėl kraujo ląstelių (daugiausia eritrocitų) gausos jos yra tamsesnės. Ši sritis priskiriama raudonajai pulpai. Vidinis blužnies skaidulinio jungiamojo audinio kapsulės sluoksnis vadinamas elastiniu, kadangi tarp jungiamojo audinio

9

gausu elastinių skaidulų. Dėl didelio elastingumo, jungiamojo audinio bei lygiųjų raumenų blužnis sugeba stipriai išsiplėsti, taip atlikdama kraujo rezervuaro funkciją. (5,6).

Beveik 2.5 proc širdies išstumiamo kraujo patenka į blužnį iš blužnies arterijos - arteria splenica, kuri išsišakoja iš celiakinio kamieno. Blužnies arterija kerta dorsalinį kairiosios kasos dalies paviršių giliajame didžiosios taukinės sluoksnyje, pasidalindama į dorsalinę ir ventralinę atšaką, einančią pro blužnies vartų (hilum) visceralinį paviršių. Iš dorsalinės atšakos išeina keletas arterijų, kurios patenka į blužnies dorsalinį galą ir į kelias trumpas skrandžio arterijas. Šunų blužnis priskiriama sinusiniam tipui, kadangi raudonojoje pulpoje stebimos arterijų anastomozės. Blužnies vena surenka kraują iš daugelio didžiųjų venų ir, prieš patenkant į vartų veną (vena portae), nuteka į gastrospleninę veną. Blužnies limfmazgius galima rasti šalia blužnies venos ir arterijos, kelių centimetrų atstumu nuo blužnies vartų (4,7).

1.1.2. Histologija

Kapsulė. Šunų blužnį dengia palyginti plona kapsulė, kurią sudaro tankus fibrozinis audinys, elastinės skaidulos bei lygusis raumeninis audinys, sudarantis didžiąją dalį kapsulės. Išorinį blužnies kapsulės sluoksnį sudaro mezotelio ląstelių sluoksnis, tačiau histologiniame preparate jų galima neaptikti. Iš kapsulės į parenchimą išeina lygiųjų raumenų sijos - trabekulės, kuriose kartu išsidėsčiusios eferentinės kraujagyslės, limfagyslės, nervai. (8,9). Arterijų atšakos kartu su sijomis patenka į parenchimą, išeidamos iš sijų arterijos padengiamos periarterinėmis limfinėmis makštimis (vaginae periarteriales lymphaticae), o jų praplatėjimai sudaro limfinius blužnies mazgelius - Malpigijaus kūnelius (10).

10

Baltoji pulpa susideda iš makrofagų, antigenus pristatančių ląstelių, B ir T limfocitų, esančių periarterinėse limfoidinėse makštyse (PALS), blužnies folikuluose (Malpigijaus kūneliai), ir marginalinės zonos. Limfoidiniai folikulai išsidėstę aplink centrines arterioles, kurį sudaro koncentriškai išsidėsčiusių retikulinių ląstelių tinklas (7). Daugumą limfoidinių folikulų sudaro funkciškai ir morfologiškai atskiri skyriai: periarteriolinė B zona, skaidrus centras ir marginalinė zona. Periarteriolinėje zonoje gausu nedidelių limfocitų, makrofagų ir dendritinių ląstelių tarpuose. Šios zonos limfocitai pasižymi kompaktiškais branduoliais su siaura citoplazma. Skaidrūs limfoidinių folikulų centrai susideda iš didesnių T ir B limfocitų ląstelių su aiškiais ir dideliais branduoliais bei palyginti mažomis citoplazmomis, kai kurie iš jų yra dar mitozės fazėje (11). Imunostimuliacijos metu folikulai sukuria specifinius germinatyvinius centrus, kuriems būdinga tamsi zona, susidedanti iš centroblastų ir imunoblastų – proliferuojantys B limfocitai bei šviesi zona - neproliferuojantys B limfocitai, tarp jų galima rasti makrofagų. Germinatyvinį centrą supa plona mantija, kurią sudaro glaudžiai išsidėstę neaktyvūs subrendę B limfocitai ir folikulinės dendritinės ląstelės. Šiuose germinaliniuose centruose antigeno stimuliacijos metu B limfocitai įgauna antigeninį specifiškumą (7).

Baltajai pulpai pereinant į raudonąją aptinkama marginalinė zona. Šią zoną dauguma laiko atskira, o kiti priskiria prie baltosios pulpos. Pagrindinis šios zonos tikslas yra apsaugoti sisteminę kraujotaką nuo antigenų ir patogenų bei atlieka svarbų vaidmenį perdirbant antigenus (9). Marginalinėje zonoje gausu išskirtinų B limfocitų, kurie esant imunizacijai geba greitai suaktyvėti. Šioje zonoje sąveikaujantys T ir B limfocitai, makrofagai sudaro puikią sąveiką tarp įgimto bei įgyto imunitetų. Stimuliuojami tinkamo antigeno, B limfocitai proliferuoja ir diferencijuojasi į antikūnus gaminančias ląsteles ir sijomis patenka į raudonąją pulpą (11).

3 pav. Šuns blužnies histologija. Apibrėžtas

limfoidinis folikulas.

Stebima centrinė arterija (CA), kurią supa T ląstelės, Viduryje šviesus germinalinis centras (GC), kuriame gausu B limfocitų, proliferuojančių į plazmines ląsteles. Mantijos zonoje (ManZ) gausu mažų

limfocitų, marginalinėje (MarZ) – didesni ir subrendę limfocitai (44)

11

Raudonoji pulpa sudaro didžiąją blužnies tūrio dalį. Ši dalis nėra tokia struktūrizuota palyginus su baltąja pulpa, o jos pagrindą sudaro sinusų (ančių) bei blužnies stygų tinklas. Blužnies stygas sudaro gausus, netaisyklingai išsidėstęs ląstelių tinklas. Pagrindinę dalį sudaro eritrocitai, plazminės ląstelės, limfocitai, makrofagai. Taip pat galima rasti granuliocitų, retikuliocitų, o jas visas gaubia nedidelis žvaigždėtųjų ląstelių sluoksnis. Į raudonąją pulpą didžioji dalis kraujo patenka per marginalinę zoną, iš centrinės arterijos išeinančiomis atšakomis. Dalis kraujo patenka iš teptukiškųjų arteriolių, per kapiliarus, tiesiai į veninius sinusus, kur su išeinančiomis venomis sudaro uždarą kraujotaką (12).

4 pav. Pavaizduota raudonoji pulpa.

Stebimi veniniai ančiai (VS) su kraujo ląstelėmis, Sinusus sudaro plokščiai išsidėsčiusių endotelinių ląstelių sluoksnis, blužnies stygos (P) sudarytos iš plazmocitų,

makrofagų, limfocitų, eritrocitų bei retikuliocitų (44)

1.1.3. Fiziologija

Blužnis yra funkciškai įvairus organas, aktyviai dalyvaujantis atliekant imuninę priežiūrą ir kraujodarą. Svarbiausios funkcijos yra mikroorganizmų ir antigeninių dalelių filtravimas iš kraujo, imunoglobulino G ir komplemento citokinų sintezė, naujai susiformavusių eritrocitų brendimas, raudonųjų kraujo kūnelių (RBC) bei trombocitų laikymas, senų, nenormalių kūnelių pašalinimas (4).

Hematopoezė. Blužnis yra atsakinga už galutinį raudonųjų kraujo kūnelių subrendimą prieš išleidimą į cirkuliaciją. Po gamybos kaulų čiulpuose RBC kelias dienas bręsta blužnyje, tuo metu pašalinama viduląstelinė medžiaga, ląstelės membrana suformuojama į diską ir sumažėja ląstelės dydis. Neelastingos ląstelės, tokios kaip sferocitai ar akantocitai, negali tinkamai deformuotis, kad galėtų praeiti pro sinusoidinę blužnį, todėl jas fagocituoja makrofagai. Iš sunaikintų kūnelių gauta geležis kaupiama blužnyje kaip feritinas ir hemosiderinas, o prireikus naudojama kaulų čiulpuose kraujodarai. Spleninė ekstramedulinė kraujodara atsiranda vaisiaus augimo ir naujagimio laikotarpiu, kol kaulų čiulpai perima

12 kraujodarą, tačiau suaugusiems gyvūnams blužnis gali atnaujinti tam tikrą RBC gamybą, reaguodamas į infiltracines kaulų čiulpų ligas arba padidėjusį poreikį dėl nukraujavimo (7, 12).

Rezervuaras. Blužnis gali saugoti 10–20% šuns RBC masės ir 30% trombocitų masės. Iš 48 šunų blužnies sinusų paimtas kraujo mėginys, pasižymėjo aukštu hematokrito lygiu (80–90%). RBC, pratekantys per blužnį įprastos cirkuliacijos metu, yra suskirstyti į tris „baseinus”, atsižvelgiant į kraujotakos modelį. Greitasis baseinas sudaro apie 90% pratekančio kraujo, patenkančio į blužnį, ir filtracija trunka mažiau nei 30 sekundžių, iki kol prisijungia prie sisteminės kraujotakos. Tarpiniam baseinui (9% cirkuliuojančio kraujo) per blužnį praeiti vidutiniškai užtrunka 8 minutes, o lėtame (1% cirkuliuojančio kraujo) - net 1 valandą. Fiziologinis kraujo poreikis sąlygoja blužnies susitraukimą, todėl iki 98% visų saugomų eritrocitų gali reikiamu momentu patekti į bendrąją kraujotaką (4).

Imunologinė funkcija. Be to, kad blužnis yra vaisiaus imuninės sistemos vystymosi pagrindas, ji yra didžiausia B-ląstelių, T-ląstelių ir IgM gamintojas šunų organizme. Blužnyje filtruojami mikroorganizmai iš kraujo, per fagocitozę. Patekęs antigenas veikiamas makrofagų, iš marginalinės zonos bei raudonosios pulpos ančių. Makrofagai antigeną transportuoja į baltosios pulpos folikulus, kur suintensyvėja specifinių B ląstelių gamyba. Antigeno patekimas padidina limfocitų gamybą, taip maksimaliai padidinamas imuninis atsakas. Per kelias dienas nuo antigeno pateikimo aktyvuoti limfocitai migruoja iš pirminio folikulo į raudonąją pulpą ir marginalinę zoną, kur susidaro daugiausia antikūnų (28).

1.2. Šunų splenektomija

Pilna splenektomija yra viena dažniausių chirurginių procedūrų, susijusių su blužnies patologijomis. Nors splenektomijos technika yra gana paprasta, pacientai dažnai būna sunkios ar net kritinės būklės. Siekiant užtikrinti hemodinamikos stabilumą prieš operaciją, prireikus reikia taikyti tinkamą skysčių terapiją, įskaitant papildomus koloidus ir kraujo produktus, jei reikia. Šunims su blužnies patologijomis būdingi širdies ritmo sutrikimai, tad reikėtų papildomai atsižvelgti renkant anestezijos planą (13).

Aliekant splenektomiją svarbu tinkamas kraujagyslių ligatūravimas. Veterinarinėje medicinoje taikomi du metodai: atskiras blužnies vartų kraujagyslių ligatūravimas arba pagrindinių blužnies arterijos ir venos bei skrandžio arterijos perrišimas. Individualus ligatūravimas užima daugiau laiko, o paskutiniai tyrimai parodė, kad skrandžio aprūpinimas krauju nepakinta perrišus pagrindines skrandžio-blužnies arterijas bei venas (14).

13

5 pav. Pagrindinės blužnies kraujagyslių ligatūravimo vietos(43)

Dažniausiai pasitaikančios komplikacijos po splenektomijos yra kraujavimas, kasos pažeidimai ir širdies aritmija. Kraujavimas, dažniausia ankstyvos pooperacinės mirties priežastis, atsiranda dėl netinkamo kraujagyslių ligatūravimo. Vėlesnėms komplikacijoms priskiriama padidėjusi sepsio rizika ir latentinės parazitinės ar bakterinės infekcijos atsiradimas. Nors diskutuojama apie profilaktinių antibiotikų naudingumą splenektomijos metu, pacientai, kurių imuninė sistema yra susilpnėjusi, ir pacientai, kuriems jau yra infekcija, operacijos metu turėtų gauti baktericidinius antibiotikus (13).

1.3. Blužnies citologinis tyrimas

Citologinis tyrimas yra viena iš biopsijos rūšių, kai iš gyvo organizmo gaunama ląstelių masė, kuri paskleidžiama per objektinį stiklelį, fiksuojama ir dažoma. Šviesiniu mikroskopu vertinama ląstelių morfologija.

Citologinis tyrimas yra gana paprastas ir greitas tyrimo metodas. Smulkios adatos aspiracija (FNA) yra metodas, naudojamas audinių ląstelėms įsiurbti į pažeidimo vietą įvedant mažo dydžio adatą. Iš FNA gauti mėginiai naudojami mėginiui paruošti, kurį galima analizuoti įvairiais metodais, pavyzdžiui, mikroskopija. Šiuos rezultatus bus galima panaudoti galutinei diagnozei nustatyti, atlikti papildomus tyrimus ar atmesti konkrečias ligas. Procedūros metu retai reikia bendros anestezijos, o mažas adatos diametras retai sukelia klinikinių komplikacijų (15).

Imant blužnies mėginį citologiniam tyrimui reikia papildomai atkreipti dėmesį į blužnies dydį, laikytis visų įmanomų atsargumo priemonių. Padidėjusi blužnis gali būti trapi, perpildyta kraujo, todėl

14 galimos citologinio mėginio ėmimo komplikacijos yra gausus kraujavimas į pilvo ertmę ar naviko metastazės pilvo ertmėje. Atlikti tyrimai su šunimis ir žmonėmis parodė, kad trombocitopenija, blužnies pažeidimas imant citologinį mėginį adata, nebuvo susiję su komplikacijų skaičiaus bei sunkumo padidėjimu (16).

Sveikos blužnies citologinio tyrimo vaizdas primena limfinio mazgo sudėtį. Geras preparatas turėtų pasižymėti gausiu kiekiu mišrių ląstelių, iš kurių daugiausia nedidelių limfocitų, nedaug makrofagų, plazminių bei putliųjų ląstelių ir kartais randamų kraujodaros ląstelių. Tinkamai paruoštame mėginyje stebimi įvairaus dydžio blužnies audinio fragmentai, susidedantys iš retikulinių skaidulų, stromos ląstelių (miofibroblastų, fibrohistiocitų), endotelio ląstelių, makrofagų ir plazminių ląstelių. Makrofaguose galima rasti fagocituotų ląstelių dalelių, hemosiderino (19). Daugelyje laukų vyrauja maži limfocitai, kadangi blužnyje yra daug limfoidinių folikulų, kai kuriose matymo laukuose gali vyrauti dideli limfocitai. Jie gali būti sulipę į chromatiną, branduoliai matomi, panašūs į neoplastinius limfocitus, dėl ko galima klaidingai nustatyti neoplastinę proliferaciją. Suradus tepinėlių sritis, kuriose yra nevienalytė limfocitų ir plazminių ląstelių koncentracija, negalima teigti, kad šios ląstelės yra neoplastinės (18). Blužnies citologinio tyrimo kokybei įtakos turi ir aptinkamo kraujo kiekis. Blužnyje galima aptikti įvairaus dydžio ir stadijos eritrocitų, gali būti apvalūs, su ryškiai matomais branduoliais. Didelis kiekis tokių ląstelių gali apsunkinti citologinio tyrimo matymo lauko analizę, patologijos nustatymą (17).

1.5. Pagrindinės šunų blužnies patologijos

1.5.1 Nenavikiniai pažeidimai Uždegimas

Nustatant uždegimo tipą, įvertinamas įvairių uždegiminių ląstelių kiekis ir jų santykis. Uždegiminės ląstelės - neutrofilai, eozinofilai, limfocitai, audinių makrofagai, epitelioidiniai makrofagai ir uždegiminės gigantinės ląstelės. Uždegiminio atsako metu galima rasti ir uždegimo sukėlėjus (babezija, leišmanija, kokcidija, aspergiliozė). Uždegimo citologinis vaizdas priklauso nuo jo trukmės ir sukėlėjo. Ūmaus uždegimo atveju dominuoja neutrofilai, lėtinio atveju dominuoja įvairios uždegiminės ląstelės (20).

Jei kraujyje esančių patogeninių bakterijų skaičius viršija blužnies makrofagų pajėgumą, kaip ir sunkios septicemijos atvejais, tai gali sukelti ūminį blužnies uždegimą. Marginalinė zona gali būti pirmoji į kraujyje esančius antigenus ir bakterijas reaguojanti vieta. Vos valandos bėgyje marginalinė zona gali būti infiltruota neutrofilų ir makrofagų agregatais (21).

15 Hiperplazija

Blužnies hiperplazija gali būti susijusi su neoplastinėmis patologijomis, dėl kurių difuziškai padidėja visa blužnis arba atsiranda lokalizuoti mazginiai židiniai. Mazginė hiperplazija šunims yra nedažna, tai gerybinis ląstelių dauginimasis (24).

Hiperplazijos atveju randamos ląstelės yra subrendę, jų citoplazmos, branduolių ir branduolėlių dydis, forma yra vienoda. Kartais galima aptikti ir nesubrendusių ląstelių, kurių būna padidėjęs branduolio - citoplazmos santykis ir tokias ląsteles sunku atskirti nuo navikinių ląstelių (18). Blužnies citologiniame mėginyje dominuoja maži limfocitai, tačiau padaugėja vidutinių bei didelių limfocitų. Dažnai hiperplazija susijusi su uždegiminiu procesu, todėl preparate stebimi makrofagai ir plazmos ląstelės, padidėjęs putliųjų ląstelių ir neutrofilų skaičius. Hiperplazija gali būti kaip reakcija į infekciją ar kraujo parazitus (17).

Ekstramedulinė hemopoezė

Apibūdinama kaip naujų kraujodaros vietų formavimasis už kaulų čiulpų ribų. Citologinis mėginys pasižymi kraujodaros ląstelių - eritroidinių, mieloidinių ląstelių, megakariocitų buvimu ekstramedulinėje srityje. Nedidelis kiekis šių ląstelių yra fiziologinė norma šunims ir katėms, o ryškus padidėjimas leidžia numanyti apie galimus susirgimus. Dažniausiai pasireiškia po nukraujavimų, esant hemolitinei anemijai, gali pasireikšti atskirai, ar kartu su neoplazijomis (22).

Hematoma

Dažniausiai aptinkama kartu su kitais pažeidimas, po traumų. Hematoma formuojasi, kuomet didelis kraujo kiekis pradeda kauptis raudonojoje pulpoje, pokapsulinėje dalyje, bei sutrinka jo nutekėjimas. Toje vietoje, atsiradus hematomai, gali atsirasti antriniai požymiai kaip lokali nekrozė ar hipoksija. Citologinio tyrimo metu stebimas didelis raudonųjų kraujo kūnelių kiekis, sankaupos (25). 2016 metais atliktas retrospektyvus tyrimas, kuriame buvo išanalizuoti 36 šunys, kuriems buvo diagnozuota blužnies hematoma. Rezultatai parodė, jog vidutinis išgyvenamumas po splenektomijos buvo 674 dienos (nuo 0 iki 3287d.), o vidutinis amžius 10 metų. Taip pat buvo pastebėta, kad hematoma bei hemangiosarkoma turi panašų klinikinį ir makroskopinį vaizdą, todėl būtinas histopatologinis tyrimas, patvirtinantis vieną iš diagnozių. Tyrime aprašoma, kad šios dvi patologijos gali būti aptinkamos kartu, todėl svarbus histopatologinio mėginio paėmimas. Siekiant diferencijuoti šias patologijas išskiriama blužnies hematomos limfoidinio audinio hiperplazija (26).

16 1.5.2. Neoplazijos

Hemangiosarkoma

Hemangiosarkoma (HSA) yra labai piktybinis navikas, kilęs iš kraujagyslių endotelio ląstelių sluoksnio, kuriam būdingos ankstyvos ir agresyvios metastazės. HSA yra dažnas šunų naviko tipas, apimantis nuo 5% iki 7% pirminių piktybinių navikų. Kitų rūšių paplitimas yra daug mažesnis, pavyzdžiui, katėms vos nuo 0,5% iki 2% (27).

Būdami kraujagysliniai navikai, HSA dažniausiai lydi cirkuliuojantys akantocitai ir šistocitai. Hemangiosarkoma dažnai sukelia hemoragijas, kurios pasunkina citologinę diagnostiką. Mikroskopiškai, hemangiosarkomos ląstelės yra didelės, nuo verpstės iki daugiakampės formos, turinčios apvalų ar ovalų branduolį su vienu ar daugiau ryškių branduolėlių, tamsiai mėlyna citoplazma ir daugybe mažų atskirų vakuolių (29).

2013 metais aprašytame tyrime buvo išanalizuoti 122 šunų HSA atvejai. Tirtų šunų amžius svyravo nuo 2 iki 14 metų. Buvo pastebėta, jog sunkesniais atvejais šunims pasireiškė hemoperitoniumas. Vidutinis išgyvenamumas po splenektomijos vos 50 dienų (išgyvenamumas buvo žinomas tik 77 šunų). Dominavusios veislės: vokiečių aviganiai, labradoro retriveriai, bei mišrios veislės šunys (30).

6 pav. Šuns blužnis su daugybiniais HSA mazgais (30)

Limfoma

Ne visada įmanoma atskirti pirminę blužnies limfomą ir metastazinę limfomą, tačiau didžioji dalis pirminių blužnies limfomų yra žemo laipsnio B ląstelių limfomos, dažnai atsirandančios iš marginalinės ar mantijos zonų. Mikroskopiškai aptinkamas padidėjęs limfoblastų procentas turėtų būti vertinamas atsargiai, nes staigus šių ląstelių padidėjimas būdingas ir hiperplastinėms blužnims (24). Ankstyvoje

17 MZL (marginalinės zonos limfomoje) mikroskopiškai stebime ląstelių homogeniškumą, dar prieš marginalinės ir mantijos zonų susiliejimą. Marginalinės zonos limfocitai pasižymi padidėjusiu branduoliu, branduolėlio dydis nesikeičia, chromatinas tampa smulkesnis, didžiausios jo sankaupos stebimos aplink branduolio membraną. Mažas mitozės rodiklis yra vienas iš MZL diagnostikos rodiklių. Progresuojant šio tipo limfomai atskiros blužnies zonos sunkiai atskiriamos, tarp neoplastinių limfocitų aptinkamas didelis kiekis raudonųjų kraujo kūnelių (31).

2011 metais aprašytame tyrime buvo išanalizuoti 5 šunų diagnozuotos limfomos atvejai. Vidutinis amžius - 8 m., 4 patinai ir 1 patelė. Visiems tyrimo gyvūnams buvo nustatyta IV limfomos stadija, dviems pasireiškusi anemija, dar dviems trūkusi blužnis, ko pasekoja stebimas laisvas kraujas pilvo ertmėje. 4 šunims buvo atlikta splenektomija ir taikyta chemoterapija, kitam - tik splenektomija. Trys iš keturių chemoterapiją gavusių augintinių gaišo nuo kitų ligų, nesusijusių su limfoma, o jų išgyvenamumo laikas siekė 760, 939 ir 1,825 dienas, kitas augintinis išgyveno iki bandymo pabaigos - 445 dienas. Šuo, kuriam nebuvo taikyta chemoterapija išgyveno 180 dienų ir buvo eutanazuotas (32). Mantijos zonos limfoma citologiniu požiūriu sudėtingiau diagnozuojama. Neoplastinės MCL ląstelių branduoliai yra šiek tiek didesni, jiems trūksta branduolėlių, mitozės randamos retai.

Priešingai nei MZL, T-zonos limfomai (TZL) būdinga ląstelių proliferacija tarp nykstančių folikulų. Citologiniame mėginyje TZL susideda iš homogeniškų mažų limfocitų populiacijos, turinčios aštrius, negilius branduolio įdubimus, nepastebimus branduolėlius ir blyškią citoplazmą (31).

Mastocitoma

Mastocitoma yra gana dažnai pasireiškiantis navikas šunims, tačiau dažniausiai aptinkamas odoje ir nėra laikomas pavojingu. Nors putliosios ląstelės yra normali blužnies populiacija, jų padidėjimas yra siejamas su mastocitomos metastazavimu į blužnies audinius (24). Mastocitoma gali pasireikšti ir kaip sisteminė liga, pasireiškianti visceraline forma, kaip pirminis navikas, nors literatūroje išskiriama, jog išlieka galimybė kad pirminis navikas nebuvo diagnozuotas. Citologiškai neoplastinės putliosios ląstelės ryškiai diferencijuotos nuo kitų ląstelių, pasižymi ryškia granuliuota citoplazma, hematoksilino-eozino dažais nusidažančia pilkai melsva spalva (33).

18

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

2.1. Informacija apie tyrimą

Blužnies mėginiai citologiniams bei histologiniams tyrimams buvo renkami iš kelių veterinarijos klinikų 2019-2020 metų laikotarpyje. Viso buvo surinkta 24 blužnies mėginiai iš įvairios veislės, amžiaus bei lyties šunų. Citologinis mėginys paimtas antspaudo bei aspiracijos metodais, iškart po splenektomijos ar gyvūno eutanazijos, toje klinikoje, kurioje atlikta procedūra. Histologinis tyrimui paimtas blužnies mėginys patalpintas į 10 proc. formalino tirpalą ir su atitinkamu lydraščiu išsiųstas patogistologiniam tyrimui į Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, veterinarijos akademijos, patologijos centrą. Vėliau surinkti mėginiai tirti ir analizuoti veterinarijos akademijos patologijos centre.

2.2. Patologinės medžiagos paruošimas citologiniam tyrimui

Citologinio mėginio ėmimas antspaudo metodu: pirmiausia blužnis apžiūrima, apčiupinėjama, nustatomos pakitusios blužnies dalys. Tuomet daromas skersinis blužnies pjūvis ties pažeista vieta. Jei pjūvyje išsiskiria kraujo, jis lengvai nusausinamas tamponėliu. Nusausinus, objektinio stiklelio paviršius priglaudžiamas prie paruošto blužnies tiriamosios vietos ploto. Tinkamai paruoštas ir nusausintas mėginys turėtų būti plonas, pasiskirstęs po visą liečiamąjį plotą. Toks mėginys fiksuojamas sausuoju metodu - paliekamas džiūti ore.

Tuo metu atliekamas citologinis mėginys aspiracijos metodu. Kadangi tiriamoji medžiaga yra blužnis, pasirinkta aspiraciją atlikti teigiamo slėgio metodu. Pirmiausia yra lokalizuojamas pažeidimas, įvertinamas jo dydis, konsistencija. Tyrimo metu FNA buvo atliekama su 21G dydžio adata ir 10 ml švirkštu. Mėginiui paimti pasiruošti du objektiniai stikleliai. Viena ranka lokalizavus mėginio ėmimo vietą, kita ranka tik su adata arba prijungtu švirkštu įbedama į blužnį ir pilnai adatos neištraukiant pakeičiama jos poziciją įvairiomis kryptimis. Atlikus šį veiksmą, adata ištraukiama, jei pridėta, nuimama nuo švirkšto, į jį pritraukiama oro, adata uždedama atgal ir vienu greitu judesiu oras išpučiamas su ląstelių turiniu ant objektinio stiklelio paviršiaus. Jeigu lokalizuotas blužnies pažeidimas kietos konsistencijos ir teigiamo slėgio metodu negaudavome reikiamo ląstelių kiekio, atliekamas FNA naudojant neigiamą slėgį: adata įbedama į lokalizuotą vietą, lengvu judesiu švirkštas pamažu atitraukiamas ir taip mėginio ėmimo vietoje sudaromas neigiamas slėgis. Šis metodas taip pat atliekamas įvairiomis kryptimis, siekiant paimti kiek įmanoma daugiau ląstelių, padėsiančių diagnozei nustatyti. Imant mėginį šiuo metodu labai svarbu neištraukti adatos su švirkštu ėmimo metu, kad ląstelių turinys nepatektų į švirkštą. Pabaigus imti

19 mėginį adata ištraukiama, nuimama, pritraukiamas oro švirkštas ir lygiai taip pat, kaip teigiamo slėgio metodu, lengvu judesiu išstumiamas ant objektinio stiklelio. Tuomet antruoju stikleliu lygiagrečiai pirmajam priglaudžiama ir švelniai paskleidžiama gautąa ląstelių masę. Tinkamai atlikus gaunamas vienas sluoksnis ląstelių ant objektinio stiklelio, be didelių priemaišų.

Gauti preparatai fiksuojami juos džiovinant ore, jiems išdžiūvus iškart dažomi paėmimo vietoje „Dip

quick stain” greitaisiais dažais.

Dažymo protokolas su „Dip quick stain” dažais:

1. Mėginys merkiamas į fiksuojamąjį tirpalą 5 kartus po 1 sek.,

2. Nusausinamas tirpalo perteklius lengvai priliečiant objektinio stiklelio galą į vienkartinį popierių, 3. Merkiama į antrąjį indelį su eozinofiliniais dažais, kartojama 5 kartus po 1 sek.,

4. Dažų perteklius nusausinamas lengvai priliečiant objektinio stiklelio galą į vienkartinį popierių, 5. Mėginys merkiamas į trečiąjį indą su bazofiliniais dažais, kartojama 5 kartus po 1 sek.,

6. Nusausinamas dažų perteklius lengvai priliečiant objektinio stiklelio galą į vienkartinį popierių, 7. Gausiai nuplaunama distiliuotu vandeniu, 8. Paliekama nudžiūti ore.

2.3. Blužnies citologinių preparatų tyrimas

Mėginiai analizuoti „Euromex“ binokuliariniu mikroskopu. Mažuoju padidinimu patikrinama mėginio kokybė: koks mėginio ląstelingumas, ar mėginys vienasluoksnis, kaip gerai nusidažęs.

Pasirenkamas tinkamiausias laukas vertinimui, toliau analizuojama ląstelių rūšis didžiuoju padidinimu, su imersija.

Didžioji dalis aptiktų ląstelių yra įprasta blužnies preparatams, tačiau patologijai diagnozuoti svarbus šių ląstelių pasiskirstymas bei intensyvumas. Reaktyvūs pokyčiai nustatomi aptinkant įvairaus dydžio limfocitų, makrofagų, plazminių ląstelių. Padidėja putliųjų ląstelių skaičius, galima hemosiderozė. Ekstramedulinę hemopoezę diagnozuojame citologiniame preparate aptikę didelį kiekį eritroidinių ląstelių. Eritrocitai įvairaus brendimo stadijų. Aptinkami megakariocitai. Splenitas nustatomas radus didelį kiekį įvairių uždegiminių ląstelių, dominuoja makrofagai. Hematoma įtariama aptikus didelį kiekį raudonųjų kraujo ląsrtelių, įprastą kiekį įvairaus tipo uždegiminių ląstelių, galima aptikti didesnį skaičių fibroblastų, makrofagų. Makrofagai vietomis stebimi fagocituojantys (prariję) eritrocitus. Navikiniai pakitimai nustatomi aptinkant specifines pakitusias ląsteles ar tam tikrų ląstelių pagausėjimą. Limfomos preparate randame didelį kiekį didelių neoplastinių limfocitų, įvairaus brendimo limfocitų. Histiocitozė

20 pasireiškia keistais ir nesubrendusiais makrofagais, dažnai pasireiškia ryškia eritrofagocitoze. Hemangiosarkomos ląstelės yra didelės, individualios, verpstės žvaigždėmis su neaiškiomis citoplazmos ribomis. Citoplazma dažnai būna vakuolinė ir bazofilinė.

2.4. Patologinės medžiagos paruošimas histologiniam tyrimui

Iškart po operacijos blužnis įvertinama makroskopiškai, palpuojant nustatomos pakitusios blužnies dalys, mazgai. Pasirenkama pažeista blužnies vieta, daromas pjūvis skalpeliu, įtraukiant tiek sveiko audinio, tiek pažeisto audinio ribų. Paimtas mėginys iškart fiksuojamas specialiame vienkartiniame indelyje su 10 proc. formalino fosfatiniu buferiniu tirpalu. 1𝑐𝑚2 audinio turi tekti 10.0 ml formalino tirpalo, kuriame medžiaga laikoma ne trumpiau nei 72 valandas.

Užpildomas mėginio lydraštis histopatologiniam tyrimui atlikti, užfiksuojama mėginio paėmimo data, bendra informacija apie gyvūną, mėginio rūšis, fiksuojamas tirpalas. Paruoštas mėginys gali keliauti į Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, veterinarijos akademijos, patobiologijos centro laboratoriją, kur atliekamas histopatologinis mėginio tyrimas. Žemiau pateikta histopaatologinio mėginio paruošimo eiga:

1. Mėginys praplaunamas šaltu tekančiu vandeniu, pašalinant formaliną.

2. Darinys supjaustomas skalpeliu, esant reikalui pažymimos ribos, gabalėliai dedami į specialias kasetes.

3. Mėginiai kasetėse dehidruojami etilo alkoholio tirpale, 2-3 valandas, pamažu didinant jo koncentraciją (60°, 80°, 96°).

4. Tuomet patalpinama izopropanolio alkoholio tirpale, laikoma 1-3 val. 5. Dehidruota patologinė medžiaga merkiama ksileno tirpale, laikoma 1-3 val.

6. Apdorotas mėginys kasetėse įliejamas parafinu, audinių įliejimo įranga „Tes 99“. Jos šaldomos ant specialaus šaldomojo stalelio – „Pfm Cooling plate 4100“. Sustingus blokeliai išimami iš kasečių, pjaustomi pusiau rotaciniu, specialiu „Leica RM 2135“ mikrotonu, nustatant 3 µm storį. 7. Histopatologiniam tyrimui pasirenkama kas 5 nuopjova, ji su specialios adatėlės pagalba

patalpinama į šildomąją vandens vonelę (37° C) – „GFL 1052“, iš kurios gautas mėginys perkeliamas ant objektinio stiklelio.

8. Tokie mėginiai džiovinami ant specialaus stalelio – „Thermo Scientific Hotplate 312061“ su ~50° temp., džiovinama 5 val.,

9. Po džiūvimo mėginiai patalpinami į termostatą dar 24 val., kur palaikoma 37 °C temp., 10. Atliekamas mėginių dažymas.

21 Laboratorijoje mėginiai dažomi Hematoksilino eozino (HE) dažais, kurių dažymo eiga pateikta žemiau esančioje 1 lentelėje.

1 lentelė. HE dažymo eiga

Procesas Naudojamas tirpalas Mirkymo trukmė

Deparafinavimas Ksilenas 2 kartus po 10 min.

Dehidracija 99 proc. etilo alkoholis 5 min.

96 proc. etilo alkoholis 5min.

Plovimas Tekantis vanduo 5min.

Branduolių dažymas Mejerio hematoksilino dažai 10 min.

Plovimas Tekantis vanduo 5min.

Branduolių diferenciacija 37 mM amonio vanduo 30 s. Plovimas Tekantis vandentiekio vanduo 1 min. Citoplazmos dažymas Etanolinis eozino Y tirpalas 5min. Plovimas Tekantis vandentiekio vanduo 1 min.

Dehidratacija 96 proc. etilo alkoholis 3 kartus po 2 min.

Skaidrinimas Ksilenas I 5min.

Ksilenas II 5min.

22 Fiksavimas - saugojimas Naudojam specialūs

histologiniai klijai – „Thermo Scientific Shandon Consul- Mount Histology

Formulation“, užlašinus 1 lašą uždedamas dengiamasis stiklelis.

Laikoma 24 val. kamb. temp. iki kol sustingsta dengiamoji terpė.

2.5. Blužnies histologinių preparatų tyrimas

Histologiniai mėginiai analizuoti „Olympus mikroskopu. Pirmiausiai, kaip ir citologiniame mėginyje mažuoju padidinimu apžiūrimas bendras histologinis vaizdas, vertinamas mėginio vientisumas, audinių struktūros. Histologinis mėginys paimamas įtraukiant sveiko audinio ir pakitusio audinio dalis. Mėginio analizavimas pradedamas 40x padidinimu vertinant sveikąją blužnies dalį: vertinami folikulai, kraujagyslės, audinių struktūringumas. Tuomet analizuojama pakitusios blužnies dalis: vyraujančios ląstelės, pakitusių ląstelių kiekis, sandara. Nustatomos vyraujančios patologijos. Gauti rezultatai tiek citologinio, tiek histologinio tyrimo metu registruojami statistinei analizei.

2.6. Statistinės analizės metodai

Statistiniai tyrimo duomenys apdorojami naudojantis Microsoft Excel 2013 metų programa. Statistiniais tyrimais siekėme įvertinti citologinio tyrimo jautrumą bei specifiškumą diagnozuojant blužnies patologijas. Vertinta amžiaus bei svorio įtaka patologijų pasireiškimui. Koreliacija skaičiuota pagal Gary Smith formulę (“Statistical reasoning“, 1991). Išanalizuotas citologinio tyrimo specifiškumas, jautrumas, bendras tyrimo tiklsumas, apskaičiuotos teigiamos bei neigiamos tyrimo prognostinės vertės. Pagal Kloperio – Pirsono metodą nustatytas pasikliautinis intervalas šiems rodikliams. Siekiant išsiaiškinti kaip skiriasi citologinio tyrimo efektyvumas diagnozuojant navikines bei nenavikines patologijas, pasinaudota Maknemaro chi kriterijaus formule šiam rezultatui patvirtinti ar paneigti.

Maknemaro chi kriterijaus formulė: 𝑋2 =(𝑏−𝑐−1)2 𝑏+𝑐

Rezultatai skaitomi statistiškai reikšmingais, kuomet rezultato patikimumas yra didesnis nei 95 proc., t.y. kai statistinis patikimumas „p value” mažesnis nei 0.05 (p < 0.05).

23 Tolesniam citologinio tyrimo efektyvumo vertinimui naudojome Koheno kappa koeficiento formulę, skirtą reikiamai hipotezei ar tyrimo rezultatams patvirtinti ar paneigti. Hipotezė laikoma paneigta, jei kappa<0; Jei kappa koeficientas tarp 0.81-1, hipotezė patvirtinama.

Algoritmo patikimumo patvirtinimui naudojome Stjudento t statistinį kriterijų.

3. TYRIMO REZULTATAI

Nuo 2019 metų įvairiose smulkių gyvūnų klinikose Lietuvoje buvo surinkti 24 šunų blužnies mėginiai. Mėginiams atlikti citologiniai bei histopatologiniai tyrimai. Gauti mėginiai sugrupuoti į dvi grupes: citologinio tyrimo diagnozės bei histologinio tyrimo diagnozės, taip siekiant palyginti citologinio tyrimo efektyvumą. Histologinį tyrimas laikomas visiškai patikimu. Ištyrus 24 blužnies mėginius daugiausiai pasitaikė EMH (9 vnt.), hematomų (7vnt.). Kitos diagnozės pasiskirstė panašiai: hemangiosarkoma nustatyta 3 šunims, limfoma 2, reaktyvūs blužnies pokyčiai, plazmocitoma rasta 2 mėginiuose, mielolipoma, limfoidinio audinio hiperplazija, mikobakteriozė ir nepakitusi blužnis buvo nustatyti po 1. Didžiojoje dalyje histologinių mėginių nustatytos kelios patologijoss, todėl statistiniams skaičiavimams bei citologinio tyrimo efektyvumo vertinimui pasirinkta vieną pagrindinė diagnozę.

7 pav. Nustatytų patologijų skaičius

9 7 2 3 1 1 2 1 1 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Blužnies mėginių pasiskirstymas pagal diagnozę

24 Gauti blužnies mėginiai buvo registruojami įvardinant gyvūno amžių, svorį. Atlikus histologinius tyrimus nustatyta, kad iš 24 blužnies mėginių 8 aptiktos neoplazijos. Vidutinis šunų amžius siekė 11 metų, jauniausiam šuniui 4, vyriausiam – 17 metų. Šunys pagal amžių suskirstyti į dvi grupes: iki 10 ir vyresnių nei 10 metų. Analizuojant augintinius pagal svorį, mažiausias šuo svėrė 6 kg, didžiausias – 45 kg. Svorio vidurkis siekė 20 kg. Pagal veislę daugiausiai ištirta mišrios veislės šunų mėginių (14), po jų, vos 3 vokiečių aviganiai, 2 biglių veislės šunys, likusios veislės (taksas, kokerspanielis, borderkolis, belgų aviganis, Jorkšyro terjeras) po 1 mėginį. Dėl mažos veislių apimties jos nebuvo akcentuotos analizėje. Siekiant įvertinti svorio bei amžiaus įtaką neoplazijų atsiradimui, atlikta koreliacija pagal Gary Smith. Koreliacija tarp navikinių susirgimų bei amžiaus mūsų tyrime silpnai neigiama (-0.2), kas parodo, jog nežymiai didėjant amžiui, navikinių susirgimų mažėja. Koreliacija tarp piktybiškumo ir svorio - silpnai teigiama (0.3), kas nusako, jog augant svoriui didėja neoplazijų tikimybė. Koreliacija tarp navikinių susirgimų ir amžiaus su svoriu kartu - skaičiaus modulis didesnis už atskirus svorio ir amžiaus (0.37), todėl galima numanyti, kad navikinių patologijų tendencijas geriau nusako svoris ir amžius kartu, nei pavieniai svorio ir amžiaus rodikliai (p>0.05).

8 pav. Tirtų šunų pasiskirstymas pagal svorį

<15 29% 15-30 46% >30 25%

Šunų pasiskirstymas pagal svorį

<15 15-30 >30

25

9 pav. Tirtų šunų pasiskirstymas pagal amžių

Visiems mėginiams atlikti citologiniai bei histologiniai tyrimai. Siekdami išsaiškinti citologinio tyrimo efektyvumą gautos diagnozės palygintos (8 pav). Analizuojant mėginius pastebėta, jog citologinio ir histologinių tyrimų diagnozės sutapo 83 proc., (20/24 mėg.).

Tačiau išaiškėjo tendencija, jog tiksliai diagnozuotos buvo nenavikinės patologijos. Nors ir tiksliai diagnozavus pagrindinę blužnies patologiją, daugeliu atveju histologinio tyrimo metu buvo stebima daugiau papildomų blužnies pakitimų, kurie citologinio tyrimo metu buvo nepastebėti, tačiau jie galėjo daryti įtaką gyvūno būklei ar ligos eigai. Histologinis mėginys paprastai būna didesnis ir aprėpia tiek darinį, tiek sveikąją blužnies dalį, arba imami atskiri mėginiai iš sveikosios ir skirtingai atrodančios blužnies. Todėl imant citologinį mėginį svarbu aprėpti kiek įmanoma daugiau darinio krypčių ar tyrimą pakartoti kelis kartus. Citologinis mėginys paimtas iš tik vienos darinio dalies gali suteikti neteisingai neigiamą atsakymą – FN (false negative).

<10; 11; 46% >11;

13; 54%

Šunų pasiskirstymas pagal amžių

<10 >11 G yvūn ų s ka ič iu s

26

8

Citologinio tyrimo metu iš 8 neoplastinės kilmės patologijų tiksliai buvo diagnozuotos tik 4. Iš 3 hemangiosarkomų, citologinio tyrimo metu buvo diagnozuota tik 1, kitame mėginyje citologinio tyrimo metu aptikome hematomą, kuri histologinio tyrimo metu buvo stebima blužnies pakraščiuose, o trečiame hemangiosarkomos mėginyje citologiniu metodu analizuojant mėginį nustatyti EMH bei uždegimo požymiai, kurie histologiniame mėginyje taip pat buvo aptikti, todėl galima teigti, jog diagnozės dalinai sutapo, tačiau pagrindinė – navikinė priežastis – nebuvo nustatyta.

Limfomos diagnostinė vertė siekė 50 proc (1/2 mėg.) – kitame mėginyje nustatyta hematoma, kuri taip pat buvo stebima histologinio preparato pakraščiuose. Citologinio tyrimo metodu taip pat nebuvo nustatyta mielolipoma, citologiniame mėginyje buvo stebima kaip ekstramedulinė hemopoezė, kuri yra priskiriama mielolipomos sudedamajai daliai, tačiau riebalinių ląstelių citologiniame preparate neaptikta.

10 pav. Diagnozių pasiskirstymas pagal tyrimo metodą

0 1 2 3 4 5 6 7 9 Citologinio tyrimo rezultatai

27

2 lentelė. Citologinio ir histologinio tyrimų palyginimas diagnozuojant navikines ir

nenavikines patologijas. Raudonai pažymėti nesutapę tyrimų atsakymai

Mėginio Nr.

Citologinio tyrimo diagnozė Histologinio tyrimo diagnozė Rezultatas

1. Nenavikas Nenavikas Sutapo

2. Navikas Navikas Sutapo

3. Nenavikas Nenavikas Sutapo

4. Nenavikas Nenavikas Sutapo

5. Nenavikas Navikas Nesutapo

6. Nenavikas Navikas Nesutapo

7. Nenavikas Nenavikas Sutapo

8. Nenavikas Nenavikas Sutapo

9. Nenavikas Nenavikas Sutapo

10. Nenavikas Navikas Nesutapo

11. Nenavikas Nenavikas Sutapo

12. Nenavikas Nenavikas Sutapo

13. Nenavikas Nenavikas Sutapo

14. Nenavikas Nenavikas Sutapo

15. Nenavikas Navikas Nesutapo

16. Nenavikas Nenavikas Sutapo

17. Navikas Navikas Sutapo

18. Nenavikas Nenavikas Sutapo

19. Nenavikas Nenavikas Sutapo

20. Nenavikas Nenavikas Sutapo

21. Nenavikas Nenavikas Sutapo

22. Navikas Navikas Sutapo

23. Nenavikas Nenavikas Sutapo

24. Navikas Navikas Sutapo

28 Iš 16 nenavikinės kilmės patologijų pagrindinės diagnozuotos teisingai, nors histologinio tyrimo metu buvo rasta daugiau nei vienas pakitimas. Skaičiuojant citologinio tyrimo specifiškumą bei jautrumą išskirtos neoplastinės bei nenavikinės diagnozės. Atrinktos citologinio tyrimo metu teisingai diagnozuotos neoplazijos (TP), neteisingai teigiamos neoplazijos (FP), tiksliai diagnozuotos nenavikinės patologijos (TN), bei netikslingai diagnozuotos nenavikinės patologijos (FN). Pagal šiuos rodiklius apskaičiuotas citologinių tyrimų efektyvumas, vertinant neoplastinės ir nenavikinės kilmės blužnies pakitimus. Apskaičiuotas citologinio tyrimo jautrumas neoplastinių patologijų diagnozavime : 50 %, specifiškumas 100%, bendras diagnostinis tikslumas 83%. Kiekvienam aukščiau nurodytam diagnostinio testo tikslumo rodikliui Kloperio Pirsono metodu buvo apskaičiuotas devyniasdešimt penkių procentų (95%) pasikliautinasis intervalas (CI). Maknemaro chi kriterijus panaudotas apskaičiavimui ar citologinio tyrimo jautrumas bei specifiškumas yra statistiškai patikimi ir leidžia numanyti, kad nenavikinės kilmės patologijos citologiniu tyrimu diagnozuojamos tiksliau, nei neoplastinės kilmės (χ2 = 4.35; p < 0.05).

3 lentelė. Citologinio tyrimo efektyvumas vertinant navikines ir nenavikines patologijas

Parametras Reikšmė (%) Pasikliautinis intervalas (CI) Jautrumas 50 (4/8) 29.04% to 96.33%

Specifiškumas 100 (16/16) 79.41% to 100.00% Tikslumas 83 (20/24) 67.79% to 97.40%

Teigiama prognostinė vertė 100

Neigiama prognostinė vertė 87.66 68.88% to 92.98%

Toliau tiriant citologinio tyrimo efektyvumo įtaką tiriant navikines ir nenavikines patologijas buvo iškelta hipotezė: citologinio tyrimo jautrumas yra vienodas tiriant nenavikines ir neoplastines patologijas. Šiai hipotezei patvirtinti ar paneigti pasitelktas Koheno kappa koeficientas (κ).

29

4 lentelė. Koheno kappa koeficiento skaičiavimas. A - (TP), B - (TN)

A B Viso

A 4 16 20 B 8 16 24 Viso 12 32 44

Atlikus skaičiavimus gauta, jog kappa koeficientas κ = -0.098 (CI: -0.366 to 0.171). Kadangi κ < 0, pagal duotus rėžius galima hipotezę paneigti. Įvertinus prieš tai apskaičiuotus citologinio tyrimo jautrumą, specifiškumą bei bendrą tikslumą galima teigti, jog citologinio tyrimo jautrumas nesutampa diagnozuojant nenavikinius ir neoplastinius pakitimus, todėl citologinis tyrimas tikslesnis diagnozuojant nenavikinius blužnies pakitimus (p<0.05).

Žemiau pateiktoje lentelėje (5 lentelė) vaizduojami gautų mėginių makroskopinis vaizdas, citologinio ir histologinio tyrimo atsakymai. Galima pastebėti, kad histologiniame tyrime stebimi ir nedideli pakitimai, kaip hemosiderozė, hiperemija ar splenito pradžia, kurių citologinio tyrimo metu nenustatėme, nors pagrindinė diagnozė ir tikslinga, tačiau lygiai taip pat galima pastebėti, jog histologiniu tyrimu nustatytuose neoplastinės kilmės pakitimuose buvo stebimos ir gretutinės patologijos, kaip hematoma ar EMH, kurias citologinio tyrimo metu taip pat diagnozavome, todėl galime teigti, kad tokiu atveju citologinis tyrimas mums buvo dalinai tikslus, nors pagrindinės priežasties – navikinės – nenustatėme. Makroskopiškai blužnies vaizdas pasiskirstė į dvi pagrindines grupes: stebimi lokalūs mazgai ar mazgeliai 54 proc. mėginių (13), bei hiperplazija 33 proc. mėginių (11). 4 mėginiuose makroskopiškai pastebėti tiek mazginiai pakitimai, tiek blužnies hiperplazija. Taip pat buvo pastebėti 2 spalviniai blužnies pakitimai, o vienoje blužnyje pakitimų nepastebėta.

Nustatyta tendencija, jog visi 8 neoplastinės kilmės pakitimai makroskopiškai turėjo lokalių mazgų ar mazgelių vaizdą. Iškelta hipotezė ar diagnozės vertinimas pagal makroskopinį vaizdą yra toks pat efektyvus, kaip citologinio tyrimo. Nustatytas testo jautrumas 87.5 proc., specifiškumas 56.25 proc., bendras tikslumas 66.67 proc. pagal Maknemaro chi formulę (χ2 = 0.021), p > 0.05 ir galima paneigti, kad makroskopinis tyrimas efektyvesnis už citologinį tyrimą.

Iš 13 mėginių, kuriuose makroskopiškai buvo užfiksuoti mazginiai pakitimai, 8 pasitvirtino neoplastinės kilmės patologijos.

Likę 11 mėginiai, kuriems histologinio ir citologinio tyrimo metu diagnozuoti nenavikiniai pakitimai, nepasižymėjo mazginiais pakitimais juos vertinant makroskopiškai. Siekiant nustatyti kokį

30 optimaliausią efektyvumą, įvertinus laiko, kokybės bei ekonomiškumo prizmę, turėtumėme subalansavus šiuos tris tyrimo metodus, sudarytas sisteminis algoritmas. Laikoma, kad makroskopiškai stebint mazgą – numanoma diagnozė neoplazija, jei citologinio tyrimo metu neoplazija nepasitvirtina, atliekamas histologinis tyrimas siekiant išvengti neteisingai neigiamų atvejų, tačiau jei makroskopiškai nematomas mazgas, o citologinio tyrimo metu jis nediagnozuotas, laikoma, jog pakitimas nenavikinės kilmės ir papildomai histologinis tyrimas nereikalingas.

Taikant šią sistemą nustatytas testo jautrumas – 100proc., specifiškumas – 100 proc., bei bendrąas diagnostinis tikslumas – 100 proc. Sistemos patikimumui įvertinti pritaikytas Stjudento t testas, p < 0.05, kuris patvirtino algoritmo patikimumą.

5 lentelė. Blužnies mėginių makroskopinis vaizdas, citologinio bei histologinio tyrimo diagnozės

Nr. Makroskopinis vaizdas Citologinio mėginio atsakymas Histologinio tyrimo atsakymas 1. Hiperlazija, mazgai Hematoma

Hematoma, fibrozė, hiperemija, EMH.

2. Lokalizuotas mazgas Limfoma limfoma, EMH

3. Hiperplazija Hematoma

Didelė hiperemija pereinanti į hematomą.

4. Hiperplazija, mazgai Hematoma

Hiperemija pereinanti į hematomą, nedidelė EMH 5. Daugybiniai mazgai, hiperplazija Hematoma Hemangiosarkoma, ko pasekoje hematoma

6. Lokalūs mazgeliai Hematoma

Difuzinė limfoma , pakraščiuose hematoma

7. Lokalizuotas mazgas Hematoma, EMH Hiperemija, EMH, angiomatozė

8. Hiperplazija EMH

EMH - intensyvi, hematoma, hemosiderozė

9. Hiperplazija EMH EMH, hiperemija, hemosiderozė

10. Mazgas EMH

Mielolipoma, hemosiderozė, trombozė

11. Spalviniai pakitimai EMH EMH, hiperemija

12. Hiperlplazija Reaktyvūs blužnies pokyčiai Reaktyvūs blužnies pokyčiai 13. Nepakitusi Įprasta blužnies citologija Nepakitusi blužnis

14. Lokalūs sustandėjimai

Limfoidinio audinio mazginė hiperplazija

Limfoidinio audinio

hiperplazija, hemosiderozė 15. Daugybiniai mazgai EMH, uždegimo požymiai Hemangiosarkoma, EMH, splenitis 16.

Hiperplazija, splaviniai

pakitimai Reaktyvūs blužnies pokyčiai

Reaktyvūs blužnies pokyčiai, pradžia splenito

31 17. Mazgas, hiperplazija Plazmocitoma Plazmocitoma

18. Netolygi hiperplazija Mikobakteriozė Mikobakteriozė

19. Tolygi hiperplazija EMH Intensyvi EMH

20. Mazgas EMH EMH

21. Mazgas Hematoma Hematoma

22. Daugybiniai mazgai Hemangiosarkoma Hemangiosarkoma 23. Tolygi hiperplazija Įprasta blužnies citologija Nepakitusi blužnis

24. Mazgas Plazmocitoma Plazmocitoma

11 ir 12 pav. vaizduojamas šuns blužnies mielolipomos histologinis vaizdas. Stebimos įvairiais telkiniais išsidėsčiusios riebalų ląstelės, blužnies struktūrinės dalys išlikusios, gausus hemosiderino kiekis, EMH. Mielolipomoje kraujagyslės trombuotos dėl stipraus spaudimo. Citologiniame vaizde mielolipomos nestebima, imant mėginį aspiracijos metodu riebalų ląstelės gali suirti, taip apsunkinat patologijos diagnozavimą.

11 pav. Mielolipomos histologinis vaizdas. 12 pav. Mielolipomos histologinis vaizdas.

Riebalų ląstelės besidėstančios įvairiais telkiniais, Stambios riebalų ląstelės, hemosiderinas, (juodos (raudonos rodyklės), hemosiderinas, stebima EMH, rodyklės). HE, 20X

pagrindinė blužnies struktūra išlikusi. HE, 10X

13 pav. Pavaizuoduotas plazmocitomos makroskopinis vaizdas. 14 paveiksle

vaizduojamas plazmocitomos citologinis vaizdas. Stebimas plazmocitinių ląstelių sankaupos. 15 paveikslėlyje pavaizduotas plazmocitomos histologinio tyrimo mėginio vaizdas. Stebimos plazmocitinių ląstelių sankaupos.

32

14 pav. Plazmocitomos citologinis vaizdas. 15 pav. Plazmocitomos histologinis vaizdas.

Stebimos plazmocitinių ląstelių sankaupos (raudonos rodyklės) Stebimos plazmocitinių ląstelių sankaupos. HE, 20X

16 paveiksle stebimas šuns blužnies limfomos makroskopinis vaizdas, kitame paveikslėlyje (17 pav.) vaizduojamas limfomos histologinis vaizdas, kuriame galima stebėti tolygią nesubrendusių navikinių limfocitų infiltraciją. Blužnies struktūra pakitusi, histologiniame preparate stebimos tik trabekulės, neišskiriama raudonoji pulpa, nėra blužnies folikulų.

1 3 pav. Plazmocitoma makro vaizdas

33

18 pav. Pavaizduotas blužnies hemangiosarkomos citologinis vaizdas. Stebimos kraujo, uždegiminės ląstelės, infiltracija hemangiosarkomos ląstelių. 19 paveikslėlyje galima pamatyti hemangiosarkomos makroskopinį vaizdą. Matoma mazginė blužnies hiperplazija. 20 pav. pavaizduotas hemangiosarkomos histologinio mėginio vaizdas. Stebimos kraujo masės su infiltruotomis uždegiminės kilmės ląstelėmis, hiperemija, neoplastinės hemangiosarkomos ląstelės.

16 pav. Limfomos makroskopinis vaizdas 17 pav. Limfomos histologinis vaizdas.

Pakitusi blužnies struktūra, gausi infiltracija nesubrendusiais navikiniais limfocitais. HE, 10X

19 pav. Hemangiosarkomos makroskopinis vaizdas.

Šuns blužnis

18pav. Hemangiosarkomos citologinis vaizdas,

hemangiosarkomos ląstelės (raudonos rodyklės)

34

20 pav. Hemangiosarkomos histologinis vaizdas.

Stebimos kraujo masės(raudonos rodyklės), hiperemija,

hemangiosarkomos ląstelių infiltracija (juodos rodyklės). HE, 10X

21 paveiksle pavaizduotas ekstramedulinės hemopoezės histologinis vaizdas. Stebimos šviesios ląstelės, megakariocitai, eritroidinės eilės nesubrendusios ląstelės. Hemosiderozė. 22 paveikslėlyje pavaizduotas EMH citologinis vaizdas. Preparate stebimas megakariocitų skaičiaus padidėjimą, nuotraukoje hemosiderofagas apsuptas eritroidinių ląstelių. 23 paveikslėlis vaizduoja EMH histologinį vaizdą. Matome megakariocitą apsuptą eritroidinių ląstelių.

21 pav. Ekstramedulinės hemopoezės histologinis

vaizdas. Stebima hemosiderozė (juodos rodyklės), megakariocitai

(raudonos rodyklės), eritroidinės eilės nesubrendusios ląstelės. HE, 20X

22 pav. Ekstramedulinės hemopoezės

citologinis vaizdas.

Stebimas hemosiderofagas (raudona rodyklė) .

35 24 pav. stebimas šuns blužnies hematomos histologinis vaizdas. Galima matyti eritrocitų mases, vietomis infiltruota uždegiminių ląstelių, vietomis nedidelis kiekis hemosiderino. 25 paveiksle

pavaizduotas hematomos citologinis vaizdas, gausios eritrocitų sankaupos, mišrios infiltracijos uždegiminės ląstelės. 26 pav galima matyti blužnies hematomos makro vaizdą. Blužnis tolygiai hiperplazuota, be ryškių mazginių struktūrų.

23 pav. Ekstramedulinės hemopoezės histologinis

vaizdas. Stebimas megakariocitas apsuptas eritroidinių ląstelių.

24 pav. Hematomos histologinis

vaizdas. Stebimos eritrocitų masės (raudonos rodyklės), uždegiminės ląstelės (juodos rodyklės). HE, 10X

36

. 26 pav. Hematomos makroskopinis vaizdas

25 pav. Hematomos citologinis vaizdas.

37

REZULTATŲ APTARIMAS

Augant gyvenimo kokybei žmonės vis labiau investuoja į savo augintinius. Atradus blužnies pakitimus labai svarbu kiek įmanoma informuoti savininkus apie ligos prognozę bei galimą baigtį. Diagnozės patvirtinimui dažnai pasirenkami citologiniai bei histologiniai blužnies tyrimai. Citologinį tyrimą galima atlikti ultragarso pagalba. Jis gali būti atliekamas dar prieš operaciją neskausmingai, greitai ir jo rezultatai gali būti vertinami toje pačioje klinikoje. Histologiniam tyrimui mėginiai imami jau po atliktos splenektomijos, konservuojami formaline ir siunčiami į laboratoriją. Histologinis tyrimas trunka ilgiau, kainuoja brangiau ir reikalauja specialios įrangos. Atrinkus 24 blužnies mėginius siekta įvertinti citologinio tyrimo efektyvumą vertinant blužnies patologijas. Rezultatams analizuoti tiems patiems mėginiams atliktas ir histologinį tyrimas, kuris laikomas visiškai patikimu ir gautss diagnozės palygintos.

Dėl blužnyje vykstančių procesų įprasta rasti eritrocitų, limfoblastų, įvairaus brendimo limfocitų, neutrofilų, makrofagų. Pačios blužnies sandaros histiocitų, retikulinių ląstelių. Per didelis eritrocitų (kraujo) kiekis trukdo atitinkamai įvertinti mėginį, todėl antspaudo būdu paimtų mėginių ląstelių diferencijavimas buvo sudėtingesnis. Mėginiai, paimti teigiamo slėgio aspiracija pasižymėjo didesniu ląstelingumu, stebima mažiau pašalinių ląstelių, kraujo, tačiau tam tikruose mėginiuose buvo galima aptikti suirusių ar sutraiškytų ląstelių dėl per didelio stiklelio spaudimo išsklaidant tiriamąją medžiagą. Todėl svarbu paimti pakankamą kiekį mėginių, siekiant diagnozuoti blužnies patologijas.

Atlikus histologinį tyrimą 24 šunų blužnims nustatyta, jog 33 proc. (8 mėg.) buvo nustatyti neoplastinės kilmės pažeidimai. Iš kurių 3 hemangiosarkomos, 2 limfomos, 2 plazmocitomos ir 1 mielolipoma. Likusioje dalyje (16 mėginių) vyravo ekstramedulinė hemopoezė (6 mėg.), hematomos (5 mėg.), reaktyvūs blužnies pokyčiai (2 mėg.), limfoidinio audinio hiperplazija, nepakitusi blužnis, mikobakteriozė nustatyta tik po 1 mėginį. 2001 metais G. Bettini, L. Mandrioli ir kitų Italijoje atliktame retrospektyviame tyrime buvo išanalizuoti109 šunų blužnies mėginiai. Histologinio tyrimo 30 proc (33 mėg.) buvo diagnozuoti neoplastinės kilmės pažeidimai, iš kurių didžiausią dalį (12 mėg.) sudarė hemangiosarkoma (34).

Analizuojant gyvūnus pagal amžių nustatytas 11 metų amžiaus vidurkis. Svorio kategorijoje vidutinis šunų svoris siekė 20 kg. Šioje kategorijoje statistiškai patikimų duomenų negauta, tačiau tyrimo metu koreliacija tarp amžiaus ir navikinių patologijų siejosi su jaunesnio, o ne vyresnio amžiaus šunimis. Tačiau reiktų atkreipti dėmesį į vidutinį didelių veislių šunų amžių. Norint susieti šuns svorio bei neoplastinės kilmės pakitimų sąsają gauta silpnai teigiama koreliacija, kas rodo, jog didesnio svorio šuo turi didesnę tikimybę neoplastinės kilmės patologijoms atsirasti. 2016 metais J Matthew Sherwood, April

38 M Haynes ir kitų aprašytame retrospektyviame tyrime buvo ištirti 325 šunys su blužnies neoplazijomis. Tyrimo tikslas buvo susieti svorio įtaką blužnies patologijoms. Vidutinis šunų svoris siekė 27.8 kg. Navikinės kilmės pakitimai diagnozuoti nepriklausomai nuo šunų dydžio mažų veislių šunims (55%) ir didelių veislių šunims (61%), (p = .291) (35). Vokietijoje, 2014 metų tyrime analizuoti 43 šunys su blužnies patologijomis. Vidutinis amžius siekė 10.69 kg, vidutinis svoris – 27,78 kg (36).

Ištyrus visus 24 šunų blužnies citologinio ir histologinių tyrimų diagnozės sutapo 83 proc., 20/24 mėginių. Histologiškai 33 proc. iš visų mėginių diagnozuoti kaip navikinės kilmės pakitimai, likusiąją (77proc.) sudarė nenavikinės kilmės diagnozės. Citologinio tyrimo metu iš 8 navikinės kilmės patologijų tiksliai buvo diagnozuotos tik 4: HSA 1/3, limfoma 1/2, plazmocitoma 2/2. Iš 3 hemangiosarkomų, citologinio tyrimo metu buvo diagnozuota tik 1, kitame mėginyje citologinio tyrimo metu aptikta hematoma, kuri histologinio tyrimo metu buvo stebima blužnies pakraščiuose, o trečiame hemangiosarkomos mėginyje citologiniu metodu analizuojant mėginį nustatyti EMH bei uždegimo požymiai, kurie histologiniame mėginyje taip pat buvo aptikti, todėl galima sakyti, kad diagnozės dalinai sutapo, tačiau pagrindinė – navikinė priežastis – nebuvo nustatyta. Limfomos diagnostinė vertė siekė 50 proc (1/2 mėg.) – kitame mėginyje nustatyta hematoma, kuri taip pat buvo stebima histologinio preparato pakraščiuose. Citologinio tyrimo metodu taip pat nebuvo nustatyta mielolipoma, citologiniame mėginyje buvo stebima kaip ekstramedulinė hemopoezė, kuri yra priskiriama mielolipomos sudedamajai daliai, tačiau riebalinių ląstelių citologiniame preparate neaptikta. Citologinio tyrimo metu diagnozavus hematomą ar ekstramedulinę hemopoezę, stebėtos susikaupusios eritrocitų masės, ko pasekoje imant mėginį aspiracija gaunamas didesnis nei įprastai kraujo užterštumas ir navikinių ląstelių tokiame mėginyje galima nerasti, ar rasti nedidelį kiekį, kuris leistų įtarti navikinį procesą blužnyje.

Nenavikinės kilmės pakitimų diagnozės tarp citologinio ir histologinio tyrimų sutapo, tačiau atliekant histopatologinį mėginio analizavimą pastebėta daugiau nedidelių patologinių pakitimų, kurie citologinio tyrimo metu nebuvo užfiksuoti. Siekiant tiksliau įvertinti citologinio tyrimo efektyvumą, tyrimas padalintas pagal navikinių ir nenavikinių patologijų diagnostikos efektyvumą. Pagal gautą tyrimų diagnozių santykį apskaičiuotas citologinio tyrimo jautrumas 50 %, specifiškumas 100%, bendras diagnostinis tikslumas 83 %. Maknemaro chi kriterijaus formule patvirtinta, kad citologinis tyrimas efektyvesnis diagnozuojant nenavikinės kilmės patologijas. Žemam tyrimo jautrumui (diagnozuojant navikinius pakitimus) įtakos galėjo turėti citologinio mėginio ėmimo technika, kadangi aspiracijos metodu imant ląsteles labai svarbu mėginį pakartoti kelis kartus, visapusiškam mėginio analizavimui ir patologijos diagnozavimui. Netinkamas citologinis mėginys gali būti užterštas krauju, ląstelės gali būti per daug sutrintos ar per storos tikslingam vertinimui. Taip pat, jei citologinį mėginį imsime tik iš vienos